JP2005192492A - 寒天分解酵素およびその利用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】次の性質を有する遺伝子組換え技術による寒天分解酵素の製造方法。作用:アガロースのβ−1,4結合を加水分解し、ネオアガロヘキサオースを主成分とする重合度の異なるネオアガロオリゴ糖を生成する。基質特異性:少なくとも寒天、アガロース等の多糖類ならびに同骨格を有するオリゴ糖に作用し、寒天由来オリゴ糖を生成するが、重合度6以下の寒天由来オリゴ糖はほとんど分解しない。金属塩の酵素に対するの安定性:金属塩の濃度が高い場合には熱に対する安定性が高まり、金属塩の濃度が低い場合には熱に対する安定性が低下する。
【選択図】図2
Description
(1)作用:
アガロースのβ−1,4結合を加水分解し、ネオアガロヘキサオースを主成分とする重合度の異なるネオアガロオリゴ糖を生成する。
(2)基質特異性:
少なくとも寒天、アガロース等のD−ガラクトースと3,6−アンヒドロ−L−ガラクトースが交互にβ−1,4結合およびα−1,3結合した骨格を有する多糖類ならびに同骨格を有するオリゴ糖に作用し、寒天由来オリゴ糖を生成するが、重合度6以下の寒天由来オリゴ糖はほとんど分解しない。
(3)金属塩が酵素の安定性に与える影響および失活の条件:
金属塩の濃度が高い場合には熱に対する安定性が高まり、金属塩の濃度が低い場合には熱に対する安定性が低下する。
(a)配列表の配列番号1に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド
(b)配列表の配列番号1に示すアミノ酸配列中の1個もしくは複数個のアミノ酸が欠
失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド
(c)配列表の配列番号1の479−1175番に示すアミノ酸配列を有するポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド
(d)配列表の配列番号1の479−1175番に示すアミノ酸配列中の1個もしくは
複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(e)配列表の配列番号2に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
(f)配列表の配列番号2に示すヌクレオチド配列中の1個もしくは複数個の塩基が欠
失、置換、付加もしくは挿入されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
(g)配列表の配列番号2に示す1690−3783番のヌクレオチド配列を有するポ
リヌクレオチド
(h)配列表の配列番号2に示す1690−3783番ヌクレオチド配列中の1個もし
くは複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入されたヌクレオチド配列を有
するポリヌクレオチド
より選ばれるポリヌクレオチドを提供するものである。
アガロースのβ−1,4結合を加水分解し、ネオアガロヘキサオースを主成分とするネオアガロオリゴ糖を生成する。
(2)基質特異性:
少なくとも寒天、アガロース等のD−ガラクトースと3,6−アンヒドロ−L−ガラクトースが交互にβ−1,4結合およびα−1,3結合した骨格を有する多糖類ならびに同骨格を有するオリゴ糖に作用し、寒天由来オリゴ糖を生成するが、重合度6以下の寒天由来オリゴ糖はほとんど分解しない。
(3)金属塩が酵素の安定性に与える影響および失活の条件:
金属塩の濃度が高い場合には熱に対する安定性が高まり、金属塩の濃度が低い場合には熱に対する安定性が低下する。ここで金属塩の濃度とは、本発明酵素または本発明酵素を産生する微生物を含む酵素溶液や反応溶液(以下、単に「反応溶液」という)中の金属塩の濃度をいう。具体的な金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等の1価の金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の2価の金属塩が挙げられるが、特にこれらの塩に限定されるものではない。
上記1価の金属塩の濃度が1〜4Mである場合、30℃で15分間熱処理後の残存活性は、熱処理をしない(0℃、15分間)場合の80%以上、好ましくは90%以上であり、40℃で15分間熱処理後の残存活性は60%以上、好ましくは70%以上である。
また、上記2価の金属塩の濃度が0.1〜0.4Mである場合、40℃で15分間熱処理後の残存活性は、熱処理をしない場合の80%以上、好ましくは85%以上である。
一方、上記1価の金属塩の濃度が0.1M以下であり、かつ上記2価の金属塩の濃度が0.1mM以下の場合、40℃で15分間熱処理後の残存活性は、熱処理をしない場合の10%以下である。
(4)温度安定性および作用最適温度:
反応溶液中のCaCl2の濃度が0.01〜1Mである場合、45℃で15分間熱処理後の残存活性は、熱処理をしない(0℃、15分間)場合の80%以上、好ましくは90%以上であり、50℃で15分間熱処理後の残存活性は、熱処理をしない場合の70%以上、好ましくは80%以上である。この場合の作用温度は20〜55℃であり、最適作用温度は40〜50℃である。
反応溶液中のMgCl2の濃度が0.1〜0.4Mである場合、30℃で15分間熱処理後の残存活性は、熱処理をしない場合の90%以上、好ましくは95%以上であり、40℃で15分間処理後の残存活性は、80%以上、好ましくは85%以上である。この場合の作用温度は20〜50℃であり、最適作用温度は35〜45℃である。
反応溶液中のNaClの濃度が1〜4Mである場合、30℃で15分間熱処理後の残存活性は、熱処理をしない場合の80%以上、好ましくは90%以上であり、40℃で15分間熱処理後の残存活性は、熱処理をしない場合の60%以上、好ましくは70%以上である。この場合の作用温度は20〜50℃であり、最適作用温度は30〜40℃である。
(5)pH安定性および作用最適pH:
pH6〜9の範囲で安定である。作用pH範囲は5〜8であり、最適pHは6〜8である。
(6)分子量:
60〜130kDa(SDS−PAGEによる測定)
(7)金属塩等が活性に与える影響:
Al3+、Co2+、Cu2+、Hg2+、Fe2+、Fe3+、Pb2+、Zn2+により強く阻害され、Cs+、K+、Li+、Mn2+によっては阻害されない。
(8)化学薬品に対する耐性:
0.1mMのN−ブロモスクシンイミドで阻害される。0.5mMのヨードアセトアミドおよびp−(クロロメルクリ)安息香酸、1mMのN−エチルマレイミド、10mMのジチオトレイトールおよび2−メルカプトエタノールで阻害されない。
<形態>
マリンブロス2216培地(ディフコ社製)に生育した細胞についての形態。
細胞の形態:桿菌
細胞の大きさ:0.6〜0.8μm×3.0〜6.0μm
運動性:有
鞭毛:有
グラム染色性:陰性
胞子形成:無
<生育状態>
液体培養における生育状態。
最適温度:20〜52℃で良好に生育
食塩濃度:1〜5%で良好に生育
<生理学的性質>
O−Fテスト:F
カタラーゼテスト:陽性
オキシダーゼテスト:陽性
ゼラチン分解能:有
デンプン分解能:有
ONPGテスト:陰性
ウレアーゼ生産:無
硫化水素生産:無
インドール生産:無
硝酸還元能:有
資化性(L−アラビノース、セロビオース、D−ガラクトース、
D−グルコース):有
(a)配列表の配列番号1に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド
(b)配列表の配列番号1に示すアミノ酸配列中の1個もしくは複数個のアミノ酸が欠
失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド
(c)配列表の配列番号1の479−1175番に示すアミノ酸配列を有するポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド
(d)配列表の配列番号1の479−1175番に示すアミノ酸配列中の1個もしくは
複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(e)配列表の配列番号2に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
(f)配列表の配列番号2に示すヌクレオチド配列中の1個もしくは複数個の塩基が欠
失、置換、付加もしくは挿入されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
(g)配列表の配列番号2に示す1690−3783番のヌクレオチド配列を有するポ
リヌクレオチド
(h)配列表の配列番号2に示す1690−3783番ヌクレオチド配列中の1個もし
くは複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入されたヌクレオチド配列を有
するポリヌクレオチド
なお、以下の実施例において、染色体DNAとプラスミドDNAはそれぞれサイトウら(Saito H, Miura K., Biochem. Biophys. Acta, 72: 619-629, (1963))およびバーンボイムら(Birnboim HC, Doly J., Nucleic Acids Res., 7:1513-1523,(1979))の方法に従って調製した。他の基本的遺伝子操作はサムブルックら(Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd edn Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, (1982))の方法に基づいて行った。また、形質転換は、ハナハンら(Hanahan D., J. Mol. Gen. Genet., 166: 557-580, (1983))の方法、バチルス.ズブチリス(B. subtilis)の形質転換はチャンら(Chang S., Cohen SN., Mol. Gen. Genet., 168:111-115, (1979))の方法で行った。
寒天分解菌のスクリーニング:
海洋科学技術センターに保存されている海底土壌のサンプルをマリンブロス2216培地(ディフコ社製)で適宜希釈し、マリンアガー平板培地に接種し、15〜55℃の様々な温度で16〜48時間培養した。コロニー周辺の寒天を分解し、用いた平板培地にくぼみを形成した菌を、更に別のマリンアガー平板培地に接種し、その菌に適した温度で培養した。続いて、同培地で画線培養を繰り返し寒天分解細菌を単離した。
(1)アガラーゼ遺伝子の解析
マイクロブルビファー エスピー A94株(以下、「A94株」と省略する)の染色体DNAをEcoRIで消化してDNA断片を得た。このDNA断片をHigh Pure PCR Product Purification Kit(Roche社製)を用いて精製し、精製DNA断片とした。この精製DNA断片と予めEcoRIで消化しておいたプラスミドベクターpUC18(TaKaRa社製)とをDNA Ligation Kit ver. 2.0(TaKaRa社製)を用いてライゲーションした。このライゲーション混合液を用いてE.coli HB101(F’supE44 hsdS20 recA13 ara−14 proA2 lacY1 galK2 rpsL20 xyl−5 mtl−1 leuB6 thi−1)を形質転換して形質転換体を作製した。
プライマー2:5’−CGAAAGGGGGATGTGCTGC−3’
AgaOをコードするDNA断片の一部、すなわち配列表の配列番号2のヌクレオチド1277−3783番に相当するDNA断片を発現用ベクターpHSP64(Sumitomo N, Ozaki K, Hitomi J. Kawaminami S, Kobayashi T. Kawai S, Ito S. (1995). Biosci. Biotechnol. Biochem., 59, 2172-2175)に導入し、得られた組換えプラスミドをpHSPO1とした。pHSPO1を用いてE.coli HB101を形質転換した。得られた形質転換体をLB寒天培地上で一晩培養後、寒天上のくぼみから、E.coli HB101における組換え体のアガラーゼ活性を確認した。
上記のようにして精製されたアガラーゼ(以下、「RagO」という)について、下記の性質を調べた。なお、特に基質が記載されていない場合には、寒天を基質として使用した。
汎用性アガロース(Agarose L 03:TaKaRa社製)を基質とした時のRagOの反応生成物の経時変化をTLCにより分析した(図2)。その結果、本発明酵素はアガロースのβ−1,4結合をエンド型に分解する反応を触媒するβ−アガラーゼであることが判明した。なお、図2中で検出されている、ネオアガロテトラオースやさらに低分子の糖は、アガロースを分解する過程で生じた重合度が10または重合度が8等のネオアガロオリゴ糖の加水分解反応で生じたものである。
汎用性アガロース(Agarose L 03:TaKaRa社製)を基質とし、RagOを48時間作用させた時の反応生成物をゲルろ過カラム(Asahipak GS220 G7:旭化成社製)をもちいた高速液体クロマトグラフィー(島津製作所社製)で定量した結果、検出された全オリゴ糖のうち、重量比で66.3%がネオアガロヘキサオースであり、21.2%がネオアガロテトラオースであった。
RagOの基質特異性を調べたところ、寒天、アガロース等のD−ガラクトースと3,6−アンヒドロ−L−ガラクトースが交互にβ−1,4結合およびα−1,3結合した骨格を有する多糖類ならびに同骨格を有するオリゴ糖に作用し、寒天由来オリゴ糖等を生成するが、アガロースと共通の2糖の繰り返し単位を持ち、重合度が6であるネオアガロヘキサオースおよび重合度が4であるネオアガロテトラオースを分解しなかった。
RagOの作用最適pHを、pH3〜pH9.5の間で0.5MのNaClを含む50mMのブライトン−ロビンソン(Britton-Robinson)広域緩衝液を用いて測定したところ、中性のpH領域で活性を持ち、その最適pHはpH6〜8であった(図3)。また、RagOのpH安定性を、pH3〜pH12の間で0.5MのNaClを含む50mMのブライトン−ロビンソン(Britton-Robinson)広域緩衝液中、25℃で30分間それぞれ保温した後の残存活性により測定した。この結果、pH6〜10の間で最大活性の80%以上の活性を保持していた(図4)。
SDS−PAGEにより測定したRagOの見かけの分子量は約76kDaであった。この値はRagO遺伝子がコードする成熟タンパクの推定分子量94kDaより小さかった。RagOは宿主であるB.subtilis ISW1214の分泌するプロテアーゼによって分解を受け、低分子化されていることが予想された。RagOの内部アミノ酸配列を液体クロマトグラフィー タンデムマススペクトロメトリーを用いて解析したところ、RagO遺伝子のコードするアミノ酸配列(配列番号1)の479〜1175番のアミノ酸配列に相当する配列を持ったタンパクであることが示された。
10mMのCaCl2を含む20mMのTris−HCl緩衝液(pH7.5)中、45℃で15分間熱処理後の残存活性は、熱処理をしない(0℃、15分間)場合の97.6%、50℃で90.5%であった(図5)。前述の緩衝液中での活性を測定したところ、最適作用温度は40〜50℃であった(図6)。0.1MのMgCl2を含む20mMのTris−HCl緩衝液(pH7.5)中で、30℃で15分間熱処理後の残存活性は、熱処理をしない(0℃、15分間)場合の100%、40℃で94%であった。同緩衝液中での活性を測定した場合、最適作用温度は35〜45℃であった。1MのNaClを含む20mMのTris−HCl緩衝液(pH7.5)中で、30℃で15分間熱処理後の残存活性は、熱処理をしない(0℃、15分間)場合の。91.3%、40℃で76.9%であった。同緩衝液中での活性を測定した場合、最適作用温度は30〜40℃であった。
重金属イオンのRagOの活性に与える影響を調べたところ、1mM濃度で、Al3+、Co2+、Cu2+、Hg2+、Fe2+、Fe3+、Pb2+、Zn2+により強く阻害され、残存活性は0〜12%であった。一方、Cs+、K+、Li+、Mn2+によっては阻害されず、残存活性は97〜111%であった。また、このことより、RagOの活性にはSH基、CO基、NH基の関与する酵素タンパクの構造維持が必要であることが考えられた。
RagOの化学薬品に対する耐性を下記表2に示す種類と濃度で調べた。RagOは0.1mMのN−ブロモスクシンイミド(シグマ社製)では阻害されたが、0.5mMのヨードアセトアミド(関東化学社製)およびp−(クロロメルクリ)安息香酸(ナカライテスク社製)、1mMのN−エチルマレイミド(和光純薬工業社製)、10mMのジチオトレイトール(Pharmacia Biotech社製)および2−メルカプトエタノール(ナカライテスク社製)で阻害されなかった。
Claims (13)
- 次の性質を有する寒天分解酵素。
(1)作用:
アガロースのβ−1,4結合を加水分解し、ネオアガロヘキサオースを主成分とする重合度の異なるネオアガロオリゴ糖を生成する。
(2)基質特異性:
少なくとも寒天、アガロース等のD−ガラクトースと3,6−アンヒドロ−L−ガラクトースが交互にβ−1,4結合およびα−1,3結合した骨格を有する多糖類ならびに同骨格を有するオリゴ糖に作用し、寒天由来オリゴ糖を生成するが、重合度6以下の寒天由来オリゴ糖はほとんど分解しない。
(3)金属塩が酵素の安定性に与える影響および失活の条件:
金属塩の濃度が高い場合には熱に対する安定性が高まり、金属塩の濃度が低い場合には熱に対する安定性が低下する。 - 配列番号1で示されるアミノ酸配列またはこの配列中の1個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する請求項第1項記載の寒天分解酵素。
- 配列番号1で示されるアミノ酸配列と57%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する請求項第1項記載の寒天分解酵素。
- 配列番号1の479−1175番のアミノ酸配列で示されるアミノ酸配列またはこの配列中の1個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する請求項第1項記載の寒天分解酵素。
- 配列番号1の479−1175番のアミノ酸配列で示されるアミノ酸配列と49%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する請求項第1項記載の寒天分解酵素。
- マイクロブルビファー(Microbulbifer)属微生物由来のものである請求項第1項記載の寒天分解酵素。
- マイクロブルビファー属微生物が、寄託番号FERM BP−8321のマイクロブルビファー エスピー A94(Microbulbifer sp. A94)である請求項第6項記載の寒天分解酵素。
- 請求項第1項記載の寒天分解酵素のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであって、下記(a)〜(h)からなる群
(a)配列表の配列番号1に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド
(b)配列表の配列番号1に示すアミノ酸配列中の1個もしくは複数個のアミノ酸が欠
失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド
(c)配列表の配列番号1の479−1175番に示すアミノ酸配列を有するポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド
(d)配列表の配列番号1の479−1175番に示すアミノ酸配列中の1個もしくは
複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(e)配列表の配列番号2に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
(f)配列表の配列番号2に示すヌクレオチド配列中の1個もしくは複数個の塩基が欠
失、置換、付加もしくは挿入されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
(g)配列表の配列番号2に示す1690−3783番のヌクレオチド配列を有するポ
リヌクレオチド
(h)配列表の配列番号2に示す1690−3783番ヌクレオチド配列中の1個もし
くは複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入されたヌクレオチド配列を有
するポリヌクレオチド
より選ばれるポリヌクレオチド。 - 請求項第8項記載のポリヌクレオチドを有する組換えベクター。
- 請求項第9項記載の組換えベクターにより形質転換された微生物。
- 請求項第10項記載の微生物を培養し、培養物より寒天分解酵素を採取することを特徴とする寒天分解酵素の製造方法。
- 藻類、藻類の粉砕物または抽出物に、請求項第1項記載の寒天分解酵素を作用させてネオアガロオリゴ糖を得ることを特徴とするネオアガロオリゴ糖の製造方法。
- 藻類に、請求項第1項記載の寒天分解酵素を作用させてプロトプラストを得ることを特徴とする藻類のプロトプラストの製造方法。
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