JP2005185276A - Ｐｓｍ’活性のプロモータ - Google Patents

Ｐｓｍ’活性のプロモータ Download PDF

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Abstract




【課題】選択的にスプライシングされた前立腺特異的膜（ＰＳＭ'）抗原をコードする単離された核酸分子であって、プロモータ活性を備えた単離された核酸を提供すること。
【解決手段】 プロモータ活性を備えた単離された核酸であって、選択的にスプライスされた前立腺特異的膜抗原をコードする遺伝子の転写に関連したプロモータ配列に対応する連続的ヌクレオチドを具備し、その構造内に、位置５８のメチオニンで始まり位置７５０のアラニンで終わる特定のアミノ酸配列をもった連続的アミノ酸を有するが、位置１〜位置５７のアミノ酸配列をもった連続的アミノ酸を有さない単離された核酸。
【選択図】なし

Description

関連出願の表示
本出願は、共に１９９５年６月２日付けで出願された米国特許出願第08/466,381号および08/470,735号（これらは１９９５年２月２４日付けで出願された米国特許出願08/394,152号の継続出願である）の一部継続出願である。これらの出願の内容は、出典明示により本明細書の一部とする。
本明細書に開示する発明の一部は、ＮＩＨ助成第DK47650号および米国保険社会福祉省からのCA58192、CA-39203、CA-29502、CA-08748-29に基づく政府の援助によりなされた。従って、米国政府は本発明において一定の権利を有する。
発明の背景
本出願ではその全体において、括弧内に示す種々の参照文献に言及している。本発明に関連した技術水準をより完全に説明するために、これらの刊行物の全体の開示を、出典明示により本出願の一部とする。実験の詳細の部における各組の実施例の最後に、これらの参照文献の完全な書誌的引用を示す。
前立腺癌は、現在、米国人男性で診断される最も一般的な悪性疾患であるため、該疾患は米国における最も重要な医学的問題の１つとなっている。１９９２年には、１３２,０００以上の症例が前立腺癌として新たに診断され、この疾患により３６,０００人以上が死亡しており、４年間で１７.３％増加している（2）。前立腺癌患者の５年生存率は、限局性疾患患者の８８％から転移性疾患患者の２９％である。症例数の急激な増加の原因は、１つには、当該疾患に気づく例が増えたことと、分泌タンパク質である前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）や前立腺酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）などの臨床的マーカーが広く使用されるようになったためと考えられる（37）。
前立腺は、良性成長（ＢＰＨ）、新形成（前立腺癌）、感染症（前立腺炎）などの状態に冒される病理学的に重要な部位である。前立腺癌は、男性の癌死亡の第２位の主要原因である（1）。しかし、前立腺癌は男性の癌発生の最も主要な部位である。これらの２つの事実の相違は、男性が齢をとるにつれて、特に他の要因による死亡が加わってくることが多い６０歳を越えてから、前立腺癌の発生頻度が増加することと関係している。また、男性によっては、検出後に該腫瘍が潜伏的組織学的腫瘍のまま維持されて臨床的に重要でなくなる例もあるが、前立腺癌の生物学的攻撃性は激しく、該腫瘍が急速に進行し、転移し、比較的短期間（２〜５年）のうちに死に至る場合もある（1, 3）。
前立腺癌細胞中で非常に高濃度で産生される２つの特異的タンパク質として、前立腺酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）および前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）が挙げられる（4, 5, 6）。これらのタンパク質は既に特徴づけされており、治療に対する反応を追跡するのに使用されている。癌が広がるにつれて、前立腺の正常な構造が変化し、例えば、分泌物を運ぶための正常な管構造が失われ、そのため該分泌物が血清に達する。実際、血清ＰＳＡの測定が、前立腺癌の潜在的スクリーニング方法として提案されている。実際、正常または良性組織と比べて、該癌におけるＰＳＡおよび／またはＰＡＰの相対量は減少する。
ＰＡＰは、転移の広がりを検出するための最も初期の血清マーカーの１つである（4）。ＰＡＰは、チロシンホスファターゼを加水分解し、広い基質特異性を有する。チロシンのリン酸化は、腫瘍形成トランスフォーメーションと共に増強されることが多い。ある種のタンパク質はチロシン残基上のリン酸化により活性化され、そのようなタンパク質を不活性化するのにホスファターゼ活性が利用できるのであるが、腫瘍性トランスフォーメーションの間は、そのようなホスファターゼ活性が低下していると仮定されている。チロシンホスファターゼ活性を有するホスファターゼを挿入することにより、悪性表現型が逆転する場合もある。
ＰＳＡはプロテアーゼであり、その活性の喪失が癌発生とどのように相関しているかを理解することは容易ではない（5, 6）。ＰＳＡのタンパク質分解活性は、亜鉛により阻害される。亜鉛濃度は、正常前立腺中では高く、前立腺癌中では減少する。おそらく、亜鉛が失われることにより、ＰＳＡのタンパク分解活性が増強されるのであろう。プロテアーゼは転移に関与しており、いくつかのプロテアーゼは有糸分裂活性を刺激するため、ＰＳＡ活性の潜在的増加は、腫瘍の転移および拡張において何らかの役割を果たしていると仮定される（7）。
ＰＳＡおよびＰＡＰは共に、前立腺分泌物中に見いだされる。両者の産生はアンドロゲンの存在に依存し、両者はアンドロゲン喪失後に実質的に減少するらしい。
前立腺膜に局在していると考えられる前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭ）が既に同定されている。この抗原は、前立腺癌細胞ＬＮＣａＰに対するモノクローナル抗体を作製した結果として同定された（8）。
ホロスツェビクツ(Horoszewicz)博士は、ホルモン治療に反応しない前もって十分に治療された患者のリンパ節から、ＬＮＣａＰと称される細胞株を樹立した（9）。この系は、異数体ヒト男性核型を有することが判明した。該細胞株は、ＰＳＡおよびＰＡＰの両方を産生する点で、前立腺分化機能を維持していた。該細胞株は、高い親和性および特異性のアンドロゲン受容体を有していた。ＬＮＣａＰ細胞でマウスを免疫し、感作動物からハイブリドーマが誘導された。モノクローナル抗体が誘導され、７Ｅ１１−Ｃ５と命名された（8）。該抗体染色は膜局在と一致し、ＬＮＣａＰ細胞膜の単離画分は、免疫ブロット法およびＥＬＩＳＡ技術で強力な陽性反応を示した。この抗体は、インビトロまたはインビボでＬＮＣａＰ細胞の成長を阻害も増強もしなかった。この抗原に対する抗体は、他の成分では反応性が認められなかったため、前立腺上皮細胞に著しく特異的であったといえる。癌性上皮細胞の免疫組織化学的染色は、正常または良性の上皮細胞の場合と比較して強かった。
また、ホロスツェビクツ博士は、前立腺癌患者の血清中において、７Ｅ１１−Ｃ５を用いた免疫反応性物質の検出を報告している（8）。該免疫反応性は、Ｄ−２段階の疾患の患者の約６０％で検出可能であった。また、より初期の段階の疾患の患者ではそれより若干低い割合の患者で検出可能であったが、このグループの患者数は少ない。良性前立腺過形成（ＢＰＨ）の患者は陰性であった。明らかな疾患を有さない患者は陰性であったが、寛解状態にあるが活性な安定疾患を有するかまたは進行中の患者の５０〜６０％は、陽性血清反応性を示した。非前立腺腫瘍の患者は、７Ｅ１１−Ｃ５による免疫反応性を示さなかった。
７Ｅ１１−Ｃ５モノクローナル抗体は、現在、臨床試験中である。該抗体のアルデヒド基を酸化し、該重鎖の反応性アルデヒドに対して、リンカー−キレート剤 グリコール−チロシル−（n,ε−ジエチレントリアミン−ペンタ酢酸）−リシン（ＧＹＫ−ＤＴＰＡ）を結合させた（10）。得られた抗体はＣＹＴ−３５６と称された。免疫組織化学的染色パターンは、ＣＹＴ−３５６修飾抗体が骨格筋を染色した以外は同様であった。ＣＹＴ−３５６を７Ｅ１１−Ｃ５モノクローナル抗体と比較することにより、両者が２型筋繊維に対する結合性を有することが示唆された。より初期の研究では骨格筋は陰性と報告されており、この報告と相違する理由は、組織固定化技術の相違によることが示唆された。それでも、前立腺上皮細胞、特に癌性細胞を用いたときに、最も強く且つ明確な反応が観察された。マウス骨格筋との反応性は、イメージング研究でなく、免疫組織化学的方法により検出された。インジウム１１１標識抗体は、ヌードマウス中で成長したＬＮＣａＰ腫瘍に局在し、４日目で腫瘍１グラム当たりの注入用量の約３０％が取り込まれていた。インビボでは、ＰＣ−３、ＤＵ−１４５などの抗原陰性腫瘍中の又は骨格筋による該抗体の選択的保持は認められなかった。ＰＳＭ抗原については、ほとんど知られていない。精製および特徴づけのための努力については、ジョージ・ライト(George Wright)博士らにより学会で説明されている（11, 12）。
発明の概要
本発明は、選択的にスプライシングされた前立腺特異的膜（ＰＳＭ'）抗原をコードする単離された哺乳動物核酸分子を提供する。
本発明は、前立腺特異的膜抗原プロモーターをコードする単離された核酸分子を提供する。本発明は、対象の血行性微小転移腫瘍細胞を検出し、対象の前立腺癌の進行を測定する方法を提供する。
発明の詳細な説明
本出願の全体において、特定のヌクレオチドに対する言及は、該核酸のコーディング鎖上に存在するヌクレオチドに対するものである。本明細書では、特定のヌクレオチドを示すために、以下の標準的な略語を使用する：
Ｃ＝シトシン、Ａ＝アデノシン、
Ｔ＝チミジン、Ｇ＝グアニン。
「遺伝子」は、特定のタンパク質の正常に調節された産生に必要な、構造コーディング配列、プロモーターおよびエンハンサーを含むすべての情報がその配列の中に含まれている核酸分子を意味する。
本発明は、選択的にスプライシングされた前立腺特異的膜（ＰＳＭ'）抗原をコードする単離された哺乳動物核酸を提供する。
本発明は、哺乳動物前立腺特異的膜（ＰＳＭ）抗原をコードする単離された哺乳動物核酸を提供する。
さらに本発明は、選択的にスプライシングされた前立腺特異的膜抗原をコードする、単離された哺乳動物核酸分子の単離された哺乳動物ＤＮＡ分子を提供する。また本発明は、選択的にスプライシングされた前立腺特異的膜抗原をコードする単離された哺乳動物ｃＤＮＡ分子を提供する。本発明は、哺乳動物の選択的にスプライシングされた前立腺特異的サイトゾル抗原をコードする単離された哺乳動物ＲＮＡ分子を提供する。
さらに本発明は、哺乳動物前立腺特異的膜抗原をコードする、単離された哺乳動物核酸分子の単離された哺乳動物ＤＮＡ分子を提供する。また本発明は、哺乳動物前立腺特異的膜抗原をコードする単離された哺乳動物ｃＤＮＡ分子を提供する。本発明は、哺乳動物前立腺特異的膜抗原をコードする単離された哺乳動物ＲＮＡ分子を提供する。
本発明の好ましい実施態様では、その単離された核酸配列は、図４７Ａ〜４７Ｄに示すヒトからのｃＤＮＡである。このヒト配列は、ＰＳＭ、ホモサピエンス、２６５３塩基対という説明と共に、受託番号M99487でジーンバンク（GenBank；Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico）へ提出されている。
また本発明は、ＰＳＭまたはＰＳＭ'抗原とは異なるが、表現型変化を与えないアミノ酸配列をコードするようなＤＮＡおよびｃＤＮＡを包含する。あるいは、本発明はまた、本発明のＤＮＡおよびｃＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡおよびｃＤＮＡを包含する。ハイブリダイゼーション法は、当業者によく知られている。
例えば、一定のイオン強度およびｐＨでの特定の配列の熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低い温度で、厳密性の高いハイブリダイゼーション条件を選択する。Ｔｍは、標的配列の５０％が、完全適合プローブとハイブリダイズする温度（一定のイオン強度およびｐＨ下において）である。典型的には、厳密性の高い条件は、pＨ７において塩濃度が少なくとも約０.０２モルであり、温度が少なくとも約６０℃であるような条件である。他の要因（とりわけ、相補鎖の塩基組成およびサイズ、有機溶媒の存在、すなわち、塩またはホルムアミド濃度、塩基ミスマッチの程度など）がハイブリダイゼーションの厳密性に有意な影響を及ぼしうるため、パラメーターの組み合わせは、いずれか１つの絶対測定値よりも重要である。例えば、厳密性の高いハイブリダイゼーションは、例えば、６×ＳＳＣ溶液中において、約６８℃で一晩ハイブリダイゼーションし、室温で６×ＳＳＣ溶液により洗浄し、ついで０.６×ＳＳＸ溶液中の６×ＳＳＣ中、約６８℃で洗浄することにより行ってもよい。
適度の厳密性でのハイブリダイゼーションは、例えば、以下のとおりに行ってもよい： １）３×塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、５０％ホルムアミド、０.１M トリス緩衝液（pＨ７.５）、５×デンハルト溶液を用いるフィルタープレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション、２）３７℃で４時間のプレハイブリダイゼーション、３）３,０００,０００cpmと同等量の標識プローブによる３７℃での合計１６時間のハイブリダイゼーション、４）２×ＳＳＣおよび０.１％ＳＤＳ溶液中での洗浄、５）４×１分間、室温（それぞれ）、および４×６０℃、３０分間（それぞれ）の洗浄、および６）乾燥およびフィルムへの露光。
本明細書中で説明し、且つ請求の範囲に記載したＤＮＡ分子は、該分子が提供するポリペプチドのアミノ酸配列に関する情報のために有用であり、また種々の組換え技術によに前記ポリペプチドを大規模合成するための物質として有用である。該分子は、新規クローニングベクターおよび発現ベクター、並びに形質転換されトランスフェクションされた原核および真核宿主細胞を作製するのに有用であり、また、該ポリペプチドおよび関連生成物の発現能を有するそのような宿主細胞の培養増殖のための新規且つ有用な方法を得るために有用である。
さらに、哺乳動物前立腺特異的膜抗原および選択的にスプライシングされたＰＳＭ'をコードする単離された哺乳動物核酸分子は、前立腺癌の腫瘍形成の研究のためのプローブを開発するために有用である。
また本発明は、前立腺特異的膜抗原または選択的にスプライシングされた前立腺特異的膜抗原をコードする核酸分子の配列と特異的にハイブリダイズする能力を有する少なくとも１５ヌクレオチドの単離された核酸分子を提供する。
製造されたこの核酸分子は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。本明細書中で用いる「特異的にハイブリダイズする」の語は、核酸分子が、それ自体と相補的な核酸配列を認識し、相補的塩基対間で水素結合により二重らせんセグメントを形成する能力を意味する。
前立腺特異的膜抗原をコードする核酸分子の配列と特異的にハイブリダイズする能力をもった少なくとも１５ヌクレオチドのこの核酸分子は、プローブとして使用することができる。核酸プローブ技術は当業者によく知られており、当業者であれば、そのようなプローブの長さは多種多様であってもよく、プローブの検出を容易にするために検出可能な標識（例、放射性同位体、蛍光染料など）でプローブを標識してもよいことを容易に理解するであろう。ＤＮＡプローブ分子は、当該分野でよく知られている方法により、ＰＳＭ抗原をコードするＤＮＡ分子を適当なベクター（例、プラスミド、バクテリオファージなど）中へ挿入し、ついで適当な細菌宿主細胞中へ形質転換し、該形質転換細菌宿主細胞中で複製し、該ＤＮＡプローブを回収することにより製造すればよい。あるいは、当該プローブは、ＤＮＡ合成装置により化学的に製造してもよい。
ＲＮＡプローブは、バクテリオファージプロモーター（例えば、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６など）の下流にＰＳＭ抗原分子を挿入することにより作製してもよい。上流プロモーターを適当なＲＮＡポリメラーゼの存在下で含有する線状化ＰＳＭ抗原断片と共に、該標識ヌクレオチドをインキュベーションすることにより、多量のＲＮＡプローブを生成させてもよい。
また本発明は、哺乳動物前立腺特異的膜抗原をコードする哺乳動物核酸分子に対して相補的な核酸分子配列と特異的にハイブリダイズする能力を有する少なくとも１５ヌクレオチドの核酸分子を提供する。この分子は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子のいずれであってもよい。
さらに本発明は、哺乳動物ＰＳＭまたはＰＳＭ'抗原の細胞中での発現を検出する方法であって、該細胞から全ｍＲＮＡを得ることと、こうして得られたｍＲＮＡを、ハイブリダイゼーション条件下において、哺乳動物ＰＳＭまたはＰＳＭ'抗原をコードする核酸分子の配列と特異的にハイブリダイズする能力を有する少なくとも１５ヌクレオチドの標識された核酸分子と接触させることと、該分子とハイブリダイズしたｍＲＮＡの存在を判定し、それにより該哺乳動物前立腺特異的膜抗原の該細胞中での発現を検出することを含んでなる方法を提供する。前記で合成された核酸分子を用いて、ＰＳＭ抗原をコードするｍＲＮＡの存在を検出することにより、ＰＳＭまたはＰＳＭ'抗原の発現を検出してもよい。該細胞からの全ｍＲＮＡは、当業者によく知られている種々の方法で単離してもよい。該標識核酸分子のハイブリダイゼーション条件は、当該分野で公知の通常の実験により決定すればよい。該プローブにハイブリダイゼーションしたｍＲＮＡの存在は、ゲル電気泳動または当該分野で公知の他の方法により判定すればよい。得られたハイブリッドの量を測定することにより、該細胞によるＰＳＭ抗原の発現を測定することができる。該標識は放射性のものであってもよい。例えば、核酸の生成時に、１以上の放射性ヌクレオチドを該核酸に取り込ませることができる。
本発明の１つの実施態様では、溶解細胞から沈殿させることにより核酸を抽出し、ｍＲＮＡのポリＡ尾部に結合するオリゴ−ｄＴカラムを用いて該抽出物からｍＲＮＡを単離する（13）。ついで、ニトロセルロース膜上で該ｍＲＮＡを放射性標識プローブにさらすと、該プローブは、相補的ｍＲＮＡ配列とハイブリダイゼーションして、それを標識する。結合は、発光オートラジオグラフィーまたはシンチレーション計数により検出してもよい。しかしながら、これらの工程を行うための他の方法も当業者によく知られており、上記で述べたものは例示にすぎない。
さらに本発明は、組織切片中でのＰＳＭまたはＰＳＭ'抗原の発現を検出するためのもう１つの方法であって、前記組織切片を、ハイブリダイゼーション条件下において、哺乳動物ＰＳＭ抗原をコードする核酸分子配列と特異的にハイブリダイズする能力を有する少なくとも１５ヌクレオチドの標識核酸分子と接触させることと、該分子とハイブリダイゼーションしたｍＲＮＡの存在を判定し、それにより、該組織切片中での哺乳動物ＰＳＭまたはＰＳＭ'抗原の発現を検出することとを含んでなる方法を提供する。該プローブは、種々の生物学的組織中におけるin-situハイブリダイゼーション、当該遺伝子を発現する組織の位置決定、またはこの遺伝子またはそのｍＲＮＡの存在についての他のハイブリダイゼーションアッセイにも有用である。標識核酸分子を用いるin-situハイブリダイゼーションは、当該分野において周知である。本質的には、組織切片を標識核酸分子とインキュベーションしてハイブリダイゼーションを起こさせる。該分子は「標識」されているため、検出用マーカーを保持しているといえる。該ハイブリッドの量は該マーカー量の検出に基づき測定され、ＰＳＭ抗原の発現についても同様である。
さらに本発明は、ＲＮＡ転写のプロモーターに作動可能に結合している単離されたＰＳＭまたはＰＳＭ'抗原核酸分子を提供する。その単離されたＰＳＭまたはＰＳＭ'抗原配列は、ベクター系に結合させることができる。プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター、他のウイルスなどの種々のベクターが、当業者において周知である。さらに本発明は、ＰＳＭまたはＰＳＭ'抗原をコードする単離された核酸分子を含んでなるベクターを提供する。
これらのベクターを得るための一例として、挿入物とベクターＤＮＡとを共に制限酵素にさらして、互いに塩基対形成する相補的末端を両分子上につくり、ついでＤＮＡリガーゼで互いに連結させることができる。あるいは、ベクターＤＮＡ中の制限部位に対応するリンカーを挿入ＤＮＡに連結し、ついでその部位で切断する制限酵素で消化する。他の手段も利用可能であり、これらは当業者に公知である。
１つの実施態様では、pSPORT/ベクター（Gibco −ＢＲＬ）のNot I/SalＩ部位中にＰＳＭ配列をクローニングしする。このプラスミドp55A-PSMは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に基づき１９９２年８月１４日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）,12301, Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A.）に寄託されている。プラスミドp55A-PSMには、ＡＴＣＣ受託番号75294が付与されている。
さらに本発明は、前立腺特異的膜抗原の生物学的活性を有するポリペプチドを製造するための宿主ベクター系を提供する。ＰＳＭ抗原の生物学的活性を有するポリペプチドの産生のための宿主細胞ベクター系を得るために、これらのベクターを適当な宿主細胞中に形質転換してもよい。
発現に必要な調節要素には、ＲＮＡポリメラーゼに結合するプロモーター配列、およびリボソーム結合のための転写開始配列が含まれる。例えば、細菌発現ベクターには、lacプロモーターなどのプロモーター、転写開始のためのシャイン・ダルガルノ配列、および開始コドンAUGが含まれる（14）。同様に、真核発現ベクターには、ＲＮＡポリメラーゼIIのための異種または同種プロモーター、下流ポリアデニル化シグナル、開始コドンAUG、およびリボゾームの脱離のための終結コドンが含まれる。そのようなベクターは、商業的に入手してもよいし、当該分野でよく知られている方法、例えば前記の一般的ベクター構築方法により、該記載配列から組み立ててもよい。発現ベクターは、ＰＳＭ抗原を発現する細胞の生産に有用である。
さらに本発明は、前記の単離されたＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子を提供するものであり、この場合、該宿主細胞は、細菌細胞（例、大腸菌（E. coli））、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞および動物細胞よりなる群から選ばれる。適当な動物細胞には、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃｏｓ細胞、ＣＶ１細胞および種々の一次哺乳動物細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。
さらに本発明は、前立腺特異的膜抗原の生物学的活性を有するポリペプチドの製造法であって、該ポリペプチドの製造を許容する適当な条件下で、ＰＳＭ抗原配列を含有するベクター系の宿主細胞を成長させ、得られたポリペプチドを回収することを含んでなる製造法を提供する。
本発明は、哺乳動物ＰＳＭまたはＰＳＭ'抗原をコードするＤＮＡ分子を含んでなる哺乳動物細胞（例えば、哺乳動物細胞中での発現に適合化されたプラスミドを含んでなる哺乳動物細胞）であって、哺乳動物ＰＳＭ抗原をコードするＤＮＡ分子および該哺乳動物細胞中での該ＤＮＡの発現に必要な調節要素を含んでなり、該調節要素が、該哺乳動物ＰＳＭまたはＰＳＭ'抗原をコードするＤＮＡに対してその発現を許容するように位置することを特徴とする哺乳動物細胞を提供する。
宿主としては種々の哺乳動物細胞を用いてもよく、例えばマウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＬｔＫ−細胞、Ｃｏｓ細胞などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば前記の発現プラスミドを用いて、リン酸カルシウム沈殿法、エレクトロポレーションなどの当該分野で周知の方法により哺乳動物細胞をトランスフェクションしてもよい。あるいは、哺乳動物ＰＳＭ抗原をコードするＤＮＡを、例えばマイクロインジェクションにより哺乳動物中に導入して、哺乳動物ＰＳＭ抗原をコードするＤＮＡ、例えばｃＤＮＡまたはプラスミドを含んでなる哺乳動物細胞を得てもよい。
本発明は、リガンドが哺乳動物前立腺膜抗原に結合するか否かを判定する方法であって、哺乳動物前立腺特異的膜抗原をコードする単離されたＤＮＡ分子を含んでなる哺乳動物細胞と該リガンドとを、該哺乳動物前立腺特異的膜抗原に対するリガンドの結合を許容する条件下で接触させ、それにより、該リガンドが哺乳動物前立腺特異的膜抗原に結合するか否かを判定することを特徴とする方法を提供する。
さらに本発明は、該哺乳動物ＰＳＭまたはＰＳＭ'抗原に結合したリガンドを提供する。
また本発明は、前記方法により同定されたリガンドと、それに結合した細胞障害剤とを含んでなる治療剤を提供する。該細胞障害剤は、放射性同位体であってもよいし毒素であってもよい。放射性同位体または毒素の具体例は、当業者によく知られている。
また本発明は、ヒト患者における前立腺癌のイメージング方法であって、該前立腺癌細胞の細胞表面に結合する能力を有しイメージング剤で標識されている前記方法により同定された少なくとも１つのリガンドを、該リガンドと該細胞表面ＰＳＭまたはＰＳＭ'抗原との複合体の形成を許容する条件下で該患者に投与することを含んでなる方法を提供する。さらに本発明は、ＰＳＭまたはＰＳＭ'抗原リガンドの有効なイメージング剤と医薬上許容しうる担体とを含んでなる組成物を提供する。医薬上許容しうる担体は当業者によく知られている。例えば、そのような医薬上許容しうる担体は生理食塩水であってもよい。
また本発明は、精製されている哺乳動物ＰＳＭおよびＰＳＭ'抗原を提供する。本明細書中で用いる「精製された前立腺特異的膜抗原」なる語は、単離された天然に生じる前立腺特異的膜抗原またはタンパク質（天然に生じる物質と一次、二次および三次コンホメーションおよび翻訳後修飾が同一となるように、天然から精製されているかまたは製造されている）、ならびに一次構造コンホメーション（すなわち、アミノ酸残基の連続配列）を有する非天然に生じるポリペプチドを意味する。そのようなポリペプチドには、誘導体および類似体が含まれる。
本発明は、前立腺特異的膜抗原プロモーターをコードする単離された核酸分子を提供する。１つの実施態様では、該ＰＳＭプロモーターは、少なくとも、図５８Ａ〜５８Ｃに記載の配列を有する。
本発明は、選択的にスプライシングされた前立腺特異的膜抗原プロモーターをコードする単離された核酸分子を提供する。
さらに本発明は、ＰＳＭおよびＰＳＭ'抗原の単離された哺乳動物核酸配列によりコードされるポリペプチドを提供する。
ＰＳＭまたはＰＳＭ'抗原と相互作用する天然リガンドが存在すると考えられており、本発明は、そのような天然リガンドまたはＰＳＭまたはＰＳＭ'抗原に結合しうる他のリガンドを同定する方法を提供する。このリガンドを同定する方法は、ａ）該精製哺乳動物ＰＳＭまたはＰＳＭ'抗原を固体マトリックスに結合させることと、ｂ）リガンドと該精製ＰＳＭまたはＰＳＭ'抗原との結合を許容する条件下において、該結合精製哺乳動物ＰＳＭまたはＰＳＭ'タンパク質を該潜在的リガンドと共にインキュベーションすることと、ｃ）ｂ）で生成したリガンドと結合精製哺乳動物ＰＳＭまたはＰＳＭ'抗原との複合体を洗浄して、非特異的結合体および不純物を除去することと、最後にｄ）該結合精製哺乳動物ＰＳＭまたはＰＳＭ'抗原から該リガンドを溶出することとを含んでなる。タンパク質を固体マトリックスに結合させる技術は、当該分野でよく知られている。潜在的リガンドは、当業者に公知の他の経験的実験により、哺乳動物ＰＳＭまたはＰＳＭ'の構造から推定してもよい。また、結合条件は容易に決定でき、そのような実験を行うためのプロトコールについては、かなり前から十分に記載されている（15）。該リガンド−ＰＳＭ抗原複合体を洗浄し、最後に、該結合リガンドを溶出し特徴づけする。標準的なリガンドの特徴づけの技術は、当該分野でよく知られている。
前記方法を用いて、いずれかの生物学的起源からリガンドを精製してもよい。該細胞中の天然リガンドを精製するためには、細胞溶解物、血清または他の生物学的サンプルを使用して、マトリックス上に結合した哺乳動物ＰＳＭまたはＰＳＭ'抗原と共にインキュベーションする。ついで、前記のとおり、特異的天然リガンドを同定し精製する。
該タンパク質配列情報を用いて抗原領域を同定し、これらの領域に対する抗体を産生させ、前立腺癌にターゲッティングして、該癌のイメージングまたは治療に用いてもよい。
本発明は、哺乳動物ＰＳＭまたはＰＳＭ'抗原のアミノ酸配列に対する抗体を提供する。
本発明は、抗体を産生させるための、ＰＳＭまたはＰＳＭ'抗原上の特異的領域を選択する方法を提供する。該タンパク質配列は、ＰＳＭまたはＰＳＭ' ＤＮＡ配列から決定してもよい。当業者によく知られている方法によりアミノ酸配列を分析して、それらが構成するタンパク質中にそれらが疎水性または親水性領域を作るか否かを判定してもよい。細胞膜タンパク質の場合、細胞膜の脂質二重層中に挿入されているタンパク質部分を疎水性領域が形成し、水性環境中の細胞表面上に親水性領域が位置することがよく知られている。通常、親水性領域は、疎水性領域より免疫原性である。したがって、親水性アミノ酸配列を選び、これを用いて、哺乳動物ＰＳＭ抗原に特異的な抗体を産生させてもよい。例えば、図１６：１〜１１の親水性プロット中に示すヒトＰＳＭ抗原の親水性配列が容易に選択できる。商業的に入手可能な機械を用いて該選択ペプチドを製造してもよい。あるいは、ＤＮＡ、例えばｃＤＮＡまたはその断片をクローニングし、発現させ、得られたポリペプチドを回収し、免疫原として用いてもよい。
これらのペプチドに対するポリクローナル抗体は、該選択ペプチドを用いて動物を免疫することにより産生させてもよい。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を用いて、免疫動物からの抗体産生Ｂ細胞を骨髄腫細胞と融合させ、所望の抗体を産生する得られたハイブリドーマ細胞株を選択することにより製造する。あるいは、当業者に公知のインビトロ技術によりモノクローナル抗体を産生させてもよい。これらの抗体は、生存動物、ヒトにおける、または動物またはヒトから単離した生物学的組織における哺乳動物ＰＳＭ抗原の発現を検出するのに有用である。
１つの実施態様では、ヒトＰＳＭ抗原のペプチドAsp-Glu-Leu-Lys-Ala-Glu（配列番号 ）、Asn-Glu-Asp-Gly-Asn-Glu（配列番号 ）およびLys-Ser-Pro-Asp-Glu-Gly（配列番号 ）を選択する。
さらに本発明は、ペプチドAsp-Glu-Leu-Lys-Ala-Glu（配列番号 ）、Asn-Glu-Asp-Gly-Asn-Glu（配列番号 ）およびLys-Ser-Pro-Asp-Glu-Gly（配列番号 ）に対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。
本発明は、ＰＳＭ抗原に対する抗体またはリガンドおよびそれに結合した細胞障害剤または該腫瘍を殺すプロドラッグを活性化する抗体結合酵素を含んでなる治療剤を提供する。該細胞障害剤は、放射性同位体または毒素のいずれであってもよい。
本発明は、哺乳動物ＰＳＭまたはＰＳＭ'抗体のペプチドに対するモノクローナル抗体を該患者に投与することを含んでなるヒト患者における前立腺癌をイメージングする方法であって、該モノクローナル抗体が、該前立腺癌細胞の細胞表面に結合する能力を有し、かつイメージング剤で標識されており、該投与を、該モノクローナル抗体と該細胞表面前立腺特異的膜抗原との複合体の形成を許容する条件下で行うことを特徴とする方法を提供する。該イメージング剤は、インジウム１１１などの放射性同位体である。
さらに本発明は、ＰＳＭまたはＰＳＭ'抗原に対する抗体とそれに結合した放射性同位体とを含んでなる前立腺癌特異的イメージング剤を提供する。
また本発明は、ＰＳＭまたはＰＳＭ'抗原に対する抗体の有効イメージング量と医薬上許容される担体とを含んでなる組成物を提供する。有効イメージング量を決定する方法は、当業者にはよく知られている。１つの方法は、種々の量の該抗体を用いる力価測定によるものである。
さらに本発明は、生物学的サンプル中の前立腺特異的膜抗原量を測定するためのイムノアッセイであって、ａ）ＰＳＭまたはＰＳＭ'抗原に対する少なくとも１つの抗体と該生物学的サンプルとを接触させて、前記抗体と該前立腺特異的膜抗原との複合体を形成させる工程と、ｂ）前記複合体の量を測定することにより、前記生物学的サンプル中の該前立腺特異的膜抗原量を測定する工程とを含んでなるイムノアッセイを提供する。該生物学的サンプルの１つの具体例は、血清サンプルである。
本発明は、哺乳動物前立腺特異的膜抗原を精製する方法であって、ａ）ＰＳＭまたはＰＳＭ'抗原に対する抗体を固体マトリックスに結合させる工程と、ｂ）前立腺特異的膜抗原を含有する溶解物と共にａ）の結合抗体を、該抗体と前立腺特異的膜とが結合しうる条件下でインキュベーションする工程と、ｃ）該固体マトリックスを洗浄して、不純物を除去する工程と、ｄ）該結合抗体から該前立腺特異的膜抗原を溶出する工程とを含んでなる方法を提供する。
また本発明は、哺乳動物ＰＳＭまたはＰＳＭ'抗原をコードする単離された核酸分子を含んでなるトランスジェニック哺乳動物（ヒトを除く）を提供する。さらに本発明は、哺乳動物前立腺特異的膜抗原をコードするＤＮＡに相補的なアンチセンスＤＮＡを含んでなるゲノムを有するトランスジェニック哺乳動物（ヒトを除く）であって、該アンチセンスＤＮＡから転写されるアンチセンスｍＲＮＡが、前立腺特異的膜抗原をコードするｍＲＮＡと相補的であり、該前立腺特異的抗原をコードするｍＲＮＡとハイブリダイズして、それによりその翻訳を抑制するものであり、該アンチセンスＤＮＡが、該アンチセンスｍＲＮＡに転写されるように位置することを特徴とする動物を提供する。
哺乳動物ＰＳＭまたはＰＳＭ'抗原の生理学的および行動的役割を解明する動物モデル系は、種々の技術により、ＰＳＭまたはＰＳＭ'抗原の発現が増加または減少されているか、あるいは該発現ＰＳＭ抗原のアミノ酸配列が改変されているトランスジェニック動物を作製することにより生産される。これらの技術としては、例えば、１）哺乳動物ＰＳＭまたはＰＳＭ'抗原をコードするＤＮＡの正常または突然変異体を、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションまたは当該分野でよく知られている他の手段により適当な受精胚中へ挿入して、トランスジェニック動物を生産すること（16）、または２）ヒトまたは動物のこれらの遺伝子の突然変異または正常遺伝子と、トランスジェニック動物中の天然遺伝子座との相同的組換え（17）により、これらのＰＳＭまたはＰＳＭ'抗原配列の発現調節または構造を改変させることなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。相同的組換え技術は当該分野でよく知られている。該相同的組換え技術により、天然遺伝子が挿入遺伝子で置換される。したがって、天然ＰＳＭ抗原を発現できないが、例えば組換えにより該動物ゲノム中の天然ＰＳＭ抗原と置き換わった挿入突然変異ＰＳＭ抗原を発現して、該輸送体の発現減少を引き起こす動物の生産に、該相同的組換え技術は有用である。マイクロインジェクションは、該ゲノムに遺伝子を加えるが遺伝子を除去しないため、それ自身のＰＳＭ抗原及び加えられたＰＳＭ抗原を発現してＰＳＭ抗原の過剰発現を引き起こす動物の生産に有用である。
トランスジェニック動物の生産に利用できる１つの手段は、例えばマウスの場合には以下のとおりである。雌マウスを交配し、得られた受精卵をその輸卵管から切り取る。該卵を、Ｍｅ培地（16）などの適当な培地中で保存する。当該分野で周知の方法により、哺乳動物ＰＳＭ抗原をコードするＤＮＡまたはｃＤＮＡをベクターから精製する。該ＤＮＡのコーディング領域と誘導プロモーターとを融合させて、該導入遺伝子の発現を調節するための実験的手段を得てもよい。その代わりにまたはそれに加えて、該導入遺伝子の組織特異的発現を可能にするために、組織特異的調節要素を該コーディング領域に融合してもよい。適当に緩衝化された溶液中の該ＤＮＡを、マイクロインジェクション針（これは、ピペットプラーを用いて毛細管から作製すればよい）中に入れ、注入すべき卵をデプレッションスライドに入れる。該針を該卵の前核中に挿入し、該ＤＮＡ溶液を注入する。ついで該注入卵を偽妊娠マウス（妊娠を維持するために適当なホルモンにより刺激されているが、実際には妊娠していないマウス）の輸卵管中に移すと、そこで、該卵は子宮に進み、着床し、分娩まで発達する。前記のとおり、マイクロインジェクションは、該卵細胞中へＤＮＡを挿入する唯一の方法ではなく、ここでは単に例示のために用いたにすぎない。
ＰＳＭ抗原配列のもう１つの用途は、種々の哺乳動物中の１以上の相同遺伝子を単離することである。それらの１以上の遺伝子は、ＰＳＭ配列からのプローブを用いて、種々の哺乳動物のｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを低い厳密性でスクリーニングすることにより単離することができる。同定された陽性クローンを、当業者によく知られているＤＮＡ配列決定技術によりさらに分析する。例えば、相同性プロービングにより、プロテインセリンキナーゼファミリーのメンバーを検出する。
本発明は、前立腺腫瘍細胞の転移能または前立腺腫瘍成長を抑制またはモジュレーションするか、または前立腺腫瘍細胞を除去する方法であって、５'調節要素に作動可能的に結合した前立腺特異的膜抗原をコードするＤＮＡ分子を対象の腫瘍細胞中へ導入し、この際、該前立腺特異的膜抗原の発現が該調節要素の制御下となるようにし、それにより、前立腺腫瘍細胞の転移能または前立腺腫瘍成長を抑制またはモジュレーションするか、または前立腺腫瘍細胞を除去することを特徴とする方法を提供する。該対象は哺乳動物、特にヒトであってもよい。
１つの実施態様では、５'調節要素に作動可能的に結合した前立腺特異的膜抗原をコードするＤＮＡ分子は、細胞または生物中に挿入された輸送ベクターの一部を形成する。さらに、該ベクターは、前立腺特異的膜抗原を複製し発現する能力を有する。前立腺特異的膜抗原をコードするＤＮＡ分子を、真核または原核細胞のゲノム中へ、または前立腺特異的膜抗原を含有および／または発現する宿主細胞へ組み込むことができる。
さらに、前立腺特異的膜抗原をコードするＤＮＡ分子を、細菌、ウイルス、真菌、動物またはリポソーム輸送ベヒクルにより導入してもよい。他の手段も利用可能であり、当業者に公知である。
さらに、プロモーターまたはエンハンサーに結合した前立腺特異的膜抗原をコードするＤＮＡ分子。いくつかのウイルスベクターは既に記載されており、これらには、ウイルス起源の種々のプロモーターおよび他の調節要素から作製されたベクターが含まれる。プロモーターは、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用する短い配置の核酸配列よりなる。種々の認識配列と該同族体転写因子の細胞濃度との組み合わせが、特定の細胞型において遺伝子が転写される効率を決定する。
適当なプロモーターとしては、例えばウイルスプロモーターなどが挙げられる。ウイルスプロモーターとしては、アデノウイルスプロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、マロニー（Malony）ネズミ白血病ウイルスプロモーター、ネズミ肉腫ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターなどが挙げられる。
さらに、もう１つの適当なプロモーターは熱ショックプロモーターである。さらに、適当なプロモーターはバクテリオファージプロモーターである。適当なバクテリオファージプロモーターとしては、例えば、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ラムダプロモーター、バキュロウイルスプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、適当なプロモーターとしては、動物細胞プロモーター、例えばインターフェロンプロモーター、メタロチオネインプロモーター、免疫グロブリンプロモーターなどが挙げられる。真菌プロモーターも適当なプロモーターである。真菌プロモーターとしては、例えば、ＡＤＣ１プロモーター、ＡＲＧプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＣＹＣ１プロモーター、ＣＵＰプロモーター、ＥＮＯ１プロモーター、ＧＡＬプロモーター、ＰＨＯプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、交配型因子プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに、植物細胞プロモーターおよび昆虫細胞プロモーターも、本明細書中に記載の方法に適している。
本発明は、前立腺腫瘍細胞の転移能または前立腺腫瘍成長を抑制またはモジュレーションするか、または前立腺腫瘍細胞を除去する方法であって、治療用ＤＮＡと結合し５'調節要素に作動可能的に結合した前立腺特異的膜抗原をコードするＤＮＡ分子を対象の腫瘍細胞中へ導入し、それにより、前立腺腫瘍細胞の転移能または前立腺腫瘍成長を抑制またはモジュレーションするか、または前立腺腫瘍細胞を除去することを特徴とする方法を提供する。該対象は哺乳動物、特にヒトであってもよい。
さらに、腫瘍細胞中へ導入する、５'調節要素に作動可能的に結合した前立腺特異的膜抗原をコードするＤＮＡ分子に結合した該治療用ＤＮＡは、サイトカイン、ウイルス抗原またはプロドラッグ活性化酵素をコードしていてもよい。他の手段も利用可能であり、当業者に公知である。
さらに本発明は、５'調節要素に作動可能的に結合した前立腺特異的膜抗原の制御下で哺乳動物前立腺特異的膜抗原をコードする哺乳動物核酸から単離されたＤＮＡ分子を含んでなる前立腺腫瘍細胞を提供する。
本明細書中で用いるＤＮＡ分子には、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡおよびゲノムＤＮＡが含まれる。
本発明は、対象におけるヒト前立腺腫瘍成長または前立腺腫瘍細胞の刺激を予防するための治療用ワクチンであって、その有効量を医薬上許容しうる担体と共に該前立腺細胞へ投与し、それにより該対象における腫瘍成長または腫瘍細胞の刺激を予防することを特徴とするワクチンを提供する。他の手段も利用可能であり、当業者に公知である。
本発明は、対象の血行性微小転移腫瘍細胞を検出する方法であって、（Ａ）前立腺特異的膜抗原プライマーまたは選択的にスプライシングされた前立腺特異的抗原プライマーを用いて、該対象の血液、骨髄またはリンパ節サンプル上でネスティッドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をなうことと、（Ｂ）ＤＮＡ配列決定およびサザン分析により微小転移を確認し、それにより該対象の血行性微小転移腫瘍細胞を検出することとを含んでなる方法を提供する。該対象は哺乳動物、特にヒトであってもよい。
該微小転移腫瘍細胞は前立腺癌であってもよく、該ＤＮＡプライマーは前立腺特異的抗原に由来するものであってもよい。さらに、該対象に有効量のホルモンを同時に投与して、前立腺特異的膜抗原の発現を増加させてもよい。さらに、増殖因子またはサイトカインを単独でまたはホルモンと組み合わせて投与してもよい。サイトカインには、トランスフォーミング増殖因子ベータ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリー、繊維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、インシュリン様増殖因子、Ｂ−神経増殖因子、血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子、インターロイキン−１、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、ＩＬ−６可溶性受容体、インターロイキン７、インターロイキン８、インターロイキン９、インターロイキン１０、インターロイキン１１、インターロイキン１２、インターロイキン１３、アンギオゲニン、ケモカイン、コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、エリトロポエチン、インターフェロン、インターフェロンガンマ、白血病阻害因子、オンコスタチンＭ、プレイオトロフィン、分泌白血球プロテアーゼ阻害剤、幹細胞因子、腫瘍壊死因子、接着分子、可溶性腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明は、トランスフェリンによる分裂促進応答を阻害する方法であって、５'調節要素に作動可能的に結合している前立腺特異的膜抗原をコードするＤＮＡ分子を腫瘍細胞中へ導入することを含んでなり、その遺伝子の発現が多細胞生物内の一定の病理学的効果と直接的に関連しており、該ＤＮＡ分子の導入により、トランスフェリンによる分裂促進応答を阻害することを特徴とする方法を提供する。該腫瘍細胞は前立腺細胞であってもよい。
本発明は、対象の前立腺癌の進行を決定する方法であって、ａ）適当な前立腺組織サンプルを得ることと、ｂ）該前立腺組織サンプルからＲＮＡを抽出することと、ｃ）該ＲＮＡ上でＲＮアーゼプロテクションアッセイを行い、それにより、二重らせんＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成させることと、ｄ）該組織サンプル中のＰＳＭおよびＰＳＭ'の量を検出することと、ｅ）ＰＳＭ／ＰＳＭ'腫瘍指数を計算し、それにより該対象の前立腺癌の進行を決定することとを含んでなる方法を提供する。前記検出方法と組み合わせて、in-situハイブリダイゼーションを行ってもよい。
本発明は、対象の前立腺癌を検出する方法であって、（ａ）対象から前立腺組織サンプルを得ることと、（ｂ）該組織サンプルを処理して、該前立腺組織サンプル中に存在する核酸分子を別々に回収することと、（ｃ）得られた核酸分子を、ハイブリダイゼーション条件下で該組織サンプルと特異的にハイブリダイゼーションする能力を有する複数の一本鎖標識オリゴヌクレオチドプライマー対と接触させることと、（ｄ）プライマー対がハイブリダイズするいずれかの核酸分子を増幅して、二本鎖増幅産物を得ることと、（ｅ）いずれかの該二本鎖増幅産物を処理して、それから一本鎖核酸分子を得ることと、（ｆ）いずれかの得られた一本鎖核酸分子を、それぞれ同じ標識を含有しハイブリダイゼーション条件下で該組織サンプルと特異的にハイブリダイゼーションする能力を有する複数の一本鎖標識オリゴヌクレオチドプローブと接触させることと、（ｇ）いずれかの得られたハイブリッドを、マーカーが結合しており該標識プローブと複合体を特異的に形成する能力を有する抗体と接触させること（該複合体中に該プローブが存在する場合、複合体形成条件下）と、（ｈ）対象中の前立腺癌を示すいずれかの得られた複合体の存在を検出することとを含んでなる方法を提供する。
本発明は、前立腺癌の診断または治療のために、前立腺組織における抗体に基づくＰＳＭまたはＰＳＭ'の標的化を強化する方法であって、ＰＳＭまたはＰＳＭ'発現のアップレギュレーションを起こすのに十分な量のｂ−ＥＧＦを患者に投与することを含んでなる方法を提供する。
本発明は、前立腺癌の診断または治療のために、前立腺組織における抗体に基づくＰＳＭまたはＰＳＭ'の標的化を強化する方法であって、ＰＳＭまたはＰＳＭ'発現のアップレギュレーションを起こすのに十分な量のＴＧＦを患者に投与することを含んでなる方法を提供する。
本発明は、前立腺癌の診断または治療のために、前立腺組織における抗体に基づくＰＳＭまたはＰＳＭ'の標的化を強化する方法であって、ＰＳＭまたはＰＳＭ'発現のアップレギュレーションを起こすのに十分な量のＥＧＦを患者に投与することを含んでなる方法を提供する。
本発明は、ＰＳＭまたは選択的にスプライシングされたＰＳＭの有効量と担体または希釈剤とを含んでなる医薬組成物を提供する。さらに本発明は、対象、好ましくはヒトに該医薬組成物を投与する方法を提供する。さらに本発明は、ＰＳＭまたは選択的にスプライシングされたＰＳＭの一定量と担体または希釈剤とを含んでなる組成物を提供する。特に、本発明は食品添加物として使用してもよい。
該組成物は、剤形に適合する態様で治療的有効量を投与する。投与を要する有効成分の正確な量は臨床家の判断にゆだねられ、それぞれの対象に特有である。
適当な初回投与およびブースター投与の計画も特に限定されるものではないが、典型的には、初回投与の後、連続注射または他の投与により１時間以上の間隔での反復投与を行う。
本明細書中で用いる投与とは、対象へ投与する方法を意味する。そのような方法は当業者によく知られており、例えば、局所的、非経口的、経口的、静脈内、筋内、皮下またはエアロゾルによる投与などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＰＳＭの投与は、連続的または断続的に行ってもよい。
本発明の医薬処方または組成物は、固体、半固体または液体（例、懸濁液、エアロゾルなど）の剤形であってもよい。好ましくは、該組成物は、正確な投与量の一回投与に適した単位投与形で投与する。また該組成物は、所望の処方に応じて、動物またはヒトに対する投与のための医薬組成物を処方するのに一般に使用される賦形剤と定義される医薬上許容される無毒性担体または希釈剤を含んでいてもよい。該希釈剤は、該組み合わせの生物学的活性に影響を及ぼさないように選ぶ。そのような希釈剤としては、例えば、蒸留水、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、ハンクス液などが挙げられる。さらに、該医薬組成物または処方は、他の担体、補助剤または無毒性、非治療的、非免疫原性安定剤などを含んでいてもよい。そのような希釈剤または担体の有効量は、成分の安定性または生物学的活性などの点で医薬上許容される処方を得るのに有効な量である。
本発明は、以下の実験の部の説明からさらに明らかとなるであろう。しかしながら、当業者であれば、記載されている特定の方法および結果は、後に続く請求の範囲でより完全に記載される本発明の例示にすぎないと容易に理解するであろう。
実験の詳細
実施例１
＜材料および方法＞：
該遺伝子をクローニングするためのアプローチには、免疫沈降法による該抗原の精製、およびポリメラーゼ連鎖反応（19, 20）で後で用いる縮重オリゴヌクレオチドプライマーの合成に使用するためのいくつかの内部ペプチドのミクロシークエンシングが必要とされた。部分ｃＤＮＡをＰＣＲ生成物として増幅し、これを相同性プローブとして使用して、ＬＮＣａＰ（前立腺のリンパ節癌）細胞株ｃＤＮＡプラスミドライブラリー（8）から完全長ｃＤＮＡ分子をクローニングした。
ＰＳＭ抗原のウエスタン分析：
低張性溶解の後、ショ糖密度勾配上で遠心分離を行うことにより、膜タンパク質を細胞から単離した（21）。１０〜２０μgのＬＮＣａＰ、ＤＵ−１４５およびＰＣ−３膜タンパク質を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離ゲルおよび４％濃縮用ゲル中、９〜１０ミリアンペアで１６〜１８時間電気泳動した。タンパク質をトランスファーバッファー（４８mMトリス塩基、３９mMグリシン、２０％メタノール）中、２５ボルト、４℃で一晩、ＰＶＤＦ膜（Millipore Corp.）にエレクトロブロットした。膜をＴＳＢ（０.１５M ＮaＣl、０.０１Ｍトリス塩基、５％ＢＳＡ）中で３０分間、室温でブロッキングし、ついで１０〜１５μg/mlのＣＹＴ−３５６モノクローナル抗体（Cytogen Corp.）と共に２時間インキュベートした。ついで、膜を１０〜１５μg/mlのウサギ抗マウス免疫グロブリン（Accurate Scientific）と共に室温で１時間インキュベートし、ついで１２５Ｉ−プロテインＡ（AmershamＴＭ）と共に１×１０６cpm/mlで室温でインキュベーションした。ついで膜を洗浄し、−７０℃で１２〜２４時間オートラジオグラフィーに付した（図１）。
ＰＳＭ抗原発現の免疫組織化学的分析：
免疫組織化学的検出のアビジン−ビオチン法を用いて、ＰＳＭ抗原発現に関してヒト組織切片および細胞株の両方を分析した（22）。クリオスタット切断前立腺組織切片（４〜６μm厚）をメタノール／アセトン中で１０分間固定した。ガラススライド上で、５０,０００細胞／１００μl／スライドを用いて細胞サイトスピン（cytospin）を作製した。あらゆる内因性ペルオキシダーゼ活性を除去するために、サンプルをＰＢＳ中１％過酸化水素で１０〜１５分間処理した。組織切片をＰＢＳ中で数回洗浄し、ついで適切なサプレッサー血清と共に２０分間インキュベーションした。該サプレッサー血清を排出し、ついで該切片または細胞を、該希釈ＣＹＴ−３５６モノクローナル抗体と共に１時間インキュベーションした。ついでサンプルをＰＢＳで洗浄し、第２抗体（ウマまたはヤギ免疫グロブリン、１：２００希釈、３０分間）およびアビジン−ビオチン複合体（１：２５希釈、３０分間）と順次インキュベーションした。色素原としてＤＡＢを使用し、ついでヘマトキシリン対比染色し、封入した。それぞれの実験では、２通りの細胞サイトスピンおよび前立腺サンプルの凍結切片を対照として用いた。陽性対照として、前記と同じ方法に従い、抗サイトケラチンモノクローナル抗体ＣＡＭ５.２を使用した。組織切片は、該細胞の少なくとも５％が免疫反応性を示せば、ＰＳＭ抗原を発現するとみなした。得点系は、以下のとおりである：１＝＜５％、２％＝５〜１９％、３＝２０〜７５％、および４＝＞７５％陽性細胞。同質性対異質性は、陽性および陰性細胞を３〜５の高性能光学顕微鏡視域（４００×）で評価し、１００〜５００個の細胞中の陽性細胞の割合を記録することにより計数した。免疫染色の強度は、１＋〜４＋の範囲で評価し、陽性対照に対して、１＋は穏やか、２〜３＋は適度、および４＋は強力な免疫染色を表すこととした。
ＰＳＭ抗原の免疫沈降法：
１００mmペトリ皿中の８０％集密性のＬＮＣａＰ細胞を、メチオニンを含まないＲＰＭＩ培地中において２時間飢餓状態にし、ついで３５Ｓ−メチオニンを１００μCi/mlで加え、該細胞をさらに１６〜１８時間増殖させた。ついで、細胞を洗浄し、４℃で２０分間インキュベーションしながら、１mlの溶解緩衝液（１％トリトンＸ−１００、５０mMヘペス，pＨ７.５、１０％グリセロール、１５０mM ＭgＣl２、１mM ＰＭＳＦおよび１mM ＥＧＴＡ）を加えることにより該細胞を溶解した。溶解物を、４℃で９０分間、パンソルビンセル（PansorbinＴＭ cells； CalbiochemＴＭ）と混合することにより前清澄化した。ついで細胞溶解物を、４℃で３〜４時間、ＣＹＴ−３５６抗体（Cytogen Corp.）およびＲＡＭ抗体（Accurate Scientific）に前結合させたプロテインＡセファロース ＣＬ−４Ｂビーズ（PharmaciaＴＭ ）と混合した。ペトリ皿当たり３mgのビーズ当たり１２μgの抗体を使用した。ついでビーズをＨＮＴＧ緩衝液（２０mMヘペス, pＨ７.５、１５０mM ＮaＣl、０.１％トリトンＸ−１００、１０％グリセロールおよび２mMオルトバナジン酸ナトリウム）で洗浄し、β−メルカプトエタノールを含有するサンプル添加緩衝液中に再懸濁し、９５℃で５〜１０分間変性させ、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよび４％濃縮用ゲル上、１０ミリアンペアで一晩移動させた。ゲルをクーマシーブルーで染色し、酢酸／メタノールで脱染し、真空乾燥機中６０℃で乾燥した。ついでゲルを−７０℃で１６〜２４時間オートラジオグラフィーに付した（図２Ａ〜２Ｄ）。
免疫沈降法およびペプチド配列決定：
約６×１０７のＬＮＣａＰ細胞を含有する８個の集密化したペトリ皿を用いて、免疫沈降のための前記方法を繰り返した。該免疫沈降産物をプールし、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの２つのレーンに添加し、９〜１０ミリアンペアで１６時間電気泳動した。タンパク質を、トランスファーバッファー中、７５ボルト、４℃で２時間、ニトロセルロースＢＡ−８５膜（Schleicher and Schuell ＴＭ ）上にエレクトロブロットした。膜をポンソーレッドで染色して、該タンパク質を可視化し、その１００kDタンパク質のバンドを切り出し、可溶化し、トリプシンでタンパク質分解的に消化した。ついで、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）１７１Ｃ型を用いて、該消化サンプルのＨＰＬＣを行い、明らかな主ペプチドピ−クを選び、改変ポストリキッド（post liquid）アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）４７７Ａ型タンパク質／ペプチドミクロシークエンサー上の改変エドマン分解により配列決定した（23）。該ペプチドのすべての配列決定データが本明細書中に含まれている。ＰＳＭ抗原を免疫沈降法により精製し、エレクトロブロッティングによりＰＶＤＦ膜（Millipore ）へ移すことを含む同様の方法により、ＰＳＭ抗原のアミノ末端を配列決定した。タンパク質を、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）４７７Ａ型タンパク質／ペプチドシークエンサー上で分析したところ、該アミノ末端がブロックされていることが判明し、したがって、この技術により配列データを得ることはできなかった。
ＰＳＭ抗原ペプチド配列：
2T17 #5 SLYES(W)TK（配列番号）
2T22 #9 (S)YPDGXNLPGG(g)VQR（配列番号）
2T26 #3 FYDPMFK（配列番号）
2T27 #4 IYNVIGTL(K)（配列番号）
2T34 #6 FLYXXTQIPHLAGTEQNFQLAK（配列番号）
2T35 #2 G/PVILYSDPADYFAPD/GVK（配列番号）
2T38 #1 AFIDPLGLPDRPFYR（配列番号）
2T46 #8 YAGESFPGIYDALFDIESK（配列番号）
2T47 #7 TILFAS(W)DAEEFGXX(q)STE(e)A(E)...（配列番号）
注：Ｘは、この位置で残基を同定できなかったことを意味する。大文字は同定結果を示すが、信頼性は低い。（小文字）は、存在するが非常に低レベルである残基を意味する。...は、配列が続くが検出限界未満であることを示す。
翻訳Genbankコンピューターデータベースの完全ホモロジー検索の後、これらのペプチド配列はすべてユニークであることが確認された。
縮重（degenerate）ＰＣＲ：
前記ペプチドの部分に対応する長さのセンスおよびアンチセンス５'−非リン酸化縮重オリゴヌクレオチドプライマーの１７〜２０ヌクレオチドを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）３９４Ａ型ＤＮＡシンセサイザー上で合成した。これらのプライマーは、３２〜１４４の縮重を有する。使用したプライマーを以下に示す。該ペプチド中の下線を付したアミノ酸は、プライマー設計で使用した残基を示す。
ペプチド３： FYDPMFK（配列番号 ）
ＰＳＭプライマー「Ａ」 TT(CまたはT) - TA (CまたはT) - GA (CまたはT) - CCX - ATG - TT （配列番号 ）
ＰＳＭプライマー「Ｂ」 AAC -ATX - GG(AまたはG) - TC(AまたはG) - TA(AまたはG) - AA（配列番号 ）
プライマーＡはセンスプライマーであり、Ｂはアンチセンスである。縮重は３２倍である。
ペプチド４： IYNVIGTL(K)（配列番号６）
ＰＳＭプライマー「Ｃ」 AT(TまたはCまたはA) - TA(TまたはC) - AA(TまたはC) - GTX - AT(TまたはCまたはA) - GG（配列番号 ）
ＰＳＭプライマー「Ｄ」 CC(AまたはTまたはG) - ATX - AC(GまたはA) - TT(AまたはG) - TA(AまたはGまたはT) - AT（配列番号 ）
プライマーＣはセンスプライマーであり、Ｄはアンチセンスプライマーである。縮重は１４４倍である。
ペプチド２： G/PVILYSDPADYFAPD/GVK（配列番号 ）
ＰＳＭプライマー「Ｅ」 CCX - GCX - GA(TまたはC) - TA(TまたはC) - TT(TまたはC) - GC（配列番号 ）
ＰＳＭプライマー「Ｆ」 GC(GまたはA) - AA(AまたはG) - TA(AまたはG) - TXC - GCX - GG（配列番号 ）
プライマーＥはセンスプライマーであり、Ｆはアンチセンスである。縮重は１２８倍である。
ペプチド６： FLYXXTQIPHLAGTEQNFQLAK（配列番号 ）
ＰＳＭプライマー「Ｉ」 ACX - GA(AまたはG) - CA(AまたはG) - AA(TまたはC) - TT(TまたはC) - CA(AまたはG) - CT（配列番号 ）
ＰＳＭプライマー「Ｊ」 AG - (TまたはC)TG - (AまたはG)AA - (AまたはG)TT - (TまたはC)TG - (TまたはC)TC - XGT（配列番号 ）
ＰＳＭプライマー「Ｋ」 GA(AまたはG) - CA(AまたはG) - AA(TまたはC) - TT(TまたはC) CA(AまたはG) - CT（配列番号 ）
ＰＳＭプライマー「Ｌ」 AG - (TまたはC)TG - (AまたはG)AA - (AまたはG)TT - (TまたはC)TG - (TまたはC)TC（配列番号２２）
プライマーＩおよびＫはセンスプライマーであり、ＪおよびＬはアンチセンスである。ＩおよびＪは１２８倍の縮重を有し、ＫおよびＬは３２倍の縮重を有する。
ペプチド７： TILFAS(W)DAEEFGXX(q)STE(e)A(E)...（配列番号 ）
ＰＳＭプライマー「Ｍ」 TGG - GA(TまたはC) - GCX - GA(AまたはG) - GA(AまたはG) - TT(CまたはT) - GG（配列番号 ）
ＰＳＭプライマー「Ｎ」 CC - (GまたはA)AA - (TまたはC)TC - (TまたはC)TC - XGC - (AまたはG)TC - CCA（配列番号 ）
ＰＳＭプライマー「Ｏ」 TGG - GA(TまたはC) - GCX - GA(AまたはG) - GA(AまたはG) - TT（配列番号 ）
ＰＳＭプライマー「Ｐ」 AA - (TまたはC)TC - (TまたはC)TC - XGC - (AまたはG)TC - CCA（配列番号 ）
プライマーＭおよびＯはセンスプライマーであり、ＮおよびＰはアンチセンスである。ＭおよびＮは６４倍の縮重を有し、ＯおよびＰは３２倍の縮重を有する。
パーキンエルマー（Perkin-Elmer）４８０型ＤＮＡサーマルサイクラー（thermal cycler）を用いて縮重ＰＣＲを行った。該ＰＣＲ用のｃＤＮＡ鋳型は、オリゴｄＴクロマトグラフィー（Collaborative Research）の標準的な方法により単離済みのＬＮＣａＰ ｍＲＮＡから調製した。該ｃＤＮＡ合成は以下のとおりに行った。
４.５μl ＬＮＣａＰポリＡ＋ ＲＮＡ（２μg）
１.０μl オリゴｄＴプライマー（０.５μg）
４.５μl ｄＨ ２ Ｏ
１０μl
６８℃×１０分間のインキュベーション。
氷上×５分間で急速冷却。
添加：
４μl ５×ＲＴ緩衝液
２μl ０.１M ＤＴＴ
１μl １０mM ｄＮＴＰｓ
０.５μl ＲＮアシン（Promega）
１.５μl ｄＨ ２ Ｏ
１９μl
３７℃で２分間インキュベーション。
１μlのスーパースクリプト（SuperscriptＴＭ ）逆転写酵素
（GibcoＴＭ -BRL）
３７℃で１時間インキュベーション。
３０μl ｄＨ２Ｏを添加。
ＰＣＲ反応毎に２μlを使用。
縮重ＰＣＲ反応は、アニーリング温度、Ｍg＋＋濃度、プライマー濃度、緩衝液組成、伸長回数およびサイクル数を変化させることにより最適化した。最適なサーマルサイクラープロフィールは、９４℃×３０秒の変性、４５〜５５℃で１分間（使用するプライマーの平均Ｔｍに依存する）のアニーリング、および７２℃で２分間の伸長であった。
５μl １０×ＰＣＲ緩衝液*
５μl ２.５mM ｄＮＴＰ混合物
５μl プライマー混合物（センスおよびアンチセンスプライマーのそれぞれの０.５〜１.０μgを含有）
５μl １００mM β−メルカプトエタノール
２μl ＬＮＣａＰ ｃＤＮＡ鋳型
５μl ２５mM ＭgＣl２（２.５mM 最終）
２１μl ｄＨ２Ｏ
２μl 希釈Taqポリメラーゼ（０.５U/μl）
５０μlの合計容量
管に６０μlの軽鉱油を重層し、３０サイクル増幅した。各サンプル５μlを２〜３％アガロースゲル上で電気泳動し、ついで臭化エチジウムで染色し写真撮影することにより、ＰＣＲ生成物を分析した。
* １０×ＰＣＲ緩衝液
１６６mM ＮＨ４ＳＯ４
６７０mM トリス, pＨ８.８
２mg/ml ＢＳＡ
ＰＣＲ生成物を示す代表的な写真を図５に示す。
ＰＣＲ生成物のクローニング：
これらのＰＣＲ生成物をさらに分析するために、「ＴＡクローニング」（InvitrogenＴＭ Corp.）を用いてこれらの産物を適切なプラスミドベクター中にクローニングした。ここで用いたクローニング戦略では、伸長するＴ残基を該挿入部位に有するプラスミドベクター中にＰＣＲ生成物を直接連結するが、これは、伸長するＡ残基をTaqポリメラーゼが該ＰＣＲ生成物の末端に残すという事実を利用している。該連結混合物をコンピテントな大腸菌（E. coli）細胞中に形質転換し、得られたコロニーを成長させ、プラスミドＤＮＡをアルカリ溶解法（24）により単離し、制限分析によりスクリーニングした（図６Ａ〜６Ｂ）。
ＰＣＲ生成物のＤＮＡ配列決定：
ついでＰＣＲ生成物のＴＡクローンを、シークエナーゼ（U.S. Biochemical）を用いるジデオキシ法（25）により配列決定した。各プラスミドＤＮＡ３〜４μgをＮaＯＨで変性させ、エタノール沈殿させた。製造業者の推奨に従い、３５Ｓ−ＡＴＰを用いて標識反応を行い、同じプロトコールに従い該反応を停止した。ついで配列決定産物を、ＩＢＩ配列決定装置を用いて６％ポリアクリルアミド／７M 尿素ゲル上で分析した。ゲルを１２０ワットで２時間泳動させた。電気泳動後、該ゲルを１０％メタノール／１０％酢酸中で１５〜２０分間固定し、ワットマン３ＭＭ紙に移し、バイオラッド（BioradＴＭ ）真空乾燥機中、８０℃で２時間乾燥した。ついでゲルを室温で１６〜２４時間オートラジオグラフィーに付した。該ＰＣＲ生成物が正しいクローンであるか否かを判定するために、該分子の５'および３'末端で得られた配列を、正しいプライマー配列、および該プライマーの設計で未使用のペプチド部分に対応する隣接配列に関して分析した。
ＩＮ−２０は正しく、ＰＳＭ遺伝子の部分ｃＤＮＡを示すことが確認された。このＰＣＲ反応では、ＩおよびＮプライマーを使用した。Ｉプライマーから読み取れるＤＮＡ配列は、
ACG GAG CAA AAC TTT CAG CTT GCA AAG（配列番号）
T E Q N F Q L A K （配列番号）
であった。下線を付したアミノ酸は、このセンスプライマーを設計するのに使用したペプチド６の一部分であり、該ペプチド内に存在するアミノ酸と合致する残りのアミノ酸は、該分子のこの末端が正しいタンパク質（ＰＳＭ抗原）を示すことを証明するものである。
該分子のもう一方の末端を、Ｎプライマーから読み取ることにより分析したところ、該アンチセンス配列は、
CTC TTC GGC ATC CCA GCT TGC AAA CAA AAT TGT TCT（配列番号）
であり、センス（相補的）配列は、
AGA ACA ATT TTG TTT GCA AGC TGG GAT GCC AAG GAG（配列番号）
R T I L F A S W D A E E （配列番号）
であった。ここで下線を付したアミノ酸は、プライマーＮを作製するのに使用したペプチド７の一部分を示す。ＩＮ−２０クローン中、このプライマーの上流のアミノ酸はすべて正しく、ペプチド７中に見いだされるアミノ酸と合致する。さらに、ＤＮＡ配列決定を行った結果、該陽性クローン内のＤＮＡ配列中の他のＰＳＭペプチドの存在を同定することが可能となった。
ゲンバンク(Genbank)コンピューターデータベース上でスクリーニングしたところ、この部分ｃＤＮＡのＤＮＡ配列はユニークであることが判明した。
ｃＤＮＡライブラリーの構築および完全長ＰＳＭｃＤＮＡのクローニング：
スーパースクリプト（SuperscriptＴＭ ）プラスミド系（BRLＴＭ -Gibco）を用いて、ＬＮＣａＰ ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを構築した。該ライブラリーを、コンピテントなＤＨ５−α細胞を用いて形質転換し、ＬＢおよび１００μg/mlカルベニシリンを含有する１００mmプレート上に播種した。プレートを３７℃で一晩成長させ、ニトロセルロースフィルターにコロニーを移した。グルンシュタイン(Grunstein)およびホグネス(Hogness)（26）に従い、フィルターを加工し、ランダムプライミング（27）により３２Ｐ−ｄＣＴＰで放射能標識した１.１kbの部分ｃＤＮＡ相同性プローブを用いてスクリーニングした。８個の陽性コロニーを得、ＤＮＡ制限および配列決定分析に付したところ、それは、ＰＳＭ抗原をコードする完全長ｃＤＮＡ分子を示すことが判明した。図７に示すのは、該ライブラリー中に提示されるｃＤＮＡ分子のサイズを示すオートラジオグラムである。図８には、いくつかの完全長クローンの制限分析を示す。図９は、図８中のサンプルのプラスミドサザン分析であり、それらがすべて１.１kb部分ｃＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションすることを示す。
該ｃＤＮＡおよび該抗原は共に、ゲンバンク(Genbank)コンピューターデータベースによりスクリーニングされており（ヒトゲノムプロジェクト）、ユニークであることが判明している。
ＰＳＭ遺伝子発現のノーザン分析：
ＰＳＭ遺伝子のノーザン分析（28）により、発現は前立腺および前立腺癌に限定されることが示された。
ＲＮＡサンプル（全ＲＮＡ１０μgまたはポリＡ+ ＲＮＡ２μgのいずれか）を変性させ、１.１％アガロース／ホルムアルデヒドゲル中、６０ミリアンペアで６〜８時間電気泳動した。ついで、１０×ＳＳＣ中、ポシ・ブロッター（Posi-blotter）（StratageneＴＭ）を用いる圧力ブロッティングにより、ＲＮＡをナイトラン（NytranＴＭ）ナイロン膜（Schleicher and SchuellＴＭ）に移した。ＲＮＡを、ストラタリンカー（Stratalinker）（Stratagene ＴＭ）を用いて膜へクロスリンキングし、ついで真空オーブン中８０℃で２時間焼いた。ブロットを、プレハイブリダイゼーション溶液（BRLＴＭ）中、６５℃で２時間プレハイブリダイズし、ついで、１〜２×１０６cpm/mlの３２Ｐ−標識ランダムプライムドｃＤＮＡプローブを含有するハイブリダイゼーション緩衝液（BRLＴＭ）中、１６時間ハイブリダイズした。膜を、１×ＳＳＰＥ／１％ＳＤＳ中で２回、０.１×ＳＳＰＥ／１％ＳＤＳ中で２回洗浄（４２℃）した。ついで、膜を風乾し、−７０℃で１２〜３６時間オートラジオグラフィーに付した。
ヒト前立腺組織におけるＰＳＭ遺伝子発現のＰＣＲ分析：
１５個のヒト前立腺サンプル上でＰＣＲを行って、ＰＳＭ遺伝子発現を測定した。それぞれ正常前立腺組織、良性前立腺過形成および前立腺癌からの５個のサンプルを使用した（組織はMSKCC Pathology Departmentにより確認された）。
第IV節に既に記載したとおりに、各サンプルからの全ＲＮＡの１０μgを逆転写してｃＤＮＡ鋳型を作製した。使用したプライマーは、１.１kbの部分ｃＤＮＡ（ＩＮ−２０）の５'および３'末端に対応し、したがって、増幅されたバンドの予想サイズは１.１kbである。該プライマーのＴｍは６４℃であるため、ＰＣＲプライマーを６０℃でアニーリングさせた。第IV節に既に記載しているのと同じ条件を用いて、３５サイクルでＰＣＲを行った。
ＬＮＣａＰおよびＨ２６ − ＲａｓトランスフェクションＬＮＣａＰ（29）が陽性対照として、ＤＵ−１４５が陰性対照として含まれていた。明らかに、１４／１５個のサンプルが１.１kbのバンドを増幅し、したがって該遺伝子を発現した。
＜実験結果＞
１００kDのＰＳＭ抗原をコードする遺伝子を同定した。完全なｃＤＮＡ配列を配列番号１に示す。その核酸配列の真下に、推定翻訳アミノ酸配列を示す。該アミノ酸の総数は７５０である（配列番号２）。該推定タンパク質配列の親水性を図１６：１〜１１に示す。図１７Ａ〜１７Ｃに示すのは、親水性の最高点を有する３つのペプチドである。それらは、Asp-Glu-Leu-Lys-Ala-Glu（配列番号）、Asn-Glu-Asp-Gly-Asn-Glu（配列番号）およびLys-Ser-Pro-Asp-Glu-Glyである。
クライン(Klein), カネイシ(Kanehisa)およびデリシ(Delisi)の方法により、特異的膜伸長ドメインを同定する。該配列は、第１９アミノ酸から第４４アミノ酸：Ala-Gly-Ala-Leu-Val-Leu-Aal-Gly-Gly-Phe-Phe-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Phe（配列番号）である。
この推定膜伸長ドメインをPC Gene（コンピューターソフトウェアプログラム）上で計算した。前立腺癌の標的化およびイメージングに使用する抗体を設計するのに助けとなるＰＳＭ抗原の内部および外部膜ドメインを予想することが、このデータから可能となる。
ＰＳＭ抗原配列をジーンバンク(GeneBank)の他の公知配列と比較したところ、該ＰＳＭ抗原配列とトランスフェリン受容体配列との間の相同性が見いだされた。該データを図１８に示す。
＜実験の考察＞
ＰＳＭ抗原の潜在的用途：
１．腫瘍検出：
顕微鏡的：
種々の抗原に対するプローブを使用することにより、はっきりと腫瘍を明示することができる。前立腺癌には、ＰＳＭ抗原プローブが有益と考えられる。したがって、ＰＳＭは診断用に使用でき、本出願人らがクローニングしたｃＤＮＡのコーディング領域由来のセンス（対照）およびアンチセンスプローブを用いるin-situハイブリダイゼーションにより、これを顕微鏡的レベルで行うことができる。これは、局所的前立腺外拡張、リンパ節、骨または他の転移部位の関連性の評価に使用することができる。骨転移は前立腺癌の大きな問題であるため、特に病期分類のためには、転移拡張の初期検出が必要である。いくつかの腫瘍では、骨髄中の腫瘍細胞が検出されれば厳しい予後が予想され、転移に向けた介入を試みることが提案される。骨髄吸引液または切片におけるＰＳＭ抗原発現の検出から、そのような初期情報が得られるかもしれない。ＰＣＲ増幅またはin-situハイブリダイゼーションを行ってもよい。ＲＴ−ＰＣＲにより、血行性転移による循環中の細胞を検出することができる。
２．抗原部位の同定
該抗原のｃＤＮＡを知ることにより、該抗原の特異的アミノ酸配列に対して用いる抗体の産生用の優れた抗原として機能する領域が同定される。そのような配列は、ＰＳＭ抗原の外部、膜または内部などの種々の領域に存在するかもしれない。これらの特異的抗体を産生させれば、該抗原を免疫組織化学的に同定できるであろう。したがって、これらの誘導抗体を、特に、免疫診断に最も有用なパラフィン固定切片および凍結切片中で働く抗体用に開発できるであろう。
３．制限断片長多型およびゲノムＤＮＡ
制限断片長多型（ＲＦＬＰＳ）は、発癌イニシエーションおよびプロモーション中に生じる遺伝的損傷の進行を示すのに有用であることが判明している。ＰＳＭ配列制限マッピング中の変化が前立腺腫瘍のリスクまたは悪性潜在性または進行の素因の証拠を与えることが、ＰＦＬＰ分析から示されるかもしれない。
ＰＳＭ抗原の染色体位置により、ＰＳＭ抗原遺伝子は、染色体分析のための有用な染色体位置マーカーとして機能するかもしれない。
４．血清
抗原特異的抗体を産生させることにより、該抗原または選択抗原断片が血清中に出現すれば、それらは転移疾患の存在についての血清マーカーを与え、単独または他の前立腺特異的マーカーと併用して有用と考えられる。
５．イメージング
エキソフェイシャル（exofacial）表面上のタンパク質の大部分を有する膜伸長タンパク質の特徴を該抗原が有することが該ｃＤＮＡ配列から暗示されるため、該腫瘍に露出し該腫瘍に特異的なペプチド断片に対する抗体、特にモノクローナル抗体により、転移腫瘍または前立腺切除術または照射後の残存腫瘍の腫瘍イメージング局所拡張が得られるかもしれない。コーディング領域を知ることによりモノクローナル抗体の産生が可能となり、これらを併用して最大のイメージング目的を達成することができる。該抗原はトランスフェリン受容体とｃＤＮＡ分析に基づく類似性（約５４％）を共有するため、この抗原に対する特異的な正常リガンドが存在し、該リガンドの同定から別のイメージング手段が得られるかもしれない。
６．リガンドの単離
ＰＳＭ抗原は、それに結合する正常リガンドの単離に使用することができる。特異性に依存するこれらのリガンドを標的化に使用してもよいし、あるいは、それらの血清レベルは病態の予想に有用かもしれない。ＰＳＭに対する正常リガンドが担体分子だとわかれば、ＰＳＭを治療目的でそのリガンドに結合させるのに用いて（鉄キレート物質のように）、循環から該リガンドを除去する助けとなるかもしれない。該リガンドが腫瘍成長または転移を促進するならば、可溶性ＰＳＭ抗原を与えることにより、該リガンドが前立腺に結合できなくなるであろう。ＰＳＭ抗原構造の知見は、同じ目的で機能しうるリガンドに結合する小断片を得るのに有用であろう。
７．治療的用途
ａ）リガンド。ＰＳＭ抗原のｃＤＮＡの構造がトランスフェリン受容体と構造的相同性を共有する（核酸レベルで５４％）という知見は、トランスフェリン様であるかそうでない受容体に対する内因性リガンドが存在する可能性を暗示する。トランスフェリンは、トランスフェリン受容体に結合した後、細胞中へ鉄を輸送するリガンドだと考えられている。しかしながら、アポトランスフェリンは、トランスフェリン受容体を発現するいくつかの細胞の増殖因子だと報告されている（30）。トランスフェリンがこの抗原のリガンドなのか、あるいは、何らかの他のリガンドがこのリガンドに結合するのかは明らかではない。リガンドが同定されれば、該リガンドにより金属イオン（鉄、亜鉛など）などの特異的物質を該腫瘍中へ運ばせてもよく、したがって、該リガンドは、毒性物質（放射性または細胞障害性化学物質、すなわち毒素、例えばリシンまたは細胞障害性アルキル化剤または細胞障害性プロドラッグ）を該腫瘍へ輸送する手段として使用しうる。
前立腺癌の主要転移部位は骨である。骨および骨支質はトランスフェリンに富む。この微環境が骨における前立腺転移に対してまさに「温床」を与えるのだ、と最近の研究は示唆している（31）。これが付着をも促進させる可能性があり、この能力の抑制因子が、骨への前立腺転移および骨における前立腺転移成長を減少させると考えられる。
新規抗原（乳癌の悪性表現型の癌遺伝子およびマーカーだと考えられているもの）に対するリガンドは、乳癌細胞の分化を誘導するように作用し、したがって該疾患のプロモーターというより治療剤として作用することが判明している。天然リガンドまたは抗体によるＰＳＭの右領域へのリガンド結合が、同様の機能を果たすかもしれない。
細胞障害剤と結合したＰＳＭ抗原に対する抗体は、前立腺癌細胞を除去するのに有用である。腫瘍細胞ではトランスフェリン受容体の発現レベルが増加する傾向があるため（32）、毒素結合体を有するトランスフェリン受容体抗体は、いくつかの腫瘍細胞に対して細胞障害性である。トランスフェリン受容体は、エンドサイトーシスにより該細胞中へ分子を取り込む。抗体と薬物との組み合わせは毒性を有することがある。トランスフェリン結合毒素は毒性を有することがある。
ｂ）細胞障害剤と結合したＰＳＭ抗原に対する抗体は、前立腺癌細胞を除くのに有用である。該細胞障害剤は、当業者に公知の放射性同位体であっても毒素であってもよい。該抗体と該毒素または放射性同位体との結合は、化学的であってもよい。直接結合毒素としては、例えば、ドキソルビシン、クロラムブシル、リシン、シュードモナス外毒素などが挙げられる。あるいは、半分はＰＳＭに対する特異性、および残りの半分は該毒素に対する特異性を有するハイブリッド毒素を産生させてもよい。そのような二価分子が該腫瘍に結合し、残りの半分が細胞障害性を該腫瘍へ輸送するか、細胞障害性リンパ球に結合してこれを活性化するようにように作用しうる（例えば、Ｔ１−Ｔ３受容体複合体に対する結合）。また、必要な特異性の抗体をＴ細胞中にクローニングすることができ、該Ｔ細胞受容体（ＴｃＲ）の免疫グロブリンドメインを置換し、所望のＭＡｂ重および軽鎖中にクローニングし、ＵｈおよびＵＬ遺伝子セグメントをαおよびβＴＣＲ鎖の定常領域でスプライシングし、そしてこれらのキメラＡｂ／ＴｃＲ遺伝子を患者のＴ細胞にトランスフェクションし、これらの雑種細胞を増殖させ、それらを該患者に注入する（33）。標的に対する組織特異的抗原およびそのような標的に特異的なＭＡｂの産生についての詳細な知見は、これを利用可能なアプローチとするのに有用である。ＰＳＭ抗原コーディング領域から、完全コーディング領域の知見が得られるため、いくつかの抗体を産生させて、ついでそれを併用して、追加的または相乗的な抗腫瘍作用を得ることが可能である。該抗体は、無毒性プロドラッグを腫瘍部位で活性化しうる酵素［例えば、マウスにおけるＡｂ−カルボキシペプチダーゼ、４−(ビス(２クロロエチル)アミノ)ベンゾイル−α−グルタミン酸およびその活性親薬物］に結合させることができる（34）。
遺伝子組換え体ＴＰ−４０などの毒性遺伝的キメラを産生させることも可能である。ＴＰ−４０は、ＴＧＦ−アルファおよびシュードモナス外毒素の毒性部分からのｃＤＮＡを有する。該ハイブリッドのＴＧＦおよび一部が上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合し、シュードモナス部分が酵素的に該細胞中に取り込まれ、タンパク質合成を行うリボソームの能力を不活性化して、細胞死を引き起こすのである。
さらに、ＰＳＭ抗原に対するリガンドが同定されたら、毒素を該リガンドへ化学的に結合させることができる。そのような結合リガンドが治療的に有用な場合もある。該毒素としては、例えば、ダウノマイシン、クロラムブシル、リシン、シュードモナス外毒素などが挙げられる。あるいは、該リガンドのｃＤＮＡを該毒素のｃＤＮＡに結合することにより、キメラ構築物を作製することができる。そのような毒素の一例は、ＴＧＦαおよびシュードモナス外毒素である（35）。
８．その他
ＰＳＭ抗原は他の用途を有する可能性もある。前立腺は亜鉛に富むことがよく知られており、該抗原がこれに関連する機能または他の生物的機能を付与すれば、ＰＳＭ抗原は、良性過形成増殖および／または前立腺炎などの他の前立腺病変の治療で有用かもしれない。
精製ＰＳＭ抗原を得ることができるため、該精製ＰＳＭ抗原をビーズに結合させ、それを標準的な「アフィニティー」精製と同様に使用することができる。ビーズに結合したＰＳＭ抗原と共にインキュベーションするのに、血清、尿または他の生物学的サンプルを使用することができる。該ビーズを十分に洗浄し、ついで、塩またはpＨ勾配で溶出させてもよい。溶出物質をＳＤＳゲルで精製し、ミクロシークエンシング用サンプルとして使用する。該配列を他の公知タンパク質と比較してユニークであれば、該リガンドを得るのに縮重ＰＣＲの技術を用いることができる。該リガンドの親和性は、一旦わかれば、標準的なプロトコールにより決定される（15）。
参考文献１
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実施例２：
前立腺特異的膜抗原の発現
ＰＳＭをコードする２.６５kbの相補的ＤＮＡをクローニングした。７Ｅ１１−Ｃ５.３抗体を用いてＰＳＭ発現に関してＬＮＣａＰ、ＤＵ−１４５およびＰＣ−３前立腺癌細胞株を免疫組織化学的分析すると、ＬＮＣａＰ細胞では強い染色が示され、ＤＵ−１４５およびＰＣ−３細胞では共に発現が検出されない。２.６５kbの完全長ＰＳＭ ｃＤＮＡのインビトロ転写／翻訳共役により、ＰＳＭの予想ポリペプチド分子量に相当する８４kDaのタンパク質が得られる。膵臓イヌミクロソームによるこのタンパク質の翻訳後修飾により、予想される１００kDaのＰＳＭ抗原が得られる。ＰＣ−３細胞を真核発現ベクター中の完全長ＰＳＭ ｃＤＮＡでトランスフェクションした後、本出願人は、７Ｅ１１−Ｃ５.３モノクローナル抗体を用いるウエスタン分析により、ＰＳＭ糖タンパク質の発現を検出する。ヒト組織におけるＰＳＭ ｍＲＮＡの発現はほとんど完全に前立腺特異的であることが、リボヌクレアーゼプロテクション分析により示された。ＰＳＭ発現は無ホルモン状態で最高であるらしく、ステロイドによりホルモン的にモジュレーションされ、ＤＨＴはヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰにおけるＰＳＭ発現を８〜１０倍ダウンレギュレーションし、テストステロンはＰＳＭを３〜４倍ダウンレギュレーションし、コルチコステロイドは有意な効果を示さない。正常および悪性前立腺組織は一貫して高いＰＳＭ発現を示すが、良性前立腺過形成では不均一であり、時にはＰＳＭの発現が無い。ヌードマウスの皮下に正所性移植し成長させたＬＮＣａＰ腫瘍は、ＰＳＭを豊富に発現し、ＰＳＭ発現の調節およびモジュレーションの研究のための優れたインビボモデル系を提供する。
＜材料および方法＞
細胞および試薬：
ＬＮＣａＰ、ＤＵ−１４５およびＰＣ−３細胞株を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）から入手した。これらの細胞株の樹立および特徴づけに関する詳細は、すでに公開されている（5A, 7A, 8A）。特に示さない限り、ＬＮＣａＰ細胞は、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸および５％ウシ胎仔血清（Gibco-BRL, Gaithersburg, MD）で補足したＲＰＭＩ １６４０培地中、ＣＯ２インキュベーター中３７℃で成長させた。ＤＵ−１４５およびＰＣ−３細胞は、１０％ウシ胎仔血清で補足した最少必須培地中で成長させた。すべての細胞培地は、MSKCC メディア・プレパレーション・ファシリティー（Media Preparation Facility）から入手した。特に示さない限り、制限および修飾酵素はGibco-BRLから購入した。
ＰＳＭの免疫組織化学的検出：
検出のアビジン−ビオチン法を用いて、ＰＳＭ抗原発現に関して前立腺癌細胞株を分析した（9A）。ガラススライド上で、５×１０４細胞／１００ul／スライドを用いて細胞サイトスピン（cytospin）を作製した。スライドをＰＢＳで２回洗浄し、ついで適当なサプレッサー血清と共に２０分間インキュベーションした。該抑制血清を排出し、ついで該細胞を、希釈７Ｅ１１−Ｃ５.３（５g/ml）モノクローナル抗体と共に１時間インキュベーションした。ついでサンプルをＰＢＳで洗浄し、第２抗体と３０分間、そしてアビジン−ビオチン複合体と３０分間、順次インキュベーションした。色素原および発色現像用にジアミノベンジジンを使用し、ついでヘマトキシリン対比染色し、封入した。それぞれの実験では、２通りの細胞サイトスピンを対照として用いた。陽性対照として、前記と同じ方法に従い、抗サイトケラチンモノクローナル抗体ＣＡＭ５.２を使用した。ヒトＥＪ膀胱癌細胞を陰性対照として使用した。
ＰＳＭ抗原のインビトロ転写／翻訳：
プラスミドpSPORT 1（Gibco-BRL）中に完全長２.６５kb ＰＳＭ ｃＤＮＡを含有するプラスミド５５Ａを、プロメガ（Promega）ＴＮＴ系（Promega Corp. Madison, WI）を用いてインビトロで転写した。ウサギ網状赤血球溶解物、メチオニンを欠くアミノ酸混合物、緩衝液および３５Ｓ−メチオニン（Amersham）を含有する反応混合物中のｃＤＮＡへ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを加え、３０℃で９０分間インキュベーションした。該反応混合物（Promega Corp. Madison、 WI.）へ膵臓イヌミクロソーム(Pancreatic canine microsomes)を加えることにより、得られたタンパク質の翻訳後修飾を行った。タンパク質産物の分析を行うために、該タンパク産物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動し、ついで、製造業者の指示に従いアンプリファイ・オートラジオグラフィー・エンハンサー（Amersham, Arlington Heights, IL.）で処理し、真空乾燥機中８０℃で乾燥した。ハイパーフィルム（Hyperfilm）ＭＰ（Amersham）を用いて、ゲルを−７０℃で一晩オートラジオグラフィーに付した。
ＰＣ−３細胞中へのＰＳＭのトランスフェクション：
pREP7 真核発現ベクター（Invitrogen, San Diego, CA.）へ、完全長ＰＳＭ ｃＤＮＡをサブクローニングした。キアゲンマキシ−プレップ（Qiagen maxi-prep）プラスミド単離カラム（Qiagen Inc., Chatsworth, CA.）を用いて、形質転換ＤＨ５−α細菌（Gibco-BRL）からプラスミドＤＮＡを精製した。精製プラスミドＤＮＡ（６〜１０g）を９００ulのオプティメン（Optimen）培地（Gibco-BRL）で希釈し、９００lのオプティメン培地で既に希釈されている３０ulのリポフェクチン試薬（Gibco-BRL）と混合した。オプティメン培地中の４０〜５０％集密性ＰＣ−３細胞のＴ−７５フラスコへ、この混合物を加えた。２４〜３６時間後、細胞をトリプシン処理し、１０％ウシ胎仔血清および１mg/mlのハイグロマイシンＢ（Calbiochem, La Jolla, CA.）で補足したＲＰＭＩ １６４０培地を含有する１００mm皿に落とした。使用したハイグロマイシンＢの用量は、時間経過／用量反応細胞毒性アッセイにより、前もって決定しておいた。離散コロニーが出現するまで、４〜５日毎に培地およびハイグロマイシンＢを変えながら、細胞をこの培地中で２〜３週間維持した。６mmのクローニングシリンダーを用いて、コロニーを単離し、同じ培地中に広げた。対照として、ＰＣ−３細胞もpREP7プラスミド単独でトランスフェクションした。該トランスフェクション細胞からＲＮＡを単離し、ＲＮアーゼプロテクション分析（後記）およびノーザン分析の両方によりＰＳＭ ｍＲＮＡ発現を検出した。
ＰＳＭ発現のウエスタンブロット検出：
既に記載されているとおりに（10A）、粗製タンパク質溶解物をＬＮＣａＰ、ＰＣ−３およびＰＳＭ−トランスフェクションＰＣ−３細胞から単離した。公開されている方法（10A）に従い、ＬＮＣａＰ細胞膜も単離した。BioRadタンパク質試薬キット（BioRad, Richmond, CA.）を用いるブラッドフォード（Bradford）法により、タンパク質濃度を定量した。変性後、２０μlのタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上、２５mAで４時間電気泳動した。ゲルをイモビロン（Immobilon）Ｐ膜（Millipore, Bedford, MA.）に４℃で一晩エレクトロブロットした。膜を０.１５M ＮaＣl／０.０１M トリス−ＨＣl（ＴＳ）および５％ＢＳＡでブロッキングし、ついで７Ｅ１１−Ｃ５.３モノクローナル抗体（１０μg/ml）と共に１時間インキュベーションした。ブロットを０.１５M ＮaＣl／０.０１M トリス−ＨＣl／０.０５％トリトン−Ｘ１００（ＴＳ−Ｘ）で４回洗浄し、１０μg/mlの濃度のウサギ抗マウスＩｇＧ（Accurate Scientific, Westbury, N.Y.）と共に１時間インキュベーションした。
ついでブロットをＴＳ−Ｘで４回洗浄し、百万cpm/mlの濃度の１２５Ｉ−プロテインＡ（Amersham, Arlington Heights, IL.）で標識した。ついでブロットをＴＳ−Ｘで４回洗浄し、ワットマン３ＭＭ紙上で乾燥し、ついで、ハイパーフィルム（Hyperfilm）ＭＰ（Amersham）を用いて−７０℃で一晩オートラジオグラフィーに付した。
ヌードマウスにおける正所性の皮下ＬＮＣａＰ腫瘍成長：
０.２５％トリプシンおよび０.０２％ＥＤＴＡの溶液に１分間さらすことにより、ＬＮＣａＰ細胞を亜密集的（sub-confluent）培養から得た。細胞を、５％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地へ再懸濁し、マトリゲル（Matrigel）（Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA.）またはカルシウムおよびマグネシウムを含まないハンクス均衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）のいずれかで洗浄し希釈した。トリパンブルー排除により９０％を越える生存度を有する単細胞懸濁液のみをインビボ注射に使用した。４〜６週齢の雄の無胸腺Swiss（nu/nu）ヌードマウスをメモリアル・スロアン・ケタリング・キャンサー・センター・アニマル・ファシリティー（Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Animal Facility）から入手した。皮下腫瘍細胞注射には、２８ゲージ針が付いている使い捨てシリンジを用いて、０.２mlのマトリゲルに再懸濁した百万個のＬＮＣａＰ細胞を各マウスの後肢に注射した。正所性注射のために、まずペントバルビタールの腹腔内注射によりマウスを麻酔し、背臥位で置いた。腹部をベタジン（Betadine）で洗浄し、前立腺を正中切開により露出させた。０.１ml中の２５０万個のＬＮＣａＰ腫瘍細胞を、１mlの使い捨てシリンジおよび２８ゲージ針を用いて、いずれかの後葉に直接注射した。マトリゲルの存在下および不存在下でＬＮＣａＰ細胞を注射した。オートクリップ・ウーンド・クリップス（Autoclip wound clips）（Clay Adams, Parsippany, N.J.）を用いて、一層で腹部を閉じた。腫瘍は６〜８週間で収穫し、メモリアル・スロアン・ケタリング・キャンサー・センター・パソロジー・デパートメント（Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Pathology Department）のメンバーにより組織学的に確認され、後続のＲＮＡ単離のために液体窒素中で凍結した。
ＲＮＡ単離：
標準的な技術（11, 12）により、およびＲＮＡzol Ｂ（Cinna/Biotecx, Houston, TX.）を用いて、全細胞ＲＮＡを細胞および組織から単離した。ＲＮＡ濃度および質を、ベックマン（Beckman）ＤＵ ６４０分光光度計でＵＶ分光法により、およびゲル分析により評価した。ヒト組織全ＲＮＡサンプルは、クローンテック・ラボラトリーズ・インコーポレーティッド（Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA.）から購入した。
リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ：
ＰＳＭ ｃＤＮＡの一部をプラスミドベクターpSPORT 1（Gibco-BRL）中にサブクローニングし、フランキングＴ７およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに対する該ｃＤＮＡ挿入の配向を制限分析により確認した。該ＰＳＭ挿入の上流のこのプラスミドを線状化し、ついでＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼにより転写することにより、４００ヌクレオチドのアンチセンスＲＮＡプローブが得られる。そのうちの３５０ヌクレオチドがＰＳＭ ＲＮＡによりＲＮアーゼ消化から保護されているはずである。このプローブは図２０で使用した。また、プラスミドpCR II（Invitrogen）中に１kbの部分ＰＳＭ ｃＤＮＡを含有するプラスミドＩＮ−２０をリボプローブ合成に使用した。Xmn I（Gibco-BRL）で線状化したＩＮ−２０を、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写すると、２９８ヌクレオチドのアンチセンスＲＮＡプローブが得られるが、そのうちの２６０ヌクレオチドはＰＳＭ ｍＲＮＡによりＲＮアーゼ消化から保護されているはずである。このプローブは図２１および２２で使用した。公開されているプロトコールに従い（13）、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ（Gibco-BRL）、ｒＮＴＰ（Gibco-BRL）、ＲＮアシン（Promega）および３２Ｐ−ｒＣＴＰ（NEN, Wilmington, DE.）を用いてプローブを合成した。プローブをNENSORB 20精製カラム（NEN）上で精製し、約百万cpmの精製放射性標識ＰＳＭプローブを１０μlの各ＲＮＡと混合し、RPA IIキット（Ambion, Austin, TX）からの緩衝液および試薬を用いて４５℃で一晩ハイブリダイズした。製造業者の指示に従い、サンプルを加工し、Seq ACRYL試薬（ISS, Natick, MA.）を用いて５％ポリアクリルアミド／７M 尿素変性ゲル上で分析した。ゲルを５５℃まで前加熱し、２５ワットで約１〜２時間移動させた。ついでゲルを１０％メタノール／１０％酢酸中で３０分間固定し、バイオラッド（BioRad）真空乾燥機中８０℃でワットマン３ＭＭ紙上で乾燥し、ハイパーフィルム（Hyperfilm）ＭＰ（Amersham）を用いて一晩オートラジオグラフに付した。走査型レーザーデンシトメーター（LKB, Piscataway, NJ.）を用いることによりＰＳＭ発現を定量した。
ステロイドモジュレーション実験：
ＬＮＣａＰ細胞（２百万）を、５％ウシ胎仔血清で補足したＲＰＭＩ １６４０培地中のＴ−７５フラスコ上に播種し、約３０〜４０％密集になるまで２４時間成長させた。ついでフラスコをリン酸緩衝食塩水で数回洗浄し、５％木炭抽出血清で補足したＲＰＭＩ培地を加えた。ついで細胞をさらに２４時間成長させ、この時点で、ジヒドロテステロン、テストステロン、エステラジオール、プロゲステロンおよびデキサメタゾン（Steraloids Inc., Wilton, NH.）を最終濃度２nMで加えた。細胞をさらに２４時間成長させ、ついで、既に記載されているとおりにＲＮＡを収穫し、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイによりＰＳＭ発現を分析した。
＜実験結果＞
ＰＳＭの免疫組織化学的検出：
７Ｅ１１−Ｃ５.３抗ＰＳＭモノクローナル抗体を用いた場合、ＰＳＭ発現は、ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞株では明らかに検出可能であるが、ＰＣ−３およびＤＵ−１４５細胞株では可能でない（図１７Ａ〜１７Ｃ）。分析したすべての正常および悪性前立腺組織は、ＰＳＭ発現について陽性に染色された。
ＰＳＭ抗原のインビトロ転写／翻訳：
図１８に示すとおり、２.６５kbの完全長ＰＳＭ ｃＤＮＡのインビトロ転写／翻訳共役は、７５０アミノ酸ＰＳＭオープンリーディングフレームからの予想タンパク質産物と一致して、８４kDaのタンパク質種を与える。膵臓イヌミクロソームを用いる翻訳後修飾の後、１００kDaのグリコシル化タンパク質種が得られ、これは成熟天然ＰＳＭ抗原と一致した。
ＬＮＣａＰ細胞膜およびトランスフェクションされたＰＣ−３細胞におけるＰＳＭ抗原の検出：
pREP7発現ベクター中の完全長ＰＳＭ ｃＤＮＡでトランスフェクションされたＰＣ−３細胞を、ノーザン分析によりＳＭ ｍＲＮＡの発現に関してアッセイした。７Ｅ１１−Ｃ５.３抗体を用いるウエスタンブロット法によるＰＳＭ抗原分析には、高いＰＳＭ ｍＲＮＡ発現を有するクローンを選んだ。図１９では、１００kDaのＰＳＭ抗原が、ＬＮＣａＰ細胞溶解物および膜画分、およびＰＳＭでトランスフェクションされたＰＣ−３細胞ではよく発現しているが、天然ＰＣ−３細胞では発現していない。該トランスフェクションＰＣ−３細胞中のこの検出可能な発現は、既にクローニングされている２.６５kbのＰＳＭ ｃＤＮＡが、７Ｅ１１−Ｃ５.３抗前立腺モノクローナル抗体により認識される抗原をコードすることを証明するものである。
ＰＳＭ ｍＲＮＡ発現：
正常ヒト組織におけるＰＳＭ ｍＲＮＡの発現を、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイにより分析した。ＰＳＭの組織発現は主に前立腺内で現れ、ヒト脳および唾液腺で検出可能な発現は非常に低レベルであった（図２０）。ノーザン分析で分析したところ、検出可能なＰＳＭ ｍＲＮＡの発現は非前立腺ヒト組織では明らかでなかった。検出可能なＰＳＭ発現が正常ヒト小腸組織で認められことがあるが、このｍＲＮＡ発現は、使用する特異的リボプローブに応じて変化しうる。アッセイした正常ヒト前立腺およびヒト前立腺腺癌のすべてのサンプルでは明らかに検出可能なＰＳＭ発現が示されたが、良性過形成を示す組織では、ＰＳＭの発現が一般に低下しているか発現していなかった（図２１）。ヌードマウスにおいて正所的におよび皮下の両方で成長させたヒトＬＮＣａＰ腫瘍では、皮下移植されたＬＮＣａＰ細胞の成長に必要なマトリゲルを使用した場合または使用しない場合に、豊富なＰＳＭ発現が検出された（図２１）。ＰＳＭ ｍＲＮＡの発現は、生理学的用量のステロイドの存在により明らかにモジュレーションされる（図２２）。ＤＨＴは２４時間後に発現を８〜１０倍下方調節し、テストステロンはＰＳＭ発現を３〜４倍減少させた。エストラジオールおよびプロゲステロンも、ＬＮＣａＰ細胞におけるＰＳＭ発現をダウンレギュレーションしたが、おそらくこれは、ＬＮＣａＰ細胞中に存在していることが公知の突然変異アンドロゲン受容体に対する結合の結果であろう。全体では、ステロイド枯渇培地中で成長させた未処理ＬＮＣａＰ細胞［ホルモンの無い（去勢）状態をインビボで刺激する状態である］においてＰＳＭ発現は最高である。この実験を２〜２００nMのステロイド用量および６時間〜７日間の時点で繰り返しても同様の結果が得られ、ＰＳＭ ｍＲＮＡの最大ダウンレギュレーションは、２４時間の時点でＤＨＴにより２〜２０nMの用量で認められた。
＜実験の考察＞
以前の研究で、２つの貴重な前立腺生物学的マーカー（ＰＡＰおよびＰＳＡ）が得られており、その両者は、前立腺悪性疾患の診断、治療および処置に大きな影響を与えている。前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭ）の予備的特徴づけを記載している本研究は、それが、多くの興味深い特徴を有する遺伝子であることを示す。ＰＳＭは、ＰＡＰおよびＰＳＡと同様、ほぼ完全に前立腺特異的であり、それ自体により、前立腺の独特の機能および挙動がさらに明らかになるかもしれない。ＰＳＭタンパク質の予想配列（3）およびＬＮＣａＰ細胞膜中のその存在（ウェスタンブロット法および免疫組織化学的方法により判定）は、それが内在性膜タンパク質であることを示す。したがって、ＰＳＭは抗体指向性診断用イメージングおよび細胞障害性標的化法のための興味深い細胞表面エピトープを与える（14）。ＰＳＭ抗原をインビトロで合成し、高レベルのＰＳＭ発現を維持する腫瘍異種移植片を産生できれば、ＰＳＭ発現の調節およびモジュレーションについてさらに研究し特徴づけるための便利で興味深いモデル系が得られる。また、ＬＮＣａＰ細胞で高レベルのＰＳＭが発現されるため、優れたインビトロモデル系が得られる。ＰＳＭ発現はステロイドに対してホルモン反応性であり、ホルモン無反応性疾患ではＰＳＭが高レベルで発現される可能性がある（15）。脳、唾液腺および小腸は、７Ｅ１１−Ｃ５.３抗体を用いる免疫組織化学的方法では、ＰＳＭ抗原の発現に関して陰性であるが（16）、これらの組織における微少量のＰＳＭ ｍＲＮＡの検出はさらなる研究を保証するものである。これらのすべての組織、特に小腸においては、３'末端付近のＰＳＭ ｃＤＮＡの領域に対応するプローブを用いるｍＲＮＡ発現であるが、５'末端ＰＳＭプローブを用いた場合には発現は検出されなかった。これらの結果は、ＰＳＭ ｍＲＮＡ転写物が種々の組織で選択的スプライシングを受けることを示しているのかもしれない。
出願人のアプローチは、前立腺組織特異的プロモーター、酵素またはサイトカインキメラに基づく。単純ヘルペスチミジンキナーゼにより毒性代謝物に変換される無毒性ガンシクロビルなどのプロドラッグ、シュードモナスカルボキシペプチダーゼＧ２による安息香酸マスタードアルキル化剤へのプロドラッグである４−(ビス(２クロロエチル)アミノ)ベンゾイル−１−グルタミン酸などのプロモーター特異的活性化を調べた。これらの薬物は、該腫瘍中で特異的に酵素（キメラ）により活性化されるため、該活性薬物は該腫瘍環境内で単に局所的に遊離されて、周囲の腫瘍細胞を破壊する。活性化および特異的抗腫瘍ワクチン療法のためのＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインのプロモーター特異的活性化を調べた。最後に、細胞死遺伝子の組織特異的プロモーター活性化がこの分野で有用だと判明するかもしれない。
遺伝子治療キメラ：
遺伝子治療のための「キメラＤＮＡ」を確立するためには、種々のＤＮＡセグメントをつないで、該結合に関与する両前駆体ＤＮＡ種の特徴を有する新しいＤＮＡを作製することが必要である。この提案の場合、結合されているその２つの断片はＤＮＡの種々の機能的態様を含み、ｍＲＮＡの生成のための該ＤＮＡの読み取りを許容するプロモーター領域は特異性を付与し、該ｍＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は治療用機能的ＤＮＡを与える。
ＤＮＡ特異的酵素またはサイトカインｍＲＮＡ：
抗腫瘍薬は、有効であれば、非常に大量の腫瘍の後退を起こしうる。抗腫瘍薬活性発現のための主な要件は、細胞死が生じるよう十分な細胞障害を保証するために腫瘍を毒性薬物にさらす場合の十分に長い時間（ｔ）および十分に高い濃度（ｃ）の両方（cxt）を得る要件である。また、薬物は「活性」でなければならず。腫瘍に対する毒性は、宿主の正常細胞に対するものより大きくなければならない（22）。腫瘍に対する薬物の有効性は、腫瘍血流および薬物の拡散能に依存する。多数の正常組織への血流は腫瘍への血流と同程度かそれを上回ることが多いため、腫瘍への血流は選択性を付与しない。化学療法用の細胞障害性薬物の大部分は、腫瘍組織に対する毒性と正常組織に対する毒性が同程度であることが多い。分裂中の細胞は非分裂正常細胞より感受性であることが多いが、前立腺癌などの成長が遅い多数の固形腫瘍では、これによる抗腫瘍特異性は得られない（22）。
これまで、抗腫瘍薬の腫瘍特異性を増大させる手段は、腫瘍関連酵素を用いて無毒性プロドラッグを活性化して細胞障害剤にすることであった（19）。このアプローチの問題点は、腫瘍中に認められる酵素のほとんどはそれらの活性が完全に特異的というわけではなく、同様の基質活性酵素または同じ酵素がわずかに少量ではあるが他の組織にも見いだされ、したがって正常の組織が傷害を受ける危険性が依存として存在するということである。
絶対的な特異性および独特の活性を得るために、選択プロドラッグに対する独特の特異性を有し、ヒトまたは他の動物細胞には存在しないウイルス、細菌および真菌の酵素が見いだされた。単純ヘルペスチミジンキナーゼ、細菌シトシンデアミナーゼ、カルボキシペプチダーゼＧ−２などの酵素を利用する試みが、抗体標的化系と結びついて、ある程度の成功を収めている（19）。残念なことに、抗体標的化酵素は、細胞当たりに利用できる酵素の数を限定する。また、ほとんどの抗体は、腫瘍標的対正常組織比が高くなく、したがって正常組織が依然として標的となり、これらの独特の酵素の特異性が減少してしまう。抗体は拡散性が低い大きな分子である上、さらに、酵素分子量が加わることにより抗体の拡散性が減少する。
遺伝子治療が正常組織でなく腫瘍においてタンパク質を特異的に発現し、該酵素の高い局所濃度を利用して腫瘍環境で活性薬物を産生できるのであれば、遺伝子治療は最高の望ましい結果を与えるであろう（21）。
サイトカイン：
結果からは、膀胱および前立腺などの腫瘍が免疫原性でないことが示された。すなわち、照射腫瘍細胞を動物へ投与し、ついで非照射腫瘍細胞を投与しても、腫瘍産生腫瘍細胞数を減少させることも、該腫瘍の成長速度を低下させることもなかった。しかし、該腫瘍をレトロウイルスおよび高濃度の分泌サイトカイン（例、Ｉｌ−２）でトランスフェクションすれば、これは抗腫瘍ワクチンとして働き、既に樹立され成長中の腫瘍の成長可能性を低下させることができた。ＩＬ−２が最も優れており、ＧＭ−ＣＳＦも活性を有していたが、他のいくつかのサイトカインははるかに低活性であった。免疫刺激に単にＩＬ−２を用いる臨床研究では、非常に高濃度を与えなければならず、毒性であることが判明した。サイトカイン遺伝子修飾腫瘍細胞の成功への鍵は、サイトカインを腫瘍部位で局所的に産生させ、毒性でないこと、およびそれが該腫瘍の免疫認識を刺激し、該腫瘍の特異的および無毒性認識を可能にすることである。腫瘍細胞によるＩＬ−２産生が免疫認識を活性化する正確なメカニズムは完全にはわかっていないが、１つの説明は、それがヘルパーＴ細胞によるサイトカイン産生の必要性を回避し、腫瘍抗原活性化細胞障害性ＣＤ８細胞を直接的に刺激する、というものである。抗原提示細胞の活性化が生じる可能性もある。
＜組織プロモーター特異的キメラＤＮＡ活性化＞
非前立腺腫瘍系：
プロモーター特異的活性化により、トランスフェクション遺伝子の組織特異的遺伝子発現が選択的に得られることが、非前立腺腫瘍で認められている。黒色腫では、メラニン発現を起こす酵素をコードするチロシナーゼプロモーターの使用により、黒色腫細胞におけるプロモータ−駆動レポーター遺伝子発現の５０倍を越える発現が得られたが、非黒色腫細胞ではこのようなことはなかった。マウス中で成長中にトランスフェクションされた黒色腫細胞で同様の特異的活性化が認められた。その実験では、非黒色腫またはメラノサイト細胞は、チロシナーゼ駆動レポーター遺伝子産物を発現しなかった。ウェルカム・ラボラトリーズ（Welcome Laboratories）の研究グループは、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）をコードする遺伝子のプロモーター領域をクローニングし配列決定した。ＣＥＡは、結腸および結腸癌細胞上で発現されるが、転移の場合は特異的である。シトシンデアミナーゼの遺伝子キメラを得た。５−フルオロシトシンを５−フルオロウラシルへ変換するシトシンデアミナーゼでは、ＣＥＡプロモーター駆動結腸腫瘍細胞を選択的に殺す（正常肝細胞は殺さない）能力の大きな増強が認められた。彼らは、シトシンデアミナーゼ遺伝子でトランスフェクションされていないバイスタンダー（bystander）腫瘍細胞も殺され、処理後に大きな腫瘍が後退する際に宿主動物に対する毒性がないことを、インビボで観察した。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、チミジンキナーゼも同様に、分裂中の癌細胞に対して毒性となるようプロドラッグであるガンシクロビルを活性化し、ＨＳＶチミジンキナーゼは、組織特異的プロモーターにより特異的に活性化されうることが示されている。
前立腺腫瘍系：
有効な癌治療のための治療上の鍵は、特異性を獲得し、患者の毒性を抑制することである。非必須組織、例えば前立腺および前立腺腫瘍が組織特異的タンパク質、例えば酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、およびクローニングされた遺伝子、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭ）を産生する点で、遺伝子治療は特異性の鍵部分を与えるかもしれない。前立腺などの組織は、これらの組織特異的ｍＲＮＡのＤＮＡのプロモーター領域に対する結合を起こす選択された組織特異的転写因子を含有する。ＰＳＡのプロモーターは既にクローニングされている。通常、転移前立腺癌の治療をされている患者は、ＰＳＡのｍＲＮＡの発現を劇的に減少させるアンドロゲン喪失療法を受けている。一方、ＰＳＭではホルモン喪失により発現が増加し、このことは、ホルモン療法で治療されている患者でＰＳＭがより一層強く発現されることを意味する。
参考文献２
Figure 2005185276
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実施例３：
ポリメラーゼ連鎖反応においてＰＳＡおよびＰＳＡ由来プライマーを用いる前立腺血行性微小転移の高感度検出
前立腺癌の患者における血行性微小転移の高感度検出を可能とするＰＣＲに基づくアッセイを開発した。前立腺特異的抗原および前立腺特異的膜抗原に対してユニークなｍＲＮＡ配列を増幅することにより「ネスティッド（nested）ＰＣＲ」を行い、それらのそれぞれの結果を比較した。ＰＳＡ由来プライマーを用いるＰＣＲにより２／３０人（６.７％）の患者で微小転移が検出され、ＰＳＭ由来プライマーを用いた場合には、１９／１６人（６３.３％）の患者で腫瘍細胞が検出された。合計８の陰性対照は、ＰＳＡおよびＰＳＭの両方のＰＣＲで陰性であった。結果を確認するためにアッセイを繰り返し、ＤＮＡ配列決定およびサザン分析によりＰＣＲ生成物を確認した。ＰＳＭでは検出されるがＰＳＡ−ＰＣＲでは検出されない循環前立腺腫瘍細胞を保持する患者として、このアッセイの時点で既に根治的前立腺切除術による治療を受けており測定できない血清ＰＳＡレベルを有する４人の患者が含まれていた。将来の疾患の再発に関するこれらの知見の重要性を調べることとする。
前立腺癌の患者の全体の生存率の向上は、より初期の診断に依存する。前立腺外拡張の証拠のない限局性疾患を根治的前立腺切除術または外部ビーム照射のいずれかで治療することは成功しており、優れた長期結果が得られている（2, 3）。大きな問題は、前立腺癌と診断された男性の約３分の２が診断時に既に前立腺外拡張の証拠を有し、そのため、現在、治療法がないということである（4）。前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）などの臨床的血清マーカーを使用することにより、臨床家はより初期に前立腺癌を検出することが可能となっており、治療に対する反応を追跡する有用なパラメーターが得られる（5）。しかし、血清ＰＳＡアッセイ、放射性核種骨スキャン、ＣＴスキャンおよび他のイメージング法の出現にもかかわらず、それらの結果からは、固形転移の定着前に微小転移細胞の存在が検出されていない。以前の研究は、循環中の乳癌、白血病および他の悪性細胞に対してユニークなｍＲＮＡ配列を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応を利用して行われており、微小転移の初期検出が可能となっている（6, 7）。最近、ＰＳＡ ＤＮＡ配列由来のプライマーを利用するＰＣＲに基づくアプローチが公開された（8）。この研究では、進行したＤ段階の前立腺癌の３／１２人の患者が、検出可能な血行性微小転移を有していた。
ＰＳＭは、前立腺腫瘍および転移中で非常に高度に発現される内在性膜糖タンパク質であるらしく、ほとんど完全に前立腺特異的である（10）。多くの退形成腫瘍および骨転移は可変的な、時には検出不可能なＰＳＡ発現を示し、一方、これらの病変は一貫して高レベルのＰＳＭを発現するらしい。前立腺から出て循環に入った前立腺腫瘍細胞は、転移形成能を有する可能性があり、おそらくより攻撃的であり、おそらく退形成細胞、すなわち、ＰＳＡを高レベルで発現できないがＰＳＭの高い発現を維持しうる細胞集団である。ＰＣＲアッセイにおいて、ＰＳＡおよびＰＳＭの両方の配列に由来するＤＮＡプライマーを使用して、末梢循環中の微小転移細胞を検出した。通常のＲＮＡ ＰＣＲが高レベルの増幅および感度を示すにもかかわらず、「ネスティッド」ＰＣＲアプローチを用いた。この方法では、標的配列を増幅し、ついでＰＣＲ増幅の別のラウンドの鋳型としてこのＰＣＲ生成物を使用し、新しいセットのプライマーは前産物の配列内に完全に含有される。このアプローチにより、１０,０００個の細胞当たり１個の前立腺腫瘍細胞から１億個の細胞当たり１個の細胞を上回るまでに、検出レベルを増加させることが可能となった。
＜材料および方法＞
細胞および試薬：
ＬＮＣａＰおよびＭＣＦ−７細胞を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（Rockville, MD.）から入手した。これらの細胞株の樹立および特徴づけに関する詳細は、すでに公開されている（11, 12）。細胞は、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸［MSKCC メディア・プレパレーション・ファシリティー（Media Preparation Facility）から入手］および５％ウシ胎仔血清（Gibco-BRL, Gaithersburg, MD）で補足したＲＰＭＩ １６４０培地中、ＣＯ２インキュベーター中３７℃で成長させた。すべての細胞培地は、MSKCC メディア・プレパレーション・ファシリティー（Media Preparation Facility）から入手した。通常の化学試薬は可能な限り高い等級のものであり、シグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical Company）（St. Louis, MO.）から入手した。
患者の血液標本：
この研究で使用したすべての血液標本は、MSKCCのスタッフである泌尿器科医が外来診察室で会った患者からのものである。定期的に予定された採血時に、患者１人当たり２本の抗凝血（パープルトップ（purple top））管を得た。標本の入手は、MSKCCインスティチューショナル・レビュー・ボード（Institutional Review Board）の承認に従い行った。サンプルは、すぐに加工するためにただちに研究室へ運んだ。血清ＰＳＡおよびＰＡＰ測定は、MSKCCクリニカル・ケミストリー・ラボラトリー（Clinical Chemistry Laboratory）による標準的な技術により行った。ＰＳＡの測定は、タンデムＰＳＡアッセイ（Hybritech, San Diego, CA.）により行った。陰性対照として使用した８個の血液標本は、正常な血清ＰＳＡ値および生検により判明したＢＰＨを有する２人の男性、１人の健康な女性、３人の健康な男性、１人の膀胱癌患者および１人の急性前骨髄球性白血病患者からのものであった。
血液サンプル加工／ＲＮＡ抽出：
４mlの全抗凝血静脈血を３mlの氷冷リン酸緩衝食塩水と混合し、ついで１５mlポリスチレン管中の８mlのフィコール（Pharmacia, Uppsala, Sweden）上に注意深く重層した。管を２００×g、４℃で３０分間遠心した。無菌パスツールピペットを用いて、バフィーコート層（約１ml）を注意深く除き、５０mlポリプロピレン管中、５０mlになるまで氷冷リン酸緩衝食塩水で再希釈した。ついでこの管を２０００×g、４℃で３０分間遠心した。該上清を注意深くデカントし、該ペレットを滴下乾燥した。ついで１mlのＲＮazol Ｂを該ペレットに加え、製造業者の指示に従い（Cinna/Biotecx, Houston, TX.）、全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡ濃度および純度は、ベックマン（Beckman）ＤＵ ６４０分光光度計によるＵＶ分光法およびゲル分析により測定した。
ＰＣＲ感度の測定：
ＲＮＡzol Ｂを用いて、ＬＮＣａＰ細胞および一定の比率（すなわち、１：１００、１：１０００など）のＬＮＣａＰ細胞とＭＣＦ−７細胞との混合物からＲＮＡを単離した。ついで、該アッセイの検出限界を測定するために、ＰＳＡとＰＳＭの両プライマーを用いて後記のとおりにネスティッドＰＣＲを行った。ＬＮＣａＰ：ＭＣＦ−７（１：１００,０００）ｃＤＮＡを蒸留水で希釈して、１：１,０００,０００および１：１０,０００,０００の濃度を得た。ＭＣＦ−７は既に試験されており、ＰＳＭを発現しないことがＰＣＲにより示されていたため、ＭＣＦ−７細胞を選んだ。
ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＳＡ外側プライマーにエキソン４および５の伸長部を用いて、４８６bpのＰＣＲ生成物を得、ｃＤＮＡと可能な混入ゲノムＤＮＡ増幅との間の識別が可能となった。ＰＳＡ ｃＤＮＡ配列中のヌクレオチド４９４から始まる上流プライマー配列は、5'-TACCCACTGCATCAGGAACA-3'（配列番号）であり、ヌクレオチド９６０の下流プライマーは、5'-CCTTGAAGCACACCATTACA-3'（配列番号）である。ＰＳＡ内側上流プライマー（ヌクレオチド５５９から始まる）5'-ACACAGGCCAGGTATTTCAG-3'（配列番号）および下流プライマー（ヌクレオチド８９４から始まる）5'-GTCCAGCGTCCAGCACACAG-3'（配列番号）は、３５５bpのＰＣＲ生成物を与える。すべてのプライマーは、MSKCCマイクロケミストリー・コア・ファシリティー（Microchemistry Core Facility）により合成された。５μgの全ＲＮＡを、製造業者の推奨に従いスーパースクリプト（Superscript）逆転写酵素（Gibco-BRL）を用いて合計容量２０μl中でｃＤＮＡに逆転写した。１μlのこのｃＤＮＡを外側プライマーＰＣＲ反応の出発鋳型として使用した。２０μlのＰＣＲ混合物には、０.５U Taqポリメラーゼ（Promega Corp., Madison, WI.）、プロメガ（Promega）反応緩衝液、１.５mM ＭgＣl２、２００mM ｄＮＴＰおよび１.０μMの各プライマーが含まれていた。ついで、この混合物をパーキンエルマー（Perkin Elmer）９６００ＤＮＡサーマルサイクラーに移し、２５サイクルのインキュベーションを行った。該ＰＣＲプロフィールは、以下のとおりであった：９４℃×１５秒、６０℃×１５秒および７２℃×４５秒。２５サイクルの後、サンプルを氷上に載せ、この反応混合物の１μlを、該内側プラマーを用いる別のＰＣＲラウンドの鋳型として使用した。管の最初のセットを該サーマルサイクラーへ戻し、さらに２５サイクル行った。ゲノムＤＮＡでなくｃＤＮＡが増幅されていることを保証するために、ＰＳＭ−ＰＣＲには、イントロンに伸長するプライマー対を選ぶ必要があった。
ＰＳＭ外側プライマーは９４６bpの産物を与え、該内側プライマーは４３４bpの産物を与えた。使用したＰＳＭ外側上流プライマーは、5'-ATGGGTGTTTGGTGGTATTGACC-3'（配列番号）（ヌクレオチド１４０１から始まる）であり、該下流プライマー（ヌクレオチド２３４８から始まる）は、5'-TGCTTGGAGCATAGATGACATGC-3'（配列番号）であった。ＰＳＭ内側上流プライマー（ヌクレオチド１５８１）は、5'-ACTCCTTCAAGAGCGTGGCG-3'（配列番号）であり、該下流プライマー（ヌクレオチド２０１５）は、5'-AACACCATCCCTCCTCGAACC-3'（配列番号）であった。使用したｃＤＮＡは、ＰＳＡアッセイのものと同じであった。該５０lのＰＣＲ混合物には、１U Taqポリメラーゼ（Promega）、２５０M ｄＮＴＰ、１０mM−メルカプトエタノール、２mM ＭgＣl２および５lの１０×緩衝液混合物（１６６mM ＮＨ４ＳＯ４、６７０mMトリス, pＨ８.８および２mg/mlのアセチル化ＢＳＡを含有）が含まれていた。ＰＣＲは、以下のパラメーターを有するパーキンエルマー（Perkin Elmer）４８０ＤＮＡサーマルサイクラー中で行った：９４℃×４分で１サイクル、９４℃×３０秒、５８℃×１分および７２℃×１分で２５サイクル、ついで７２℃×１０分。ついでサンプルを氷冷し、この反応混合物の２lを、該内側ＰＳＭプライマーを含有する新しい反応混合物を用いる別の２５サイクルの鋳型として使用した。ｃＤＮＡの質は、４４６bpのＰＣＲ生成物を与えるアクチン由来のプライマーを用いる対照反応を行うことにより確認した。使用した上流プライマーは、5'-AGGCCAACCGCGAGAAGATGA-3'（配列番号）（エキソン３）であり、該下流プライマーは、5'-ATGTCACACTGGGGAAGC-3'（配列番号）（エキソン４）であった。全ＰＳＡ混合物および１０lの各ＰＳＭ反応混合物を、１.５〜２％アガロースゲル上で移動させ、臭化エチジウムで染色し、イーグル・アイ・ビデオ・イメージング・システム（Eagle Eye Video Imaging System）（Stratagene, Torrey Pines, CA.）中で写真撮影した。結果を確認するために、少なくとも３回、アッセイを繰り返した。
ＰＣＲ生成物のクローニングおよび配列決定：
ＴＡクローニング系（Invitrogen）を用いて、ＰＣＲ生成物をpCR IIプラスミドベクター中にクローニングした。これらのプラスミドを、標準的な方法（13）を用いてコンピテントな大腸菌（E. coli）細胞中に形質転換し、マジック・マニプレップス（Magic Minipreps）（Promega）を用いてプラスミドＤＮＡを単離し、制限分析によりスクリーニングした。ついで、シークエナーゼ（U.S. Biochemical）を用いてジデオキシ法（14）によりＴＡクローンを配列決定した。３〜４gの各プラスミドをＮaＯＨで変性し、エタノール沈殿させた。製造業者の推奨に従い、３５Ｓ−ｄＡＴＰ（NEN）を用いて標識反応を行い、同じプロトコールの記載に従い該反応を停止した。ついで配列決定産物を、１２０ワットで２時間移動させる６％ポリアクリルアミド／７M 尿素ゲル上で分析した。ゲルを１０％メタノール／１０％酢酸中で２０分間固定し、ワットマン３ＭＭ紙に移し、真空乾燥機中、８０℃で２時間乾燥した。ついでゲルを室温で１８時間オートラジオグラフィーに付した。
サザン分析：
ＰＣＲ生成物のエチジウム染色アガロースゲルを、０.２N ＨＣlに１５分間、ついで０.５N ＮaＯＨ／１.５M ＮaＣlおよび０.１Mトリス（pＨ７.５／１.５M ＮaＣl）にそれぞれ３０分間浸けた。ついで、ゲルを１０×ＳＳＣ（１.５M ＮaＣl／０.１５M クエン酸ナトリウム）中で１０分間平衡化した。ＤＮＡを、１０×ＳＳＣ中、ポシ・ブロッター（Posi-blotter）（Stratagene）を用いる圧力ブロッティングによりナイトラン（Nytran）ナイロン膜（Schleicher and Schuell）に移した。ＵＶストラタリンカー（Stratalinker）（Stratagene）を用いて、ＤＮＡを該膜にクロスリンキングした。ブロットを６５℃で２時間プレハイブリダイズし、ついで変性３２Ｐ−標識ランダムプライムドｃＤＮＡプローブ（ＰＳＭまたはＰＳＡのいずれか）とハイブリダイズした（9, 15）。ブロットを１×ＳＳＰＥ／０.５％ＳＤＳ中、４２℃で２回、０.１×ＳＳＰＥ／０.５％ＳＤＳ中、５０℃で２回、それぞれ２０分間洗浄した。膜を風乾し、コダック（Kodak）X-Omatフィルムを用いて−７０℃で３０分〜１時間オートラジオグラフィーに付した。
＜実験結果＞
ＰＳＡまたはＰＳＭ由来プライマーのいずれかを用いるネスティッドプライマーによるＰＣＲ増幅により前立腺細胞の検出レベルが向上し、１０,０００個のＭＣＦ−７細胞当たり約１個の前立腺細胞から、百万個のＭＣＦ−７細胞当たり１個の細胞より優れた検出レベルになった（図２６および２７）。これは、微小疾患（minimal disease）を検出する能力の実質的な向上を示す。臨床段階、治療、血清ＰＳＡおよびＰＡＰ値に関して分析した１６人の患者の特徴、および該アッセイの結果を示す。全体で、ＰＳＡ−ＰＣＲは２／３０人の患者（６.７％）で腫瘍細胞を検出したが、ＰＳＭ−ＰＣＲは１９／３０人の患者（６３.３％）で細胞を検出した。腫瘍細胞がＰＳＡで陽性であるが、ＰＳＭで陽性でない患者はいなかったが、ＰＳＭは、ＰＳＡで検出されない８人の陽性患者を検出した。表１中の患者１０および１１は共に、非常に進行したホルモン無反応性疾患を有する患者であり、ＰＳＡおよびＰＳＭの両方で検出された。これらの両患者は、これらのサンプルを得た後で死亡している。患者４、７および１２はすべて、臨床的限局性疾患のために根治的前立腺切除術で治療され、手術の１〜２年後にはその全員が測定できない血清ＰＳＡ値を有していた患者であり、これらの患者は循環前立腺腫瘍細胞に関して、ＰＳＭ−ＰＣＲでは陽性であったが、ＰＳＡ−ＰＣＲでは陰性であった。ＰＳＭ−ＰＣＲの代表的なエチジウム染色ゲル写真を図２８に示す。レーンＡ中を移動したサンプルは、該外側プライマーから生じたＰＣＲ生成物を示し、Ｂと表示されたレーン中のサンプルは内側プライマー対の産物である。対応するＰＳＭサザンブロットオートラジオグラフを図２９に示す。いくつかのサンプルでは、該外側産物が図２８では見えないが、図２９に示すサザンブロット法では検出可能なことからわかるとおり、該サザンブロット分析の感度は、エチジウム染色の感度を上回るものであった。さらに、図２８および２９のサンプル３（図３０の患者６）は、残りの患者の対応するバンドより小さい外側および内側両方のバンドを含有しているらしい。ＤＮＡ配列決定により、これらのバンドのヌクレオチド配列が、小さな欠失を除きＰＳＭのものと符号することが確認された。これは、ＰＣＲの人工産物、この患者のＰＳＭ ｍＲＮＡの選択的スプライシングまたはＰＳＭ突然変異のいずれかを示している可能性がある。サザン分析により配列決定し分析したすべてのサンプルは、ＰＳＡおよびＰＳＭに関して真に陽性であることが確認された。
＜実験の詳細＞
前立腺癌の患者を診断時に正確に段階づけしうることは、適当な治療法を選択し、治療に対する長期的反応および治癒の可能性を予想する上で最も重要であることは明らかである。手術前の段階づけは、現在、身体的検査、血清ＰＳＡおよびＰＡＰ測定および多数のイメージング法（例、経直腸超音波検査法、ＣＴスキャン、放射性核種骨スキャン、ＭＲＩスキャン）よりなる。しかしながら、現在の治療法のなかには、血行性微小転移疾患の問題や、それから生じうる予後に対する潜在的な否定的影響に向けられているものはない。以前の研究では、固形転移形成への進行を避けられないのは循環腫瘍細胞のうちのごくわずかであることが示されているが（16）、循環腫瘍細胞の検出および潜在的定量の負担は、疾患をより正確に段階づけするのに貴重かもしれない。血行性微小転移疾患の長期的影響は、循環内にこれらの細胞を有すると判明している患者の臨床経過を、試験で陰性の同様の段階および治療の患者と比較して研究する必要がある。
ＰＳＡの発現は、分化程度がより低い退形成前立腺癌において、可変的であるのに対し、ＰＳＭの発現は、すべての段階およびグレードの前立腺癌において、一貫していることが認められるため、腫瘍細胞の検出レベルが、ＰＳＡよりＰＳＭによる場合に高いことは、驚くべきものではない。根治的前立腺切除術を既に受けており、その後血清ＰＳＡを検出できなかった３人の患者において腫瘍細胞が検出されたことは、驚くべきものであった。これらの患者は、標準的な基準により外科的に「治癒している」とみなされているが、前立腺腫瘍細胞を保持し続けていることは明らかである。ＰＣＲによる残存疾患の証拠を有さない他の患者と比較して、これらの患者の臨床経過を追跡することは興味深いことであろう。
参考文献３
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実施例４：
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭ）の発現は、トランスフェリンによる攻撃的ヒト前立腺癌細胞の分裂促進刺激を抑制する
トランスフェリンとヒト前立腺癌との関連性が、いくつかの研究から示唆されている。前立腺癌患者の発現前立腺分泌物はトランスフェリン含量に富み、前立腺癌細胞はトランスフェリン受容体に富むことが示されている（J. Urol. 143, 381, 1990）。骨髄由来のトランスフェリンは、攻撃的前立腺癌細胞の成長を選択的に刺激することが示されている（PNAS 89, 6197, 1992）。ＤＮＡ配列分析により、該コーディング領域の一部分（ヌクレオチド１２５０〜１７００）が、ヒトトランスフェリン受容体に対して５４％の相同性を有することが示された。ＰＣ−３細胞は、ＰＳＭ ｍＲＮＡまたはタンパク質を発現せず、トランスフェリンに応答して細胞成長の増加を示すが、ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞は、ＰＳＭを高度に発現し、トランスフェリンに対する応答性が非常に弱い。前立腺癌細胞によるＰＳＭ発現が、トランスフェリンに対するその分裂促進応答に影響を及ぼすか否かを判定するために、完全長ＰＳＭ ｃＤＮＡをＰＣ−３前立腺癌細胞にトランスフェクションした。ＰＳＭ ｍＲＮＡを高度に発現するクローンをノーザン分析により同定し、ＰＳＭタンパク質の発現を、抗ＰＳＭモノクローナル抗体７Ｅ１１−Ｃ５.３を用いるウエスタン分析により確認した。
１ウェル当たり２×１０４個のＰＣ−３またはＰＳＭでトランスフェクションされたＰＣ−３細胞を、１０％ウシ胎仔血清で補足したＲＰＭＩ培地に播種し、２４時間たった時点で１μg/mlのホロトランスフェリンを該細胞に加えた。１日たった時点で細胞を計数したところ、該ＰＣ−３細胞に対して高度に分裂促進性であった。平板効率を測定するために１日たった時点で、そして該トランスフェリンの効果を判定するために５日たった時点で、細胞を計数した。その結果を確認するために実験を繰り返した。
ＰＣ−３細胞では、対照に対して平均して２７５％増加したが、ＬＮＣａＰ細胞は４３％刺激したに過ぎなかった。成長速度論からは、ＰＳＭによりトランスフェクションされたＰＣ−３細胞の成長が、天然のＰＣ−３細胞より３０％遅いことが示された。このデータが示唆するとおり、攻撃的転移ヒト前立腺癌細胞におけるＰＳＭ発現は、トランスフェリンに対するその分裂促進応答を阻害する。
サイトカインを分泌する腫瘍細胞調製物よりなる治療用ワクチンを定着前立腺癌の治療に使用することについて、Dunning R3327-MatLyLuラット前立腺腺癌モデルで調べた。ＩＬ−２を分泌する照射腫瘍細胞調製物だけが、皮下に定着した腫瘍から動物を治癒させる能力を有しており、別の腫瘍攻撃から該動物を防御する免疫記憶を引き起こした。腫瘍を正所的に誘導した場合、免疫療法はそれほど有効ではなかったが、それでも結果の改善につながり、癌性前立腺の切除後の腫瘍の再発を有意に遅らせ、時にはそれを予防した。非免疫原性MatLyLu腫瘍に対する強力な免疫応答が腫瘍担持動物で誘導されることは、前立腺癌の能動免疫療法が治療上有益かもしれないという見解を支持する。
実施例５：
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭ）プロモーターのクローニングおよび特徴づけ
ＰＳＭ遺伝子の発現および調節は複雑である。免疫染色法により、ＰＳＭ抗原は、転移した腫瘍および器官限局性腫瘍では強く発現されるが、正常前立腺組織ではより低度であり、ＢＰＨではより不均一であることが判明した。ＰＳＭは、退形成腫瘍およびホルモン無反応性腫瘍の両方で強力に発現される。ＰＳＭ ｍＲＮＡは、アンドロゲンによりダウンレギュレーションされることが示されている。また、ＰＳＭ ＲＮＡの発現は、サイトカインおよび増殖因子の宿主によりモジュレーションされる。ＰＳＭ発現の調節についての知見は、前立腺癌のイムノシンチグラフィーイメージングおよび前立腺特異的プロモーター駆動遺伝子治療のような診断および治療戦略で助けとなるはずである。
転写開始部位の２.５kb上流を含有する３kbのゲノムＤＮＡクローンの配列決定により、約３００b.p.の２つの伸長（−２６０〜−６００および−１３２５〜−１６２５）が、公知遺伝子に対して実質的な相同性（７９〜８７％）を有することが示された。該プロモーターはＧＣに富む領域を欠く上に、コンセンサスＴＡＴＡボックスも有さない。しかしながら、それは−３５位〜−６５位にＴＡに富む領域を含有する。
ＡＰ１、ＡＰ２、ＮＦｋＢ、ＧＲＥ、Ｅ２−ＲＥなどの一般の転写因子のための幾つかのコンセンサス認識部位が同定された。プロモーターの無いクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子に融合したＰＳＭ遺伝子の上流領域の断片を含有するキメラ構築物を、ＬＮＣａＰ、ＰＣ−３およびＳＷ６２０（結腸細胞株）にトランスフェクションし、これらの細胞内で一過性発現させた。追加的ＳＶ４０エンハンサーを用いた場合、−５６５〜＋７６の配列はプロモーター活性をＬＮＣａＰでは示したが、ＰＣ−３やＳＷ６２０では示さなかった。
＜材料および方法＞
細胞株
ＬＮＣａＰおよびＰＣ−３前立腺癌細胞株（American Type Culture Collection）を、それぞれＲＰＭＩおよびＭＥＭ（５％ウシ胎仔血清で補足したもの）中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。結腸細胞株であるＳＷ６２０は、メリサ（Melisa）から贈呈された。
ポリメラーゼ連鎖反応
該反応は、以下の最終濃度の試薬を含む５０μl容量中で行った：１６.６mM ＮＨ４ＳＯ４、６７mM トリス−ＨＣl, pＨ８.８、アセチル化ＢＳＡ０.２mg/ml、２mM ＭgＣl２、２５０μM ｄＮＴＰ、１０mM β−メルカプトエタノールおよび１U rth 111 Taqポリメラーゼ（Boehringer Mannhiem, CA）。以下のプロフィールで合計２５サイクルを完了した：サイクル１、９４℃４分；サイクル２〜２５、９４℃１分、６０℃１分、７２℃１分。最終反応は延長した（７２℃で１０分間）。該反応のアリコートを、１×トリス−酢酸−ＥＤＴＡ緩衝液中、１％アガロースゲル上で電気泳動した。
ＰＳＭプロモーターのクローニング
ピアス(Pierce)らのＰＣＲ法を用いて、ヒト繊維芽細胞ゲノムＤＮＡ（Genomic Systems, Inc., St. Louis, MI.）のバクテリオファージＰ１ライブラリーをスクリーニングした。ＰＳＭ ｃＤＮＡの５'末端に位置するプライマーは、5'-CTCAAAAGGGGCCGGATTTCC-3'および5'-CTCTCAATCTCACTAATGCCTC-3'であった。陽性クローンp683をXho1制限酵素で消化した。ＰＳＭ ｃＤＮＡの末端（extreme）５'からAva-1部位のＤＮＡプローブを用いる制限断片のサザン分析により、３kb断片がＰＳＭ遺伝子の５'調節配列を含有することが確認された。該３kb Xho1断片をpKSBluscrptベクター中にサブクローニングし、ジデオキシ法により配列決定した。
ＰＳＭプロモーターの機能的アッセイ
プロモーターの無いpCAT基礎またはpCAT−エンハンサーベクター（Promega）へ挿入することにより、Smal-HindIII断片またはサブフラグメント（制限酵素サブフラグメントまたはＰＣＲのいずれかを使用）からクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子プラスミドを構築した。リン酸カルシウム法（Gibco-BRL, Gaithersburg, MD.）により、pCAT−構築物をpSVβgalプラスミド（５μgの各プラスミド）と共に細胞株に２通りにコトランスフェクションした。７２時間後に該トランスフェクション細胞を収穫し、ＬＳＣ法によりＣＡＴ活性に関して、そしてβgal活性に関して（Promega）アッセイした（１５μgの溶解物）。ＣＡＴ活性を、βgal活性の場合と比較することにより標準化した。
＜結果＞
ＰＳＭ遺伝子の５'末端の配列
ＲＮＡ開始部位からのＤＮＡの５００bpを含むp683の３kb XhoI断片のＤＮＡ配列を決定した（図３１Ａ〜３１Ｄ）。配列６８３ＸＦＲＶＳは、ＰＳＭプロモーターの５'遠位末端から始まり、公開されているＰＳＭ推定プロモーターとnt２４８５で重複する。すなわち、該推定転写開始部位はnt２４８５にある。配列６８３ＸＦ１０７は逆である（６８３ＸＦＲＶＳの相補体）。該XhoI断片からの配列は、真核プロモーターおよび調節領域（他の遺伝子中で見いだされるもの）に特徴的な注目に値する一連の要素およびモチーフを示した（図３２）。
上流ＰＳＭゲノム要素のプロモーター活性についての機能的分析
２つの前立腺細胞株：ＬＮＣａＰ、ＰＣ−３および結腸ＳＷ６２０で、種々のpCAT-PSMプロモーター構築物のプロモーター活性を試験した（図３３）。ＣＡＴ活性の誘導は、１０７０bpのＰＳＭ５'プロモーター断片を含有するp1070-CATにおいても、６４１bpのＰＳＭ５'プロモーター断片を含有するp676-CATにおいても観察されなかった。しかしながら、追加的ＳＶ−４０エンハンサーを用いると、−５６５〜＋７６の配列（p676-CATE）はプロモーター活性を、ＬＮＣａＰにおいては示したが、ＰＣ−３およびＳＷ６２０においては示さなかった。
したがって、ＰＳＭプロモーター駆動遺伝子治療で使用できる−５６５〜＋７６のＬＮＣａＰ特異的プロモーター断片が単離された。
実施例６：
前立腺特異的膜抗原ＲＮＡの選択的にスプライシングされた変異体：進行の潜在的測定としての発現の割合
＜材料および方法＞
細胞株
ＬＮＣａＰおよびＰＣ−３前立腺癌細胞株を、５％ウシ胎仔血清で補足された、それぞれＲＰＭＩおよびＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
一次組織
一次前立腺組織を、MSKCCの企業内腫瘍入手サービスから入手した。粗大標本が、MSKCCの病理学サービスにより病理学的に段階づけされた。
ＲＮＡの単離
ＲＮＡzol Ｂキット（Tel-Test, Friendswood, TX）を用いる改変グアニジニウムチオシアナート／フェノール／クロロホルム法により、全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡは、ジエチルピロカルボナートで処理された水中に−８０℃で保存した。ＲＮＡは、分光光度吸収により２６０nmで定量した。
ｃＤＮＡ合成
外傷により死亡した男性から得た正常ｍＲＮＡ（Clontech, Palo Alto, CA）の２つの異なるバッチを７０℃で１０分間変性させ、ついでランダムヘキサマーおよびスーパースクリプト（Superscript）II逆転写酵素（GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD）を５０℃で３０分間使用し、ついで９４℃で５分間インキュベーションすることにより、ｃＤＮＡへ逆転写した。
ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＳＭ ｃＤＮＡの５'および３'末端に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー（5'-CTCAAAAGGGGCCGGATTTCC-3'および5'-AGGCTACTTCACTCAAAG-3'）を、該ｃＤＮＡ配列が伸長するように設計した。該反応は、以下の最終濃度の試薬を含む５０μl容量中で行った：１６.６mM ＮＨ４ＳＯ４、６７mM トリス−ＨＣl, pＨ８.８、アセチル化ＢＳＡ ０.２mg/ml、２mM ＭgＣl２、２５０μM ｄＮＴＰ、１０mM β−メルカプトエタノールおよび１U rTthポリメラーゼ（Perkin Elmer, Norwalk, CT）。以下のプロフィールで合計２５サイクルを完了した：サイクル１、９４℃４分；サイクル２〜２５、９４℃１分、６０℃１分、７２℃１分。最終反応は延長した（７２℃で１０分間）。該反応のアリコートを、１×トリス−酢酸−ＥＤＴＡ緩衝液中、１％アガロースゲル上で電気泳動した。
ＰＣＲ生成物のクローニング
ＴＡクローニング法により、インビトロゲン（Invitrogen）（San Diego, CA）からのキットを用いて、ＰＣＲ生成物をpCRIIベクター中にクローニングした。連結反応混合物をコンピテント大腸菌（Escherichia coli）Inv5α中に形質転換した。
配列決定
US バイオケミカル（Biochemical）（Cleveland, OH）からのシークエナーゼキットを用いてジデオキシ法により配列決定を行った。配列決定産物を、５％ポリアクリルアミド／７M尿素ゲル上、５２℃で電気泳動した。
ＲＮアーゼプロテクションアッセイ
完全長ＰＳＭ ｃＤＮＡクローンをNgoM 1およびNhe1で消化した。３５０bpの断片を単離し、pSPORT1ベクター（GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD）中にサブクローニングした。得られたプラスミドpSP350を線状化し、該挿入物をSP6 ＲＮＡポリメラーゼにより転写して、３９５ヌクレオチド長のアンチセンスプローブを得た。該プローブのうちの３５５ヌクレオチドおよび／または２１０ヌクレオチドは、それぞれＰＳＭまたはＰＳＭ' ＲＮＡによりＲＮアーゼ消化から保護されるはずである（図２）。種々の組織からの全細胞ＲＮＡ（２０μg）を前記のアンチセンスＲＮＡプローブとハイブリダイゼーションさせた。記載されているとおりに（7）、アッセイを行った。tＲＮＡを陰性対照として使用した。ＬＮＣａＰおよびＰＣ−３についてＲＰＡを繰り返した。
＜結果＞
正常前立腺組織からのｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ
正常前立腺からのｍＲＮＡの２つの独立したＲＴ−ＰＣＲを、「材料および方法」に記載のとおりに行った。ついで行った該ＰＣＲ生成物のクローニングおよび配列決定から、選択的にスプライシングされた変異体（ＰＳＭ'）の存在が示された。ＰＳＭ'は、ＰＳＭ（２６５３ヌクレオチド）より短いｃＤＮＡ（２３８７ヌクレオチド）を有する。配列分析の結果を図３４に示す。これらのｃＤＮＡは、ＰＳＭ ｃＤＮＡの５'末端付近の２６６ヌクレオチド領域（ヌクレオチド１１４〜３８０）がＰＳＭ' ｃＤＮＡ中に存在しないことを除き、同一である。種々のｍＲＮＡサンプルのＲＴ−ＰＣＲを独立して２回繰り返しても同じ結果が得られた。
ＲＮアーゼプロテクションアッセイ
ＰＳＭ ＲＮＡに相補的でＰＳＭ' ＲＮＡの３'スプライス部位に伸長するＲＮＡプローブを使用して、ＰＳＭ ｍＲＮＡとＰＳＭ' ｍＲＮＡの発現を相対的に測定した（図３５）。このプローブを用いて、ＬＮＣａＰ細胞中のＰＳＭおよびＰＳＭ'双方のＲＮＡを検出したところ、優勢な形態はＰＳＭであった。ＰＳＭおよびＰＳＭ'のＲＮＡは共に、ＰＣ−３細胞では検出されなかったが、これは、既に行われているノーザンおよびウエスタンブロットのデータと一致する（5, 6）。図３６からは、ヒト一次前立腺組織中の両スプライス変異体の存在が示された。一次前立腺腫瘍では、ＰＳＭが優勢な形態である。これに対し、正常な前立腺はＰＳＭよりＰＳＭ'を多く発現した。ＢＰＨサンプルは、両変異体のほぼ等しい発現を示した。
腫瘍指数
ＰＳＭとＰＳＭ'との発現（図３６）をデンシトメトリーにより相対的に定量し、腫瘍指数として表した（図３７）。ＬＮＣａＰは９〜１１、ＣａＰは３〜６、ＢＰＨは０.７５〜１.６、正常前立腺は０.０７５〜０.４５の指数を有する。
＜考察＞
５'および３'末端ＰＳＭオリゴヌクレオチドプライマーを用いた場合のヒト正常前立腺ｍＲＮＡ由来のＰＣＲ生成物の配列決定データは、既に記載されているＰＳＭ ｃＤＮＡに加え、第２のスプライス変異体ＰＳＭ'を示した。
ＰＳＭは、計算分子量８４,３３０を有する７５０a.a.のタンパク質である。ＰＳＭは、II型内在性膜タンパク質であると仮定された（5）。古典的なII型膜タンパク質はトランスフェリン受容体であり、実際、ＰＳＭは、トランスフェリン受容体と適度な相同性を有する領域を有する（5）。RaoおよびArgos（7）またはEisenburgら（8）のいずれかの方法による該ＰＳＭアミノ酸配列の分析から、アミノ酸２０〜４３の領域内に１つの膜貫通ヘリックスがあるという説得力のある予想がなされた。両プログラムは、膜結合しうるが膜貫通領域の可能な候補とは考えられない他の領域を見いだした。
一方、ＰＳＭ'抗原は、そのｍＲＮＡ配列から推定すると、７８,０００の分子量を有する６９３アミノ酸のタンパク質である。ＰＳＭ'抗原は、ＰＳＭ抗原内に存在する最初の５７アミノ酸を欠く（図３４）。ＰＳＭ'抗原はサイトゾル性であると考えられる。
ＰＳＭとＰＳＭ'では、それらの機能がおそらく異なっているであろう。ＰＳＭ抗原の細胞局在からは、それが細胞外または細胞内のいずれかのリガンドまたはその両方と相互作用しうることが示唆される。一方、ＰＳＭ'の細胞局在からは、ＰＳＭ'がサイトゾルリガンドとだけしか反応しないことが暗示される。さらに、ＰＳＭ抗原は、そのサイトゾルドメイン上に３個の潜在的リン酸化部位を有する。これらの部位はＰＳＭ'抗原内には存在しない。一方、ＰＳＭ'抗原は２５個の潜在的リン酸化部位、１０個のＮ−ミリストイル化部位および９個のＮ−グリコシル化部位を有する。ＰＳＭ抗原の場合、これらの潜在的部位はすべて、細胞外表面上にあるのであろう。これらの相同性タンパク質のこれらの部位の修飾は、それらの細胞位置に応じて異なるであろう。その結果、各形態の機能は、それらの修飾のされ方に依存するであろう。
ＲＮアーゼプロテクションアッセイによるＰＳＭとＰＳＭ'の発現の相対的相違を分析した。一次前立腺組織におけるＰＳＭおよびＰＳＭ'の発現の結果は、これらの変異体の相対発現と該細胞の状態（正常か癌性か）との関係を強く示唆した。該研究のサンプルのサイズが小さいことがここでは注目されるが（図３６および３７）、傾向の一貫性は明らかである。使用したサンプルは、患者からの粗大標本であった。ＣａＰ、ＢＰＨまたは正常物の含量の点で純粋な標本を使用していたなら、この結果はより一層劇的なものとなったであろう。それでも、これらの標本で正常からＣａＰへ変化する場合に、ＰＳＭ' ｍＲＮＡに対してＰＳＭの相対的な増加があることは明らかである。腫瘍指数（図３７）は、与えられたサンプルの病理学的状態の測定に有用であろう。ＰＳＭ'に対するＰＳＭの発現の変化が腫瘍進行の根拠となる可能性もある。より分化した腫瘍状態は、トランスフェクションまたは分化剤の使用のいずれかによりＰＳＭ'で回復しうる。
参考文献４
Figure 2005185276
Figure 2005185276
実施例７：
ＰＳＭプライマーを用いる高感度ネスティッド逆転写−ＰＣＲアッセイによる前立腺血行性微小転移の検出の強化（ＰＳＡプライマーを用いる場合との比較）
前立腺癌の患者からランダムに選択された７７サンプルを分析したところ、ＰＳＭおよびＰＳＡプライマーが、それぞれ４８人（６２.３％）および７人（９.１％）の患者で循環前立腺細胞を検出することが示された。治療段階がＤの疾患の患者で、ＰＳＭプライマーは２４人中１６人（６６.７％）で細胞を検出したが、ＰＳＡプライマーは２４人中６人（２５％）で細胞を検出した。ホルモン無反応性前立腺癌（Ｄ３段階）では、ＰＳＡおよびＰＳＭの両プライマーにより７人中６人の患者が陽性であった。精力的な細胞障害性化学療法にもかかわらず、これらの６人の患者は全員、そのアッセイ後２〜６カ月以内に死亡したのに対し、試験結果が陰性であったこのグループの１人の患者はそのアッセイ後１５カ月生存している。このことは、ＰＳＡ−ＰＣＲの陽性結果が早期死亡の予測因子として働きうることを示唆する。陰性の血清ＰＳＡ値を有する根治的前立腺切除術後の患者において、ＰＳＭプライマーは３１人中２１人（６７.７％）の患者で転移を検出したが、ＰＳＡプライマーは３３人中わずか１人（３.０％）で細胞を検出したにすぎず、このことは、微小転移の広がりが前立腺癌の比較的初期のイベントであるらしいことを示す。前立腺癌と判明していない４０人の分析から、このアッセイが非常に特異的であるとの証拠が得られ、臨床的に明白な前立腺癌を有さない患者でＰＳＭ発現が発癌を予想しうることが示唆される。ＰＳＭプライマーを用いることにより、４０人中４人の対照で微小転移が検出された。そのうちの２人は前立腺生検によりＢＰＨであると判明していたが、後で血清ＰＳＡ値が上昇したので前立腺生検を繰り返したところ、以前に未検出だった前立腺癌を有することが判明した。これらの結果は、ＰＳＭプライマーを用いる血行性微小転移前立腺細胞の検出の臨床的重要性、およびこの分子アッセイの潜在的有用性を示す。
実施例８：
インビトロでの前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭ）発現のサイトカインおよび増殖因子によるモジュレーション
ＣＹＴ−３５６イメージングの有効性は、ＰＳＭの発現を操作することにより向上する。ＰＳＭ ｍＲＮＡ発現は、ステロイドによりダウンレギュレーションされる。このことは、ＰＳＭが退形成病変およびホルモン無反応性病変の両方で強く発現されるという臨床的観察と一致する。これに対して、ＰＳＡ発現はホルモン停止により減少する。ホルモン無反応性疾患では、腫瘍細胞が増殖因子および受容体の両方を産生し、そして細胞が正常な成長拘束を克服するのを可能にする自己分泌ループを確立すると考えられている。多数の前立腺腫瘍上皮細胞は、ＴＧＦαおよびその受容体である上皮増殖因子受容体の両方を発現する。結果は、ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰにおけるＰＳＭのインビトロでの発現に対するＴＧＦαおよび他の選択された増殖因子およびサイトカインの効果を示す。
アンドロゲン枯渇培地中で成長する２×１０６個のＬＮＣａＰ細胞を、０.１ng/ml〜１００ng/mlの濃度のＥＧＦ、ＴＧＦα、ＴＮＦβまたはＴＮＦαで２４〜７２時間処理した。該細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＰＳＭ ｍＲＮＡ発現をノーザンブロット分析およびレーザーデシメトリーにより定量した。未処理ＬＮＣａＰと比べて、ｂ−ＦＧＦおよびＴＧＦαは共に、ＰＳＭ発現を用量依存的に１０倍アップレギュレーションし、ＥＧＦは５倍アップレギュレーションした。これに対し、他のグループは、この同じインビトロモデルにおいて、これらの増殖因子により誘導されるＰＳＡ発現の著しいダウンレギュレーションを示した。ＬＮＣａＰ細胞に対して細胞障害性であるＴＮＦα、およびＴＮＦβはアンドロゲン枯渇ＬＮＣａＰ細胞でＰＳＭ発現を８倍ダウンレギュレーションした。
ＴＧＦαは、攻撃的前立腺癌細胞に対して分裂促進性である。ＰＳＭには複数の形態があり、膜形態だけが腫瘍進行に関連していることが判明している。サイトカインおよび増殖因子で処理してＰＳＭ発現を操作することにより、サイトジェン（Cytogen）３５６イメージングの効力および前立腺転移の治療的標的化を向上させうる。
実施例９：
プライマーを用いるネスティッドＲＴ−ＰＣＴで検出したところによれば、根治的前立腺切除術前のネオアジュバント（neoadjuvant）アンドロゲン喪失療法（ＡＤＴ）により、残存微小転移疾患の発生率が有意に減少する
臨床的に限局性の前立腺癌に対する根治的前立腺切除術は「金本位（gold standard）」的治療であると考える人は多い。過去１０年にわたる進歩は、罹患率を劇的に減少させるのに役立っている。臨床家が手術前に患者をよりよく段階づけするのを助けることを意図した改良が開発されてきたが、前立腺外拡張の発生率は、依然として５０％を越えることが、多数の研究で報告されている。フェーズIIIの予見的無作為臨床研究を行った。この研究は、根治的前立腺切除術を受けている患者での３カ月間のＡＤＴの効果を、手術だけを受け同様に調和させた対照と比較するように設計されている。既に完了しているフェーズIIの研究は、ＡＤＴ群（Ｎ＝６９）では１０％のマージン陽性率を示したのに対して、手術だけの群では３３％の陽性率（Ｎ＝７２）を示した。
フェイズIIIの研究を完了した患者を分析して、残存微小転移疾患に関してその２つの群の間に何らかの違いがあるか否かを判定した。前立腺切除術後の患者においてＰＣＲ結果が陽性であれば、循環中の生存可能転移細胞が確認されたことになる。
ＡＤＴ群からの１２人患者および対照群からの１０人の患者でＰＳＭプライマーを用いてネスティッドＲＴ−ＰＣＲを行った。微小転移細胞が検出された患者は、対照群では９／１０人（９０％）なのに対し、ＡＤＴ群ではわずか２／１２人（１６.７％）であった。器官限局性疾患の患者で陽性であったのは、ＡＤＴ群では７人中１人なのに対し、対照群では３人中３人であった。前立腺外疾患の患者で陽性であったのは、ＡＤＴ群では５人中１人なのに対して、対照群では７人中６人であった。これらの結果が示すとおり、ネオアジュバントＡＤＴを用いることにより、有意により多くの患者で腫瘍がなくなり、潜在的に「治癒した」。
実施例１０：
循環前立腺腫瘍細胞の高感度ネスティッドＲＴ−ＰＣＲ検出−ＰＳＭおよびＰＳＡに基づくアッセイ間での比較
高感度血清ＰＳＡアッセイ、ＣＴスキャン、経直腸超音波検査法、直腸内co.I ＭＲＩなど、現在臨床家が利用できる多種多様な治療法が改良され拡大しているにもかかわらず、骨盤リンパ節切開および根治的前立腺切除術の際に転移疾患を有することが判明する患者が依然として多い。現在利用できる段階づけ方法によれば未検出のままとなる不顕性血行性微小転移前立腺細胞を検出する能力を有する高感度の逆転写ＰＣＲアッセイが開発された。このアッセイは、前立腺癌および他の悪性疾患の患者で行う同様のＰＣＲアッセイの変法である（2, 3, 4, 5）。該アッセイは、前立腺特異的抗原（6）および最近クローニングされ配列決定された前立腺特異的膜抗原のｃＤＮＡ配列に由来するＰＣＲプライマーを使用する。
＜材料および方法＞
細胞および試薬
ＬＮＣａＰおよびＭＣＦ−７細胞を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（Rockville, MD.）から入手した。これらの細胞株の樹立および特徴づけに関する詳細は、すでに公開されている（8, 9）。細胞は、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸および５％ウシ胎仔血清（Gibco-BRL, Gaithersburg, MD）で補足したＲＰＭＩ １６４０培地中、ＣＯ２インキュベーター中３７℃で成長させた。すべての細胞培地は、MSKCC メディア・プレパレーション・ファシリティー（Media Preparation Facility）から入手した。通常の化学試薬は可能な限り高い等級のものであり、シグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical Company）（St. Louis, MO.）から入手した。
患者の血液標本
この研究で使用したすべての血液標本は、MSKCCのスタッフである泌尿器科医が外来診察室で会った患者からのものである。定期的に予定された採血時に、患者１人当たり２本の抗凝血管を得た。標本の入手は、各患者のインフォームドコンセントにより、MSKCCインスティチューショナル・レビュー・ボード（Institutional Review Board）の承認に従い行った。サンプルは、すぐに加工するためにただちに研究室へ運んだ。前立腺癌の患者からの７７個の標本を無作為に選び、陰性対照からのサンプルと共に、「盲検的」に研究室へ移し、加工した。これらは、Ｄ段階の疾患の２４人の患者（３人はＤ０、３人はＤ１、１１人はＤ２、および７人はＤ３）、根治的前立腺切除術を既に受けており検出不可能な術後血清ＰＳＡレベルを有する３１人の患者（１８人はｐＴ２病変、１１人はｐＴ３、および２人はｐＴ４）、根治的前立腺切除術後の限局性再発性疾患の２人の患者、外部ビーム放射線治療または間隙性Ｉ１２５インプラントを受けた４人の患者、未治療の臨床段階がＴ１〜Ｔ２の疾患の１０人の患者、および抗アンドロゲン療法を受けている臨床段階がＴ３の疾患の６人の患者を含んでいた。陰性対照として使用した４０個の血液標本は、１０人の健康な男性、生検により判明したＢＰＨおよび上昇した血清ＰＳＡレベルを有する９人の男性、７人の健康な女性、４人の腎細胞癌の男性患者、２人の前立腺上皮内癌（ＰＩＮ）患者、２人の膀胱および病理学的に正常な前立腺の移行上皮癌患者、１人の急性前立腺炎患者、１人の急性前骨髄球性白血病患者、１人の精巣癌患者、１人の腎細胞癌の女性患者、１人の肺癌患者、および１人の精巣嚢胞患者からのものであった。
血液サンプル加工／ＲＮＡ抽出
４mlの全抗凝血静脈血を３mlの氷冷ＰＢＳと混合し、ついで１４mlポリスチレン管中の８mlのフィコール（Pharmacia, Uppsala, Sweden）上に注意深く重層した。管を２００×g、４℃で３０分間遠心した。無菌パスツールピペットを用いて、バフィーコート層（約１ml）を注意深く除き、５０mlポリプロピレン管中、５０mlになるまで氷冷ＰＢＳで再希釈した。ついでこの管を２０００×g、４℃で３０分間遠心した。該上清を注意深くデカントし、該ペレットを滴下乾燥した。ついで１mlのＲＮazol Ｂを該ペレットに加え、製造業者の指示に従い（Cinna/Biotecx, Houston, TX.）、全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡ濃度および純度は、ベックマン（Beckman）ＤＵ ６４０分光光度計によるＵＶ分光法およびゲル分析により測定した。
ＰＣＲ感度の測定
ＲＮＡzol Ｂを用いて、ＬＮＣａＰ細胞および一定の比率（すなわち、１：１００、１：１０００など）のＬＮＣａＰ細胞とＭＣＦ−７細胞との混合物からＲＮＡを単離した。ついで、該アッセイの検出限界を測定するために、ＰＳＡとＰＳＭの両プライマーを用いて後記のとおりにネスティッドＰＣＲを行った。ＬＮＣａＰ：ＭＣＦ−７（１：１００,０００）ｃＤＮＡを蒸留水で希釈して、１：１,０００,０００の濃度を得た。ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７は既に本発明者らにより試験されており、ＰＳＭもＰＳＡも発現しないことが免疫組織化学的方法および通常のＰＣＲおよびネスティッドＰＣＲにより示されていたため、ＭＣＦ−７細胞を選んだ。
ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＳＡ外側プライマーは、ＰＳＡ ｃＤＮＡのエキソン４中のヌクレオチド４９４〜５１３（センス）およびエキソン５中のヌクレオチド９６０〜９７９（アンチセンス）である。これらのプライマーは、考えられる混入ゲノムＤＮＡからの合成産物から識別できるＰＳＡ ｃＤＮＡからの４８６bpのＰＣＲ生成物を与える。
PSA-494 5'-TAC CCA CTG CAT CAG GAA CA-3'
PSA-960 5'-CCT TGA AGC ACA CCA TTA CA-3'
ＰＳＡ内側上流プライマーはヌクレオチド５５９から始まり、下流プライマーはヌクレオチド８９４から始まり、３５５bpのＰＣＲ生成物を与える。
PSA-559 5'-ACA CAG GCC AGG TAT TTC AG-3'
PSA-894 5'-GTC CAG CGT CCA GCA CAC AG-3'
すべてのプライマーは、MSKCCマイクロケミストリー・コア・ファシリティー（Microchemistry Core Facility）により合成された。５μgの全ＲＮＡを、製造業者の推奨に従い、ランダムヘキサマープライマー（Gibco-BRL）およびスーパースクリプト（Superscript）II 逆転写酵素（Gibco-BRL）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。１μlのこのｃＤＮＡを外側プライマーＰＣＲ反応の出発鋳型として使用した。２０μlのＰＣＲ混合物には、０.５U Taqポリメラーゼ（Promega）、プロメガ（Promega）反応緩衝液、１.５mM ＭgＣl２、２００mM ｄＮＴＰおよび１.０μMの各プライマーが含まれていた。ついで、この混合物をパーキンエルマー（Perkin Elmer）９６００ＤＮＡサーマルサイクラーに移し、２５サイクルのインキュベーションを行った。該ＰＣＲプロフィールは、以下のとおりであった：９４℃×１５秒、６０℃×１５秒および７２℃×４５秒。２５サイクルの後、サンプルを氷上に載せ、この反応混合物の１μlを、該内側プラマーを用いる別の２５サイクルの鋳型として使用した。管の最初のセットを該サーマルサイクラーへ戻し、さらに２５サイクル行った。ＰＳＭ外側上流プライマー配列はヌクレオチド１３６８〜１３９０であり、該下流プライマーはヌクレオチド１９９５〜２０１５であり、６７bpのＰＣＲ生成物を与える。
PSM-1368 5'-CAG ATA TGT CAT TCT GGG AGG TC-3'
PSM-2015 5'-AAC ACC ATC CCT CCT CGA ACC-3'
ＰＳＭ内側上流プライマーはヌクレオチド１６８９〜１７１３に伸長し、該下流プライマーはヌクレオチド１８９９〜１９２３に伸長し、２３４bpのＰＣＲ生成物を与える。
PSM-1689 5'-CCT AAC AAA AGA GCT GAA AAG CCC-3'
PSM-1923 5'-ACT GTG ATA CAG TGG ATA GCC GCT-3'
該ＰＣＲアッセイの出発ＤＮＡ鋳型として、２μlのｃＤＮＡを使用した。該５０μlのＰＣＲ混合物には、１U Taqポリメラーゼ（Boehringer Mannheim）、２５０M ｃＮＴＰ、１０mM−β−メルカプトエタノール、２mM ＭgＣl２および５μlの１０×緩衝液混合物（１６６mM ＮＨ４ＳＯ４、６７０mMトリス, pＨ８.８および２mg/mlのアセチル化ＢＳＡを含有）が含まれていた。ＰＣＲは、以下のパラメーターを有するパーキンエルマー（Perkin Elmer）４８０ＤＮＡサーマルサイクラー中で行った：９４℃×４分で１サイクル、９４℃×３０秒、５８℃×１分および７２℃×１分で２５サイクル、ついで７２℃×１０分。ついでサンプルを氷冷し、この反応混合物の２.５μlを、該内側ＰＳＭプライマーを含有する新しい反応混合物を用いる別の２５サイクルの鋳型として使用した。ｃＤＮＡの質は、遍在性ハウスキーピング遺伝子であるβ−２−ミクログロブリン遺伝子配列（10）由来のプライマーを用いる対照反応を行うことにより確認した。これらのプライマーはエキソン２〜４に伸長し、６２０bpのＰＣＲ生成物を与える。これらのプライマーの配列は、以下のとおりである：
β-2（エキソン２） 5'-AGC AGA GAA TGG AAA GTC AAA-3'
β-2（エキソン４） 5'-TGT TGA TGT TGG ATA AGA GAA-3'。
全ＰＳＡ混合物および７〜１０μlの各ＰＳＭ反応混合物を、１.５〜２％アガロースゲル上で移動させ、エチジウムブロミドで染色し、イーグル・アイ・ビデオ・イメージング・システム（Eagle Eye Video Imaging System）（Stratagene, Torrey Pines, CA.）中で写真撮影した。結果を確認するために、少なくとも２回、アッセイを繰り返した。
ＰＣＲ生成物のクローニングおよび配列決定
ＴＡクローニング系（Invitrogen）を用いて、ＰＣＲ生成物をpCR IIプラスミドベクター中にクローニングした。これらのプラスミドを、標準的な方法（11）を用いてコンピテント大腸菌（E. coli）細胞中に形質転換し、マジック・マニプレップス（Magic Minipreps）（Promega）を用いてプラスミドＤＮＡを単離し、制限分析によりスクリーニングした。ついで、３５Ｓ−ｃＣＴＰ（NEN）およびシークエナーゼ（U.S. Biochemical）を用いてジデオキシ法（12）により二本鎖ＴＡクローンを配列決定した。ついで、記載されているとおりに、配列決定産物を６％ポリアクリルアミド／７M 尿素ゲル上で分析し、固定し、乾燥し、オートラジオグラフィーに付した。
サザン分析
製造業者の指示に従いポシ・ブロッター（Posi-blotter）（Stratagene）を用いる圧力ブロッティングにより、ＰＣＲ生成物を、エチジウム染色アガロースゲルからナイトラン（Nytran）ナイロン膜（Schleicher and Schuell）に移した。ＵＶストラタリンカー（Stratalinker）（Stratagene）を用いて、ＤＮＡを該膜にクロスリンキングした。ブロットを６５℃で２時間プレハイブリダイズし、ついで変性３２Ｐ−標識ランダムプライムド（13）ｃＤＮＡプローブ（ＰＳＭまたはＰＳＡのいずれか）とハイブリダイズした（6, 7）。ブロットを１×ＳＳＣ／０.５％ＳＤＳ中、４２℃で２回、０.１×ＳＳＣ／０.５％ＳＤＳ中、５０℃で２回、それぞれ２０分間洗浄した。膜を風乾し、ハイパーフィルム（Hyperfilm）ＭＰ（Amersham）を用いて室温で１〜３時間オートラジオグラフィーに付した。
＜結果＞
ＰＳＡおよびＰＳＭネスティッドＰＣＲアッセイ：
ネスティッドＰＣＲを適用することにより、検出レベルが、外側プライマーだけを用いた場合の平均値である１：１０,０００から、１：１,０００,０００より優れた値にまで上昇した。ＰＳＡおよびＰＳＭ−ＰＣＲの場合のこの感度の増加を示す希釈曲線を、それぞれ図１および２に示す。図１に示すとおり、ＰＳＡ外側プライマーセットの４８６bpの産物は、エチジウム染色により１：１０,０００希釈まで明確に検出可能であり、一方、ＰＳＡ内側プライマーの３５５bpの産物は、示しているすべての希釈において明確に検出可能である。また、図２では、ＰＳＭ外側プライマーの６４７bpの産物が通常のＰＣＲにより明確に検出可能なのは１：１０,０００までの希釈にすぎないが、ＰＳＭ内側ネスティッドＰＣＲの２３４bpの産物は１：１,０００,０００に希釈においても検出される。特異性を確認するために、対照のすべておよび患者のサンプルのほとんで、サザンブロット法を行った。それぞれの希釈曲線のサザンブロットから、該プライマーの特異性は確認されたが、感度の有意な増加は示されなかった。
陰性対照でのＰＣＲ：
材料および方法の項に記載したとおりに、患者およびボランティアからの４０個のサンプルについてネスティッドＰＳＡおよびＰＳＭ ＰＣＲを行った。図４８は、陽性対照に加えて４つの代表的陰性対照標本からの結果を示す。この図に示すとおり、ＲＮＡの完全性を確認するために、この研究の各標本はβ−２−ミクログロブリン対照と共にアッセイした。ＰＳＡプライマーを用いた場合には、これらのサンプルの３９個で陰性結果が得られたが、ＰＳＭネスティッドＰＣＲでは４個の陽性結果が得られた。これらの「偽陽性」の２つは、血清ＰＳＡ値が上昇し、前立腺が拡大しており、経直腸前立腺生検を受けたところ間質および線維筋過形成が示された患者に相当する。これらの両患者では、血清ＰＳＡレベルが上昇し続け、後日再び行った前立腺生検により前立腺癌が示された。精巣嚢胞で該診察室に現れた１人の患者は、ＰＳＭネスティッドＰＣＲで陽性結果を有することが判明し、これについては説明不可能である。残念なことに、この患者はフォローアップに戻らなかったため、このアッセイを繰り返すための別の血液サンプルを得られなかった。腎細胞癌の６１歳の男性患者で、ＰＳＡおよびＰＳＭの両プライマーを用いて陽性結果が得られた。この患者は、血清ＰＳＡレベルが正常であり、指による直腸検査が正常である。全体としては、陽性ＰＣＲ（他の臨床試験ではない）が前立腺癌の存在を正確に予想した２人の患者を除外すれば、３６／３８（９４.７％）の陰性対照がＰＳＭプライマーで陰性であり、３９／４０（９７.５％）がＰＳＡプライマーを用いて陰性であった。
患者のサンプル：
研究スタッフに各標本の性質が知られないように「盲検的」に、４０個の陰性対照と無作為に混合した７７人の患者からの１１７個のサンプルをアッセイした。既に記載したとおり、その患者のサンプルは、種々の異種群から選ばれたものである。いくつかの代表的な患者のサンプルを図４９に示すが、これは、限局性および散在性の両方の疾患の患者からの陽性結果に対応する。患者４および５は共にＤ段階の前立腺癌の患者であり、外側および内側の両プライマー対により陽性結果を示したが、これは、他のサンプルと比べて、大きな循環腫瘍細胞負荷を示すものである。既に示したとおり、ＰＳＭおよびＰＳＡプライマーはＬＮＣａＰ希釈曲線で同様の感度を示したが、ＰＳＭプライマーは該患者サンプルの６２.３％で微小転移を検出したのに対し、ＰＳＡプライマーは９.１％を検出したにすぎなかった。抗アンドロゲン治療を受けている実証された転移前立腺癌（Ｄ０〜Ｄ３段階）の患者で、ＰＳＭプライマーは１６／２４（６６.７％）で微小転移を検出したのに対し、ＰＳＡプライマーは６／２４（２５％）で循環細胞を検出したにすぎなかった。この研究では、ホルモン無反応性前立腺癌（Ｄ３段階）の６／７の患者が陽性だった。この研究で、ＰＳＡプライマーが微小転移細胞を示したのは、根治的前立腺切除術後のｐＴ３またはｐＴ４（局所的に進行した）のいずれかの前立腺癌患者のわずか１／１５（６.７％）であった。ＰＳＭプライマーは、これらの患者の９／１５（６０％）で循環細胞を検出した。興味深いことに、根治的前立腺切除術後のｐＴ２（器官限局性）前立腺癌の１３／１８（７２.２％）の患者で、ＰＳＭプライマーを用いることにより循環細胞が検出された。これらの患者のサンプルはいずれも、ＰＳＡ−ＰＣＲで陽性ではなかった。
免疫組織化学的方法（14）およびポリメラーゼ連鎖反応（3, 4, 5）を用いて最小の不顕性微小転移疾患を検出するための高感度改良法が、いくつかの悪性疾患について報告されている。前立腺癌における不顕性血行微小転移を検出するためのＰＣＲの適用については、Morenoら（2）が最初に記載しており、これはＰＳＡ由来プライマーを用いる通常のＰＣＲによるものである。
免疫組織化学的方法およびｍＲＮＡ分析によりインビトロのヒト前立腺腫瘍および前立腺癌細胞を研究したところ、ＰＳＡと比べて、ＰＳＭは退形成細胞、ホルモン無反応性細胞および骨転移（22, 23, 24）中で高度に発現されるようであった。血行転移能を有する細胞がより攻撃的な低分化細胞に相当すれば、それらは、ＰＳＡより高レベルのＰＳＭを１細胞当たりで発現すると考えられ、このためＲＴ−ＰＣＲによるその検出能が向上する。
ネスティッドＲＴ−ＰＣＲアッセイは高感度かつ特異的である。繰り返し行った場合でも、結果は確実に再現されている。ｃＤＮＡおよびＲＮＡの両方の安定性についての長期試験が、現在進行中である。両アッセイは、同様の大きさの少なくとも百万個の非前立腺細胞の中の１個の前立腺細胞を検出する能力を有する。このことは、ＰＳＭおよびＰＳＡの両プライマー間の比較の妥当性を証明するものである。インビボのヒト前立腺癌細胞およびインビトロのＬＮＣａＰ細胞において、同様のレベルのＰＳＭ発現が得られた。ＰＳＭ−ＰＣＲで陽性結果が出た２人の「陰性対照」患者が後で前立腺癌だと判明したという知見は、ＰＳＭ−ＰＣＲアッセイの特異性を支持するものであった。このことは、この技術が癌スクリーニングのための感動的な潜在的適用性を示唆する。ＰＳＡプライマーが病理学的に器官限局性の前立腺癌の患者の微小転移性細胞を正確に検出する能力については、該アッセイが高感度であるにもかかわらず、最近公開されたデータ（18）に対する有意性は得られなかった。「治癒的」な根治的前立腺切除術の後で不顕性循環前立腺細胞を有する限局性前立腺癌の患者がやや驚くほどに高い割合であるが、このことは、微小転移が前立腺癌の初期イベントであることを示唆するものである。
この強力で新しい療法を前立腺癌の患者で潜在的に段階づけおよび／または治療に対する反応を追跡するのに適用することについては、疑いなく、さらに研究の価値がある。不顕性腫瘍細胞の分子検出に比べると、前立腺癌拡張を検出するための現在の臨床的方法は不十分だと考えられる。
参考文献５
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実施例１１：
蛍光in-situハイブリダイゼーションによるコスミドクローン１９４および６８３の染色体上の位置決定：
まずＰＳＭをマッピングしたところ、これは染色体１１ｐ１１.２−ｐ１３上に位置していた（図５１〜５４）。さらにｃＤＮＡin-situハイブリダイゼーション実験の情報からは、ｑ腕上でｐ腕と同程度のハイブリダイゼーションが示された。ゲノムＤＮＡのより一層大きな断片がコスミドとして得られ、これらのうちの２つ（それぞれ約６０キロベースで、一方は３'へ、もう一方は５'へ伸長する）は、厳密性の低い条件下で第１１染色体のｐおよびｑに対する結合性を示した。しかしながら、より高い緊縮条件下では、１１ｑ１４〜ｑ２１での結合だけが残った。この結果は、ＰＳＭと非常に類似したもう１つの遺伝子が１１ｐ上に存在することを示唆する。なぜなら、それは、ゲノムＤＮＡの約１２０キロベースに対して非常に強く結合するからである（図５０）。
コスミドクローン１９４および６８３からの精製ＤＮＡを、ニックトランスレーションによりビオチンｄＵＴＰで標識した。標識プローブを剪断ヒトＤＮＡと一緒にし、５０％ホルムアミド、１０％デキストラン硫酸および２×ＳＳＣを含有する溶液中、別々にＰＨＡ刺激末梢血リンパ球由来の正常中期染色体とハイブリダイズさせたた。該ハイブリダイゼーションスライドをフルオレセイン結合アビジン中でインキュベーションすることにより、特異的ハイブリダイゼーションシグナルを検出した。シグナル検出の後、該スライドをヨウ化プロピジウムで対比染色し分析した。これらの第１の実験により、長短両腕上のグループＣ染色体の特異的標識を得た。この染色体は、そのサイズおよび形態に基づき、第１１染色体だと考えられている。一連の第２の実験では、第１１染色体セントロメア特異的プローブを該コスミドクローンとコハイブリダイゼーションした。厳密性の低いハイブリダイゼーションを行う場合に観察される交差反応性シグナルを除去するため、これらの実験は６０％ホルムアミド中で行った。これらの実験により、第１１染色体のセントロメアおよび長腕の特異的標識が得られた。１０個の特異的標識第１１染色体を測定したところ、コスミドクローンは、該セントロメアから染色体１１ｑ腕のテロメアまでの距離の４４％の位置（バンド１４ｑに相当する領域）にあることが示された。合計１６０個の中期細胞を調べたところ、１５３個で特異的標識が示された。
ＰＳＭゲノムＤＮＡの５'上流および３'下流領域のクローニング。ヒト繊維芽細胞ゲノムＤＮＡのバクテリオファージＰ１ライブラリー（Genomic Systems, St. Louis, MI）を、PierceらのＰＣＲ法によりスクリーニングした。ＰＳＭ ｃＤＮＡの５'または３'のいずれかの末端に位置するプライマー対を使用した。陽性コスミドクローンを制限酵素で消化し、ＰＳＭ ｃＤＮＡの５'または３'のいずれかの末端から構築したプローブを用いるサザン分析により確認した。陽性クローンp683は、ＰＳＭ ｃＤＮＡの５'領域および約６０kbの上流領域を含有する。クローン−１９４は、ＰＳＭ ｃＤＮＡの３'末端および約６０kbの下流を含有する。
実施例１２：
ペプチダーゼ酵素活性
ＰＳＭは２型膜タンパク質である。ほとんどの２型膜タンパク質は結合タンパク質、輸送タンパク質またはペプチダーゼである。ＰＳＭはペプチダーゼ活性を有するらしい。基質Ｎ−アセチル−アスパルチル−１４Ｃグルタミン酸（ＮＡＡＧ）を用いてＬＮＣａＰ細胞を調べたところ、グルタミン酸が遊離したため、カルボキシペプチダーゼとして働いている。インビトロで翻訳されたＰＳＭメーセージもこのペプチダーゼ活性を有していた。
その結果が示すところによれば、精漿はそのグルタミン酸含量に富み、その増加レベルが所望の生物学的活性を有するのであれば、未分解正常基質の活性を増強する阻害剤を設計しうる。また、生物学的活性を測定して、それがメッセージのレベルとどのように相関しているかを調べることができる。in-situ分析または免疫組織化学的プローブを用いて、間接的にではなく直接的に、組織の活性を調べてもよい。非常に類似したもう１つの遺伝子が第１１染色体のもう一方の腕上にあるため、単離し発現させた該クローン化遺伝子を用いて、基質の相違が何かを判定し、ＰＳＭ関連活性の同定にそれらの基質を用いることができる（例えば、循環細胞における転移の探索）。
実施例１３：
前立腺組織内のチャンネル型グルタミン酸受容体の分布
＜緒言＞：
中枢神経系（ＣＮＳ）での興奮性神経伝達は、主にグルタミン酸受容体により媒介される。ヒトＣＮＳでは、２つの型のグルタミン酸受容体（第２メッセンジャー系と共役している代謝調節型受容体、およびリガンド依存性イオンチャネルとして働くイオンチャンネル型受容体）が同定されている。ヒト前立腺組織内のイオンチャネル型グルタミン酸受容体の存在を調べた。
＜方法＞：
パラフィン包埋ヒト前立腺組織で抗GluR2/3および抗ビオチン免疫組織化学技術を用いて、グルタミン酸受容体発現の検出を行った。ＰＳＭ抗原は、グルタミン酸を遊離するように作用するニューロカルボキシペプチダーゼである。ＣＮＳにおいて、グルタミン酸はグルタミン酸作動性イオンチャンネルに作用することにより神経伝達物質として作用し、カルシウムイオンなどのイオン流動を増加させる。グルタミン酸シグナルが細胞活性に変換される１つの方法は、ＮＯシンターゼの活性化である。最近、ＮＯシンターゼはヒト組織中に存在することが判明した。ＮＯは主要なシグナル伝達機構であり、細胞の成長および死の制御、炎症に対する応答、平滑筋細胞収縮などに関与している。前立腺では、支質のほとんどが平滑筋である。前立腺はグルタミン酸作動性受容体に富むことが知見されており、この関係が解明され始めている。支質異常は、ＢＰＨの重要な特徴である。支質上皮相互作用はＢＰＨおよびＣａＰの両方で重要である。もう一方のグルタミン酸作動性受容体は、Ｇタンパク質を介して細胞の代謝を変化させる。
＜結果＞：
抗GluR2/3免疫反応性は前立腺支質に特有であり、前立腺上皮画分には存在しなかった。強力な抗GluR4免疫反応性が前立腺房の基底細胞で観察された。
＜考察＞：
イオンチャネル型グルタミン酸受容体サブタイプの分布が前立腺の支質と上皮の画分間で異なることについては、未だ記載されていない。前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）は同様の前立腺分布を有し、発現は上皮画分に限定される。ＰＳＭ抗原は、ＮＡＡＧ１からグルタミン酸を遊離するように作用するニューロカルボキシペプチダーゼであり、神経伝達物質である可能性もある。ＣＮＳで、グルタミン酸はグルタミン酸作動性（glutaminergic）イオンチャンネルに作用することにより神経伝達物質として作用し、カルシウムイオンなどのイオン流動を増加させる。グルタミン酸シグナルが細胞活性に変換される１つの方法は、ＮＯシンターゼの活性化である。最近、ＮＯシンターゼはヒト組織中に存在することが判明した。ＮＯは主要なシグナル伝達機構であり、細胞の成長および死の制御、炎症に対する応答、平滑筋細胞収縮などに関与している。前立腺では、支質のほとんどが平滑筋である。前立腺はグルタミン酸作動性受容体に富む。支質異常は、ＢＰＨの重要な特徴である。支質上皮相互作用はＢＰＨおよびＣａＰの両方で重要である。もう一方のグルタミン酸作動性受容体は、Ｇタンパク質を介して細胞の代謝を変化させる。グルタミン酸は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）のカルボキシペプチダーゼ活性を介して大脳皮質内で産生されうる。この場所で、ＰＳＭＡはアセチル−アスパルチル−グルタミン酸からグルタミン酸を切断する。総合すると、これらの観察はヒト前立腺におけるＰＳＭＡの機能を示唆するものであり、グルタミン酸は、おそらく上皮−支質相互作用を媒介する自己分泌および／またはパラ分泌シグナル伝達分子と考えられる。イオンチャンネル型グルタミン酸受容体は、ヒト前立腺内で独特の区画分布を示す。
カルボキシペプチダーゼ様活性の１つである基質は、ジペプチドＮ−アセチル−アスパルチルグルタミン酸（ＮＡＡＧ）であり、これは、中枢神経系で神経伝達物質として作用する今日見いだされている最良の基質の１つである。その異常な機能は、てんかん、ＡＬＳ、アルツハイマーなどの神経毒性障害と関連していると考えられる。ＰＳＭカルボキシペプチダーゼは、前立腺内で神経ペプチド伝達物質をプロセッシングするように働くと考えられる。神経ペプチド伝達物質は前立腺の神経内分泌細胞と関連しており、前立腺腫瘍の進行において何らかの役割を果たしていると考えられている。興味深いことに、癌ではＰＳＭ抗原の発現がアップレギュレーションされる。ＴＧＦ−ａ、ｂＦＧＦなどの前立腺増殖因子として作用することが公知のペプチドは、該抗原の発現をアップレギュレーションする。一方、ＴＮＦはＰＳＭをダウンレギュレーションする。ＴＧＦおよびＦＧＦは分裂促進因子活性化シグナル伝達経路を通じて作用するのに対し、ＴＮＦはストレス活性化プロテインキナーゼ経路を通じて作用する。したがって、ＰＳＭ発現のモジュレーションは治療の改善に有用である。
実施例１４：
ヒト前立腺癌中で発現される膜結合プテロイルポリガンマグルタミルカルボキシペプチダーゼ（葉酸加水分解酵素）の同定
ＰＳＭは、葉酸加水分解酵素およびカルボキシニューロペプチダーゼとしての活性を有すると考えられる。細胞障害性薬メトトレキセートが腫瘍毒素となるためには、それが該細胞内に入り、ポリガンマグルタミン酸化されて活性化される必要がある。なぜなら、ポリガンマグルタミン酸化形態は酵素基質として働き、また、ポリガンマグルタミン酸化形態または毒素は該細胞により保持されるからである。葉酸加水分解酵素は競合的反応で作用し、メトトレキセートを脱グルタミン酸化し、ついでこれは該細胞から逆拡散しうる。葉酸加水分解酵素にさらされ過ぎた細胞は、メトトレキセートに抵抗性である。このことは、前立腺癌が常にメトトレキセート療法に絶対無反応性である理由を説明しうる。なぜなら、前立腺および前立腺癌は多量の葉酸加水分解活性を有するからである。しかしながら、この活性に基づき、腫瘍部位で活性化されるプロドラッグ（例、Ｎ−ホスホノアセチル−１−アスパラギン酸−グルタミン酸）を生成させてもよい。ＰＡＬgluは、ＮＡＡＧを基質とする酵素活性の阻害剤である。
前立腺特異的膜抗原は前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰから免疫沈降し、それは葉酸加水分解酵素活性に富むことが示された。ガンマグルタミン酸化葉酸またはポリグルタミン酸化メトトレキセートは、この時点までの報告で最も強力な阻害剤であったキスカル酸よりはるかに強力なニューロペプチダーゼ活性阻害剤であり、ポリグルタミン酸化葉酸が好ましい基質であるという見解と一致する。
ペンタ−ガンマグルタミル−葉酸は非常に強力な活性阻害剤である（該酵素活性の阻害は、０.５uMのＫiによる）。ペンタ−ガンマグルタミル−葉酸は基質でもあり、葉酸は細胞内に輸送されるためには脱ポリガンマグルタミン酸化される必要があるため、このことは、この酵素が葉酸代謝で何らかの役割を果たしていることを示唆する。葉酸は、細胞機能および成長を助けるのに必要であり、したがって、この酵素は、前立腺および前立腺癌への葉酸の接近をモジュレーションする働きがあると考えられる。ＰＳＭが発現されるもう一方の領域は小腸である。葉酸の取り込みに関与する小腸の鍵酵素は、葉酸から末端ガンマグルタミニル基を逐次的にタンパク質分解により除去する際に、ガンマカルボキシペプチダーゼとして作用することが判明している。骨では、高レベルの異常ガンマグルタミン酸修飾タンパク質が存在しており、該タンパク質中では、ガンマグルタミル基がさらにカルボキシル化されてガンマカルボキシグルタミン酸またはＧＬＡを生成している。そのような１つのタンパク質はオステオネクチンである。
キャピラリー電気泳動により、アンドロゲン感受性ヒト前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ）からの膜調製物中でプテロイルポリ−ガンマ−グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ（加水分解）活性を調べた。該酵素は、前立腺特異的膜（ＰＳＭ）抗原を認識する抗前立腺モノクローナル抗体（７Ｅ１１−Ｃ５）の誘導体と免疫学的に交差反応する。ＰＳＭ酵素はメトトレキセートトリグルタマート（ＭＴＸＧlu３）および葉酸ペンタグルタマート（Ｐte Ｇlu３）からグルタミン酸を次第に放出させ、それぞれＭＴＸおよびＧｌｕを蓄積させるため、ＰＳＭ酵素はガンマ−グルタミル結合を加水分解するエキソペプチダーゼである。半精製膜結合酵素は、pＨ２〜１０で広域活性を有し、pＨ４.０で最大活性を示す。酵素活性は、ジチオトレイトール（０.２mM以上）により少し阻害されるが、還元型グルタチオン、ヘモシステインまたはp−ヒドロキシ安息香酸水銀（０.０５〜０.５mM）では阻害されなかった。ＬＮＣａＰ細胞膜とは対照的に、アンドロゲン無感受性ヒト前立腺（ＴＳＵ−Ｐrl、Ｄuke−１４５、ＰＣ−３）およびエストロゲン感受性乳房腺癌（ＭＣＦ−７）細胞から単離された膜は、比較しうる加水分解活性を示さないし、７Ｅ１１−Ｃ５とも反応しない。このようにして、ＬＮＣａＰ細胞において、エキソペプチダーゼ活性を示しこの細胞中で強く発現される葉酸加水分解酵素が同定された。
Ｎ−アセチルアスパルチルグルタミン酸（ＮＡＡＧ１）（図５９）を製造することにより、ＰＡＬＡグルタミン酸３のプロドラッグ戦略の効果を調べた。ＮＡＡＧの合成は、商業的に入手可能なガンマ−ベンジルアスパルタートから行い、これをピリジン中無水酢酸でアセチル化して、Ｎ−アセチルガンマ−ベンジルアスパルタートをほぼ定量的に得た。その後者を、ピリジン中、０℃で１時間ペンタフルオロフェニルトリフルオロアセタートで処理することにより、そのペンタフルオロフェニルエステルとして活性化した。この活性化エステルは、化合物１および４（図６０）の製造における中心物質である。ＴＨＦ−ＤＭＦ（テトラヒドロフラン、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド）中、ＨＯＡＴ（１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール）の存在下、還流温度で一晩、６をイプシロン−ベンジル−Ｌ−グルタマートと反応させ、水素化分解（Ｈ２、３０psi、１０％Ｐd／Ｃ、酢酸エチル中）によりベンジル保護基を除去すると、商業的に入手可能なＮＡＡＧ（Sigma）とあらゆる点で一致する生成物が得られた。
単なるアセタートではなく保護されたホスホノアセタート部を導入することにより、同様にして、ＰＡＬＡ−グルタミン酸３および類似体５を合成した。それは、比較的穏やかな条件下でエチル基を脱離させるジエチルホスホノ酢酸の機能に適合しうる。
商業的に入手可能なジエチルホスホノ酢酸をペンタフルオロフェニルアセタートと、ピリジン中０℃から室温で１時間処理し、ショートパスカラムクロマトグラフィーの後、対応するペンタオフルオロエステルをほぼ定量的に得た。ついでこれをガンマベンジルアスパルタートおよびＨＯＡＴとテトラヒドロフラン中、還流温度で３０分間反応させ、フラッシュカラムクロマトグラフィーの後、保護されたＰＡＬＡ７（Ｎ−ホスホノアセチルアスパルタート）を収率９０％で得た。ついで該遊離酸をそのペンタフルオロフェニルエステル８として活性化し、ついでそれを、ＴＨＦ−ＤＭＦ（９：１, v/v）の混合物中、還流温度で１２時間、デルタ−ベンジル−Ｌ−グルタマートおよびＨＯＡＴと反応させ、カラムクロマトグラフィーの後、完全に保護されたＰＡＬＡ−グルタミン酸９を収率６６％で得た。ベンジル基とエチル基の両方を１工程で脱保護することにより、エチル基の連続的脱離およびそれに続く脱ベンジル化を行った。したがって、保護ＰＡＬＡ−グルタミン酸をニートのトリメチルシリルクロリド中で還流するまで一晩加熱した。得られたビストリメチルシリルホスホナートエステル１０を、精製することなく水素化分解（Ｈ２、３０psi、１０％Ｐd／Ｃ、酢酸エチル）に付した。逆相カラムクロマトグラフィーおよびイオン交換樹脂により精製した後、所望の物質３を単離した。
アルファ−カルボキシル−保護グルタミン酸からホスホノグルタミン酸１４を製造することにより、類似体４および５を合成した。
商業的に入手可能なアルファ−ベンジル−Ｎ−Boc−Ｌ−グルタマート１１を、ＴＨＦの還流温度でニートのボランジメチルスルフィド錯体と反応させて、対応するアルコールを収率９０％で得た。常法（ＰpH３、ＣＢr４）により、これをブロミド１２に変換した。
亜リン酸トリエチルを用いるミカエリス−アルブゾフ反応により対応するジエチルホスホナート１３を得、これをトロフルオロ酢酸により窒素の位置で脱保護して遊離アミノ酸１４を得た。その後者をペンタフルオロフェニルエステル６または８のいずれかと、３に関して記載したのと同様の条件下で別々に縮合して、それぞれ１６および１５を得た。１５および１６を３と同様に脱保護して、所望の類似体４および５を得た。
ＤＯＮ（６−ジアゾ−５−オキソ−ノルロイシン）またはそのアスパラギン酸（１７など）およびグルタミン酸（１８など）類似体などのプリンおよびピリミジンの代謝阻害剤を一連の基質に加えた。
類似体２０を塩化オキサリル、ついでジアゾメタンで処理し、脱保護して（公知条件下）所望のアナログを得ることにより、化合物１７に変換する。また、アゾトマイシンは、ＰＳＭが類似体１７、１８および１９に作用した後で遊離されるＤＯＮへインビボで変換された後でのみ活性である。
また、全てではないがほとんどの化学療法は１つの仮定に基づいている。成長の早い細胞は正常細胞と比べて、栄養素に対する要求度が高い、というものである。したがって、該細胞はその近くの化学療法薬のほとんどを取り込む。このため、化学療法は、患者を生命の危機に直面させることがある重篤な二次効果（免疫系の減弱、毛の喪失など）と関連しているのである。傷害されてはならない部位を傷害することなく治癒の必要な部位を治癒する選択的かつ効果的な薬物は、代表的構造式２１および２２で例示される。
代表的化合物２１および２２は、ＰＳＭのいくつかの特異的効果および特徴、およびいくつかの新しく知見された細胞障害性分子（現在、作用機序は公知である）の独特の特徴に基づいて設計された。後者は一般にエンジインと称され、例えばダイネマイシンＡ ２３および／またはその活性類似体などが挙げられる。ダイネマイシンＡ ２３などの新規天然産物が最近単離されたことにより、医学および化学分野において非常に関心が高まってきている。それらは、ナノモルレベル以下で多数の癌細胞株に細胞毒性を示している。１つの問題点は、それらは毒性が高く、不安定で非選択的なことである。それらは、以下に示すラジカル機構によるＤＮＡ損傷によりインビトロで活性を示しているが、それらの高レベルの毒性は、それらがその経路でタンパク質、酵素などのいずれに対しても同等に損傷を与えうることを暗示するものである。
これらの分子は特異な構造的特徴を有し、そのため例外的な反応性を有する。ダイナマイシンＡ ２３は、アントラキノン部分がヒドロアントラキノン２４へ生物的に還元されるまでは比較的安定であるが、これにより一連のイベントが誘発され、バーグマン芳香環化Ｆによりジラジカル種２５が生成する。ジラジカル種２５は、ダイナマイシンＡの最終的な損傷刃（damaging edge）である。それは、いずれかの隣接分子（すなわちＤＮＡ）から２個のプロトンを引き抜いて、分子中にラジカルを生成する。今度はこれらのラジカルが分子状酸素と結び付いてヒドロペルオキシド中間体を与え、ＤＮＡの場合には、これが一本鎖または二本鎖切断および細胞死を引き起こす。もう１つの興味深い特徴は、多数の有機化学者の精力的な研究から得られた。彼らは、（＋）−ダイネマイシンＡ ２３および他のエンジインの全合成を行っただけでなく、より単純であるが活性なアナログ（例、２６）を設計し効率的に製造した。
エンジイン２６も、２３と同じメカニズムにより誘発され作用する。この観点は、本研究での提案と非常に関連性がある。すなわち、２７（２６の非常に近い類似体）をＮＡＡＧに結合させ、得られるＮＡＡＧ−２７分子（２１）が前立腺癌および転移細胞の付近を除く体内のあらゆる部位（血液、器官、正常前立腺細胞など）で不活性となるようにするのである。これに関して、ＮＡＡＧは以下の複数の役割を果たす：
− 可溶化および輸送：２６のタイプの類似体は疎水性であり水性媒体中で不溶性であるが、体内に固有の水溶性ジペプチドにより、基質２１は、ＮＡＡＧが輸送され体内に貯蔵されるのと同じ経路をたどるはすである。
− 認識、誘導および選択性：ＰＳＭの同族体は小腸および脳内に位置する。
後者に関しては、２７などの化合物はＮＡＡＧなどの多荷電ジペプチドに結合すると、血液脳関門を通過する可能性がない。前者に関しては、小腸内のＰＳＭ同族体濃度は、前立腺癌細胞中のＰＳＭ濃度に比べて非常に低い。さらに、前立腺への局所注射により、該プロドラッグの輸送選択性を向上させることができる。この戦略のもう１つの構想は、以下のように組み立てることができる。前立腺癌が戦争であり、該戦域の平和的環境の損傷を最小限にするために「スマート爆弾」が必要だとすると、２１はその「スマート爆弾」である。ＮＡＡＧはその誘導システムであり、ＰＳＭは誘発装置であり、２７は弾頭である。
２６およびその類似体は、ダイナマイシンＡの活性を発現する確立された活性分子である。それらの合成は本明細書中に記載されている。光学活性な２７の全合成は既に記載されているＧ。２８の製造のための合成スキームは、２７のものとほとんど同じであり、メトキシ基の位置だけが異なる。２８の場合には、メトキシ基は窒素に対してメタ位にある。これは２９のタイプの中間体を必要とし、これはMyers法の変法により製造されることとなる。化合物２８は２６と非常によく似ており、おそらく最も類似した光学活性類似体であろう。後者の活性は公知で非常に高い。
ＮＡＡＧは光学的に純粋であるため、それがラセミ体と混ざると中間体の精製が複雑になることがある。さらに、この系の成分を一度で修飾するためには、２１および２２のタイプの光学的に純粋な中間体を製造する。２７は、商業的に入手可能な物質から１７工程で製造した。２７のもう１つの興味深い特徴は、非常に類似した類似体２６と同様、矢印で示す２つの誘導装置を有することである。
該酸素および窒素は共に、バーグマン芳香環化およびそれによる所望の障害を引き起こしうる。いずれかの官能基の簡単な保護・脱保護操作により、該窒素または酸素中心におけるＮＡＡＧの選択的な位置づけが可能となるはずである。ＰＳＭは２１または２２のＮＡＡＧ部分を認識するはずであり、それによりグルタミン酸部分を脱離させるのである。これは、２７をＮ−アセチルアスパラギン酸に結合したままの状態に保つ。
Ｎ−アセチルアスパラギン酸などの系の分子内支援加水分解は、文献に十分に記載されている。該アミノ酸部分がそのような結合の加水分解を促進するはずである。ＮＡＡＧが窒素上に位置しこれが作用しない場合には、その代わりに、ＮＡＡＧを酸素に結合させてフェノール性エステル２２を得るが、これはそれ自体が不安定であり穏やかな条件下で除去される。ＰＳＭ特異的基質は、前立腺腫瘍細胞部位でプロドラッグを活性化して、それらの細胞を殺すように設計しうる。ＰＳＭ特異的基質は、良性前立腺過形成の治療に使用してもよい。
実施例１５：
ＰＳＭエキソン／イントロン結合配列のゲノム体制

エキソン 1 イントロン 1
1F. 鎖
CGGCTTCCTCTTCGG
cggcttcctcttcgg taggggggcgcgtcgcggag...tatttttca

1R. 鎖 ...ataaaaagtCCCACCAAA

エキソン 2 イントロン 2
2F. 鎖
ACATCAAGAAGTTCT
acatcaagaagttct caagtaagtccatactcgaag...

2R. 鎖 ...caagtggtcATTAAAATG

エキソン 3 イントロン 3
3F. 鎖
GAAGATGGAAATGAG
gaagatggaaatgag gtaaaatataaataaataaataa...

エキソン 4 イントロン 4
4F. 鎖
AAGGAATGCCAGAGG
aaggaatgccagagg taaaaacacagtgcaacaaa...

4R. 鎖 ...agagttgTCCCGCTAGAT

エキソン 5 イントロン 5
5F. 鎖
CAGAGGAAATAAGGT
cagaggaaataaggt aggtaaaaattatctctttttt...
...gtgttttctAGGTTAAAAATG

5R. 鎖 ...cacttttgaTCCAATTT

エキソン 6 イントロン 6
6F. 鎖
GTTACCCAGCAAATG
gttacccagcaatg gtgaatgatcaatccttgaat...

6R. 鎖 ...aaaaaaagtCTTATACGAATA

エキソン 7 イントロン 7
7F. 鎖
ACAGAAGCTCCTAGA
acagaagctcctaga gtaagtttgtaagaaaccargg...

7R . 鎖 ...aaacacaggttatcTTTTTACCCA

エキソン 8 イントロン 8
8F. 鎖
AAACTTTTCTACACA
aaacttttctacaca gttaagagactatataaatttta...

8R. 鎖 ...aaacgtaatcaTTTTCAGTTCTAC

エキソン 9F. イントロン 9
9F. 鎖
AGCAGTGGAACCAG
agcagtggaaccag gtaaaggaatcgtttgctagca...
...tttctagatAGATATGTCATTC

9R. 鎖 ...aaagaTCTGTCTATACAGTAA

エキソン 10 イントロン 10
10F. 鎖
CTGAAAAAGGAAGG
ctgaaaaaggaagg taatacaaacaaatagcaagaa...

エキソン 11 イントロン 11
11F. 鎖
TGAGTGGGCAGAGG
agagg ttagttggtaatttgctataatata...

エキソン 13 イントロン 12
12R. 鎖
GAGTGTAGTTTCCT
gtagtttcct gaaaaataagaaaagaatagat...

エキソン 14 イントロン 13
13R. 鎖
AGGGCTTTTCAGCT
agggcttttcagct acacaaattaaaagaaaaaaag...

エキソン 14 イントロン 14
14F. 鎖
GTGGCATGCCCAGG
gtggcatgcccagg taaataaatgaatgaagtttcca...

エキソン 16 イントロン 15
15R. 鎖
AATTTGTTTGTTTCC
aatttgtttgtttcc tacagaaaaaacaacaaaaca...

エキソン 16 イントロン 16
16F. 鎖
CAGTGTATCATTTG
cagtgtatcatttg gtatgttacccttcctttttcaaatt...
...tttcagATTCACTTTTTT

16R. 鎖 ...aaagtcTAAGTGAAAA

エキソン 17 イントロン 17
17F. 鎖
TTTGACAAAAGCAA
tttgacaaaagcaa gtatgttctacatatatgtgcatat...

17R. 鎖 ...aaagagtcGGGTTA

エキソン 18 イントロン 18
18F. 鎖
GGCCTTTTTATAGG
ggcctttttatagg taaganaagaaaatatgactcct...

18R. 鎖 ...aatagttgTGTAAACCC

エキソン 19 イントロン 19
19F. 鎖
GAATATTATATATA
gaatattatatata gttatgtgagtgtttatatatgtgtgt...

注: F: フォワード鎖
: R: リバース鎖
図１は、ＰＳＭ抗原のウエスタン分析の結果を示すオートラジオグラムである。レーン２のシグナルは、１００kDのＰＳＭ抗原を示す。ＥＧＦｒを陽性対照として使用し、これをレーン１に示す。ウサギ抗マウス（ＲＡＭ）抗体単独でのインキュベーションを陰性対照として用い、これをレーン３に示す。 図２は、ＰＳＭ抗原の免疫沈降法の結果を示すオートラジオグラムである。 図２Ａ〜２Ｄ：上側の２つの写真は、ＰＳＭ抗原について陽性に染色するＬＮＣａＰサイトスピンを示す。左下はＤＵ−１４５、右下はＰＣ−３サイトスピンであり、両者はＰＳＭ抗原発現について陰性である。 図３Ａ〜３Ｄ：上側の２つのパネルは、ＰＳＭ抗原について陽性に染色するヒト前立腺切片（ＢＰＨ）である。下側の２つのパネルは、ＰＳＭ抗原の発現について陽性に染色する侵襲性前立腺癌ヒト切片を示す。 Ｃｙｔ−３５６抗体による３５Ｓ−メチオニン標識ＬＮＣａＰ細胞の免疫沈降後の１００kDのＰＳＭ抗原。 エチジウムブロミドで染色された３％アガロースゲルであり、縮重ＰＳＭ抗原プライマーを用いて得たＰＣＲ生成物を示す。矢印は、１.１kb ＰＣＲ生成物であるサンプルＩＮ−２０を示し、これは、ＰＳＭ遺伝子をコードする部分ｃＤＮＡであることが後で確認された。 図６Ａ−６Ｂ：ＰＣＲ生成物のＴＡクローニングにより得たプラスミドＤＮＡの２％アガロースゲル。EcoRIで消化することにより、挿入物をＰＣＲ IIベクター（Invitrogen Corp.）から切り出した。１.１kbのＰＳＭ遺伝子部分ｃＤＮＡ産物を、ゲル１のレーン３に示す。 Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素を用いて出願人のＬＮＣａＰライブラリーで示されるｃＤＮＡのサイズを示すオートラジオグラム。 ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした後で得たＰＳＭ遺伝子の完全長クローンの制限分析。該挿入物を遊離するように、サンプルはNot IおよびSal I制限酵素で切断されている。 完全長ＰＳＭ遺伝子クローンのプラスミドサザンオートラジオグラム。サイズは約２.７kbである。 ＬＮＣａＰプロテアーゼ癌系およびＨ２６ ＲａｓでトランスフェクションされたＬＮＣａＰ細胞株に限定されているＰＳＭ発現を表すノーザンブロット。ＰＣ−３、ＤＵ−１４５、Ｔ−２４、ＳＫＲＣ−２７、ＨＥＬＡ、ＭＣＦ−７、ＨＬ−６０、その他はすべて陰性であった。 ＬＮＣａＰ細胞株にユニークな（レーン１）、およびＤＵ−１４５（レーン２）およびＰＣ−３細胞株（レーン３）に存在しない２.８kb ＰＳＭメッセージの発現を表すノーザン分析のオートラジオグラム。ＲＮＡサイズラダーを、左に示し（kb）、２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡバンドを右に示す。 図１２Ａ〜１２Ｂ：ＰＳＭ遺伝子プライマーを用いるヒト前立腺組織のＰＣＲの結果。レーンは、左から右へ番号が付されている。レーン１はＬＮＣａＰ、レーン２はＨ２６、レーン３はＤＵ−１４５、レーン４は正常前立腺、レーン５はＢＰＨ、レーン６は前立腺癌、レーン７はＢＰＨ、レーン８は正常、レーン９はＢＰＨ、レーン１０はＢＰＨ、レーン１１はＢＰＨ、レーン１２は正常、レーン１３は正常、レーン１４は癌、レーン１５は癌、レーン１６は癌、レーン１７は正常、レーン１８は癌、レーン１９はＩＮ−２０対照、レーン２０はＰＳＭ ｃＤＮＡである。 ＰＳＭ抗原（グリコシル化されていないもの）の等電点。 ＰＳＭ抗原の二次構造。 ＰＳＭ抗原の二次構造（続き）。 ＰＳＭ抗原の二次構造（続き）。 ＰＳＭ抗原の二次構造（続き）。 ＰＳＭ抗原の二次構造（続き）。 ＰＳＭ抗原の二次構造（続き）。 ＰＳＭ抗原の二次構造（続き）。 ＰＳＭ抗原の二次構造（続き）。 ＰＳＭ抗原の親水性プロット。 ＰＳＭ抗原の膜伸長セグメントの予想。 ニワトリ、ラットおよびヒトトランスフェリン受容体配列に対する相同性。 ニワトリ、ラットおよびヒトトランスフェリン受容体配列に対する相同性（続き）。 ニワトリ、ラットおよびヒトトランスフェリン受容体配列に対する相同性（続き）。 ニワトリ、ラットおよびヒトトランスフェリン受容体配列に対する相同性（続き）。 ニワトリ、ラットおよびヒトトランスフェリン受容体配列に対する相同性（続き）。 ニワトリ、ラットおよびヒトトランスフェリン受容体配列に対する相同性（続き）。 ニワトリ、ラットおよびヒトトランスフェリン受容体配列に対する相同性（続き）。 ニワトリ、ラットおよびヒトトランスフェリン受容体配列に対する相同性（続き）。 ニワトリ、ラットおよびヒトトランスフェリン受容体配列に対する相同性（続き）。 ニワトリ、ラットおよびヒトトランスフェリン受容体配列に対する相同性（続き）。 ニワトリ、ラットおよびヒトトランスフェリン受容体配列に対する相同性（続き）。 図１７Ａ〜１７Ｃ：前立腺細胞株におけるＰＳＭ抗原発現の免疫組織化学的検出。上部パネルは、ＬＮＣａＰ細胞における均一で高いレベルの発現を示す。中央パネルおよび下部パネルは、それぞれ、ＤＵ−１４５およびＰＣ−３細胞であり、どちらも陰性である。 ＰＳＭインビトロ転写／翻訳共役の産物を示すタンパク質ゲルのオートラジオグラム。グリコシル化されていないＰＳＭポリペプチドが８４kDaで認められ（レーン１）、ミクロソームを加えた後で合成されたＰＳＭ糖タンパク質が１００kDaで認められる（レーン２）。 トランスフェクションされた非ＰＳＭ発現ＰＣ−３細胞でのＰＳＭ発現を検出するウエスタンブロット分析。ＬＮＣａＰ膜（レーン１）、ＬＮＣａＰ粗製溶解物（レーン２）、およびＰＳＭでトランスフェクションされたＰＣ−３細胞（レーン４）では、１００kDa ＰＳＭ糖タンパク質種が明らかに認められるが、天然ＰＣ−３細胞（レーン３）ではそれが検出できない。 正常ヒト組織におけるＰＳＭ ｍＲＮＡ発現についてアッセイするリボヌクレアーゼプロテクションゲルのオートラジオグラム。放射能標識１kb ＤＮＡラダーを（Gibco-BRL）をレーン１に示す。未消化プローブは４００ヌクレオチドであり（レーン２）、予想保護ＰＳＭバンドは３５０ヌクレオチドである。ｔＲＮＡ対照をレーン３に示す。ヒト前立腺で強いシグナルが認められ（レーン１１）、ヒト脳（レーン４）およびヒト唾液腺（レーン１２）で、非常にかすかであるが検出可能なシグナルが認められる。 ヌードマウス中およびヒト前立腺組織中で成長させたＬＮＣａＰ腫瘍中のＰＳＭ ｍＲＮＡの発現についてアッセイするリボヌクレアーゼプロテクションゲルのオートラジオグラム。３２Ｐで標識された１kb ＤＮＡラダーをレーン１に示す。２９８ヌクレオチドの未消化プローブをレーン２に、ｔＲＮＡ対照をレーン３に示す。ＬＮＣａＰ細胞（レーン４）、マトリゲルを用いるまたは用いないヌードマウス中で正所的に成長させたＬＮＣａＰ腫瘍（レーン５および６）、およびヌードマウスの皮下に移植し成長させたＬＮＣａＰ腫瘍（レーン７）では、ＰＳＭ ｍＲＮＡの発現がはっきりと検出できる。ＰＳＭ ｍＲＮＡの発現は、正常なヒト前立腺（レーン８）、および適度に分化したヒト前立腺腺癌（レーン１０）でも認められる。良性過形成を有するヒト前立腺組織のサンプルでは、非常にかすかな発現が認められる（レーン９）。 生理学的用量の種々のステロイドで２４時間処理されたＬＮＣａＰ細胞におけるＰＳＭ発現についてのリボヌクレアーゼプロテクションアッセイ。３２Ｐで標識されたＤＮＡラダーをレーン１に示す。２９８ヌクレオチドの未消化プローブをレーン２に示し、ｔＲＮＡ対照をレーン３に示す。ＰＳＭ ｍＲＮＡの発現は、木炭除去培地での未処理ＬＮＣａＰ細胞で最も高い（レーン４）。ＤＨＴ（レーン５）、テストステロン（レーン６）、エストラジオール（レーン７）およびプロゲステロン（レーン８）で処理したＬＮＣａＰ細胞においては、ＰＳＭ発現の有意な減少が認められ、デキサメタゾンに対してはほとんど反応しなかった（レーン９）。 サザンおよびノーザンブロット法を用いて得た、トランスフェクトダニング（transfect Dunning）細胞株中のＰＳＭ ＤＮＡおよびＲＮＡの存在の結果を示すデータ。 図Ａは、サイトカインでトランスフェクションされた細胞が非修飾細胞を教える能力を示す。投与は、親側腹部または前立腺細胞に対して行った。その結果は、微環境考慮点を示す。図Ｂは、サイトカインでトランスフェクションされた細胞が非修飾細胞を教える能力を示し、特定の部位での実際の効力を示す。該腫瘍を前立腺細胞に移植し免疫細胞で処理した（２つの異なる部位について行った）。 原発性腫瘍の成長阻害におけるサイトカインの効力に関するものである。動物に非修飾親腫瘍細胞を投与し、ワクチンをトランスフェクションされた細胞として投与した。げっ歯類の腫瘍の前立腺切除術により、生存率が増加する。 いずれかのＰＳＡを用い、ネスティッド（nested）プライマーを用いるＰＣＲ増幅により、１０,０００個のＭＣＦ−７細胞あたり約１個の細胞検出レベルから、百万個のＭＣＦ−７細胞あたり１個の細胞検出レベルを上回るまで、前立腺細胞の検出レベルが向上した。 いずれかのＰＳＭ由来プライマーを用い、ネスティッドプライマーを用いるＰＣＲ増幅により、１０,０００個のＭＣＦ−７細胞あたり約１個の細胞検出レベルから、百万個のＭＣＦ−７細胞あたり１個の細胞検出レベルを上回るまで、前立腺細胞の検出レベルが向上した。 ＰＳＭ−ＰＣＲの代表的なエチジウム染色ゲル写真。レーンＡ中を移動したサンプルは、外側プライマーから生成したＰＣＲ生成物を示し、Ｂと表示したレーン中のサンプルは、内側プライマー対の産物である。 ＰＳＭサザンブロットオートラジオグラフ。サザンブロット分析の感度は、エチジウム染色の感度を上回った。これは、外側産物が図３では見えないが、図４に示すサザンブロット法では検出可能ないくつかのサンプルで示されるとおりである。 臨床段階、血清ＰＳＡおよびＰＡＰ値、およびアッセイ結果に関して分析された１６人の患者の特徴。 ＲＮＡ開始部位からの５００bpのＤＮＡを含むp683の３kb XhoI断片のＤＮＡ配列を決定した。配列６８３ＸＦＲＶＳは、ＰＳＭプロモーターの５'遠位末端から出発する。 図３１Ａの配列の続き。 図３１Ｂの配列の続き。 図３１Ｃの配列の続き。 ＰＳＭプロモーター上の潜在的結合部位。 ＰＳＭ上流断片／ＣＡＴ遺伝子キメラのプロモーター活性。 ＰＳＭとＰＳＭ' ｃＤＮＡとの比較。ＰＳＭ ｃＤＮＡ（５）の５'末端の配列を示す。下線を付した領域は、ＰＳＭ ｃＤＮＡ配列中には存在するがＰＳＭ' ｃＤＮＡ中には存在しないヌクレオチドを示す。枠で囲んだ領域は、ＰＳＭ抗原の推定膜貫通ドメインを示す。アステリスク（＊）は、ＰＳＭ'の推定翻訳開始部位を示す。 ＰＳＭおよびＰＳＭ' ｃＤＮＡ配列およびアンチセンスＰＳＭ ＲＮＡプローブを示す図である（ｂ）。完全コーディング領域を有するＰＳＭ ｃＤＮＡ配列（5）。（ｃ）網影部分および中空枠部分は、ＰＳＭおよびＰＳＭ'中の配列同一性を示す。線影枠部分は、ＰＳＭ'にない配列を示す。該アンチセンスプローブに相補的なｃＤＮＡ配列の領域を、配列間の破線で示す。 一次前立腺組織におけるＰＳＭ特異的プローブを用いるＲＮアーゼプロテクションアッセイ。全細胞ＲＮＡをヒト前立腺サンプル（正常前立腺、ＢＰＨおよびＣａＰ）から単離した。ＰＳＭおよびＰＳＭ'のスプライシングされた変異体を右側に矢印で示す。左のレーンはＤＮＡラダーである。種々の患者からのサンプルを以下のように分類した：レーン３〜６、ＣａＰ、前立腺癌；ＢＰＨ、良性前立腺肥大、レーン７〜９；正常、正常前立腺組織、レーン１０〜１２。レーン５および９を読み取るために、より長時間オートラジオグラフを露光した。 腫瘍指数、ＰＳＭおよびＰＳＭ'の発現の定量。ＰＳＭおよびＰＳＭ'（図３）の発現をデンシトメトリーにより定量し、Ｙ軸上にＰＳＭ／ＰＳＭ'の割合として表した。一次ＣａＰ、ＢＰＨおよび正常前立腺組織について、それぞれ３つのサンプルを定量した。ＬＮＣａＰについては、２つのサンプルを定量した。「正常」は正常前立腺組織である。 膜に結合したＰＳＭおよびサイトゾル中のＰＳＭ'の特徴づけ。 イントロン１Ｆ：順配列。イントロン１は、腫瘍細胞中の染色体不安定性と関連する領域と考えられるいくつかのトリヌクレオチド反復を含有する。ＬＮＣａＰ細胞と一次前立腺組織とは同じであるが、ＰＣ−３およびＤｕ−１４５腫瘍ではこれらのトリヌクレオチド反復レベルが実質的に変化しており、このことは、それらがＰＳＭの発現を欠くことと関係している可能性がある。 イントロン１Ｒ：逆配列。 図４０Ａの配列の続き イントロン２Ｆ：順配列。 イントロン２Ｒ：逆配列。 イントロン３Ｆ：順配列。 図４３Ａの配列の続き イントロン３Ｒ：順配列。 図４４Ａの配列の続き イントロン４Ｆ：順配列。 図４５Ａの配列の続き イントロン４Ｒ：順配列。 図４６Ａの配列の続き ＰＳＭの５'転写開始部位の上流のゲノム領域の配列。 図４７Ａの配列の続き 図４７Ｂの配列の続き 図４７Ｃの配列の続き 該研究で用いた代表的な陰性および陽性対照を示すエチジウムブロミド染色ゲルの写真。サンプル１〜５は、それぞれ、前立腺炎の男性、健康な女性ボランティア、ＢＰＨの男性、ＬＮＣａＰ細胞の対照１：１,０００,０００希釈物、および腎細胞癌の患者から得た。それぞれの反応の下には、対応する対照反応を示すが、これは、ＲＮＡの完全性を保証するためにβ−２−ミクログロブリンプライマーを用いて行った。これらの陰性対照のいずれについてもＰＣＲ生成物は検出されなかった。 限局性または散在性のいずれかの前立腺癌の選ばれた患者における、ＰＳＭプライマーを用いる代表的な陽性ＰＣＲ結果を示すゲルの写真。サンプル１〜５は、それぞれ、臨床的に限局したＴ１Ｃ段階の疾患、器官限局性疾患および陰性血清ＰＳＡを有する根治的前立腺切除術を受けた患者、局所進行疾患および陰性血清ＰＳＡを有する根治的前立腺切除術を受けた患者、治療されたＤ２段階の疾患の患者、および治療されたホルモン無反応性疾患の患者から得た。 コスミド構造に基づくＰＳＭの染色体位置。 第１１染色体がＰＳＭ遺伝子配列を含有していたことをサザン分析により示すヒト単染色体体細胞ハイブリッドブロットである。PstI制限酵素で消化し、ＰＳＭ ｃＤＮＡでプローブしたＤＮＡパネル。レーンＭおよびＨは、マウスおよびハムスターＤＮＡを示す。数字は、そのハイブリッドにおけるヒト染色体ＤＮＡに対応する。 ＰＳＭ放射能標識ＲＮＡプローブを用いるリボヌクレアーゼプロテクションアッセイは、ＰＳＭ ｍＲＮＡ発現がＡＴ６.１−１１クローン１では豊富であるが、ＡＴ６.１−１１クローン２ではそうでないことを示し、そのため、ＰＳＭを１１ｐ１１.２−１３領域に対してマッピングする。 ノーザンブロット法およびＲＮアーゼプロテクションアッセイによるＰＳＭ ＲＮＡの組織特異的発現。 サザンブロット法およびin-situハイブリダイゼーションによる、ヒト第１１染色体の１１ｐ１１.２−ｐ１３領域に対するＰＳＭ遺伝子のマッピング。 潜在的反応要素の図。 ＰＳＭ遺伝子のゲノム体制。 転移前立腺細胞の図。 ＰＳＭゲノムＤＮＡの核酸は、転写開始部位から５プライム（prime）離れて読み取られる。配列上の数字は、該開始部位の上流のヌクレオチドを示す。したがって、ヌクレオチド番号１２１は、通常の番号付けでは実際には−１２１となる。 図５８Ａの配列の続き。 図５８Ｂの配列の続き。 ＮＡＡＧ１、アシビジン、アゾトマイシンおよび６−ジアゾ−５−オキソノルロイシン（ＤＯＮ）を示す。 Ｎ−アセチルアスパルチルグルタミン酸（ＮＡＡＧ１）の製造。 Ｎ−アセチルアスパルチルグルタミン酸（ＮＡＡＧ１）合成。 Ｎ−ホスホノアセチルアスパルチル−Ｌ−グルタミン酸の合成。 ５−ジエチルホスホノン−２ アミノベンジル吉草酸中間体の合成。 類似体４および５の合成。 ＤＯＮ、類似体１７〜２０を示す。 標的化トラッグデリバリーの基質、類似体２１および２２。 ダイネマイシンＡおよびその作用機序。 類似体２８の合成。 中間体類似体２８の合成。 ＰＡＬＡの結合点。 基質２１についての作用機序。 イントロン１Ｆ：順配列。 図７２Ａの配列の続き 図７２Ｂの配列の続き 図７２Ｃの配列の続き イントロン１Ｒ：逆配列 図７３Ａの配列の続き 図７３Ｂの配列の続き 図７３Ｃの配列の続き 図７３Ｄの配列の続き イントロン２Ｆ：順配列。 図７４Ａの配列の続き 図７４Ｂの配列の続き イントロン２Ｒ：逆配列。 図７５Ａの配列の続き 図７５Ｂの配列の続き イントロン３Ｆ：順配列。 図７６Ａの配列の続き イントロン３Ｒ：逆配列。 図７７Ａの配列の続き イントロン４Ｆ：順配列。 図７８Ａの配列の続き 図７８Ｂの配列の続き イントロン４ＲＦ：逆配列。 図７９Ａの配列の続き 図７９Ｂの配列の続き 図７９Ｃの配列の続き 図７９Ｄの配列の続き エキソンおよび１９個のイントロン結合配列のＰＳＭゲノム体制。該エキソン／イントロン結合（実施例１５を参照されたし）は以下のとおりである： １．bp３８９〜３９０のエキソン／イントロン１、 ２．bp４９０〜４９１のエキソン／イントロン２、 ３．bp６８１〜６８２のエキソン／イントロン３、 ４．bp７８４〜７８５のエキソン／イントロン４、 ５．bp９１１〜９１２のエキソン／イントロン５、 ６．bp１０９６〜１０９７のエキソン／イントロン６、 ７．bp１１９０〜１１９１のエキソン／イントロン７、 ８．bp１２８９〜１２９０のエキソン／イントロン８、 ９．bp１３７５〜１３７６のエキソン／イントロン９、 １０．bp１４９６〜１４９７のエキソン／イントロン１０、 １１．bp１５７９〜１５８０のエキソン／イントロン１１、 １２．bp１６４０〜１６４１のエキソン／イントロン１２、 １３．bp１７０８〜１７０９のエキソン／イントロン１３、 １４．bp１８０３〜１８０４のエキソン／イントロン１４、 １５．bp１８９２〜１８９３のエキソン／イントロン１５、 １６．bp２１５８〜２１５９のエキソン／イントロン１６、 １７．bp２２４０〜２２４１のエキソン／イントロン１７、 １８．bp２３３４〜２３３５のエキソン／イントロン１８、 １９．bp２６４４〜２６４５のエキソン／イントロン１９。

Claims (1)

  1. プロモータ活性を備えた単離された核酸であって、選択的にスプライスされた前立腺特異的膜抗原をコードする遺伝子の転写に関連したプロモータ配列に対応する連続的ヌクレオチドを具備し、その構造内に、位置５８のメチオニンで始まり位置７５０のアラニンで終わる図４７Ａ〜図４７Ｄに記載したアミノ酸配列をもった連続的アミノ酸を有するが、図４７Ａ〜図４７Ｄに記載した位置１〜位置５７のアミノ酸配列をもった連続的アミノ酸を有さない単離された核酸。
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