JP2005143333A

JP2005143333A - 魚類の養殖における病原性微生物の防除および有機物分解のための方法および構造物

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Publication number: JP2005143333A
Application number: JP2003382430A
Authority: JP
Inventors: Masashige Maeda; 昌調前田; Kosuke Noguchi; 浩介野口
Original assignee: MIYAZAKI TLO KK; Miyazaki TLO KK
Current assignee: MIYAZAKI TLO KK; Miyazaki TLO KK
Priority date: 2003-11-12
Filing date: 2003-11-12
Publication date: 2005-06-09
Anticipated expiration: 2023-11-12
Also published as: JP4469941B2

Abstract

【課題】本発明は、魚類の養殖に際し、病原性微生物または病原性ウイルスの増殖を抑制する方法および養殖水域中のまたは養殖水域の底土に蓄積した有機物を分解する方法ならびにそのための構造物を提供する。
【解決手段】本発明は、魚類の養殖に際し、病原性微生物および／または病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有するアルテロモナス（Alteromonas）属に属する細菌を養殖水中に添加することにより病原性微生物または病原性ウイルスの増殖を抑制する方法に関する。本発明はまた、該細菌を担持する構造物に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、魚類の養殖に際して疾病を防除しまたは養殖水域底土環境の向上を図るための方法および構造物に関する。

魚類の養殖においては、病原性微生物または病原性ウイルスの増殖による疾病の発生により甚大な損害が発生することがある。魚類の養殖における疾病防除には、抗生物質が多用されている。また、卵や仔魚に感染する真菌などの防除にはホルマリンやマラカイトグリーン等が暫定的に使用されている。しかし、薬剤耐性菌の出現等の理由により、これらの薬剤の効果が低下する事態が起きている。また、水中に添加された抗生物質等は水流により容易に拡散されるため効果は一時的なものとなる。このように、魚類の養殖において疫病防除を行うことができる有効な方法、特に持続的に作用効果を発揮する方法、は未だ存在しない。

細菌等の微生物が有する抗菌性を利用して病原性微生物またはウイルスを防除することができれば、抗生物質等を添加する従来技術と比較して、より持続的な作用が期待できる。これまでに、甲殻類の養殖においてアルテロモナス属細菌を添加して病原性微生物または病原性ウイルスの増殖を抑制する技術は開示されている（特許文献１および特許文献２参照）。しかしながら、魚類の養殖において同様の作用効果が奏されることは確認されていない。当業者であれば、甲殻類におけるのと魚類におけるのとでは病原性微生物または病原性ウイルスがその病原性を発揮する作用機序が全く異なっており、甲殻類での上記知見が必ずしも魚類に応用できないことは理解できる。

一方、養殖底土には、残存した配合飼料や魚類の糞が沈降し蓄積して、魚粉を主体とした配合飼料または魚類の糞を起源とするタンパク質を主体とする、硫黄、窒素およびリンを含んだ有機物からなるヘドロ等を形成し、有毒ガス（硫化水素等）の生産や赤潮発生の原因となっている。また、それらの現象により魚類の成長不良、病原性細菌または病原性ウイルスによる感染、大量斃死などが引き起こされる。そこで養殖水域底土を改善するために耕運やバチルス菌などの陸生細菌散布が行われているが、陸生細菌が海水中では増殖できない等の理由から効果は一時的である。このように、養殖水域底土環境の改善を持続的に行うことができる方法も未だ存在しない。

養殖水中または養殖底土中のヘドロ等の有機物を分解するために、水中で生息する細菌を利用する方法が考えられる。これまでに、海洋性の細菌であるアルテロモナス属細菌が多糖類を分解する能力を有することは知られているが（特許文献３参照）、養殖漁業で問題となるタンパク質に由来する有機物を分解するか否かに関しては確認されていない。

特開平０５−０７６３５１号公報特開平０９−２０６０６７号公報特開平０８−２９８９３７号公報

本発明が解決しようとする課題は、魚類の養殖に際し、病原性微生物または病原性ウイルスの増殖を抑制する方法および養殖水域中のまたは養殖水域の底土に蓄積した有機物を分解する方法を提供することである。

本発明が解決しようとする課題はさらにまた、魚類の養殖に際し、病原性微生物および／または病原性ウイルスの増殖を抑制することならびに有機物を分解することを同時且つ持続的に行うための構造物を提供することである。

すなわち本発明は、以下の発明を包含する。
（１）魚類の養殖に際し、病原性微生物および／または病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有するアルテロモナス（Alteromonas）属に属する細菌を養殖水中に添加することにより病原性微生物または病原性ウイルスの増殖を抑制する方法。
（２）病原性微生物および／または病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有するアルテロモナス属に属する細菌を養殖水中に添加することにより、養殖水域中のまたは養殖水域の底土に蓄積した有機物を分解する方法。
（３）上記の有機物が、ヘドロ中の、魚粉を主体とした配合飼料または魚類の糞を起源とするタンパク質を主体とする、硫黄、窒素およびリンを含んだ有機物である上記（２）に記載の方法。
（４）病原性微生物および／または病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有するアルテロモナス属に属する細菌を担持してなる魚類養殖用構造物を養殖水中に添加することを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）病原性微生物および／または病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有するアルテロモナス属に属する細菌を担持してなる魚類養殖用構造物。
（６）上記の構造物が魚類養殖用飼料、網イケスの支持柱、漁礁または小粒子である上記（５）に記載の魚類養殖用構造物。

本発明により、魚類の養殖に際し、病原性微生物または病原性ウイルスの増殖を抑制する方法が提供される。

本発明により、養殖水域中のまたは養殖水域の底土に蓄積した有機物を分解する方法が提供される。

本発明によりさらにまた、魚類の養殖に際し、病原性微生物および／または病原性ウイルスの増殖を抑制することならびに有機物を分解することを同時且つ持続的に行うための構造物が提供される。

以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明は第一に、魚類の養殖に際し、病原性微生物および／または病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有するアルテロモナス属に属する細菌を養殖水中に添加することにより病原性微生物または病原性ウイルスの増殖を抑制する方法に関する。細菌は自ら増殖する能力を有しているため、抗生物質を添加する従来技術と比較してより持続的に効果が奏される。

本発明は第二に、病原性微生物および／または病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有するアルテロモナス属に属する細菌を養殖水中に添加することにより、養殖水域中のまたは養殖水域の底土に蓄積した有機物を分解する方法に関する。

本発明において「魚類」とは当業者にとって自明である任意の魚類を意味するが、例えば、タイ、ハマチ、ヒラメ、カンパチ、シマアジ、ギンザケ、フグ等の海水魚、またはアユ、ニジマス、ウナギ、ヤマメ、アマゴ、イワナ、ワカサギ等の淡水魚が挙げられる。

本発明において「病原性微生物および／または病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有するアルテロモナス属に属する細菌」とは、病原性微生物および／または病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有し、アルテロモナス属に属する任意の細菌を意味し、例えばアルテロモナス・マクレオディ（Alteromonas macleodii）、アルテロモナス・ハロプランクティス(A. haloplanktis)、アルテロモナス・エスペジアナ(A. espejiana)、アルテロモナス・ウンディナ(A. undina)、アルテロモナス・ルブラ (A. rubra)、アルテロモナス・ハネダ (A. hanedai)、アルテロモナス・バーガ(A. vaga)などを意味する。

病原性微生物および／または病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有するアルテロモナス属に属する細菌のうちで本発明に使用されるのに特に好ましい細菌は、本発明者により発見されアルテロモナス・マクレオディEKZ-2株と命名された細菌である。なお、このアルテロモナス・マクレオディEKZ-2株は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM P-19541として寄託されている。

本発明において「細菌を養殖水中に添加する」とは、適当な細菌を直接に、または該細菌を担体に担持させたものを、養殖水中に添加することを意味する。「添加」の形態は任意であってよく、例えば細菌が含まれる懸濁液を養殖水域に散布もしくは噴霧する形態、または、該細菌を担体に担持させたものを養殖水中に散布、投入、設置する形態が挙げられるがこれらに限られない。病原性微生物および／または病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有するアルテロモナス属に属する細菌を担持してなる魚類養殖用構造物を養殖水中に添加することが好ましい。該構造物については後の記載を参照されたい。

本発明において「病原性微生物」とは対象とする魚類に応じて変化するものであるが、例えば病原性の細菌が挙げられ、例えば、病原性細菌としてはビブリオ・アンギララム(Vibrio anguillarum)、エドワジエラ・タルダ（Edwardsiella tarda）、サプロレジナ・ディクリナ(Saprolegina diclina)、デルモシスティディウム・アンギラ(Dermocystidium anguillae)、キャンディダ・サケ (Candida sake)などが挙げられる。

本発明において「病原性ウイルス」とは対象とする魚類に応じて変化するものであるが、例えば伝染性造血器壊死症ウイルス（IHNV）、イリドウイルス（LCDV）、ノダウイルス（SJNNV）、ビルナウイルス(YAV)、ラブドウイルス (HIRRV) 等が挙げられる。

本発明において「養殖水域中のまたは養殖水域の底土に蓄積した有機物」とは、例えばヘドロ、動植物または動植物プランクトンの死骸、養殖魚類用飼料の残留物、魚類の糞を意味し、特に、ヘドロ中の、魚粉を主体とした配合飼料または魚類の糞を起源とするタンパク質を主体とする有機物を意味する。該有機物は硫黄、窒素およびリンを含んでいる場合がある。

本発明は第三に、病原性微生物および／または病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有するアルテロモナス属に属する細菌を担持してなる魚類養殖用構造物に関する。該構造物は、上述した本発明に係る、魚類の養殖に際し病原性微生物または病原性ウイルスの増殖を抑制する方法、および養殖水域中のまたは養殖水域の底土に蓄積した有機物を分解する方法に使用することができる。

該構造物中に上記のアルテロモナス属細菌が担持されており、該構造物が養殖水中に添加されると、該アルテロモナス属細菌が構造物内で増殖して徐々に流出し構造物外で病原性微生物および／または病原性ウイルスの増殖を抑制するとともに、養殖水域中のまたは養殖水域の底土に蓄積した有機物を分解する。該構造物が水中に添加された場合、該アルテロモナス属細菌は構造物内に担持されているか、または構造物外に流出したとしてもその流出速度は緩やかであるから、該アルテロモナス属細菌による有利な作用効果は持続的なものである。さらにまた、構造物中に担持された該アルテロモナス属細菌が、該構造物が養殖水中に添加された後も構造物中で増殖を続けることができる場合は、該アルテロモナス属細菌による有利な作用効果はより一層持続的なものとなるためより好ましい。

本発明における「構造物」は、その全部または一部が、病原性微生物および／または病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有するアルテロモナス属に属する細菌が付着可能な部分からなっている。該細菌は種々の材料に付着する性状があるため、該付着可能部分は単独または組み合わされた種々の材料からなっていてよく、例えば糖質、タンパク質、脂質、核酸などを含む養殖魚類用飼料を構成する材料、天然のまたは合成された繊維、天然のまたは合成された樹脂（例えば生分解性プラスチックおよび生分解性樹脂）、コンクリート、セラミックス、珊瑚砂、岩石（例えば砂利）、木竹炭、木材などの材料からなっていてよい。生分解性プラスチック、生分解性樹脂、木材などの生分解性材料を使用した場合には、当該付着可能部分は一定期間経過後に水中で分解・消失するので底土中に残存することがなく好適である。当該部分は平滑構造（例えば平滑な材料表面）を有していても多孔質構造を有していてもよいが、多孔質構造を有していることが好ましい。

本発明における構造物としては、例えば養殖魚類用飼料（カプセル飼料を含む）、魚網、網イケスの支持柱、漁礁、小粒子が挙げられる。

本発明の構造物は好ましくは養殖魚類用飼料である。この場合は、飼料中に含まれる有用微生物を魚類が摂食し消化管内の病原微生物が駆除されるとともに、微生物を含んだ残餌や糞が底土に沈降して隣接する養殖水中及びヘドロ中の有機物が分解されるという点で有利である。病原性微生物および／または病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有するアルテロモナス属に属する細菌を担持した養殖魚類用飼料は該細菌を通常の養殖魚類用飼料に任意の方法で適宜添加することにより得ることができる。養殖魚類用飼料とは、魚類の養殖に使用できる飼料であれば任意のものであってよく、例えば、配合飼料、カプセル飼料、生魚を破砕した生餌が挙げられる。

本発明の構造物は好ましくはまた網イケスの支持柱または漁礁である。病原性微生物および／または病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有するアルテロモナス属に属する細菌を担持した網イケスの支持柱または漁礁は、例えば該細菌を塗料、コンクリート、粘土などに混合したものを網イケスの支持柱または漁礁の表面に塗沫または散布することにより得ることができる。粘土が剥離することが危惧される場合には、ボンドなどの接着剤を用いて菌体を混合した粘土をより強固に固定することもできる。ここで使用する網イケスの支持柱または漁礁は、魚類の養殖に際して設置できるものであれば任意のものであってよい。細菌を塗料中に混合させるには、珊瑚砂、活性炭、粘土粒子などの多孔質素材に該細菌を吸着させたものを塗料中に混合することにより行う。このとき塗料としては通常の塗料であってよい。細菌をコンクリート中に混合させるには、上記多孔質素材に該細菌を吸着させたものをコンクリート中に混合することにより行う。ここでコンクリートは通常のものであってよい。また細菌を粘土中に混合させるには、細菌の培養物を直接粘土と混合することにより行う。ここで粘土は通常のものであってよい。

本発明の構造物は好ましくはまた小粒子である。ここで「小粒子」とは、珊瑚砂、活性炭、粘土粒子などを意味する。これらの小粒子に細菌を担持させる方法は、前段落に記載したとおりである。

本発明においてアルテロモナス属細菌を上記構造物に担持させるには、上記以外にも種々の方法を採ることができる。例えば該細菌を培養し、培養細胞を必要に応じて任意の液体と混合した細胞懸濁液の状態で上記の構造物に直接塗沫または散布することにより移植する方法が挙げられる。

また、構造物にアルテロモナス属細菌を移植させた後に該構造物を２〜３日間海水または淡水中に放置すると、細菌の担体への担持がより強固になり好適である。移植された細菌がより容易に増殖することができるようにするために、細菌を移植する前に、構造物表面にアルコール類、塩素剤等を塗布するかまたは紫外線を照射するなどの任意の方法により構造物表面を滅菌しさらに滅菌水で洗浄しておくことが好適である。

また、構造物に担持されたアルテロモナス属細菌の構造物中での増殖を促進させるために、細菌の増殖のための栄養成分を構造物に更に担持させることが好適である。また、細菌の移植後に構造物を、アミノ酸、有機酸、ビタミンなどの細菌の増殖のための栄養成分を添加した海水または淡水を入れた水槽中に一定期間放置することにより構造物上で細菌を増殖させておくことも好適である。

本発明者らが実際に行った本発明の構造物の具体的な例としては次のようなものがある。市販の粘土とアルテロモナス・マクレオディEKZ-2株の培養菌体とを最終濃度10⁸個細胞/mLになるように混合したものを漁礁（コンクリートブロック）または養殖網イケスの支持柱に塗沫した。ここで、粘土が剥離することが危惧される場合には、ボンドなどの接着剤を用いて菌体を混合した粘土をより強固に固定した。続いて、当該漁礁または養殖網イケスを養殖水中に設置したところ、10⁶個細胞／mL／日の割合で上記菌体が海水中に遊離し、ヘドロ等の有機物を分解した。また、養殖用イケスの直下海底土に、上記と同様の粘土と菌体の混合物を固定した漁礁（コンクリートブロック）を設置するか、または当該混合物を固定した珊瑚砂もしくは活性炭を散布した場合も、10⁶個細胞／mL／日の割合で上記菌体が海水中に遊離し、ヘドロ等の有機物を分解した。さらにまた、アルテロモナス・マクレオディEKZ-2株の菌体培養液を珊瑚砂や活性炭のような多孔質素材に吸着させ、当該珊瑚砂または活性炭をコンクリートに混合して漁礁に塗沫したものを養殖水中に設置した場合も、10⁶個細胞／mL／日の割合で上記菌体が海水中に遊離し、ヘドロ等の有機物を分解した。この場合には、多孔質素材中の小孔に分布するアルテロモナス属細菌の多くはコンクリートに接することなく生存し増殖することができた。なお、菌体の遊離速度は下記実施例５に記載の方法と同様の方法で測定することができる。

また本発明者らが上記アルテロモナス属細菌を付着基盤上（表面の粗いコンクリートブロック）に移植したところ、海水、淡水中に放置しても、その付着特性のため大半が当該基盤上にとどまった。また、水中の栄養物を利用して当該基盤上において増殖した。海水中に設置した当該基盤上でのアルテロモナス・マクレオディEKZ-2株の占有率を経時的に測定した結果を図１に示す。図１に示す通り、３０日を経過後も当該アルテロモナス属細菌の占有率は高く維持されていることから、接種された菌体の大半が当該基盤上にとどまっていることがわかる。

アルテロモナス属細菌を養殖魚類用飼料に添加した例については、実施例２，３，４を参照されたい。

アルテロモナス・マクレオディEKZ-2株の単離および同定
本実施例に使用したアルテロモナス・マクレオディEKZ-2株は沿岸海水中より単離された菌株であり、以下のような特徴を持つ。
ア）：長さ1〜3ミクロンで、形状は短桿菌、両端は丸味を呈す。鞭毛は体後端より1本を生じ、運動を行う。色は透明感のある黄白色である。
イ）：培地：ペプトン培地組成：Bacto-peptone (Difco Co. Ltd.) 2 g、 Bacto-yeast extracts (同上) 1 g 、クエン酸鉄（同上） 0.1 g、海水 1 L、ｐＨ 7.6においてよく増殖する。

アルテロモナス属菌株の菌学的性状
1−1. 細胞の形：短桿状、両端は丸みを帯びる細胞の大きさ：１〜３（μｍ）。１−２. 多形性：長さの異なる種々の細胞が通常の培養で多々存在する。１−3. 運動性：あり、鞭毛：体後端に1本、胞子：なし、グラム染色性：陰性、抗酸性：なし。

２−１．生育程度：５日間培養で数mmのコロニーを形成する、色：薄い黄白色、光沢：特になし、表面は平滑、拡散性色素：なし。

３−１. 硝酸塩還元：長期培養（７日）で微弱に還元。３−２. 脱窒反応： −。３−３. ＭＲテスト： −。３−４. ＶＰテスト： −。３−５. インドール： −。３−６．硫化水素： −。３−７．デンプン水解： −。３−８．クエン酸 (K) ：＋ (C) ：＋。３−９．硝酸塩利用：＋、アンモニウム塩利用：＋。３−１０．色素生成： −。３−１１．ウレアーゼ： −。３−１２．オキシダーゼ：＋。３−１３．カタラーゼ：＋。３−１４．pH ：5.0(-), 5.6(+), 8.6(+), 9.0(+) 。３−１５．温度：中温性５−２５℃．酸素要求性：好気性。３−１６．ＯＦテスト：oxidative。 G-C含量：38〜50 mol%。

4−１. NaCl濃度と生育：0.3-10％で生育、至適範囲 0.3-4％。
（１）核酸の抽出
"Sepa Gene"キット（三光純薬（株）製）を用いて核酸の抽出を行った後、エタノール沈殿により核酸を回収した。
（２）PCR
１６SrRNAに特異的なユニバーサルプライマー２種（５’ 末端側及び３’ 末端側）を用いて約450 bpの増幅を行った。
（３）PCR増幅産物の精製
増幅終了後、スピンカラム（ファルマシア社製）を用いて精製を行った。
（４）１６SrRNA塩基配列の解析
精製したPCR増幅産物をアプライドバイオシステムズ 377DNAシークエンサー（パーキンエルマー社製）により５’ 末端側456 bpの塩基配列解析を行った。
（５）１６SrRNAデータベース検索による相同解析
ジーンバンクのデータベースよりオンラインで検索を行った。

アルテロモナス属菌株の塩基配列を図２に示す。
本発明菌を産業別審査基準応用微生物工業改訂版（特許庁編）の新種細菌の記載例に従って、その性状を調べ、Baumann 等(1984)に基づきその分類学上の位置を検討した結果、本菌株は、アルテロモナス・マクレオディと同定された。

本発明者らは該菌株をアルテロモナス・マクレオディEKZ-2株と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM P-19541として寄託した。

抗細菌試験
上記のアルテロモナス・マクレオディEKZ-2株が病原性細菌の増殖を抑制する能力を有することを以下のように確認した。

寒天培地にあらかじめ塗沫した2本の上記菌株のスミアの間に、魚類疾病原因細菌であるビブリオ・アンギララムまたはエドワジエラ・タルダを移植して25℃下にて10日間培養後のスミアの間の病原菌のコロニーの大きさを、病原菌のみを対照区として培養した場合のコロニーの大きさと比較したところ、表１に示すとおり、ビブリオ・アンギララムおよびエドワジエラ・タルダの増殖が抑制された。表１中の「阻害率」は、対照区培地上のビブリオ・アンギララム（またはエドワジエラ・タルダ）のコロニーの横幅の大きさと試験区の同菌のコロニーの同大きさとの比を百分率で表したものである。

抗ウイルス試験
上記の菌株アルテロモナス・マクレオディEKZ-2株が病原性ウイルスの増殖を抑制する能力を有することを以下のように確認した。

マスノスケの細胞 CHSE-214の培養系において、上記菌株の培養上澄液が伝染性造血器壊死症の原因ウイルスである伝染性造血器壊死症ウイルス（IHNV）の作用を抑制するか否かについて検定した。作用抑制効果はマスノスケ細胞の変性効果(CPE) を抑制する度合いを指標として判定した。

マスノスケ細胞 CHSE-214を、1 mLの液体培地（10％ウシ血清成分、0．075％NaHCO₃、100 IU／mLペニシリン、100μg／mLストレプトマイシン、1.6％Tris-HCl(pH 7.8) 含有）中で15℃にて培養し、その培養系に、IHNV培養液および上記アルテロモナス属細菌の培養上清液（0.1 mL）を加えた。対照実験として、前記培養系にIHNVの培養液のみ（0.1 mL）を添加した。ここで、上記アルテロモナス属細菌の培養上清液とは、該細菌をZoBell 2216E培地中で3日間25℃で培養した後に遠沈 (4000rpm)して菌体を沈澱させ、0.22μmのフィルターでろ過して得られた濾液を指す。またIHNVの培養液とは、同様の上記培養液およびCHSE-214を用いてIHNVを増殖させた後、0.45μmのフィルターで濾過して得られた濾液を指す。

上記の菌体培養上清液を添加した後のCPEを経時的に測定した。CPEが低いということは、すなわちウイルスの増殖が抑制されていることを意味すると考えられる。結果を図３に示す。図３に示すとおり、アルテロモナス・マクレオディEKZ-2株の培養上清を添加した場合にIHNVの増殖が抑制された。

アルテロモナス・マクレオディEKZ-2株を含有する飼料の調製
1.配合飼料の調製
アルテロモナス・マクレオディEKZ-2株が担持された魚類用配合飼料を、市販の粉末配合飼料（日本水産株式会社製）に、アルテロモナス・マクレオディEKZ-2株の培養液（ヘプトン(Difco製)5g、酵母エキス(Difco製)1g、酢酸鉄0.1g、海水1000mLに溶解させpH 7.6に調整して得られた液体培地中で同菌株を培養した菌体を含む培養液）を20 w/v ％の割合で添加し、よく混合することにより調製した。

2.カプセル飼料の調製
アルテロモナス・マクレオディEKZ-2株が担持された魚類用カプセル飼料は、市販のカプセル（シグマ製）中に、上記と同様の手順で調製した同菌株を含有する配合飼料400mgを封入することにより調製した。

タイに対するウイルス攻撃試験
実施例２で調製した配合飼料、またはアルテロモナス・マクレオディEKZ-2株を含有しない飼料（対照実験）を、タイ（体長約8cm、各実験区につき20尾）に、100 L容量の水槽中で0.2尾／Lの飼育密度で、25℃において、5g／尾／日の割合で10日間投与した後、タイの致死濃度に設定したイリドウイルス液を腹腔内注射した。ここで、対照実験に使用したアルテロモナス・マクレオディEKZ-2株を含有しない飼料は、市販の粉末配合飼料（日本水産株式会社製）に、ヘプトン(Difco製)5g、酵母エキス(Difco製)1g、酢酸鉄0.1g、海水1000mLに溶解させpH 7.6に調整して得られた液体培地（菌株は含まず）を20 w/v ％の割合で添加し、よく混合することにより調製したものである。また上記のイリドウイルス液は、予めタイ腹腔内でウイルスを培養させ、タイの死亡後に腹腔内より取り出したウイルス液を致死濃度に希釈したものである。ここで、致死濃度は、タイの死亡後に腹腔内より取り出したウイルス液を種々の割合で希釈したものをタイに投与して実際に感染して死亡する濃度を確認することにより決定した。

その後、両実験区のタイを対照実験で使用したのと同じアルテロモナス・マクレオディEKZ-2株を含有しない飼料で飼育し、両実験区における魚体生残率を経時的に測定した。結果を図４に示す。アルテロモナス・マクレオディEKZ-2株無添加区のタイは全て死滅したが、アルテロモナス・マクレオディEKZ-2株添加実験区のタイは80%が生残した。

ヒラメ飼育槽底砂の栄養塩の定量
砂を底面に敷き詰めた水槽（100 L容量）において、実施例２で調製した配合飼料、または実施例３と同様にして調製したアルテロモナス・マクレオディEKZ-2株を含有しない飼料（対照実験）を用いて、ヒラメ（実験当初の体長約20cm）を10個体／m²の密度で、20℃において5g／尾／日の割合で上記飼料を投与して約3ヶ月間飼育し、砂に蓄積した栄養物質の中で全硫化物量、全窒素量、全リン量および全有機物量（灼熱減量）を測定した。

全硫化物量はヨウ素滴定法により測定した。全窒素量はペルオキソ２硫酸カリウム酸化法により測定した。全リン量はアスコルビン酸還元法により測定した。灼熱減量は、試料有機物を600℃で熱することにより測定した。これらの測定はいずれも当業者にとって周知の標準的な測定手順に従って行った。

結果を図５に示す。アルテロモナス・マクレオディEKZ-2株を含有する飼料をヒラメに投与した場合に全硫化物量、全窒素量、全リン量および全有機物量が低減した。このように、養殖水域底土中の有機物分解が進行したことが示された。

市販の粘土（合成植物油粘土、株式会社日本教材製作所製）とアルテロモナス・マクレオディEKZ-2株の培養菌体（ZoBell 2216E培地中で培養し菌体濃度約10¹⁰個細胞／mLとなったもの）とを最終濃度10⁸個細胞/mLになるように混合したものを養殖網イケスの支持柱に塗沫した。該養殖網イケスをヒラメ飼育槽（100 L容量）中に設置したところ、ヒラメの糞の蓄積量が減少したことが観察された。

また、別途、上記の粘土と細菌との混合物を適量、水槽（10 L 容量）に置き、滅菌海水を5 L添加し、海水中に遊離してくる菌数を計数したところ、10⁶個細胞／mL／日の速度で本発明のアルテロモナス属細菌が海水中に遊離していることが明らかとなった。従って、上記の該養殖網イケスからも養殖水中に同様の遊離速度で本発明のアルテロモナス属細菌が遊離しているものと考えられる。

付着基盤（コンクリートブロック）上の細菌群におけるアルテロモナス・マクレオディの占有率を示す図である。アルテロモナス・マクレオディの16SrRNAの塩基配列を示す図である。アルテロモナス・マクレオディEKZ-2株の培養上清を添加した場合にIHNVの増殖が抑制されたことを示す図である。抗ウイルス細菌アルテロモナス・マクレオディを添加した、或いは無添加の配合飼料の投与によるタイの飼育結果を示す図である。飼料中にアルテロモナス・マクレオディEKZ-2株（図中では単に「微生物」）を添加した場合と、無添加の場合における、ヒラメ飼育水槽底砂中の栄養塩濃度を示す図である。

Claims

魚類の養殖に際し、病原性微生物および／または病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有するアルテロモナス（Alteromonas）属に属する細菌を養殖水中に添加することにより病原性微生物または病原性ウイルスの増殖を抑制する方法。
病原性微生物および／または病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有するアルテロモナス属に属する細菌を養殖水中に添加することにより、養殖水域中のまたは養殖水域の底土に蓄積した有機物を分解する方法。
上記の有機物が、ヘドロ中の、魚粉を主体とした配合飼料または魚類の糞を起源とするタンパク質を主体とする、硫黄、窒素およびリンを含んだ有機物である請求項２に記載の方法。
病原性微生物および／または病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有するアルテロモナス属に属する細菌を担持してなる魚類養殖用構造物を養殖水中に添加することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
病原性微生物および／または病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有するアルテロモナス属に属する細菌を担持してなる魚類養殖用構造物。
上記の構造物が魚類養殖用飼料、網イケスの支持柱、漁礁または小粒子である請求項５に記載の魚類養殖用構造物。