JP2005062053A

JP2005062053A - フロースルー型リガンド検出装置

Info

Publication number: JP2005062053A
Application number: JP2003294177A
Authority: JP
Inventors: Tomonari Minamizawa; 智成南澤
Original assignee: Denka Seiken Co Ltd
Current assignee: Denka Seiken Co Ltd
Priority date: 2003-08-18
Filing date: 2003-08-18
Publication date: 2005-03-10

Abstract

【課題】標識抗体を含有するパッドの取り扱いを容易にし、パッドをアダプター開口部へ設置する際の作業効率を向上させることのできるフルースルー型リガンド検出装置を提供することを目的とする。
【解決手段】アダプター開口部に立設され標識抗体を含有するパッド21に、保持体22を一体に備えた。保持体22は窓孔33を有する枠状のプラスチック板32からなり、パッド21は保持体22により挟まれる。複数の窓孔33を一定間隔で有する２枚のプラスチック板32に挟んで接着した後、一定間隔に切断してパッド21を形成した。
【選択図】図３

Description

本発明は、免疫測定法で使用される標識抗体を含有するパッドを備えたフロースルー型リガンド検出装置に関する。

従来、特殊な設備，器具や技術を用いることなく目標のリガンドを簡便かつ正確に検出するために、免疫測定法が利用されている。免疫測定法という用語は免疫反応の特異性を利用して試料中の分析対象物を免疫学的手法により検出または定量する分析方法の総称として用いられ、具体的には免疫拡散法，酵素免疫測定法などの種々の方法が実用化されている。このような免疫測定法の中で、フロースルー式アッセイ法はラテラルフロー式，タンジェンタルフロー式などと並ぶメンブランを使用したイムノクロマトグラフィー法の一種であり、操作が簡便であるため一般的な検査の場に普及している。

フロースルー式アッセイ法による免疫測定法についての詳細は、例えば“Guide to Diagnostic Rapid Test Device Components", 2^nd edition, published by Schleicher & Schuell company, January 2000, Edited by Lisa Vickers, p6-8，特公平７−３４０１６号などに記載されている。

このフロースルー式アッセイ法に用いられるフルースルー型リガンド検出装置の例としては、特開平３−１１８４７３号公報に開示されているものが知られている。この装置は、底部と蓋とから構成される外殻部材の内側にフィルター部材を配置したものであり、目標のリガンドを含むと思われる検体を蓋に設けられた開口部を経てフィルター部材に導入し、リガンドを結合剤へ結合させ発色させるなどの処理を行うことによって目標のリガンドを検出するものである。

また、このようなフロースルー型リガンド検出装置において、試料としての検体を含む溶液を開口部へ導く容器状のアダプター開口部を有するアダプターを設け、このアダプター開口部に標識抗体を含有させて乾燥させた不織布製のパッドを設けておき、検体の溶液を開口部に導入した際にパッドの標識抗体を検体の溶液に溶出させて検体と反応させてフィルター部材に導入することによって、検体を開口部に導入する前に予め標識抗体を検体と混合する手間を省き、操作をより簡便にしたものが知られている。なお、このパッドは、開口部に導入された検体の溶液がフィルター部材に完全に吸収されたかどうかを確認するため、開口部の底面が上方から見えるように、開口部に立設されていた。
Guide to Diagnostic Rapid Test Device Components", 2nd edition, published by Schleicher & Schuell company, January 2000, Edited by Lisa Vickers, p6-8 特公平７−３４０１６号公報特開平３−１１８４７３号公報

ところで、従来の標識抗体を含有させ乾燥させたパッドは、アダプター開口部に立設させる必要があり、不織布製であってやわらかいために取り扱いにくく、パッドをアダプター開口部へ設置する際の作業効率が悪いという欠点があった。

本発明かかる課題に鑑みてなされたものであり、標識抗体を含有するパッドの取り扱いを容易にし、パッドをアダプター開口部へ設置する際の作業効率を向上させることのできるフルースルー型リガンド検出装置を提供することを目的とする。

本発明の請求項１記載のフロースルー型リガンド検出装置は、フィルター部材と、このフィルター部材の上面に開口部を有する外郭部材と、試料を前記開口部へ導く容器状のアダプター開口部を有するアダプターと、前記アダプター開口部に立設され標識抗体を含有するパッドとを備えたフロースルー型リガンド検出装置において、前記パッドは保持体を一体に備えていることを特徴とする。

本発明の請求項２記載のフロースルー型リガンド検出装置は、請求項１において、前記保持体は窓孔を有する枠状のプラスチック板からなり、前記パッドは前記保持体により挟まれていることを特徴とする。

本発明の請求項３記載のフロースルー型リガンド検出装置は、請求項２において、前記パッドは、複数の前記窓孔を一定間隔で有する２枚のプラスチック板に挟まれて接着された後、一定間隔に切断されて形成されたことを特徴とする。

本発明の請求項１記載のフロースルー型リガンド検出装置によれば、パッドを保持体によって保持させて硬くすることができ、パッドの取り扱いを容易にし、パッドをアダプター開口部へ設置する際の作業効率を向上させることができる。

本発明の請求項２記載のフロースルー型リガンド検出装置によれば、窓孔の部分から標識抗体を溶出できるので標識抗体の溶出を妨げることがなく、枠状の保持体によってパッドの周縁部を保持させてパッドを確実に硬くすることができる。

本発明の請求項３記載のフロースルー型リガンド検出装置によれば、保持体を一体に備えたパッドを効率よく製造することができる。

以下、本発明における好ましい実施例について、添付図面を参照しながら説明する。

以下、本発明のフロースルー型リガンド検出装置の一実施例について添付した図１〜図３を参照しながら説明する。構成を示す図１および図２において、１は装置の下部外郭をなす下部デバイスであり、２は装置の上部外郭をなす上部デバイスである。下部デバイス１は、略長方形の底面１ａとこの底面１ａの周縁部から略垂直に上方へ延設された側壁１ｂとを有する容器状に形成されている。この下部デバイス１の中には、フィルター部材３が収容，支持されている。このフィルター部材３は、メンブランフィルターからなる膜部材３ａと、この膜部材３ａの下部に配置されガラス孔フィルターからなるスペーサー３ｂと、このスペーサー３ｂの下部に配置され液体吸収能力に優れた吸収部材３ｃとから構成されている。なお、スペーサー３ｂは、吸収体３ｃからの色戻りをなくし膜部材３ａの着色による判定を正確に行うために設けられるものであって、省略してもよい。

本発明において使用可能な膜部材３ａとしては、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ社製ニトロセルローストランスファーメンブラン（孔径０．１〜０．４５μｍ），アドバンテック社製セルロース混合エステルタイプメンブランフィルター（孔径０．１０〜５．００μｍ），ミリポア社製セルロース混合エステル（孔径０．０２５〜８．０μｍ），ワットマン社製ニトロセルロースメンブラン（孔径０．２〜１．２μｍ）等が挙げられるがこれらに限定されない。この中でＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ社製ニトロセルローストランスファーメンブランが他の物に比べ丈夫なため糸による縫製やステープラーの金具によって破れることがなく、好適に用いられる。また、吸収体３ｃからの色戻りを防ぐ効果を有するスペーサー３ｂとしては、ワットマン社製Ｆ０７５−１４，ミリポア社製ＧＦＣＰ２０３０００，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ社製３３ＧＬＡＳＳ等が挙げられるがこれらに限定されない。さらに、吸収体３ｃとしては、ワットマン社製（ＷＦ１．５，ＣＤ４２７−０５，ＣＤ４２７−０７），日本ポール社製Ｓ７０００９等が挙げられるがこれらに限定されない。

一方、上部デバイス２は、下部デバイス１の形状に対応して上面２ａとこの上面２ａから略垂直に下方へ延設された側壁２ｂとを有する蓋状に形成されている。そして、上部デバイス２には水平方向の断面が略円形の開口部４が設けられており、この開口部４には検体を導入するためのアダプター開口部５と孔部６を有するアダプター７が載置されている。また、開口部４には上部デバイス２から下方に向けて徐々に直径が小さくなるように斜設された略円錐形状の内壁８が上部デバイス２と一体に形成されており、アダプター７はこの開口部４の形状に対応した容器状の形状に形成され、開口部４に取り外し自在に設けられている。また、アダプター７の底部９の略中央部には、部分的に孔部６が設けられている。また、アダプター開口部５の外側へ着脱自在に、アダプター７の底部９の下側に設けられたフィルター10を支持する固定リング11が備えられている。なお、このフィルター10は、検体と後述するパッド21との非特異的な凝集物を除去するためのゴミ取りフィルターであって、その材質としてはポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）などが好適に用いられる。

そして、下部デバイス１の側壁１ｂの上端と上部デバイス２の側壁２ｂの下端とを嵌合させることで、下部デバイス１と上部デバイス２とで装置の外郭部材をなすように構成されている。また、下部デバイス１と上部デバイス２とを組み合わせたときに開口部４がフィルター部材３のほぼ中央部に位置するように構成され、開口部４の内壁８の下端はフィルター部材３の上面を下方に向かって押さえ込むようになっている。

また、21はリガンドの検出に用いられるパッドであって、標識抗体としての金コロイド標識抗体を不織布に含有させて乾燥させ、プラスチック板からなる支持体を一体に備えたものである。このパッド21は、アダプター開口部５の内壁12にアダプター７と一体に設けられた２対のガイド13によって、アダプター開口部５の内側に立設されている。また、パッド21は、上面から見たときに孔部６に重ならない位置に設けられ、アダプター開口部５に導入された検体がフィルター部材３へ完全に吸収されたことを確認できるようになっている。なお、パッド21の構成については後述する。

つぎに、図３を参照しながら、パッド21の製造方法の一例について説明する。例えば、図３（ａ）に示すように、幅１．０ｃｍ，長さ３０ｃｍの短冊状のパッド材料31を用意する。このパッド材料31は、後述するように、Ｐａｌｌ社製８９７５などの不織布に金コロイドを含浸させて乾燥したものである。なお、パッド材料31としては、このほかにＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ社製ガラスフィルター（ＳＳ１６，３３Ｇｌａｓｓ），ミリポア社製ガラスフィルター（ＧＦＣＰ２０３０００）等を用いることができるが、これらの材料に限定されない。

また、図３（ｂ）に示すように、幅１．４ｃｍ，長さ３０．４ｃｍ，厚さ１ｍｍ程度の２枚のプラスチック板32を用意する。なお、このプラスチック板32には、一定間隔で０．８ｃｍ四方の窓孔33を設ける。また、プラスチック板32の材質としては水溶性でなければ何でも用いることができ、プラスチック製でなくてもよい。

つぎに、図３（ｃ）に示すように、２枚のプラスチック板32によりパッド材料31を挟み、接着剤を用いるか、溶着によって、パッド材料31とプラスチック板32とを接着する。そして、図３（ｄ）に示すように、一定間隔で切断すると、一辺が１．４ｃｍの略正方形のパッド21ができあがる。このようにして製造されたパッド21は、窓孔33を有する枠状のプラスチック板からなる保持体22を一体に備えているとともに、パッド21は保持体22により挟まれている。

そして、このパッド21をアダプター７のアダプター開口部５の内壁12に設けられた２対のガイド13に挿入することによって、アダプター開口部５の内側にパッド21を立設する。

つぎに、上記フロースルー型リガンド検出装置の製造方法について、免疫測定法を用いたＡ型インフルエンザウイルスの検出に用いる場合を例に取り説明する。

（１）金コロイド標識用抗Ａ型インンフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体（マウス）の作製及び精製
精製Ａ型インフルエンザウイルス抗原を免疫し、一定期間維持したＢＡＬＢ／ｃマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol.256, p495-497(1975)）によりマウスミエローマ細胞（Ｐ３×６３）と融合する。得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を、Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗原固相プレートを用いてインキュベーター中で３７℃に維持する。その後、ＥＬＩＳＡにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化（単クローン化）を行う。取得した該細胞株をプリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取する。得られた腹水からアフィニティクロマトグラフィー法によってＩｇＧを精製する（クローン名８Ｄ２）。

（２）固相用Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体（マウス）の作製及び精製
上記（１）の方法と同様にして作製する（クローン名Ｂ４０）。

（３）金コロイド標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体の作製
９ｍＬの金コロイド溶液（ＢＢＩ社、濃度０．０１（Ｗ／Ｖ）％の水溶液、ｐＨ７．１）に対して、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）を１ｍＬ加えｐＨを８．５に合わせる。上記（１）で精製した抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体（クローン名８Ｄ２）を２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．１）で透析後、蒸留水で希釈し０．１ｍｇ／ｍＬに調製する。この抗体１ｍＬを上記金コロイド溶液に撹拌しながら滴下し５分間静置し結合させる。その後１０％ＢＳＡを１ｍＬ加え１０時間穏やかに攪拌する。つぎに遠心管へ全量移し５０００ｇで３０分間遠心し上清を吸引廃棄する。沈渣を５％のシュークロースを含む２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．７）０．９ｍＬで浮遊させる。

（４）金コロイド標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体パッド（パッド21）の作製
上記（３）で作製した金コロイド標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体を最終濃度として５％シュークロースを含む精製水で希釈し、ＢｉｏＤｏｔ社ＸＹＺＰｌａｔｆｏｍＤｉｓｐｅｎｓｉｎｇＳｙｓｔｅｍを用いて、パッド材料31の１．０ｃｍ四方あたり３０μＬを含浸させ、真空乾燥機にて３０分間乾燥させる。その後、上述の製造方法により、保持体22により保持されたパッド21を作成する。

（５）フロースルー型リガンド検出装置の組み立て
膜部材３ａとしてＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ社製ニトロセルローストランスファーメンブラン（孔径０．４５μｍ）、スペーサー３ｂとしてミリポア社製ＧＦＣＰ２０３０００、吸収体３ｃとしてワットマン社製ＣＤ４２７−０７を重ね合わせ、下部デバイス１に設置し、上部デバイス２で閉じる。その後アダプター７を上部デバイス２に取りつける。

（６）膜部材３ａへの抗体の塗布
上記（５）で組み立てたフロースルー型リガンド検出装置のアダプター７の孔部６を通して（２）で作製・精製した抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体（クローン名Ｂ４０）を１％トレハロースを含むクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．７）で希釈した液１２μＬを膜部材３ａに塗布し、45℃の乾燥室で40分間乾燥を行なう。

（７）フロースルー型リガンド検出装置の最終作製
上記（６）で組立てたフロースルー型リガンド検出装置のアダプター７を一度取り外し、サンプル（検体）とパッド21との反応中に生じる非特異的な凝集物を取りの除く為のフィルター10をアダプター７の下部に設置し、固定リング11を用いて固定する。再度上部デバイス２へアダプター７を装着し、その後、（４）で作製した金コロイド標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体パッド（パッド21）を、アダプター７のガイド13に挿入する。

つぎに、上記のように製造されたフロースルー型リガンド検出装置を用いたリガンド検出方法について、免疫測定法を用いたＡ型インフルエンザウイルスの検出を例に取り説明する。

（８）検出方法
Ａ型インフルエンザウイルスを含むと思われるサンプル（検体）を１％ＢＳＡ，５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００，１５０ｍＭＮａＣｌを含む２０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）緩衝液０．５ｍＬに浮遊させ、０．２２μｍのフィルターで濾過した後、フロースルー型リガンド検出装置のアダプター７の孔部６へ全量滴下する。サンプルが吸収体３ｃに全量吸収されたらアダプター７を上部デバイス２から外し膜部材３ａへの着色の有無を判定する。孔部６下部の膜部材３ａが金コロイドの色（赤色）に着色していたら、サンプル中にＡ型インフルエンザウイルスが含まれていた事になる。膜部材３ａの色が白色のままであれば、サンプル中にＡ型インフルエンザウイルスが含まれていなかった事になる。

以上のように、本実施例のフロースルー型リガンド検出装置によれば、フィルター部材３と、このフィルター部材３の上面に開口部４を有する外郭部材たる上部デバイス２と、試料を前記開口部４へ導く容器状のアダプター開口部５を有するアダプター７と、前記アダプター開口部５に立設され標識抗体を含有するパッド21とを備えたフロースルー型リガンド検出装置において、前記パッド21は保持体22を一体に備えている。

この構成によれば、パッド21を保持体22によって保持させて硬くすることができ、パッド21の取り扱いを容易にし、パッド21をアダプター開口部５へ設置しやすくなり、パッド21をアダプター開口部５へ設置する際の作業効率を大幅に向上させることができる。

また、前記保持体22は窓孔33を有する枠状のプラスチック板32からなり、前記パッド21は前記保持体22により挟まれている。

この構成によれば、窓孔33の部分から標識抗体を溶出できるので標識抗体の溶出を妨げることがなく、枠状の保持体22によってパッド21の周縁部を保持させてパッド21を確実に硬くすることができる。

さらに、前記パッド21は、複数の前記窓孔33を一定間隔で有する２枚のプラスチック板32に挟まれて接着された後、一定間隔に切断されて形成されている。

この構成によれば、保持体22を一体に備えたパッドを効率よく大量に製造することができる。

なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内において種々の変形実施が可能である。例えば、保持体22の形状は窓孔33を有する枠状に限らず、パッド21の１辺のみ、または２辺のみに設けるようにしてもよい。また、２枚の保持体22でパッド21の両側を挟むのではなく、１枚の保持体22をパッド21の片側に接着することによって保持体22を一体に設けたパッド21としてもよい。また、場合によっては、ごみ取りフィルターとしてのフィルター10を設けなくともよい。また、開口部４を２つ以上設けて、２種以上のリガンドを同時に検出できるようにしてもよい。さらに、検出対象となるリガンドはＡ型インフルエンザウイルスに限らず、それ以外のリガンドの検出に用いてもよいなど種々の変形が可能である。

本発明のフロースルー型リガンド検出装置の一実施例を示す上面図である。同上断面図である。同上パッドの製造方法を示す説明図である。

符号の説明

２上部デバイス（外郭部材）
３フィルター部材
４開口部
５アダプター開口部
７アダプター
21 パッド
22 保持体
32 プラスチック板
33 窓孔

Claims

フィルター部材と、このフィルター部材の上面に開口部を有する外郭部材と、試料を前記開口部へ導く容器状のアダプター開口部を有するアダプターと、前記アダプター開口部に立設され標識抗体を含有するパッドとを備えたフロースルー型リガンド検出装置において、前記パッドは保持体を一体に備えていることを特徴とするフロースルー型リガンド検出装置。
前記保持体は窓孔を有する枠状のプラスチック板からなり、前記パッドは前記保持体により挟まれていることを特徴とする請求項１記載のフロースルー型リガンド検出装置。
前記パッドは、複数の前記窓孔を一定間隔で有する２枚のプラスチック板に挟まれて接着された後、一定間隔に切断されて形成されたことを特徴とする請求項２記載のフロースルー型リガンド検出装置。