JP2006275932A - 試薬の塗布方法 - Google Patents

Abstract

【課題】貫通穴の下層に気泡（空気）が溜まることなく、所望の塗布スポット面積に確実に塗布でき、試薬塗布を効率よく行うことができる試薬の塗布方法を提供する。
【解決手段】フロースルー型アッセイ装置に備えられる検体試料中の被測定物を捕捉するための膜部材に対し、塗布用治具を用いて捕捉試薬を塗布する試薬の塗布方法において、塗布用治具に対して所定量の試薬を吐出する分注操作を複数回に分けて分注する。また、分注操作を少なくとも塗布用治具が膜部材に当接する前に１回行い、当接後に１回行う。これによって、塗布用治具に設けられた貫通穴に存在する気泡（空気）を貫通穴から外へ逃がすことができるので貫通穴の下層に気泡（空気）が溜まることなく、所望の塗布スポット面積に確実に塗布でき、試薬塗布を効率よく行うことができる。
【選択図】図４

Description

本発明は、検体試料中の被測定物を捕捉するための捕捉試薬が固定された膜部材を備えたフロースルー型アッセイ装置の製造において膜部材に試薬を塗布する試薬の塗布方法に関する。

従来、特殊な設備，器具や技術を用いることなく目標のリガンドを簡便かつ正確に検出するために、免疫測定法が利用されている。免疫測定法という用語は免疫反応の特異性を利用して試料中の分析対象物を免疫学的手法により検出または定量する分析方法の総称として用いられ、具体的には免疫拡散法，酵素免疫測定法などの種々の方法が実用化されている。このような免疫測定法の中で、フロースルー式アッセイ法はラテラルフロー式，タンジェンタルフロー式などと並ぶメンブランを使用したイムノクロマトグラフィー法の一種であり、操作が簡便であるため一般的な検査の場に普及している。フロースルー式アッセイ法による免疫測定法についての詳細は、例えば非特許文献１及び特許文献１などに記載されている。

このフロースルー式アッセイ法を用いたフロースルー型アッセイ装置に備えられる検体試料中の被測定物を捕捉するための膜部材に対し、捕捉試薬を塗布する方法として、試薬が充填されたシリンジを挿通するための貫通穴を中心軸に沿って備えている塗布用治具を用いた塗布方法がある。この塗布用治具を用いた塗布方法は、まず昇降手段によって支持された塗布用治具を膜部材に当接するまで降下させ、塗布用治具と膜部材を当接させた状態で、シリンジを塗布用治具の貫通穴に挿入し、試薬を分注することによって膜部材に塗布する方法である。
特公平７−３４０１６号公報 Guide to Diagnostic Rapid Test Device Components", 2nd edition, published by Schleicher & Schuell company, January 2000, Edited by Lisa Vickers, p6-8

しかしながら、上述の方法では、塗布用治具と膜部材を当接させた状態で、塗布用治具の貫通穴を通して試薬を分注しているため、試薬液に気泡（空気）が混ざった場合、気泡が外へ逃げることができず貫通穴の下層に気泡（空気）が溜まり所望の塗布スポット面積に確実に塗布されず、装置の不良品個数の増加を招いていた。

本発明にかかる課題に鑑みてなされたものであり、貫通穴の下層に気泡（空気）が溜まることなく、所望の塗布スポット面積に確実に塗布でき、試薬塗布を効率よく行うことができる試薬の塗布方法を提供することを目的とする。

本発明の請求項１記載の試薬の塗布方法は、フロースルー型アッセイ装置に備えられる検体試料中の被測定物を捕捉するための膜部材に対し、塗布用治具を用いて捕捉試薬を塗布する試薬の塗布方法において、前記塗布用治具に対して所定量の試薬を吐出する分注操作を、前記塗布用治具を前記膜部材に当接させる前と当接後に複数回に分けて行うことを特徴とする。

本発明の請求項２記載の試薬の塗布方法は、前記分注操作を、前記塗布用治具を前記膜部材に当接させる前に１回行い、当接後に１回行うことを特徴とする。

本発明の請求項１記載の試薬の塗布方法によれば、所定量の試薬の一部を塗布用治具を膜部材に当接させる前に分注することにより貫通穴の気泡（空気）を外に逃がすことができ、貫通穴の下層に気泡（空気）が溜まることなく、所望の塗布スポット面積に確実に塗布でき、試薬塗布を効率よく行うことができる。さらに、装置の不良品の個数を減らすことができ、生産性を向上させることができる。

本発明の請求項２記載の試薬の塗布方法によれば、所定量の試薬の一部を塗布用治具を膜部材に当接させる前に分注することにより貫通穴の気泡（空気）を外に逃がすことができ、貫通穴の下層に気泡（空気）が溜まることなく、所望の塗布スポット面積に確実に塗布でき、試薬塗布を効率よく行うことができる。

以下本発明について詳細に説明する。

本明細書でいう被測定物を捕捉するための捕捉試薬（液）とは、被測定物と抗原抗体反応のような特異的反応により結合して、被測定物と複合体を形成するものである。従って、被測定物により使用する捕捉試薬が異なることは当然であるが、一般には被測定物が細菌、ウイルス、ホルモン、その他臨床マーカー等の場合には、これらに対し特異的に反応して結合するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等が挙げられる。その他、ウイルス抗原、ウイルス中空粒子、遺伝子組換え大腸菌発現タンパク質、遺伝子組換え酵母発現タンパク質等が挙げられる。

次に、本発明の試薬の塗布方法の実施に使用する塗布用治具の一実施例を図１に示す。塗布用治具20は、略円柱形状に形成されており、その長手方向の一端面の中央部に捕捉試薬を塗布するための突出部21を有し、シリンジの先端に設けられた針を挿通するための貫通穴22をその中心軸に沿って備えている。そして、シリンジの先端に設けられた針を貫通穴22に通過させ、突出部21の位置まで挿入し、捕捉試薬を突出部21に分注することによって膜部材に塗布できるようになっている。

また、突出部21は貫通穴22を囲うように突出して形成された任意の形状の枠体からなり、突出部21の形状は菱形に形成されているが、これに限定されるものではなく、例えば円、楕円、多角形、長方形、正方形、台形等の任意の形状に成形してもよい。また、塗布用治具の材質としては、ある程度の強度を有し、非吸水性および保形性があり、洗浄後も使用可能であればいかなる材質であってもよく、好ましくはプラスチック又は金属が挙げられる。プラスチックであれば、例えばポリアセタール樹脂（デルリン（登録商標）など）、フッ素樹脂（テフロン（登録商標）など）、アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン（ＡＢＳ）樹脂、ポリプロピレン（ＰＰ）樹脂、ポリエチレン（ＰＥ）樹脂、６ポリアミド樹脂等が挙げられる。金属であれば、例えばステンレス、銅、アルミニウム等が挙げられる。

次に、本発明の試薬の塗布方法の実施に使用する装置はフロースルー型アッセイ装置の一実施例について添付した図２〜３を参照しながら説明する。

１は装置の下部外郭をなす下部デバイスであり、２は装置の上部外郭をなす上部デバイスである。下部デバイス１は、略長方形の底面１ａとこの底面１ａの周縁部から略垂直に上方へ延設された側壁１ｂとを有する容器状に形成されている。この下部デバイス１の中には、フィルター部材３が収容，支持されている。このフィルター部材３は、ニトロセルロースを含有するメンブランフィルターからなる膜部材３ａと、この膜部材３ａの下部に配置されガラス孔フィルターからなるスペーサー３ｂと、このスペーサー３ｂの下部に配置され液体吸収能力に優れた吸収部材３ｃとから構成されている。なお、スペーサー３ｂは、吸収体３ｃからの色戻りをなくし膜部材３ａの着色による判定を正確に行うために設けられるものであって、省略してもよい。

一方、上部デバイス２は、下部デバイス１の形状に対応して上面２ａとこの上面２ａから略垂直に下方へ延設された側壁２ｂとを有する蓋状に形成されている。そして、上部デバイス２には水平方向の断面が略円形の開口部４が設けられており、この開口部４には検体を導入するためのアダプター開口部５と孔部６を有するアダプター７が載置されている。また、開口部４には内壁８が上部デバイス２と一体に形成されており、アダプター７はこの開口部４の形状に対応した形状に形成され、開口部４に取り外し自在に設けられている。また、アダプター７の底部９には、孔部６が設けられている。また、アダプター開口部５について１つの孔部６が設けられている。また、アダプター開口部５へ着脱自在に、検体中の異物などを取り除くためのゴミ取りフィルター10を支持する固定リング11が備えられている。

そして、下部デバイス１の側壁１ｂの上端と上部デバイス２の側壁２ｂの下端とを嵌合させることで、下部デバイス１と上部デバイス２とで装置の外郭をなすように構成されている。また、下部デバイス１と上部デバイス２とを組み合わせたときに開口部４がフィルター部材３のほぼ中央部に位置するように構成され、開口部４の内壁８の下端はフィルター部材３の上面を下方に向かって押さえ込むようになっており、アダプター７の下端はフィルター部材３の上面に接している。また、12はリガンドの検出に用いられる金コロイドパッドであり、アダプター開口部５に設けられた挿入ガイド13に金コロイドパッド12を挿入することにより設置される。

次に、上記装置および塗布用治具20を用いた場合を例にとって、本発明の試薬の塗布方法の一実施例について説明する。なお、本発明の塗布方法を適用する際のフロースルー型アッセイ装置としては、最終的に組立てられた装置ではなく、膜部材３ａを含むフィルター部材３が収納され下部デバイス１と上部デバイス２とが組み合わされたものである。すなわち、アダプター７が載置される前工程の状態のものである。

本発明の塗布方法は、フロースルー型アッセイ装置に備えられる検体試料中の被測定物を捕捉するための膜部材に対し、塗布用治具を用いて捕捉試薬を塗布する試薬の塗布方法において、塗布用治具に対して所定量の試薬を吐出する分注操作を複数回に分けて分注することによって、膜部材に試薬を塗布する方法であり、具体的には分注操作を少なくとも塗布用治具が膜部材に当接する前に１回行い、当接後に１回行う方法である。塗布用治具が膜部材に当接する前に分注操作を行うことによって、塗布用治具に設けられた貫通穴に存在する気泡（空気）を貫通穴から外へ逃がすことができるので貫通穴の下層に気泡（空気）が溜まることなく、所望の塗布スポット面積に確実に塗布でき、試薬塗布を効率よく行うことができる。さらに、装置の不良品の個数を減らすことができ、生産性を向上させることができる。なお、塗布用治具が膜部材に当接する前に分注される試薬液の量は、塗布用治具から液垂れを起こすことのない量が望ましく、すなわち液体の表面張力によって液垂れを防止できる量である。

以下、本発明の実施例を添付図を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

試薬の塗布方法の一実施形態を図面に基づいて説明する。図４は、本発明の試薬の塗布方法の一実施例である塗布用治具を備えた自動塗布装置を用いた場合の工程を示す図である。なお、本実施例に使用するフロースルー型アッセイ装置は図２〜３に示すものを使用し、その詳細な説明を省略する。

工程１では、アダプター７が載置されておらず、膜部材３ａと、スペーサー３ｂと、吸収体３ｃとが収納されているデバイスＸを一列に多数配列し、塗布ライン方向へ間欠的に移送する。

工程２では、デバイスＸの開口部４と塗布用治具20とが対向する所定の位置でデバイスＸを停止する。

工程３では、塗布用治具20の上方に位置するシリンジ31を下降させることにより、シリンジ31の先端に設けられた針30を塗布用治具20の中心軸に沿って設けられた貫通穴22に通過させ、突出部21の位置まで挿入し、１回目の分注操作を行う。この１回目の分注操作を行うことによって、貫通穴22の中にある空気を外へ逃がすことができる。ここで１つのデバイスＸ当りの試薬液の所定量が１２μＬである場合、１回目の分注量は７μＬであり、突出部21から液垂れを起こさない量である。なお、シリンジ31は、昇降手段たる可動アーム（図示せず）に保持されており、可動アームの昇降動作に伴って下降及び上昇が可能である。

工程４では、塗布用治具20の突出部21を、デバイスＸに収納された膜部材３aに当接する所定の位置まで下降させ、１回目に分注された試薬液を膜部材３ａに塗布するとともに、２回目の分注操作により試薬液の所定量１２μＬ中の残りの５μＬを分注して塗布が完了する。捕捉試薬が塗布された面積Ａは、図５に示すように、塗布用治具20の突出部21の菱形をなしている。なお、塗布用治具20は、昇降手段たる可動アーム（図示せず）に保持されており、可動アームの昇降動作に伴って下降及び上昇が可能である。このように２回に分けて分注することにより、１回目の分注操作で貫通穴22および突出部21の中に存在する気泡（空気）を外へ逃がすことができ、貫通穴22の下層に気泡（空気）が溜まることなく、２回目の分注操作にて試薬の所定量の全量を分注するので、所望の塗布スポット面積に確実に塗布でき、試薬塗布を効率よく行うことができる。

工程５では、塗布用治具20およびシリンジ31が上昇し、元の位置に戻る。

以上のように、本実施例では請求項１に対応して、フロースルー型アッセイ装置に備えられる検体試料中の被測定物を捕捉するための膜部材３ａに対し、塗布用治具20を用いて捕捉試薬を塗布する試薬の塗布方法において、前記塗布用治具20に対して所定量の試薬を吐出する分注操作を、前記塗布用治具20を前記膜部材３ａに当接させる前と当接後に複数回に分けて行うことを特徴とする試薬の塗布方法である。

この構成によれば、塗布用治具20に設けられた貫通穴22に存在する気泡（空気）を貫通穴22から外へ逃がすことができるので貫通穴22の下層に気泡（空気）が溜まることなく、所望の塗布スポット面積に確実に塗布でき、試薬塗布を効率よく行うことができる。さらに、装置の不良品の個数を減らすことができ、生産性を向上させることができる。

また、本実施例では請求項２に対応して、前記分注操作を、前記塗布用治具を前記膜部材に当接させる前に１回行い、当接後に１回行うことを特徴とする試薬の塗布方法である。

この構成によれば、１回目の分注操作で塗布用治具20に設けられた貫通穴22に存在する気泡（空気）を貫通穴22から外へ逃がすことができ、貫通穴22の下層に気泡（空気）が溜まることなく、２回目の分注操作にて試薬の所定量の全量を分注するので、所望の塗布スポット面積に確実に塗布でき、試薬塗布を効率よく行うことができる。さらに、装置の不良品の個数を減らすことができ、生産性を向上させることができる。

次に、上記フロースルー型アッセイ装置を用いたリガンド検出方法について、免疫測定法を用いたインフルエンザウイルスの検出を例にとり説明する。

（１）金コロイド標識用抗Ａ型インンフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体（マウス）の作製及び精製
精製Ａ型インフルエンザウイルス抗原を免疫し、一定期間維持したＢＡＬＢ／ｃマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol.256, p495-497(1975)）によりマウスミエローマ細胞（Ｐ３×６３）と融合した。得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を、Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗原固相プレートを用いてインキュベーター中で３７℃に維持した。その後、ＥＬＩＳＡにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化（単クローン化）を行った。取得した該細胞株をプリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水からアフィニティクロマトグラフィー法によってＩｇＧを精製した（クローン名８Ｄ２）。

（２）固相用Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体（マウス）の作製及び精製
上記（１）の方法と同様にして作製した（クローン名Ｂ４０）。

（３）金コロイド標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体の作製
９ｍＬの金コロイド溶液（ＢＢＩ社、濃度０．０１（Ｗ／Ｖ）％の水溶液、ｐＨ７．１）に対して、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）を１ｍＬ加えｐＨを８．５に合わせた。上記（１）で精製した抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体（クローン名８Ｄ２）を２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．１）で透析後、蒸留水で希釈し０．１ｍｇ／ｍＬに調製した。この抗体１ｍＬを上記金コロイド溶液に撹拌しながら滴下し５分間静置し結合させた。その後１０％ＢＳＡを１ｍＬ加え１０分間穏やかに攪拌した。つぎに遠心管へ全量移し５０００ｇで３０分間遠心し上清を吸引廃棄した。沈渣を５％のシュークロースを含む２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．７）０．９ｍＬで浮遊させた。

（４）金コロイド含有乾燥パッドの作成
（３）で作製した金コロイド標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体を蒸留水で１０倍に希釈し、ＢｉｏＤｏｔ社XYZPlatfom Dispensing Systemを用いて、１．０ｃｍ^２のパッドに１０μＬの金コロイド標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体を含浸させ、真空乾燥機にて３０分間乾燥させた。その後、１ｃｍ×０．６ｃｍに切断した。

（５）フロースルー型アッセイ装置の組み立て
膜部材３ａとしてＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ社製ニトロセルローストランスファーメンブラン（孔径０．４５μｍ）、スペーサー３ｂとしてワットマン社製Ｆ０７５−１４、吸収体３ｃとしてワットマン社製ＣＤ４２７−０７を重ね合わせ、下部デバイス１に設置し、上部デバイス２で閉じた。

（６）膜部材３ａへの固相
上記（５）で組み立てたフロースルー型アッセイ装置を上記実施例１に示した試薬の塗布方法により、（２）で作製・精製した抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体（クローン名Ｂ４０）をクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．７）で希釈した液１２μＬを膜部材３ａに塗布し、４５℃の乾燥室で４０分間乾燥を行った。

（７）フロースルー型アッセイ装置の最終作製
サンプル（検体）と金コロイド標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体パッドとの非特異的な凝集物を取りの除く為のゴミ取りフィルター10を、固定リング11を用いてアダプター７のアダプター開口部５に固定し、（６）で抗体を塗布済みのフロースルー型アッセイ装置の上部デバイス２へ装着した。その後、このフロースルー型アッセイ装置のアダプター開口部５へ金コロイド標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体パッド（金コロイドパッド12）を挿入ガイド13に沿って挿入し１枚入れた。

（８）検出方法
Ａ型インフルエンザウイルスを含むと思われるサンプル（検体）を１％ＢＳＡ，５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００，１５０ｍＭＮａＣｌを含む２０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）緩衝液０．５ｍＬに浮遊させ、０．２２μｍのフィルターで濾過した後、フロースルー型アッセイ装置の上部アダプター７へ全量滴下した。サンプルが吸収体３ｃに全量吸収されたらアダプター７を上部デバイス２から外し膜部材３ａへの着色の有無を判定した。膜部材３ａが金コロイドの色（赤色）に着色していたら、サンプル中にＡ型インフルエンザウイルスが含まれていた事になる。膜部材３ａの色が白色のままであれば、サンプル中にＡ型インフルエンザウイルスが含まれていなかった事になる。

なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内において種々の変形実施が可能である。例えば、開口部４を複数設けたフロースロー型アッセイ装置においては、開口部４の個数に合わせて塗布用治具20を複数個設け塗布するようにしてもよい。

（ａ）本発明の試薬の塗布方法の実施に用いる塗布用治具の一実施例を示す断面図であり、（ｂ）は塗布用治具の下面図である。 本発明の試薬の塗布方法の実施に用いるフロースルー型アッセイ装置の一実施例を示す上面図である。 同上断面図である。 本発明の試薬の塗布方法の一実施例である工程を示す説明図である。 本発明の試薬の塗布方法を適用後のフロースルー型アッセイ装置の上面図である。

符号の説明

３ａ 膜部材
20 塗布用治具
21 突出部
22 貫通穴

Claims (2)

1. フロースルー型アッセイ装置に備えられる検体試料中の被測定物を捕捉するための膜部材に対し、塗布用治具を用いて捕捉試薬を塗布する試薬の塗布方法において、前記塗布用治具に対して所定量の試薬を吐出する分注操作を、前記塗布用治具を前記膜部材に当接させる前と当接後に複数回に分けて行うことを特徴とする試薬の塗布方法。
2. 前記分注操作を、前記塗布用治具を前記膜部材に当接させる前に１回行い、当接後に１回行うことを特徴とする請求項１記載の試薬の塗布方法。

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