JP2005061873A - 特定高分子結晶の検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】試料溶液中から容易に特定高分子結晶試料を探すことができ、特定高分子結晶試料に対する測定・評価の迅速処理に貢献し得る特定高分子結晶の検出方法を提供する。
【解決手段】試料溶液に紫外線を照射し、該試料溶液中の試料が発する蛍光像を検出することにより試料溶液中の特定高分子を検出する。さらに、試料溶液中に含まれる試料の可視光像から該試料の外形を検出することで、その外形から結晶とそれ以外のものとを区別する。そして、上記蛍光像と可視光像の検出結果を総合して特定高分子結晶を試料溶液中から検出する。
【選択図】 図３

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、試料溶液中の特定高分子結晶試料を検出するための検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡの二重らせん構造が発見されて以来、ゲノム計画の展開と相まって、蛋白質の構造解析が世界的に注目を集めている。蛋白質の構造解析には、ＮＭＲ（核磁気共鳴装置）を用いた手法、電子顕微鏡を用いた手法、Ｘ線の回折現象を利用した手法等が開発されており、特に、Ｘ線の回折現象を利用したＸ線結晶構造解析は、イメージングプレート等の二次元Ｘ線検出器や二次元データからの解析ソフトウエア等の開発に伴い飛躍的な進展をみせている。
【０００３】
従来、Ｘ線の回折現象を利用した蛋白質の結晶構造解析は、まず溶液中で蛋白質を結晶化させて得られた蛋白質の結晶粒を、キャピラリーと称するガラス製の細管に溶液ごと注入し、このキャピラリーをＸ線回折装置に装着して行われていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
さて、上述したようにＸ線回折装置を利用して蛋白質結晶のＸ線構造解析を行うためには、Ｘ線の照射位置にターゲットである蛋白質結晶を正確に位置決めしなければならない。このため、従来は、試料溶液注入キャピラリーをＸ線回折装置に装着した後、キャピラリー内の蛋白質結晶を顕微鏡を用いて目視観察し、手作業にてＸ線の照射位置へ位置決めしていた。
このような目視観察による蛋白質結晶の探索と、位置決めの作業は繁雑で時間がかかる。しかも、従来は一回の測定が終了する都度、これらの作業を行う必要があり、自動化により多くの試料を迅速に測定・評価するには適さなかった。
【０００５】
例えば、人体を構成する蛋白質は５万〜１０万種類にも及ぶとされており、それら多くの蛋白質の構造を短期間で解明することが、近年の構造生物学における緊急の課題となっている。
【０００６】
本発明は上述した事情に鑑みさなされたもので、その目的は、試料溶液中から容易に特定高分子結晶試料を探すことができ、特定高分子結晶に対する測定・評価の迅速処理に貢献し得る特定高分子結晶の検出方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、請求項１の発明方法は、試料溶液に紫外線を照射したとき該試料溶液中の試料が蛍光を発することを条件に該試料を特定高分子と判別するとともに、該試料の可視光像に基づき該試料が結晶であるか否かを判別することを特徴とする。
【０００８】
また、請求項２の発明方法は、試料溶液に紫外線を照射し、該試料溶液中の試料が発する蛍光像を検出する特定高分子検出ステップと、
試料溶液中に含まれる試料の可視光像から該試料の外形を検出する結晶検出ステップと、を含み、
特定高分子検出ステップで蛍光像が検出され、かつ結晶検出ステップで結晶を示す外形が検出された試料を特定高分子結晶と判定することを特徴とする。
【０００９】
高分子結晶、特に生体高分子の多くは、紫外線を照射したとき蛍光を発する。本明細書では、このように紫外線を照射したとき蛍光を発する特性を有した高分子結晶を「特定高分子結晶」と称する。例えば、蛋白質結晶がこの特定高分子結晶に該当する。
【００１０】
本発明方法は、かかる特定高分子結晶の特性に着目して、試料溶液に紫外線を照射し、該試料溶液中の試料が発する蛍光像を検出することにより試料溶液中の特定高分子を検出するようにしている。
【００１１】
しかし、検出された特定高分子が、結晶を形成するものか否かは、蛍光像だけでは判別できない場合がある。例えば、特定高分子の凝集が試料溶液中に存在した場合、かかる凝集も蛍光を発するため、結晶の蛍光像と凝集の蛍光像とが混在して検出されてしまう。
【００１２】
そこで、本発明方法は、試料溶液中に含まれる試料の可視光像から該試料の外形を検出することで、その外形から結晶とそれ以外のものとを区別し、上記蛍光像の検出結果と相俟って「特定高分子」の「結晶」を試料溶液中から検出するようにした。
【００１３】
さらに、請求項３の発明方法は、上記請求項２の構成に加え、特定高分子結晶と判定された試料の位置を認識するステップを含むことを特徴とする。
【００１４】
また、上記結晶検出ステップは、
試料溶液中に含まれる試料の可視光像を画像データとして得る画像入力ステップと、
得られた可視光像の画像データを２値化する画像処理ステップと、
２値化された画像データから試料溶液中に含まれる試料のエッジに該当する画素を検出するエッジ検出ステップと、
検出された試料のエッジに該当する画素の連続性を探索し、該試料の閉じた輪郭線を検出する輪郭線検出ステップと、
閉じた輪郭線の内部領域を認識し、該内部領域の重心位置を検出する重心検出ステップと、
を含んでもよい（請求項４）
【００１５】
上記ステップで認識した閉じた輪郭線を有する試料は、一定の面積をもつ結晶であり、一方、輪郭線が閉じていない試料は凝集など結晶化されていない試料と推定される。そこで、閉じた輪郭線を有する試料のみに着目し、その重心位置を検出する。該試料が特定高分子の結晶か否かは、特定高分子検出ステップの判別結果を総合して判断することができる。
【００１６】
上述した本発明方法は、コンピュータ処理により自動処理することができる。よって、特定高分子結晶試料に対する測定・評価の自動化に利用でき、同測定・評価の迅速処理に貢献し得るものと期待される。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。本実施形態では、蛋白質結晶を検出対象（特定高分子結晶）として説明する。
図１は、本発明方法の実施に適した蛋白質結晶検出装置の概要を示す模式図である。
【００１８】
図１に示す蛋白質結晶検出装置は、試料台１の下方に可視光照射ユニット２および紫外線照射ユニット３を備えている。これら可視光照射ユニット２および紫外線照射ユニット３は、試料台１上に配置された試料容器１０内の試料溶液Ｌに対し、可視光又は紫外線を照射する光源である。
可視光照射ユニット２および紫外線照射ユニット３は、横方向にスライドしていずれか一方のユニットが透孔１ａを介して試料台１上の試料容器１０と対向配置される。なお、試料容器１０と可視光照射ユニット２および紫外線照射ユニット３の中間に反射ミラーを配置して、可視光照射ユニット２から発射される可視光線又は紫外線照射ユニット３から発射される紫外線を試料容器１０に導く構成とすれば、これら各照射ユニット２，３は、試料容器１０と対向配置する必要はない。
【００１９】
試料台１には、可視光照射ユニット２から照射される可視光および紫外線照射ユニット３から照射される紫外線をそれぞれ透過するための透孔１ａが形成してあり、この透孔の上に試料容器１０が載置される。
【００２０】
試料容器１０は、紫外線、可視光線およびＸ線を透過するポリイミド等の材料で形成された結晶化プレートを用いることが好ましい。結晶化プレートを利用した試料容器１０には、図２（ａ）に示すように、多数の凹部１１が形成されており、この凹部１１内で蛋白質の結晶を生成することができる。結晶化プレートを用いた蛋白質の結晶生成方法は、蒸気拡散法をはじめとして種々の方法が知られている。図２（ｂ）は、蒸気拡散法により蛋白質結晶Ｓが生成された状態を模式的に示す図であり、カバープレート１２の下面においた試料溶液Ｌの滴中に蛋白質結晶Ｓが生成されている。試料容器１０に形成された多数の凹部１１には、それぞれ生成条件を違えたり、異なる種類の蛋白質結晶を別個に生成することができる。
【００２１】
図１に戻り、試料台１の上方には、顕微鏡４と２次元撮像ユニット５が配設されている。顕微鏡４は、紫外線又は可視光の照射により試料容器１０内の試料溶液Ｌを透して得られる画像を拡大して２次元撮像ユニット５へ導く。なお、顕微鏡４は上下方向に焦点位置を変更して、試料溶液Ｌ中の蛋白質結晶Ｓを探索することができるように構成されている。
【００２２】
２次元撮像ユニット５としては、例えば、ＣＣＤを用いることができる。２次元撮像ユニット５は、顕微鏡４を介して入射した拡大画像を電気信号（画像データ）に変換し、中央処理装置（ＣＰＵ）６へ出力する。中央処理装置６は、２次元撮像ユニット５から入力された画像データを処理して、試料溶液Ｌ中の蛋白質結晶Ｓを検出するとともに、その位置を認識する。
【００２３】
次に、上記の装置を用いた蛋白質結晶の検出方法について説明する。
図３および図４は中央処理装置により実行される蛋白質結晶の検出方法を示すフローチャートである。
まず、蛋白質結晶Ｓが試料溶液Ｌ中に生成された試料容器１０を、試料台１の透孔１ａ上に配置する。次いで、光源を紫外線照射ユニット３に設定し、該紫外線照射ユニット３から発射される紫外線を試料容器１０内の試料溶液Ｌに照射する。
【００２４】
このとき、試料容器１０内の試料溶液Ｌを透して得られる画像は、顕微鏡４により拡大されて２次元撮像ユニット５へ入射する。中央処理装置６は、２次元撮像ユニット５から送られてくる画像データを入力し（ステップＳ１）、該画像データから蛍光像を検出する（ステップＳ２）。すなわち、試料溶液Ｌ中に生成された蛋白質結晶Ｓは、紫外線が照射されたとき蛍光を発するため、その蛍光像が２次元撮像ユニット５に入射する。そこで、中央処理装置６は、２次元撮像ユニット５から入力した画像データを分析して蛍光像を検出し、蛍光像すなわち蛋白質の位置を把握する。なお、ここで把握される蛋白質の位置は、水平面（ｘｙ座標）上の位置であり、高さ方向（ｚ座標）の位置は、顕微鏡４の焦点位置により把握される。
【００２５】
次いで、光源を紫外線照射ユニット３から可視光照射ユニット２に切り替え、該可視光照射ユニット２から発射される可視光線を試料容器１０内の試料溶液Ｌに照射する。このとき、試料容器１０内の試料溶液Ｌを透して得られる可視光像は、顕微鏡４により拡大されて２次元撮像ユニット５へ入射する。中央処理装置６は、２次元撮像ユニット５から送られてくる画像データを入力し（ステップＳ３）、該画像データを処理して試料溶液Ｌ中の結晶を検出するとともに、その重心位置を認識する（ステップＳ４）。
【００２６】
このステップＳ４（結晶検出ステップ）は、図４に示すサブルーチンに沿って処理される。すなわち、２次元撮像ユニット５から入力した画像データを、所定のしきい値を基準に２値化処理して、ｘｙ座標上の各画素を「１」「０」の２値データに変換する（ステップＳ１０）。
【００２７】
次いで、２値化処理された画像データから、試料溶液中に存在する試料のエッジに該当する画素を検出する（ステップＳ１１）。ここでは、例えば、図５に示すように判別対象である注目画素が黒（データ「１」）であるか否かを判別し、黒であったときは、その周囲の画素（画素１〜８）について、同様に黒（データ「１」）か白（データ「０」）かを判別していく。
【００２８】
そして、周囲の画素（画素１〜８）がすべて白（データ「０」）であったときは、注目画素が孤立点であると結論付ける。また、周囲の画素（画素１〜８）がすべて黒（データ「１」）であったときは、注目画素が画像の内部点であると結論付ける。このようにして、孤立点と内部点に相当する画素はすべて除外し、周囲の画素（画素１〜８）の一部が白（データ「０」）である注目画素を試料のエッジと認識し、そのｘｙ座標を記憶する。
上述した処理を、ｘｙ座標系のすべての画素について実行し、試料のエッジに該当する画素をすべて抽出する。
【００２９】
続いて、抽出した試料のエッジに該当する画素に着目し、隣接する画素を連結していき、試料の輪郭線を検出する（ステップＳ１２）。この輪郭線の始点と終点が一致すれば、該輪郭線は閉じた輪郭線と判定される。そして、閉じた輪郭線をもつ試料が、一定の面積を有する結晶と判別される。一方、輪郭線が閉じていない試料は、凝集など結晶化されていないものとして除外される。
【００３０】
次に、閉じた輪郭線をもつ試料（すなわち結晶）の内部領域を認識し、該内部領域の重心位置を、公知の演算法を用いて算出する（ステップＳ１３）。
平面画像の重心位置を求める手法としては、例えば、結晶として認識された連結図形Ｓのモーメント量を求め、このモーメント量から計算することができる。すなわち、連結図形Ｓの各画素の重みを均等に１とした場合、モーメントＭ（ｍ，ｎ）は次式（数１）で定義される。
【００３１】
【数１】

Ｍ（０，０）は、連結図形Ｓの面積
Ｍ（１，０）は、ｘ軸に対するモーメント
Ｍ（０，１）は、ｙ軸に対するモーメント
【００３２】
そして、上記のモーメント量を用いて重心座標（ｐ，ｑ）は、次式で計算できる。
ｐ＝Ｍ（１，０）／Ｍ（０，０）
ｑ＝Ｍ（０，１）／Ｍ（０，０）
【００３３】
中央処理装置６は、検出された結晶の重心位置を算出した後、再び図３に示すメインルーチンに戻り、蛍光像に基づき検出された蛋白質の位置と、可視光像に基づき検出された結晶の位置を重ね合わせて、蛋白質結晶を認識する。そして、該蛋白質結晶に対し図４のステップＳ１３で得られた重心位置を記憶する（ステップＳ５）。以上により、試料容器１０内の試料溶液Ｌに存在する蛋白質結晶の重心位置を自動的に検出することができる。
【００３４】
図６は図１の特定高分子検出装置を組み込んだ蛋白質結晶評価装置の概要を示す模式図である。
特定高分子検出装置２０は、Ｘ線回折装置３０と組み合わせて、蛋白質結晶を自動評価する装置を構成することができる。すなわち、特定高分子検出装置２０の試料台１と、Ｘ線回折装置３０の試料台３１との間を、Ｘ−Ｙテーブル等の移動手段４０で結び、試料容器１０を特定高分子検出装置２０からＸ線回折装置３０へと自動搬送して、Ｘ線回折装置３０による蛋白質結晶Ｓの評価を自動にて実行させることが可能である。
【００３５】
Ｘ線回折装置３０は、周知のとおり、Ｘ線源３２とＸ線検出器３３を備え、Ｘ線源３２から発射したＸ線を蛋白質結晶Ｓに照射したとき、所定の回折角度に出射してくる回折Ｘ線をＸ線検出器３３により検出する装置である。この回折Ｘ線が出射してくる回折角度は物質の結晶構造によって決まっているため、該回折角度に基づき蛋白質結晶の構造を評価することができる。
【００３６】
ここで、Ｘ線回折装置３０による蛋白質結晶の評価を実施するためには、Ｘ線の照射位置に蛋白質結晶を正確に位置決めする必要がある。そこで、まず、特定高分子検出装置２０を用いて試料容器１０内に存在する蛋白質結晶Ｓの重心位置を検出し、該重心位置がＸ線回折装置３０のＸ線照射位置に位置決めされるように、移動手段４０を制御して試料容器１０を搬送する。
【００３７】
このような構成の蛋白質結晶評価装置を用いれば、図２に示したごとき結晶化プレートの各凹部１１内に生成した蛋白質結晶を自動的に測定・評価することができ、作業の容易化と測定・評価の迅速化が実現可能となる。
【００３８】
〔実施例〕
図７は蛋白質結晶と自家蛍光を発しない物質の結晶とが混在して含まれる試料溶液を観察したときの顕微鏡画像のスケッチであり、（ａ）は同試料溶液に可視光線を照射して得られた可視光像、（ｂ）は同試料溶液に紫外線を照射して得られた蛍光像である。
【００３９】
同図（ａ）に示すように、試料溶液に可視光線を照射したときは、蛋白質結晶の可視光像Ａとその他の結晶の可視光像Ｂが観察された。この画像では、いずれの可視光像が蛋白質結晶であるか判別がつかない。
しかし、同図（ｂ）に示すように、試料溶液に紫外線を照射したとき、蛋白質結晶の蛍光像Ｃのみが観察され、その他の結晶は検出されない。よって、可視光像Ａと蛍光像Ｃを重ね合わせることで、蛋白質結晶の位置を認識することができる。
【００４０】
図８は蛋白質の凝集が含まれる試料溶液を観察したときの顕微鏡画像のスケッチであり、（ａ）は同試料溶液に紫外線を照射して得られた蛍光像、（ｂ）は同試料溶液に可視光線を照射して得られた可視光像である。
【００４１】
同図（ａ）に示すように、試料溶液に紫外線を照射したときは、蛋白質の凝集から発せられる蛍光像Ｄが観察された。この蛍光像Ｄでは、蛋白質の凝集か結晶かの判断はつかない。
しかし、同図（ｂ）に示すように、試料溶液に可視光線を照射したとき、蛋白質が凝集した場合は、明瞭な結晶の稜線は観察されずに、不連続であったり、針状の外形をとったりする場合がほとんどである、これにより該観察対象が蛋白質の凝集であると判断することができる。
【００４２】
このように、試料溶液に紫外線を照射したとき得られる蛍光像と、試料溶液に可視光線を照射したとき得られる可視光像とを総合することで、蛋白質以外の結晶や蛋白質の凝集を除外して、蛋白質結晶の位置を認識することが可能となる。
【００４３】
なお、上記実施形態および実施例では蛋白質結晶を検出対象として説明してきたが、本発明方法の対象はこれに限定されるものではなく、紫外線を照射したとき蛍光を発する特性を有した各種の特定高分子結晶を検出対象とすることができる。
【００４４】
【発明の効果】
以上のように本発明によれば、試料溶液に紫外線を照射したとき得られる蛍光像と、試料溶液に可視光線を照射したとき得られる可視光像とを総合することで、特定高分子結晶を容易に探すことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明方法の実施に適した蛋白質結晶検出装置の概要を示す模式図である。
【図２】試料容器の構成例を示す図である。
【図３】中央処理装置により実行される蛋白質結晶の検出方法を示すフローチャートである。
【図４】図３のステップＳ４にかかるサブルーチンを示すフローチャートである。
【図５】図４に示すステップＳ１１のエッジ検出処理を説明するための図である。
【図６】図１の特定高分子検出装置を組み込んだ蛋白質結晶評価装置の概要を示す模式図である。
【図７】蛋白質結晶と自家蛍光を発しない物質の結晶とが混在して含まれる試料溶液を観察したときの顕微鏡画像のスケッチである。
【図８】蛋白質の凝集が含まれる試料溶液を観察したときの顕微鏡画像のスケッチである。
【符号の説明】
１：試料台
１ａ：透孔
２：可視光照射ユニット
３：紫外線照射ユニット
４：顕微鏡
５：２次元撮像ユニット
６：中央処理装置
１０：試料容器
１１：凹部
１２：カバープレート
２０：特定高分子検出装置
３０：Ｘ線回折装置
３１：試料台
３２：Ｘ線源
３３：Ｘ線検出器
４０：移動手段

Claims (5)

1. 試料溶液に紫外線を照射したとき該試料溶液中の試料が蛍光を発することを条件に該試料を特定高分子と判別するとともに、該試料の可視光像に基づき該試料が結晶であるか否かを判別することを特徴とする特定高分子結晶の検出方法。
2. 試料溶液に紫外線を照射し、該試料溶液中の試料が発する蛍光像を検出する特定高分子検出ステップと、
   前記試料溶液中に含まれる試料の可視光像から該試料の外形を検出する結晶検出ステップと、を含み、
   前記特定高分子検出ステップで蛍光像が検出され、かつ前記結晶検出ステップで結晶を示す外形が検出された試料を特定高分子結晶と判定することを特徴とする特定高分子結晶の検出方法。
3. 前記特定高分子結晶と判定された試料の位置を認識するステップを含むことを特徴とする請求項２に記載した特定高分子結晶の検出方法。
4. 前記結晶検出ステップは、
   前記試料溶液中に含まれる試料の可視光像を画像データとして得る画像入力ステップと、
   得られた可視光像の画像データを２値化する画像処理ステップと、
   ２値化された画像データから前記試料溶液中に含まれる試料のエッジに該当する画素を検出するエッジ検出ステップと、
   前記検出された試料のエッジに該当する画素の連続性を探索し、該試料の閉じた輪郭線を検出する輪郭線検出ステップと、
   前記閉じた輪郭線の内部領域を認識し、該内部領域の重心位置を検出する重心検出ステップと、
   を含むことを特徴とする請求項２又は３に記載した特定高分子結晶の検出方法。
5. 前記特定高分子結晶が蛋白質結晶である請求項１乃至４のいずれか一項に記載した特定高分子結晶の検出方法。

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