JPH0735687A

JPH0735687A - 生体高分子結晶の検索方法

Info

Publication number: JPH0735687A
Application number: JP20129593A
Authority: JP
Inventors: Hidefumi Ueda; 秀文植田; Takaharu Asano; 高治浅野
Original assignee: Fujitsu Ltd
Current assignee: Fujitsu Ltd
Priority date: 1993-07-22
Filing date: 1993-07-22
Publication date: 1995-02-07

Abstract

(57)【要約】【目的】簡便な装置を用い、溶液中の生体高分子の吸
光特性を利用して生体高分子結晶を検出することができ
る、生体高分子結晶の検索方法を提供する。【構成】生体高分子の吸光特性を利用してその吸収域
にある波長による透過光観察を行い、結晶化試料溶液中
の生体高分子濃度分布をその透過率により測定して、測
定分解能の大きさを最小画素単位として二次元画像化
し、溶液部分に比べて極端に透過率が高いかもしくは低
い範囲を検出して結晶を認識する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、蛋白質、核酸等の生体
高分子結晶の検索方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】蛋白質や核酸等の生体高分子の結晶化
は、Ｘ線構造解析における最重要過程の１つであり、蛋
白質等の生体高分子工学の基礎研究に欠かせないもので
ある。これまで、蛋白質の結晶化は、基本的に実験者の
手作業によって行われてきた。しかし、蛋白質の結晶化
のための操作は、非常に微妙であるため、作業者の熟練
が必要であった。また、蛋白質の結晶化のための条件
は、蛋白質の種類によって異なり、各種の蛋白質におい
て独自に条件を検討しなければならない。蛋白質の結晶
化に影響する要因は非常に多く、そのため検討作業では
トライ−アンド−エラーを繰り返して、膨大な数のスク
リーニングを行うことになる。このとき、１つの試料ご
との観察を数回から多いときには十数回繰り返すことに
なり、観察作業に対して極めて多くの時間と労力を費や
している。しかも、得られる情報は結晶の形状や数とい
った程度のものであり、観察は単に結晶生成の有無を確
認するだけのものとなっている。

【０００３】また、蛋白質等の生体高分子の結晶化は、
薬品や食品等の製造過程において、物質の単離、精製、
高純度化などに利用されている。このような工程は、製
品の品質の向上、ひいては信頼性の確保に直接影響して
くる部分である。このほか、生体高分子の結晶化は、化
粧品等の製造過程でも多く利用されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】結晶化条件の検討をト
ライ−アンド−エラーに頼らなければならないことの原
因としては、生体高分子結晶の成長機構が、ほとんど不
明であることが挙げられる。これは、生体高分子結晶の
作製を目的とした研究者が通常得ることのできる観察情
報が、結晶の形状や個数のような結晶生成の確認程度の
ものであることから、機構解析に必要なデータが根本的
に不足していることに起因する。

【０００５】結晶化機構の解明ならびに結晶化条件の選
択に有効な情報の取得、例えば、蛋白質濃度分布の測定
などは一般には行われておらず、また測定装置自体も紫
外線顕微鏡、光干渉測定装置などの高価なものが多かっ
た。従って、本発明は、簡便な装置を用い、溶液中の生
体高分子の吸光特性を利用して生体高分子結晶を検出す
ることができる、生体高分子結晶の検索方法を提供しよ
うとするものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記課題を解
決するため、生体高分子の吸光特性を利用してその吸収
域にある波長による透過光観察を行い、結晶化試料溶液
中の生体高分子濃度分布をその透過率により測定して、
測定分解能の大きさを最小画素単位として二次元画像化
し、溶液部分に比べて極端に透過率が高いかもしくは低
い範囲を検出して結晶を認識することを特徴とする生体
高分子結晶の検索方法を提供する。

【０００７】蛋白質等の生体高分子の吸光特性を利用
し、その吸収域にある波長の光により試料溶液中に生成
した結晶を透過光観察し、得られたデータを二次元画像
化すると、結晶部分と溶液部分とでは画素の透過率およ
び分布の状態が明らかに異なっている。本発明の方法で
は、この画素の透過率の分布を認識することによって結
晶を検出するのである。

【０００８】結晶のエッジ部分は、試料溶液が入ってい
ない状態の容器の透過率を１００％とした場合に、透過
率が０〜１０％の最低レベルであるか、または溶液部分
に比べて２０％以上低くなる。従って、結晶の大きさが
測定分解能の１〜２倍であれば、結晶部分は透過率が０
〜１０％の最低レベルであるかまたは溶液部分に比べて
２０％以上低い画素の複数個の集合体として認識され
る。結晶の大きさが測定分解能の５倍程度になると、透
過率レベルが溶液部分よりも低い画素（０〜１０％）の
集まりの中に透過率レベルが極端に高い画素（９０％以
上）が現れる。これは、蛋白質結晶の屈折作用の集光効
果によるものと考えられる。測定分解能の１０倍以上の
大きさになると結晶のエッジは直線状に認識されるよう
になる。結晶が測定分解能の２０倍以上の大きさになっ
てくると、結晶部分に透過率が極端に高い画素が現れな
くなる場合もある。また、結晶の面ごとにほぼ均一な透
過光を示す場合もあり、結晶を多面的に捕らえることが
できる。

【０００９】本発明の方法では、生体高分子の結晶は、
また、試料溶液が入っていない状態の容器の透過率を１
００％とした場合に、結晶部分の透過率の分布が０〜２
５％の最低レベルの透過率をもつ画素と７５％以上の最
高レベルの透過率をもつ画素の集合体または溶液部分に
比べて２０％以上低い透過率をもつ画素と２０％以上高
い透過率をもつ画素の集合体として検出される。あるい
は、生体高分子の結晶は、結晶部分の透過率の分布が溶
液部分と直線状の境界をもち、その境界の両側において
２０％以上透過率の異なる画素の集合体として検出され
る。

【００１０】結晶成長に伴って結晶周辺の溶液に生体高
分子濃度の勾配ができるため、この勾配を認識すること
によっても、結晶の成長状態を確認することができる。
生体高分子結晶の検索に際して、生体高分子は、気相と
隔絶された状態の生体高分子溶液を徐々に結晶生成条件
に移行させ、かつ、生体高分子濃度をほぼ均一に保持す
ることにより、結晶化されてもよい。例えば、生体高分
子の溶液中に固形の沈澱剤を入れ、沈澱剤をこの溶液中
に溶出させ、拡散させることによって、生体高分子溶液
を徐々に結晶生成条件に移行させることができる。

【００１１】図１に示すように、例えば、硫酸アンモニ
ウム、ポリエチレングリコール等の固形の沈澱剤を、凹
型で内容量が正確に明らかになっている結晶化容器の底
部に入れる（図１（１））。次いで、蛋白質試料の溶液
を容器内に溢れる寸前まで満たす（図１（２））。容器
に蓋をするときに蛋白質試料溶液の一部（表面張力によ
る容器外にはみ出している部分）を溢れさせることによ
り、容器内の空気を排除する（図１（３））。この結晶
化容器内に密閉された蛋白質試料溶液を、一定温度で静
置する（図１（４））。静置の間に固形の沈澱剤が溶解
し、蛋白質試料溶液中に拡散することにより、溶液内の
沈澱剤濃度が上昇して蛋白質の溶解度が低下し、試料溶
液は結晶化条件となる（図１（５））。

【００１２】

【実施例】以下、実施例により、本発明をさらに詳しく
説明する。実施例１本発明の方法の実施例として、紫外光による蛋白質結晶
の検索を行った。検索装置として用いた紫外線顕微鏡
は、光源部（紫外光の発生、波長変換および照射装
置）、測定部（試料固定台、透過光量検出器および走査
装置）、制御部（データ記録および処理装置、画像化お
よび画像処理装置、および光源図および測定部の制御装
置）からなる。蛋白質試料にはリゾチームおよびリボヌ
クレアーゼＳを用い、試料容器として石英ガラス製のも
のを用いた。

【００１３】（１）リゾチームの結晶検索リゾチームの結晶を紫外線顕微鏡により観察した。測定
分解能２５μｍで経時的に結晶成長を観察したところ、
初期結晶核（長さ５０μｍ）の検出、成長した蛋白質結
晶（長さ０．１〜１．０ｍｍ）および結晶成長に伴う蛋
白質濃度勾配が観察された。

【００１４】リゾチームは、０．１Ｍ酢酸−酢酸ナトリ
ウム緩衝液中で、ｐＨ４．２、塩化ナトリウム４〜５
％、リゾチーム濃度２％の条件で結晶化された。また、
結晶化試料を石英ガラス製の容器に保存した。試料溶液
に波長２８０〜２９０ｎｍの紫外光を照射し、フォトマ
ルを走査して、その透過率を、試料溶液が入っていない
容器の透過光量を１００％として、測定した。測定デー
タを、モニタ上に二次元画像化して観察した。

【００１５】初期結晶核の検出では、３０μｍ程度の微
小結晶は、最初、透過率が０〜５％の１つの画素で観察
され、これはアモルファス状蛋白質や測定ノイズとほと
んど区別がつかないが、５０μｍ程度に成長すると画面
上では数画素の集合体として観察される（図２）。この
ときの結晶部の透過率は、最低レベル（０〜５％）であ
った。

【００１６】結晶がある程度の大きさになると、画面上
の結晶部分の透過率レベルに変化が現れる。０．１ｍｍ
以上になると、エッジ部分は最低レベルの透過率である
が、それ以外の部分は透過率レベルが最高（９０〜１０
０％）になる（図３）。すなわち、結晶部分は最低もし
くは最高の透過率レベルをもつ集合体という極めて特異
なパターンとなる。０．３ｍｍ以上の大きさの結晶で
は、結晶部と溶液部にはっきりとした直線状の境界が見
られるようになり、この境界の検出によっても、結晶の
認識が可能である（図４）。さらに大きく成長した結晶
では、結晶部分全体の透過率が最低レベルとなるものも
ある（図５）。また、結晶の各面単位で透過率が異なっ
ている場合もある（図６）。これらは、いずれも、結晶
に特有の画素分布状態であり、検出するときの重要な目
印となる。

【００１７】結晶の成長に伴って、結晶近傍の溶液部
に、蛋白質濃度の勾配が現れる（図５および図６）。こ
の勾配は、結晶に近い部分ほど濃度が低くなっており、
試料溶液の初期蛋白質濃度から最大２０％程度減少して
いる場合がある。このような結晶周辺の蛋白質濃度勾配
は、結晶を認識するための一手段となる。また、これは
結晶の成長機構の解析データとしても有効である。

【００１８】（２）リボヌクレアーゼＳの結晶検索リボヌクレアーゼＳの結晶を紫外線顕微鏡により観察し
た。測定分解能２５μｍで経時的に結晶成長を観察した
ところ、初期結晶核（長さ５０μｍ）の検出、成長した
蛋白質結晶（長さ０．１〜１．０ｍｍ）および結晶成長
に伴う蛋白質濃度勾配が観察された。

【００１９】リボヌクレアーゼＳは、０．１Ｍ酢酸−酢
酸ナトリウム緩衝液中で、ｐＨ６．１、塩化セシウム３
Ｍ、硫酸アンモニウム４０％飽和濃度、リボヌクレアー
ゼＳ濃度３．７５％の条件で、結晶化された。また、結
晶化試料の保存容器として、石英ガラス製のものを用い
た。試料溶液に波長２８０〜２９０ｎｍの紫外光を照射
し、フォトマルを走査して、その透過率を、試料溶液が
入っていない容器の透過光量を１００％として、測定し
た。測定データをモニタ上に二次元画像化して観察し
た。

【００２０】上記の条件で観察を行ったところ、３０μ
ｍ程度の微小結晶の確認、エッジ部分の透過率の極端な
低下、大きさ０．１ｍｍの結晶の、最低もしくは最高の
透過率レベルをもつ画素の集まりとしての検出、エッジ
の直線状境界としての認識など、上記（１）の場合と同
様の結果を得ることができた。実施例２（１）リゾチームの結晶化１．固形の塩化ナトリウム４ｍｇを、先ず、内容量１０
０μｌの凹型容器に量り取る。

【００２１】２．次に、ニワトリ卵白リゾチームを２％
含む０．１Ｍ酢酸−酢酸ナトリウムのｐＨ４．２の緩衝
液を容器内に溢れる寸前まで満たし、容器に蓋をすると
きに蛋白質溶液の一部を溢れさせることにより、容器内
の空気を排除して試料溶液を密閉する。３．この状態で２０℃の雰囲気下に静置保存し、２４時
間後に観察した。実験を合計５回行ったところ、５つの
試料のうち４つの試料で０．３ｍｍ角以上の正方晶系結
晶がそれぞれ３〜５個成長しているのが確認された。

【００２２】比較のため、静置バッチ法でリゾチームの
結晶化を行った。塩化ナトリウム含有量４．５％、ニワ
トリ卵白リチーム含有量２％および０．１Ｍ酢酸−酢酸
ナトリウム緩衝液ｐＨ４．２に調製した試料溶液を１０
０μｌづつ５つの容器に分注した後、密閉した。この状
態で２０℃の雰囲気下に静置保存し、２４時間後に観察
すると、５つの試料のうち２つの試料で０．３ｍｍ以上
の結晶がそれぞれ２〜３個づつ確認された。その他の試
料では、０．１ｍｍ以下の微結晶が生成したのみであっ
た。この結果から、本発明の方法に用いる結晶化方法
は、大きな結晶を高い再現性で得るのに適しているとい
える。

【００２３】（２）シトクロムＣオキシダーゼの結晶化１．固形のＢｒｉｊ−３５の１００ｍｇを、内容量１０
０μｌの凹型容器に量り取る。２．次に、牛心筋シトクロムＣオキシダーゼを７％含む
１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４を、容器内
に、蛋白質溶液が溢れる寸前まで満たし、容器に蓋をす
るときに蛋白質溶液の一部を溢れさせることにより、容
器内の空気を排除しながら試料溶液を密閉する。

【００２４】３．この状態で２０℃の雰囲気下に静置保
存し、２週間後に観察した。実験を合計５回行ったとこ
ろ５つの試料のうち４つの試料で０．３ｍｍ角以上の六
方晶系結晶がそれぞれ２〜５個成長しているのが確認さ
れた。比較のため、静置バッチ法でシトクロムＣオキシ
ダーゼの結晶化を行った。Ｂｒｉｊ−３５含有量１０
％、シトクロムＣオキシダーゼ含有量７％および１０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４に調製した試料溶
液を１００μｌづつ５つの容器に分注した後、密閉し
た。この状態で２０℃の雰囲気下に静置保存し、２４時
間後に観察してみると、５つの試料全てにおいて結晶は
生成しておらず、液表面には変性していると思われる蛋
白質の白濁が生じていた。また、同様の組成に調製した
試料溶液を内容量１００μｌの容器内に密閉し、気液界
面を排除した状態で２０℃の雰囲気下に静置保存した。
一週間後に観察してみると、５つの試料のうち１つの試
料で０．１ｍｍ程度の微結晶が多数観察された。その他
の試料では、蛋白質の一部がアモルファス状に沈澱して
いるのみで、結晶は生成していなかった。

【００２５】以上から、界面変性を非常に起こしやす
く、また通常の静置バッチ法では再現性があまり高くな
い試料であるシトクロムＣオキシダーゼを結晶化するた
めに、本発明の方法で用いる結晶化方法が非常に有用で
あるといえる。

【００２６】

【発明の効果】本発明の方法によれば、下記の効果が達
成される。（１）生体高分子濃度の分布状態によって結晶を検出す
るため、結晶の数や形状だけでなく、生体高分子濃度分
布などの成長機構の解析に必要なデータを取得すること
ができる。

【００２７】（２）生体高分子結晶を紫外線により透過
光観察すると特異的な二次元吸光パターンとなるため、
このパターンの検出により結晶の認識が可能である。（３）可視光観察よりも低い分解能で結晶が検出できる
ため、光学系の設計が簡素化でき、また保存する情報量
が膨大にならない。このため、観察作業を自動化する際
に有利である。

【００２８】（４）試料溶液を容器内に密閉し、気相を
排除した状態で徐々に結晶化条件に移行させることによ
って、蒸気拡散法や静置バッチ法に存在する界面変性の
危険性を排除することができる。また、蛋白質濃度は常
にほぼ均一であるため、自由界面拡散法のように蛋白質
濃度の希薄化により蛋白質が変性することがない。（５）沈澱剤が蛋白質溶液中に拡散する過程において、
その濃度勾配が形成される。沈澱剤の拡散は、固形沈澱
剤の溶出という段階を経て生じるため、非常にゆっくり
と進行する。このため、形成される濃度勾配は長時間に
わたって存在することになる。従って、静置バッチ法の
ように条件がピンポイントとならず、結晶核形成頻度が
増大する。

【００２９】（６）結晶化しようとする蛋白質試料と使
用する結晶化方法には相性のようなものが存在するた
め、これまで結晶化に成功しなかった蛋白質試料でも、
本方法を用いることにより結晶化できる可能性が生じ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の方法に有用な結晶化方法を説明する図
である。

【図２】蛋白質試料の結晶化の一過程における紫外線透
過光を二次元画像化したときの画像である。

【図３】蛋白質試料の結晶化の他の一過程における紫外
線透過光を二次元画像化したときの画像である。

【図４】蛋白質試料の結晶化の他の一過程における紫外
線透過光を二次元画像化したときの画像である。

【図５】蛋白質試料の結晶化の他の一過程における紫外
線透過光を二次元画像化したときの画像である。

【図６】蛋白質試料の結晶化の他の一過程における紫外
線透過光を二次元画像化したときの画像である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】生体高分子の吸光特性を利用してその吸
収域にある波長による透過光観察を行い、結晶化試料溶
液中の生体高分子濃度分布をその透過率により測定し
て、測定分解能の大きさを最小画素単位として二次元画
像化し、溶液部分に比べて極端に透過率が高いかもしく
は低い範囲を検出して結晶を認識することを特徴とする
生体高分子結晶の検索方法。
【請求項２】生体高分子の結晶が、試料溶液が入って
いない状態の容器の透過率を１００％とした場合に、結
晶部分の透過率の分布が０〜１０％の最低レベルにある
かまたは溶液部分に比べて２０％以上低い画素の集合体
として検出される、請求項１記載の方法。
【請求項３】生体高分子の結晶が、試料溶液が入って
いない状態の容器の透過率を１００％とした場合に、結
晶部分の透過率の分布が０〜２５％の最低レベルの透過
率をもつ画素と７５％以上の最高レベルの透過率をもつ
画素の集合体または溶液部分に比べて２０％以上低い透
過率をもつ画素と２０％以上高い透過率をもつ画素の集
合体として検出される、請求項１記載の方法。
【請求項４】生体高分子の結晶が、結晶部分の透過率
の分布が溶液部分と直線状の境界をもち、その境界の両
側において２０％以上透過率の異なる画素の集合体とし
て検出される、請求項１記載の方法。
【請求項５】生体高分子の結晶が、その周辺の溶液中
に結晶に近いほど低濃度となっている生体高分子濃度の
勾配を認識することにより検出される、請求項１記載の
方法。
【請求項６】生体高分子結晶の検索に際して、生体高
分子が、気相と隔絶された状態の生体高分子溶液を徐々
に結晶生成条件に移行させ、かつ、生体高分子濃度をほ
ぼ均一に保持することにより、結晶化される請求項１記
載の方法。
【請求項７】生体高分子溶液が、この溶液中に固形の
沈澱剤を入れ、沈澱剤をこの溶液中に溶出させ、拡散さ
せることによって、徐々に結晶生成条件に移行される、
請求項６記載の方法。