WO2005017513A1 - 特定高分子結晶の評価装置 - Google Patents

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WO2005017513A1
WO2005017513A1 PCT/JP2004/012142 JP2004012142W WO2005017513A1 WO 2005017513 A1 WO2005017513 A1 WO 2005017513A1 JP 2004012142 W JP2004012142 W JP 2004012142W WO 2005017513 A1 WO2005017513 A1 WO 2005017513A1
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WO
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sample
crystal
ray
sample container
stage
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/012142
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English (en)
French (fr)
Inventor
Takahisa Sato
Akihito Yamano
Shoichi Yasukawa
Hiroki Yoshida
Kensaku Hamada
Original Assignee
Rigaku Corporation
Riken
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rigaku Corporation, Riken filed Critical Rigaku Corporation
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Publication of WO2005017513A1 publication Critical patent/WO2005017513A1/ja

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N23/00—Investigating or analysing materials by the use of wave or particle radiation, e.g. X-rays or neutrons, not covered by groups G01N3/00 – G01N17/00, G01N21/00 or G01N22/00
    • G01N23/20—Investigating or analysing materials by the use of wave or particle radiation, e.g. X-rays or neutrons, not covered by groups G01N3/00 – G01N17/00, G01N21/00 or G01N22/00 by using diffraction of the radiation by the materials, e.g. for investigating crystal structure; by using scattering of the radiation by the materials, e.g. for investigating non-crystalline materials; by using reflection of the radiation by the materials

Definitions

  • the present invention relates to an apparatus for evaluating a specific high molecular crystal for evaluating a specific high molecular crystal by utilizing an X-ray diffraction phenomenon, and particularly to an apparatus suitable for evaluating a biological high molecular crystal such as a protein crystal.
  • the structural analysis of protein crystals using X-ray diffraction phenomena involves first injecting protein crystal grains obtained by crystallizing the protein in a solution into a glass capillary tube called a cabinetry. It was carried out by loading into a line diffractometer.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and it is an object of the present invention to automate the structural analysis of a specific polymer crystal using the X-ray diffraction phenomenon to speed up the processing. Disclosure of the invention
  • the present invention provides a device for evaluating a specific polymer crystal present in a sample container using a sample container that transmits X-rays, ultraviolet rays, and visible light, A sample detection stage for detecting a specific polymer crystal,
  • An X-ray measurement stage that is located at a distance from the sample detection stage and performs X-ray diffraction measurement of a specific polymer crystal
  • control means for positioning the sample on the sample placement portion.
  • the specific polymer crystal in the sample container is detected by the sample detection stage, and the transport means is controlled based on the information obtained there. Since the positioning is performed to the sample, the work from the detection of the specific polymer crystal to the positioning to the sample placement part can be automated, and the evaluation process can be sped up.
  • a crystallization plate having a large number of recesses for producing protein crystals is used as a sample container, and protein crystals are generated in each recess of the crystallization plate.
  • the crystals are detected on the sample detection stage, and then the crystallization plate is transported to the X-ray measurement stage, and the protein crystals in each recess are sequentially positioned on the sample placement part and X-ray diffraction measurement is performed. If you carry out many proteins Crystals can be continuously evaluated, and the working time can be greatly reduced.
  • the sample detection stage irradiates the sample container with ultraviolet light to detect a fluorescent image emitted from the sample in the sample container, and a visible light image of the sample present in the sample container.
  • a crystal detecting means for detecting the outer shape of the sample.
  • control means determines a sample in which a fluorescent image is detected by the specific polymer detecting means and an outer shape indicating a crystal is detected by the crystal detecting means as a specific polymer crystal, and the position of the specific polymer crystal is determined. It can be configured to recognize (claim 2).
  • Polymer crystals especially many biopolymers, emit fluorescence when irradiated with ultraviolet light.
  • a polymer crystal having the property of emitting fluorescence when irradiated with ultraviolet light is referred to as “specific polymer crystal”.
  • a protein crystal corresponds to the specific polymer crystal.
  • the present invention is directed to a method of detecting a specific polymer in a sample container by irradiating the sample container with ultraviolet light and detecting a fluorescent image emitted from the sample in the sample container, focusing on the characteristics of the specific polymer crystal. I have to.
  • the detected specific macromolecule forms a crystal may not be distinguished from the fluorescence image alone.
  • the aggregation of a specific polymer when present in the sample container, the aggregation also emits fluorescence, so that the fluorescence image of the crystal and the fluorescence image of the aggregation are detected together.
  • the present invention detects the outer shape of the sample from the visible light image of the sample present in the sample container, distinguishes the crystal from the other from the outer shape, and compares the result of the fluorescence image with the detection result. Together with this, the “crystal” of the “specific polymer” is determined, and the position of the specific polymer crystal is recognized.
  • the X-ray measurement stage includes an X-ray irradiator that irradiates X-rays from above or below to the specific polymer crystal in the sample container placed in the sample placement section,
  • a rotary drive mechanism for rotating the rotary arm by an arbitrary angle about a substantially horizontal axis.
  • the integrated intensity of the diffraction X-ray for the specific polymer crystal can be obtained without rotating the sample container.
  • the integrated intensity of diffracted X-rays is obtained by changing the X-ray irradiation angle on the crystal, detecting the X-ray diffracted intensity when X-rays are irradiated from various angles, and integrating those intensity data.
  • the integrated intensity of the diffracted X-rays has been determined by rotating the cavities enclosing the crystal sample.
  • the peak intensity (diffraction spot) of the diffracted X-ray detected at a fixed position with respect to the crystal was obtained by observing only one cross section of the reflected X-ray distributed in a spherical shape. Is only a few hundredths to a thousandths of the peak intensity required for the structural analysis (ie, the determination of the molecular structure).
  • peak intensities can be obtained from a plurality of cross sections for reflected X-rays from crystals distributed in a spherical shape. It can be detected and its integrated intensity can be obtained. As a result, highly reliable analysis and evaluation of the crystal structure can be realized based on the integrated intensity of the detected diffracted X-rays.
  • the concave portion of the crystallization plate is filled with a solution, and specific polymer crystals such as protein crystals exist in a suspended state in this solution. Therefore, when the crystallization plate is rotated, the solution spills out, or the crystals in the solution move, so that it cannot be rotated.
  • the crystallization plate is rotated as described above. Diffraction without X-ray integral intensity Degree can be determined.
  • the transport means includes a sample stage on which a sample container is placed, an XYZ table for mounting the sample stage and moving the sample stage in X, Y, and height directions orthogonal to each other on a horizontal plane. And a slider that conveys the table from the sample detection stage to the X-ray measurement stage.
  • FIG. 1 is a schematic plan view showing the entire configuration of a specific polymer crystal evaluation apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is also a schematic front view.
  • FIG. 3A is a perspective view showing a configuration example of a sample container.
  • FIG. 3B is an enlarged front sectional view showing a part of the sample container.
  • FIG. 4A is a plan view showing the configuration of the sample stage.
  • FIG. 4B is a front sectional view showing the configuration of the sample stage.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing an outline of the sample detection stage.
  • FIG. 6 is a flowchart showing a method for detecting protein crystals performed by the central processing unit.
  • FIG. 7 is a flowchart showing a subroutine relating to step S4 in FIG. 6 c
  • FIG. 8 is a diagram for explaining the page detection processing in step SI1 shown in FIG. 7 c
  • FIG. 9A and FIG. 9B Is a sketch of a microscope image when a sample solution containing a mixture of protein crystals and crystals of a substance that does not emit autofluorescence is observed.
  • Figures 10A and 10B show microscopic observations of a sample solution containing protein aggregation. It is a sketch of a mirror image.
  • FIG. 11 is a side view showing the configuration of the X-ray measurement stage.
  • FIG. 12 is a diagram schematically showing the principle of measurement of a protein crystal in the X-ray measurement stage.
  • FIG. 1 is a schematic plan view showing the entire configuration of the specific polymer crystal evaluation apparatus according to the present embodiment
  • FIG. 2 is a front wedge type diagram similarly.
  • the specific polymer crystal evaluation apparatus includes a sample container storage unit 100, a supply port bot 200, a sample container identification unit 300, a transport unit 400 (transport means), and a sample inspection unit.
  • An output stage 500, an X-ray measurement stage 600, and a central processing unit 700 (control means) are provided.
  • the sample container storage unit 100 is formed by a partition shelf capable of storing a plurality of sample containers 10 side by side, and the sample containers 10 storing protein crystals are arranged side by side in the sample container storage unit 100. It is placed.
  • a crystallization plate formed of a material such as polyimide that transmits ultraviolet light, visible light, and X-rays.
  • FIG. 3A a large number of recesses 11 are formed in the sample container 10 using the crystallization plate, and protein crystals S can be generated in the recesses 11. .
  • Various methods for producing a protein crystal using a crystallization plate are known, including a vapor diffusion method.
  • FIG. 3B is a diagram schematically showing a state in which the protein crystal S is generated by the vapor diffusion method. The protein crystal S is generated in the droplet of the sample solution L on the lower surface of the cover plate 12.
  • the formation conditions for each of the many recesses 11 formed in the sample container 10 were different. Thus, different types of protein crystals S can be separately produced.
  • the supply robot 200 is provided with a robot arm 201 that can freely expand and contract in the axial direction, can move in the height direction, and can turn on a horizontal plane.
  • An open / close chuck 202 is provided at the end of the robot arm 201. Is provided.
  • the sample container 100 stored in the sample container storage unit 100 is gripped by the opening / closing chuck 202, pulled out from the storage unit 100, and first transferred to the sample container identification unit 300. You.
  • the sample container identification section 300 is provided with an information reading device for reading the identification information attached to the sample container 10 in advance, and a position where the information reading device can read the identification information (information reading position).
  • the sample container 10 is placed in the).
  • an information reading device is constituted by the bar code reader.
  • the sample container 10 pulled out from the sample container storage unit 100 is used.
  • a container holding part 310 is provided near the sample container storage part 100. The sample container 10 pulled out from the sample container storage unit 100 is once placed in the container holding unit 3110, and the opening / closing chuck 202 is accurately grasped again and the sample container identification unit 30 Transferred to 0.
  • the transport unit 400 includes a sample table 410 on which the sample container 10 is placed, an XYZ table 402 on which the sample table 401 is mounted, and a sample table 4001 on which the XYZ table 402 is mounted. And a slider 403 that is integrally conveyed.
  • the sample table 401 is provided with a positioning work block 404 and a pressing unit 405 on the upper surface, and a sample container 100 mounted on the upper surface.
  • the sample container 10 is always kept at a fixed position on the sample table 401 by pressing the corners with the actuator 400 and bringing the diagonal corners into contact with the alignment block 404. It is designed to be placed.
  • the sample stage 401 has a through-hole 401a at a position where the sample container 10 is placed.
  • the through-holes 401 a are used for the ultraviolet and visible light irradiating the sample container 10 at the sample detection stage 500 described below, and for the X-ray measurement stage 6. It is for transmitting X-rays irradiated to the protein crystal S in the sample container 10 at 00.
  • the XYZ table 402 is a mechanism for moving the sample table 401 in the X and Y directions orthogonal to each other on a horizontal plane and moving the sample table 401 in the height direction (Z direction).
  • the XYZ table 402 is mounted on a slider 403.
  • the slider 400 forms a transport path connecting the sample detection stage 500 and the X-ray measurement stage 600, and the sample stage 401 mounted on the XYZ table 402 is used for sample detection. It has a function of transporting linearly between the stage 500 and the X-ray measurement stage 600.
  • the sample detection stage 500 is a stage for detecting the protein crystal S in the sample container 10 and recognizing the position of the center of gravity.
  • the X-ray measurement stage 600 is a stage for X-ray diffraction measurement of the protein crystal S in the sample container 10 detected in the sample detection stage 500. Each of these stages will be described in detail later.
  • the central processing unit 700 is composed of a general-purpose computer and executes the above-described drive control of each unit of the device. In addition, the central processing unit 700 executes discrimination of the protein crystal S in the sample detection stage 500 and recognition of the position of the center of gravity, and also executes X-ray measurement processing in the X-ray measurement stage 600.
  • the central processing unit 700 performs the XYZ table 402 and the slider 400 based on the positional information (information of the position of the center of gravity) of the protein crystal S recognized based on the information obtained at the sample detection stage 500.
  • 3 has a function of positioning the protein crystal S on the sample placement unit 6100 of the X-ray measurement stage 600.
  • the slider 403 gradually accelerates for a certain period from the start, and then drives the slider 403 at a constant speed, then gradually decelerates and stops at the sample placement unit 610.
  • the drive is controlled so that As a result, the inertia force can be suppressed, and the movement of the protein crystal S in the sample container 10 placed on the sample stage 401 can be prevented.
  • sample detection stage 500 Next, the sample detection stage 500 will be described in more detail.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing an outline of the sample detection stage.
  • a visible light irradiation unit 52 and an ultraviolet irradiation unit 52 1 are installed below the sample detection unit 5100 on which the sample container 10 is arranged.
  • the visible light irradiation unit 520 and the ultraviolet light irradiation unit 521 are light sources for irradiating the sample container 10 arranged in the sample detection unit 510 with visible light or ultraviolet light.
  • the visible light irradiation unit 52 and the ultraviolet irradiation unit 52 1 are slid in the horizontal direction, and one of the units is arranged to face the sample container 10.
  • a reflection mirror is arranged between the sample container 10, the visible light irradiation unit 52, and the ultraviolet irradiation unit 521, and the visible light or ultraviolet irradiation unit 5 emitted from the visible light irradiation unit 52 is arranged. If the configuration is such that the ultraviolet rays emitted from 21 are guided to the sample container 10, it is not necessary to arrange these irradiation units 52 0, 52 21 so as to face the sample container 10.
  • the sample container 10 is placed on the sample table 401 as described above, and is arranged in the sample detecting section 5100 by moving the XYZ table 402 and the slider 403.
  • a microscope 5300 and a two-dimensional imaging unit 5400 are arranged above the sample detecting section 5100.
  • the microscope 530 enlarges an image obtained through the sample container 10 by irradiation with ultraviolet light or visible light, and guides the image to the two-dimensional imaging unit 540.
  • the microscope 530 is configured so that the protein crystal S in the sample container 10 can be searched by changing the focal position in the vertical direction.
  • the two-dimensional imaging unit 540 for example, CCD can be used.
  • the two-dimensional imaging unit 540 converts the magnified image incident through the microscope 530 into an electric signal (image data), and outputs it to the central processing unit 700.
  • the central processing unit 700 processes the image data input from the two-dimensional imaging unit 540 to detect the protein crystal S in the sample container 10 and recognize its position.
  • Figures 6 and 7 show the method of detecting protein crystals performed by the central processing unit. Mouth-chart.
  • the light source is set to the ultraviolet irradiation unit 521, and the sample container 10 is irradiated with ultraviolet light emitted from the ultraviolet irradiation unit 521.
  • the image obtained through the sample container 10 is magnified by the microscope 530 and enters the two-dimensional imaging unit 540.
  • the central processing unit 700 inputs the image data sent from the two-dimensional imaging unit 540 (step S1), and detects a fluorescent image from the image data (step S2). . That is, since the protein crystals S generated in the sample solution L emit fluorescence when irradiated with ultraviolet rays, the fluorescence image is incident on the two-dimensional imaging unit 540. Therefore, the central processing unit 700 analyzes the image data input from the two-dimensional imaging unit 540 to detect the fluorescent image, and grasps the fluorescent image, that is, the position of the protein.
  • the position of the protein grasped here is a position on the horizontal plane (xy coordinate), and the position in the height direction (z coordinate) is grasped by the focal position of the microscope 530.
  • the light source is switched from the ultraviolet irradiation unit 52 1 to the visible light irradiation unit 52 0, and the sample container 10 is irradiated with visible light emitted from the visible light irradiation unit 5 20.
  • the visible light image obtained through the sample container 10 is magnified by the microscope 530 and enters the two-dimensional imaging unit 540.
  • the central processing unit 700 inputs the image data sent from the two-dimensional imaging unit 540 (step S 3), processes the image data, and detects the crystals in the sample solution L.
  • the position of the center of gravity is recognized (step S4).
  • This step S 4 (crystal detection step) is processed according to a subroutine shown in FIG. That is, the image data input from the two-dimensional imaging unit 540 is binarized based on a predetermined threshold, and each pixel on the xy coordinate is converted into a binary data of “1” and “0”. (Step S10).
  • a pixel corresponding to the edge of the sample present in the sample solution L is detected from the binarized image data (step SI 1).
  • the pixel of interest to be determined is black (“1”), and when it is black, the surrounding pixels (pixels 1 to 8) are similarly black (pixels 1 to 8). It determines whether it is "1" or white (data "0").
  • the above-described processing is performed for all pixels in the xy coordinate system, and all pixels corresponding to the edge of the sample are extracted.
  • the adjacent pixels are connected, and the contour of the sample is detected (step S12). If the start point and end point of this contour line match, the contour line is determined to be a closed contour line. Then, a sample having a closed contour is determined to be a crystal having a certain area. On the other hand, a sample whose contour is not closed is excluded because it is not crystallized, such as agglomeration.
  • step S13 the internal region of the sample (ie, crystal) having a closed contour is recognized, and the position of the center of gravity of the internal region is calculated using a known calculation method (step S13).
  • the moment amount of the connected figure S recognized as a crystal is obtained, and the calculation can be performed from this moment amount. That is, when the weight of each pixel of the connected figure S is set to 1 equally, the moment M (m, n) is defined by the following equation.
  • M (1, 0) is the moment about the X axis
  • M (0, 1) is the moment about the y-axis
  • the central processing unit 700 After calculating the position of the center of gravity of the detected crystal, the central processing unit 700 returns to the main routine shown in FIG. 6 again, and returns to the position of the protein detected based on the fluorescence image and the crystal detected based on the visible light image. Recognize protein crystal S by superimposing the positions of. Then, the position of the center of gravity obtained in step S13 in FIG. 7 is stored for the protein crystal S (step S5). As described above, the position of the center of gravity of the protein crystal S existing in the sample container 10 can be automatically detected.
  • Figures 9A and 9B are sketches of microscopic images when observing a sample solution containing a mixture of protein crystals and crystals of a substance that does not emit autofluorescence.
  • Figure 9A shows visible light in the sample solution.
  • FIG. 9B is a fluorescent image obtained by irradiating the sample solution with ultraviolet light.
  • Figures 10A and 10B are sketches of microscopic images when observing a sample solution containing protein aggregation.
  • Figure 1OA shows a fluorescence image obtained by irradiating the sample solution with ultraviolet light. It is a visible light image obtained by irradiating a sample solution with visible light.
  • FIG. 11 is a side view showing the configuration of the X-ray measurement stage
  • FIG. 12 is a diagram schematically showing the principle of measuring protein crystals in the X-ray measurement stage.
  • the X-ray measurement stage 600 has an X-ray irradiation unit 62 (X-ray irradiation means) below the sample placement section 610 and an X-ray A line detector 630 (X-ray detecting means) is provided.
  • X-ray irradiation unit 62 X-ray irradiation means
  • X-ray A line detector 630 X-ray detecting means
  • the sample container 10 placed on the sample table 4 0 1 is positioned and positioned in the sample placement section 6 10 by moving the XYZ table 4 0 2 and the slider 4 3. c
  • the X-ray irradiation unit 620 includes an X-ray source 621 and an X-ray optical system 622.
  • the X-ray source 6 2 1 uses a laboratory X-ray generator with a built-in electron gun and evening c. This type of X-ray generator is a large-scale X-ray generator that generates synchrotron radiation. Unlikely, the dimensions and weight are much smaller. Therefore, it can be mounted on the rotary arm 640 and driven to rotate as described later.
  • the X-ray optical system 622 selects only X-rays of a specific wavelength from the X-rays extracted from the X-ray source 621 (monochromatization), or converges the X-rays to the sample placement section 610 It has functions such as a mirror function and a combination of optical devices such as confocal mirror and collimator.
  • the X-ray detector 630 a two-dimensional X-ray detector is used.
  • a CCD is used as the X-ray detector 630, and the intensity of the diffracted X-ray detected on the plane is converted into an electric signal and output to the central processing unit 700. Is configured.
  • the X-ray irradiation unit 62 and the X-ray detector 630 described above are mounted on the rotating arm 640, respectively.
  • the shape of the rotating arm 640 is arbitrary, and may be, for example, a plate or a rod.
  • An X-ray irradiation unit 620 is mounted on one end of the rotating arm 640, and an X-ray detector 630 is mounted on the other end thereof.
  • the center of the rotary arm 64 is mounted on the rotary shaft 641a of the rotary drive mechanism 641, and the rotary drive mechanism 641 allows rotation by an arbitrary angle around the rotary shaft 641a. It is.
  • the center line 0 of the rotation axis 641 a of the rotation drive mechanism 641 is arranged substantially horizontally, and the optical axis of the X-ray emitted from the X-ray irradiation unit 62 Adjusted to intersect center line 0 of 1 a.
  • the rotation drive mechanism 641 is composed of, for example, a drive motor such as a stepping motor capable of controlling the rotation angle with high accuracy, and a gear mechanism for transmitting the rotation to the rotation shaft 641a.
  • the rotation angle of the motor is controlled by the central processing unit 700. It is preferable that the rotation angle can be arbitrarily controlled in a range of about 45 ° in both the forward and reverse directions.
  • the X-ray irradiation unit 620 mounted on the rotating arm 640 is disposed below the sample placement unit 610, and the X-ray detector 630 is mounted on the sample placement unit 610.
  • X-rays are radiated from below to the protein crystals S generated in the sample container 10 above the sample placement section 610, and the diffracted X-rays reflected by the protein crystals S are arranged above.
  • the X-ray detector 630 detects the sample above the sample container 10.
  • the arrangement of the X-ray irradiation unit 62 and the X-ray detector 630 is reversed, and the X-ray irradiation unit 62 is arranged above the sample placement unit 61 and the X-ray
  • the vessel 630 can also be arranged below it.
  • the X-ray detector 630 is provided with a detection position adjusting mechanism 650. This The detection position adjusting mechanism 650 moves the X-ray detector 630 in the direction of the radius of rotation (the direction a in the drawing), and moves the X-ray detector 630 in one direction parallel to the sample container 10 placed in the sample placement section 610.
  • the detection position adjusting mechanism 6550 is moved along the first guide rail 651 installed on the rotating arm 64, and the first guide rail 651.
  • a driving mode (not shown) for driving each of these moving tables, and an X-ray detector 630 is fixed to the second moving table. Is defined.
  • the protein crystal S in the sample container 10 is automatically positioned and arranged in the sample placement section 6110.
  • c i.e. to adjust the distance between the protein crystal S and the X-ray detector 6 3 0 If necessary, the closer the X-ray detector 6 3 0 to protein crystal S, radiate from protein crystal S It can detect diffraction spots of X-rays reflected in a wide angle range. However, when the reciprocal lattice density of the protein crystal S is high, when the X-ray detector 630 is brought close to the protein crystal S, diffraction spots of X-rays radially reflected from the protein crystal S are overlapped and detected. There is a risk that it will.
  • the distance between the protein crystal S and the X-ray detector 630 is appropriately adjusted by moving and adjusting the X-ray detector 630 in the direction a in FIG. 11 using the detection position adjusting mechanism 650. It is possible to obtain a suitable detection data by adjusting.
  • the detection range of the diffracted X-rays radially reflected from the protein crystal S is changed by moving and adjusting the X-ray detector 630 in the direction b in FIG. 11 with the detection position adjusting mechanism 650. You can also.
  • X-rays are emitted from the X-ray irradiation unit 62 to perform X-ray diffraction measurement.
  • the X-rays emitted from the X-ray irradiation unit 620 are incident on the protein crystal S in the sample container 10 from below. And from the protein crystal S radially X The rays are diffracted, and the diffracted X-rays are detected by the X-ray detector 630.
  • the central processing unit 700 executes crystal evaluation and crystal structure analysis based on the detected diffraction X-ray intensity data.
  • the rotation arm 640 When the protein crystal S is irradiated with X-rays from various angles to detect the intensity of the diffracted X-rays, the rotation arm 640 is driven to rotate by the rotation drive mechanism 641, and the protein is rotated. The angles of the X-ray irradiation unit 62 and the X-ray detector 630 with respect to the lattice plane of the white matter crystal S are adjusted, and the above X-ray diffraction measurement is repeated. By this operation, the integrated intensity of the diffracted X-ray with respect to the protein crystal S can be obtained without rotating the sample container 10, and a highly reliable crystal structure analysis based on the integrated intensity can be realized. Can be done.
  • protein crystals have been described as targets for detection.
  • the subject of the method of the present invention is not limited to this, and various methods having characteristics of emitting fluorescence when irradiated with ultraviolet rays are used.
  • the specific polymer crystal can be detected.
  • the specific high molecular crystal in the sample container is detected by the sample detection stage, and the transport means is controlled based on the information obtained therefrom. Since the positioning is performed on the sample placement part of the measurement stage, the work from the detection of the specific polymer crystal to the positioning on the sample placement part can be automated, and the evaluation process can be accelerated.

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Abstract

本発明に係る特定高分子結晶の評価装置は、試料容器(10)内の蛋白質結晶を検出するための試料検出ステージ(500)と、試料検出ステージ(500)とは離間した位置にあって、蛋白質結晶のX線回折測定を行うX線測定ステージ(600)と、試料検出ステージ(500)からX線測定ステージ(600)ヘ試料容器(10)を搬送する搬送ユニット(400)と、試料検出ステージ(500)で得られた情報に基づき、蛋白質結晶の位置を認識するとともに、該位置情報に基づき搬送ユニット(400)を制御して蛋白質結晶をX線測定ステージ(600)の試料配置部(610)へ位置決めする中央処理装置(700)と、を備えている。

Description

明 細 書 特定高分子結晶の評価装置 技術分野
この発明は、 特定高分子結晶を X線の回折現象を利用して評価するための特定高 分子結晶の評価装置に関し、 特に蛋白質結晶等の生体高分子結晶の評価に好適な装 置に関する。 背景技術
D N Aの二重らせん構造が発見されて以来、 ゲノム計画の展開と相まって、 蛋白 質結晶の構造解析が世界的に注目を集めている。 蛋白質結晶の構造解析には、 NM R (核磁気共鳴装置） を用いた手法、 電子顕微鏡を用いた手法、 X線の回折現象を 利用した手法等が開発されており、 特に、 X線の回折現象を利用した X線結晶構造 解析は、 イメージングプレート等の二次元 X線検出器や二次元デ一夕からの解析ソ フトウエア等の開発に伴い飛躍的な進展をみせている。
従来、 X線の回折現象を利用した蛋白質結晶の構造解析は、 まず溶液中で蛋白質 を結晶化させて得られた蛋白質の結晶粒をキヤビラリーと称するガラス製の細管に 注入し、 この状態で X線回折装置に装填して行われていた。
さて、 蛋白質結晶の X線構造解析を行うためには、 X線照射位置にターゲットで ある蛋白質結晶を正確に位置決めする作業が必要となる。 このため、 従来は、 蛋白 質結晶を検出するための顕微鏡を X線回折装置に付設しておき、 該顕微鏡を利用し て作業者が目視観察により人手をもって蛋白質結晶の位置決め操作を行っていた。 このような目視観察と手作業による位置決め操作は煩雑で時間がかかる。 しかも、 従来は一回の測定が終了する都度、 X線回折装置での位置決め操作を行っており、 多くの蛋白質結晶を迅速に評価することができなかった。 例えば、 人体を構成する蛋白質は 5万〜 1 0万種類にも及ぶとされており、 それ ら多くの蛋白質結晶の構造を短期間で解明することが、 近年の構造生物学における 緊急の課題となっている。
本発明はこのような事情に鑑みてなされたもので、 X線の回折現象を利用した特 定高分子結晶の構造解析を自動化して、 処理の迅速化を図ることを目的とする。 発明の開示
上記目的を達成するために、 本発明は、 X線、 紫外線および可視光線を透過する 試料容器を用い、 該試料容器内に存在する特定高分子結晶を評価する装置であって、 試料容器内の特定高分子結晶を検出するための試料検出ステージと、
試料検出ステージとは離間した位置にあって、 特定高分子結晶の X線回折測定を 行う X線測定ステージと、
試料検出ステージから X線測定ステージへ試料容器を搬送する搬送手段と、 試料検出ステージで得られた情報に基づき、 特定高分子結晶の位置を認識すると ともに、 該位置情報に基づき搬送手段を制御して該特定高分子結晶を X線測定ステ
―ジの試料配置部へ位置決めする制御手段と、 を備えたことを特徴とする。
このように、 試料検出ステージで試料容器内の特定高分子結晶を検出し、 そこで 得られた情報に基づき搬送手段を制御することで、 特定高分子結晶を X線測定ステ ージの試料配置部へ位置決めするようにしたので、 特定高分子結晶の検出から試料 配置部への位置決めまでの作業を自動化することができ、 評価処理の迅速化を図る ことが可能となる。
特に、 蛋白質結晶の評価に際しては、 蛋白質結晶を生成するための多数の凹部が 形成された結晶化プレートを試料容器として用い、 該結晶化プレートの各凹部で蛋 白質結晶を生成させ、 それら各蛋白質結晶を試料検出ステージで検出しておき、 そ の後、 該結晶化プレートを X線測定ステージへ搬送させて、 逐次、 各凹部内の蛋白 質結晶を試料配置部へ位置決めして X線回折測定を実施していけば、 多数の蛋白質 結晶を連続的に評価することができ、 作業時間の大幅な短縮を図ることができる。 ここで、 試料検出ステージは、 試料容器に紫外線を照射し、 該試料容器内の試料 が発する蛍光像を検出する特定高分子検出手段と、 試料容器内に存在する試料の可 視光像から該試料の外形を検出する結晶検出手段と、 を備えた構成とすることがで きる。
また、 制御手段は、 特定高分子検出手段により蛍光像が検出され、 かつ結晶検出 手段により結晶を示す外形が検出された試料を特定高分子結晶と判定するとともに、 該特定高分子結晶の位置を認識する構成とすることができる （請求項 2 ) 。
高分子結晶、 特に生体高分子の多くは、 紫外線を照射したとき蛍光を発する。 本 明細書では、 このように紫外線を照射したとき蛍光を発する特性を有した高分子結 晶を 「特定高分子結晶」 と称する。 例えば、 蛋白質結晶がこの特定高分子結晶に該 当する。
本発明は、 かかる特定高分子結晶の特性に着目して、 試料容器に紫外線を照射し、 該試料容器内の試料が発する蛍光像を検出することにより試料容器内の特定高分子 を検出するようにしている。
しかし、 検出された特定高分子が、 結晶を形成するものか否かは、 蛍光像だけで は判別できない場合がある。 例えば、 特定高分子の凝集が試料容器内に存在した場 合、 かかる凝集も蛍光を発するため、 結晶の蛍光像と凝集の蛍光像とが混在して検 出されてしまう。
そこで、 本発明は、 試料容器内に存在する試料の可視光像から該試料の外形を検 出することで、 その外形から結晶とそれ以外のものとを区別し、 上記蛍光像の検出 結果と相俟って 「特定高分子」 の 「結晶」 を判定するとともに、 該特定高分子結晶 の位置を認識する構成とした。
また、 X線測定ステージは、 試料配置部に配置された試料容器内の特定高分子結 晶に対し、 上方又は下方から X線を照射する X線照射手段と、
試料容器を介して X線照射手段と対向配置され、 試料容器を透過してきた特定高 分子結晶からの回折 X線を検出する X線検出手段と、
X線照射手段および X線検出手段を支持する回転アームと、
回転アームをほぼ水平な軸中心に任意の角度回転させる回転駆動機構と、 を備え た構成とすることができる。
この構成によれば、 試料容器を回転させることなく、 特定高分子結晶に対する回 折 X線の積分強度を求めることができる。 回折 X線の積分強度は、 結晶に対する X 線の照射角度を変えて、 様々な角度から X線を照射したときの回折 X線強度を検出 し、 それらの強度データを積分して求められる。 従来は、 結晶試料を封入したキヤ ビラリ一を回転させることで、 回折 X線の積分強度が求められていた。
蛋白質結晶等の特定高分子結晶の構造を解析するには、 結晶で回折してきた X線 の積分強度を求める必要がある。 すなわち、 回折を生じる可能性のある結晶からの 反射 X線は、 逆格子空間 （回折空間） において球状に分布している。 したがって、 結晶に対し固定された位置で検出される回折 X線のピーク強度 （回折斑点） は、 こ の球状に分布する反射 X線の一断面のみを観察して得られたものであり、 結晶の構 造解析 （すなわち、 分子構造の決定） に必要なピーク強度のわずか数百分の一乃至 数千分の一に過ぎない。
本発明によれば、 試料ホルダに対し X線照射手段及び X線検出手段を回転させる ことにより、 球状に分布する結晶からの反射 X線に対して複数の断面からピーク強 度 （回折斑点） を検出して、 その積分強度を求めることができる。 その結果、 検出 された回折 X線の積分強度に基づいて、 高い信頼性をもった結晶構造の解析 ·評価 を実現することができる。
特に、 結晶化プレートを試料容器として利用した場合、 結晶化プレートの凹部に は溶液が充填されており、 蛋白質結晶等の特定高分子結晶はこの溶液中に浮遊した 状態で存在する。 したがって、 結晶化プレートを回転させると溶液が零れ出たり、 溶液中の結晶が移動したりするため、 これを回転させることはできないが、 本発明 装置によれば上記のとおり結晶化プレートを回転させることなく回折 X線の積分強 度を求めることができる。
また、 搬送手段は、 試料容器を載置する試料台と、 試料台を搭載するとともに該 試料台を水平面上で直交する X、 Y方向および高さ方向に移動させる XY Zテープ ルと、 この X Y Zテーブルを試料検出ステージから X線測定ステージへ搬送するス ライダと、 を含む構成とすることができる （請求項 4 ) 。
これら X Y Zテーブルとスライダの駆動制御をもって、 試料容器内に存在する特 定高分子結晶を、 X線測定ステージに設けた試料配置部へ自動的に位置決めするこ とが可能となり、 作業性が格段に向上する。 図面の簡単な説明 図 1は、 本発明の実施形態に係る特定高分子結晶評価装置の全体構成を示す平面 模式図である。
図 2は、 同じく正面模式図である。
図 3 Aは、 試料容器の構成例を示す斜視図である。
図 3 Bは、 同試料容器の一部を拡大して示す正面断面図である。
図 4 Aは、 試料台の構成を示す平面図である。
図 4 Bは、 試料台の構成を示す正面断面図である。
図 5は、 試料検出ステージの概要を示す模式図である。
図 6は、 中央処理装置により実行される蛋白質結晶の検出方法を示すフローチヤ ートである。
図 7は、 図 6のステップ S 4にかかるサブルーチンを示すフローチャートである c 図 8は、 図 7に示すステップ S I 1のェヅジ検出処理を説明するための図である c 図 9 A, 図 9 Bは、 蛋白質結晶と自家蛍光を発しない物質の結晶とが混在して含 まれる試料溶液を観察したときの顕微鏡画像のスケッチである。
図 1 0 A , 図 1 0 Bは、 蛋白質の凝集が含まれる試料溶液を観察したときの顕微 鏡画像のスケッチである。
図 1 1は、 X線測定ステージの構成を示す側面構成図である。
図 1 2は、 X線測定ステージにおける蛋白質結晶の測定原理を模式的に示す図で ある。 . 発明を実施するための最良の形態
以下、 蛋白質結晶を評価対象 （特定高分子結晶） とした、 本発明に係る好ましい 実施の形態について図面を参照しながら説明する。
〔装置の全体構成〕
図 1は本実施形態に係る特定高分子結晶評価装置の全体構成を示す平面模式図、 図 2は同じく正面楔式図である。
図 1に示すように、 特定高分子結晶評価装置は、 試料容器収納部 1 0 0、 供給口 ボット 2 0 0ヽ 試料容器識別部 3 0 0、 搬送ュニヅト 4 0 0 (搬送手段） 、 試料検 出ステージ 5 0 0、 X線測定ステージ 6 0 0、 および中央処理装置 7 0 0 (制御手 段） を備えている。
試料容器収納部 1 0 0は、 複数の試料容器 1 0を並べて収納できる仕切棚によつ て形成されており、 該試料容器収納部 1 0 0に蛋白質結晶を収容する試料容器 1 0 が並べて載置されている。
試料容器 1 0は、 紫外線、 可視光線および X線を透過するポリイミド等の材料で 形成された結晶化プレートを用いることが好ましい。 結晶化プレートを利用した試 料容器 1 0には、 図 3 Aに示すように、 多数の凹部 1 1が形成されており、 この凹 部 1 1内で蛋白質の結晶 Sを生成することができる。 結晶化プレートを用いた蛋白 質の結晶生成方法は、 蒸気拡散法をはじめとして種々の方法が知られている。 図 3 Bは、 蒸気拡散法により蛋白質結晶 Sが生成された状態を模式的に示す図であり、 カバープレート 1 2の下面においた試料溶液 Lの滴中に蛋白質結晶 Sが生成されて いる。 試料容器 1 0に形成された多数の凹部 1 1には、 それぞれ生成条件を違えた り、 異なる種類の蛋白質結晶 Sを別個に生成することができる。
供給ロボット 2 0 0は、 軸方向に伸縮自在で、 高さ方向に移動自在、 かつ水平面 上を旋回可能なロボヅトアーム 2 0 1を備えており、 このロボヅトアーム 2 0 1の 先端に開閉チャック 2 0 2が設けられている。 試料容器収納部 1 0 0に収納されて いる試料容器 1 0は、 開閉チャック 2 0 2により把持されて同収納部 1 0 0から引 き出され、 まず試料容器識別部 3 0 0に移送される。
試料容器識別部 3 0 0には、 あらかじめ試料容器 1 0に付された識別情報を読み 取る情報読取装置が設置されており、 該情報読取装置が識別情報を読み取ることの できる位置 （情報読取位置） に試料容器 1 0が配置される。 ここで、 識別情報とし てバーコ一ドを用いた場合は、 バーコ一ドリーダにより情報読取装置が構成される c なお、 本実施形態では、 試料容器収納部 1 0 0から引き出した試料容器 1 0を、 開閉チャック 2 0 2で確実に把持して移送する目的から、 試料容器収納部 1 0 0の 近傍位置に容器持ち換え部 3 1 0が設けてある。 試料容器収納部 1 0 0から引き出 され試料容器 1 0は、 いったんこの容器持ち換え部 3 1 0に置かれ、 再び開閉チヤ ック 2 0 2が正確に把持して試料容器識別部 3 0 0へ移送される。
搬送ユニット 4 0 0は、 試料容器 1 0を載置する試料台 4 0 1と、 この試料台 4 0 1を搭載する X Y Zテーブル 4 0 2と、 この X Y Zテーブル 4 0 2を試料台 4 0 1と一体に搬送するスライダ 4 0 3とで構成されている。
試料台 4 0 1には、 図 4 Aに示すように、 上面に位置合わせプロヅク 4 0 4と押 圧用のァクチユエ一夕 4 0 5が設けてあり、 上面に載置された試料容器 1 0の角部 をァクチユエ一夕 4 0 5により押圧して、 対角線上にある角部を位置合わせプロッ ク 4 0 4に当接させることにより、 試料容器 1 0を常に試料台 4 0 1の一定位置に 載置するようになっている。
また、 試料台 4 0 1には、 図 4 Bに示すように、 試料容器 1 0が載置される部位 に透孔 4 0 1 aが穿設してある。 この透孔 4 0 1 aは、 後述する試料検出ステージ 5 0 0で試料容器 1 0に照射される紫外線と可視光線、 および X線測定ステージ 6 0 0で試料容器 1 0内の蛋白質結晶 Sに照射される X線を透過するためのものであ る。
X Y Zテーブル 4 0 2は、 試料台 4 0 1を水平面上で直交する X方向および Y方 向に移動させるとともに試料台 4 0 1を高さ方向 （Z方向） に移動させる機構であ る。 この X Y Zテ一ブル 4 0 2は、 スライダ 4 0 3に搭載されている。
スライダ 4 0 3は、 試料検出ステージ 5 0 0と X線測定ステージ 6 0 0とを結ぶ 搬送経路を形成しており、 X Y Zテーブル 4 0 2に搭載された試料台 4 0 1を、 試 料検出ステージ 5 0 0と X線測定ステージ 6 0 0との間で直線的に搬送する機能を 有している。
試料検出ステージ 5 0 0は、 試料容器 1 0内の蛋白質結晶 Sを検出し、 その重心 位置を認識するためのステージである。 また、 X線測定ステージ 6 0 0は、 試料検 出ステージ 5 0 0で検出された試料容器 1 0内の蛋白質結晶 Sを X線回折測定する ためのステ一ジである。 これら各ステージについては、 追って詳細に説明する。 中央処理装置 7 0 0は汎用コンビュ一夕で構成され、 上述した装置各部の駆動制 御を実行する。 また、 中央処理装置 7 0 0は、 試料検出ステージ 5 0 0における蛋 白質結晶 Sの判別と重心位置の認識を実行するとともに、 X線測定ステージ 6 0 0 における X線測定処理を実行する。 特に、 この中央処理装置 7 0 0は、 試料検出ス テージ 5 0 0で得られた情報により認識した蛋白質結晶 Sの位置情報 （重心位置の 情報） に基づき、 X Y Zテーブル 4 0 2とスライダ 4 0 3を制御して、 該蛋白質結 晶 Sを X線測定ステージ 6 0 0の試料配置部 6 1 0へ位置決めする機能を有してい る。
ここで、 スライダ 4 0 3は、 始動時から一定期間は徐々に加速していき、 その後、 一定の速度でスライダ 4 0 3を駆動し、 次いで徐々に減速して試料配置部 6 1 0に 停止させるように駆動制御される。 これにより慣性力を抑え試料台 4 0 1に載置さ れた試料容器 1 0内での蛋白質結晶 Sの移動を防止できる。
〔試料検出ステージ〕 次に、 試料検出ステージ 5 0 0について更に詳細に説明する。
図 5は試料検出ステージの概要を示す模式図である。
試料検出ステージ 5 0 0には、 試料容器 1 0が配置される試料検出部 5 1 0を基 準として、 その下方に可視光照射ュニット 5 2 0および紫外線照射ュニット 5 2 1 が設置してある。 これら可視光照射ュニット 5 2 0および紫外線照射ュニット 5 2 1は、 試料検出部 5 1 0に配置された試料容器 1 0に対し、 可視光又は紫外線を照 射する光源である。
可視光照射ュニット 5 2 0および紫外線照射ュニット 5 2 1は、 横方向にスライ ドしていずれか一方のュニットが試料容器 1 0と対向配置される。 なお、 試料容器 1 0と可視光照射ュニヅト 5 2 0および紫外線照射ュニヅト 5 2 1の中間に反射ミ ラーを配置して、 可視光照射ュニット 5 2 0から発射される可視光線または紫外線 照射ュニット 5 2 1から発射される紫外線を試料容器 1 0に導く構成とすれば、 こ れら各照射ユニット 5 2 0 , 5 2 1は、 試料容器 1 0と対向配置する必要はない。 試料容器 1 0は、 既述したように試料台 4 0 1に載置されており、 X Y Zテープ ル 4 0 2とスライダ 4 0 3の移動により、 試料検出部 5 1 0に配置される。
試料検出部 5 1 0の上方には、 顕微鏡 5 3 0と 2次元撮像ュニット 5 4 0が配設 されている。 顕微鏡 5 3 0は、 紫外線又は可視光の照射により試料容器 1 0を透し て得られる画像を拡大して 2次元撮像ユニット 5 4 0へ導く。 なお、 顕微鏡 5 3 0 は上下方向に焦点位置を変更して、 試料容器 1 0内の蛋白質結晶 Sを探索すること ができるように構成されている。
2次元撮像ユニット 5 4 0としては、 例えば、 C C Dを用いることができる。 2 次元撮像ュニット 5 4 0は、 顕微鏡 5 3 0を介して入射した拡大画像を電気信号 (画像デ一夕） に変換し、 中央処理装置 7 0 0へ出力する。 中央処理装置 7 0 0は、 2次元撮像ュニット 5 4 0から入力された画像デ一夕を処理して、 試料容器 1 0内 の蛋白質結晶 Sを検出するとともに、 その位置を認識する。
図 6および図 7は中央処理装置により実行される蛋白質結晶の検出方法を示すフ 口—チャートである。
まず、 光源を紫外線照射ュニット 5 2 1に設定し、 該紫外線照射ュニット 5 2 1 から発射される紫外線を試料容器 1 0に照射する。
このとき、 試料容器 1 0を透して得られる画像は、 顕微鏡 5 3 0により拡大され て 2次元撮像ュニット 5 4 0へ入射する。 中央処理装置 7 0 0は、 2次元撮像ュニ ヅト 5 4 0から送られてくる画像デ一夕を入力し （ステップ S 1 ) 、 該画像データ から蛍光像を検出する （ステップ S 2 ) 。 すなわち、 試料溶液 L中に生成された蛋 白質結晶 Sは、 紫外線が照射されたとき蛍光を発するため、 その蛍光像が 2次元撮 像ユニット 5 4 0に入射する。 そこで、 中央処理装置 7 0 0は、 2次元撮像ュニヅ ト 5 4 0から入力した画像データを分析して蛍光像を検出し、 蛍光像すなわち蛋白 質の位置を把握する。
なお、 ここで把握される蛋白質の位置は、 水平面 （x y座標） 上の位置であり、 高さ方向 （z座標） の位置は、 顕微鏡 5 3 0の焦点位置により把握される。
次いで、 光源を紫外線照射ュニット 5 2 1から可視光照射ュニット 5 2 0に切り 替え、 該可視光照射ュニット 5 2 0から発射される可視光線を試料容器 1 0に照射 する。 このとき、 試料容器 1 0を透して得られる可視光像は、 顕微鏡 5 3 0により 拡大されて 2次元撮像ユニット 5 4 0へ入射する。 中央処理装置 7 0 0は、 2次元 撮像ユニット 5 4 0から送られてくる画像デ一夕を入力し （ステップ S 3 ) 、 該画 像データを処理して試料溶液 L中の結晶を検出するとともに、 その重心位置を認識 する （ステップ S 4 ) 。
このステップ S 4 (結晶検出ステップ） は、 図 7に示すサブルーチンに沿って処 理される。 すなわち、 2次元撮像ユニット 5 4 0から入力した画像データを、 所定 のしきい値を基準に 2値化処理して、 x y座標上の各画素を 「1」 「0」 の 2値デ —夕に変換する （ステップ S 1 0 ) 。
次いで、 2値化処理された画像データから、 試料溶液 L中に存在する試料のエツ ジに該当する画素を検出する （ステヅプ S I 1 ) 。 ここでは、 例えば、 図 8に示す ように判別対象である注目画素が黒 （デ一夕 「1」 ） であるか否かを判別し、 黒で あつたときは、 その周囲の画素 （画素 1〜8 ) について、 同様に黒 （デ一夕 「1」 ） か白 （データ 「0」 ） かを判別していく。
そして、 周囲の画素 （画素 1〜8 ) がすべて白 （デ一夕 「0」 ） であったときは、 注目画素が孤立点であると結論付ける。 また、 周囲の画素 （画素 1〜8 ) がすべて 黒 （デ一夕 「1」 ） であったときは、 注目画素が画像の内部点であると結論付ける このようにして、 孤立点と内部点に相当する画素はすべて除外し、 周囲の画素 （画 素 1〜8 ) の一部が白 （デ一夕 「0」 ） である注目画素を試料のエッジと認識し、 その x y座標を記憶する。
上述した処理を、 x y座標系のすべての画素について実行し、 試料のエッジに該 当する画素をすベて抽出する。
続いて、 抽出した試料のエッジに該当する画素に着目し、 隣接する画素を連結し ていき、 試料の輪郭線を検出する （ステップ S 1 2 ) 。 この輪郭線の始点と終点が 一致すれば、 該輪郭線は閉じた輪郭線と判定される。 そして、 閉じた輪郭線をもつ 試料が、 一定の面積を有する結晶と判別される。 一方、 輪郭線が閉じていない試料 は、 凝集など結晶化されていないものとして除外される。
次に、 閉じた輪郭線をもつ試料 （すなわち結晶） の内部領域を認識し、 該内部領 域の重心位置を、 公知の演算法を用いて算出する （ステップ S 1 3 ) 。
平面画像の重心位置を求める手法としては、 例えば、 結晶として認識された連結 図形 Sのモーメント量を求め、 このモーメント量から計算することができる。 すな わち、 連結図形 Sの各画素の重みを均等に 1とした場合、 モーメント M (m, n) は次式で定義される。
M(m, n) = ∑ (xm Xyn)
(χ, y)es M (0， 0) は、 連結図形 Sの面積
M (1， 0) は、 X軸に対するモーメント
M (0， 1) は、 y軸に対するモーメント
そして、 上記のモーメント量を用いて重心座標 （p， q) は、 次式で計算できる c p二 M ( 1 , 0) /M (0, 0)
q=M (0, 1) ZM (0， 0)
中央処理装置 700は、 検出された結晶の重心位置を算出した後、 再び図 6に示 すメインルーチンに戻り、 蛍光像に基づき検出された蛋白質の位置と、 可視光像に 基づき検出された結晶の位置を重ね合わせて、 蛋白質結晶 Sを認識する。 そして、 該蛋白質結晶 Sに対し図 7のステップ S 13で得られた重心位置を記憶する （ステ ップ S 5) 。 以上により、 試料容器 10内に存在する蛋白質結晶 Sの重心位置を自 動的に検出することができる。
図 9 A， 図 9 Bは蛋白質結晶と自家蛍光を発しない物質の結晶とが混在して含ま れる試料溶液を観察したときの顕微鏡画像のスケッチであり、 図 9 Aは同試料溶液 に可視光線を照射して得られた可視光像、 図 9 Bは同試料溶液に紫外線を照射して 得られた蛍光像である。
図 9 Aに示すように、 試料溶液に可視光線を照射したときは、 蛋白質結晶の可視 光像 Aとその他の結晶の可視光像 Bが観察された。 この画像では、 いずれの可視光 像が蛋白質結晶であるか判別がつかない。
しかし、 図 9 Bに示すように、 試料溶液に紫外線を照射したとき、 蛋白質結晶の 蛍光像 Cのみが観察され、 その他の結晶は検出されない。 よって、 可視構造 Aと蛍 光像 Cを重ね合わせることで、 蛋白質結晶の位置を認識することができる。
図 10A， 図 10Bは蛋白質の凝集が含まれる試料溶液を観察したときの顕微鏡 画像のスケッチであり、 図 1 OAは同試料溶液に紫外線を照射して得られた蛍光像、 図 10 Bは同試料溶液に可視光線を照射して得られた可視光像である。
図 1 OAに示すように、 試料溶液に紫外線を照射したときは、 蛋白質の凝集から 発せられる蛍光像 Dが観察された。 この蛍光像 Dでは、 蛋白質の凝集か結晶かの判 断はっかない。
しかし、 図 1 0 Bに示すように、 試料溶液に可視光線を照射したとき、 蛋白質の 凝集に特徴的な針状の外形をもつ可視光像 Eが観察され、 よって該観察対象が蛋白 質の凝集であると判定することができる。
このように、 試料溶液に紫外線を照射したとき得られる蛍光像と、 試料溶液に可 視光線を照射したとき得られる可視光像とを総合することで、 蛋白質以外の結晶や 蛋白質の凝集を除外して、 蛋白質結晶の位置を認識することが可能となる。
〔X線測定ステージ〕
次に、 X線測定ステージについて更に詳細に説明する。
図 1 1は X線測定ステージの構成を示す側面構成図、 図 1 2は X線測定ステージ における蛋白質結晶の測定原理を模式的に示す図である。
図 1 1に示すように、 X線測定ステージ 6 0 0には、 試料配置部 6 1 0を基準と して、 その下方に X線照射ュニット 6 2 0 (X線照射手段） 、 上方に X線検出器 6 3 0 (X線検出手段） が配設されている。
試料配置部 6 1 0には、 既述したように試料台 4 0 1上に載置された試料容器 1 0が、 X Y Zテ一ブル 4 0 2とスライダ 4 0 3の移動をもって位置決め配置される c
X線照射ュニヅト 6 2 0は、 X線源 6 2 1と X線光学系 6 2 2を含んでいる。 X 線源 6 2 1には、 電子銃と夕一ゲットを内蔵したラボ用の X線発生器が用いられる c この種の X線発生器は、 放射光を発生させる大規模 X線発生設備と異なり、 寸法お よび重量が格段に小さい。 そのため、 後述するように回転アーム 6 4 0に搭載して 回転駆動することが可能である。
X線光学系 6 2 2は、 X線源 6 2 1から取り出された X線のうち、 特定波長の X 線のみを選別したり （単色化） 、 試料配置部 6 1 0へ X線を収束する等の機能を有 し、 コンフォーカルミラーゃコリメ一夕等の光学機器の組合せをもって構成されて いる。 X線検出器 6 3 0には、 二次元 X線検出器が用いられる。 特に、 本実施形態では、 X線検出器 6 3 0として C C Dを用いており、 平面上に検出される回折 X線の強度 を電気信号に変換して、 中央処理装置 7 0 0へ出力するように構成されている。 上述した X線照射ュニヅト 6 2 0および X線検出器 6 3 0は、 回転アーム 6 4 0 にそれぞれ搭載されている。 なお、 回転アーム 6 4 0の形状は任意であり、 例えば、 板状であっても棒状であってもよい。 この回転アーム 6 4 0の一端部に X線照射ュ ニット 6 2 0が搭載され、 他端部に X線検出器 6 3 0が対向するように搭載されて いる。
回転アーム 6 4 0の中心部は、 回転駆動機構 6 4 1の回転軸 6 4 1 aに装着され ており、 回転駆動機構 6 4 1により回転軸 6 4 1 a中心に任意の角度回転可能とな つている。 回転駆動機構 6 4 1の回転軸 6 4 1 aの中心線 0は、 ほぼ水平に配置し てあり、 X線照射ュニヅト 6 2 0から放射される X線の光軸は、 この回転軸 6 4 1 aの中心線 0と交わるように調整されている。 この回転駆動機構 6 4 1は、 例えば、 ステッピングモータ等の高精度に回転角度を制御可能な駆動モー夕とその回転を回 転軸 6 4 1 aに伝達する歯車機構で構成されており、 駆動モー夕は中央処理装置 7 0 0によって回転角度が制御されている。 回転角度は、 正逆両方向へ 4 5 ° 程度の 範囲で任意に制御できるようにすることが好ましい。
本実施形態では、 回転アーム 6 4 0に搭載された X線照射ュニヅト 6 2 0を試料 配置部 6 1 0の下方に配置するとともに、 X線検出器 6 3 0を試料配置部 6 1 0の 上方に配置してあり、 試料配置部 6 1 0上の試料容器 1 0内に生成された蛋白質結 晶 Sに対して下方から X線を照射し、 蛋白質結晶 Sで反射してきた回折 X線を、 試 料容器 1 0の上方で X線検出器 6 3 0により検出する構成となっている。 なお、 X 線照射ュニット 6 2 0と X線検出器 6 3 0の配置を上下逆転して、 X線照射ュニッ ト 6 2 0を試料配置部 6 1 0の上方に配置するとともに、 X線検出器 6 3 0をその 下方に配置することもできる。
また、 X線検出器 6 3 0には、 検出位置調整機構 6 5 0が付設されている。 この 検出位置調整機構 6 5 0は、 X線検出器 6 3 0を回転半径方向 （図示 a方向） に移 動させるとともに、 試料配置部 6 1 0に配置される試料容器 1 0と平行な一方向
(図示 b方向） に移動させる機構である。 図 1 1に示す構成例では、 検出位置調整 機構 6 5 0を、 回転アーム 6 4 0に設置された第 1の案内レール 6 5 1と、 この第 1の案内レール 6 5 1に沿って移動可能な第 1の移動台 6 5 2と、 この移動台 6 5 2から図示 b方向に延出する第 2の案内レール 6 5 3と、 この第 2の案内レール 6 5 3に沿って移動可能な第 2の移動台 （図示せず） と、 これら各移動台を駆動する 駆動モー夕 （図示せず） とで構成してあり、 第 2の移動台に X線検出器 6 3 0が固 定されている。
次に、 X線測定ステージ 6 0 0における蛋白質結晶の測定方法を説明する。
X Y Zテーブル 4 0 2およびスライダ 4 0 3の移動により試料配置部 6 1 0に試 料容器 1 0内の蛋白質結晶 Sが自動的に位置決め配置される。
ここで、 必要に応じて蛋白質結晶 Sと X線検出器 6 3 0との間の距離を調整する c すなわち、 蛋白質結晶 Sに X線検出器 6 3 0を近づけるほど、 蛋白質結晶 Sから放 射状に反射してくる X線の回折斑点を広い角度範囲で検出することができる。 しか し、 蛋白質結晶 Sの逆格子密度が高い場合、 蛋白質結晶 Sに X線検出器 6 3 0を近 づけると、 蛋白質結晶 Sから放射状に反射してくる X線の回折斑点が重なり合って 検出されてしまうおそれがある。 そこで、 検出位置調整機構 6 5 0をもって X線検 出器 6 3 0を図 1 1の a方向に移動調整することで、 蛋白質結晶 Sと X線検出器 6 3 0との間の距離を適宜調整し好適な検出デ一夕を得ることが可能となる。
さらに、 検出位置調整機構 6 5 0をもって X線検出器 6 3 0を図 1 1の b方向に 移動調整することで、 蛋白質結晶 Sから放射状に反射してくる回折 X線の検出範囲 を変更することもできる。
次いで、 X線照射ュニット 6 2 0から X線を放射して X線回折測定を実行する。 図 1 2に示すように、 X線照射ュニット 6 2 0から放射された X線は、 試料容器 1 0内の蛋白質結晶 Sに下方から入射する。 そして、 蛋白質結晶 Sからは放射状に X 線が回折して、 この回折 X線が X線検出器 6 3 0で検出される。 中央処理装置 7 0 0は、 検出された回折 X線の強度データに基づき結晶評価や結晶構造解析を実行す る。
また、 蛋白質結晶 Sに対して様々な角度から X線を照射して回折 X線の強度を検 出する場合には、 回転駆動機構 6 4 1により回転アーム 6 4 0を回転駆動して、 蛋 白質結晶 Sの格子面に対する X線照射ュニット 6 2 0および X線検出器 6 3 0の角 度を調整し、 上記 X線回折測定を繰り返す。 この操作をもって、 試料容器 1 0を回 転させることなく、 蛋白質結晶 Sに対する回折 X線の積分強度を求めることができ、 さらに、 積分強度に基づき高い信頼性をもった結晶構造解析を実現することができ る。
なお、 上記実施形態および実施例では蛋白質結晶を検出対象として説明してきた が、 本発明方法の対象はこれに限定されるものではなく、 紫外線を照射したとき蛍 光を発する特性を有した各種の特定高分子結晶を検出対象とすることができる。 産業上の利用可能性
以上説明したように、 本発明によれば、 試料検出ステージで試料容器内の特定高 分子結晶を検出し、 そこで得られた情報に基づき搬送手段を制御することで、 特定 高分子結晶を X線測定ステージの試料配置部へ位置決めするようにしたので、 特定 高分子結晶の検出から試料配置部への位置決めまでの作業を自動化することができ、 評価処理の迅速化を図ることが可能となる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . X線、 紫外線および可視光線を透過する試料容器を用い、 該試料容器内に存 在する特定高分子結晶を評価する装置であって、
前記試料容器内の特定高分子結晶を検出するための試料検出ステージと、 前記試料検出ステージとは離間した位置にあって、 前記特定高分子結晶の X線回 折測定を行う X線測定ステージと、
前記試料検出ステージから前記 X線測定ステージへ試料容器を搬送する搬送手段 と、
前記試料検出ステージで得られた情報に基づき、 特定高分子結晶の位置を認識す るとともに、 該位置情報に基づき前記搬送手段を制御して該特定高分子結晶を前記
X線測定ステージの試料配置部へ位置決めする制御手段と、 を備えたことを特徴と する特定高分子結晶の評価装置。
2 . 前記試料検出ステージは、 前記試料容器に紫外線を照射し、 該試料容器内の 試料が発する蛍光像を検出する特定高分子検出手段と、
前記試料容器内に存在する試料の可視光像から該試料の外形を検出する結晶検出 手段と、 を備え、
前記制御手段は、 前記特定高分子検出手段により蛍光像が検出され、 かつ前記結 晶検出手段により結晶を示す外形が検出された試料を特定高分子結晶と判定すると ともに、 該特定高分子結晶の位置を認識する構成であることを特徴とする請求の範 囲 1に記載した特定高分子結晶の評価装置。 .
3 . 前記 X線測定ステージは、 試料配置部に配置された試料容器内の特定高分子 結晶に対し、 上方又は下方から X線を照射する X線照射手段と、
前記試料容器を介して前記 X線照射手段と対向配置され、 前記試料容器を透過し てきた前記特定高分子結晶からの回折 X線を検出する X線検出手段と、
前記 X線照射手段および X線検出手段を支持する回転アームと、
前記回転アームをほぼ水平な軸中心に任意の角度回転させる回転駆動機構と、 を 備えたことを特徴とする請求の範囲 1に記載した特定高分子結晶の評価装置。
4 . 前記搬送手段は、 試料容器を載置する試料台と、 前記試料台を搭載するとと もに該試料台を水平面上で直交する X、 Y方向および高さ方向に移動させる X Y Z テ一プルと、 この X Y Zテーブルを前記試料検出ステージから前記 X線測定ステ一 ジへ搬送するスライダと、 を含むことを特徴とする請求の範囲 1に記載した特定高 分子結晶の評価装置。
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