JP2005061874A - 特定高分子結晶の位置検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】試料溶液中に存在する特定高分子結晶の高さ位置を自動的に検出する。
【解決手段】顕微鏡の焦点と試料溶液との間の相対高さ位置を逐次変更し、各相対高さ位置において顕微鏡をとおして得られる平面画像を撮像するとともに、各高さ位置における特定高分子結晶の平面画像からそれぞれの面積を算出し、この面積が最小となるときの前記相対高さ位置を算出する。
【選択図】 図３

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、試料溶液中に存在する特定高分子結晶の位置を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡの二重らせん構造が発見されて以来、ゲノム計画の展開と相まって、蛋白質の構造解析が世界的に注目を集めている。蛋白質の構造解析には、ＮＭＲ（核磁気共鳴装置）を用いた手法、電子顕微鏡を用いた手法、Ｘ線の回折現象を利用した手法等が開発されており、特に、Ｘ線の回折現象を利用したＸ線結晶構造解析は、イメージングプレート等の二次元Ｘ線検出器や二次元データからの解析ソフトウエア等の開発に伴い飛躍的な進展をみせている。
【０００３】
従来、Ｘ線の回折現象を利用した蛋白質の結晶構造解析は、まず溶液中で蛋白質を結晶化させて得られた蛋白質の結晶粒を、キャピラリーと称するガラス製の細管に溶液ごと注入し、このキャピラリーをＸ線回折装置に装着して行われていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
さて、上述したようにＸ線回折装置を利用して蛋白質結晶のＸ線構造解析を行うためには、Ｘ線の照射位置にターゲットである蛋白質結晶を正確に位置決めしなければならない。このため、従来は、試料溶液注入キャピラリーをＸ線回折装置に装着した後、キャピラリー内の蛋白質結晶を顕微鏡を用いて目視観察し、手作業にてＸ線の照射位置へ位置決めしていた。
このような目視観察による蛋白質結晶の探索と、位置決めの作業は繁雑で時間がかかる。しかも、従来は一回の測定が終了する都度、これらの作業を行う必要があり、自動化により多くの試料を迅速に測定・評価するには適さなかった。
【０００５】
例えば、人体を構成する蛋白質は５万〜１０万種類にも及ぶとされており、それら多くの蛋白質の構造を短期間で解明することが、近年の構造生物学における緊急の課題となっている。
【０００６】
本発明は上述した事情に鑑みさなされたもので、その目的は、試料溶液中に存在する特定高分子結晶の位置を自動的に検出することができ、特定高分子結晶に対する測定・評価の迅速処理に貢献し得る特定高分子結晶の位置検出方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明は、試料溶液中に存在する特定高分子結晶の位置を検出する方法であって、次のステップを含むことを特徴としている。
（ａ）顕微鏡の焦点と試料溶液との間の相対高さ位置を逐次変更し、各相対高さ位置において顕微鏡をとおして得られる平面画像を撮像する撮像ステップ
（ｂ）撮像された各相対高さ位置における平面画像の中から特定高分子結晶を認識する結晶認識ステップ
（ｃ）認識された各特定高分子結晶に関し、各相対高さ位置における平面画像からそれぞれの面積を算出する面積算出ステップ
（ｄ）認識された各特定高分子結晶に関し、面積が最小となるときの相対高さ位置を求める高さ決定ステップ
【０００８】
高分子結晶、特に生体高分子の多くは、紫外線を照射したとき蛍光を発する。本明細書では、このように紫外線を照射したとき蛍光を発する特性を有した高分子結晶を「特定高分子結晶」と称する。例えば、蛋白質結晶がこの特定高分子結晶に該当する。
【０００９】
かかる特定高分子結晶の特性を利用して、上記撮像ステップでは、試料溶液に向かって紫外線を照射することが好ましい。紫外線の照射により特定高分子結晶からは蛍光が発せられる。結晶認識ステップにおいては、紫外線の照射により現れる特定高分子結晶の蛍光像から特定高分子結晶を認識することができる。
【００１０】
一方、上記撮像ステップでは、試料溶液に向かって可視光線を照射することにより特定高分子結晶の可視光像を撮像してもよい。
【００１１】
さらに、上記撮像ステップは、試料溶液に向かって紫外線を照射することにより、各相対高さ位置における特定高分子結晶の蛍光像を撮像するとともに、試料溶液に向かって可視光線を照射することにより、各相対高さ位置における特定高分子結晶の可視光像を撮像するようにしてもよい。
この場合、結晶認識ステップにおいては、紫外線の照射により現れる蛍光像から特定高分子を認識することができる。さらに、可視光像からその特定高分子の外形を検出することで、その外形から結晶とそれ以外のもの（例えば、針状に成長した凝集）とを区別することができる。これにより、「特定高分子」の「結晶」を高精度に認識することが可能となる。
【００１２】
また、上記高さ決定ステップでは、具体的には、認識された各特定高分子結晶に関し、面積を相対高さ位置の関数として、当該面積が最小となるときの前記相対高さ位置を最小二乗法により求めることができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。本実施形態では、蛋白質結晶を検出対象（特定高分子結晶）として説明する。
図１は、本発明方法の実施に適した蛋白質結晶検出装置の概要を示す模式図である。
【００１４】
図１に示す蛋白質結晶検出装置は、試料台１の下方に可視光照射ユニット２および紫外線照射ユニット３を備えている。これら可視光照射ユニット２および紫外線照射ユニット３は、試料台１上に配置された試料容器１０内の試料溶液Ｌに対し、可視光又は紫外線を照射する光源である。
可視光照射ユニット２および紫外線照射ユニット３は、横方向にスライドしていずれか一方のユニットが透孔１ａを介して試料台１上の試料容器１０と対向配置される。なお、試料容器１０と可視光照射ユニット２および紫外線照射ユニット３の中間に反射ミラーを配置して、可視光照射ユニット２から発射される可視光線又は紫外線照射ユニット３から発射される紫外線を試料容器１０に導く構成とすれば、これら各照射ユニット２，３は、試料容器１０と対向配置する必要はない。
【００１５】
試料台１には、可視光照射ユニット２から照射される可視光および紫外線照射ユニット３から照射される紫外線をそれぞれ透過するための透孔１ａが形成してあり、この透孔の上に試料容器１０が載置される。
【００１６】
試料容器１０は、紫外線、可視光線およびＸ線を透過するポリイミド等の材料で形成された結晶化プレートを用いることが好ましい。結晶化プレートを利用した試料容器１０には、図２（ａ）に示すように、多数の凹部１１が形成されており、この凹部１１内で蛋白質の結晶を生成することができる。結晶化プレートを用いた蛋白質の結晶生成方法は、蒸気拡散法をはじめとして種々の方法が知られている。図２（ｂ）は、蒸気拡散法により蛋白質結晶Ｓが生成された状態を模式的に示す図であり、カバープレート１２の下面においた試料溶液Ｌの滴中に蛋白質結晶Ｓが生成されている。試料容器１０に形成された多数の凹部１１には、それぞれ生成条件を違えたり、異なる種類の蛋白質結晶を別個に生成することができる。
【００１７】
図１に戻り、試料台１の上方には、顕微鏡４と２次元撮像ユニット５が配設されている。顕微鏡４は、紫外線又は可視光の照射により試料容器１０内の試料溶液Ｌを透して得られる画像を拡大して２次元撮像ユニット５へ導く。この顕微鏡４は上下方向に焦点位置を変更して、試料溶液Ｌ中の蛋白質結晶Ｓを探索することができるように構成されている。
【００１８】
２次元撮像ユニット５としては、例えば、ＣＣＤを用いることができる。２次元撮像ユニット５は、顕微鏡４を介して入射した拡大画像を電気信号（画像データ）に変換し、中央処理装置（ＣＰＵ）６へ出力する。中央処理装置６は、２次元撮像ユニット５から入力された画像データを処理して、試料溶液Ｌ中の蛋白質結晶Ｓを検出するとともに、その位置を認識する。
【００１９】
次に、上記の装置を用いた蛋白質結晶の位置検出方法について説明する。
図３は中央処理装置により実行される蛋白質結晶の位置検出方法を示すフローチャートである。
まず、蛋白質結晶Ｓが試料溶液Ｌ中に生成された試料容器１０を、試料台１の透孔１ａ上に配置する。次いで、顕微鏡４の高さ方向の焦点位置（以下、高さ位置と称することもある）Ｚをあらかじめ設定した任意の位置に調整する（ステップＳ１）。
【００２０】
続いて、光源を紫外線照射ユニット３に設定し、該紫外線照射ユニット３から発射される紫外線を試料容器１０内の試料溶液Ｌに照射する。このとき、試料容器１０内の試料溶液Ｌを透して得られる平面画像は、顕微鏡４により拡大されて２次元撮像ユニット５へ入射する。この平面画像は、２次元撮像ユニット５によって撮像され、中央処理装置６に保存される（ステップＳ２）。
【００２１】
任意の高さ位置Ｚでの試料溶液Ｌの平面画像を撮像した後、再び顕微鏡４の高さ位置Ｚを変更し、同様に試料溶液Ｌの平面画像を撮像する。このようにして、あらかじめ設定した複数の高さ位置（Ｚ：１，２，・・・，ｎ）における試料溶液Ｌの平面画像を撮像して、次のステップに移行する（ステップＳ３）。
【００２２】
次のステップでは、顕微鏡４の高さ位置Ｚを上述と同じあらかじめ設定した任意の位置に調整する（ステップＳ４）。続いて、光源を可視光照射ユニット２に切り替え、該可視光照射ユニット２から発射される可視光線を試料容器１０内の試料溶液Ｌに照射する。このとき、試料容器１０内の試料溶液Ｌを透して得られる平面画像は、顕微鏡４により拡大されて２次元撮像ユニット５へ入射する。この平面画像は、２次元撮像ユニット５によって撮像され、中央処理装置６に保存される（ステップＳ５）。
【００２３】
任意の高さ位置Ｚでの試料溶液Ｌの平面画像を撮像した後、再び顕微鏡４の高さ位置Ｚを変更し、同様に試料溶液Ｌの平面画像を撮像する。このようにして、紫外線照射ユニット３を用いて撮像した高さ位置と同じ複数の高さ位置（Ｚ：１，２，・・・，ｎ）における試料溶液Ｌの平面画像を撮像する（ステップＳ６）。
以上の各ステップにより、紫外線照射による複数の高さ位置Ｚにおける試料溶液Ｌの平面画像と、可視光線の照射による複数の高さ位置Ｚにおける試料溶液Ｌの平面画像とが得られる。
【００２４】
次いで、中央処理装置６は、各高さ位置Ｚにおける試料溶液Ｌの平面画像を画像処理して蛋白質結晶を探索する（ステップＳ７）。ここでは、公知の画像処理技術を用いて、各画像データを２値化処理するとともに、エッジ検出を行う。そして、連結領域を抽出（ラベリング）して、連結図形を認識する。
【００２５】
既述したとおり、蛋白質は紫外線を照射したとき蛍光を発する。つまり、ステップＳ２で得た紫外線照射による試料溶液Ｌの平面画像において、蛋白質は蛍光像として現れる。一方、蛋白質以外の物質からは蛍光が発せられない。これにより、紫外線照射による試料溶液Ｌの平面画像から蛋白質を特定することができる。
【００２６】
しかし、結晶化されていない蛋白質の凝集なども蛍光像として現れる。そこで、本実施の形態では、ステップＳ５で得た可視光線の照射による試料溶液Ｌの平面画像を参照して、結晶とそれ以外のものを高精度に区別している。
【００２７】
すなわち、蛋白質が凝集した場合は、明瞭な結晶の稜線は観察されずに、不連続であったり、針状の外形をとったりする場合がほとんどであるため、その２値画像は閉じた輪郭線を有する連続図形とならない。一方、結晶の２値画像は閉じた輪郭線を有する連結図形として現れる。これにより、結晶を特定することができる。
【００２８】
このように、本実施の形態では、紫外線照射による試料溶液Ｌの平面画像に基づき蛋白質を特定するとともに、可視光線の照射による試料溶液Ｌの平面画像に基づき結晶を特定し、それらの分析結果を複合して蛋白質結晶を認識している。
【００２９】
上記のとおりステップＳ７において蛋白質結晶を認識した後、次いで、各高さ位置Ｚにおいて検出された蛋白質結晶について、それぞれ平面座標（Ｘ，Ｙ）と面積（Ａ）を求める（ステップＳ８）。ここでは、紫外線照射による試料溶液Ｌの平面画像と、可視光線の照射による試料溶液Ｌの平面画像のいずれを利用してもよいが、本実施の形態では、紫外線照射による平面画像を利用して、蛋白質結晶の平面座標（Ｘ，Ｙ）と面積（Ａ）を求める。
【００３０】
任意の高さ位置Ｚで撮像した一つの平面画像に、複数の蛋白質結晶が存在することもある。その場合は、各蛋白質結晶につき、図４に示すごとく平面座標（Ｘ，Ｙ）と面積（Ａ）を求める。
【００３１】
上述した蛋白質結晶の探索（ステップＳ７）と、蛋白質結晶の平面座標（Ｘ，ｙ）および面積（Ａ）の解析（ステップＳ８）を、各高さ位置Ｚ（１，２，・・・，ｎ）での平面画像について実行する（ステップＳ９）。
このとき、各高さ位置Ｚ（１，２，３・・・，ｎ）における平面画像には、新たに別の蛋白質結晶が写し出されることもあるが、通常、同一の蛋白質結晶が写し出されていることが多い。そこで、各高さ位置Ｚ（１，２，３・・・，ｎ）における平面画像で探索された蛋白質結晶について、その平面座標（Ｘ、Ｙ）に基づき関連性を分析し、同一の蛋白質結晶と判断されるものは、まとめてその平面座標（Ｘ，Ｙ）と面積（Ａ）を登録する（図４参照）。
【００３２】
次に、各高さ位置Ｚ（１，２，・・・，ｎ）における蛋白質結晶の面積（Ａ）に基づき、蛋白質結晶の最外形部分が存在する高さ位置Ｚａを求める（ステップＳ１０）。この高さ位置Ｚａに顕微鏡４の焦点を合わせることで、明瞭な蛋白質結晶の画像を得ることができ、しかも後述するＸ線回折測定においても、この高さ位置ＺａにＸ線の焦点を合わせることで、高精度な測定が可能となる。
【００３３】
さて、顕微鏡４の高さ方向の焦点位置（高さ位置）Ｚを変更して蛋白質結晶を観察すると、図５（ａ）に示すように、蛋白質結晶Ｓの最外形部分が存在する高さ位置Ｚａに顕微鏡４の焦点が合ったとき、図５（ｄ）に示すように、シャープな輪郭の蛋白質結晶Ｓの像Ｓａが観察される。一方、顕微鏡４の焦点が、この高さ位置Ｚａよりも上方または下方にずれているときは、図５（ｂ），（ｃ），（ｅ），（ｆ）に示すように、顕微鏡４からは焦点がぼけた像Ｓｂ，Ｓｃ，Ｓｅ，Ｓｆが観察される。これらの焦点がぼけた像は、シャープな輪郭の蛋白質結晶Ｓの像Ｓａよりも広がりをもつため、その面積（Ａ）は大きくなる。
【００３４】
この現象を利用して、本発明では蛋白質結晶Ｓの最外形部分が存在する高さ位置Ｚａを、各高さ位置Ｚ（１，２，・・・，ｎ）における蛋白質結晶の面積（Ａ）から算出する。具体的には、各蛋白質結晶に関し、面積（Ａ）を高さ位置Ｚの関数として、当該面積（Ａ）が最小となるときの高さ位置Ｚａを最小二乗法により求める（図６参照）。
【００３５】
ところで、顕微鏡４で蛋白質結晶を観察するとき、カバープレート１２や試料溶液Ｌと大気との間の屈折率の違いにより光路差が生じるため、実際の蛋白質結晶の高さ位置に対し、顕微鏡４で観察される蛋白質結晶の高さ位置Ｚａが、実際の高さ位置Ｚｒよりも若干ずれてしまうことがある。そこで、本実施の形態では、ステップＳ１１において、顕微鏡４で観察される蛋白質結晶の高さ位置Ｚａとその実際の高さ位置Ｚｒとの間の位置ずれを、次を関係式に基づいて補正している。
【００３６】
すなわち、図７に示すように、ある基準点Ｚ＝０からカバープレート１２の上面までの距離をＺｐ（定数）、実際の結晶位置までの距離をＺｒ、顕微鏡４で観察される結晶位置までの距離をＺａとすると、それらの間には次式で示す関係が成立する。ここで、Ｎａｉｒは空気の屈折率、Ｎｐはカバープレー１２の屈折率である。なお、試料溶液Ｌの屈折率はカバープレーと１２の屈折率にほぼ等しいので、その間の屈折率差は無視する。

【００３７】
次に、ステップＳ７で検出された各蛋白質結晶につき、その平面上の位置である平面座標（Ｘａ，Ｙａ）を決定するとともに、各蛋白質結晶の重心位置を求める（ステップＳ１２）。
ここで、平面座標（Ｘａ，Ｙａ）は、各高さ位置Ｚにおける蛋白質結晶の平面座標（Ｘ，Ｙ）の平均値を用いる。
各蛋白質結晶の重心位置は、例えば、結晶として認識された連結図形Ｓのモーメント量を求め、このモーメント量から計算することができる。すなわち、連結図形Ｓの各画素の重みを均等に１とした場合、モーメントＭ（ｍ，ｎ）は次式（数１）で定義される。
【００３８】
【数１】

Ｍ（０，０）は、連結図形Ｓの面積
Ｍ（１，０）は、ｘ軸に対するモーメント
Ｍ（０，１）は、ｙ軸に対するモーメント
【００３９】
そして、上記のモーメント量を用いて重心座標（ｐ，ｑ）は、次式で計算できる。
ｐ＝Ｍ（１，０）／Ｍ（０，０）
ｑ＝Ｍ（０，１）／Ｍ（０，０）
【００４０】
以上の各ステップにより試料溶液中に存在する蛋白質結晶の平面座標（Ｘａ，Ｙａ）、高さ位置Ｚａおよび重心位置が自動的に求められる。
【００４１】
図８は図１の特定高分子検出装置を組み込んだ蛋白質結晶評価装置の概要を示す模式図である。
特定高分子検出装置２０は、Ｘ線回折装置３０と組み合わせて、蛋白質結晶を自動評価する装置を構成することができる。すなわち、特定高分子検出装置２０の試料台１と、Ｘ線回折装置３０の試料台３１との間を、Ｘ−Ｙテーブル等の移動手段４０で結び、試料容器１０を特定高分子検出装置２０からＸ線回折装置３０へと自動搬送して、Ｘ線回折装置３０による蛋白質結晶Ｓの評価を自動にて実行させることが可能である。
【００４２】
Ｘ線回折装置３０は、周知のとおり、Ｘ線源３２とＸ線検出器３３を備え、Ｘ線源３２から発射したＸ線を蛋白質結晶Ｓに照射したとき、所定の回折角度に出射してくる回折Ｘ線をＸ線検出器３３により検出する装置である。この回折Ｘ線が出射してくる回折角度は物質の結晶構造によって決まっているため、該回折角度に基づき蛋白質結晶の構造を評価することができる。
【００４３】
ここで、Ｘ線回折装置３０による蛋白質結晶の評価を実施するためには、Ｘ線の照射位置に蛋白質結晶を正確に位置決めする必要がある。そこで、まず、特定高分子検出装置２０を用いて試料容器１０内に存在する蛋白質結晶Ｓの高さ位置および重心位置を求め、該高さ位置と重心位置がＸ線回折装置３０のＸ線照射位置に位置決めされるように、移動手段４０を制御して試料容器１０を搬送する。蛋白質結晶Ｓの高さ位置と重心位置は、既述した方法をもって自動的に求めることができる。
【００４４】
このような構成の蛋白質結晶評価装置を用いれば、図２に示したごとき結晶化プレートの各凹部１１内に生成した蛋白質結晶を自動的に測定・評価することができ、作業の容易化と測定・評価の迅速化が実現可能となる。
【００４５】
なお、上記実施形態では、蛋白質結晶を検出対象として説明してきたが、本発明方法の対象はこれに限定されるものではなく、紫外線を照射したとき蛍光を発する特性を有した各種の特定高分子結晶を検出対象とすることができる。
【００４６】
また、上記実施形態では、顕微鏡の焦点を移動させることにより、試料溶液との間の相対高さ位置を変更させたが、試料溶液が挿入された試料容器１０を高さ方向に移動させることで、顕微鏡の焦点との間の相対高さ位置を変更させることもできる。
【００４７】
上記実施形態では、紫外線照射により得られる蛍光像から蛋白質（特定高分子）を検出するとともに、可視光線の照射により得られる可視光像から結晶を検出し、これらを複合して蛋白質結晶（特定高分子結晶）を検出した。しかし、探索精度は低下するものの、必要に応じて、紫外線照射により得られる蛍光像のみを用いて蛋白質結晶（特定高分子結晶）を探索することもでき、また可視光線の照射により得られる可視光像のみを用いて蛋白質結晶（特定高分子結晶）を探索することもできる。
【００４８】
また、上記実施形態では、蒸気拡散法を用いて蛋白質結晶を生成していたが、図９に示すように、その他の方法を用いて試料容器１０（結晶化プレート）の凹部１１内に充填した試料溶液Ｌ内で蛋白質結晶Ｓを生成することもできる。
さらに、試料容器１０に対して、同図に示すごとく、その下方に顕微鏡４を配置するとともに、可視光照射ユニット２からの可視光線は、試料容器１０の上方から蛋白質結晶Ｓに向けて照射し、一方、紫外線照射ユニット３からの紫外線は試料容器１０の下方から蛋白質結晶Ｓに向けて照射してもよい。さらに、顕微鏡４は、試料容器１０の下方位置に配置し、下方から蛋白質結晶Ｓを観察する構成としてもよい。
【００４９】
このように構成した場合であっても、顕微鏡４で観察される蛋白質結晶の高さ位置Ｚａとその実際の高さ位置Ｚｒとの間の位置ずれを、次を関係式に基づいて補正することが好ましい。
【００５０】
すなわち、図９に示すように、ある基準点Ｚ＝０から試料容器１０の下面までの距離をＺｐ（定数）、実際の結晶位置までの距離をＺｒ、顕微鏡４で観察される結晶位置までの距離をＺａとすると、それらの間には次式で示す関係が成立する。ここで、Ｎａｉｒは空気の屈折率、Ｎｐは試料容器１０の屈折率である。なお、試料溶液Ｌの屈折率は試料容器１０の屈折率にほぼ等しいので、その間の屈折率差は無視する。
Ｚａ＝Ｚｐ＋（Ｚｒ−Ｚｐ）×（Ｎａｉｒ／Ｎｐ）
ゆえに、
Ｚｒ＝Ｚｐ＋（Ｚａ−Ｚｐ）×（Ｎｐ／Ｎａｉｒ）
【００５１】
【発明の効果】
以上のように本発明によれば、顕微鏡の焦点と試料溶液との間の相対高さ位置を逐次変更し、各相対高さ位置において顕微鏡をとおして得られる平面画像を撮像するとともに、各高さ位置における特定高分子結晶の平面画像からそれぞれの面積を算出し、さらにこの面積が最小となるときの前記相対高さ位置を算出することで、高分子結晶の位置を自動的に求めることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明方法の実施に適した蛋白質結晶検出装置の概要を示す模式図である。
【図２】試料容器の構成例を示す図である。
【図３】中央処理装置により実行される蛋白質結晶の位置検出方法を示すフローチャートである。
【図４】図３のステップＳ８で求められた蛋白質結晶の平面座標と面積に関する登録例を示す表である。
【図５】顕微鏡により観察される蛋白質結晶の輪郭を模式的示す図で、（ａ）は正面図、（ｂ）〜（ｆ）は平面図である。
【図６】最小二乗法を用いて算出される蛋白質結晶の高さ位置に関するデータを示す図である。
【図７】蛋白室結晶の位置に関する補正方法を説明するための模式図である。
【図８】図１の特定高分子検出装置を組み込んだ蛋白質結晶評価装置の概要を示す模式図である。
【図９】本発明の応用例を説明するための模式図である。
【符号の説明】
１：試料台
１ａ：透孔
２：可視光照射ユニット
３：紫外線照射ユニット
４：顕微鏡
５：２次元撮像ユニット
６：中央処理装置
１０：試料容器
１１：凹部
１２：カバープレート
２０：特定高分子検出装置
３０：Ｘ線回折装置
３１：試料台
３２：Ｘ線源
３３：Ｘ線検出器
４０：移動手段

Claims (5)

1. 試料溶液中に存在する特定高分子結晶の位置を検出する方法であって、
   顕微鏡の焦点と前記試料溶液との間の相対高さ位置を逐次変更し、各相対高さ位置において前記顕微鏡をとおして得られる平面画像を撮像する撮像ステップと、
   前記撮像された各相対高さ位置における平面画像の中から特定高分子結晶を認識する結晶認識ステップと、
   前記認識された各特定高分子結晶に関し、各相対高さ位置における平面画像からそれぞれの面積を算出する面積算出ステップと、
   前記認識された各特定高分子結晶に関し、前記面積が最小となるときの前記相対高さ位置を求める高さ決定ステップと、を含む特定高分子結晶の位置検出方法。
2. 前記撮像ステップでは、前記試料溶液に向かって紫外線を照射することを特徴とする請求項１に記載した特定高分子結晶の位置検出方法。
3. 前記結晶認識ステップでは、前記紫外線の照射により現れる特定高分子結晶の蛍光像から特定高分子結晶を認識することを特徴とする請求項２に記載した特定高分子結晶の位置検出方法。
4. 前記撮像ステップでは、前記試料溶液に向かって可視光線を照射することを特徴とする請求項１に記載した特定高分子結晶の位置検出方法。
5. 前記高さ決定ステップでは、前記認識された各特定高分子結晶に関し、面積を前記相対高さ位置の関数として、当該面積が最小となるときの前記相対高さ位置を最小二乗法により求めることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載した特定高分子結晶の位置検出方法。

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