JP2005061872A - 特定高分子結晶の評価装置 - Google Patents
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Abstract
【課題】Ｘ線の回折現象を利用した特定高分子結晶の構造解析を自動化して、処理の迅速化を図る。
【解決手段】試料容器１０内の蛋白質結晶を検出するための試料検出ステージ５００と、試料検出ステージ５００とは離間した位置にあって、蛋白質結晶のＸ線回折測定を行うＸ線測定ステージ６００と、試料検出ステージ５００からＸ線測定ステージ６００へ試料容器１０を搬送する搬送ユニット４００と、試料検出ステージ５００で得られた情報に基づき、蛋白質結晶の位置を認識するとともに、該位置情報に基づき搬送ユニット４００を制御して蛋白質結晶をＸ線測定ステージ６００の試料配置部６１０へ位置決めする中央処理装置７００（制御手段）と、を備えたことを特徴とする。
【選択図】 図１
【解決手段】試料容器１０内の蛋白質結晶を検出するための試料検出ステージ５００と、試料検出ステージ５００とは離間した位置にあって、蛋白質結晶のＸ線回折測定を行うＸ線測定ステージ６００と、試料検出ステージ５００からＸ線測定ステージ６００へ試料容器１０を搬送する搬送ユニット４００と、試料検出ステージ５００で得られた情報に基づき、蛋白質結晶の位置を認識するとともに、該位置情報に基づき搬送ユニット４００を制御して蛋白質結晶をＸ線測定ステージ６００の試料配置部６１０へ位置決めする中央処理装置７００（制御手段）と、を備えたことを特徴とする。
【選択図】 図１
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、特定高分子結晶をＸ線の回折現象を利用して評価するための特定高分子結晶の評価装置に関し、特に蛋白質結晶等の生体高分子結晶の評価に好適な装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡの二重らせん構造が発見されて以来、ゲノム計画の展開と相まって、蛋白質結晶の構造解析が世界的に注目を集めている。蛋白質結晶の構造解析には、ＮＭＲ（核磁気共鳴装置）を用いた手法、電子顕微鏡を用いた手法、Ｘ線の回折現象を利用した手法等が開発されており、特に、Ｘ線の回折現象を利用したＸ線結晶構造解析は、イメージングプレート等の二次元Ｘ線検出器や二次元データからの解析ソフトウエア等の開発に伴い飛躍的な進展をみせている。
【０００３】
従来、Ｘ線の回折現象を利用した蛋白質結晶の構造解析は、まず溶液中で蛋白質を結晶化させて得られた蛋白質の結晶粒をキャピラリーと称するガラス製の細管に注入し、この状態でＸ線回折装置に装填して行われていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
さて、蛋白質結晶のＸ線構造解析を行うためには、Ｘ線照射位置にターゲットである蛋白質結晶を正確に位置決めする作業が必要となる。このため、従来は、蛋白質結晶を検出するための顕微鏡をＸ線回折装置に付設しておき、該顕微鏡を利用して作業者が目視観察により人手をもって蛋白質結晶の位置決め操作を行っていた。このような目視観察と手作業による位置決め操作は煩雑で時間がかかる。しかも、従来は一回の測定が終了する都度、Ｘ線回折装置での位置決め操作を行っており、多くの蛋白質結晶を迅速に評価することができなかった。
【０００５】
例えば、人体を構成する蛋白質は５万〜１０万種類にも及ぶとされており、それら多くの蛋白質結晶の構造を短期間で解明することが、近年の構造生物学における緊急の課題となっている。
【０００６】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたもので、Ｘ線の回折現象を利用した特定高分子結晶の構造解析を自動化して、処理の迅速化を図ることを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明は、Ｘ線、紫外線および可視光線を透過する試料容器を用い、該試料容器内に存在する特定高分子結晶を評価する装置であって、
試料容器内の特定高分子結晶を検出するための試料検出ステージと、
試料検出ステージとは離間した位置にあって、特定高分子結晶のＸ線回折測定を行うＸ線測定ステージと、
試料検出ステージからＸ線測定ステージへ試料容器を搬送する搬送手段と、
試料検出ステージで得られた情報に基づき、特定高分子結晶の位置を認識するとともに、該位置情報に基づき搬送手段を制御して該特定高分子結晶をＸ線測定ステージの試料配置部へ位置決めする制御手段と、を備えたことを特徴とする（請求項１）。
【０００８】
このように、試料検出ステージで試料容器内の特定高分子結晶を検出し、そこで得られた情報に基づき搬送手段を制御することで、特定高分子結晶をＸ線測定ステージの試料配置部へ位置決めするようにしたので、特定高分子結晶の検出から試料配置部への位置決めまでの作業を自動化することができ、評価処理の迅速化を図ることが可能となる。
【０００９】
特に、蛋白質結晶の評価に際しては、蛋白質結晶を生成するための多数の凹部が形成された結晶化プレートを試料容器として用い、該結晶化プレートの各凹部で蛋白質結晶を生成させ、それら各蛋白質結晶を試料検出ステージで検出しておき、その後、該結晶化プレートをＸ線測定ステージへ搬送させて、逐次、各凹部内の蛋白質結晶を試料配置部へ位置決めしてＸ線回折測定を実施していけば、多数の蛋白質結晶を連続的に評価することができ、作業時間の大幅な短縮を図ることができる。
【００１０】
ここで、試料検出ステージは、試料容器に紫外線を照射し、該試料容器内の試料が発する蛍光像を検出する特定高分子検出手段と、試料容器内に存在する試料の可視光像から該試料の外形を検出する結晶検出手段と、を備えた構成とすることができる（請求項２）。
また、制御手段は、特定高分子検出手段により蛍光像が検出され、かつ結晶検出手段により結晶を示す外形が検出された試料を特定高分子結晶と判定するとともに、該特定高分子結晶の位置を認識する構成とすることができる（請求項２）。
【００１１】
高分子結晶、特に生体高分子の多くは、紫外線を照射したとき蛍光を発する。本明細書では、このように紫外線を照射したとき蛍光を発する特性を有した高分子結晶を「特定高分子結晶」と称する。例えば、蛋白質結晶がこの特定高分子結晶に該当する。
【００１２】
本発明は、かかる特定高分子結晶の特性に着目して、試料容器に紫外線を照射し、該試料容器内の試料が発する蛍光像を検出することにより試料容器内の特定高分子を検出するようにしている。
しかし、検出された特定高分子が、結晶を形成するものか否かは、蛍光像だけでは判別できない場合がある。例えば、特定高分子の凝集が試料容器内に存在した場合、かかる凝集も蛍光を発するため、結晶の蛍光像と凝集の蛍光像とが混在して検出されてしまう。
そこで、本発明は、試料容器内に存在する試料の可視光像から該試料の外形を検出することで、その外形から結晶とそれ以外のものとを区別し、上記蛍光像の検出結果と相俟って「特定高分子」の「結晶」を判定するとともに、該特定高分子結晶の位置を認識する構成とした。
【００１３】
また、Ｘ線測定ステージは、試料配置部に配置された試料容器内の特定高分子結晶に対し、上方又は下方からＸ線を照射するＸ線照射手段と、
試料容器を介してＸ線照射手段と対向配置され、試料容器を透過してきた特定高分子結晶からの回折Ｘ線を検出するＸ線検出手段と、
Ｘ線照射手段およびＸ線検出手段を支持する回転アームと、
回転アームをほぼ水平な軸中心に任意の角度回転させる回転駆動機構と、を備えた構成とすることができる（請求項３）。
【００１４】
この構成によれば、試料容器を回転させることなく、特定高分子結晶に対する回折Ｘ線の積分強度を求めることができる。回折Ｘ線の積分強度は、結晶に対するＸ線の照射角度を変えて、様々な角度からＸ線を照射したときの回折Ｘ線強度を検出し、それらの強度データを積分して求められる。従来は、結晶試料を封入したキャピラリーを回転させることで、回折Ｘ線の積分強度が求められていた。
【００１５】
蛋白質結晶等の特定高分子結晶の構造を解析するには、結晶で回折してきたＸ線の積分強度を求める必要がある。すなわち、回折を生じる可能性のある結晶からの反射Ｘ線は、逆格子空間（回折空間）において球状に分布している。したがって、結晶に対し固定された位置で検出される回折Ｘ線のピーク強度（回折斑点）は、この球状に分布する反射Ｘ線の一断面のみを観察して得られたものであり、結晶の構造解析（すなわち、分子構造の決定）に必要なピーク強度のわずか数百分の一乃至数千分の一に過ぎない。
【００１６】
本発明によれば、試料ホルダに対しＸ線照射手段及びＸ線検出手段を回転させることにより、球状に分布する結晶からの反射Ｘ線に対して複数の断面からピーク強度（回折斑点）を検出して、その積分強度を求めることができる。その結果、検出された回折Ｘ線の積分強度に基づいて、高い信頼性をもった結晶構造の解析・評価を実現することができる。
特に、結晶化プレートを試料容器として利用した場合、結晶化プレートの凹部には溶液が充填されており、蛋白質結晶等の特定高分子結晶はこの溶液中に浮遊した状態で存在する。したがって、結晶化プレートを回転させると溶液が零れ出たり、溶液中の結晶が移動したりするため、これを回転させることはできないが、本発明装置によれば上記のとおり結晶化プレートを回転させることなく回折Ｘ線の積分強度を求めることができる。
【００１７】
また、搬送手段は、試料容器を載置する試料台と、試料台を搭載するとともに該試料台を水平面上で直交するＸ、Ｙ方向および高さ方向に移動させるＸＹＺテーブルと、このＸＹＺテーブルを試料検出ステージからＸ線測定ステージへ搬送するスライダと、を含む構成とすることができる（請求項４）。
これらＸＹＺテーブルとスライダの駆動制御をもって、試料容器内に存在する特定高分子結晶を、Ｘ線測定ステージに設けた試料配置部へ自動的に位置決めすることが可能となり、作業性が格段に向上する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、蛋白質結晶を評価対象（特定高分子結晶）とした、本発明の実施の形態について図面を参照して詳細に説明する。
【００１９】
〔装置の全体構成〕
図１は本実施形態に係る特定高分子結晶評価装置の全体構成を示す平面模式図、図２は同じく正面模式図である。
図１に示すように、特定高分子結晶評価装置は、試料容器収納部１００、供給ロボット２００、試料容器識別部３００、搬送ユニット４００（搬送手段）、試料検出ステージ５００、Ｘ線測定ステージ６００、および中央処理装置７００（制御手段）を備えている。
【００２０】
試料容器収納部１００は、複数の試料容器１０を並べて収納できる仕切棚によって形成されており、該試料容器収納部１００に蛋白質結晶を収容する試料容器１０が並べて載置されている。
試料容器１０は、紫外線、可視光線およびＸ線を透過するポリイミド等の材料で形成された結晶化プレートを用いることが好ましい。結晶化プレートを利用した試料容器１０には、図３（ａ）に示すように、多数の凹部１１が形成されており、この凹部１１内で蛋白質の結晶Ｓを生成することができる。結晶化プレートを用いた蛋白質の結晶生成方法は、蒸気拡散法をはじめとして種々の方法が知られている。図３（ｂ）は、蒸気拡散法により蛋白質結晶Ｓが生成された状態を模式的に示す図であり、カバープレート１２の下面においた試料溶液Ｌの滴中に蛋白質結晶Ｓが生成されている。試料容器１０に形成された多数の凹部１１には、それぞれ生成条件を違えたり、異なる種類の蛋白質結晶Ｓを別個に生成することができる。
【００２１】
供給ロボット２００は、軸方向に伸縮自在で、高さ方向に移動自在、かつ水平面上を旋回可能なロボットアーム２０１を備えており、このロボットアーム２０１の先端に開閉チャック２０２が設けられている。試料容器収納部１００に収納されている試料容器１０は、開閉チャック２０２により把持されて同収納部１００から引き出され、まず試料容器識別部３００に移送される。
【００２２】
試料容器識別部３００には、あらかじめ試料容器１０に付された識別情報を読み取る情報読取装置が設置されており、該情報読取装置が識別情報を読み取ることのできる位置（情報読取位置）に試料容器１０が配置される。ここで、識別情報としてバーコードを用いた場合は、バーコードリーダにより情報読取装置が構成される。
なお、本実施形態では、試料容器収納部１００から引き出した試料容器１０を、開閉チャック２０２で確実に把持して移送する目的から、試料容器収納部１００の近傍位置に容器持ち換え部３１０が設けてある。試料容器収納部１００から引き出され試料容器１０は、いったんこの容器持ち換え部３１０に置かれ、再び開閉チャック２０２が正確に把持して試料容器識別部３００へ移送される。
【００２３】
搬送ユニット４００は、試料容器１０を載置する試料台４０１と、この試料台４０１を搭載するＸＹＺテーブル４０２と、このＸＹＺテーブル４０２を試料台４０１と一体に搬送するスライダ４０３とで構成されている。
試料台４０１には、図４に示すように、上面に位置合わせブロック４０４と押圧用のアクチュエータ４０５が設けてあり、上面に載置された試料容器１０の角部をアクチュエータ４０５により押圧して、対角線上にある角部を位置合わせブロック４０４に当接させることにより、試料容器１０を常に試料台４０１の一定位置に載置するようになっている。
【００２４】
また、試料台４０１には、試料容器１０が載置される部位に透孔４０１ａが穿設してある。この透孔４０１ａは、後述する試料検出ステージ５００で試料容器１０に照射される紫外線と可視光線、およびＸ線測定ステージ６００で試料容器１０内の蛋白質結晶Ｓに照射されるＸ線を透過するためのものである。
【００２５】
ＸＹＺテーブル４０２は、試料台４０１を水平面上で直交するＸ方向およびＹ方向に移動させるとともに試料台４０１を高さ方向（Ｚ方向）に移動させる機構である。このＸＹＺテーブル４０２は、スライダ４０３に搭載されている。
【００２６】
スライダ４０３は、試料検出ステージ５００とＸ線測定ステージ６００とを結ぶ搬送経路を形成しており、ＸＹＺテーブル４０２に搭載された試料台４０１を、試料検出ステージ５００とＸ線測定ステージ６００との間で直線的に搬送する機能を有している。
【００２７】
試料検出ステージ５００は、試料容器１０内の蛋白質結晶Ｓを検出し、その重心位置を認識するためのステージである。また、Ｘ線測定ステージ６００は、試料検出ステージ５００で検出された試料容器１０内の蛋白質結晶ＳをＸ線回折測定するためのステージである。これら各ステージについては、追って詳細に説明する。
【００２８】
中央処理装置７００は汎用コンピュータで構成され、上述した装置各部の駆動制御を実行する。また、中央処理装置７００は、試料検出ステージ５００における蛋白質結晶Ｓの判別と重心位置の認識を実行するとともに、Ｘ線測定ステージ６００におけるＸ線測定処理を実行する。特に、この中央処理装置７００は、試料検出ステージ５００で得られた情報により認識した蛋白質結晶Ｓの位置情報（重心位置の情報）に基づき、ＸＹＺテーブル４０２とスライダ４０３を制御して、該蛋白質結晶ＳをＸ線測定ステージ６００の試料配置部６１０へ位置決めする機能を有している。
【００２９】
ここで、スライダ４０３は、始動時から一定期間は徐々に加速していき、その後、一定の速度でスライダ４０３を駆動し、次いで徐々に減速して試料配置部６１０に停止させるように駆動制御される。これにより慣性力を抑え試料台４０１に載置された試料容器１０内での蛋白質結晶Ｓの移動を防止できる。
【００３０】
〔試料検出ステージ〕
次に、試料検出ステージ５００について更に詳細に説明する。
図５は試料検出ステージの概要を示す模式図である。
試料検出ステージ５００には、試料容器１０が配置される試料検出部５１０を基準として、その下方に可視光照射ユニット５２０および紫外線照射ユニット５２１が設置してある。これら可視光照射ユニット５２０および紫外線照射ユニット５２１は、試料検出部５１０に配置された試料容器１０に対し、可視光又は紫外線を照射する光源である。
可視光照射ユニット５２０および紫外線照射ユニット５２１は、横方向にスライドしていずれか一方のユニットが試料容器１０と対向配置される。なお、試料容器１０と可視光照射ユニット５２０および紫外線照射ユニット５２１の中間に反射ミラーを配置して、可視光照射ユニット５２０から発射される可視光線または紫外線照射ユニット５２１から発射される紫外線を試料容器１０に導く構成とすれば、これら各照射ユニット５２０，５２１は、試料容器１０と対向配置する必要はない。
【００３１】
試料容器１０は、既述したように試料台４０１に載置されており、ＸＹＺテーブル４０２とスライダ４０３の移動により、試料検出部５１０に配置される。
試料検出部５１０の上方には、顕微鏡５３０と２次元撮像ユニット５４０が配設されている。顕微鏡５３０は、紫外線又は可視光の照射により試料容器１０を透して得られる画像を拡大して２次元撮像ユニット５４０へ導く。なお、顕微鏡５３０は上下方向に焦点位置を変更して、試料容器１０内の蛋白質結晶Ｓを探索することができるように構成されている。
【００３２】
２次元撮像ユニット５４０としては、例えば、ＣＣＤを用いることができる。２次元撮像ユニット５４０は、顕微鏡５３０を介して入射した拡大画像を電気信号（画像データ）に変換し、中央処理装置７００へ出力する。中央処理装置７００は、２次元撮像ユニット５４０から入力された画像データを処理して、試料容器１０内の蛋白質結晶Ｓを検出するとともに、その位置を認識する。
【００３３】
図６および図７は中央処理装置により実行される蛋白質結晶の検出方法を示すフローチャートである。
まず、光源を紫外線照射ユニット５２１に設定し、該紫外線照射ユニット５２１から発射される紫外線を試料容器１０に照射する。
【００３４】
このとき、試料容器１０を透して得られる画像は、顕微鏡５３０により拡大されて２次元撮像ユニット５４０へ入射する。中央処理装置７００は、２次元撮像ユニット５４０から送られてくる画像データを入力し（ステップＳ１）、該画像データから蛍光像を検出する（ステップＳ２）。すなわち、試料溶液Ｌ中に生成された蛋白質結晶Ｓは、紫外線が照射されたとき蛍光を発するため、その蛍光像が２次元撮像ユニット５４０に入射する。そこで、中央処理装置７００は、２次元撮像ユニット５４０から入力した画像データを分析して蛍光像を検出し、蛍光像すなわち蛋白質の位置を把握する。
なお、ここで把握される蛋白質の位置は、水平面（ｘｙ座標）上の位置であり、高さ方向（ｚ座標）の位置は、顕微鏡５３０の焦点位置により把握される。
【００３５】
次いで、光源を紫外線照射ユニット５２１から可視光照射ユニット５２０に切り替え、該可視光照射ユニット５２０から発射される可視光線を試料容器１０に照射する。このとき、試料容器１０を透して得られる可視光像は、顕微鏡５３０により拡大されて２次元撮像ユニット５４０へ入射する。中央処理装置７００は、２次元撮像ユニット５４０から送られてくる画像データを入力し（ステップＳ３）、該画像データを処理して試料溶液Ｌ中の結晶を検出するとともに、その重心位置を認識する（ステップＳ４）。
【００３６】
このステップＳ４（結晶検出ステップ）は、図７に示すサブルーチンに沿って処理される。すなわち、２次元撮像ユニット５４０から入力した画像データを、所定のしきい値を基準に２値化処理して、ｘｙ座標上の各画素を「１」「０」の２値データに変換する（ステップＳ１０）。
【００３７】
次いで、２値化処理された画像データから、試料溶液Ｌ中に存在する試料のエッジに該当する画素を検出する（ステップＳ１１）。ここでは、例えば、図８に示すように判別対象である注目画素が黒（データ「１」）であるか否かを判別し、黒であったときは、その周囲の画素（画素１〜８）について、同様に黒（データ「１」）か白（データ「０」）かを判別していく。
【００３８】
そして、周囲の画素（画素１〜８）がすべて白（データ「０」）であったときは、注目画素が孤立点であると結論付ける。また、周囲の画素（画素１〜８）がすべて黒（データ「１」）であったときは、注目画素が画像の内部点であると結論付ける。このようにして、孤立点と内部点に相当する画素はすべて除外し、周囲の画素（画素１〜８）の一部が白（データ「０」）である注目画素を試料のエッジと認識し、そのｘｙ座標を記憶する。
上述した処理を、ｘｙ座標系のすべての画素について実行し、試料のエッジに該当する画素をすべて抽出する。
【００３９】
続いて、抽出した試料のエッジに該当する画素に着目し、隣接する画素を連結していき、試料の輪郭線を検出する（ステップＳ１２）。この輪郭線の始点と終点が一致すれば、該輪郭線は閉じた輪郭線と判定される。そして、閉じた輪郭線をもつ試料が、一定の面積を有する結晶と判別される。一方、輪郭線が閉じていない試料は、凝集など結晶化されていないものとして除外される。
【００４０】
次に、閉じた輪郭線をもつ試料（すなわち結晶）の内部領域を認識し、該内部領域の重心位置を、公知の演算法を用いて算出する（ステップＳ１３）。
平面画像の重心位置を求める手法としては、例えば、結晶として認識された連結図形Ｓのモーメント量を求め、このモーメント量から計算することができる。すなわち、連結図形Ｓの各画素の重みを均等に１とした場合、モーメントＭ（ｍ，ｎ）は次式（数１）で定義される。
【００４１】
【数１】
Ｍ（０，０）は、連結図形Ｓの面積
Ｍ（１，０）は、ｘ軸に対するモーメント
Ｍ（０，１）は、ｙ軸に対するモーメント
【００４２】
そして、上記のモーメント量を用いて重心座標（ｐ，ｑ）は、次式で計算できる。
ｐ＝Ｍ（１，０）／Ｍ（０，０）
ｑ＝Ｍ（０，１）／Ｍ（０，０）
【００４３】
中央処理装置７００は、検出された結晶の重心位置を算出した後、再び図６に示すメインルーチンに戻り、蛍光像に基づき検出された蛋白質の位置と、可視光像に基づき検出された結晶の位置を重ね合わせて、蛋白質結晶Ｓを認識する。そして、該蛋白質結晶Ｓに対し図７のステップＳ１３で得られた重心位置を記憶する（ステップＳ５）。以上により、試料容器１０内に存在する蛋白質結晶Ｓの重心位置を自動的に検出することができる。
【００４４】
図９は蛋白質結晶と自家蛍光を発しない物質の結晶とが混在して含まれる試料溶液を観察したときの顕微鏡画像のスケッチであり、（ａ）は同試料溶液に可視光線を照射して得られた可視光像、（ｂ）は同試料溶液に紫外線を照射して得られた蛍光像である。
【００４５】
同図（ａ）に示すように、試料溶液に可視光線を照射したときは、蛋白質結晶の可視光像Ａとその他の結晶の可視光像Ｂが観察された。この画像では、いずれの可視光像が蛋白質結晶であるか判別がつかない。
しかし、同図（ｂ）に示すように、試料溶液に紫外線を照射したとき、蛋白質結晶の蛍光像Ｃのみが観察され、その他の結晶は検出されない。よって、可視構造Ａと蛍光像Ｃを重ね合わせることで、蛋白質結晶の位置を認識することができる。
【００４６】
図１０は蛋白質の凝集が含まれる試料溶液を観察したときの顕微鏡画像のスケッチであり、（ａ）は同試料溶液に紫外線を照射して得られた蛍光像、（ｂ）は同試料溶液に可視光線を照射して得られた可視光像である。
【００４７】
同図（ａ）に示すように、試料溶液に紫外線を照射したときは、蛋白質の凝集から発せられる蛍光像Ｄが観察された。この蛍光像Ｄでは、蛋白質の凝集か結晶かの判断はつかない。
しかし、同図（ｂ）に示すように、試料溶液に可視光線を照射したとき、蛋白質の凝集に特徴的な針状の外形をもつ可視光像Ｅが観察され、よって該観察対象が蛋白質の凝集であると判定することができる。
【００４８】
このように、試料溶液に紫外線を照射したとき得られる蛍光像と、試料溶液に可視光線を照射したとき得られる可視光像とを総合することで、蛋白質以外の結晶や蛋白質の凝集を除外して、蛋白質結晶の位置を認識することが可能となる。
【００４９】
〔Ｘ線測定ステージ〕
次に、Ｘ線測定ステージについて更に詳細に説明する。
図１１はＸ線測定ステージの構成を示す側面構成図、図１２はＸ線測定ステージにおける蛋白質結晶の測定原理を模式的に示す図である。
【００５０】
図１１に示すように、Ｘ線測定ステージ６００には、試料配置部６１０を基準として、その下方にＸ線照射ユニット６２０（Ｘ線照射手段）、上方にＸ線検出器６３０（Ｘ線検出手段）が配設されている。
試料配置部６１０には、既述したように試料台４０１上に載置された試料容器１０が、ＸＹＺテーブル４０２とスライダ４０３の移動をもって位置決め配置される。
【００５１】
Ｘ線照射ユニット６２０は、Ｘ線源６２１とＸ線光学系６２２を含んでいる。Ｘ線源６２１には、電子銃とターゲットを内蔵したラボ用のＸ線発生器が用いられる。この種のＸ線発生器は、放射光を発生させる大規模Ｘ線発生設備と異なり、寸法および重量が格段に小さい。そのため、後述するように回転アーム６４０に搭載して回転駆動することが可能である。
【００５２】
Ｘ線光学系６２２は、Ｘ線源６２１から取り出されたＸ線のうち、特定波長のＸ線のみを選別したり（単色化）、試料配置部６１０へＸ線を収束する等の機能を有し、コンフォーカルミラーやコリメータ等の光学機器の組合せをもって構成されている。
【００５３】
Ｘ線検出器６３０には、二次元Ｘ線検出器が用いられる。特に、本実施形態では、Ｘ線検出器６３０としてＣＣＤを用いており、平面上に検出される回折Ｘ線の強度を電気信号に変換して、中央処理装置７００へ出力するように構成されている。
【００５４】
上述したＸ線照射ユニット６２０およびＸ線検出器６３０は、回転アーム６４０にそれぞれ搭載されている。なお、回転アーム６４０の形状は任意であり、例えば、板状であっても棒状であってもよい。この回転アーム６４０の一端部にＸ線照射ユニット６２０が搭載され、他端部にＸ線検出器６３０が対向するように搭載されている。
【００５５】
回転アーム６４０の中心部は、回転駆動機構６４１の回転軸６４１ａに装着されており、回転駆動機構６４１により回転軸６４１ａ中心に任意の角度回転可能となっている。回転駆動機構６４１の回転軸６４１ａの中心線Ｏは、ほぼ水平に配置してあり、Ｘ線照射ユニット６２０から放射されるＸ線の光軸は、この回転軸６４１ａの中心線Ｏと交わるように調整されている。この回転駆動機構６４１は、例えば、ステッピングモータ等の高精度に回転角度を制御可能な駆動モータとその回転を回転軸６４１ａに伝達する歯車機構で構成されており、駆動モータは中央処理装置７００によって回転角度が制御されている。回転角度は、正逆両方向へ４５°程度の範囲で任意に制御できるようにすることが好ましい。
【００５６】
本実施形態では、回転アーム６４０に搭載されたＸ線照射ユニット６２０を試料配置部６１０の下方に配置するとともに、Ｘ線検出器６３０を試料配置部６１０の上方に配置してあり、試料配置部６１０上の試料容器１０内に生成された蛋白質結晶Ｓに対して下方からＸ線を照射し、蛋白質結晶Ｓで反射してきた回折Ｘ線を、試料容器１０の上方でＸ線検出器６３０により検出する構成となっている。なお、Ｘ線照射ユニット６２０とＸ線検出器６３０の配置を上下逆転して、Ｘ線照射ユニット６２０を試料配置部６１０の上方に配置するとともに、Ｘ線検出器６３０をその下方に配置することもできる。
【００５７】
また、Ｘ線検出器６３０には、検出位置調整機構６５０が付設されている。この検出位置調整機構６５０は、Ｘ線検出器６３０を回転半径方向（図示ａ方向）に移動させるとともに、試料配置部６１０に配置される試料容器１０と平行な一方向（図示ｂ方向）に移動させる機構である。図１１に示す構成例では、検出位置調整機構６５０を、回転アーム６４０に設置された第１の案内レール６５１と、この第１の案内レール６５１に沿って移動可能な第１の移動台６５２と、この移動台６５２から図示ｂ方向に延出する第２の案内レール６５３と、この第２の案内レール６５３に沿って移動可能な第２の移動台（図示せず）と、これら各移動台を駆動する駆動モータ（図示せず）とで構成してあり、第２の移動台にＸ線検出器６３０が固定されている。
【００５８】
次に、Ｘ線測定ステージ６００における蛋白質結晶の測定方法を説明する。
ＸＹＺテーブル４０２およびスライダ４０３の移動により試料配置部６１０に試料容器１０内の蛋白質結晶Ｓが自動的に位置決め配置される。
【００５９】
ここで、必要に応じて蛋白質結晶ＳとＸ線検出器６３０との間の距離を調整する。すなわち、蛋白質結晶ＳにＸ線検出器６３０を近づけるほど、蛋白質結晶Ｓから放射状に反射してくるＸ線の回折斑点を広い角度範囲で検出することができる。しかし、蛋白質結晶Ｓの逆格子密度が高い場合、蛋白質結晶ＳにＸ線検出器６３０を近づけると、蛋白質結晶Ｓから放射状に反射してくるＸ線の回折斑点が重なり合って検出されてしまうおそれがある。そこで、検出位置調整機構６５０をもってＸ線検出器６３０を図１１のａ方向に移動調整することで、蛋白質結晶ＳとＸ線検出器６３０との間の距離を適宜調整し好適な検出データを得ることが可能となる。
【００６０】
さらに、検出位置調整機構６５０をもってＸ線検出器６３０を図１１のｂ方向に移動調整することで、蛋白質結晶Ｓから放射状に反射してくる回折Ｘ線の検出範囲を変更することもできる。
【００６１】
次いで、Ｘ線照射ユニット６２０からＸ線を放射してＸ線回折測定を実行する。図１２に示すように、Ｘ線照射ユニット６２０から放射されたＸ線は、試料容器１０内の蛋白質結晶Ｓに下方から入射する。そして、蛋白質結晶Ｓからは放射状にＸ線が回折して、この回折Ｘ線がＸ線検出器６３０で検出される。中央処理装置７００は、検出された回折Ｘ線の強度データに基づき結晶評価や結晶構造解析を実行する。
【００６２】
また、蛋白質結晶Ｓに対して様々な角度からＸ線を照射して回折Ｘ線の強度を検出する場合には、回転駆動機構６４１により回転アーム６４０を回転駆動して、蛋白質結晶Ｓの格子面に対するＸ線照射ユニット６２０およびＸ線検出器６３０の角度を調整し、上記Ｘ線回折測定を繰り返す。この操作をもって、試料容器１０を回転させることなく、蛋白質結晶Ｓに対する回折Ｘ線の積分強度を求めることができ、さらに、積分強度に基づき高い信頼性をもった結晶構造解析を実現することができる。
【００６３】
なお、上記実施形態および実施例では蛋白質結晶を検出対象として説明してきたが、本発明方法の対象はこれに限定されるものではなく、紫外線を照射したとき蛍光を発する特性を有した各種の特定高分子結晶を検出対象とすることができる。
【００６４】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、試料検出ステージで試料容器内の特定高分子結晶を検出し、そこで得られた情報に基づき搬送手段を制御することで、特定高分子結晶をＸ線測定ステージの試料配置部へ位置決めするようにしたので、特定高分子結晶の検出から試料配置部への位置決めまでの作業を自動化することができ、評価処理の迅速化を図ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施形態に係る特定高分子結晶評価装置の全体構成を示す平面模式図である。
【図２】同じく正面模式図である。
【図３】試料容器の構成例を示す図である。
【図４】試料台の構成を示す図で、（ａ）は平面図、（ｂ）は正面断面図である。
【図５】試料検出ステージの概要を示す模式図である。
【図６】中央処理装置により実行される蛋白質結晶の検出方法を示すフローチャートである。
【図７】図６のステップＳ４にかかるサブルーチンを示すフローチャートである。
【図８】図７に示すステップＳ１１のエッジ検出処理を説明するための図である。
【図９】蛋白質結晶と自家蛍光を発しない物質の結晶とが混在して含まれる試料溶液を観察したときの顕微鏡画像のスケッチである。
【図１０】蛋白質の凝集が含まれる試料溶液を観察したときの顕微鏡画像のスケッチである。
【図１１】Ｘ線測定ステージの構成を示す側面構成図である。
【図１２】Ｘ線測定ステージにおける蛋白質結晶の測定原理を模式的に示す図である。
【符号の説明】
Ｓ：蛋白質結晶
１０：試料容器
１１：凹部
１２：カバープレート
１００：試料容器収納部
２００：供給ロボット
２０１：ロボットアーム
２０２：開閉チャック
３００：試料容器識別部
３１０：容器持ち換え部
４００：搬送ユニット
４０１：試料台
４０１ａ：透孔
４０２：ＸＹＺテーブル
４０３：スライダ
４０４：位置合わせブロック
４０５：アクチュエータ
５００：試料検出ステージ
５１０：試料検出部
５２０：可視光照射ユニット
５２１：紫外線照射ユニット
５３０：顕微鏡
５４０：２次元撮像ユニット
６００：Ｘ線測定ステージ
６１０：試料配置部
６２０：Ｘ線照射ユニット
６２１：Ｘ線源
６２２：Ｘ線光学系
６３０：Ｘ線検出器
６４０：回転アーム
６４１：回転駆動機構
６４１ａ：回転軸
６５０：検出位置調整機構
６５１：第１の案内レール
６５２：第１の移動台
６５３：第２の案内レール
７００：中央処理装置
【発明の属する技術分野】
この発明は、特定高分子結晶をＸ線の回折現象を利用して評価するための特定高分子結晶の評価装置に関し、特に蛋白質結晶等の生体高分子結晶の評価に好適な装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡの二重らせん構造が発見されて以来、ゲノム計画の展開と相まって、蛋白質結晶の構造解析が世界的に注目を集めている。蛋白質結晶の構造解析には、ＮＭＲ（核磁気共鳴装置）を用いた手法、電子顕微鏡を用いた手法、Ｘ線の回折現象を利用した手法等が開発されており、特に、Ｘ線の回折現象を利用したＸ線結晶構造解析は、イメージングプレート等の二次元Ｘ線検出器や二次元データからの解析ソフトウエア等の開発に伴い飛躍的な進展をみせている。
【０００３】
従来、Ｘ線の回折現象を利用した蛋白質結晶の構造解析は、まず溶液中で蛋白質を結晶化させて得られた蛋白質の結晶粒をキャピラリーと称するガラス製の細管に注入し、この状態でＸ線回折装置に装填して行われていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
さて、蛋白質結晶のＸ線構造解析を行うためには、Ｘ線照射位置にターゲットである蛋白質結晶を正確に位置決めする作業が必要となる。このため、従来は、蛋白質結晶を検出するための顕微鏡をＸ線回折装置に付設しておき、該顕微鏡を利用して作業者が目視観察により人手をもって蛋白質結晶の位置決め操作を行っていた。このような目視観察と手作業による位置決め操作は煩雑で時間がかかる。しかも、従来は一回の測定が終了する都度、Ｘ線回折装置での位置決め操作を行っており、多くの蛋白質結晶を迅速に評価することができなかった。
【０００５】
例えば、人体を構成する蛋白質は５万〜１０万種類にも及ぶとされており、それら多くの蛋白質結晶の構造を短期間で解明することが、近年の構造生物学における緊急の課題となっている。
【０００６】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたもので、Ｘ線の回折現象を利用した特定高分子結晶の構造解析を自動化して、処理の迅速化を図ることを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明は、Ｘ線、紫外線および可視光線を透過する試料容器を用い、該試料容器内に存在する特定高分子結晶を評価する装置であって、
試料容器内の特定高分子結晶を検出するための試料検出ステージと、
試料検出ステージとは離間した位置にあって、特定高分子結晶のＸ線回折測定を行うＸ線測定ステージと、
試料検出ステージからＸ線測定ステージへ試料容器を搬送する搬送手段と、
試料検出ステージで得られた情報に基づき、特定高分子結晶の位置を認識するとともに、該位置情報に基づき搬送手段を制御して該特定高分子結晶をＸ線測定ステージの試料配置部へ位置決めする制御手段と、を備えたことを特徴とする（請求項１）。
【０００８】
このように、試料検出ステージで試料容器内の特定高分子結晶を検出し、そこで得られた情報に基づき搬送手段を制御することで、特定高分子結晶をＸ線測定ステージの試料配置部へ位置決めするようにしたので、特定高分子結晶の検出から試料配置部への位置決めまでの作業を自動化することができ、評価処理の迅速化を図ることが可能となる。
【０００９】
特に、蛋白質結晶の評価に際しては、蛋白質結晶を生成するための多数の凹部が形成された結晶化プレートを試料容器として用い、該結晶化プレートの各凹部で蛋白質結晶を生成させ、それら各蛋白質結晶を試料検出ステージで検出しておき、その後、該結晶化プレートをＸ線測定ステージへ搬送させて、逐次、各凹部内の蛋白質結晶を試料配置部へ位置決めしてＸ線回折測定を実施していけば、多数の蛋白質結晶を連続的に評価することができ、作業時間の大幅な短縮を図ることができる。
【００１０】
ここで、試料検出ステージは、試料容器に紫外線を照射し、該試料容器内の試料が発する蛍光像を検出する特定高分子検出手段と、試料容器内に存在する試料の可視光像から該試料の外形を検出する結晶検出手段と、を備えた構成とすることができる（請求項２）。
また、制御手段は、特定高分子検出手段により蛍光像が検出され、かつ結晶検出手段により結晶を示す外形が検出された試料を特定高分子結晶と判定するとともに、該特定高分子結晶の位置を認識する構成とすることができる（請求項２）。
【００１１】
高分子結晶、特に生体高分子の多くは、紫外線を照射したとき蛍光を発する。本明細書では、このように紫外線を照射したとき蛍光を発する特性を有した高分子結晶を「特定高分子結晶」と称する。例えば、蛋白質結晶がこの特定高分子結晶に該当する。
【００１２】
本発明は、かかる特定高分子結晶の特性に着目して、試料容器に紫外線を照射し、該試料容器内の試料が発する蛍光像を検出することにより試料容器内の特定高分子を検出するようにしている。
しかし、検出された特定高分子が、結晶を形成するものか否かは、蛍光像だけでは判別できない場合がある。例えば、特定高分子の凝集が試料容器内に存在した場合、かかる凝集も蛍光を発するため、結晶の蛍光像と凝集の蛍光像とが混在して検出されてしまう。
そこで、本発明は、試料容器内に存在する試料の可視光像から該試料の外形を検出することで、その外形から結晶とそれ以外のものとを区別し、上記蛍光像の検出結果と相俟って「特定高分子」の「結晶」を判定するとともに、該特定高分子結晶の位置を認識する構成とした。
【００１３】
また、Ｘ線測定ステージは、試料配置部に配置された試料容器内の特定高分子結晶に対し、上方又は下方からＸ線を照射するＸ線照射手段と、
試料容器を介してＸ線照射手段と対向配置され、試料容器を透過してきた特定高分子結晶からの回折Ｘ線を検出するＸ線検出手段と、
Ｘ線照射手段およびＸ線検出手段を支持する回転アームと、
回転アームをほぼ水平な軸中心に任意の角度回転させる回転駆動機構と、を備えた構成とすることができる（請求項３）。
【００１４】
この構成によれば、試料容器を回転させることなく、特定高分子結晶に対する回折Ｘ線の積分強度を求めることができる。回折Ｘ線の積分強度は、結晶に対するＸ線の照射角度を変えて、様々な角度からＸ線を照射したときの回折Ｘ線強度を検出し、それらの強度データを積分して求められる。従来は、結晶試料を封入したキャピラリーを回転させることで、回折Ｘ線の積分強度が求められていた。
【００１５】
蛋白質結晶等の特定高分子結晶の構造を解析するには、結晶で回折してきたＸ線の積分強度を求める必要がある。すなわち、回折を生じる可能性のある結晶からの反射Ｘ線は、逆格子空間（回折空間）において球状に分布している。したがって、結晶に対し固定された位置で検出される回折Ｘ線のピーク強度（回折斑点）は、この球状に分布する反射Ｘ線の一断面のみを観察して得られたものであり、結晶の構造解析（すなわち、分子構造の決定）に必要なピーク強度のわずか数百分の一乃至数千分の一に過ぎない。
【００１６】
本発明によれば、試料ホルダに対しＸ線照射手段及びＸ線検出手段を回転させることにより、球状に分布する結晶からの反射Ｘ線に対して複数の断面からピーク強度（回折斑点）を検出して、その積分強度を求めることができる。その結果、検出された回折Ｘ線の積分強度に基づいて、高い信頼性をもった結晶構造の解析・評価を実現することができる。
特に、結晶化プレートを試料容器として利用した場合、結晶化プレートの凹部には溶液が充填されており、蛋白質結晶等の特定高分子結晶はこの溶液中に浮遊した状態で存在する。したがって、結晶化プレートを回転させると溶液が零れ出たり、溶液中の結晶が移動したりするため、これを回転させることはできないが、本発明装置によれば上記のとおり結晶化プレートを回転させることなく回折Ｘ線の積分強度を求めることができる。
【００１７】
また、搬送手段は、試料容器を載置する試料台と、試料台を搭載するとともに該試料台を水平面上で直交するＸ、Ｙ方向および高さ方向に移動させるＸＹＺテーブルと、このＸＹＺテーブルを試料検出ステージからＸ線測定ステージへ搬送するスライダと、を含む構成とすることができる（請求項４）。
これらＸＹＺテーブルとスライダの駆動制御をもって、試料容器内に存在する特定高分子結晶を、Ｘ線測定ステージに設けた試料配置部へ自動的に位置決めすることが可能となり、作業性が格段に向上する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、蛋白質結晶を評価対象（特定高分子結晶）とした、本発明の実施の形態について図面を参照して詳細に説明する。
【００１９】
〔装置の全体構成〕
図１は本実施形態に係る特定高分子結晶評価装置の全体構成を示す平面模式図、図２は同じく正面模式図である。
図１に示すように、特定高分子結晶評価装置は、試料容器収納部１００、供給ロボット２００、試料容器識別部３００、搬送ユニット４００（搬送手段）、試料検出ステージ５００、Ｘ線測定ステージ６００、および中央処理装置７００（制御手段）を備えている。
【００２０】
試料容器収納部１００は、複数の試料容器１０を並べて収納できる仕切棚によって形成されており、該試料容器収納部１００に蛋白質結晶を収容する試料容器１０が並べて載置されている。
試料容器１０は、紫外線、可視光線およびＸ線を透過するポリイミド等の材料で形成された結晶化プレートを用いることが好ましい。結晶化プレートを利用した試料容器１０には、図３（ａ）に示すように、多数の凹部１１が形成されており、この凹部１１内で蛋白質の結晶Ｓを生成することができる。結晶化プレートを用いた蛋白質の結晶生成方法は、蒸気拡散法をはじめとして種々の方法が知られている。図３（ｂ）は、蒸気拡散法により蛋白質結晶Ｓが生成された状態を模式的に示す図であり、カバープレート１２の下面においた試料溶液Ｌの滴中に蛋白質結晶Ｓが生成されている。試料容器１０に形成された多数の凹部１１には、それぞれ生成条件を違えたり、異なる種類の蛋白質結晶Ｓを別個に生成することができる。
【００２１】
供給ロボット２００は、軸方向に伸縮自在で、高さ方向に移動自在、かつ水平面上を旋回可能なロボットアーム２０１を備えており、このロボットアーム２０１の先端に開閉チャック２０２が設けられている。試料容器収納部１００に収納されている試料容器１０は、開閉チャック２０２により把持されて同収納部１００から引き出され、まず試料容器識別部３００に移送される。
【００２２】
試料容器識別部３００には、あらかじめ試料容器１０に付された識別情報を読み取る情報読取装置が設置されており、該情報読取装置が識別情報を読み取ることのできる位置（情報読取位置）に試料容器１０が配置される。ここで、識別情報としてバーコードを用いた場合は、バーコードリーダにより情報読取装置が構成される。
なお、本実施形態では、試料容器収納部１００から引き出した試料容器１０を、開閉チャック２０２で確実に把持して移送する目的から、試料容器収納部１００の近傍位置に容器持ち換え部３１０が設けてある。試料容器収納部１００から引き出され試料容器１０は、いったんこの容器持ち換え部３１０に置かれ、再び開閉チャック２０２が正確に把持して試料容器識別部３００へ移送される。
【００２３】
搬送ユニット４００は、試料容器１０を載置する試料台４０１と、この試料台４０１を搭載するＸＹＺテーブル４０２と、このＸＹＺテーブル４０２を試料台４０１と一体に搬送するスライダ４０３とで構成されている。
試料台４０１には、図４に示すように、上面に位置合わせブロック４０４と押圧用のアクチュエータ４０５が設けてあり、上面に載置された試料容器１０の角部をアクチュエータ４０５により押圧して、対角線上にある角部を位置合わせブロック４０４に当接させることにより、試料容器１０を常に試料台４０１の一定位置に載置するようになっている。
【００２４】
また、試料台４０１には、試料容器１０が載置される部位に透孔４０１ａが穿設してある。この透孔４０１ａは、後述する試料検出ステージ５００で試料容器１０に照射される紫外線と可視光線、およびＸ線測定ステージ６００で試料容器１０内の蛋白質結晶Ｓに照射されるＸ線を透過するためのものである。
【００２５】
ＸＹＺテーブル４０２は、試料台４０１を水平面上で直交するＸ方向およびＹ方向に移動させるとともに試料台４０１を高さ方向（Ｚ方向）に移動させる機構である。このＸＹＺテーブル４０２は、スライダ４０３に搭載されている。
【００２６】
スライダ４０３は、試料検出ステージ５００とＸ線測定ステージ６００とを結ぶ搬送経路を形成しており、ＸＹＺテーブル４０２に搭載された試料台４０１を、試料検出ステージ５００とＸ線測定ステージ６００との間で直線的に搬送する機能を有している。
【００２７】
試料検出ステージ５００は、試料容器１０内の蛋白質結晶Ｓを検出し、その重心位置を認識するためのステージである。また、Ｘ線測定ステージ６００は、試料検出ステージ５００で検出された試料容器１０内の蛋白質結晶ＳをＸ線回折測定するためのステージである。これら各ステージについては、追って詳細に説明する。
【００２８】
中央処理装置７００は汎用コンピュータで構成され、上述した装置各部の駆動制御を実行する。また、中央処理装置７００は、試料検出ステージ５００における蛋白質結晶Ｓの判別と重心位置の認識を実行するとともに、Ｘ線測定ステージ６００におけるＸ線測定処理を実行する。特に、この中央処理装置７００は、試料検出ステージ５００で得られた情報により認識した蛋白質結晶Ｓの位置情報（重心位置の情報）に基づき、ＸＹＺテーブル４０２とスライダ４０３を制御して、該蛋白質結晶ＳをＸ線測定ステージ６００の試料配置部６１０へ位置決めする機能を有している。
【００２９】
ここで、スライダ４０３は、始動時から一定期間は徐々に加速していき、その後、一定の速度でスライダ４０３を駆動し、次いで徐々に減速して試料配置部６１０に停止させるように駆動制御される。これにより慣性力を抑え試料台４０１に載置された試料容器１０内での蛋白質結晶Ｓの移動を防止できる。
【００３０】
〔試料検出ステージ〕
次に、試料検出ステージ５００について更に詳細に説明する。
図５は試料検出ステージの概要を示す模式図である。
試料検出ステージ５００には、試料容器１０が配置される試料検出部５１０を基準として、その下方に可視光照射ユニット５２０および紫外線照射ユニット５２１が設置してある。これら可視光照射ユニット５２０および紫外線照射ユニット５２１は、試料検出部５１０に配置された試料容器１０に対し、可視光又は紫外線を照射する光源である。
可視光照射ユニット５２０および紫外線照射ユニット５２１は、横方向にスライドしていずれか一方のユニットが試料容器１０と対向配置される。なお、試料容器１０と可視光照射ユニット５２０および紫外線照射ユニット５２１の中間に反射ミラーを配置して、可視光照射ユニット５２０から発射される可視光線または紫外線照射ユニット５２１から発射される紫外線を試料容器１０に導く構成とすれば、これら各照射ユニット５２０，５２１は、試料容器１０と対向配置する必要はない。
【００３１】
試料容器１０は、既述したように試料台４０１に載置されており、ＸＹＺテーブル４０２とスライダ４０３の移動により、試料検出部５１０に配置される。
試料検出部５１０の上方には、顕微鏡５３０と２次元撮像ユニット５４０が配設されている。顕微鏡５３０は、紫外線又は可視光の照射により試料容器１０を透して得られる画像を拡大して２次元撮像ユニット５４０へ導く。なお、顕微鏡５３０は上下方向に焦点位置を変更して、試料容器１０内の蛋白質結晶Ｓを探索することができるように構成されている。
【００３２】
２次元撮像ユニット５４０としては、例えば、ＣＣＤを用いることができる。２次元撮像ユニット５４０は、顕微鏡５３０を介して入射した拡大画像を電気信号（画像データ）に変換し、中央処理装置７００へ出力する。中央処理装置７００は、２次元撮像ユニット５４０から入力された画像データを処理して、試料容器１０内の蛋白質結晶Ｓを検出するとともに、その位置を認識する。
【００３３】
図６および図７は中央処理装置により実行される蛋白質結晶の検出方法を示すフローチャートである。
まず、光源を紫外線照射ユニット５２１に設定し、該紫外線照射ユニット５２１から発射される紫外線を試料容器１０に照射する。
【００３４】
このとき、試料容器１０を透して得られる画像は、顕微鏡５３０により拡大されて２次元撮像ユニット５４０へ入射する。中央処理装置７００は、２次元撮像ユニット５４０から送られてくる画像データを入力し（ステップＳ１）、該画像データから蛍光像を検出する（ステップＳ２）。すなわち、試料溶液Ｌ中に生成された蛋白質結晶Ｓは、紫外線が照射されたとき蛍光を発するため、その蛍光像が２次元撮像ユニット５４０に入射する。そこで、中央処理装置７００は、２次元撮像ユニット５４０から入力した画像データを分析して蛍光像を検出し、蛍光像すなわち蛋白質の位置を把握する。
なお、ここで把握される蛋白質の位置は、水平面（ｘｙ座標）上の位置であり、高さ方向（ｚ座標）の位置は、顕微鏡５３０の焦点位置により把握される。
【００３５】
次いで、光源を紫外線照射ユニット５２１から可視光照射ユニット５２０に切り替え、該可視光照射ユニット５２０から発射される可視光線を試料容器１０に照射する。このとき、試料容器１０を透して得られる可視光像は、顕微鏡５３０により拡大されて２次元撮像ユニット５４０へ入射する。中央処理装置７００は、２次元撮像ユニット５４０から送られてくる画像データを入力し（ステップＳ３）、該画像データを処理して試料溶液Ｌ中の結晶を検出するとともに、その重心位置を認識する（ステップＳ４）。
【００３６】
このステップＳ４（結晶検出ステップ）は、図７に示すサブルーチンに沿って処理される。すなわち、２次元撮像ユニット５４０から入力した画像データを、所定のしきい値を基準に２値化処理して、ｘｙ座標上の各画素を「１」「０」の２値データに変換する（ステップＳ１０）。
【００３７】
次いで、２値化処理された画像データから、試料溶液Ｌ中に存在する試料のエッジに該当する画素を検出する（ステップＳ１１）。ここでは、例えば、図８に示すように判別対象である注目画素が黒（データ「１」）であるか否かを判別し、黒であったときは、その周囲の画素（画素１〜８）について、同様に黒（データ「１」）か白（データ「０」）かを判別していく。
【００３８】
そして、周囲の画素（画素１〜８）がすべて白（データ「０」）であったときは、注目画素が孤立点であると結論付ける。また、周囲の画素（画素１〜８）がすべて黒（データ「１」）であったときは、注目画素が画像の内部点であると結論付ける。このようにして、孤立点と内部点に相当する画素はすべて除外し、周囲の画素（画素１〜８）の一部が白（データ「０」）である注目画素を試料のエッジと認識し、そのｘｙ座標を記憶する。
上述した処理を、ｘｙ座標系のすべての画素について実行し、試料のエッジに該当する画素をすべて抽出する。
【００３９】
続いて、抽出した試料のエッジに該当する画素に着目し、隣接する画素を連結していき、試料の輪郭線を検出する（ステップＳ１２）。この輪郭線の始点と終点が一致すれば、該輪郭線は閉じた輪郭線と判定される。そして、閉じた輪郭線をもつ試料が、一定の面積を有する結晶と判別される。一方、輪郭線が閉じていない試料は、凝集など結晶化されていないものとして除外される。
【００４０】
次に、閉じた輪郭線をもつ試料（すなわち結晶）の内部領域を認識し、該内部領域の重心位置を、公知の演算法を用いて算出する（ステップＳ１３）。
平面画像の重心位置を求める手法としては、例えば、結晶として認識された連結図形Ｓのモーメント量を求め、このモーメント量から計算することができる。すなわち、連結図形Ｓの各画素の重みを均等に１とした場合、モーメントＭ（ｍ，ｎ）は次式（数１）で定義される。
【００４１】
【数１】
Ｍ（１，０）は、ｘ軸に対するモーメント
Ｍ（０，１）は、ｙ軸に対するモーメント
【００４２】
そして、上記のモーメント量を用いて重心座標（ｐ，ｑ）は、次式で計算できる。
ｐ＝Ｍ（１，０）／Ｍ（０，０）
ｑ＝Ｍ（０，１）／Ｍ（０，０）
【００４３】
中央処理装置７００は、検出された結晶の重心位置を算出した後、再び図６に示すメインルーチンに戻り、蛍光像に基づき検出された蛋白質の位置と、可視光像に基づき検出された結晶の位置を重ね合わせて、蛋白質結晶Ｓを認識する。そして、該蛋白質結晶Ｓに対し図７のステップＳ１３で得られた重心位置を記憶する（ステップＳ５）。以上により、試料容器１０内に存在する蛋白質結晶Ｓの重心位置を自動的に検出することができる。
【００４４】
図９は蛋白質結晶と自家蛍光を発しない物質の結晶とが混在して含まれる試料溶液を観察したときの顕微鏡画像のスケッチであり、（ａ）は同試料溶液に可視光線を照射して得られた可視光像、（ｂ）は同試料溶液に紫外線を照射して得られた蛍光像である。
【００４５】
同図（ａ）に示すように、試料溶液に可視光線を照射したときは、蛋白質結晶の可視光像Ａとその他の結晶の可視光像Ｂが観察された。この画像では、いずれの可視光像が蛋白質結晶であるか判別がつかない。
しかし、同図（ｂ）に示すように、試料溶液に紫外線を照射したとき、蛋白質結晶の蛍光像Ｃのみが観察され、その他の結晶は検出されない。よって、可視構造Ａと蛍光像Ｃを重ね合わせることで、蛋白質結晶の位置を認識することができる。
【００４６】
図１０は蛋白質の凝集が含まれる試料溶液を観察したときの顕微鏡画像のスケッチであり、（ａ）は同試料溶液に紫外線を照射して得られた蛍光像、（ｂ）は同試料溶液に可視光線を照射して得られた可視光像である。
【００４７】
同図（ａ）に示すように、試料溶液に紫外線を照射したときは、蛋白質の凝集から発せられる蛍光像Ｄが観察された。この蛍光像Ｄでは、蛋白質の凝集か結晶かの判断はつかない。
しかし、同図（ｂ）に示すように、試料溶液に可視光線を照射したとき、蛋白質の凝集に特徴的な針状の外形をもつ可視光像Ｅが観察され、よって該観察対象が蛋白質の凝集であると判定することができる。
【００４８】
このように、試料溶液に紫外線を照射したとき得られる蛍光像と、試料溶液に可視光線を照射したとき得られる可視光像とを総合することで、蛋白質以外の結晶や蛋白質の凝集を除外して、蛋白質結晶の位置を認識することが可能となる。
【００４９】
〔Ｘ線測定ステージ〕
次に、Ｘ線測定ステージについて更に詳細に説明する。
図１１はＸ線測定ステージの構成を示す側面構成図、図１２はＸ線測定ステージにおける蛋白質結晶の測定原理を模式的に示す図である。
【００５０】
図１１に示すように、Ｘ線測定ステージ６００には、試料配置部６１０を基準として、その下方にＸ線照射ユニット６２０（Ｘ線照射手段）、上方にＸ線検出器６３０（Ｘ線検出手段）が配設されている。
試料配置部６１０には、既述したように試料台４０１上に載置された試料容器１０が、ＸＹＺテーブル４０２とスライダ４０３の移動をもって位置決め配置される。
【００５１】
Ｘ線照射ユニット６２０は、Ｘ線源６２１とＸ線光学系６２２を含んでいる。Ｘ線源６２１には、電子銃とターゲットを内蔵したラボ用のＸ線発生器が用いられる。この種のＸ線発生器は、放射光を発生させる大規模Ｘ線発生設備と異なり、寸法および重量が格段に小さい。そのため、後述するように回転アーム６４０に搭載して回転駆動することが可能である。
【００５２】
Ｘ線光学系６２２は、Ｘ線源６２１から取り出されたＸ線のうち、特定波長のＸ線のみを選別したり（単色化）、試料配置部６１０へＸ線を収束する等の機能を有し、コンフォーカルミラーやコリメータ等の光学機器の組合せをもって構成されている。
【００５３】
Ｘ線検出器６３０には、二次元Ｘ線検出器が用いられる。特に、本実施形態では、Ｘ線検出器６３０としてＣＣＤを用いており、平面上に検出される回折Ｘ線の強度を電気信号に変換して、中央処理装置７００へ出力するように構成されている。
【００５４】
上述したＸ線照射ユニット６２０およびＸ線検出器６３０は、回転アーム６４０にそれぞれ搭載されている。なお、回転アーム６４０の形状は任意であり、例えば、板状であっても棒状であってもよい。この回転アーム６４０の一端部にＸ線照射ユニット６２０が搭載され、他端部にＸ線検出器６３０が対向するように搭載されている。
【００５５】
回転アーム６４０の中心部は、回転駆動機構６４１の回転軸６４１ａに装着されており、回転駆動機構６４１により回転軸６４１ａ中心に任意の角度回転可能となっている。回転駆動機構６４１の回転軸６４１ａの中心線Ｏは、ほぼ水平に配置してあり、Ｘ線照射ユニット６２０から放射されるＸ線の光軸は、この回転軸６４１ａの中心線Ｏと交わるように調整されている。この回転駆動機構６４１は、例えば、ステッピングモータ等の高精度に回転角度を制御可能な駆動モータとその回転を回転軸６４１ａに伝達する歯車機構で構成されており、駆動モータは中央処理装置７００によって回転角度が制御されている。回転角度は、正逆両方向へ４５°程度の範囲で任意に制御できるようにすることが好ましい。
【００５６】
本実施形態では、回転アーム６４０に搭載されたＸ線照射ユニット６２０を試料配置部６１０の下方に配置するとともに、Ｘ線検出器６３０を試料配置部６１０の上方に配置してあり、試料配置部６１０上の試料容器１０内に生成された蛋白質結晶Ｓに対して下方からＸ線を照射し、蛋白質結晶Ｓで反射してきた回折Ｘ線を、試料容器１０の上方でＸ線検出器６３０により検出する構成となっている。なお、Ｘ線照射ユニット６２０とＸ線検出器６３０の配置を上下逆転して、Ｘ線照射ユニット６２０を試料配置部６１０の上方に配置するとともに、Ｘ線検出器６３０をその下方に配置することもできる。
【００５７】
また、Ｘ線検出器６３０には、検出位置調整機構６５０が付設されている。この検出位置調整機構６５０は、Ｘ線検出器６３０を回転半径方向（図示ａ方向）に移動させるとともに、試料配置部６１０に配置される試料容器１０と平行な一方向（図示ｂ方向）に移動させる機構である。図１１に示す構成例では、検出位置調整機構６５０を、回転アーム６４０に設置された第１の案内レール６５１と、この第１の案内レール６５１に沿って移動可能な第１の移動台６５２と、この移動台６５２から図示ｂ方向に延出する第２の案内レール６５３と、この第２の案内レール６５３に沿って移動可能な第２の移動台（図示せず）と、これら各移動台を駆動する駆動モータ（図示せず）とで構成してあり、第２の移動台にＸ線検出器６３０が固定されている。
【００５８】
次に、Ｘ線測定ステージ６００における蛋白質結晶の測定方法を説明する。
ＸＹＺテーブル４０２およびスライダ４０３の移動により試料配置部６１０に試料容器１０内の蛋白質結晶Ｓが自動的に位置決め配置される。
【００５９】
ここで、必要に応じて蛋白質結晶ＳとＸ線検出器６３０との間の距離を調整する。すなわち、蛋白質結晶ＳにＸ線検出器６３０を近づけるほど、蛋白質結晶Ｓから放射状に反射してくるＸ線の回折斑点を広い角度範囲で検出することができる。しかし、蛋白質結晶Ｓの逆格子密度が高い場合、蛋白質結晶ＳにＸ線検出器６３０を近づけると、蛋白質結晶Ｓから放射状に反射してくるＸ線の回折斑点が重なり合って検出されてしまうおそれがある。そこで、検出位置調整機構６５０をもってＸ線検出器６３０を図１１のａ方向に移動調整することで、蛋白質結晶ＳとＸ線検出器６３０との間の距離を適宜調整し好適な検出データを得ることが可能となる。
【００６０】
さらに、検出位置調整機構６５０をもってＸ線検出器６３０を図１１のｂ方向に移動調整することで、蛋白質結晶Ｓから放射状に反射してくる回折Ｘ線の検出範囲を変更することもできる。
【００６１】
次いで、Ｘ線照射ユニット６２０からＸ線を放射してＸ線回折測定を実行する。図１２に示すように、Ｘ線照射ユニット６２０から放射されたＸ線は、試料容器１０内の蛋白質結晶Ｓに下方から入射する。そして、蛋白質結晶Ｓからは放射状にＸ線が回折して、この回折Ｘ線がＸ線検出器６３０で検出される。中央処理装置７００は、検出された回折Ｘ線の強度データに基づき結晶評価や結晶構造解析を実行する。
【００６２】
また、蛋白質結晶Ｓに対して様々な角度からＸ線を照射して回折Ｘ線の強度を検出する場合には、回転駆動機構６４１により回転アーム６４０を回転駆動して、蛋白質結晶Ｓの格子面に対するＸ線照射ユニット６２０およびＸ線検出器６３０の角度を調整し、上記Ｘ線回折測定を繰り返す。この操作をもって、試料容器１０を回転させることなく、蛋白質結晶Ｓに対する回折Ｘ線の積分強度を求めることができ、さらに、積分強度に基づき高い信頼性をもった結晶構造解析を実現することができる。
【００６３】
なお、上記実施形態および実施例では蛋白質結晶を検出対象として説明してきたが、本発明方法の対象はこれに限定されるものではなく、紫外線を照射したとき蛍光を発する特性を有した各種の特定高分子結晶を検出対象とすることができる。
【００６４】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、試料検出ステージで試料容器内の特定高分子結晶を検出し、そこで得られた情報に基づき搬送手段を制御することで、特定高分子結晶をＸ線測定ステージの試料配置部へ位置決めするようにしたので、特定高分子結晶の検出から試料配置部への位置決めまでの作業を自動化することができ、評価処理の迅速化を図ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施形態に係る特定高分子結晶評価装置の全体構成を示す平面模式図である。
【図２】同じく正面模式図である。
【図３】試料容器の構成例を示す図である。
【図４】試料台の構成を示す図で、（ａ）は平面図、（ｂ）は正面断面図である。
【図５】試料検出ステージの概要を示す模式図である。
【図６】中央処理装置により実行される蛋白質結晶の検出方法を示すフローチャートである。
【図７】図６のステップＳ４にかかるサブルーチンを示すフローチャートである。
【図８】図７に示すステップＳ１１のエッジ検出処理を説明するための図である。
【図９】蛋白質結晶と自家蛍光を発しない物質の結晶とが混在して含まれる試料溶液を観察したときの顕微鏡画像のスケッチである。
【図１０】蛋白質の凝集が含まれる試料溶液を観察したときの顕微鏡画像のスケッチである。
【図１１】Ｘ線測定ステージの構成を示す側面構成図である。
【図１２】Ｘ線測定ステージにおける蛋白質結晶の測定原理を模式的に示す図である。
【符号の説明】
Ｓ：蛋白質結晶
１０：試料容器
１１：凹部
１２：カバープレート
１００：試料容器収納部
２００：供給ロボット
２０１：ロボットアーム
２０２：開閉チャック
３００：試料容器識別部
３１０：容器持ち換え部
４００：搬送ユニット
４０１：試料台
４０１ａ：透孔
４０２：ＸＹＺテーブル
４０３：スライダ
４０４：位置合わせブロック
４０５：アクチュエータ
５００：試料検出ステージ
５１０：試料検出部
５２０：可視光照射ユニット
５２１：紫外線照射ユニット
５３０：顕微鏡
５４０：２次元撮像ユニット
６００：Ｘ線測定ステージ
６１０：試料配置部
６２０：Ｘ線照射ユニット
６２１：Ｘ線源
６２２：Ｘ線光学系
６３０：Ｘ線検出器
６４０：回転アーム
６４１：回転駆動機構
６４１ａ：回転軸
６５０：検出位置調整機構
６５１：第１の案内レール
６５２：第１の移動台
６５３：第２の案内レール
７００：中央処理装置
Claims (4)
- Ｘ線、紫外線および可視光線を透過する試料容器を用い、該試料容器内に存在する特定高分子結晶を評価する装置であって、
前記試料容器内の特定高分子結晶を検出するための試料検出ステージと、
前記試料検出ステージとは離間した位置にあって、前記特定高分子結晶のＸ線回折測定を行うＸ線測定ステージと、
前記試料検出ステージから前記Ｘ線測定ステージへ試料容器を搬送する搬送手段と、
前記試料検出ステージで得られた情報に基づき、特定高分子結晶の位置を認識するとともに、該位置情報に基づき前記搬送手段を制御して該特定高分子結晶を前記Ｘ線測定ステージの試料配置部へ位置決めする制御手段と、を備えたことを特徴とする特定高分子結晶の評価装置。 - 前記試料検出ステージは、前記試料容器に紫外線を照射し、該試料容器内の試料が発する蛍光像を検出する特定高分子検出手段と、
前記試料容器内に存在する試料の可視光像から該試料の外形を検出する結晶検出手段と、を備え、
前記制御手段は、前記特定高分子検出手段により蛍光像が検出され、かつ前記結晶検出手段により結晶を示す外形が検出された試料を特定高分子結晶と判定するとともに、該特定高分子結晶の位置を認識する構成であることを特徴とする請求項１に記載した特定高分子結晶の評価装置。 - 前記Ｘ線測定ステージは、試料配置部に配置された試料容器内の特定高分子結晶に対し、上方又は下方からＸ線を照射するＸ線照射手段と、
前記試料容器を介して前記Ｘ線照射手段と対向配置され、前記試料容器を透過してきた前記特定高分子結晶からの回折Ｘ線を検出するＸ線検出手段と、
前記Ｘ線照射手段およびＸ線検出手段を支持する回転アームと、
前記回転アームをほぼ水平な軸中心に任意の角度回転させる回転駆動機構と、を備えたことを特徴とする請求項１又は２に記載した特定高分子結晶の評価装置。 - 前記搬送手段は、試料容器を載置する試料台と、前記試料台を搭載するとともに該試料台を水平面上で直交するＸ、Ｙ方向および高さ方向に移動させるＸＹＺテーブルと、このＸＹＺテーブルを前記試料検出ステージから前記Ｘ線測定ステージへ搬送するスライダと、を含むことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載した特定高分子結晶の評価装置。
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