JP2005015483A - マイクロ波利用のペプチド合成 - Google Patents

Abstract

【課題】 ペプチドの固相合成を促進するための装置及び方法を開示する。
【解決手段】 本発明の方法は、固相樹脂に結合された保護第一アミノ酸をマイクロ波透過性容器において脱保護性溶液と混合しながら、該混合アミノ酸及び溶液にマイクロ波を照射することにより、該保護結合アミノ酸を脱保護する工程と、次いで第二アミノ酸及び活性化溶液を該同一容器に添加しながら、該容器にマイクロ波を照射することにより、該第二アミノ酸を活性化させる工程と、次いで該同一容器中の組成物にマイクロ波を照射しながら、該第二アミノ酸を該第一アミノ酸にカップリングさせる工程と、そして、結合されたペプチドを該同一容器において切断性組成物と混合しながら、該組成物にマイクロ波を照射することにより、該結合ペプチドを該固相樹脂から切断する工程とを含む。
【選択図】 なし

Description

発明の分野
本発明は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）に関するものであり、詳しくは、ＳＰＰＳのためのマイクロ波利用技術に関するものである。

発明の背景
２０世紀初めには、合成製造されたペプチドによって、化学構造と生物活性との関係に関する研究を大いに促進できるという科学研究における新しい概念が誕生した。それまでは、ペプチドとそれらの生物学的機能との間の構造活性関係に関する研究は、精製された天然のペプチドを用いて行われてきた。しかしながら、その初期のペプチド精製のための溶液ベースの技術では、例えば、生成物の収率が低い、不純物による汚染、手間がかかる、いくつかのペプチドの溶解性が予想できないというような問題に悩まされていた。２０世紀前半の間は、いくつかの溶液ベースの合成技術では、公知の技術をそれらの限界まで用いることによって、一定の「難しい」ペプチドを製造できた。より高い収率及び純度でペプチドを得たいという需要が増加することにより、まず最初に、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）と現在呼ばれている、１９６３年に示されたアミノ酸から直接ペプチドを合成するための画期的な技術が生まれた。

溶液ベースのペプチド合成に固有の欠点は、ペプチド合成のためにＳＰＰＳをほぼ限定的に使用することに起因していた。固相カップリングにより、試薬の分離がより容易になり、従来の化学（蒸発、再結晶など）による生成物の損失が排除され、更に、過剰の試薬を添加することにより反応を強制的に完了させることができる。

ペプチドとは、一方のアミノ酸のカルボキシル基と他方のアミノ酸のアミノ基とを結合させた２つ以上のアミノ酸からなる小さなタンパク質と定義される。したがって、基本的なレベルでは、どのようなタイプのペプチド合成であっても、複数のアミノ酸分子を、互いに又は存在するアミノ酸のペプチド鎖に添加する繰り返し工程を含む。

ペプチドの合成製造は、科学研究分野では、多くの理由から計り知れないほど貴重な手段である。例えば、インフルエンザ及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のために存在する抗ウイルスワクチンには、ペプチドをベースとするものがある。同様に、抗菌ペプチドをベースとするワクチン（ジフテリア毒素及びコレラ毒素）に関して行われた研究もある。合成により変質されたペプチドは、放射性同位体などのトレーサーで標識でき、また天然のペプチドの生物学的受容体（レセプターとして知られている）の量、場所及び作用メカニズムを解明するために用いることができる。次に、その情報を利用して、そのレセプターを介して作用するより良好な薬剤を設計することができる。また、ペプチドは、ペプチドをベースとする抗体などの抗原目的のために用いて、新しく発見された遺伝子のタンパク質を同定することもできる。最終的に、いくつかのペプチドは、疾患の原因物質であるかもしれない。例えば、β−アミロイドタンパク質の生物学的な処理の失敗によって、脳において神経線維の「もつれ」が生じて、神経斑が形成される。これらの斑の存在は、アルツハイマー病の病理学的特徴である。β−アミロイドの前駆体又は親分子の合成製造により、アルツハイマー病の研究が促進される。

これらは、もちろん、ペプチド合成を基礎的な科学的手段とする、多種多様な話題及び研究基礎のほんの一例である。
ＳＰＰＳの基本原則は、カップリング相が完成したら切断及び精製することができる固相粒子にリンカー分子を介して固定される成長ポリペプチド鎖に対して、アミノ酸を段階的に添加することである。簡単に言えば、固相樹脂支持体及び出発アミノ酸は、リンカー分子を介して互いに付着する。そのような樹脂−リンカー−酸マトリクスは商業的に入手可能である（例えば、ドイツのダルムシュタットのMerck KGaAの関係会社であるEMD Biosciencesの商標であるCalbiochem；又は、ドイツのハイデルベルクにあるORPEGEN Pharma）。出発アミノ酸は、そのアミノ末端において化学基によって保護され、また化学側鎖保護基を有していてもよい。保護基は、遊離アミノ酸の非保護カルボキシル基と成長ペプチド鎖の脱保護α−アミノとの間での新しいペプチド結合の形成中に、不所望な反応又は有害な反応がα−アミノ基において起こるのを防ぐ。続いて、最後までカップリング結合させるためのペプチド鎖において、一連の化学的工程によりアミノ酸が脱保護され、次のアミノ酸が準備される。換言すれば、アミノ酸を「保護」することにより、不所望な副反応又は競争反応が防止され、アミノ酸を「脱保護」することにより、その官能基（単数又は複数）は所望の反応のために利用可能となる。

アミノ酸の所望の配列が達成されたら、ペプチドは、リンカー分子において、固相支持体から切断される。この技術は、多くの繰返し工程からなり、可能であるときは必ず自動化を魅力あるものにする。

ＳＰＰＳの様々な工程には反応のタイプをはじめとする多くの選択が存在する。ＳＰＰＳは、連続フロー法又はバッチフロー法を用いて行うことができる。連続フローは、分光光度計によって、反応の進行度をリアルタイムにモニターできるので有用である。しかしながら、連続フローは、樹脂上のペプチドと接触する試薬が希釈されることと、固相樹脂の物理的な寸法の制約により規模が限定されることの２つの明確な欠点を有する。バッチフローは濾過反応器で起こり、反応体がアクセス可能で、手動又は自動的に添加できることから有用である。

α−アミノ末端を化学的に保護するための他の選択が存在する。第一は、「Ｂｏｃ」（Ｎα’−ｔ−ブトキシカルボニル）として知られている。Ｂｏｃ法のための試薬は比較的費用がかからないが、高度に腐食性で、高価な装置が必要となる。好ましい別法は、「Ｆｍｏｃ」（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）による保護スキームであり、これは腐食性は低いがより高価な試薬である。

ＳＰＰＳの場合、固体支持体相は、通常はポリスチレン懸濁液であり；最近では、ポリアミドのようなポリマー支持体も用いられている。固相支持体の調製としては、適切な溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド又はＤＭＦ）中に支持体を「溶媒和」させることが挙げられる。固相支持体は、溶媒和中に体積がかなり膨潤する傾向があり、それにより、ペプチド合成を実施するのに利用可能な表面積が増加する。これまでに説明したように、リンカー分子は、アミノ酸鎖を固相樹脂に接続させる。リンカー分子は、最後の切断により、カルボキシル末端において遊離酸又は遊離アミドを提供するように設計される。リンカーは、樹脂に特異的ではなく、４−ヒドロキシメチルフェノキシアセチル−４’−メチルベンジヒドリルアミン（ＨＭＰ）のようなペプチド酸、又はベンズヒドリルアミン誘導体のようなペプチドアミドが挙げられる。

適切な溶媒によって固相支持体を調製したら、次の工程では、ペプチド鎖にくっつけるアミノ酸を脱保護する。脱保護は、一時的な保護基については緩塩基処理（例えば、ピクロジン又はピペリジン）によって実施され、永久的な側鎖保護基は、緩酸分解（例として、トリフルオロ酢酸又はＴＦＡ）によって除去される。

脱保護についで、アミノ酸鎖の伸長又はカップリングは、ペプチド結合の形成によって特徴付けられる。この方法では、Ｃ−α−カルボキシル基の活性化が必要であり、その活性化は、５つの異なる技術のうち１つを用いて達成できる。これらは、順番は関係ないが、in situ 試薬、予め形成された対称無水物、活性エステル、酸ハロゲン化物及びウレタン保護Ｎ−カルボキシ無水物である。in situ 法は、同時に活性化させカップリングさせることが可能であり；最も一般的なタイプのカップリング試薬は、カルボジイミド誘導体、例えばＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミドである。

所望の配列が合成されたら、ペプチドは樹脂から切断される。この方法は、ペプチドのアミノ酸組成物と側鎖保護基との感受性に依存する。しかし、一般的には、切断は保護基及びリンカーから生ずる反応性カルボニウムイオンを消失させるための掃去剤を複数含有する環境において実施される。１つの一般的な切断剤はＴＦＡである。

端的に言えば、ＳＰＰＳでは、各々のアミノ酸を付加するための脱保護、活性化及びカップリングの繰返し工程を必要とし、続いて、最終ペプチドを元の固体支持体から分離するための最終切断工程を必要とする。

現在のＳＰＰＳ技術に関しては２つの明確な欠点が存在する。第一は、所与のペプチドを合成するのに必要な時間の長さである。脱保護工程は３０分以上かかることがある。上記のように各々のアミノ酸をアミノ酸鎖にカップリングさせるには、約４５分必要であり、各々のアミノ酸の活性化工程は１５〜２０分必要とし、切断工程では２〜４時間必要とする。したがって、単に１２個のアミノ酸からなるペプチドを合成するのに最大１４時間かかることがある。この問題を解決するために、ペプチド合成及びカップリングの代替的な方法をマイクロ波技術を用いて試みた。マイクロ波による加熱は、マイクロ波は組成物又は溶媒と即座に直接相互作用する傾向があることから、有機合成を含む多様な化学反応において有利である。初期の研究者は、キッチン型の電子レンジにおける単純なカップリング工程（完全なペプチド合成ではない）を報告している。しかしながら、そのような結果の再現は、放射線源として家庭用電子レンジでは限界があり、出力制御ができず、また電子レンジごとに再現性の問題があることから容易ではない。別の研究者は、マイクロ波を用いてカップリング速度を速めることを報告したが、同時に高温が発生して、固相支持体及び反応混合物が変質する傾向があった。工程間におけるサンプルの移動による欠点も生じた。

現在の技術の別の問題は、ペプチド配列の凝集である。凝集とは、成長ペプチドがそれ自体の上に折り畳まれてループを形成し、水素結合によってくっつく傾向をいう。これは、更なる鎖の伸長に関して明らかな問題を生む。理論的には、温度が高くなると水素結合が減少するので、折り畳みの問題が少なくなるが、そのように温度が高いと、熱に敏感なペプチドカップリング試薬に悪影響が及ぼされることがあるので、高温自体による欠点が生じることがある。この理由から、ＳＰＰＳ反応は一般的に室温で行われ、特徴的に反応時間が延長される。

発明の要旨
一の側面において、本発明は、ペプチドの固相合成のための方法であって：（ａ）固相樹脂に結合された第一アミノ酸を、保護第一化学基を除去することにより脱保護する工程；（ｂ）第二アミノ酸上の化学基を活性化して、該第一アミノ酸とのカップリングのための第二アミノ酸を調製する工程；（ｃ）該活性化第二アミノ酸を該脱保護第一アミノ酸にカップリングさせて、該第一アミノ酸及び該第二アミノ酸からペプチドを形成する工程；及び（ｄ）マイクロ波のエネルギーを施用して、脱保護、活性化及びカップリングのサイクルを促進する工程を含む方法である。

別の側面において、本発明は、固相法によるペプチドの促進合成のための装置であって：マイクロ波放射に対して透過性である反応セル；該反応セルに液体を添加するための通路；該反応セルから固体ではなく液体を取り出すため通路；該反応セルを保持するためのマイクロ波キャビティ；及び該キャビティと波動連絡しているマイクロ波源を含む装置である。

更に別の側面において、本発明は、固相法によるペプチドの促進合成のための容器系であって：マイクロ波放射に対して透過性である反応セル；該セルと流体連絡している、該セルに対して外部にある樹脂源と該セルとの間で固相樹脂を移動させるための第一通路；少なくとも１つのアミノ酸源と該セルとの間を流体連絡している、アミノ酸を該セルに添加するための第二通路；不活性気体源及びベントと気体連絡している第三通路であって、該セルに対する及び該セルからの制御された気体流れを用いて、流体及び流動固体を該セルに添加したり該セルから取り出したりできるように、気体圧力を該セルに施用したり、気体圧力を該セルから放出したりするための第三通路を含む容器系である。

更に別の側面において、本発明は、ペプチドの固相合成を促進するための方法であって：固相樹脂に対して結合された保護第一アミノ酸をマイクロ波透過性容器において脱保護性溶液と混合しながら、該混合アミノ酸及び溶液にマイクロ波を照射することにより、該保護結合アミノ酸を脱保護する工程；第二アミノ酸及び活性化溶液を該同一容器に添加しながら、該容器にマイクロ波を照射することにより、該第二アミノ酸を活性化させる工程；該同一容器中の組成物にマイクロ波を照射しながら、該第二アミノ酸を該第一アミノ酸にカップリングさせる工程；及び、結合されたペプチドを該同一容器において切断性組成物と混合しながら、該組成物にマイクロ波を照射することにより、該結合ペプチドを該固相樹脂から切断する工程を含む方法である。

具体的な説明
本発明は、１つ以上のペプチドを固相合成するための装置及び方法であって、具体的には、マイクロ波エネルギーを利用してかかる方法を促進する装置及び方法である。

図１は、固相ペプチド合成法のいくつかの側面を図示する概略図である。図１は、本質的に一般的なものであり、本発明を限定するものではないことが理解される。図１は、第一アミノ酸１０を示しており、第一アミノ酸１０は、それにくっついているＮ−α保護基１１及び側鎖保護基１２を含む。リンカー分子１３は樹脂支持体１４にくっついている。矢印１５で示されている第一の工程では、第一アミノ酸及びその保護基１１と１２が、リンカー１３及び樹脂支持体１４にくっつく。矢印１７で示されている第二の工程では、Ｎ−α保護基が除去されて（脱保護）、第一アミノ酸１０及びその側鎖保護基１２がリンカー分子１３を介して支持体１４に結合されている構造が生成される。矢印２１で示されている次の工程では、第一アミノ酸１０は、２０で示されている第二アミノ酸にカップリングされる。第二アミノ酸は、それにくっついているＮ−α保護基１１とカップリングを促進するための活性基２２とを同様に有する。カップリング工程２１の後、得られる構造には、互いに接続された第一アミノ酸１０及び第二アミノ酸２０が含まれ、更に第二アミノ酸２０にくっついているＮ−α保護基１１と、第一アミノ酸１０にくっついている側鎖保護基１２とが含まれ、接続されたアミノ酸は、リンカー分子１３を介して支持体１４に結合している。破線長方形２５で示されている追加のアミノ酸は、同じやり方（矢印２１´）で添加されて、ペプチド鎖を所望の長さに延長する。

最終工程では、接続されたアミノ酸１０，２０及び２５は、矢印２３で示されているように、保護基及び支持体から切断されて、樹脂支持体１４から分離した所望のペプチドが得られる。カップリング工程は、本明細書中の他のところで何度も示されるように、所望の回数繰り返して、得られるペプチドを製造することができる。

図２には、３０で広範に示される本発明の１つの商業的態様が図示してある。図２は、本発明の広範な構造的側面のいくつかを示しており、その詳細は、図３及び図６で説明する。

まず第一に、図２は、デバイス３１のマイクロ波部分を示している。容器にマイクロ波照射を施用する装置の部分は、好ましくは、本発明の方法において用いられるサンプル寸法及び材料に対して適する出力量を施用するように制御することができる、単一モードキャビティ装置である。本発明の好ましい態様において、装置のマイクロ波部分は、同時係属する又は共通して譲渡された数多くの米国特許出願において記載されている設計を有しそのように運転できる。これらには、公開出願として（U.S.）第20030089706号及び第20020117498号が挙げられ、未公開出願として2002年4月19日に出願された第10/126,838号；2002年6月26日に出願された第10/064,261号；及び2002年7月31日に出願された第10/064,623号が挙げられる。これらの引用文献のすべての開示は、参照により本願明細書中に全体として援用される。そのような単一モードマイクロ波装置の市販型は、本発明の譲受人である、ノースカロライナ州マシューズにあるCEM CorporationからDISCOVERY（商標）、VOYAGER（商標）及びEXPLORER（商標）という商品名で入手可能である。

上記の事実を考慮して図２を参照する。図２は、キャビティ３２、ハウジング３３及び運転中の指示又は情報を提供するための適切なディスプレー３４の配置が図示してある。複数のアミノ酸源のコンテナー又はボトルが、それぞれ３５で示してある。それぞれの樹脂コンテナーは３６で示してあり、生成物ペプチドコンテナーは３７で示してある。一連の流体通路は、４０で広範に示してある配管の部分によって図示してあり、それについては図６でより詳細に考察する。同様に、装置３０には、本願明細書で説明されるやり方で流体及び樹脂を物理的に移動させるための、適切なマニホールドを含む上部ハウジング部分４１が含まれる。マニホールドは図示されていないが、本願明細書で説明され、特に図６の回路図に関して特定的に説明されるやり方で流体を指向させるのに役立つ通路及びバルブのいずれかの系列を含むことができる。

したがって、図２に示す態様においては、自動化された様式で、最大２０までの異なるアミノ酸をそれぞれのコンテナー３５の中に受け入れることができ、また最大で１２の異なるペプチドをそれぞれのコンテナー３７中で生成し配置することができる。それらは商業的な態様での数であるが、本発明はその数に限定されず、また図示してあるように多くの供給源又は生成物コンテナーを有する必要も無いことは理解される。

また、図２は、４２で広範に明示される配管として示される通路の相補的系列も図示してあり、この系列は反応容器アダプター４３に直接接続されている。反応容器アダプター４３は、図２に部分的に図示されているが、図３、４及び５でより詳細に説明する。

図３は、その部分が図２にも図示されている、反応容器４５及び容器アダプター４３の部分的斜視図である。反応容器４５は、好ましくは西洋ナシの形状であり、マイクロ波照射に対して透過性である材料から形成される。好ましい材料としては、ガラス、テフロン（登録商標）及びポリプロピレンが挙げられるが、それらに限定されない。配管４６として示される第一通路は、セル４５の外部にある樹脂源とセル４５との間で固相樹脂を移動させるために、反応容器（又は「セル」、本願明細書では互換性をもって用いられる）４５と流体連絡している。第二通路４７は、アミノ酸をセル４５に添加するために、少なくとも１つのアミノ酸源（図６）とセル４５との間を流体連絡している。第三通路５０は、マニホールドにおける、またセル４５に対する及びセル４５からの制御された気体流れを用いて、流体及び流動固体をセル４５に添加したりセル４５から取り出したりできるように、気体圧力をセル４５に施用したり、気体圧力をセル４５から放出したりするために、不活性気体源（図６）及びベント（図６）と気体連絡している。

図３には第二通路４７も図示され、第二通路４７には、固相樹脂がセル４５から第二通路４７へと入るのを防ぐために、フリット５１として示してあるフィルターも含まれる。
好ましい態様において、本発明は更に第四通路５２も含み、第四通路５２は、セル４５を溶媒で洗い流すため、外部溶媒源（図６）とセル４５との間を流体連絡している。図３に示すように、第四通路５２には、セル４５に溶媒を添加するためにスプレーヘッド５３又はそれと等価な構造が含まれる。

アダプター４３は、マイクロ波透過性で化学的に不活性な材料から形成され、好ましくは、フッ化ポリマー（例えば、ＰＴＦＥ）又は適切な等級のポリプロピレンなどのポリマーから形成される。アダプター４３は、好ましくは、穴をあけられたか又はくり抜かれた通路４６、４７、５０及び５２を有する中実の筒である。通路４６、４７、５０及び５２は、単純に、アダプター４３を貫通する穿孔を含むことができるが、好ましくは、同様に、ＰＴＦＥ、ＰＴＦＥ変体又はポリプロピレンなどのマイクロ波透過性で化学的に不活性な材料から形成される配管も含むことができる。配管は、好ましくは外径１／８インチ（０．３２ｃｍ）で内径１／１６インチ（０．１６ｃｍ）である。

図３には示されていないが（図が複雑にならないようにするため）、容器ネック５４は、好ましくは外部にねじ山が切られていて、アダプター４３の下部において外部にねじ山が切られた穿孔５５と係合する。容器４５とアダプター４３とのねじ係合によって、これら２つのアイテムを確実に係合でき、容器４５をアダプター４３に係合させたり、アダプター４３からはずしたりするのを容易に行うことができる。特に、異なる寸法の容器又は異なる材料から形成された容器は、ネックが同じ寸法で、ねじ山が切られているならば、置換することができ、更にアダプター４３に取り付けることができる。

いくつかの最終的な詳細として、図３には、それぞれ第一、第二、第三及び第四の通路４６、４７、５０及び５２に対するねじ付き管継手５６、５７、６０及び６２も含まれる。これらによりアダプター４３と容器４５の全体を装置３０の他の部分に容易に接続したり、他の部分から容易に取り外すことができる。

図４及び図５は、それぞれ、図３のアダプターの組立て斜視図及び分解斜視図であり、同じ要素を図示している。いずれの図にもアダプター４３及びセル４５が含まれている。ねじ付き管継手５７、６０、５６及び６２は図５に図示されており、５７、６０及び５６は５４中にも見ることができる。図５の分解図には、第一通路及び第二通路４６、４７の一部、ならびにねじ付き容器ネック５４、及びアダプター４３の下部にあるボード開口部５５も図示されている。

図６は、本発明のための流れ回路図である。可能な場合には必ず、図６に示されている要素は他の図でも同じ番号で示してある。図６に図示されている要素のほとんどは一般的に入手可能であり、よく理解されていることから、当業者は過度に実験を行うことなく図６に基づいて本発明を実行できるので、特に詳しくは説明しない。

したがって、図６は、固相法によるペプチドの促進合成のための容器系を示している。容器系は、図６に概略的に正方形で示してある反応セル（又は容器）４５を含む。反応セル４５は、他の点では既に説明した特徴のすべてを有しており、このことは図６に関して繰り返して説明しない。第一通路４６は、外部樹脂源３６とセル４５との間で固相樹脂を移動させるため、セル４５と流体連絡している。３つの樹脂源３６（Ａ、Ｂ及びＣ）が図６に示してあり、図２に示した樹脂源３６に対応している。図２で説明したように、樹脂源の数は決まっているものではなく選択できるものであり、図２の態様では１２であり、図６では単純化及び概略化するために３つで示してある。樹脂源３６の各々は、三方バルブ６４、Ａ、Ｂ及びＣそれぞれと連絡し、次いで三方バルブは、適切な樹脂ライン６５、Ａ、Ｂ及びＣと連絡し、更にそれらは、樹脂を第一通路４６を通してセル４５に送達するため、セル４５に隣接する別の三方バルブ６６と連絡している。三方バルブ６６は、別の三方バルブ６７と直接連絡している。その目的を以下で簡潔に説明する。

図６には、第二通路４７が示してあり、第二通路は、図６の上部に長方形として図示されているアミノ酸源３５の少なくとも１つと連絡している。概略的に示してあるアミノ酸源又はコンテナー３５は、図２に示したコンテナー３５に対応している。

第三通路５０は、セル４５への及びセル４５からの制御された気体流れを用いて、流体及び流動固体をセルに添加したり、セルから取り出したりできるように、気体圧力をセル４５に施用したり、気体圧力をセル４５から気体圧力を放出したりするため、不活性気体源７０及びベント７１と気体連絡している。第三通路５０は、その方向に依存して第三通路５０を気体供給源７０又はベント７１のいずれかと連絡させることができる少なくとも１つのバルブ７２と一緒になって前記作業を達成する。気体供給源は、適切に加圧でき、ペプチド合成の化学反応又は装置自体の要素の障害とならない任意の気体であることができる。したがって、多くの種類の不活性気体が適するが、広範な利用可能性、低コスト、使い易さ及び毒性が無いことから、典型的には、加圧窒素が好適である。図６は、窒素供給源７０が、二方バルブ７２及び適切なレギュレータ７３によって（フィルターが含まれてもよい）制御されることを示している。図６の方向では、二方バルブ７２からベント７１への気体ラインは７４で示してあり、バルブ７２からレギュレータ７３への通路は７５で示してある。

また、図６には、固相樹脂がセル４５から第二通路に入ることを防ぐための、第二通路４７中に存在するフィルターも図示してある。
更に、図６には、スプレーヘッド５３とともに第四通路５２も図示してある。図３に関して説明したように、第四通路５２は、そのうちの３つは７６，Ａ，Ｂ及びＣで示されている１つ以上の外部溶媒源と流体連絡している。２つの他の外部溶媒源７７及び８０は、任意に異なる流体の通路なので、別々に標識してある。

図６は、組成物がペプチド、溶媒、廃棄物又は樹脂であるかどうかに関わらず所望であれば、気体供給源７０からの加圧気体を用いて、反応セル４５へと組成物を送達し、次いで、反応セル４５から組成物を取り出すことができるやり方も説明している。したがって、そのような送達の１つの側面において、図６にはいくつかのアイテムと連絡している気体通路８１が図示してある。第一に、気体通路８１は、８２Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤで示されている一連の二方バルブと連絡し、二方バルブは各々、それぞれのバルブがその対応するアミノ酸コンテナー３５に対して開放しているときに気体の通路を提供する。コンテナー３５に入る加圧気体は、それぞれの送達ライン８３Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤを通してアミノ酸を押し流し、送達ライン８３Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤは、それぞれのアミノ酸バルブ８４Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤと連絡し、次いで、第二通路４７ならびにそのそれぞれの二方バルブ８５及び三方バルブ８６と連絡している。説明するために、バルブ８２Ａ及び８４Ａが開き、残りのバルブ８２Ｂ、Ｃ及びＤが閉じると、供給源７０からの気体は、気体通路８１、バルブ８２Ａを通って、アミノ酸ボトル３５Ａへと向けることができ、ボトル３５Ａからバルブ８４Ａ、８５及び８６を通って、セル４５へと向けることができる。

それぞれのバルブは、合成の適切な時点においてセルに所望の組成物（例えば、樹脂、溶媒、酸など）を提供するため、ならびに他の適切な時点においてセルから組成物（ペプチド、廃棄物）を取り出すために、自動化されている。必要なプログラミング及びプロセッサ性能は、パーソナルコンピュータ型のプロセッサ（例えば、PENTIUM III（登録商標））の能力の範囲内で充分であり、自動化された制御及びシーケンスは当技術分野及び関連技術分野においてよく理解されている（例えば、Dorf, The Electrical Engineering Handbook, 2d Ed.（CRC Press 1997））。

多くの種類のアミノ酸が存在する一方、これに限定されないが、この装置の２０の供給源コンテナーが意図され、当業者にとって周知であるタンパク質を合成するための２０種の「必須」アミノ酸を含有することを理解すべきである。これらの商業的に入手可能な必須アミノ酸は、化学的に「保護された」形態で購入して（同様にSigma-Aldrichから）、望ましくない及び／又は有害な反応が起こるのを防ぐことができる。

溶媒は、類似のやり方でセルに送達できる。溶媒は、バルブ８７Ａ、Ｂ及びＣ及び９０及び９１を介して気体通路８１と連絡している。それにより、気体は、外部溶媒槽７６Ａ、Ｂ及びＣ及び７７及び８０と直接連絡している状態におかれる。外部溶媒槽７６Ａ、Ｂ及びＣは、更に、それぞれ二方バルブ９２Ａ、Ｂ及びＣと、それぞれ三方バルブ９３及び９４と連絡している。バルブを適切な方向に向けると、これらすべてにより、アミノ酸を送達するのと同じやり方で気体圧力を用いて溶媒を反応容器４５に送達するための第二通路４７へと導かれる。ＴＦＡ溶媒は、外部リザーバ７６Ｃで用いられるので、任意に単離するための代替的なラインを通して方向付けることができる。

図６は、アミノ酸及び外部溶媒リザーバに対してすべてのバルブを閉じ、次いで気体を、レギュレータ及びフィルター９２及びそれと関連している通路９３を通して、直接バルブ６７及び６６に向け、次いで第一通路４６及びセル４５の中へと向けることにより、気体供給源７０を用いて、直接セル４５からアイテムを押し流すことができることを示している。

別法として、第一通路４６を用いてセル４５を空にすることができる。この側面において、バルブ７２は、気体を、気体供給源７０から通路７５を通してバルブ７２へ、そして第三通路５０を通してセルの中に向けるように設定される。次いで、気体圧力により、セル４５中の流体を、バルブ８６、６６及び６７の方向に依存して第二通路４７又は第一通路４６に通すように方向付ける。また図６は、図２に示してある生成物コンテナー３７に対応する生成物コンテナー３７Ａ、Ｂ及びＣへと生成物を向けることができる追加の三方バルブ９５も図示してある。生成物バルブ９６Ａ、Ｂ及びＣの適切なセットは、所望のペプチド生成物を所望の生成物コンテナー３７Ａ、Ｂ又はＣへと方向付けることを望む場合に、開けるか又は閉じることができる。

別法として、バルブ８６、６６、６７及び９５の方向に依存し、そして廃棄物コンテナー１０２Ａ及び１０２Ｂに隣接する追加の二方バルブ１００及び三方バルブ１０１と一緒になって、材料をセル４５から廃棄物コンテナー１０２Ａ及びＢのいずれかへと方向付けることができる。

また、気体供給源７０からの加圧気体を用いて樹脂を送達することもできる。この側面において、加圧気体を気体通路８１及び三方バルブ１０３及び１０４を通るように方向付ける。しかし樹脂の送達に関して、バルブ１０３及び１０４の両方が樹脂コンテナーに対して開放しており、それらのバルブにより、加圧気体は、樹脂コンテナー３６、次いで出口バルブ６４Ａ、６４Ｂ及び６４Ｃに連絡している３つのそれぞれのバルブ１０５Ａ、Ｂ及びＣへと方向付けられ、出口バルブ６４Ａ、６４Ｂ及び６４Ｃは、送達される気体圧力を用いて、樹脂を樹脂ライン６５を通して最終的に反応容器４５の中に送達するための第一通路４６へと押し流す。

樹脂供給源は、これらに限定されないが、Wang樹脂、Trityl樹脂及びRink酸不安定樹脂などの量や種類を変動できる樹脂を含有してもよい；これらの樹脂はセントルイス、MO 63101にあるSigma-Aldrich Corp.などのベンダーから商業的に入手可能である。

溶媒は、溶媒リザーバと樹脂コンテナーの間のバルブ１０３、１０４を用いて、外部リザーバ７７、８０から樹脂コンテナー３６Ａ、Ｂ、Ｃへと向けることができる。
図６Ａは、反応器４５に隣接するバルブ系に関する更に詳細な説明である。特に、図６Ａは、一連の三方バルブ１１１、１１２、１１３、１１４及び１１５と共に、一連の液体センサー１０６、１０７及び１１０を示している。これらのセンサーにしたがってバルブを操作すると、望ましいか又は必要な場合に、計量された量の液体を反応容器４５に添加することができる。例えば、図６Ａの方向で示されているバルブ１１１、１１３及び１１４により、反応容器４５の中に直接延びている第二通路４７のそれらの部分に対して、流体をバルブ８６から直接流すことができる。別法として、バルブ１１１がバルブ１１２の方へと開放している場合、流体は、液体センサー１０７及び１１０に達するまで、バルブ１１１及び１１２を通って流れる。液体センサーは適切な又は所望な量の液体が含まれている場合に系に通知し、バルブ１１２の操作を変更することにより、これらの液体を、望まされるようにバルブ１１３、次いでバルブ１１４、更に次いで第二通路４７、そして最終的にセル４５の中に送達することができる。

したがって、全様式において、図６は、それぞれの供給源から単一の反応セルへの前駆体組成物（アミノ酸、溶媒、樹脂、脱保護剤、活性化剤）の送達を図示しており、更に、生成物及び副生物（ペプチド、廃棄物、切断された樹脂）の反応セルからそれぞれの行き先への送達を図示している。特定の流路及びバルブ配置は本発明を説明するが限定するものではないことが理解される。

はじめに言及したように、合成装置のマイクロ波装置部分は、共通して譲渡された同時係属する多くの米国特許出願に記載されているものと実質的に同じであることができる。したがって、本願明細書中では過度に説明せずに、図７には装置のマイクロ波部分の一定の側面を強調するために含まれている。特に、図７は、先に援用された2002年6月26日に出願された出願番号第10/064261号の図１と実質的に同じである。図７は、破断図で示してあるマイクロ波キャビティ１１７を明確にするため示している。キャビティは導波管１２０にくっ付いており、導波管は適切な照射源（図示せず）とマイクロ波連絡している。マイクロ波源は広く入手可能であり、当業者には充分に理解されている。マイクロ波源としては、マグネトロン、クライストロン及び固体ダイオードが挙げられる。図７には、キャビティ１１７にある試験管形状のセル１２１が示してあり、このセルは所望であれば本発明の反応に用いることができるが、一般的には、洋ナシ形状の容器４５が好ましい。

同時冷却を実施するため、装置には、冷却気体をフローバルブ１２３（典型的にはソレノイド）上の入口管継手１２２へと送達する冷却気体源（図示せず）が含まれる。活性冷却の間、冷却気体は、典型的にはソフトウェアで制御されるソレノイド１２３により、配管１２４を介して冷却ノズル１２５へと向けられ、更に冷却ノズル１２５により反応容器１２１へと向けられる。

しかしながら、他の冷却機構、例えば、冷却空気流、又はマイクロ波エネルギーの移動を妨害しないと考えられる様式で反応セル周囲に冷凍液を循環させる液体冷却機構などをこの方法に適合できることも指摘されるべきである。

また、図７には、典型的には反応バイアル１２１の温度観察を可能にするために用いられる円筒形開口部１２６も図示してある。この温度観察は、対象物によって生成される赤外線放射を読み取ることにより対象物の温度を測定できる任意の適切なデバイスで実施することができる。このようなデバイスは、当技術分野において充分に理解されており、いくつかの側面は援用された参考文献中で既に考察されているので、本願明細書中では更に詳細には説明しない。

好ましい態様において、マイクロ波源は、これに限定されないが、マイクロ波エネルギーを「スパイキング（spiking）」することができる。言い換えれば、マイクロ波源は、高出力を短時間発生することができ、これに限定されないが、反対に低出力を長時間発生することができる。この特徴は、反応容器の内容物を過熱する不所望な効果を防止するのに役立ち、また反応速度も増大させると考えられる。

装置には、場合により、温度を測定するための赤外線光センサーが含まれる。赤外線センサーは、反応セルの内容物とは接触しないが、単に内容物周囲の空気温度ではなく、反応セルの内容物の平均温度を正確に測定する。赤外線温度分析は、高度に正確で、非侵襲的であり、局所的領域のみを測定し内容物との物理的接触が必要と考えられるプローブなどに比べて、より単純化された装置設計が可能である。

第二通路は、更に、樹脂の通過を妨げるフィルターを有することを特徴とする。また、第一通路及び第二通路は、液体溶媒及び流動固体の移動に関して互いに流体連絡している；本明細書中において、「流動固体」とは、くっ付いているアミノ酸又はペプチドの有無に関わらす、適切な溶媒中に懸濁された樹脂を指している。

別の側面において、本発明は、マイクロ波エネルギーの使用を含む、１つ以上のペプチドを固相合成する方法である。脱保護工程、活性化工程、カップリング工程及び切断工程中に反応セルの内容物に施用されるマイクロ波エネルギーにより、これらの反応を完了するのに要する時間が大いに短縮される。マイクロ波エネルギーを施用する方法は、最短の反応時間を提供しながら熱の蓄積量は少なくするようなやり方で、マイクロ波源により緩和することができるので、高いマイクロ波エネルギーを施用してもよく、熱に付随する反応セル内容物の分解は起こらない。この方法には、これに限定されないが、短時間に大量にマイクロ波エネルギーをスパイキングすることが含まれる。

本方法には、場合により、単一の反応器における２種類以上のアミノ酸からなる最終的なペプチドの合成が含まれ、１種類以上のアミノ酸を、固相樹脂にくっ付いている１種類以上のアミノ酸にカップリングすることが含まれてもよい。

本方法には、マイクロ波エネルギーの施用中及び施用と施用の間に、反応セル、したがってその内容物を冷却する工程が含まれ、そして最終の切断工程が含まれる。本方法の冷却機構は、アミノ酸の伸長サイクル中に行う。本願明細書で使用する「サイクル」という用語は、１つのアミノ酸を別のアミノ酸に結合させるのに必要な脱保護、活性化、及びカップリングを指している。また、冷却系は、所与のサイクルにおいてマイクロ波エネルギーの施用中及びマイクロ波エネルギーの施用と施用との間に動作させて、反応セルの内容物のバルク温度を低く保つこともできる。冷却系は、最終ペプチドを樹脂から切断するときに動作させることもできる。

別法では、温度を厳密に制御するのではなく出力を制御することにより、反応の進行にわたって所望の制御を提供できることも発見した。本明細書中の他のところで言及したように、可変又は切換え電源の使用によりこの目的を果たすことができ、その例は共通して譲渡された米国特許第6,288,379号に与えられている；その内容は、本明細書中に全体として援用される。

この方法には、溶媒及び遊離アミノ酸に対して、樹脂と樹脂にくっ付いているあらゆるアミノ酸又はペプチドとを最も効果的に暴露することを促進するため、窒素気体で反応セルの内容物を撹拌することが含まれる。

好ましい態様において、この方法は、選択された樹脂に結合された第一の必須アミノ酸（どちらも適切な溶媒中に懸濁されている）を加圧された窒素気体によって反応セルへと移動させることを含む。次いで、脱保護溶液をポンプで反応セル中に送る。この方法は、マイクロ波エネルギーを施用することによって促進され、マイクロ波エネルギーにより発生する熱は、冷却機構によって最少限に抑えられる。多数の脱保護工程を行ってもよい。次いで、脱保護溶液を反応セルから抜き出し、樹脂に結合された脱保護必須アミノ酸を残留させる。各々適切な溶媒を用いて、約１樹脂体積の樹脂を数回（３〜５回）洗浄し、洗浄溶媒を除去した後、次の「遊離」必須アミノ酸（一種又は複数種）（溶液中に溶解されている）を活性化溶液とともに反応セルに添加する。遊離アミノ酸の活性化は、マイクロ波エネルギーを施用することにより促進され、反応セル温度は、上記の冷却機構により制御される。この方法は、更に、方法を促進させるためにマイクロ波エネルギーを用いて、遊離アミノ酸（一種又は複数種）を脱保護された結合アミノ酸にカップリングさせ、ペプチドを形成させることを含む。上記のとおり、マイクロ波エネルギーにより発生する熱は冷却機構によって最少限に抑えられる。カップリング工程は、更に、反応セル内容物の窒素撹拌を含むことが好ましい。この工程の完了は、１回以上のアミノ酸添加の一サイクルで表される。カップリング工程の後、活性化溶液を抜き出し、樹脂を上記のとおり洗浄する。このサイクルを、所望のペプチド配列が合成されるまで繰り返す。ペプチド合成が完了したら、更なる脱保護工程を実施して、アミノ酸の側鎖にくっ付いている保護化学基を取り除くことができる。この脱保護工程は上記のとおりに実施する。次に、くっ付いている最終ペプチドを含有する樹脂を、第二の溶媒で上記のように洗浄して、ペプチドを樹脂から切断する準備をする。第二溶媒を除去したら、切断性溶液を反応セルに加え、マイクロ波エネルギーを施用することによって切断を促進し、マイクロ波エネルギーによって生じる熱は、冷却機構によって最少限に抑える。切断が完了したら、ペプチド生成物を生成物管に移す。場合により、ペプチドを、合成プロセス中の任意の時点で「キャップ」してもよい。キャップは、不完全にカップリングしたペプチドを終止させ、ペプチド配列の適切な折り畳みを助け、そして所与のペプチドに対して特異的な化学的な識別タグを提供するのに役立つ。しかし、これらの修飾により合成ペプチドの溶解度が低下するので、注意しなければならない。キャップは、例えば、限定するものではないが、固相合成において無水酢酸又はフルオラス（fluorous）によるキャップを用いるか又は、ビオチンなどの多様な化学基のいずれかをペプチドのＮ−末端、Ｃ−末端又は側鎖のいずれかにくっ付けることにより実施する。

別の態様において、本発明は、保護第一化学基を除去することにより、固相樹脂に結合された第一アミノ酸を脱保護し、第二アミノ酸上の化学基を活性化させて、第一アミノ酸とカップリングさせるため第二アミノ酸を調製し、活性化された第二アミノ酸を脱保護された第一アミノ酸にカップリングさせて、第一アミノ酸及び第二アミノ酸からペプチドを形成し、ペプチドを固相樹脂から切断し、マイクロ波エネルギーを施用して、脱保護、活性化及びカップリングのサイクルを促進させ、そしてマイクロ波エネルギーを施用して切断工程を促進させる工程を含む。

もちろん、多数のアミノ酸を互いに添加してペプチド配列を形成することは通常の手順である。したがって、この方法は、通常は、脱保護、活性化及びカップリングのサイクルを繰り返して、第三アミノ酸及び連続するアミノ酸を添加して、所望の配列からなるペプチドを形成する工程を含むことができる。

この点において、本明細書中に用いられる「第一」、「第二」又は「第三」という用語は、絶対的な意味ではなく、相対的な意味で用いていることが理解される。
特に好ましい態様において、本方法は、サイクルとサイクルとの間に、固相樹脂からペプチドを取り出すことなく、単一の容器において複数のアミノ酸を連続的に脱保護し、活性化し、そしてカップリングさせてペプチドにすることを含む。本発明のこの側面及び追加の側面は、図に関する考察によって理解される。

別の態様において、本方法は、マイクロ波エネルギーの施用中に容器とその内容物とを未然に冷却して、それにより、マイクロ波エネルギーの施用に起因するであろう熱の蓄積を制限することによりペプチド又は酸の不所望な分解を防ぐことを含む。

ペプチド合成においては典型的であるように、脱保護工程は、アミノ酸のα−アミノ基を脱保護することを含むが、また、マイクロ波及び放射線のいずれの存在下においても、ペプチドのアミノ酸上の側鎖を脱保護することを含むこともできる。同様に、活性化工程は、典型的には第二アミノ酸のα−カルボキシル基を活性化させることを含む。

アミノ酸及びペプチドは過剰な熱に敏感であるので、上記の未然の冷却工程に加えて、マイクロ波エネルギーを施用する工程は、マイクロ波エネルギーの施用を比較的短い時間間隔に「スパイキング」し、それにより、マイクロ波エネルギーの連続施用によって促進され得る熱の蓄積を制限して、ペプチド酸の不所望な分解を防ぐことを含むことができる。本明細書中で用いる「スパイキング」という用語は、マイクロ波エネルギーの施用を、比較的短い時間間隔に制限することを指している。別法として、マイクロ波出力は、共通して譲渡された米国特許第6,288,379号（その内容は参照により本明細書中に全体として援用される）に記載されている切換え電源から供給することができる。

他の態様において、ペプチド合成法は、カルボジイミド型のカップリングフリー薬剤（coupling free agent）を用いてin situで活性化及びカップリングさせることを含むことができる。

別の側面において、本発明はペプチドの固相合成を促進するための方法である。この側面において、本方法は、マイクロ波透過性容器において保護結合酸を脱保護性溶液と混合しながら、混合された酸及び溶液にマイクロ波を照射し、混合物を冷却して（または別法では、施用される出力を制御して、あるいはこれら両方により）、マイクロ波エネルギーかの熱の蓄積により固相支持体又は混合組成物のうちいずれかが分解しないよう防ぐことにより、固相樹脂に結合された保護第一アミノ酸を脱保護することを含む。特に、本方法はアミノ酸のα−アミノ基を脱保護すること、最も典型的には、ｆｍｏｃ及びｂｏｃからなる群から選択される保護化学物質を除去するのに適する組成物により脱保護することを含む。脱保護の化学に精通している当業者にとっては既知であるように、脱保護工程は、アミノ酸の側鎖を脱保護することを含むこともできる。それらの環境において、脱保護工程は、ｔ−ブチルをベースとする側鎖保護基を除去するのに適する組成物を用いることを含む。

脱保護工程の後、本方法は、この第二アミノ酸及び活性化溶液を同じ容器に添加しながら、この容器にマイクロ波を照射し、同時にこの容器を冷却して、マイクロ波エネルギーからの熱の蓄積により固相支持体又は混合組成物のうちのいずれかが分解するのを防ぐことにより、第二アミノ酸を活性化させる工程を含む。

次に、本方法は、第二アミノ酸を第一アミノ酸にカップリングさせながら、同一容器においてその組成物にマイクロ波を照射し、混合物を冷却して、マイクロ波エネルギーからの熱の蓄積により固相支持体又は混合組成物のうちいずれかが分解するのを防ぐことを含む。

最後に、本方法は、結合されたペプチドを同一容器において切断性組成物と混合しながら、この組成物にマイクロ波を照射し、この容器を冷却して、マイクロ波エネルギーからの熱の蓄積により固相支持体又はペプチドが分解するのを防ぐことにより、結合ペプチドを固相樹脂から切断することを含む。

また、活性化工程は、in situ活性化法と、ホスホリウム又はウラニウム活性剤、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵ、ＰｙＢＯＰ，ＰｙＡＯＰ及びＨＯＢＴなどの組成物とを用いて、第二アミノ酸を活性化させ且つカップリングさせることを含むこともできる。

また、ペプチドの合成には殆ど常に、３つ以上のアミノ酸を鎖中に添加することが含まれるので、本方法は、連続して３つ以上のアミノ酸に関して脱保護工程、活性化工程及びカップリング工程を周期的に繰り返し、それにより、所望のペプチドを合成することを含むことができる。

本発明の特定の態様においては、サイクルとサイクルの間に固相樹脂又は容器からペプチドを取り出すことなく、単一の反応容器中で脱保護、活性化、カップリング及びプリーディング（pleading）の連続工程を実施する。

本方法は、混合物を、好ましくは脱保護工程、活性化工程、カップリング工程及びプリーディング工程の１つ以上の工程中に窒素ガスとともに、撹拌する工程を更に含むことができる。合成化学、すなわちペプチド又はアミノ酸に干渉しないという条件で、撹拌に関して任意の気体を用いることができるが、その広い入手可能性、低コスト及び特定の反応に関して化学的に不活性であるので、典型的にはこの目的には窒素が好ましい。

実験：
ペプチド：Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ
-ＭＷ＝２８８
規模＝０．１０ｍｍｏｌ
用いた樹脂＝Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｗａｎｇ樹脂
樹脂置換＝樹脂１ｇあたり０．２７×１０^−３モル
マイクロ波プロトコル：
このペプチドにおけるすべての反応に関して、マイクロ波出力は、はじめに５０Ｗに設定し、次いで６０℃未満の温度に保たれるように調節した。

脱保護：ＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液を脱保護に用いた。反応はそのマイクロ波中で３０秒間行い、次いでマイクロ波中で１：００分間新しい脱保護溶液を用いて繰り返した。

カップリング：合成における各々カップリングのために、ＨＣＴＵを０．４０ｍｍｏｌ、ＤＩＰＥＡを０．８０ｍｍｏｌ及び各々のＦｍｏｃ−アミノ酸を０．４０ｍｍｏｌ用いて活性化を行った。約１０ｍＬのＤＭＦを用いてその混合物を溶解させた。反応はマイクロ波中において５：００分間行った。

洗浄：容器に約１０ｍＬのＤＭＦを充填し、脱保護工程及びカップリング工程それぞれの後に５回すすいだ。
切断：切断は、９５％ＴＦＡ及び５％Ｈ_２Ｏを用いて９０：００分間行った。

ペプチドは、冷エチルエーテル５０ｍＬ中で一晩沈殿させた。生成物を収集し乾燥させた。Thermo Finnigan Advantage LC/MSを用いるエレクトロスプレーイオン化質量分析によって、粗生成物に関する質量スペクトルを得た。

結果：エレクトロスプレーイオン化質量分析（図８）は、Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌの分子量に対応する２８９．１で単一ピークを示した。不完全なカップリングに対応する他のピークは認められなかった。

ペプチド：Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ
-ＭＷ＝１０６２
規模＝０．２５ｍｍｏｌ
用いた樹脂＝Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｗａｎｇ樹脂
樹脂置換＝樹脂１ｇあたり０．２７×１０^−３モル
マイクロ波プロトコル：
このペプチドは、出力時間制御法によって合成した。

脱保護：ＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液を脱保護に用いた。脱保護は、２５Ｗのマイクロ波出力中で３０秒間行い、次いでそのマイクロ波中で１：００分間新しい脱保護溶液を用いて繰り返した。

カップリング：合成における各々のカップリングのために、ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔをそれぞれ０．９／１．０ｍｍｏｌ、ＤＩＰＥＡを２ｍｍｏｌ及びＦｍｏｃ−アミノ酸を１．０ｍｍｏｌ用いて活性化を行った。ＤＭＦを約１５ｍＬ用いてその混合物を溶解させた。カップリング反応は、１５秒間オン及び４５秒間オフを交互に繰り返す出力でマイクロ波中において５：００分間行った。出力の第一サイクルは２５Ｗであり、残りの４サイクルは各々２０Ｗであった。

洗浄：反応器にＤＭＦを約１５ｍＬ充填し、脱保護工程及びカップリング工程各々の後５回すすいだ。
切断：切断は、９５％ＴＦＡ、２．５％Ｈ_２Ｏ及び２．５％ＴＩＳを用いて行った。

ペプチドは、冷エチルエーテル１００ｍＬ中で一晩沈殿させた。生成物を集め乾燥させた。Thermo Finnigan Advantage LC/MSを用いるエレクトロスプレーイオン化質量分析によって、粗生成物に関する質量スペクトルを得た。

結果：エレクトロスプレーイオン化質量分析（図９）は、所望のペプチド質量に対応する１０６３．３において単一ピークを示している。不完全なカップリングに対応するピークは検出されなかった。第二のピークは、余分なＩｌｅアミノ酸を有する所望のペプチドに対応する１１７６．５において得られた。このピークは、複数のＩｌｅカップリング反応のうち１つの反応の前において脱保護溶液の除去が不完全であって、それにより２つのＩｌｅアミノ酸がペプチドに付加されていることに対応している。

図面及び明細書では、本発明の典型的な態様を開示した。特定の用語の使用は、説明のためにのみ用いており、それらの用語は、特許請求の範囲に記載してある本発明の範囲を限定することを意図していない。

図１は、固相ペプチド合成の一の側面を図示する概略図である 図２は、本発明にしたがった合成装置の斜視図である。 図３は、本発明にしたがった反応容器及びアダプターの斜視図である。 図４は、本発明にしたがった反応容器及びアダプターの斜視図である。 図５は、本発明にしたがった反応容器及びアダプターの斜視図である。 図６は、本発明の側面を図示する流れ回路図である。 図７は、本発明のキャビティ及び導波管の破断斜視図である。 図８は、本発明の方法にしたがって合成された一のペプチドの質量スペクトルである。 図９は、本発明の方法にしたがって合成された第二のペプチドの質量スペクトルである。

Claims (37)

1. ペプチドの固相合成を促進する方法であって：
   固相樹脂に結合された保護第一アミノ酸をマイクロ波透過性容器において脱保護性溶液と混合しながら、該混合アミノ酸及び溶液にマイクロ波を照射することにより、該保護結合アミノ酸を脱保護する工程；
   第二アミノ酸及び活性化溶液を該同一容器に添加しながら、該容器にマイクロ波を照射することにより、該第二アミノ酸を活性化させる工程；
   該同一容器中の組成物にマイクロ波を照射しながら、該第二アミノ酸を該第一アミノ酸にカップリングさせる工程；及び
   結合されたペプチドを該同一容器において切断性組成物と混合しながら、該組成物にマイクロ波を照射することにより、該結合ペプチドを該固相樹脂から切断する工程、を含む方法。
2. 脱保護工程、活性化工程、カップリング工程及び切断工程の任意の１つ以上の工程の間に容器を冷却して、マイクロ波エネルギーからの熱の蓄積により固相支持体又はペプチドが分解するのを防ぐ工程を含む、請求項１記載のペプチド合成方法。
3. ３つ以上のアミノ酸に関して脱保護工程、活性化工程及びカップリング工程を連続して周期的に繰り返すことにより、所望のペプチドを合成することを含む、請求項１記載のペプチド合成方法。
4. 複数の周期の間にペプチドを固相樹脂から又は容器から取り出すことなく、連続する脱保護工程、活性化工程、カップリング工程及び切断工程を単一反応器において実施することを含む、請求項１記載のペプチド合成方法。
5. 更に、脱保護工程、活性化工程、カップリング工程及び切断工程の１つ以上の工程の間に、混合物を窒素気体により撹拌する工程を含む、請求項１記載のペプチド合成方法。
6. アミノ酸のα−アミノ基を脱保護することを含む、請求項１記載のペプチド合成方法。
7. アミノ酸の側鎖を脱保護することを含む、請求項１記載のペプチド合成方法。
8. 更に、カルボジイミド型のカップリング試薬を用いて、第二アミノ酸をin situで活性化させカップリングさせることを含む、請求項１記載のペプチド合成方法。
9. 更に、トリフルオロ酢酸から成り、保護基及びリンカーから生ずる反応性カルボニウムイオンを消失させるための複数の掃去剤を含有する切断性組成物により、ペプチドを切断することを含む、請求項１記載のペプチド合成方法。
10. マイクロ波の施用の間に容器及びその内容物を未然に冷却することにより、マイクロ波エネルギーの施用に起因するであろう熱の蓄積を制限して、ペプチド又はアミノ酸の不所望な分解を防ぐことを含む、請求項１記載のペプチド合成方法。
11. 活性化工程が第二アミノ酸のα−カルボキシル基を活性化させることを含む、請求項１記載のペプチド合成方法。
12. マイクロ波エネルギーを施用する工程が、マイクロ波エネルギーの施用を比較的短い時間間隔に制限することにより、該マイクロ波エネルギーの継続施用により助長され得る熱の蓄積を制限して、ペプチド又はアミノ酸の不所望な分解を防止することを含む、請求項１記載のペプチド合成方法
    。
13. 更に、in situ法と、ホスホリウム活性剤、ウロニウム活性剤、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵ、ＰｙＢＯＰ、ＰｙＡＯＰ及びＨＯＢＴからなる群から選択される組成物とを用いて、活性化させカップリングさせることを含む、請求項１記載のペプチド合成方法。
14. 容器の温度をモニターし、施用される出力を該モニター温度に基づいて節制することを含む、請求項１記載のペプチド合成方法。
15. 施用される出力を反応の状態に基づいて節制することを含む、請求項１記載のペプチド合成方法。
16. 固相法によるペプチドの促進合成のための容器系であって：
    マイクロ波放射に対して透過性である反応セル；
    前記セルと流体連絡している、前記セルに対して外部にある樹脂源と前記セルとの間で固相樹脂を移動させるための第一通路；
    少なくとも１つのアミノ酸源と前記セルとの間を流体連絡している、アミノ酸を前記セルに添加するための第二通路；
    不活性気体源及びベントと気体連絡している第三通路であって、前記セルに対する及び前記セルからの制御された気体流れを用いて、流体及び流動固体を前記セルに添加したり前記セルから取り出したりできるように、気体圧力を前記セルに施用したり、気体圧力を前記セルから放出したりするための第三通路、を含む容器系。
17. 通路を制御して、アミノ酸を容器及びペプチドに連続的に添加し、最終ペプチドを前記容器からペプチドリザーバへと移動させるためのプロセッサ及び制御系を含む、請求項１６記載のペプチド合成容器系。
18. 容器を外部溶媒源からの溶媒ですすぎ、その後アミノ酸を前記容器に連続的に添加して、前記同一容器において次のペプチドを形成させるための手段を含む、請求項１７記載のペプチド合成容器系。
19. 更に、固相樹脂がセルから第二通路へと入るのを防ぐためのフィルターを第二通路中に含む、請求項１６記載のペプチド合成容器系。
20. 更に、外部溶媒源とセルとの間を流体連絡している、前記セルを溶媒で洗い流すための第四通路を含む、請求項１６記載のペプチド合成容器系。
21. 第一通路、第二通路、第三通路又は第四通路のいずれかにおける流体連絡を制御するためのバルブ系を含む、請求項１６又は２０記載のペプチド合成容器系。
22. 第一通路、第二通路及び第四通路が、更に、それぞれの外部溶媒源と流体連絡している、請求項１６又は２０記載のペプチド合成容器系。
23. 第一通路と流体連絡している、固相樹脂をセル中に堆積させるための樹脂リザーバを含む、請求項１６記載のペプチド合成容器系。
24. １〜１２個のリザーバからなる樹脂リザーバ群を含む、請求項２３記載のペプチド合成容器系。
25. 第二通路と流体連絡している、所望のアミノ酸をセル中に堆積させるためのアミノ酸リザーバを含む、請求項１６記載のペプチド合成容器系。
26. １〜１２個のリザーバからなるアミノ酸リザーバ群を含む、請求項２５記載のペプチド合成容器系。
27. 第二通路と流体連絡している、最終ペプチドを堆積させるためのペプチドリザーバを含む、請求項１６記載のペプチド合成容器系。
28. １〜１２個のリザーバからなるペプチドリザーバ群を含む、請求項２７記載のペプチド合成容器系。
29. 第二通路と流体連絡している、その中に溶媒廃棄物を堆積させるための液体廃棄物コンテナと、第一通路と流体連絡している、その中に樹脂廃棄物を堆積させるための樹脂廃棄物コンテナとを含む、請求項１６記載のペプチド合成容器系。
30. アミノ酸リザーバ群及びペプチドリザーバ群を含み、その各々が、アミノ酸リザーバ群及びペプチドリザーバ群とセルとの間の流体連絡を制御するため、第二通路及び１つ以上のバルブと流体連絡している、請求項１６記載のペプチド合成容器系。
31. 切断性溶液専用リザーバと、前記切断性溶液リザーバ及びセルと流体連絡している専用通路とを含む、請求項１６記載のペプチド合成容器系。
32. 第二通路、第三通路及び第四通路と流体連絡しており、サンプルループ及び流体バイパス回路からなる群から選択される流路を規定するバルブ機構を含む、請求項２０記載のペプチド合成容器系。
33. 更に、サンプルループ及びセルにおいて液体の体積を測定するための液体センサーを含む、請求項３２記載のペプチド合成容器系。
34. 必須アミノ酸又はアミノ酸誘導体のための１〜１２個の供給源を含む、請求項１６記載のペプチド合成容器系。
35. マイクロ波源と容器のためのキャビティとを含み、前記マイクロ波源が前記キャビティと波動連絡している、請求項１６記載のペプチド合成容器系。
36. キャビティ中のセルの内容物により放出される赤外線を、前記セルの内容物と接触することなく測定することができ、該赤外線を測定するために配置することができる赤外温度センサーを含む、請求項１６記載のペプチド合成容器系。
37. 更に、マイクロ波放射の施用中又は施用と施用の間に、同時にセルを冷却するための手段を含む、請求項１６記載のペプチド合成容器系。

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