JP2004534521A5

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Publication number: JP2004534521A5
Application number: JP2002570602A
Authority: JP
Filing date: 2002-03-01
Publication date: 2008-10-16

Description

ＥＬＲ−ＣＸＣケモカインの高アフィニティアンタゴニスト

発明の詳細な説明

発明の分野
本発明は、ＣＸＣケモカインレセプターアンタゴニストの分野に関する。

発明の背景
レセプターシグナル伝達グルタミン酸−リジン−アルギニン（ＥＬＲ）モチーフを保有するＣＸＣケモカイン（例えばＣＸＣＬ１／ＧＲＯα、ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８；Baggiolini,M.1998. Nature.392:565-568）は、虚血再かん流傷害（Sekido, N et al. 1993. Nature. 365:654-657; Villard, J. et al. 1995. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 152:1549-1554）、エンドトキシン症誘導性急性呼吸窮迫症候群(ARDS; Mukaida, N. et al. 1998. Inflamm. Res. 47 suppl. 3)S151-157)、関節炎、および免疫複合型糸球体腎炎(Harada, A. et al. 1996. Inflamm. Res. 2:482-489）を含む多重位置の病理の多くを仲介する炎症性細胞の流入に対して重要である。例えば、活性化好中球から不適当に放出された加水分解酵素および反応性酸素種は、病理学的過程を開始および／または永続させる。他方、ほとんどの細菌性感染中に、このケモカイン応答は、防御の第一線を示し、しかしここでＥＬＲ^＋ＣＸＣケモカイン応答でさえも、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２レセプターを呈する炎症性細胞を活性化するそれらの能力を介して、病理を悪化させ得る。例えば、実験的「盲腸穿刺および結さつ」腐敗症中、ＭＩＰ−２の中和は、マウス死亡率を、８５％から３８％に減少させる（Walley, K. R. et al. 1997. Infect. Immun.65:3847-3851）。そして循環する好中球を排除する実験的処置は、肺炎マンハイミオシス（mannheimiosis）（Slocombe, R. et al. 1985. Am J. Vet. Res. 46:2253）を緩和し、ここで気道のＣＸＣＬ８発現は、変化可能に好中球化学誘引をもたらす。（Caswell, J. L. et al. 1997. Vet. Pathol.35.124-131;Caswell, J.L.et al. 2001. Canad.J.Vet.Res.65:229-232)。多くの位置でのこれらのケモカイン応答の決定的な重要性にもかかわらず、わがままな炎症性細胞応答は、我々がＥＬＲ^＋αケモカインを阻止する治療的手段の開発が研究プライオリティとなることを十分に損傷しつつある（Baggiolini, M., and B. Moser. 1997.J.Exp. Med. 186:1189-1191）。

「ＥＬＲ」ケモカインは、それらのＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２レセプターを介して、炎症性細胞を化学誘引および活性化する（Baggiolini, 1998; Ahuja, S.K. and P.M.Murphy. 1996. J. Biol. Chem. 271:20545-20550）。ＣＸＣＲ１は、ＣＸＣＬ８およびＣＸＣＬ６／顆粒球化学走性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）に特異的であり、一方ＣＸＣＲ２はＣＸＣＬ８に高アフィニティで、しかしまたマクロファージ炎症性タンパク質−２（ＭＩＰ−２）、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ５／ＥＮＡ−７８、およびＣＸＣＬ６に、ややより低いアフィニティで結合する（例えばBaggiolini and Moser, 1997参照）。ヒトＣＸＣＲ１またはＣＸＣＲ２でトランスフェクトされた細胞株のＣＸＣＬ８シグナル伝達は、等能力化学走性応答を誘導し（Wuyts, A. et al.1998. Eur. J. Biochem.255:67-73; Richerdson, R. et al. 1998. J. Biol. Chem. 273:23830-23836）、そして一方好中球サイトソル性遊離Ｃａ^＋＋は変化し、そしてＣＸＣＬ８に応答しての細胞性脱顆粒化はまた、両レセプター、呼吸バーストおよびホスホリパーゼＤの活性化によって介在され、報告的にはＣＸＣＲ１に専ら依存する（Jones, S.A.et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.93:6682-6686）。他方、ＣＸＣＲ１ではなくＣＸＣＲ２の非ペプチドアンタゴニストは、細胞性活性化ではなく、ＣＸＣＬ８介在好中球化学走性に拮抗する（White, J.R. et al. 1998. J. Biol. Chem. 273:10095-10098）。最後に、ケモカインはもっともしばしば炎症性応答中に豊富に発現される豊富な証拠がある（例えばCaswell et al.,1997参照）。しかし、この分野の活発な研究にかかわらず、両ＥＬＲ−ＣＸＣケモカインレセプターによって誘導される不利な炎症性細胞活性を抑制するのに有効であるＣＸＣケモカインアンタゴニストは、先行技術で既知でない。

発明の要約
本発明の組成は、哺乳動物炎症性細胞のＣＸＣＲ１またはＣＸＣＲ２レセプターに結合できる新規ＥＬＲ−ＣＸＣケモカインアンタゴニストタンパク質を含む。これらは、高アフィニティ結合が可能であるアンタゴニストを含み、ここで「高アフィニティ」は、野生型ケモカインアゴニストのそれより少なくとも約１桁大きいレセプターについてのアンタゴニストのアフィニティをいう。新規アンタゴニストタンパク質はまた、野生型ウシＣＸＣＬ８タンパク質に実質的に同等なもの（すなわち、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２結合機能を欠失しないアミノ酸置換、付加および欠失を含むもの）を含み、そしてまたＬｙｓ１１のＡｒｇでのおよびＧｌｙ３１のＰｒｏでの置換とともに最初の２アミノ酸残基の途切れ(truncation)を有する。このＣＸＣＬ_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐのアナログ、すなわちＣＸＣＬ_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐ／Ｐ３２ＧおよびＣＸＣＬ_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｔ１２Ｓ／Ｈ１３Ｆ／Ｇ３１Ｐが含まれる。加えて、哺乳動物炎症性細胞のＣＸＣＲ１またはＣＸＣＲ２レセプターに高アフィニティ結合を生じる３次元構造を有する化合物。

本発明の他の組成は、これらのタンパク質に関する新規ポリヌクレオチドおよびポリペプチドである。１つのそのような新規ポリヌクレオチドは、配列番号４としてここに同定するヌクレオチド配列であり、一方１つのそのような新規ポリペプチドは、配列番号１としてここに同定するアミノ酸配列である。さらに、本発明は、新規ポリヌクレオチドを含むベクター、およびポリヌクレオチドの発現を制御する調節配列と作動性に連関された新規ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。同様に、アフィニティハンドルおよび新規ポリヌクレオチドを含む遺伝子融合物は、得られるベクターおよび発現ベクターがそのような遺伝子融合物を含む限り、本発明に含まれる。

本発明はまた、新規ポリヌクレオチドを含むよう遺伝的に改変された宿主並びに調節配列に作動性に連関された新規ポリヌクレオチドを含むよう遺伝的に改変された宿主、すなわち調節配列が新規ポリヌクレオチドの発現を制御するような様式で調節配列と連関されたものを含む。また調節配列が遺伝子融合物の発現を制御するような様式で調節配列と連関された、またはそのような調節配列の不存在の、遺伝子融合物を含む宿主が含まれる。これらの宿主は、ウイルスまたは細胞であり得、ここで後者は、限定することなく、細菌、酵母、原生生物、真菌、藻類、植物細胞、および動物細胞およびそれに由来する高等生物を含む。

本発明は追加的に、哺乳動物でＣＸＣＲ１またはＣＸＣＲ２レセプターに関与するＣＸＣケモカイン介在病理を処置することにおける、新規ポリペプチドの使用（用途）を含む。同様に、本発明は、ＣＸＣＲ１またはＣＸＣＲ２レセプターに関与するＥＬＲ−ＣＸＣケモカイン介在病理の処置方法であって、罹患哺乳動物に、有効量の新規ポリペプチドのいずれかを投与することを含む方法を含む。新規ポリペプチドのいずれかの生物学的活性量を含む医薬組成物がまた本発明に含まれる。
最後に、新規ポリペプチドを生産および精製する方法がまた、本発明に含まれる。

ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１ＲのＧ３１Ｐアナログは、ＣＸＣＬ８が末梢血液好中球に結合することの有能な阻害剤である。ウシ末梢血液好中球（８７−９３％純度）を、（上方パネル）４℃で２時間、ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒアナログ（１０ｎｇ／ｍｌ）または培地（ｍｅｄ）単独に曝露し、次いで洗浄し、ビオチニル化ＣＸＣＬ８（^ｂｉｏｔＣＸＣＬ８；１０００ｎｇ／ｍｌまたは１２９ｎＭ）と同様にインキュベートした。ＣＸＣＬ８のこれらのレベルは、肺炎パスツレラ症を有する動物の肺組織中に見出されるものに近い（ｒｅｆ８，９）。^ｂｉｏｔＣＸＣＬ８の細胞に結合するレベルは、ＥＬＩＳＡ技法を使用して決定した。ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ内の示されるアミノ酸置換は、以下を含む：Ｇ３１Ｐ；Ｐ３２Ｇ；Ｔ１２Ｓ／Ｈ１３Ｐ／Ｇ３１ＰおよびＴ１２Ｓ／Ｈ１３Ｐ／Ｇ３１Ｐ／Ｐ３２Ｇ。Ｐ３２ＧではなくＧ３１Ｐアナログは、ＣＸＣＬ８の、細胞へ結合する高度に有効なアンタゴニストであった。両Ｇ３１ＰおよびＰ３２Ｇアナログについて、Ｔ１２ＳおよびＨ１３Ｆの追加的置換は、これらのＣＸＣＬ８アンタゴニスト活性を減少させた（下方パネル）。好中球を同時的に、４５分間４℃で、種々の濃度のＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐまたは非標識ＣＸＣＬ８および〜２０ｐＭ^１２５ＩＣＸＣＬ８に曝露した。^１２５Ｉ−ＣＸＣＬ８のこのレベルは、細胞の高アフィニティＣＸＣＬ８レセプターをほとんど飽和させるよう選択した（データ示さず）。細胞結合 ^１２５Ｉ−ＣＸＣＬ８のレベルは、γカウンターを使用して評価した。データは、ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１ＰがＣＸＣＬ８よりも好中球について実質的により高いアフィニティを有したことを明確に指摘する。ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐは、好中球化学誘引応答またはβグルクロニダーゼ放出のアゴニストではない。ＣＸＣＬ８およびＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１ＲのＧ３１Ｐ、Ｐ３２Ｇまたは組み合わせＧ３１Ｐ／Ｐ３２Ｇアナログを、新しく精製したウシ末梢血液好中球を使用してこれらの好中球アゴニスト活性について試験した。（上方パネル）それぞれのタンパク質への化学走性応答を、ミクロ化学走性アッセイで３０分試験し、そして結果を、方法の節で概説のように、細胞の平均の数（＋／−ＳＥＭ）／４０ｘ対物顕微鏡視野として表現した。Ｇ３１ＰおよびＧ３１Ｐ／Ｐ３２Ｇアナログの両方は、識別可能な化学走性活性をほとんど呈さず、一方Ｐ３２Ｇアナログは、１００ｎｇ／ｍｌで実質的な応答を刺激した。（下方パネル）好中球を、種々の用量のそれぞれのアナログに３０分間曝露し、次いで細胞性分泌産物を、方法の節で提示のように、色素生産性基質ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニドを使用して、βグルクロニダーゼについてアッセイした。βグルクロニダーゼの総細胞蓄積を、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００で細胞溶解された細胞のアリコートから決定した。それぞれの処置での酵素放出を、総細胞蓄積のパーセントとして表現する。アナログは、実質的なアゴニスト活性を有しなかったが、しかしＣＸＣＬ８それ自体は、有意な酵素放出を誘導した。ホルボール−１２，１３−ミリステートアセテートおよびカルシウムイオン透過担体Ａ２３１８７での陽性対照処置は、４２＋／−６％酵素放出を誘導した。ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ−Ｇ３１Ｐは、ＥＬＲ−ＣＸＣケモカイン介在好中球化学誘引の高度に有効なアンタゴニストである。ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐの、いくつかのＥＬＲ−ＣＸＣケモカインへのウシ好中球の化学走性応答を阻止する能力は、２０分ミクロ化学走性アッセイを使用して測定した。（左パネル）細胞を同時的に、ＣＸＣＬ８（１μｇ／ｍｌ）および種々の濃度のアナログに曝露した。ＣＸＣＬ８に応答した細胞の数は、図２におけるように、化学走性アッセイ膜の直接的カウンティングによって評価した。ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐは、ＣＸＣＬ８への細胞の応答の高度に有効な競合的阻害剤であった。（中央パネル）ウシ好中球の、ヒトＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ５、またはＣＸＣＬ８による化学誘引の用量−応答曲線。それぞれのケモカインは、最大１−１０ｎｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌでの二相性活性パターンを呈した。（右パネル）ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐの、１ｎｇ／ｍｌのヒトＣＸＣＬ５またはＣＸＣＬ１または１０ｎｇ／ｍｌのヒトＣＸＣＬ８への細胞の応答を阻止する能力を、前記のように評価した。ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐは効果的に、それぞれのＥＬＲ−ＣＸＣケモカインと拮抗し、完全な阻害が３−２０ｎＭのＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐにより達成される。ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ−Ｇ３１Ｐは、肺炎性気道内、またはエンドトキシン誘導性乳房炎で発現される、ＣＸＣＬ８および非ＣＸＣＬ８化学誘引剤の活性を阻止する。モノクローナル抗ＩＬ８抗体８Ｂ６またはＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ−Ｇ３１Ｐの、肺炎パスツレラ症を有する動物の気道内またはエンドトキシン誘導性乳房炎を有するウシの乳房槽中に発現される化学誘引剤への、好中球応答に及ぼす影響を、図３におけるように評価した。（Ａ）希釈した（１：１０）、肺炎のウシの病変性肺葉からの気管支肺胞洗浄流体（ＢＡＬＦ）（ＰＮＥＵＭＯＮＩＡ）または乳房炎を有するウシからの乳頭槽洗浄流体（ＭＡＳＴＩＴＩＳ）を、そのまま（ｎｏｎｅ）または抗ＣＸＣＬ８ＭＡｂ８Ｂ６（５μｇ／ｍｌ）またはＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐ（Ｇ３１Ｐ；１または１０ｎｇ／ｍｌ）での処置後、培地単独と比較した化学走性活性を試験した。両方のサンプルについて、Ｍａｂ８Ｂ６抗体は独力で、サンプル中の化学走性活性の〜７４％を中和し、一方ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐは、９３−９７％まで応答を減少させた。（Ｂ）これらの結果を、代替的戦略を使用して確認するため、我々は病変性ＢＡＬ流体を、モノクローナル抗体８Ｂ６−免疫アフィニティマトリクスで吸収し、ＣＸＣＬ８のこれらの含量の９９％以上除去し、次いで両方のこれらの残留化学走性活性を試験し、そしてＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐの、これらの残留非ＣＸＣＬ８化学走性活性に拮抗する能力を試験した。サンプル中の総および残留化学走性活性の用量依存性阻害があり、このことは、ＣＸＣＬ８および非ＣＸＣＬ８化学誘引剤がこれらの病変で発現されることを指摘する。ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ−Ｇ３１Ｐは、インビボのエンドトキシン誘導性炎症性応答を除去できる。２週齢ホルスタインウシを、ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ−Ｇ３１Ｐ（７５μｇ／ｋｇ）の静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎ．）または筋肉内（ｉ．ｍ．）注射の前、および種々の時間後の皮膚内エンドトキシン（１μｇ／部位）チャレンジに対するこれらの好中球炎症性応答について試験した。１５時間エンドトキシン反応部位ビオプシーを、処置の０、１６、４８および７２時間後取得し、そして切片あたり９つの４０ｘ対物顕微鏡視野中の好中球の数をカウントすることによって決定されるような、好中球応答の組織病理学的評価のために加工した。（左パネル）処置前（０ｈ）、および処置４８時間後の、細網皮膚内の血管周辺のエンドトキシンチャレンジへの組織応答の光学顕微鏡図。多数の好中球は、処置後ではなく処置前組織中で、細網皮膚内脈管構造周辺に蓄積した。（Ｂ）それぞれの経路による、ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ−Ｇ３１Ｐ送達の前（０ｈ）または後（１６、４８、７２ｈ）のエンドトキシンチャレンジへの好中球応答のグラフ的提示。＊＊または＊＊＊はそれぞれ、当初コントロール前処置応答に対するｐ＜０．０１または０．００１。アトピー性喘息またはアトピー性非喘息ドナーの血液（左パネル）または高好酸球症を有する対象（右パネル）から精製した好酸球を、組換えウシＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐ（Ｇ３１Ｐ）の指摘される用量の存在または不存在下、組換えヒトＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ５またはＣＣＬ１１へのこれらの応答について評価した。Ｇ３１Ｐの低用量は、これらの細胞の、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２リガンドのそれぞれへの応答を阻止することができなかったが、非関連ＣＣＲ３リガンドＣＣＬ１１／エオタキシンへの好酸球の応答への影響は有しなかった。健康体ドナーの末梢血液からの好中球を、ウシＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐ（Ｇ３１Ｐ；１０ｎｇ／ｍｌ）の存在または不存在下の、組換え体ヒトＣＸＣＬ８またはＣＸＣＬ５へのこれらの応答について試験した。Ｇ３１Ｐは、両方のリガンドへの好中球の応答を阻止した。

発明の詳細な記載
（以下の省略形を本開示を通じて使用する：ＡＲＤＳ、急性呼吸窮迫症候群；ＢＡＬＦ、気管支肺胞洗浄流体；ＢＨＲ、Bolton-Hunter試薬；CXCR1、CXCR2、CXCL８それぞれレセプターＡ、Ｂ；ＥＬＲ、グルタミン酸−リジン−アルギニンモチーフ；ＣＸＣＬ１、成長関連性癌遺伝子アルファ、ＣＸＣＬ４、血小板因子−４；ＣＸＣＬ５、上皮誘導性好中球由来好中球活性化剤−７８；ＣＸＣＬ６、顆粒球化学走性タンパク質−２；ＣＸＣＬ８、インターロイキン−８；ｆＭＬＰ、ホルミルメチオニル−ロイシルプロリン細菌性トリペプチド；ＩＰＴＧ、イソプロピル−チオ−Ｄ−ガラクトピラノシド；ＭＩＰ−２、マクロファージ炎症性タンパク質−２；ＰＭＳＦ、フェニルメチルスルホニルフルオリド；ＴＭＢ、テトラメチルベンジジン）

ウシＣＸＣＬ８のアミノ末端途切れを、アミノ酸１１でのリジンのアルギニンへの置換と組み合わせるとき（すなわちＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ）、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２レセプターアフィニティの劇的な増加が明らかであり、その結果ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒは競合的に、両方のレセプターへの多重リガンドの結合を阻害する（引用によりここに含めるLi, F.,and J.R.Gordon.2001.Biochem. Biophys. Res. Comm. 286:595-600）。いくつかのＣＸＣケモカインのレセプターシグナル伝達ＥＬＲモチーフ（例えばヒトＣＸＣＬ８のアミノ酸４−６）への途切れは、これらを温和な（ＣＸＣＬ８_{（６−７２）}）ないし中度の（ＣＸＣＬ１_{（８−７３）} ）レセプターアンタゴニストへトランスフォームする（McColl and Clark Lewis 1999; Moser, B. et al., 1993. J. Biol. Chem. 268:7125-7128）。ここに開示のように、第２のアミノ酸置換、すなわちグリシン３１のプロリン残基へのものの、ウシＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒへの導入は（すなわちＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐ）、このＣＸＣＬ８アナログをウシおよびヒトＥＬＲ−ＣＸＣケモカイン応答へ非常に高アフィニティアンタゴニストへとさせる。それは十分に、細菌性またはエンドトキシン誘導性炎症病巣内に発現されるＥＬＲ−ＣＸＣケモカインの完全なアレイを拮抗し、そしてインビボのエンドトキシン誘導性炎症を阻止する。

以下の議論は、原則としてウシ好中球を取り扱うが、他の哺乳動物（ヒトを含む）炎症性細胞はまた、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２レセプターを呈し（たとえばBenson, M. et al., 1999. Pediatr. Allergy Immunol.10:178-185参照)、そのためＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１による阻害に脆弱である。よって、本発明は、哺乳動物ＥＬＲ−ＣＸＣケモカイン介在病理に広い適用可能性を有する。

本発明の代替的実施態様において、結合部位で同じ３次元構造を有する化合物を、アンタゴニストとして使用し得ることを想起される。化学構造の３次元分析を使用し、ケモカインについての結合部位を含む活性部位の構造を決定する。ハイスループットスクリーニングにより導き出される化学物質を使用し、ＣＸＣＲ２の選択的アンタゴニストを生成および化学的に最適化した（引用によりここに含めるJ Biol Chem, 1998, 273:10095）。類似のアプローチをまた使用し、ＣＣＲ３アンタゴニストを生成した（引用によりここに含めるJ Biol Chem 2000, 275:36626）。

Wells et al(引用によりここに含めるJ Leuk biol, 1996, 59;53)は核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）を使用し、ＥＬＲおよび非ＥＬＲＣＸＣケモカインを含む、ＣＸＣＲについてのリガンドの３次元構造を詳細に研究した。これらのＮＭＲ情報で、Wells et alは多重ケモカインのレセプター結合部位内の多重置換を生成し、その結果これらは実質的にリガンドのレセプター特異性を変化させることができた。

材料および方法
試薬および供給
以下の試薬を、商業的に購入した：グルタチオン−セファロース、発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ、Sephadex G-25(Amersham-Pharmacia-Biotech, Baie d'Urfe, PQ)、Bolton-Hunter試薬、タンパク質ビオチニル化キット（Pierce Scientific, Rockford, IL）、シーケンシングベクターpBluescript II KS, PfuTurbo（登録商標）DNAポリメラーゼ(Stratagene, La Jolla, CA)、部位特異的突然変異誘発キット（QuickChange(登録商標)；Boerhinger-Mannheim Canada,Laval,PQ）、アプロチニン、ベンゼン、カルシウムイオン透過担体A23187、クロルアミンＴ、サイトカラシンＢ、ジメチルホルムアミド、エンドトキシン(Escherichia coliリポ多糖類、血清型0127B8）、イソプロピル-チオ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、ロイペプチン、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド、鉱油、シリコンオイル、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ホルボール−１２，１３−ミリステートアセテート（ＰＭＡ）およびTriton X-100(Sigma Chemical Co,Mississauga, ON)、Diff-Quick染色キット（American Scientific Products,McGaw Pk, IL)、ヒトCXCL1、ＣＸＣＬ５、およびＣＸＣＬ８（R & D Systems Inc, Minneapolis, MN)、ホースラッディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のコンジュゲートした抗ウサギＩｇ（Zymed, South San Francisco, CA)、ＤＭＥＭ、ＨＢＳＳ（Gibco, Grand Island, NY)、ＨＲＰ−ストレプトアビジン(Vector Labs, Burlingame,CA)、ＡＢＴＳ酵素基質(Kirkegaard & Perry Labs, Gaithersburg, MD)、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、およびLymphocyte Separation Medium（ICN Pharmaceuticals, Aurora, IL)。

ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒアナログの生成。高アフィニティＣＸＣＲ１／ＣＸＣＲ２リガンドＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ、およびそのＴ１２Ｓ／Ｈ１３Ｆアナログを、Li and Gordon(2001、前掲）に記載の方法にしたがって生成した。これらのタンパク質のＧｌｙ３１Ｐｒｏ（Ｇ３１Ｐ）、Ｐｒｏ３２Ｇｌｙ（Ｐ３２Ｇ）、およびＧ３１Ｐ／Ｐ３２Ｇアナログを同様に、適当な正および逆オリゴヌクレオチドプライマー（表１）でＰＣＲを使用して部位特異的突然変異誘発によって生成した。それぞれの反応からの産物を、ＤｐｎＩで消化し、ベクターｐＧＥＸ−２Ｔにライゲートし、ＨＢ１０１細胞にトランスフェクトし、そしてこれらの配列を商業的に確認した（Plant Biotechnology Institute, Saskatoon）。簡単には、組換え体細菌を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（２ｍＭＰＭＳＦ、２μｇ／ｍｌアプロチニン、および２μｇ／ｍｌロイペプチン）の存在下で細胞溶解し、そしてCaswell et alの方法（Caswell, J.L.,D.M. Middleton, and J.R.Gordon.1998.Vet. Immunol. Immunophath. 67:327-340）にしたがってグルタチオン−セファローズビーズを使用して、上清中の組換え融合タンパク質をアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒアナログを、トロンビン消化によってＧＳＴ融合タンパク質から切断し、リン酸緩衝生食水（ＰＢＳ）に対して透析し、商業的エンドトキシン除去カラムを介して流し、それからポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびヤギ抗ウシＣＸＣＬ８抗体（Dr. M. Morseyによって提供される）でのウェスタンブロットによって特徴付けた。それぞれの精製したアナログは、〜８ｋＤａの分子量を有し、ウェスタンブロットで抗ＣＸＣＬ８抗体によって特異的に認識され、そして＞９６％の相対純度を有し、ＰＡＧＥゲルのデンシトメトリック分析によって決定される通りである。

組換え体タンパク質の標識
我々は、好中球へのアナログ結合の当初調査のため^ｂｉｏｔＣＸＣＬ８および相対的レセプターアフィニティのより遅い段階のアッセイのため^１２５Ｉ−ＣＸＣＬ８を使用した。ＣＸＣＬ８をビオチニル化し、そしてLi and Gordon(2001前掲）で注記されるとおり、ビオチン置換のレベルを商業的キットを使用して決定した。^ｂｉｏｔＣＸＣＬ８を、ＣＸＣＬ８のモルあたり２．１５モルのビオチンで置換した。ＣＸＣＬ８を、Bolton-Hunter Reagent（ＢＨＲ）法を使用して^１２５Ｉで標識した。詳細に記載される通りである(Li and Gordon 2001前掲）。標識したタンパク質を、Sephadex G50上のクロマトグラフィーにより非取り込み^１２５Ｉ−ＢＨＲから分離し、そして標識したＣＸＣＬ８を好中球についてのその相対的アフィニティ、そして結合平衡を達成するため必要な時間を特徴づけた。Li and Gordon(2001前掲）に記載されるとおりである。

ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒアナログ結合アッセイ。
細胞（８５−９３％好中球）を、Caswell法（Caswell, J.L. et al., 1998. Vet. Immunol. Immunopath.67:327-340）にしたがってウシの血液から精製した。予備実験において、我々は、我々のアナログは、トリパンブルー色素排除によって決定されるように、好中球の生存性に影響しないことを実証した。広いアナログ調査のため、ＨＢＳＳ／０．５％ＢＳＡ中の好中球を、２時間４℃でアナログとインキュベートし、冷ＤＭＥＭで洗浄し、それからさらに２時間４℃で^ｂｉｏｔＣＸＣＬ８（１０００ｎｇ／ｍｌ）とインキュベートした。細胞と結合したビオチンを、洗浄した細胞をアルカリフォスファターゼのコンジュゲートしたストレプトアビジン（１：７００希釈）と、それからＡＢＴＳ酵素基質とインキュベートすることにより検出した。サンプルのＯＤ_４０５を、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して決定した。培地処置した好中球は、十分な^ｂｉｏｔＣＸＣＬ８にルーチンに結合し、〜０．５−０．６のＯＤ_４０５を生成した。

ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐでの深い研究のため、我々は、非標識ＣＸＣＬ８またはＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐでの結合阻害アッセイで、^１２５Ｉ−ＣＸＣＬ８を使用した。予備実験で、我々は、^１２５Ｉ−ＣＸＣＬ８についての好中球の結合平衡時間は〜４５分であり、そして２０ｐＭの^１２５Ｉ−ＣＸＣＬ８はちょうど細胞の高アフィニティレセプターを飽和することを決定した。こうして、我々のアッセイでは、１０^６の精製好中球を２０ｐＭの^１２５Ｉ−ＣＸＣＬ８および種々の濃度の非標識競合剤リガンドと氷上で４５分間インキュベートした。細胞を次いで、シリコンオイル中の６％鉱油によって沈降させ、そしてγカウンターを使用して細胞が会合した放射性リガンドのレベルを決定した。^１２５ＩＣＸＣＬ８の、細胞ヘの非特異的結合を、サンプルのあるセット中に２００倍モル過剰の非標識リガンドを含めることによって、それぞれのアッセイで評価した。この値を使用し、特異的結合のパーセントを計算した（Coligan, J., A. Kruisbeek, D.Margulies, E. Shevach, and W. Strober. 1994. Current Protocols in Immunology. Johon Wiley & Sons, New York）。

好中球βグルクロニダーゼ放出アッセイ。好中球βグルクロニダーゼアッセイが詳細に報告された（Li and Gordon 2001,前掲）。簡単には、サイトカラシンＢで処置した好中球を、ＣＸＣＬ８アナログと３０分間インキュベートし、次いでこれらの分泌産物を、酵素について比色定量的にアッセイした。βグルクロニダーゼ放出を、総細胞含量のパーセントとして表現し、培地で処置した細胞を０．２％（ｖ／ｖ）Triton X-100で細胞溶解することによって決定した。陽性コントロール刺激ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＡ２３１８７（１μｇ／ｍｌ）での好中球チャレンジは、総細胞性βグルクロニダーゼストアの４２＋／−６％放出を誘導した。

炎症性病変からのサンプル。我々は、診断された臨床的繊維素性化膿性肺炎性マンハイミオシス（Caswell et al., 1997）を有するウシ（ｎ＝４）の肺から気管支肺胞洗浄流体（ＢＡＬＦ）、並びに実験的エンドトキシン誘導性乳房炎（Waller, K.P.1997.Vet.Immunol. Immunopathol.57:239-251）を有するウシ（ｎ＝４）からの乳頭槽洗浄流体を取得した。予備的用量−応答実験では、我々は５μｇのエンドトキシンが強い（〜７０−８０％最大）乳房好中球応答を誘導することを決定した。こうして、報告された実験では、乳房炎を５μｇのエンドトキシンまたは担体培地単独（生食水；３ｍｌ体積）の、乳汁分泌しないホルスタイン乳牛の乳房槽への注入によって誘導し、そして１５時間後に浸潤物を３０ｍｌＨＢＳＳでの洗浄によって槽から回収した。ＢＡＬＦおよび乳頭槽洗浄流体からの細胞を、遠心分離によって沈殿させ、そして示差カウントを実施した。非処置およびＣＸＣＬ８枯渇した（以下）洗浄流体を、ＥＬＩＳＡ（ＣＸＣＬ８のみ）および化学走性アッセイによってこれらのケモカイン含量について評価した。

好中球化学走性アッセイ。ミクロ化学走性アッセイを、既知方法にしたがって（Caswell et al., 1998; Cairns,C.M.et al. 2001.J.Immunol.167:57-65）、ポリビニルピロリドン−フリー５μｍポアサイズポリカーボネートフィルターを使用して二反復修飾Boydenミクロ化学走性チャンバーで稼動させた。それぞれのサンプルについて、２０−３０分にわたり膜に移動した細胞の数を、少なくとも９つの４０ｘ対物視野の直接カウンティングによって数え、そして結果を平均細胞の数／４０ｘ視野（＋／−ＳＥＭ）として表現した。化学誘引剤は、ウシまたはヒトＣＸＣＬ８、ヒトＣＸＣＬ５およびＣＸＣＬ１、肺炎マンハイミオシスＢＡＬＦおよび乳房炎洗浄流体（ＨＢＳＳ中１：１０−１：８０希釈）を含んだ。一方アンタゴニストは、マウス抗ヒツジＣＸＣＬ８抗体８Ｍ６（Dr. P. Wood, CSIRO, Australiaによって一般に提供された）またはＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒアナログを含んだ。いくつかのアッセイでは、我々は抗体（５μｇ／ｍｌ）とサンプルを６０分間氷上で前インキュベートした（Gordon, J. R. 2000. Cell Immunol. 201:42-49）。その他には、我々は、８Ｍ６抗体およびタンパク質−Ａ−セファローズビーズを有するＣＸＣＬ８特異的免疫アフィニティマトリクスを生成し、そしてこれらを過剰に使用し、サンプルを吸収した（Caswell et al., 1997; Gordon, J.R., and S.J. Galli. 1994. J. Exp. Med. 180:2027-2037）;ＣＸＣＬ８枯渇の程度を、処理サンプルのＥＬＩＳＡによって確認した。組換え体アンタゴニストでのアッセイのため、阻害剤を直接的に、試験直前にサンプルと混合した。

ＣＸＣＬ８ＥＬＩＳＡ。我々のＥＬＩＳＡのため、ＭＡｂ８Ｍ６を捕捉抗体として、ウサギ抗ヒツジＣＸＣＬ８抗血清（またP.Wood, CSIROから）を二次抗体として、およびＨＲＰのコンジュゲートした抗ウサギＩｇ、およびＴＭＢを検出システムとして、Caswell et al.(1997)に記載されるように使用した。それぞれのサンプルの一連希釈物を、３反復でアッセイし、そしてそれぞれのアッセイは、組換え体ウシＣＸＣＬ８標準曲線を含んだ。

インビボでのエンドトキシン応答のＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐ遮断。我々は、連続的な一連の１５時間皮膚試験を使用し、ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐの、インビボのエンドトキシン誘導性炎症性応答を阻止する能力を試験した。それぞれの試験のために、我々は、１００μｌ生食水中の１μｇのエンドトキシンで、〜２週齢健康ホルスタインウシに皮膚内にチャレンジし、次いで１５時間後、局所麻酔（リドカイン）下６ｍｍパンチビオプシーをとり、そして組織病理学のためこれらを加工した（Gordon and Galli, 1994)。最初の（内部陽性コントロール）試験後、我々はそれぞれの動物の皮下に、筋肉内に、または静脈内に、生食水中のＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐ（７５μｇ／ｋｇ）を注射し、次いでこれらを再び、前記のようにエンドトキシンでチャレンジした。動物を、全部で４回エンドトキシンでチャレンジし、その結果１５時間反応部位ビオプシーを、処置０、１６、４８、および７２時間後取得した。ビオプシーを、ルーチンな方法によって６μｍパラフィン切片に加工し、Giemsa溶液で染色し、そしてブラインド様式で４００ｘ拡大で試験した（Gordon and Galli, 1994; Gordon, J.R.2000.J.Allergy Clin. Immunol. 106:110-116）。４０ｘ対物顕微鏡視野あたりの好中球の平均数を、皮膚、乳頭（表面）、中間、および細網（深い）皮膚内の３つの異なる深さで決定した。

統計分析。多重群のデータを、ＡＮＯＶＡおよびpost-hoc Fisher protected最小有意差検定（ＰＬＳＤ）によって分析し、一方２群比較をスチューデントｔ検定を使用して実施した（両側検定）。結果を平均＋／−ＳＥＭとして表現する。

結果
ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐは、好中球ヘのＣＸＣＬ８結合を競合的に阻害する。我々は、それぞれのＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒアナログの、好中球上のＣＸＣＬ８レセプターへの結合する能力を試験し、そしてそれによってリガンドとしてのＣＸＣＬ８と競合する。我々の当初の試験では、われわれは^ｂｉｏｔＣＸＣＬ８結合阻害アッセイを実施し、細胞をアナログと（１０ｎｇ／ｍｌ）２時間４℃で、^ｂｉｏｔＣＸＣＬ８（１μｇ／ｍｌ）への曝露に先立ちインキュベートした。ＣＸＣＬ８のこのレベルは、実験的肺炎性マンハイミオシスを有するヒツジの肺組織中に見出されるものと近い（Caswell, J.L.1998. The role of interleukin-8 as a neutrophil chemoattractant in bovine bronchopneumonia. Ph.D. thesis, Department of Veterinary Pathology, University of Saskatchewan）。我々はＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐは、このアッセイではＣＸＣＬ８結合の強力なアンタゴニストであることを見出し（図１）、その結果１０ｎｇ／ｍｌのＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐは、その後の細胞ヘの^ｂｉｏｔＣＸＣＬ８結合の〜９５％を阻止した。この用量で試験したとき、ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｐ３２ＧはＣＸＣＬ８結合のたった４８％を阻止し、一方非標識ＣＸＣＬ８それ自体はその後の細胞ヘの^ｂｉｏｔＣＸＣＬ８結合の３０％を競合的に阻害した。ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１ＰまたはＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｐ３２Ｇへの、Ｔｈｒ１２およびＨｉｓ１３での追加的アミノ酸置換の導入は、アナログのアンタゴニスト活性を、実質的に減少させた（図１）。このデータは明確に、好中球の、ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐとの前インキュベーションは、ＣＸＣＬ８のその後の結合を強く下方調節することを示唆する。

さらに詳細に、ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１の、ＣＸＣＬ８の結合を阻害する能力をマッピングするために、我々の次のセットの実験において、我々は同時的に細胞を、^１２５ＩＣＸＣＬ８および種々の用量のＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐまたは非標識ＣＸＣＬ８に曝露した。我々はＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐが、細胞へ２０ｐＭの^１２５Ｉ−ＣＸＣＬ８の結合を阻害することにおいて約２桁野生型ＣＸＣＬ８よりもより有効であることを見出した（図１）。標識したリガンド結合の５０％阻害のための濃度（ＩＣ_５０）は、非標識ＣＸＣＬ８について〜１２０ｐＭであり、そしてＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐについて〜４ｐＭであった。このデータは、ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐは好中球ヘのＣＸＣＬ８結合の非常に強力な競合的阻害剤であることを示唆する。

ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐは好中球アゴニスト活性を呈しない。ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐは確かに、好中球ＣＸＣＬ８レセプターについての高アフィニティリガンドであるが、それはアゴニストまたはアンタゴニストとして同等に良さそうであろう。こうして我々の次の実験は、我々が生成したＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒアナログの可能性のあるアゴニスト活性と取り組み、インビトロでこれらの細胞を化学誘引するまたは好中球顆粒加水分解酵素βグルクロニダーゼの放出を誘導するこれらの能力によって測定されるとおりである（図２）。我々は、１００ｎｇ／ｍｌでさえも、ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐが弱い化学誘引剤であり、１または１００ｎｇ／ｍｌのＣＸＣＬ８によってそれぞれ誘導される応答の、１３．９＋／−４％または５．４＋／−２％を誘導する（ｐ＜０．００１）ことを見出した。１００ｎｇ／ｍｌで、ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｐ３２Ｇアナログは、明瞭に実在する（ＣＸＣＬ８応答の３８．３＋／−２％）応答を誘導し、一方組み合わせＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐ／Ｐ３２Ｇアナログはまた有効な化学誘引剤ではなかった。我々はβグルクロニダーゼ放出を誘導するこれらの能力を評価するとき、我々はＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒアナログがメディエーター放出を誘導することにおいてＣＸＣＬ８と同じ位有効でないことを見出した。実際、我々は＜１０ｎｇ／ｍｌでこれらのいずれかでのバックグラウンド放出のみを、そして１００ｎｇ／ｍｌでＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐ／Ｐ３２Ｇのみが有意な好中球応答を誘導することを見出した（図２）。組合わせＣＸＣＬ８競合的阻害および好中球アゴニストデータを考慮して、以後、我々はＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐに注目する。

ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐは、ＣＸＣＲ１とＣＸＣＲ２リガンド両方への好中球化学走性応答を阻止する。不適当なＥＬＲ^＋ケモカイン発現のほとんどの病原性効果は、炎症性細胞の、組織ヘの誘引である。こうして、我々は次に、ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐの、高用量のＣＸＣＬ８への好中球の化学走性応答へ及ぼす影響について評価した（図３）。ヒツジおよびウシでのインビボ観察から予測されるように（３３）、１μｇ／ｍｌ（１２９ｎＭ）ＣＸＣＬ８は非常に強力に化学誘引性であったが、非常に低用量のＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐでさえこの応答を緩和した。１２．９ｐＭのＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐの添加は、細胞の化学走性応答を〜３３％減少させた。ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐについての、これらの条件下でのＩＣ_５０は、〜０．１１ｎＭであったが、一方このＣＸＣＬ８応答の完全な阻止は、１０ｎＭのＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐで達成された。

我々は、ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐの、より繊細なウシＣＸＣＬ８チャレンジへの応答の阻止における効験を試験したとき、我々はまた、研究を延長し、ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐの、ヒトＣＸＣＬ８への並びにヒトＣＸＣＲ２特異的リガンドＣＸＣＬ１およびＣＸＣＬ５への好中球応答を阻止する能力を評価した。これらのそれぞれは、膵臓炎（Hochreiter, W.W. et al. 2000. Urology. 56: 1025-1029）またはＡＲＤＳ（Villard et al., 1995）に罹患した患者の組織中では〜１−１０ｎｇ／ｍｌで発現される。我々は、ウシ好中球は〜１ｎｇ／ｍｌのｈＣＸＣＬ１またはｈＣＸＣＬ５に応答性であり、そして同様に１０ｎｇ／ｍｌのｈＣＸＣＬ８に応答性であり（図３）、だから我々はこれらの用量を用い、ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐの、これらのリガンドの好中球応答への影響を試験した。ｈＣＸＣＬ１およびｈＣＸＣＬ５への好中球応答は、それぞれ０．２６および０．０６ｎＭのＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐによって５０％減少し、一方ｈＣＸＣＬ８へのこれらの応答は、０．０４ｎＭのＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐによって５０％減少した（図３）。このデータは、ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐは、ケモカインのＥＬＲ−ＣＸＣサブファミリーの多重数の作用に拮抗することができることを示唆する。

ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐは細菌性肺炎または乳房炎病変で発現される好中球ケモカインの有効なインビトロアンタゴニストである。我々は、我々のアンタゴニストがインビボの複合炎症性環境内で発現される好中球化学誘引のアレイを阻止し得る程度を試験しようとした。こうして、我々はケモカインに駆動される好中球活性化が病理の進行に重要に貢献する２疾患、乳房炎および肺炎性マンハイミオイスを選択した。我々は乳房炎のエンドトキシンモデルを利用し（Persson, K. et al., 1993. Vet. Immunol. Immunopathol. 37: 99-112）、ここで我々は５μｇのエンドトキシン／乳頭槽を注入しそして１５時間後それぞれの槽を洗浄した。好中球は、エンドトキシンおよび生食水コントロール貯蔵室からのそれぞれ〜８２および〜６％の細胞を含み、残りの細胞の大部分はマクロファージを含んでいた。希釈した（１：１０）洗浄流体は、インビトロで強い好中球化学走性応答を誘導し、そして抗ＣＸＣＬ８抗体の、サンプルヘの添加は最大で、培地コントロールと比較して、７３＋／−８％までこれらを減少させた（図４Ａ）。他方、１ｎｇ／ｍｌのＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐの、サンプルへの添加は、これらの化学走性活性を９７％＋／−３％まで減少させた。

好中球はまた、進行した肺炎性マンハイミオシスを有するウシのＢＡＬＦから回収した細胞の９３＋／−１２％を構成した。インビトロで試験したとき、これらのサンプルは非常に強く好中球について化学走性であり、そして抗ＣＸＣＬ８抗体の添加は最大で、７３＋／−５％までこれらの好中球化学走性活性を減少させた（図４Ａ）。これらのＢＡＬＦサンプルの、１または１０ｎｇ／ｍｌのＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐでの処置は、培地コントロールと比較して、それぞれ７５＋／−９または９３＋／−９％まで好中球応答を減少させた。このデータは、ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐがサンプル中のＣＸＣＬ８および非ＣＸＣＬ８化学誘引剤の作用を阻止することを示唆する。

代替的戦略を使用してこれらの観察を確認するため、我々は次に、免疫アフィニティマトリクスを使用して細菌性肺炎ＢＡＬＦサンプルからＣＸＣＬ８を枯渇させ、次いでサンプル中の残留好中球化学走性活性を阻止することにおける、ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐの効験を評価した（図４Ｂ）。非処置病変ＢＡＬＦサンプルは、３２１５＋／−２７５ｐｇ／ｍｌのＣＸＣＬ８を含んだが、一方免疫アフィニティ吸収ＢＡＬＦは、２４＋／−１７ｐｇ／ｍｌのＣＸＣＬ８を含んだ。この一連の実験では、ＣＸＣＬ８枯渇ＢＡＬＦサンプルへの好中球応答は、非吸収サンプルへのこれらの応答の６５．４＋／−４％であった。ＣＸＣＬ８は臨床ケースのアレイから取得される肺炎性マンハイミオシスＢＡＬＦにおける好中球化学走性活性のほんの１５％貢献できたことが既知である（Caswell et al.,2001）。ＣＸＣＬ８枯渇処置はＣＸＣＬ８を除去するにおいて＞９９％有効であったが、これらのサンプル中にかなりの量の好中球化学走性活性が残留し、そして１ｎｇ／ｍｌのＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐの添加は完全に、これらの累積的効果を排除した（図４Ｂ）。このデータはあいまいでなく、ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐがまた、これらのサンプル中で発現される非ＩＬ−８化学誘引剤のスペクトルに拮抗することを確認した。

ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐは、インビボのエンドトキシン誘導性好中球炎症を阻止することにおいて高度に有効である。我々の最後の実験では、われわれはＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐの、ウシの皮膚におけるエンドトキシン誘導性炎症性応答を阻止する能力、並びにそれが有効である時間枠を評価した。動物を、ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐ（７５μｇ／ｋｇ）の静脈内、皮下または筋肉内注射の１５時間前（内部陽性コントロール応答）、またはその後の３つの異なる時に１μｇの細菌性エンドトキシンで皮膚内にチャレンジした。こうして、１５時間エンドトキシン反応部位のパンチビオプシーを、処置〜１５分前およびそれぞれの動物へのアンタゴニストの注射の１６、４８および７２時間後にとり、そして浸潤好中球の数を、それぞれのビオプシーについて乳頭（表面）、中間および細網皮膚についてブラインド様式で決定した。アンタゴニスト処置に先立ち、強い好中球性炎症応答が、それぞれの動物のエンドトキシンチャレンジ部位で明らかであった（図５）。ビオプシー内で、乳頭皮膚の応答は、すべての動物で温和であり（データ示さず）そして皮膚深度が増加するにつれ進行的により顕著になり、その結果最大炎症（好中球浸潤）を細網皮膚の血管周辺で観察した（図５Ａ）。ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐ処置後、１６時間ビオプシー内で観察された炎症性応答は、これらのそれぞれの前処置応答と比較して、８８−９３％抑制されたが、一方４８時間ビオピシーのこれらは５７％（静脈内）ないし９７％（皮膚内）抑制された。処置７２時間後、静脈内投与したアンタゴニストの効果はなくなったが、一方皮膚内および皮下に処置したウシのエンドトキシン応答はなお〜６０％抑制された。このデータは明かに、ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐは、インビボでのエンドトキシン誘導性炎症性応答の高度に有効なアンタゴニストであり、これらの効果は２−３日続くことができそして送達の経路は、この新規アンタゴニストの薬物動態学に顕著に影響することを指摘する。

我々は、Ｇ３１がまた、ヒト好中球ヘのヒトＥＬＲ−ＣＸＣカモカインＣＸＣＬ８／ＩＬ−８およびＣＸＣＬ５／ＥＮＡ−７８の化学走性効果に拮抗することを見出した。こうして、ＣＸＣＬ８（図６、左パネル）またはＣＸＣＬ５／ＥＮＡ−７８（図６、右パネル）の０．１ないし５００ｎｇ／ｍｌの化学走性活性が本質的に、化学走性アッセイへの我々のアンタゴニストの１０ｎｇ／ｍｌの添加によって完全に阻止された。同様にＧ３１Ｐは、ＣＸＣＲ１／ＣＸＣＲ２陽性好酸球についてのＣＸＣＬ８の化学走性効果を阻止した。我々およびその他は、アトピー性または喘息性対象からの好酸球が両方ともＥＬＲ−ＣＸＣケモカインレセプターを発現し、そしてＣＸＣＬ８に応答性であることを見出した（図７、左パネル）。ＣＣＲ３リガンドＣＣＬ１１／エオタキシンでなく、１００ｎｇ／ｍｌＣＸＣＬ８の、温和なアトピー性、非喘息ドナー（‰９９％純度）の精製末梢血好酸球に及ぼす化学走性効果は、化学走性アッセイヘの１０ｎｇ／ｍｌＧ３１Ｐの添加によって完全に排除された（図７、中央パネル）。高好酸球症患者からの精製好酸球に対して試験したとき（図７右パネル）、Ｇ３１Ｐはこれらの細胞の、ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８またはＣＸＣＬ５／ＥＮＡ−７８への応答を中和した。

このデータは明かに、ウシＧ３１Ｐが、エンドトキシンチャレンジへ応答したインビボで発現されたウシＥＬＲ−ＣＸＣケモカインの有効なアンタゴニストであるが、また十分に、ＣＸＣＬ８およびＣＸＣＬ５(ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２の両方についての既知のリガンド)への、好中球および好酸球ＥＬＲ−ＣＸＣケモカインレセプター応答に拮抗できることを指摘する。

表１．それぞれのＣＸＣＬ８アナログの生成のために使用されたＰＣＲプライマー

考察
我々はここに、ＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐが、多重ＥＬＲ−ＣＸＣケモカインの高アフィニティアンタゴニストであることを実証した。インビトロで、このアンタゴニストは、２つの粘膜性区画（肺、乳房腺）内の温和から強度の炎症性病変に発現された好中球化学走性活性のすべてを阻止し、そしてインビボでのエンドトキシン誘導性炎症性応答を９７％まで阻止した。我々はＣＸＣＬ８を肺炎および乳房炎サンプルでの主要な化学誘引剤として同定したが、また細菌性肺炎サンプル中の走化性の活性の〜３５％が非ＣＸＣＬ８化学誘引剤のためであり、これもまたＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐによって有効に拮抗されることを実証した。げっ歯動物（Tateda et al., 2001;Tsai et al., 2000）、ウシ（Caswell et al.,1997）、およびヒト（Villard et al., 1995）での炎症性応答の研究に基づいて、これらのサンプルが多数のＥＬＲ^＋ＣＸＣケモカイン（例えばＣＸＣＬ５およびＣＸＣＬ８）を含み得、それらに対しＣＸＣＬ８_{（３−７４）}Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐがアンタゴニスト性効果を有し得ることが明かである。

Claims

（ｉ）配列番号３のヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）野生型ウシＣＸＣＬ８配列と実質的に同等なアミノ酸配列を含むＥＬＲ−ＣＸＣケモカインアンタゴニストをコードするヌクレオチド配列であって、ここで
（ａ）アンタゴニストのアミノ酸配列がアミノ酸残基Ｔｈｒ３で開始し、
（ｂ）野生型配列のＬｙｓ１１がアンタゴニストのアミノ酸配列においてＡｒｇで置換され、かつ
（ｃ）野生型配列のＧｌｙ３１がアンタゴニストのアミノ酸配列においてＰｒｏで置換されるもの、
（ｉｖ）野生型ウシＣＸＣＬ８配列と実質的に同等なアミノ酸配列を含むＥＬＲ−ＣＸＣケモカインアンタゴニストをコードするヌクレオチド配列であって、ここで
（ａ）アンタゴニストのアミノ酸配列がアミノ酸残基Ｔｈｒ３で開始し、
（ｂ）野生型配列のＬｙｓ１１がアンタゴニストのアミノ酸配列においてＡｒｇで置換され
（ｃ）野生型配列のＧｌｙ３１がアンタゴニストのアミノ酸配列においてＰｒｏで置換され、かつ
（ｄ）野生型配列のＰｒｏ３２がアンタゴニストのアミノ酸配列においてＧｌｙで置換されるもの、および
（ｖ）野生型ウシＣＸＣＬ８配列と実質的に同等なアミノ酸配列を含むＥＬＲ−ＣＸＣケモカインアンタゴニストをコードするヌクレオチド配列であって、ここで
（ａ）アンタゴニストのアミノ酸配列がアミノ酸残基Ｔｈｒ３で開始し、
（ｂ）野生型配列のＬｙｓ１１がアンタゴニストのアミノ酸配列において、Ａｒｇで置換され、
（ｃ）野生型配列のＴｈｒ１２がアンタゴニストのアミノ酸配列においてＳｅｒで置換され、
（ｄ）野生型配列のＨｉｓ１３がアンタゴニストのアミノ酸配列においてＰｈｅで置換され、かつ
（ｅ）野生型配列のＧｌｙ３１がアンタゴニストのアミノ酸配列においてＰｒｏで置換されるもの；
（ｉｖ）配列番号５のヌクレオチド配列；および
（ｖｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
を含む群より選択される配列を含む単離ポリヌクレオチド。
請求項１のポリヌクレオチドの相補物を含む単離ポリヌクレオチド。
請求項１のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
請求項１のポリヌクレオチドを含むよう遺伝的に改変された宿主細胞。
細菌、酵母、原生生物、真菌、藻類、植物細胞および動物細胞を含む群より選択される、請求項４の宿主細胞。
請求項１のポリヌクレオチドを含むよう遺伝的に改変されたウイルス宿主。
宿主のポリヌクレオチドの発現を制御する調節配列と作動性に連関する請求項１のポリヌクレオチドを含むよう遺伝的に改変された宿主細胞。
細菌、酵母、真菌、藻類、植物細胞および動物細胞を含む群より選択される請求項７の宿主細胞。
宿主のポリヌクレオチドの発現を制御する調節配列に作動性に連関される請求項１のポリヌクレオチドを含むよう遺伝的に改変されたウイルス宿主。
請求項１のポリヌクレオチドを含むベクター。
請求項１のポリヌクレオチドを含む発現ベクターであって、かつポリヌクレオチドの発現を制御する調節配列と作動性に連関されている、ベクター。
請求項１１の発現ベクターを含む宿主細胞。
細菌、原生生物、酵母、真菌、藻類、植物細胞および動物細胞を含む群より選択される請求項１２の宿主細胞。
請求項１１の発現ベクターを含むウイルス宿主。
野生型ウシＣＸＣＬ８配列と実質的に同等なアミノ酸配列を含むＥＬＲ−ＣＸＣケモカインアンタゴニストであって、当該アミノ酸配列が
（ｉ）アンタゴニスト配列の最初の２アミノ酸残基が途切れ、その結果それがアミノ酸残基Ｔｈｒ３で開始し、野生型配列のＬｙｓ１１がアンタゴニストのアミノ酸配列においてＡｒｇで置換され、かつ野生型配列のＧｌｙ３１がアンタゴニストのアミノ酸配列においてＰｒｏで置換されるもの、
（ｉｉ）アンタゴニスト配列の最初の２アミノ酸残基が途切れ、その結果それがアミノ酸残基Ｔｈｒ３で開始し、野生型配列のＬｙｓ１１がアンタゴニストのアミノ酸配列においてＡｒｇで置換され、野生型配列のＧｌｙ３１がアンタゴニストのアミノ酸配列においてＰｒｏで置換され、かつ野生型配列のＰｒｏ３２がアンタゴニストのアミノ酸配列においてＧｌｙで置換されるもの、および
（ｉｉｉ）アンタゴニスト配列の最初の２アミノ酸残基が途切れ、その結果それがアミノ酸残基Ｔｈｒ３で開始し、野生型配列のＬｙｓ１１がアンタゴニストのアミノ酸配列においてＡｒｇで置換され、野生型配列のＴｈｒ１２がアンタゴニストのアミノ酸配列においてＳｅｒで置換され、野生型配列のＨｉｓ１３がアンタゴニストのアミノ酸配列においてＰｈｅで置換され、かつ野生型配列のＧｌｙ３１がアンタゴニストのアミノ酸配列においてＰｒｏで置換されるもの
を含む群より選択される野生型アミノ酸配列との相違をさらに含む、アンタゴニスト。
ＣＸＣケモカイン介在病理を処置するための医薬組成物の製造のための請求項１５のケモカインの使用であって、ここで該ケモカインが哺乳動物のＣＸＣＲ１またはＣＸＣＲ２レセプターに結合する、使用。
ＥＬＲ−ＣＸＣケモカイン介在病理を処置するための医薬組成物の製造のための請求項１５のケモカインの使用であって、該ケモカインが哺乳動物のＣＸＣＲ１またはＣＸＣＲ２レセプターに結合する、使用。
哺乳動物がウシ科である、請求項１７の使用。
哺乳動物がヒトである、請求項１７の使用。
医薬組成物が静脈内送達、皮膚内送達および皮下送達を含む群より選択される手段によって哺乳動物に投与される請求項１７の使用。
該病理が、虚血再かん流傷害、エンドトキシン症誘導性急性呼吸窮迫症候群、免疫複合型糸球体腎炎、細菌性肺炎、および乳房炎を含む群より選択される、請求項１７の使用。
請求項３のポリペプチドを生産する方法であって、
（ｉ）宿主細胞に当該ポリペプチドをコードする遺伝子を導入する、
（ｉｉ）当該宿主細胞を成長させる、
（ｉｉｉ）当該ポリペプチドを蓄積する、
（ｉｖ）当該ポリペプチドを含むエキストラクトを調製するおよび
（ｖ）当該ポリペプチドを精製する
ことを含む方法。
当該宿主細胞が、細菌、酵母、真菌、藻類、原生生物、植物細胞および動物細胞からなるリストより選択される請求項２２の方法。
請求項３のポリペプチドを植物で生産する方法であって、
（ｉ）当該植物に当該ポリペプチドをコードする遺伝子を導入する、
（ｉｉ）当該植物を成長させる、
（ｉｉｉ）当該植物に当該ポリペプチドを蓄積する、
（ｉｖ）当該ポリペプチドを含むエキストラクトを調製するおよび
（ｖ）当該ポリペプチドを精製する
ことを含む方法。
請求項３のポリペプチドを非ヒト動物で生産する方法であって、
（ｉ）当該動物に当該ポリペプチドをコードする遺伝子を導入する、
（ｉｉ）当該動物を成長させる、
（ｉｉｉ）当該動物に当該ポリペプチドを蓄積する、
（ｉｖ）当該ポリペプチドを含むエキストラクトを調製するおよび
（ｖ）当該ポリペプチドを精製する
ことを含む方法。
アフィニティハンドルおよび
（ｉ）配列番号３のヌクレオチド配列
（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）野生型ウシＣＸＣＬ８配列と実質的に同等なアミノ酸配列を含むＥＬＲ−ＣＸＣケモカインアンタゴニストをコードするヌクレオチド配列であってここで
（ａ）アンタゴニストのアミノ酸配列がアミノ酸残基Ｔｈｒ３で開始し、
（ｂ）野生型配列のＬｙｓ１１がアンタゴニストのアミノ酸配列においてＡｒｇで置換されかつ
（ｃ）野生型配列のＧｌｙ３１がアンタゴニストのアミノ酸配列においてＰｒｏで置換されるもの
（ｉｖ）野生型ウシＣＸＣＬ８配列と実質的に同等なアミノ酸配列を含むＥＬＲ−ＣＸＣケモカインアンタゴニストをコードするヌクレオチド配列であって、ここで
（ａ）アンタゴニストのアミノ酸配列がアミノ酸残基Ｔｈｒ３で開始し、
（ｂ）野生型配列のＬｙｓ１１がアンタゴニストのアミノ酸配列においてＡｒｇで置換され
（ｃ）野生型配列のＧｌｙ３１がアンタゴニストのアミノ酸配列においてＰｒｏで置換され、かつ
（ｄ）野生型配列のＰｒｏ３２がアンタゴニストのアミノ酸配列においてＧｌｙで置換されるもの、および
（ｖ）野生型ウシＣＸＣＬ８と実質的に同等なアミノ酸配列を含むＥＬＲ−ＣＸＣケモカインアンタゴニストをコードするヌクレオチド配列であってここで、
（ａ）アンタゴニストのアミノ酸配列がアミノ酸残基Ｔｈｒ３で開始し、
（ｂ）野生型配列のＬｙｓ１１がアンタゴニストのアミノ酸配列においてＡｒｇで置換され
（ｃ）野生型配列のＴｈｒ１２がアンタゴニストのアミノ酸配列においてＳｅｒで置換され
（ｄ）野生型配列のＨｉｓ１３がアンタゴニストのアミノ酸配列においてＰｈｅで置換されかつ
（ｅ）野生型配列のＧｌｙ３１がアンタゴニストのアミノ酸配列においてＰｒｏで置換されるもの
（ｉｖ）配列番号５のヌクレオチド配列；および
（ｖｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
を含む群より選択される配列を含むポリヌクレオチドを含む遺伝子融合物。
請求項２６の遺伝子融合物によってコードされる融合ポリペプチド。
請求項２６の遺伝子融合物を含むよう遺伝的に改変された宿主細胞。
細菌、酵母、原生生物、真菌、藻類、植物細胞、および動物細胞を含む群より選択される請求項２８の宿主細胞。
請求項２６の遺伝子融合物を含むよう遺伝的に改変されたウイルス宿主。
宿主で遺伝子融合物の発現を制御する調節配列と作動性に連関された請求項２６の遺伝子融合物を含むよう遺伝的に改変された宿主細胞。
細菌、酵母、真菌、藻類、植物細胞、および動物細胞を含む群より選択される請求項３１の宿主細胞。
宿主で遺伝子融合物の発現を制御する調節配列と作動性に連関された請求項２６の遺伝子融合物を含むよう遺伝的に改変されたウイルス宿主。
請求項２６の遺伝子融合物を含むベクター。
請求項２６の遺伝子融合物を含む発現ベクターであって、該遺伝子融合物の発現を制御する調節配列と作動性に連関されている、ベクター。
請求項３５の発現ベクターを含む宿主細胞。
細菌、原生生物、酵母、真菌、藻類、植物細胞および動物細胞を含む群より選択される請求項３６の宿主細胞。
請求項３５の発現ベクターを含むウイルス宿主。
請求項２７の融合ポリペプチドを生産する方法であって、
（ｉ）該遺伝子融合物を宿主細胞に導入する、
（ｉｉ）当該宿主細胞を成長させる
（ｉｉｉ）当該融合ポリペプチドを蓄積する
（ｉｖ）当該融合ポリペプチドを含むエキストラクトを調製するおよび
（ｖ）当該融合ポリペプチドを精製する
ことを含む方法。
当該宿主細胞が、細菌、酵母、真菌、藻類、原生生物、植物細胞および動物細胞からなるリストから選択される、請求項３９の方法。
植物で請求項２７の融合ポリペプチドを生産する方法であって、
（ｉ）当該植物に遺伝子融合物を導入する
（ｉｉ）当該植物を成長させる
（ｉｉｉ）当該植物で当該融合ポリペプチドを蓄積するおよび
（ｉｖ）当該融合ポリペプチドを含むエキストラクトを調製するおよび
（ｖ）当該融合ポリペプチドを精製する
ことを含む方法。
非ヒト動物で請求項２７の融合ポリペプチドを生産する方法であって、
（ｉ）当該動物に遺伝子融合物を導入する
（ｉｉ）当該動物を成長させる
（ｉｉｉ）当該動物で当該融合ポリペプチドを蓄積する
（ｉｖ）当該融合ポリペプチドを含むエキストラクトを調製するおよび
（ｖ）当該融合ポリペプチドを精製する
ことを含む方法。
請求項２７の融合ポリペプチドを精製する方法であって、ここで宿主細胞の細胞性エキストラクトからの上清を、アフィニティハンドル特異的アフィニティマトリクスを使用して、アフィニティクロマトグラフィーによって精製し、該請求項３のポリペプチドが該アフィニティハンドルから切断され、透析されそしてアフィニティハンドル特異的アフィニティマトリクス上に分離される、方法。
該アフィニティハンドルがＧＳＴ融合タンパク質であり、該融合ポリペプチドがグルタチオンアフィニティマトリクスを使用して該上清から分離され、該請求項３のポリペプチドがトロンビン消化によってアフィニティハンドルから切断され、リン酸緩衝生食水（ＰＢＳ）に対して透析され、そしてエンドトキシン除去カラム上に分離される、請求項４３の方法。