JP2004529847A - p185HER−2またはEGF受容体を細胞内において発現する択一的なHER−2/NEU産物であるハースタチンの発現は受容体の活性と細胞の増殖を抑制する - Google Patents
p185HER−2またはEGF受容体を細胞内において発現する択一的なHER−2/NEU産物であるハースタチンの発現は受容体の活性と細胞の増殖を抑制する Download PDFInfo
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Abstract
選択的スプライシングによるHER−2/neu産物であるハースタチンは、p185HER−2の細胞外領域からのサブドメインIおよびIIと、イントロン8によってコードされているC末端の独自の79個のアミノ酸とからなる。組み換えハースタチンを細胞に添加するとp185HER−2に結合し、p185HER−2を抑制することがわかった。いくつかの細胞系において、ハースタチンをp185HER−2またはそのホモログであるEGF受容体と同時に異所発現させた場合の効果を調べた。ハースタチンとHER−2を同時にトランスフェクトすると、p185HER−2のレベルが抑制され、p185のチロシンリン酸化が約8分の1に減少した。p185HER−2のチロシンリン酸化の抑制は、p185HER−2とハースタチンを同時に発現する細胞によるコロニー形成が劇的に減少することと対応していた。ハースタチンはまた、同時にトランスフェクトされた細胞におけるEGFによるEGF受容体の活性化を阻止し(受容体のチロシンリン酸化が減少することでわかる)、受容体のダウンレギュレーションと増殖抑制を減少させた。p185HER−2とEGF受容体の両方に関し、抑制の程度は、このEGF受容体に対するハースタチンの相対的発現レベルによる影響を受けていた。ハースタチンはp185HER−2の自己抑制剤であり、その抑制活性は、グループIファミリーに属する受容体チロシンキナーゼの第2のメンバーであるEGF受容体にまで及んでいる。ハースタチンは、活性化したAktを媒介としたEGF生存シグナルを阻止するとともに、トランスフォーミング増殖因子(TGFα)を媒介としたEGF受容体の活性化、生存シグナル、増殖シグナルも阻止した。精製した組み換えハースタチンは、HER−2を過剰発現しているヒトのガン細胞を特異的に抑制した。また、精製した組み換えハースタチンは、腹腔内に注射したマウスの血液に効果的に吸収され、タンパク質分解酵素によって分解されず、1〜3時間にわたって血液中に存在していた。
Description
【0001】
関連する出願の相互参照
本出願は、HER−2に結合するアンタゴニストという名称で2000年2月16日に出願されたアメリカ合衆国特許出願シリアル番号第09/506,079号の一部継続出願であり、このシリアル番号第09/506,079号の出願は、HER−2に結合するアンタゴニストという名称で1999年1月20日に出願されたアメリカ合衆国特許出願シリアル番号第09/234,208号の一部継続出願となっている。
【0002】
発明の背景
HER−2に結合するアンタゴニストを説明し、提供する。さらに詳細には、イントロンが保持されていることによってHER−2受容体と結合するHER−2の新規なアンタゴニスト・ポリペプチドが生まれる。
【0003】
この仕事は、国防総省(DOD)の乳ガン研究計画からの助成を受けた。アメリカ合衆国政府は、この発明に関して所定の権利を有する。
【0004】
HER−2/neu(erbB−2)ガン遺伝子は、受容体様チロシンキナーゼ(RTK)をコードしている。このRTKは、ヒトの何種類かのガン(HynesとStem、Biochim. et Biophys. Acta、1198巻、165〜184ページ、1994年;Dougall他、Oncogene、第9巻、2109〜2123ページ、1994年)および哺乳類の発生(Lee他、Nature、第378巻、394〜398ページ、1995年)においてある役割を果たしているというので精力的に研究されてきた。HER−2タンパク質の配列は、クローニングされたcDNAが、胎盤(Coussens他、Science、第230巻、1132〜1139ページ、1985年)および胃ガン細胞系(ヤマモト他、Nature、第319巻、230〜234ページ、1986年)からの上皮増殖因子受容体(EGFR)のmRNAと相同性を有することから決定された。HER−2のmRNAは、約4.5kbであることがわかっており(Coussens他、Science、第230巻、1132〜1139ページ、1985年;ヤマモト他、Nature、第319巻、230〜234ページ、1986年)、ヒトの正常組織および悪性組織において185kDaの膜貫通糖タンパク質(p185HER−2)をコードしている(HynesとStem、Biochim. et Biophys. Acta、1198巻、165〜184ページ、1994年;Dougall他、Oncogene、第9巻、2109〜2123ページ、1994年)。HER−2遺伝子の機能は、主として、トランスフェクションされた細胞内で4.5kbの転写産物に対応するcDNAを発現させることによってと、185kDaタンパク質産物の構造ならびに生化学的特性から調べられている。p185HER−2は、大きな細胞外領域と、膜貫通領域と、チロシンキナーゼ活性を有する細胞内領域とからなる(HynesとStem、Biochim. et Biophys. Acta、1198巻、165〜184ページ、1994年;Dougall他、Oncogene、第9巻、2109〜2123ページ、1994年)。p185HER−2を過剰発現させると、培養した細胞の形質転換が起こる(DiFiore他、Science、第237巻、178〜182ページ、1987年;Hudziak他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第84巻、7159〜7163ページ、1987年)。また、p185HER−2の過剰発現には、臨床上、乳ガンと卵巣ガンの急激な進行が伴う(Slamon他、Science、第235巻、177〜182ページ、1987年;Slamon他、Science、第244巻、707〜712ページ、1989年)。p185HER−2は、EGFRと相同性が極めて大きい。しかしp185HER−2に対して高アフィニティで直接結合するリガンドは、まだ同定されていない。しかも、HER−2のシグナル伝達活性は、EGFRファミリーの他のリガンド結合メンバーとのヘテロダイマー化によるらしい(CarrawayとCantley、Cell、第78巻、5〜8ページ、1994年;Earp他、Breast Cancer Res. Treat.、第35巻、115〜132ページ、1995年;Qian他、Oncogene、第10巻、211〜219ページ、1995年)。
【0005】
HERファミリーに属するRTKの細胞外領域のいくつかの領域を含むさまざまなタンパク質の産生は、完全長受容体のタンパク質分解プロセシングを通じて(LinとClinton、Oncogene、第6巻、639〜643ページ、1991年;Zabrecky他、J. Biol. Chem.、第266巻、1716〜1720ページ、1991年;Pupa他、Oncogene、第8巻、2917〜2923ページ、1993年;Vecchi他、J. Biol. Chem.、第271巻、18989〜18995ページ、1996年;VecchiとCarpenter、J. Cell. Biol.、第139巻、995〜1003ページ、1997年)、また選択的RNAプロセシングを通じて(Petch他、Mol. Cell. Biol.、第10巻、2973〜2982ページ、1990年;Scott他、Mol. Cell. Biol.、第13巻、2247〜2257ページ、1993年;LeeとMaihle、Oncogene、第16巻、3243〜3252ページ、1998年)起こる。p185HER−2の細胞外領域は、培養した乳ガン細胞のタンパク質分解によって生まれる(Petch他、Mol. Cell. Biol.、第10巻、2973〜2982ページ、1990年;Scott他、Mol. Cell. Biol.、第13巻、2247〜2257ページ、1993年;LeeとMaihle、Oncogene、第16巻、3243〜3252ページ、1998年)。また、このp185HER−2の細胞外領域は、ある種のガン患者の血清中に見いだされるため(Leitzel他、J. Clin. Oncol.、第10巻、1436〜1443ページ、1992年)、乳ガン転移の血清マーカーとして使えるであろう(Leitzel他、J. Clin. Oncol.、第10巻、1436〜1443ページ、1992年)。さらにこのp185HER−2の細胞外領域は、HER−2リッチな腫瘍を免疫系による監視から逃れさせている可能性もある(Baselga他、J. Clin. Oncol.、第14巻、737〜744ページ、1966年;Brodowicz他、Int. J. Cancer、第73巻、875〜879ページ、1997年)。
【0006】
HER−2の細胞外領域の断片は、選択的スプライシングによる2.3kbの転写産物でもあり、イントロン内のポリアデニル化シグナルを利用して産生される(Scott他、Mol. Cell. Biol.、第13巻、2247〜2257ページ、1993年)。選択的スプライシングによるこの転写産物は、胃ガン細胞系MKN7において最初に同定された(ヤマモト他、Nature、第319巻、230〜234ページ、1986年;Scott他、Mol. Cell. Biol.、第13巻、2247〜2257ページ、1993年)。受容体の断片は、これらガン細胞から分泌されるのではなく、むしろ核周辺の細胞質に位置していた(Scott他、Mol. Cell. Biol.、第13巻、2247〜2257ページ、1993年)。しかしこの細胞外領域ポリペプチド断片には特別な治療上、診断上、研究上の用途が見つかっていない。選択的スプライシングによって産生されるEGFRの細胞外領域断片(Petch他、Mol. Cell. Biol.、第10巻、2973〜2982ページ、1990年)は、分泌されて、リガンドに結合する性質とダイマー化する性質を示し(Basu他、Mol. Cell. Biol.、第9巻、671〜677ページ、1989年)、受容体の機能に対してドミナント・ネガティブな効果を及ぼす可能性がある(Basu他、Mol. Cell. Biol.、第9巻、671〜677ページ、1989年;Flickinger他、Mol. Cell. Biol.、第12巻、883〜893ページ、1992年)。
【0007】
EGF受容体(HER−1、erbB−1)、HER−2(erbB−2)、HER−3(erbB−3)、HER−4(erbB−4)などのグループI受容体チロシンキナーゼは、上皮組織、間充組織、神経組織で広く発現し、増殖と分化において基本的な役割を担っている。p185HER−2は別にして、受容体チロシンキナーゼは、さまざまなEGF関連増殖因子と結合することによって活性化される。リガンドの結合は、受容体のダイマー化、チロシンの自己リン酸化、シグナル活性化と関係している。p185HER−2は、特定の増殖因子と結合することとは無関係に、自らダイマー化するか、あるいは、パートナーとなる好ましいヘテロダイマーとして招集されて他の受容体ファミリーに属するメンバーの転写促進を行なう。
【0008】
細胞膜においてグループI受容体の量が増加すると、ヒトでしばしばガンが発生する。受容体の数がこのように増加することにより、受容体オリゴマーの形成が促進され、シグナルが増幅されるらしい。EGF受容体とp185HER−2は、非常にしばしば、かつ明確に、ヒトの悪性腫瘍に付随している。HER−2は、脳、卵巣、胃、子宮内膜のガンにおいて過剰発現している。乳ガンや卵巣ガンでp185HER−2のレベルが25〜30%が増加すると、生存率が有意に低下し、再発までの時間が短くなることが予測される。EGF受容体遺伝子の増幅と変化は、肺の扁平上皮細胞ガン(Pavelic他、1993年)、グリア細胞腫瘍(Libermann他、1985年)、グリオブラストーマでしばしば観察されるが、その中でも、最も悪性のグリア細胞腫瘍であるグリオブラストーマで観察される頻度が最も高い。
【0009】
受容体の活性化メカニズムを理解し、細胞表面で受容体の作用を阻止することを目的として、グループI受容体の細胞外領域の構造と機能を明らかにする努力が精力的に続けられてきた。細胞外領域と膜アンカーからなる受容体突然変異体は、細胞質領域がない場合には、ダイマー化して(Lemmon他、1997年;Tzahar他、1997年;TannerとKyte、1999年)、細胞表面の受容体との間でキナーゼに対して不活性な複合体を形成することができる(Greene)。グループI受容体の細胞外領域は、(N末端から始まる)サブドメインI〜サブドメインIVに分割されており、膜隣接位置で終わっている。サブドメインIIとIVは多数のシステイン残基を含んでおり、これらシステイン残基は、4つのグループI受容体において保存されている。サブドメインIとIIは、サブドメインIIIとIVの繰り返し単位であるように見える。これは、おそらく遺伝子重複によって生じたのであろう(Ullrich他、1984年)。EGF受容体からサブドメインIとIIが欠失すると、リガンドとは関係なく、構成的ダイマー化が起こるとともにガンに形質転換し(Hayely他、1989年;CarterとKung、1994年;Qian他、1994年;Moscatello他、1996年)、リガンドとは関係なく、膜に固定されたp185neu細胞外領域突然変異体とヘテロダイマーを形成できるようになる(Greene)。サブドメインIIIは、EGFがEGF受容体と結合することからわかるように、高アフィニティのリガンド結合部位を含んでいる(Wu他、1990年;Woltjer他、1992年;Lax他、1989年、1991年)が、サブドメインIのほうは、リガンドの認識に関して相手を特定しない低アフィニティ部位として機能することが示唆されている(Lax他、1989年、1991年;Tzahar他、1997年)。このモデルによると、EGF様リガンドは二面性があり、サブドメインIII内にあって受容体に直接結合する高アフィニティ部位と、サブドメインI内にあって特異性がゆるやかでp185HER−2と相互作用するほうを好む低アフィニティ部位とを有するため、p185HER−2がなぜダイマーの好ましいパートナーとなるかが説明される。これらの結果を合わせて考えると、サブドメインIとIIは、リガンドがない場合にはダイマー化にマイナスの制約を与えているため、受容体を招集してヘテロダイマーを形成するのに重要である可能性があることが示唆される。
【0010】
腫瘍の増殖を制限するのにp185HER−2の細胞外領域とEGF受容体に対するモノクローナル抗体が有効であることがわかった。この抗体は、高アフィニティと高い特異性でもって標的となる対応する受容体と結合するため、毒性は低い。抗体の抗腫瘍効果の裏に隠れているメカニズムははっきりしていない。rhuMAb4D5モノクローナル抗体(ハーセプチン(登録商標))は、p185HER−2をダウンレギュレーションすることによって細胞表面で作用し、HER−2を介した細胞増殖に可逆的な細胞分裂抑制効果を及ぼしている可能性がある(Hurwitz他、1995年)。ハーセプチン(登録商標)を全身投与すると治療効果があることがわかっている。というのも、転移した乳ガン患者のグループで再発までの期間が延びたからである。EGF受容体に対する高アフィニティのヒト化モノクローナル抗体は、抗腫瘍薬としても用いられている。EGF受容体に対して抗体が活性を有することの裏に隠れている分子メカニズムはまだ明らかになっていないが、テストした抗体は、増殖因子の結合と競合した。p185HER−2とEGF受容体を標的とする抗体戦略や、これら2つの受容体間のヘテロダイマーを標的とする抗体戦略も、以前から試みられている。予備的な結果によると、両方の受容体を標的にすると抗増殖効果が有意に増大することが示唆されている。
【0011】
細胞外領域からなる受容体突然変異体が腫瘍発生を抑制する効果を持つことが明らかにされた。膜に固定されたp185neuの細胞外領域は、細胞内で異所発現し、ドミナントネガティブな抑制剤として機能する。これは、この細胞外領域が、グループI受容体の細胞外領域とダイマー化してキナーゼに対して不活性な複合体を形成する能力を有することに基づいている。p185neuの細胞外領域突然変異体は、p185HER−2ホモダイマーのシグナル伝達を特異的に抑制するとともに、EGF受容体のシグナル伝達をトランス抑制することもできる。p185細胞外領域は、すべてのグループI受容体の活性化を抑制することができる。というのも、p185HER−2は、グループIのRTKにとってヘテロダイマーを形成する際の好ましいパートナーだからである。しかしドミナントネガティブ効果を及ぼすには、細胞外領域突然変異体が膜に固定されることが必要である。というのも、可溶性のある細胞外領域と細胞表面受容体の間の相互作用は、複合体を形成するのに弱過ぎるからである。
【0012】
発明のまとめ
本発明は、ハースタチンと呼ばれる、HER−2受容体チロシンキナーゼの天然抑制剤に関する。このハースタチンは、p185HER−2のN末端側のサブドメインIとIIに一致する最初の340個のアミノ酸と、それに続く79個のアミノ酸からなる新規なC末端と、挿入された配列によって特定される終止コドンとで構成されている。可溶性のある細胞外領域とは異なり、ハースタチンは、高アフィニティ(約14nM Kd)でもってp185HER−2の細胞表面に結合する。ハースタチンは分泌されてp185HER−2と細胞表面で複合体を形成するとはいえ、他のEGR様リガンドとは、p185HER−2の活性を抑制する能力が異なる。現在行なっている研究において、われわれは、ハースタチンとp185HER−2の両方を発現させると細胞増殖が顕著に少なくなることを見いだした。これは、p185の自己リン酸化が抑制されたことに対応している。さらに、ハースタチンの抑制活性は、EGFによるEGF受容体の活性化にまで及んでいる。
【0013】
別の実施態様には、EGF受容体の過剰発現を特徴とする固形腫瘍の治療法が開示されている。この治療法には、EGF受容体の細胞外領域(ECD)に結合する薬剤を投与する操作が含まれる。薬剤は、(a)配列ID番号1の配列に由来する約50〜79個のアミノ酸を含み、EGF受容体の細胞外領域ECDに少なくとも108のアフィニティで結合する単離ポリペプチド、(b)配列ID番号2の配列に由来する約80〜419個のアミノ酸を含み、その中にはC末端の79個のアミノ酸と、少なくとも3つのN結合型グリコシル部位とが存在している、グリコシル化された単離ポリペプチド、(c)EGF受容体のECDに結合するモノクローナル抗体、(d)これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択する。薬剤をモノクローナル抗体だけで構成することはできない。
【0014】
さらに別の実施態様には、EGF受容体を過剰発現している固形腫瘍を治療するための薬理学的組成物が開示されている。この薬理学的組成物は、(a)配列ID番号1の配列に由来する約50〜79個のアミノ酸を含み、EGF受容体の細胞外領域ECDに少なくとも108のアフィニティで結合する単離ポリペプチド、(b)配列ID番号2の配列に由来する約80〜419個のアミノ酸を含み、その中にはC末端の79個のアミノ酸と、少なくとも3つのN結合型グリコシル部位とが存在している、グリコシル化された単離ポリペプチド、(c)EGF受容体のECDに結合するモノクローナル抗体、(d)これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択した薬剤と、薬理学的に受容可能な基剤とを含んでいる。なお、薬剤をモノクローナル抗体のみと、薬学上許容される単体から構成することはできない。
【0015】
さらに別の実施態様として、固形腫瘍組織に治療用薬剤を到達させる方法が開示されている。この方法には、EGF受容体の過剰発現を特徴とする固形腫瘍組織に治療用薬剤を到達させる操作が含まれる。この方法には、治療用薬剤を、配列ID番号1の配列に由来する約50〜79個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドに付着させる操作が含まれる。このポリペプチドは、EGF受容体の細胞外領域ECDに少なくとも108のアフィニティで結合する。
【0016】
さらに別の実施態様として、EGF受容体を過剰発現している腫瘍を有する患者の腫瘍を治療した後の予後予測法が開示されている。この方法には、(a)患者の血液、血清、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、胎盤組織、臍帯組織、羊水、絨毛膜絨毛組織、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択した体液サンプルを取得し、(b)ELISA、免疫沈降法、免疫組織化学法、ウエスタンブロット分析法からなるグループの中から選択して抗p68HER−2受容体抗体をベースとしたアッセイを行なうことにより、発現したp68HER−2受容体の量を測定し、(c)体液に含まれるEGF受容体のECDの量を測定し、(d)p68HER−2の量とEGF受容体の量の比を明らかにすることにより、EGF受容体の量よりもp68HER−2の量が多いほど患者の予後がよいと判定する操作が含まれる。
【0017】
ハースタチンの1つの利点は、特に、グループI受容体チロシンキナーゼを含むヒトの腫瘍に対する治療法の開発に役立っていることである。ハースタチンの別の利点は、p185HER−2またはEGF受容体を過剰発現している細胞の増殖を抑制できることである。
【0018】
発明の詳細な説明
本発明は、イントロン8であると同定された274bpの挿入体を有する、選択的スプライシングによるHER−2の4.8kbのmRNAが初めて発見されたことに基づいている。保持されているこのイントロンはイン・フレームであり、79個のアミノ酸[配列ID番号1]をコードした後、ヌクレオチド配列236位に終止コドンを有する。この新規なmRNAからは、膜貫通領域と細胞内領域を欠いたHER−2タンパク質断片が予測される。このタンパク質断片は、419個のアミノ酸[配列ID番号2]を含む。419個のアミノ酸は、p185HER−2のN末端と一致する340個の残基と、C末端の新規な79個の残基[配列ID番号1]からなる。C末端の新規な79個のアミノ酸残基[配列ID番号1]に対して特異的な抗体、またはp185HER−2のN末端に対して特異的な抗体を用い、68kDaのタンパク質産物を同定した[配列ID番号2]。この68kDaのタンパク質は、新規なHER−2転写産物であり、細胞抽出液の中や、いくつかの細胞系からの細胞外マトリックスの中に見いだされる。この新規な転写産物の発現は、トランスフェクトされていないヒト胚性腎臓細胞系で最大であった。
【0019】
ここに提示した結果は、HER−2の新規なmRNAの発現を示している。このmRNAは、274個多いヌクレオチドを含んでおり、それはおそらくイントロン8であろう。この知見に合致するように、約4.8kbの新規な転写産物が、ヒト胎児の腎臓組織とヒト胚性腎臓細胞系HEK293で検出された。さらに、2.6kbの転写産物が、挿入された配列、すなわちHER−2のECDをコードしている配列に対して特異的なプローブを用いたノーザンブロット分析によりヒト胎児の肝臓組織で検出された(図2)。この2.6kbというサイズは、挿入配列がHER−2の2.3kbのmRNA断片(ヤマモト他、Nature、第319巻、230〜234ページ、1986年;Scott他、Mol. Cell. Biol.、第13巻、2247〜2257ページ、1993年)に含まれている場合に予想されるサイズである。挿入された配列には終止コドンが含まれているため、p185HER−2タンパク質の340番目の残基の位置に、ECD IIIaと表記する新規な79個のアミノ酸延長部が含まれることが予測される。したがってこの予測されるタンパク質は、p185HER−2の膜貫通領域と細胞内領域を欠いているが、細胞外領域のサブドメインIとIIを含んでいる。予想されるように、p185HER−2のN末端配列と、新規な配列を含むことで生まれるC末端延長部とを含む分泌タンパク質が検出された(図3と図5)。ECD IIIaタンパク質は68kDaであることがわかった。これは、p185HER−2のサブドメインIとIIに見られる5つのN結合型グリコシル化部位がグリコシル化される場合に新規な転写産物によってコードされるタンパク質として予想されるサイズとほぼ同じである(Stern他、Mol. Cell. Biol.、第6巻、1729〜1740ページ、1986年)。
【0020】
ここに提示したデータは、p68HER−2がp185HER−2に特異的に結合することを示している。p185HER−2との結合は、p68HER−2のN末端のサブドメインIとIIよりは、プロリン・リッチな新規なECD IIIa領域によって生じている可能性がある。インビトロでの欠失突然変異誘発によって生まれるHER−2のECDもサブドメインIとIIを備えているが、より近接した状態にされるのでなければp185HER−2の細胞外領域とは結合しない(Tzahar他、EMBO J.、第16巻、4938〜4950ページ、1997年;O’Rourke他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第94巻、3250〜3255ページ、1997年;Fitzpatrick他、FEBS Letters、第431巻、102〜106ページ、1998年)。しかし新規なECD IIIaペプチドは、p185HER−2に対してと、p185HER−2を過剰発現している形質転換された17−3−1細胞に対して高アフィニティ(nMの濃度)で結合する(図5)。ECD IIIaペプチドが17−3−1細胞に好んで結合するというのは、分泌されたp68HER−2がp185HER−2の細胞外領域と細胞表面で相互作用することを示している。したがって、p68HER−2とその断片は、HER−2遺伝子によってコードされる天然のHER−2結合タンパク質であるように思われる。EGFRファミリーのリガンド(Groenen他、Growth Factors、第11巻、235〜257ページ、1994年)とは異なり、p68HER−2はEGF相同領域を欠いており、p185HERという受容体そのものの最初の340個のアミノ酸を含んでいる。
【0021】
以前に推定されたHER−2のリガンドは、EGFRファミリーのメンバーとヘテロダイマーの形態でのみp185HER−2と間接的に結合することがわかった(HeldinとOstman、Cytokine Growth Factor Rev.、第7巻、33〜40ページ、1996年)。ECD IIIaは共通の受容体を通じてp185HER−2と間接的に結合することが可能であるが、界面活性剤で溶解させたp185HER−2は固定化したECD IIIaペプチドによって特異的かつ効果的に“プルダウンされる”ため、こんなことは起こりそうにない(図5B)。
【0022】
哺乳類のEGFRファミリーのメンバーに対する天然または人工のすべてのリガンドにとって、結合するというのは、受容体のダイマー化促進およびチロシンリン酸化促進と強く結びついている(HynesとStem、Biochim. et Biophys. Acta、1198巻、165〜184ページ、1994年;Dougall他、Oncogene、第9巻、2109〜2123ページ、1994年;Groenen他、Growth Factors、第11巻、235〜257ページ、1994年)。p68HER−2もECD IIIaペプチドもp185HER−2と結合するにもかかわらず、p185HER−2を活性化させないことがわかった。活性化は、p185HER−2のチロシンリン酸化の程度が異なる2つの別々の細胞系、すなわち形質転換した17−3−1細胞と、SKOV−3卵巣ガン細胞において評価した。さらに、p185HER−2がダイマーの形態になることによって増加するインビトロでの自己リン酸化活性(Dougall他、Oncogene、第9巻、2109〜2123ページ、1994年;Lin他、J. Cell. Biochem.、第49巻、290〜295ページ、1992年)は、p68HER−2とECD IIIaにいずれによっても大きくならなかった。同様に、ショウジョウバエのEGF受容体の細胞外阻害剤であり、クラスIのRTKのアンタゴニストとして知られている唯一のものであるアルゴス・タンパク質は、この受容体のチロシンリン酸化を促進しなかった(Schweitzer他、Nature、第376巻、699〜702ページ、1995年)。同様に、タイ2RTKの天然のアンタゴニストであるアンギオポエチン−2は、内皮受容体と結合したが、その受容体を活性化することはなかった(Maisonpierre他、Science、第277巻、55〜60ページ、1997年)。
【0023】
理論に囚われないとすると、p68HER−2はp185HER−2と結合するがp185HER−2を活性化させないのであるから、p68HER−2がp185HER−2のダイマー化を阻止している可能性がある。類推により、RTKへの結合が促進されるようなHER−2のECDを作ったところ、このHER−2のECDは、リン酸基転移と受容体活性化に必要な生産性のあるダイマーの形成を阻止し、ドメイン・ネガティブな効果を示した(O’Rourke他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第94巻、3250〜3255ページ、1997年)。可溶性p68HER−2は、HER−2のECDとは違ってp185HER−2への強い結合力を示したが、ECDのサブドメインIとIIをやはり含んでいる。サブドメインIは、p185HER−2をヘテロマー複合体にするのに必要な、低アフィニティで何とでも結合するリガンド結合部位である可能性があるため(Tzahar他、EMBO J.、第16巻、4938〜4950ページ、1997年)、p68HER−2がこの部位をブロックし、p185HER−2がダイマーになるのを妨げている可能性がある。また、p68HER−2は、p185HER−2に結合するための、まだ特性が同定されていないリガンドと競合する可能性もある。ヒト胎児の肝臓および腎臓においてp68HER−2が組織特異的に発現することによって、これら器官の発達中にp185HER−2が占める程度が変わる可能性がある。しかも、HER−2遺伝子の増幅に伴ってガン細胞中でp68HER−2よりもp185HER−2が過剰に発現するということ(図3)が、p68HER−2などの結合タンパク質の効果を上回るような選択的圧力によって起こる可能性がある。したがって、p68HER−2は、p185HER−2の活性化を妨げる可能性のある天然のp185HER−2結合タンパク質の最初の例である。
【0024】
薬理学的組成物
本発明は、さらに、HER−2を過剰発現している固形ガンを治療するための薬理学的組成物であって、(a)配列ID番号1の配列に由来する約50〜79個のアミノ酸を含み、HER−2の細胞外領域(ECD)に少なくとも108のアフィニティで結合する単離ポリペプチド、(b)配列ID番号2の配列に由来する約300〜419個のアミノ酸を含み、その中にはC末端の79個のアミノ酸と、少なくとも3つのN結合型グリコシル化部位とが存在している、グリコシル化された単離ポリペプチド、(c)HER−2のECDと結合するモノクローナル抗体、(d)これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択した薬剤と、薬理学的に受容可能な基剤とを含むが、上記薬剤がモノクローナル抗体のみからなることはありえないという薬理学的組成物を提供する。上記薬剤は、配列ID番号1の配列に由来する約50〜79個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドであることが好ましい。さらに好ましいのは、この薬剤が、配列ID番号1の配列に由来する約50〜79個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドと、HER−2のECDに結合するモノクローナル抗体の組み合わせになっていることである。
【0025】
本発明のポリペプチドおよび/またはモノクローナル抗体の一方または両方を含む本発明の薬理学的組成物は、そのまま(複合体または組み合わせ)で、または、適切な基剤および添加剤と混合した薬理学的組成物として、患者に投与することができる。本発明のポリペプチドは、静脈内注射または点滴、腹腔内注射、皮下注射、筋肉内注射などの非経口的な方法で投与することができる。本発明のポリペプチドは、基剤と添加剤を加え、錠剤、ピル、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、分散液などの適切な製剤にして、経口的に、または直腸から投与することができる。本発明のポリペプチドは、皮膚パッチなどの方法で局所的に投与することにより、活性成分のレベルが全身で一定となるようにすることができる。本発明のポリペプチドは、局部に使用するクリーム、皮膚または粘膜のパッチ、皮膚または粘膜の表面に局所的に塗布するのに適切な液体またはゲルにされる。本発明のポリペプチドは、HER−2の過剰発現を特徴とするガンの局所的治療または全身治療のため、吸入器を用いて気道に投与することができる。
【0026】
本発明で使用する本発明のポリペプチドの投与量は、この明細書に記載されている内容から当業者が決定することができる。本発明のポリペプチドは、(投与経路と、活性成分の薬物動態に依存する)本発明のポリペプチドの効果的な投与量と、製剤に応じた投与経路(すなわち経口、非経口、局所的、吸入など)に適した薬理学的基剤および添加剤を含むことになる。本発明の活性なポリペプチドは、混合、溶解、粒子化、糖衣形成、乳剤化、カプセル化、包括化、凍結乾燥といった方法で混合して薬理学的製剤にする。非経口投与する薬理学的組成物は、水溶性形態にした本発明のポリペプチドの水溶液を含んでいる。さらに、本発明のポリペプチドの分散液は、油性注射分散液として調製することができる。適切な親油性溶媒または賦形剤としては、ゴマ油などの不揮発性油、オレイン酸エチルやトリグリセライドなどの合成脂肪酸エステル、リポソームなどが挙げられる。水溶性注射分散液は、この分散液の粘性を高める物質、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、デキストランなど含むことができる。分散液は、より濃縮した溶液にできるよう、複合体または組み合わせの溶解性を高めるための安定化剤や薬剤を含んでいてもよい。
【0027】
経口投与する薬理学的組成物は、活性成分を固体添加剤と組み合わせることにより得られる。固体添加剤としては、糖(例えばラクトース、ショ糖、マンニトール、ソルビトール)、セルロース調製物(例えばデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース)、ゼラチン、ガム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。さらに、分解剤や安定化剤を添加することもできる。
【0028】
p68と、C末端領域にある79個のアミノ酸の合成方法
ポリペプチドの合成は、ペプチド合成装置を、製造業者のペプチド合成指示書に従って使用することによりアミノ酸を順次つなげるという、多数ある標準的なポリペプチド合成法による。アミノ酸の数が100未満の短いポリペプチドの場合には、アミノ酸を順次つなげるというポリペプチド合成法が最適である。さらに、異種ポリペプチドは、標準的な組み換えDNA技術を用いて形質転換した細胞で発現させることができる。すなわち、原核細胞または真核細胞のいずれかを形質転換し、発現に適した増殖培地を用意し、使用する細胞のタイプとその細胞の発現特性に応じてその培地または細胞内物質のいずれかから本発明のポリペプチドを精製する。
【0029】
p68、C末端領域にある79個のアミノ酸、またはこれらの組み合わせを用いたガンの治療法
本発明は、HER−2またはHER−2変異体(実施例8を参照のこと)の過剰発現を特徴とする固形ガンを治療するためにHER−2の細胞外領域(ECD)と結合する薬剤を投与する操作を含む方法であって、この薬剤を、(a)配列ID番号1の配列に由来する約50〜79個のアミノ酸を含み、HER−2の細胞外領域(ECD)に少なくとも108のアフィニティで結合する単離ポリペプチド、(b)配列ID番号2の配列に由来する約300〜419個のアミノ酸を含み、その中にはC末端の79個のアミノ酸と、少なくとも3つのN結合型グリコシル化部位とが存在している、グリコシル化された単離ポリペプチド、(c)HER−2のECDに結合するモノクローナル抗体、(d)これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択するが、この薬剤がモノクローナル抗体のみからなることはありえないという方法を提供する。HER−2を過剰発現している固形ガンは、乳ガン、肺小細胞ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、胃ガン、子宮頚ガン、食道ガン、大腸ガンからなるグループの中から選択することが好ましい。上記薬剤は、配列ID番号1の配列に由来する約50〜79個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドであることが好ましい。より好ましいのは、上記薬剤が、配列ID番号1の配列に由来する約50〜79個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドと、HER−2のECDに結合するモノクローナル抗体の組み合わせである。
【0030】
この明細書に記載したp68HER−2ポリペプチドは、HER−2と結合し、キナーゼ領域を通じてシグナル伝達を妨げることが見いだされた。理論に囚われないとすると、新規なECD IIIa領域はp185HER−2との特異的結合に関与し、その結果としてp68ECDI IIIaと相互作用することでp185HER−2のダイマー化を阻止し、その後に続くシグナル伝達を阻止する。したがってp68HER−2はHER−2のアンタゴニストとして機能し、シグナル伝達に不可欠なダイマー化を阻止することでシグナル伝達を阻止する。つまり、HER−2のアンタゴニストとしてのp68HER−2の機能は、この明細書に記載したアミノ酸79個のポリペプチドや、HER−2のECDに結合するモノクローナル抗体などの結合剤の機能とは異なっている。本発明の方法では、HER−2を過剰に発現している腫瘍内で腫瘍細胞に対してp68HER−2が選択的圧力を加えることによってこの腫瘍細胞の成長を抑制する。同様に、結合剤であるHER−2のアンタゴニストも、HER−2を過剰に発現している腫瘍内で腫瘍細胞に対して選択的圧力を加えてリガンドがHER−2のECDと結合することを阻止し、ダイマー化する可能性が生まれる前にすでにシグナル伝達を阻止することにより、この腫瘍細胞の成長を抑制する。
【0031】
C末端領域にある79個のアミノ酸を利用した標的ターゲッティング分子
本発明は、さらに、HER−2の過剰発現を特徴とする固形ガン組織に治療薬をターゲッティングさせる方法であって、この治療薬を、配列ID番号1の配列に由来する約50〜79個のアミノ酸を含み、HER−2の細胞外領域(ECD)に少なくとも108のアフィニティで結合する単離ポリペプチドに付着させる操作を含む方法を提供する。この単離ポリペプチドは、長さがアミノ酸約69〜79個であることが好ましい。この単離ポリペプチドは、HER−2のECD上の部位のうち、ハーセプチン(登録商標)(ガンの治療に用いられる市販のヒト化モノクローナル抗体であり、HER−2のECDと結合する)の結合部位とは異なる部位に結合することが好ましい。アミノ酸79個からなるこのポリペプチド[配列ID番号1]は、HER−2のECDに対して驚くほど高いアフィニティで結合する特性を示すことがわかった。さらに、そのような結合部位は、市販のヒト化モノクローナル抗体(ハーセプチン(登録商標))の結合部位とは異なっていて、このヒト化モノクローナル抗体の影響を受けない。したがって、この高い結合アフィニティにより、アミノ酸79個からなるこのポリペプチドが、HER−2を発現している腫瘍細胞への標的ターゲッティング分子として機能する。
【0032】
診断/予後予測用の薬剤としての抗p68抗体
p68HER−2のグリコシル化されたECD IIIa変異体3ポリペプチド(後出の表1を参照のこと)を発現させ、抗体産生用の抗原として使用した。より詳細には、p68HER−2に対して特異的な抗体を、ポリヒスチジン・タグを有する精製ECD IIIa変異体3ペプチドをウサギに注射することによって調製した。このペプチドは、イントロンがコードしている新規なC末端領域すなわちp68HER−2と同じものであり、この領域が、高いアフィニティでp185HER−2に結合する。単離したポリクローナル抗体により、ECD IIIaペプチドまたはp68HER−2のpM量を高い特異性で検出した(図3と図5を参照のこと)。したがってp68HER−2に対して特異的な抗体は、体液中および腫瘍組織中のp68HER−2を、ELISA、免疫沈降法、免疫組織化学法、ウエスタンブロット分析法などの診断技術を利用して検出するための診断用薬剤として有用である。
【0033】
ECD IIIaの1つ以上のエピトープ、p68HER−2のエピトープ、ペプチド断片のいずれかを特異的に認識し、したがってECD IIIa変異体(後出の表1を参照のこと)相互の違いを区別する抗体も、本発明に含まれる。そのような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAbs)、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片、F(ab’).sub.2断片、Fab発現ライブラリーによって産生された抗体、抗イディオタイプ(抗Id)抗体、これらのうちの任意のもののエピトープ結合断片などが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。本発明の抗体は、例えば、生物サンプル中のp68HER−2の特定のECD IIIa変異体を検出するのに使用できるため、患者のサンプルまたは組織サンプルに特定の変異体が存在しているかどうかや、特定の変異体の量が異常であるかどうかを調べることで、診断法または予後予測法の一部として利用できる。
【0034】
このような抗体は、テスト化合物が特定のp68HER−2変異体の発現および/または活性に対して及ぼす効果を評価するための化合物スクリーニング法と合わせて利用することもできる。さらに、このような抗体は、この明細書に記載したガン治療法と合わせて利用することができる。
【0035】
抗体産生のためには、例えばポリヒスチジン・タグを有するECD IIIa変異体ポリペプチド、ECD IIIa変異体ポリペプチドの断片、ECD IIIa変異体の機能的等価物、ECD IIIa領域の突然変異体などを注射することによってさまざまな宿主動物に免疫を確立するとよい。このような宿主動物の具体例をほんの少しだけ挙げるならば、ウサギ、マウス、ハムスター、ラットであるが、これだけに限定されるわけではない。宿主の種が何であるかに応じ、さまざまなアジュバントを用いて免疫応答を高めることができる。アジュバントとしては、フロイント(完全、不完全)アジュバント、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、リソレシチンなどの界面活性物質、ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシアニン、ジニトロフェノール、役に立つ可能性のあるヒトのアジュバント(BCG(カルメット−ゲランの細菌)など)、コリネバクテリア(Corynebacterium parvum)などが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【0036】
ポリクローナル抗体は、免疫確立した動物の血清に由来する異種混合の抗体群である。モノクローナル抗体は、特定の抗原に対する均一な抗体群であり、培養した継代細胞系によって抗体分子を産生させることのできる任意の方法で得られる。方法としては、ケーラーとミルシュタインのハイブリドーマ法(Nature、第256巻、495〜497ページ、1975年;アメリカ合衆国特許第4,376,110号)、ヒトB細胞ハイブリドーマ法(Kosbor他、Immunology Today、第4巻、72ページ、1983年;Cole他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第80巻、2026〜2030ページ、1983年)、EBV−ハイブリドーマ法(Cole他、『モノクローナル抗体とガン治療』、アラン R. リス社、77〜96ページ、1985年)が挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。このような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDというクラスのうちのどの免疫グロブリンでもよく、そのどのサブクラスでもよい。ハイブリドーマ産生mAbは、インビトロでもインビボでも培養することができる。インビボで大きな力価のmAbを産生させるというのが、現在のところ最も好ましい産生方法である。
【0037】
さらに、“キメラ抗体”を産生させるために開発された方法(Morrison他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第81巻、6851〜6855ページ、1984年;Neuberger他、Nature、第312巻、604〜608ページ、1984年;タケダ他、Nature、第314巻、452〜454ページ、1984年)、すなわち、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子と、適切な生物活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子をスプライスするという方法を利用することができる。キメラ抗体は、個々の部分がそれぞれ異なる動物種に由来する構成の分子であり、例えば、ネズミのmAbに由来する可変領域と、ヒト免疫グロブリンの定常領域とを有する抗体(ヒト化抗体)がそうである。
【0038】
また、一本鎖抗体の産生方法(アメリカ合衆国特許第4,946,778号;Bird、Science、第242巻、423〜426ページ、1988年;Huston他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第85巻、5879〜5883ページ、1988年;Ward他、Nature、第334巻、544〜546ページ、1989年)を改変してECD IIIa変異遺伝子産物に対する一本鎖抗体を産生させることもできる。一本鎖抗体は、Fv領域のH鎖とL鎖の断片をアミノ酸架橋を通じて結合させることによって形成され、一本鎖のポリペプチドになる。
【0039】
特定のエピトープを認識する抗体断片は、公知の方法で産生させることができる。そのような断片としては、例えば、抗体分子をペプシンで消化させて得られるF(ab’).sub.2断片、F(ab’).sub.2断片のジスルフィド結合を還元することにより得られるFab断片が挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。また、Fab発現ライブラリー(Huse他、Science、第246巻、1275〜1281ページ、1989年)を構成して、望む特異性を有するモノクローナルFab断片を迅速かつ容易に同定することもできる。
【0040】
同様に、特定のECD IIIa変異体に対する抗体は、当業者に周知の方法を用い、ECD IIIa変異体を“真似る”抗イディオタイプ抗体を産生させるのに用いることができる(GreenspanとBona、FASEB J、第7巻(5)、437〜444ページ、1993年;Nissinoff、J. Immunol.、第147巻、2429〜2438ページ、1991年)。例えばECD IIIa変異体に結合する一方で、p68HER−2がHER−2受容体に結合するのを競合的に抑制する抗体を用いると、ECD IIIa変異体を“真似し”、したがってHER−2受容体に結合してこのHER−2受容体を中性化する抗イディオタイプ抗体を産生させることができる。このような中性化抗イディオタイプ抗体、またはこのような抗イディオタイプ抗体のFab断片は、ガン治療の投薬計画において利用することができる。
【0041】
また、特定のECD IIIa変異体に対する抗体で、ECD IIIa変異体の活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用しうる抗体を産生させることができる。このような抗体は、ECD IIIa変異体と結合し、p185HER−2受容体を介したシグナル伝達に対するp68HER−2の活性を変化させる。このような抗体は、特定のガンの治療および/または腫瘍の分化の調節に特に役立つ可能性がある。したがって、本発明は、さらに、HER−2を過剰発現しているガンの治療の予後を予測する方法であって、(a)血液、血清、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択した体液サンプルを取得し、(b)ELISA、免疫沈降法、免疫組織化学法、ウエスタンブロット分析法からなるグループの中から選択して抗p68HER−2抗体をベースとしたアッセイを行なうことにより、発現したp68HER−2の量を測定する操作を含む方法を提供する。ガン治療の予後を予測するこの方法は、体液中のp185HER−2のECDの量を測定し、p68HER−2の量とp185HER−2の量の比を決定する操作をさらに含むことが好ましい。p185HER−2に対するp68HER−2の比の値が大きいほど患者の予後が優れている。
【0042】
診断/予後予測用の薬剤としてのECD IIIa領域変異体
実施例11(後出)は、ヒトのイントロン8の配列が、プロリン・リッチかつ多型であることを示している。別々の15人から採取したゲノムDNAをシークエンシングした結果、HER−2のイントロン8に可変配列領域が10箇所あることが同定された。配列ID番号10、図8、表1を参照のこと。図8は、イントロン8の最も一般的なヌクレオチド配列とそれに対応するポリペプチド配列を示している。この領域は、10通りの多型(配列ID番号10の中には文字W(2箇所)、Y(3箇所)、R、N、M、S(2箇所)で示し、図8には“X”で示してある)を含んでおり、その結果として保存されないアミノ酸置換が起こっている(表1の注を参照のこと)。例えば、ヌクレオチド配列の161位に多型(G→C)があると(図8;表1)、配列ID番号1のアミノ酸残基#54の位置、または配列ID番号2の残基#394の位置でアルギニン(R)がプロリン(P)に代わるはずである。図8または配列ID番号10の1位で示されるN末端のグリシン(G)は、“ハースタチン”配列のアミノ酸残基341に対応する(Doherty他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第96巻、10,869〜10,874ページ、1999年)。図1(A)に示したヌクレオチド配列(Doherty他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第96巻、10,869〜10,874ページ、1999年)は、図8に示した最も一般的であることがわかった配列と比べてアミノ酸残基#6と#73の位置のアミノ酸が異なる多型になっている。
【0043】
この結果は、ヒトの集団において、イントロン8がコードされている領域にいくつかのバリエーションが存在していて、ECD IIIaを含むタンパク質変異体相互の間で生化学的特性や生物学的特性が異なる可能性のあることを示している。ヒトは遺伝的に、特に、2つの変異体に関してヘテロ接合になっているか、所定の1つの変異体に関してホモ接合になっているか、1つの二重変異体に関してホモ接合になっているかの可能性がある。腫瘍の進行にせよ最適の治療にせよ、ある一人の人に現われる変異体が何であるかによって異なる可能性がある。
【0044】
この違いは、予後予測と診断のどちらにも役立つ。本発明は、ECD IIIaを含むポリペプチドがHER−2受容体に強固に結合でき、したがってこのHER−2受容体をアンタゴニスト化できることを示している。このような高アフィニティで特異的な相互作用は、ECD IIIaを含むポリペプチドの特殊な一次構造、二次構造、三次構造に依存する。ECD IIIa領域はプロリン・リッチであり、従来からよく知られていることとして、所定のタンパク質のプロリン・リッチ配列中にあるプロリン残基またはそれ以外の残基の保存されない置換は、このタンパク質の二次構造と三次構造に大きな影響を及ぼしうるということがある。したがって、本発明の多型は、(図8に示した)最も一般的な構造と比べて構造特性、生化学的特性、生物学的特性が大きく異なっているであろう。ECD IIIa変異体タンパク質相互間の構造上の違いとしては、例えば、サイズ、電気陰性度、抗原性の違いが挙げられる。ECD IIIa変異体相互間の生物学的特性の違いは、例えば、細胞分泌の程度、HER−2受容体の変化の性質および/または程度、薬物動態(例えば血清半減期、除去特性)、タンパク質分解に対する抵抗力、N結合型グリコシル化のパターンなどに見られるであろう。これら生物学的性質の違いが今度は腫瘍の進行を変化させることが予想され、したがって最適な治療のプロトコルを変化させることが予想される。そのため、ある人が特定の1つまたは複数のECD IIIa変異体を有することがわかっていると(例えば所定の1つの変異体に関してヘテロ接合である人、または表1の変異体11のように化合物変異体を有する人など)、そのことだけで、特定のガンになりやすさの予測ができる可能性がある。
【0045】
ECD IIIa領域の遺伝的違いが明らかになるということは、ある人が有する特定のECD IIIa変異体の性質を、その人の遺伝子診断を試みる前に配列同定アッセイによって確認できるはずであることを意味する。分析は、患者の体液に由来する任意のゲノムDNAについて行なうことができる。体液は、一般には大人または子どもの血液サンプルであるが、その代わりとして、血清、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、胎盤組織、臍帯組織、羊水、絨毛膜絨毛組織が可能である。ハイブリダイゼーションや増幅アッセイなどの標準的な遺伝子診断法を利用できると考えられる。特定のECD IIIa変異体配列を検出するのに、生物サンプルのハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイにおいて、DNAとRNAのいずれかを用いることができる。このような配列同定アッセイとしては、サザンブロット分析法、ノーザンブロット分析法、一本鎖構造多型分析法、インサイチュ・ハイブリダイゼーション・アッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応(“PCR”)分析法などが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。このような分析法により、ECD IIIa変異体配列の発現に関する特徴を定量的にも定性的にも明らかにすることができよう。特徴としては、例えば、点突然変異および/または遺伝子発現の活性化または不活化が挙げられる。標準的なインサイチュ・ハイブリダイゼーション法を利用すると、所定の組織内でどの細胞が特定のECD IIIa変異体配列を発現しているかに関する情報が得られる可能性がある。
【0046】
ECD IIIa変異体の核酸分子を検出する診断法は、分析する細胞種または組織に由来する核酸を、特定のECD IIIa変異体に対して特異的な、標識された1つまたはそれ以上の核酸試薬すなわちプローブと接触させて培養する操作を含んでいることが好ましい。さらに好ましいのは、PCRまたは逆転写PCRを利用してECD IIIa領域内の核酸の違いを同定することである。PCR反応の条件は、増幅された産物の収量と特異性が最適になるように選択するだけでなく、それに加えて、標準的なゲル電気泳動法を利用して分析できる長さを有する増幅産物が生成するように選択せねばならない。このような反応条件は当業者には周知であり、重要な反応パラメータとしては、例えば、オリゴヌクレオチド・プライマーの長さとヌクレオチド配列、アニーリングして伸長させるステップの温度、反応時間が挙げられる。PCR反応の後、PCR産物は、ヘテロ二本鎖検出、RNAアーゼAを利用したRNA−DNAハイブリッドの開裂、一本鎖構造多型、変性用勾配ゲル電気泳動などの方法で分析することができる。
【0047】
さらに、特定のECD IIIa配列変異体が、制限部位を付加したり除去したりすること、また特定の制限断片のサイズを有意に変化させてしまっていることがわかっている場合には、制限断片長多型(“RFLP”)分析に基づいたプロトコルが適切である可能性がある。
【0048】
ECD IIIa変異体は、患者由来の体液に対して配列同定アッセイを行なうことにより、発現レベルで分析することもできる。体液は、一般には大人または子どもの血液サンプルであるが、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、胎盤組織、臍帯組織、羊水、絨毛膜絨毛組織などでもよい。発現を分析するためのよく知られている配列同定アッセイとしては、mRNAをベースとした方法、例えばノーザンブロット法、(関係するcDNAに由来する核酸プローブを利用した)インサイチュ・ハイブリダイゼーション法、(St−Jacques他、Endocrinology、第134巻、2645〜2657ページ、1994年に記載されている)定量的PCR法が挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【0049】
興味の対象であるECD IIIa変異体に対して特異的な抗体を利用することを含む、ポリペプチドをベースとした方法(例えばウエスタンブロット分析法があるが、これだけに限定されるわけではない)も、上に説明したように、利用することができよう。これらの方法により、所定のECD IIIa変異体の発現量を少なくとも正と負の制御に関して定量することができる。さまざまなECD IIIaのエピトープまたは変異体に対して特異的な種々のモノクローナル抗体を利用し、特定のECD IIIa変異体を発現している細胞サンプルまたは組織サンプルを迅速にスクリーニングすること、またはECD IIIa変異体ポリペプチドのレベルを定量することができると好ましい。ECD IIIa変異体ペプチド分子を定量的または定性的に検出するための好ましい診断法としては、例えば、特定のECD IIIaを含むペプチドが、抗ECD IIIa変異体に対して特異的な抗体との相互作用によって検出されるというイムノアッセイが挙げられる。これは、例えば、蛍光標識した抗体を用いる蛍光抗体法を、光学顕微鏡検出、フローサイトメトリー検出、蛍光定量検出のいずれかと組み合わせることによって実現できる。さらに、本発明で有用な抗体(またはその断片)を蛍光抗体法または免疫電子顕微鏡法などにおけるように組織構造を知るのに利用し、ECD IIIaを含むペプチドを本来存在している場所で検出することもできる。このような方法を利用すると、特定のECD IIIaを含むポリペプチドの存在だけでなく、検査している組織内におけるそのペプチドの分布も検出することができる。
【0050】
ECD IIIa変異体ポリペプチドのイムノアッセイには、ECD IIIaを含むペプチドの同定が可能な検出可能標識をした抗体の存在下で培養した生物サンプル(例えば具体例を列挙した上記の体液)を培養し、結合した抗体を従来技術で周知の多数ある方法のうちの任意の方法で検出する操作が含まれていることが好ましい。生物サンプルは、ニトロセルロースなどの固相支持体または担体や、可溶性タンパク質、細胞、細胞粒子を固定することのできる他の固相支持体と接触させて、その上に固定化するとよい。固相支持体を適切な緩衝液で洗浄した後、抗ECD IIIa変異体に特異的な検出可能標識抗体で処理する。次に、緩衝液を用いて固相支持体の2回目の洗浄を行ない、結合していない抗体を除去する。続いて、固相支持体上に結合している標識の量を従来法で検出する。
【0051】
別の方法として、抗ECD IIIa変異体に対して特異的な抗体を、酵素イムノアッセイすなわち固相酵素免疫検定法(“ELISA”)で使用する酵素に結合させることにより、この抗体に検出可能な標識をすることができる。抗体と結合する酵素は、適切な基質、好ましくは発光性基質と反応して化学基を生成させるため、それを例えば分光光度計、蛍光測定手段、目視などによって検出することができる。抗体に対する検出可能な標識として使用できる酵素としては、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカル・ヌクレアーゼ、Δ−5−ステロイド・イソメラーゼ、酵母のアルコール・デヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコース・オキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【0052】
検出は、酵素に対する発光性基質を用いる熱量測定法によって実現することができる。検出は、目視により酵素反応の程度を適切な基準と比較することによって行なうこともできる。検出は、多彩な他のイムノアッセイ法のうちの任意の方法を用いて実現することもできる。例えば、抗体または抗体断片に放射性標識することにより、放射線免疫検定法(RIA)を利用してECD IIIaを含むペプチドを検出することが可能である。放射性同位体は、γ線カウンター、シンチレーション・カウンターなどの手段により、あるいは放射能写真撮影により検出することができる。
【0053】
抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光標識した抗体を適切な波長の光に曝露すると、蛍光のためにその抗体の存在が検出できる。最もよく使われる蛍光標識化合物としては、フルオレセイン・イソチオシアナート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o−フタルアルデヒド、フルオレスカミンがある。
【0054】
抗体に対しては、152Euやランタノイド系列に属する他の蛍光発光金属を用いて検出可能な標識をすることもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)などの金属キレート化剤を用いて抗体に付着させることができる。
【0055】
抗体は、化学発光化合物と結合させることによって検出可能な標識をすることもできる。化学発光体をタグとして有する抗体の存在は、化学反応中に発生する蛍光の存在を検出することによって明らかにされる。特に有用な標識用の化学発光化合物の具体例としては、ルミノール、イソルミノール、セロマティック・アクリジニウム・エステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステルがある。同様に、生物発光化合物を用いて本発明の抗体に標識することもできる。生物発光は、生物系で見つかった化学発光の一種であり、生体内で触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増大させている。生物発光タンパク質の存在は、蛍光の存在を検出することによって明らかにされる。標識の目的で重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、エクオリンである。
【0056】
抗ECD IIIa変異体に対して特異的な所定ロットの抗体の結合活性は、周知の方法で測定することができる。当業者であれば、定法を利用することによりそれぞれの測定におけるアッセイの操作条件や最適条件を決定できるはずである。
【0057】
したがって、本発明は、プロリン・リッチなECD IIIa領域内に複数の可変配列位置が予想外に発見されたこと、また特定のECD IIIa変異体に対して特異的な抗体が予想外に発見されたことに基づき、予後予測および診断に関する重要な情報とアッセイを提供する。
【0058】
したがって、本発明は、さらに、HER−2を過剰に発現しているガン患者のガン治療の予後を予測する方法であって、(a)患者の血液、血清、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、胎盤組織、臍帯組織、羊水、絨毛膜絨毛組織、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択したから体液サンプルを取得し、(b)ELISA、免疫沈降法、免疫組織化学法、ウエスタンブロット分析法からなるグループの中から選択して抗p68HER−2抗体をベースとしたアッセイを行なうことにより、発現したp68HER−2の量を測定する操作を含む方法を提供する。ガン治療の予後を予測するこの方法は、体液に含まれるp185HER−2のECDの量を測定し、p68HER−2の量とp185HER−2の量の比を決定する操作をさらに含むことが好ましい。p185HER−2に対するp68HER−2の比の値が大きいほど患者の予後が優れている。ガン治療の予後を予測するこの方法は、特定のどのECD IIIa変異体が存在しているかを明らかにし、さまざまなECD IIIaタンパク質変異体の個々の生化学的特性と生物学的特性を考慮してガンの治療を最適化する操作をさらに含むことが好ましい。
【0059】
本発明は、さらに、ガン患者のガンの治療、予後予測、または診断を行なう方法であって、(a)患者の血液、血清、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、胎盤組織、臍帯組織、羊水、絨毛膜絨毛組織、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択した体液サンプルを取得し、(b)配列同定アッセイにより、この体液サンプル中に特定のECD IIIa変異体配列が存在しているかどうかを判定し、(c)歴史データベースを用いて、このECD IIIa変異体配列の存在をガンの治療および診断と関連づける操作を含む方法を提供する。上記の配列同定アッセイは、DNAシークエンシング、PCRアッセイ、ELISA免疫アッセイ、イムノアッセイ、ハイブリダイゼーション・アッセイ、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択することが好ましい。
【0060】
本発明は、さらに、患者のガンの治療、予後予測、または診断を行なう方法であって、(a)患者の血液、血清、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、胎盤組織、臍帯組織、羊水、絨毛膜絨毛組織、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択したから体液サンプルを取得し、(b)ELISA、免疫沈降法、免疫組織化学法、ウエスタンブロット分析法からなるグループの中から選択して抗p68HER−2抗体をベースとしたアッセイを行なうことにより、この体液サンプル中にp68HER−2のECD IIIa変異体が存在しているかどうかを判定し、(c)歴史データベースを用いて、このp68HER−2のECD IIIa変異体の存在またはその量をガンの治療および診断と関連づける操作を含む方法を提供する。
【0061】
本発明は、さらに、ガンの治療、予後予測、または診断を行なう上記の方法が、体液サンプルに含まれるp185HER−2のECDの量を測定する操作をさらに含む方法を提供する。
【0062】
本発明は、さらに、ガンの治療、予後予測、または診断を行なう上記の方法が、体液中のp185HER−2のECDの量を測定し、p185HER−2のECDの量と特定のp68HER−2のECD IIIa変異体の量の比を測定する操作をさらに含む方法を提供する。
【0063】
本発明は、さらに、後に示す配列ID番号1または配列ID番号2の配列のECD IIIa変異体に対して特異的な抗体を提供する。
【0064】
治療薬としてのp68HER−2
理論に囚われないとすると、p68HER−2またはECD IIIaペプチドは、細胞表面でp185HER−2に結合することにより、HER−2を過剰に発現している腫瘍細胞の成長を抑制しているように思われる。この仮説の検証を、p68HER−2の存在下および不在下で基質とは独立な細胞の成長をテストすることにより行なった。そのとき用いた細胞の内部では、p185HER−2の過剰発現の程度に応じて悪性腫瘍が成長するが、p68HER−2はほとんど存在しないか検出できない。腫瘍の細胞毒性を予測するモデルとして、柔らかい寒天における、基質とは独立な細胞の成長を用いた。これは、形質転換活性を調べるための一般的な予測方法であり、細胞が腫瘍またはガンを発生させる能力を反映している(DiFiore他、Science、第237巻、178〜182ページ、1987年;Hudziak他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第84巻、7159〜7163ページ、1987年;Baasner他、Oncogene、第13巻、901〜911ページ、1996年)。
【0065】
柔らかい寒天において基質とは独立な細胞の成長にp68HER−2が及ぼす効果を、SKOV−3ガン細胞と、HER−2をトランスフェクトした17−3−1細胞を用いて測定した。両方の細胞とも腫瘍生成能力があり、p185HER−2を過剰発現している。これら細胞を、p68HER−2の存在下および不在下でウシ胎仔血清を補充した培地に分散させ、湿潤な培養器の中で21日間培養した。50個を超える細胞が含まれるコロニーの数を数えることにより、基質とは独立な細胞の成長を定量した。図7は、p68HER−2の存在下で、SKOV−3細胞と17−3−1細胞の両方に関し、基質とは独立な成長が数分の一に抑制されたことを示している。したがって、これらのデータは、p68HER−2が単に細胞毒性だけを有するのではなく、細胞毒性に加え、おそらくアポトーシス誘導性も有することを示している。
【0066】
ハースタチンを同時に発現させることによりp185HER−2のレベルが抑制され、コロニーの形成が抑制される
ハースタチンの異所発現が、トランスフェクトされたCos−7細胞中のp185HER−2に及ぼす効果を調べた。図9は、HER−2のみをトランスフェクトした細胞と比べると、ハースタチンも同時に発現させたときにはp185のレベルが約5分の1に低下したことを示している。ハースタチンの発現によってトランスフェクトされた細胞の生存率が低下するのであれば、そのことにより、同時にトランスフェクトされた細胞中でp185HER−2のレベルが低下することが説明できる。マーカー用ガラクトシダーゼ・プラスミドの発現が、同時にトランスフェクトされた細胞中で変化しているかどうかを調べた。図10は、ガラクトシダーゼ・プラスミドをp185HER−2と同時にトランスフェクトした場合にガラクトシダーゼ活性が最大となり、対照(pcDNAエンプティ・プラスミド)を同時にトランスフェクトした場合よりも約35%大きくなることを示している。p185HER−2とガラクトシダーゼ・プラスミドに加えてハースタチンを細胞に同時にトランスフェクトした場合には、ガラクトシダーゼ活性が約3分の1に低下した。この低下は、別の2つの細胞系、CHOとHEK−293でも観察された。さらに、同程度の抑制が、ハースタチンとHER−2をトランスフェクトした細胞中で別のマーカーである蛍光グリーン・タンパク質(FPG)の発現を調べたときにも観察された(図示せず)。これらの結果は、HER−2のみをトランスフェクトした場合には同時にトランスフェクトしたマーカーのレベルを増加させるのに対し、ハースタチンとHER−2を同時に発現させるとマーカーのシグナルが低下することを示している。1つの可能な説明は、トランスフェクトされた細胞の生存は、p185HER−2の発現によって増大し、ハースタチンとp185HER−2の同時発現によって抑制されるというものである。
【0067】
コロニーの形成に及ぼす直接的な効果を測定するため、CHO細胞に対してトランスフェクションを行ない、20日間にわたってG418による選択を実施し、生き残った細胞のコロニーを染色して定量した。CHO細胞は、安定なトランスフェクションがなされた細胞を素早く増殖させるのに非常に適している。図11に示したように、p185HER−2をトランスフェクトすると、対照をトランスフェクトした細胞と比べてコロニーの増殖が約60%増加したが、ハースタチンだけを発現させた場合には、増殖に有意な変化は見られなかった。しかしハースタチンをHER−2と同時にトランスフェクトすると、HER−2だけをトランスフェクトした細胞と比べてコロニー形成が劇的に約7分の1に低下した(図11)。
【0068】
ハースタチンの発現によりp185HER−2のチロシンリン酸化が抑制される
ハースタチンの発現がp185HER−2に及ぼす効果をさらに評価するため、p185HER−2発現プラスミドに対するハースタチンの割合を変化させた。ハースタチン発現プラスミドをp185HER−2発現プラスミドの5分の1のレベルで導入した場合には、p185に対する影響はほとんどなかった。図14に示したように、HER−2プラスミドに対してハースタチン発現プラスミドの量を増やしていくと、p185HER−2のレベルが低下し、図1に示したように、トランスフェクトしたマーカーGFPプラスミドの発現も低下した。それとは対照的に、図13に示したように、対照であるGFP発現プラスミドだけをトランスフェクトすると、細胞の生存には影響を与えることはなく、添加したプラスミドの量に比例してGFPの発現が増えた。したがって、ウエスタンブロット分析により検出したp185HER−2のレベル低下は、トランスフェクトされた細胞の生存率が低下したことと関係しているように思われる。図15のレーン6に示したように、p185HER−2のレベルが3分の1に低下したのに対し、p185HER−2のチロシンリン酸化シグナルは25分の1に減った。これは、p185HER−2のチロシンリン酸化のレベルが約8分の1に低下したことを示している。p185のチロシンリン酸化が抑制される程度は、HER−2発現プラスミドに対するハースタチンの割合によって影響され、この比が1:2のときに最も強い効果が観察された。図15に示したように、レーン1とレーン6を比較すると、ハースタチン・プラスミドだけをトランスフェクトした場合には185kDaのタンパク質に付随するチロシンリン酸化シグナルが約2分の1に低下したことがわかる。トランスフェクトしたプラスミドから発現したp185HER−2と同時にp185タンパク質が移動したが、このp185タンパク質は内在性p185HER−2である可能性がある。これらの結果は、ハースタチンを異所発現させると外来性p185HER−2のチロシンリン酸化が減少すること、また、HER−2発現プラスミドに対するハースタチンの割合が、p185HER−2のチロシンリン酸化を抑制する程度とp185の発現レベルとに影響を与えることを示している。さらに、これらの知見から、p185HER−2のチロシンリン酸化の減少が、HER−2とハースタチンを同時にトランスフェクトした細胞のコロニー形成の減少と関係していることもわかる。
【0069】
ハースタチンの発現により、p185HER−2を過剰発現している細胞のコロニー形成が強く抑制される。さらに、ハースタチンは、EGF受容体の過剰発現によって増加した生存率を引き下げる。細胞生存率の低下は、p185HER−2のチロシンリン酸化が減少することと、EGFによるEGF受容体の活性化が妨げられることに対応している。さらに別の証拠は、p185HER−2に対する抑制活性として現われており、ハースタチンの負の調節活性は、グループIファミリーに属する受容体チロシンキナーゼの第2のメンバーであるEGF受容体にまで及んでいる。
【0070】
ハースタチンは、p185HER−2のチロシンリン酸化を抑制する。ハースタチンをトランスフェクトすると、異所発現したp185の構成的チロシンリン酸化のレベルが8分の1に低下する。この抑制は、トランスフェクトされたCHO細胞、HEK−293細胞、Cos−7細胞で観察される。ハースタチンによってp185のチロシンリン酸化がどの程度抑制されるかは、ハースタチンの投与量に依存する。というのも、抑制度は、細胞に添加されるHER−2プラスミドの量に対するハースタチンの量の影響を受けるからである。ハースタチンは、受容体のリン酸基転移反応と活性化に不可欠なステップである受容体のダイマー化を妨げることにより、p185HER−2受容体のチロシンリン酸化を抑制できる可能性がある。
【0071】
ハースタチンが異所発現すると、EGFによるEGF受容体(p185HER−2と相同性があるグループIの受容体)の活性化も妨げられた。ハースタチンは、EGFにより誘起される受容体のチロシンリン酸化を減少させ、別の2つの細胞質タンパク質がEGFからの刺激を受けてチロシンリン酸化するのを抑制し、受容体のダウンレギュレーションを妨げた。受容体のチロシンリン酸化とダウンレギュレーションは、EGFによりEGF受容体が活性化されたことの証拠である。ハースタチンによるEGF受容体の抑制は、EGFの飽和濃度で起こった。ハースタチンのC末端に位置する、イントロン8によってコードされている領域は、p185HER−2に対して高アフィニティで結合するらしく、EGF受容体と結合するが、EGFの結合とは競合しない(Doherty他、投稿中)。これらの結果は、ハースタチンが、増殖因子の結合との競合を含まないメカニズムによってEGF受容体の活性化を阻止していることを示唆している。別の研究によれば、ハースタチンは“プルダウン”アッセイにおいてEGF受容体と結合することがわかっている(Doherty他、投稿中)。ハースタチンはEGF受容体と安定な複合体を形成するように見えるため、EGFにより誘起されるホモダイマーの形成を抑制する可能性がある。EGFにより誘起されるホモダイマーの形成をハースタチンが阻止することによって、あるいは受容体との複合体形成を含まない別のメカニズムによって、ハースタチンがEGF受容体を間接的に抑制することもありうる。
【0072】
p185HER−2またはEGF受容体の過剰発現により、細胞の増殖および/または生存が促進される。細胞にp185HER−2をトランスフェクトすると、G418による選択を生き延びたコロニーの数が、対照をトランスフェクトした細胞と比べて約60%増加した。また、EGF受容体をトランスフェクトすると、細胞コロニーの数が対照をトランスフェクトした細胞と比べて約40%増加した。ハースタチンだけをトランスフェクトしても、コロニーの数が有意に変化することはなかったが、CHO細胞内にp185HER−2と同時に移動した内在性タンパク質に付随するチロシンリン酸化は確かに減った。CHO細胞はp185HER−2以外はグループIの受容体をほとんど含んでいないかまったく含んでいないため、これはp185HER−2であろう。ハースタチンをEGF受容体と同時に発現させると、EGF受容体だけをトランスフェクトした細胞と比べてコロニーの形成が抑制された。ハースタチンがEGFによるEGF受容体の活性化も抑制し、EGF受容体と安定な複合体を形成することが見いだされた(Doherty他、投稿中)ため、増殖の抑制は、ハースタチンがEGF受容体と不活性なキナーゼ複合体を形成したため、あるいは内在性p185HER−2と複合体を形成することによりEGF受容体のトランス作用を抑制したためである可能性がある。増殖の抑制は、EGF受容体またはp185HER−2との相互作用とは直接関係しない、ハースタチンの未知の独立な作用によって起こった可能性もある。最も強力な増殖抑制活性は、ハースタチンをp185HER−2と同時に発現させたときに観察された。この組み合わせにすると、コロニーの形成は、p185HER−2だけをトランスフェクトした細胞と比べて7分の1に減り、ハースタチンだけをトランスフェクトした細胞または対照をトランスフェクトした細胞と比べて5分の1に抑制された。過剰発現したp185HER−2は、細胞内で構成的活性を持っており、その活性を止めると、細胞の増殖だけでなく生存まで抑制される可能性がある。
【0073】
ハースタチンは、これまでに知られているグループIの他のRTK抑制剤と比べると、ドミナント・ネガティブな抑制剤として機能するp185neu細胞外領域突然変異体との共通性をいくつか有することがわかる。ハースタチンと同様、膜に固定されたドミナント・ネガティブなneu突然変異体は、受容体の細胞外領域からの配列を含んでおり、RTKと複合体を形成する(Doherty他;Greene)。また、p185neu細胞外領域と異所発現したハースタチンは、p185HER−2とEGF受容体を抑制することが可能である。サブドメインI〜IVと膜へのアンカーとからなる、以前に報告されているp185neu細胞外領域とは異なり、ハースタチンは、p185neu細胞外領域からのサブドメインIとIIしか含んでおらず、胎仔の腎臓細胞と肝臓細胞で発現する天然産物である(Doherty他、1999年)。ハースタチンは分泌されるので、複合体を形成するための膜アンカーは必要なく、抑制活性を及ぼすこともない。
【0074】
実施例1
この実施例では、細胞外領域(ECD)をコードしている配列中のHER−2のmRNAの多様性を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を利用して調べた実験の結果を示す。HER−2遺伝子が8倍に増幅されている卵巣ガン細胞系(Tyson他、Am. J. Obstet. Gynecol.、第165巻、640〜646ページ、1991年)である、(アメリカ基準培養株コレクション(ロックヴィル、メリーランド州)が、10%のウシ胎仔血清と0.05%のゲンタマイシンを補充したDMEM中に維持している)SKOV−3細胞からのcDNAライブラリーを、エキソン1(Tal他、Mol. Cell. Biol.、第7巻、2597〜2601ページ、1987年)に対して特異的でヌクレオチド142〜161と一致する順プライマーと、エキソン9(Scott他、Mol. Cell. Biol.、第13巻、2247〜2257ページ、1993年)のヌクレオチド1265〜1286に相補的な逆プライマーとを用いて調べた。簡単に説明するならば、SKOV−3のcDNAライブラリーは、オリジーン・テクノロジーズ社(ロックヴィル、メリーランド州)から提供してもらうか、SKOV−3細胞から抽出したRNAから調製するかした。トリリージェント(モレキュラー・リサーチ・センター社、シンシナチ、オハイオ州)を製造業者のプロトコルに従って用いることで15cmのプレート上に80%の集密度で成長したSKOV−3細胞からRNAを抽出し、全RNAを得た。RNAは、逆転写およびcDNAライブラリー構成のために10mMのトリスEDTA、pH8.0に再び分散させるか、リボヌクレアーゼ保護アッセイ(RPA)のためにRNAハイブリダイゼーション用緩衝液(80%のホルムアルデヒド、40mMのPIPES、4mMのNaCl、1mMのEDTA、pH7.5)に再び分散させるかした。RNAの濃度は、分光光度計でOD260における値を測定した。mRNA抽出キット(オリゴテックス、キアジェン社)を用いてポリA+mRNAを全RNAから選択した。
【0075】
サザンブロット法によってHER−2に特異的であることがわかった約1420bpの産物は、以前に報告されたcDNA配列(Coussens他、Science、第230巻、1132〜1139ページ、1985年)から予想される1144bpというサイズよりも約270bp大きかった。簡単に説明するならば、サザンブロット法の手続きに従い、真空下(バイオ−ラド・モデル785ヴァキューム・ブロッター)にある0.4MのNaOH中のアガロース・ゲルから核酸を遺伝子スクリーン・プラス・ハイブリダイゼーション・トランスファー膜(ネン・リサーチ・プロダクツ社、ボストン、マサチューセッツ州)に移した。UV−ストラターリンカー(ストラタジーン社、ラ・ジョラ、カリフォルニア州)の中でUV架橋させることにより核酸を膜に固定し、その膜をハイブリダイゼーション用緩衝液(50%のホルムアルデヒド、5×SSC、1%のSDS、10mg/mlのニシンの精子DNA)中で42℃にて2時間にわたってブロックした。ランダム・プライムDNA標識キット(ベーリンガー・マンハイム社)を用い、膜を、ハイブリダイゼーション用緩衝液中で、42℃にて16時間にわたり、(α−32P)dCTP(ネン・ライフ・サイエンシーズ社)で標識したECD IIIaのcDNAからの220bpのKpn−HincII断片107cpmとハイブリダイズさせた。
【0076】
鋳型を、2.5mMのMgCl2、5μgの各プライマー、200μMのdNTPを含む1×ハイ・フィデリティPCR緩衝液とともに、拡張ハイ・フィデリティPCRシステム(ベーリンガー・マンハイム社)を用いてパーキン・エルマー遺伝子増幅PCRシステム2400(パーキン・エルマー・シータス社、エメリーヴィル、カリフォルニア州)の中で増幅した。すべてのプライマーは、GIBCO BRL社(ライフ・テクノロジーズ社)から得られた。ヌクレオチド残基とアミノ酸残基の番号は、Coussens他が報告しているHER−2のcDNA配列(Coussens他、Science、第230巻、1132〜1139ページ、1985年)に従っている。HER−2の細胞外領域を増幅のターゲットとし、順プライマー(A)(5’−TGAGCACCATGGAGCTGGC−3’[配列ID番号3])と、逆プライマー(B)(5’−TCCGGCAGAAATGCCAGGCTCC−3’[配列ID番号4])を用いてSKOV−3のcDNAライブラリー(オリジーン・テクノロジーズ社)から増幅した。順プライマーは、HER−2のcDNAのヌクレオチド(nt)142〜161と一致していて開始コドン(下線部)の周囲に広がっており、逆プライマーは、HER−2のエキソン配列のnt1265〜1286と相補的になっている。サイクルのパラメータは、94℃で30秒間;58℃で45秒間;68℃で3分間を30サイクルである。ゲノムDNAからの(ECD IIIaと表記する)新規な配列の周囲に広がっている領域は、HER−2のエキソンに対して特異的な配列のnt1131〜1152と一致する順プライマー(C)(5’−AACACAGCGGTGTGAGAAGTGC−3’[配列ID番号5])と、報告されている(Bond他、FEBS Letters、第367巻、61〜66ページ、1995年)ようにして調製したDNAに関する逆プライマー(B)[配列ID番号4]を用いて増幅した。サイクルのパラメータは、94℃で30秒間;62℃で30秒間;72℃で60秒間を25サイクルである。
【0077】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)を利用し、ECD IIIa配列を含むmRNAの構造を調べた。まず最初に鎖状cDNAを、0.5μgのオリゴ−dTで処理した5μgのRNAを用いて逆転写した(Bond他、FEBS Letters、第367巻、61〜66ページ、1995年)。ECD IIIa挿入体とそれに隣接する5’HER−2エキソン配列を増幅するため、上記の順プライマー(A)と、3’ECD IIIaに対して特異的な配列に相補的な逆プライマー(D)(5’−ATACCGGGACAGGTCAACAGC−3’[配列ID番号6])を用いた。サイクルのパラメータは、94℃で30秒間;60℃で40秒間;68℃で2分間を30サイクルである。
【0078】
ECD IIIa挿入体とそれに隣接する3’HER−2エキソンに対して特異的な配列の増幅を、順プライマー(E)(5’−TCTGGGTACCCACTCACTGC−3’[配列ID番号7])と、逆プライマー(F)(5’−TTCACACTGGCACGTCCAGACC−3’[配列ID番号8])を用いて行なった。順プライマーは、5’ECD IIIaに対して特異的な配列と一致していてKpn1制限部位を含んでおり、逆プライマーは、HER−2のエキソン配列のnt3898〜3919と相補的で、終止コドン(下線部)のまわりに広がっている。サイクルのパラメータは、94℃で30秒間;60℃で40秒間;68℃で5分間を30サイクルである。
【0079】
PCR産物をサブクローニングしてヌクレオチド配列を決定した。
その結果は、正常なHER−2をコードしている配列が、5’プライマー配列から始まって中断することなくヌクレオチド1171まで続いていることを示していた。そしてこの位置で、274個のヌクレオチドからなる挿入体が見つかり、その後には予想されるコード配列が続き、その中に3’プライマーが含まれていた。予想されるタンパク質産物を分析した結果、274個のヌクレオチドからなる挿入体が、残基番号340から始まる既知のHER−2タンパク質の延長部をコードしており(Coussens他、Science、第230巻、1132〜1139ページ、1985年)、アミノ酸が79個続いた後にイン・フレーム終止コドンが存在していることを示していた(図1)。挿入されたヌクレオチドとそのヌクレオチドから予想されるアミノ酸配列を遺伝子バンクの配列と比較したところ、相同な配列は見つからなかった。この配列の5’接合部と3’接合部を調べたところ、共通するスプライス・ドナー部位とスプライス・アクセプター部位が明らかになり(SharpとBurge、Cell、第91巻、875〜879ページ、1997年)、挿入配列の3’末端近傍に、ピリミジン領域と、分岐点となる可能性のあるアデニン残基が含まれていることがわかった(図1)。したがって、この挿入配列はイントロンらしい。
【0080】
挿入配列によってコードされる新規な79個のアミノ酸として予想されるアミノ酸配列[配列ID番号1]を調べると、共通のN結合型グリコシル化部位があることと、19%という高い割合でプロリンが含まれていることがわかる(図1)。挿入配列は、p185HER−2配列の細胞外領域中のサブドメインIIとIIIの間に位置しているため(Lax他、Mol. Cell. Biol.、第8巻、1831〜1834ページ、1988年)、ECD IIIaと表記した。この挿入配列は、隣接する5’HER−2エキソン配列と236ntにわたってイン・フレームであり、その中に終止コドンが含まれている。
【0081】
実施例2
この実施例では、ゲノム内でHER−2のエキソンと隣接しているECD IIIaの特性を明らかにする実験の結果を示す。ECD IIIa配列が存在する領域におけるHER−2遺伝子の構造を調べるため、ヌクレオチド763〜785と一致する順プライマーと、HER−2のcDNAのヌクレオチド1265〜1286と相補的な逆プライマーを用い、ヒトゲノムDNAについてPCRを行なった。増幅産物は、エキソン5(Tal他、Mol. Cell. Biol.、第7巻、2597〜2601ページ、1987年)からECD IIIa配列の3’に近接するエキソンまで広がっていることが予想された。イントロンの数とサイズは、PCR産物のサイズ、制限消化分析、増幅産物の部分配列の分析に基づいて推定した。
【0082】
次に、HER−2のエキソンに特異的で挿入体に直接接するプライマーを用いてヒトゲノムDNAを調べ、ECD IIIa配列に直接接している配列を決定した。約430bpの産物を、正常なヒトゲノムDNAからと、3種類のガン細胞系SCOV−3、SKBR−3、BT474から抽出したゲノムDNAから増幅した。これらすべてのガン細胞系においてHER−2遺伝子が増幅されており(Kraus他、EMBO J.、第6巻、605〜610ページ、1987年)、cDNAにECD IIIaを発現していることがわかった。PCR産物がHER−2であることが、実施例1に記載した方法を利用したサザンブロット分析によって確認された。ヌクレオチド配列を分析したところ、ヒトゲノムDNAからのPCR産物がECD IIIa挿入体を含んでおり、その両側が、HER−2をコードしている既知の配列に接していることがわかった。突然変異または再配置は見られなかった。これらのデータは、ECD IIIa配列が、完全な状態で保持されたイントロンであることを表わしており、増幅された産物がイントロン4の次に大きなサイズであることと、相同なEGFR遺伝子およびHER−2遺伝子のイントロン8の位置(LeeとMaihle、Oncogene、第16巻、3243〜3252ページ、1998年)とに基づくと、このイントロンがイントロン8であるらしいことを示している。
【0083】
実施例3
この実施例では、ECD IIIaが、HER−2のmRNAのコード配列内に保持されている唯一のイントロンであることを示す。ECD IIIa挿入配列を含むmRNAの中に別のイントロンが含まれているかどうかを明らかにするため、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)を行なった。まず最初に、5’HER−2のcDNA配列の142〜161と一致していて開始コドンを含む順プライマーと、3’ECD IIIa配列と相補的な逆プライマーを、SKBR−3とSKOV−3のcDNAに対して用いた。1.3kbの産物が増幅された。これは、この産物がイントロン8以外のイントロンを含んでいない場合に予想されるサイズである。次に、5’ECD IIIa配列と一致した順プライマーと、3’HER−2のcDNA配列のヌクレオチド3898〜3919に相補的でp185HER−2の終止コドンを含む逆プライマーとを用い、3’HER−2コード配列を増幅した。2.9kbの産物が増幅された。これは、この産物が別のイントロンを含んでいない場合にHER−2のcDNAから予想されるサイズである。
【0084】
制限消化分析とヌクレオチドのシークエンシングにより5’増幅産物(1.3kb)と3’増幅産物(2.9kb)の両方についてキャラクテリゼーションを行なったところ、別のイントロンは保持されていないことがわかった。イントロン配列が含まれているときに増幅される産物のサイズを決定するため、ゲノムDNAをPCR反応の鋳型として用いた。その結果、5’コード配列に対しては約10kbの産物、3’コード配列に対しては約5kbの産物が得られた。これらの結果は、5’非翻訳領域(5’UTR)と3’非翻訳領域(3’UTR)のサイズが以前に報告されている約4.5kbのHER−2のcDNA(Coussens他、Science、第230巻、1132〜1139ページ、1985年)と同じであるならば、274bpのイントロンが保持されていることで生まれるHER−2の新規な転写産物の予想サイズが約4.8kbとなることを示している。
【0085】
実施例4
この実施例では、ECD IIIa配列を含むタンパク質の発現を示す。新規な配列がタンパク質産物に翻訳されるかどうかを調べるため、ECD IIIa配列を細菌内でポリヒスチジン・タグを有するペプチドとして発現させ、このペプチドをニッケル・アフィニティ・クロマトグラフィにより精製し、この精製ペプチドに対する抗血清を得た。簡単に説明するならば、プライマーEと、ECD IIIa挿入配列の3’末端に相補的な逆プライマーとを用いてSKOV−3のcDNAライブラリーからECD IIIaを増幅することによって細菌の発現ベクターを調製した。逆プライマーはBamH1制限部位配列を含んでおり、(実施例1と2に記載した)RPAにおいて鋳型を構成するのに用いたプライマーと同じであった。約280bpというPCR増幅産物をKpn1とBamH1で消化させ、ゲル(キアエックスII、キアジェン社、チャッツワース、カリフォルニア州)で精製し、クローニングしてpET30aベクターに組み込んだ。このベクターは、発現したタンパク質のアミノ末端の位置に6個のヒスチジンからなるタグをコードしている(ノヴァジェン社、マディソン、ウィスコンシン州)。得られたpET−ECD IIIa発現ベクターを利用して細菌株BL21を形質転換した。
【0086】
ECD IIIaタンパク質産物を発現させるため、pET−ECD IIIa発現ベクターで形質転換したBL21細胞をLB培養液の中で30μg/mlのカナマイシンとともに37℃にて4時間にわたって増殖させた。0.1mMのIPTGで3時間にわたって発現を誘導し、回収した細胞を超音波処理して溶解させ、次に39,000×gで20分間遠心分離した。室温で60分間にわたって撹拌しながら上澄みをNi−NTAアガロース樹脂(キアジェン社)に吸収させた。この樹脂を10容積の洗浄用緩衝液(10mMのトリスpH7.9と300mMのNaCl)で洗浄し、次に、50mMのイミダゾールを加えた10容積の洗浄用緩衝液で洗浄した。ヒスチジン・タグを有するECD IIIaタンパク質を、250mMのイミダゾールを加えた洗浄用緩衝液中に溶離させた。ヒスチジン・タグを有するこのタンパク質は、ゲルをクーマシー・ブルーで染色することにより、約90%の純度であると推定された。このタンパク質を用いて抗体を産生させ、その抗体のキャラクタリゼーションを行なった。
【0087】
簡単に説明するならば、コカリコ・バイオロジカルズ社(リームズタウン、ペンシルヴェニア州)に依頼し、2匹のウサギにポリヒスチジン・タグを有する精製ECD IIIaペプチド(以下に記載)を注射することにより抗ECD IIIa抗血清を生産してもらった。p185HER−2のアミノ酸残基151〜165と一致するペプチドに対するポリクローナル抗neu(N)抗体を作った(LinとClinton、Oncogene、第6巻、639〜643ページ、1991年)。p185HER−2のカルボキシ端末の最後の15残基と一致するペプチドに対するポリクローナル抗neu(N)抗体を作った(Lin他、Mol. Cell. Endocrin.、第69巻、111〜119ページ、1990年)。免疫を確立した2匹のウサギからの抗血清をキャラクテリゼーションしたところ、精製ECD IIIaペプチドと反応する高力価の抗体が含まれていることがわかった。
【0088】
ウエスタンブロット分析により、cDNA中に新規な配列を発現したSKBR−3細胞が抗ECD IIIa抗体と反応するタンパク質を産生させたかどうかを調べた。細胞抽出液および細胞外マトリックスからの68kDaのタンパク質は、2匹のウサギからの抗ECD IIIa抗体を少なくとも20,000倍に希釈したものと反応したが、免疫確立前の血清とは反応しなかった。新規な転写産物のcDNA配列(図1)を調べたところ、p185HER−2のN末端配列中の5つの共通N結合型グリコシル化部位すべてがグリコシル化されている場合には、65〜70kDaの分泌タンパク質産物が予測されることがわかった(Stern他、Mol. Cell. Biol.、第6巻、1729〜1740ページ、1986年)。
【0089】
68kDaのECD IIIaタンパク質[配列ID番号2]は、HER−2の新規なmRNAの翻訳産物であり、そのN末端の残基は、p185HER−2のN末端の340個の残基と一致していなくてはならない。そこで、SKBR−3細胞からの細胞抽出液を、HER−2のN末端配列である抗neu(N)(LinとClinton、Oncogene、第6巻、639〜643ページ、1991年)に対する抗ペプチド抗体、または抗ECD IIIaを用いて免疫沈降させ、得られた免疫複合体を両方の抗体を用いてウエスタンブロット分析法で調べた。簡単に説明するならば、3〜5μlの抗血清を、M−RIPA緩衝液(1%のノニデットP−40、50mMのトリスpH7.4、0.1%のデオキシコール酸ナトリウム、150mMのNaCl、1mMのPMSF、1%のアプロチニン)中に調製した細胞溶離液からのタンパク質2mgに添加した。なお細胞溶離液は、遠心分離で核をあらかじめ除去しておいた。報告されている(Lin他、Mol. Cell. Endocrin.、第69巻、111〜119ページ、1990年)ようにして、免疫沈降を、4℃にて撹拌しながら2時間にわたって行なった。免疫複合体を振盪しながら4℃にて1時間培養するとプロテインGセファロース(ファルマシア社)に結合したため、遠心分離により回収し、M−RIPAで4回洗浄した。この免疫複合体を95℃で2分間にわたってSDS−PAGE用サンプル緩衝液中で培養したところ、タンパク質が免疫複合体から放出された。そこでそのタンパク質を、7.5%のゲル中でSDS−PAGEにより分離させた(ミニ−プロティーンII電気泳動細胞、バイオ−ラド社)。
【0090】
SDS−PAGEの後、ウエスタンブロット分析を行なった。ゲル(厚さ0.75mm)1つにつき半乾燥トランスファー・ユニット(バイオ−ラド社)を1つ用い、電気泳動により、15Vの電圧で20分間にわたってタンパク質をニトロセルロース膜(トランス−ブロット、バイオ−ラド社)上にブロットした。なおゲルは、25mMのトリスpH8.3、192mMのグリシン、50mMのNaCl、20%のメタノールで平衡させた。この膜を、5%の脱脂粉乳を用いて25℃にて1時間にわたってブロックした。次に、ブロットを一次抗体とともに培養し、TBS−トゥイーン(0.05%のトゥイーンを含むトリス緩衝液)で15分間ずつ2回にわたって洗浄し、5分間ずつ4回にわたって洗浄し、ヤギの抗ウサギ二次抗体とともに40分間培養し、西洋ワサビのペルオキシダーゼ(バイオ−ラド社)と結合させ、TBS−トゥイーン中に1:10,000となるように希釈した。膜は、二次抗体とともに培養した後に上記のようにして洗浄し、化学発光試薬(ピアース社)と反応させ、コダック社のX−OMAT BLUフィルムに曝露した。
【0091】
免疫沈降とウエスタンブロット分析において抗ECD IIIaを用いたときには、予想通りp68HER−2が検出された。免疫沈降では抗ECD IIIaを用い、ウエスタンブロット分析におけるプローブを抗neu(N)にしたときには、68kDaのタンパク質が検出された。これは、p68ECD IIIaがp185HER−2のN末端配列を含んでいることを示している。さらに、抗neu(N)がp68HER−2を沈降させた。そのことは、抗ECD IIIa抗体をプローブとして調べることにより検出された。これらの結果は、p68HER−2がECD IIIaとHER−2のN末端配列の両方を含んでいることを示している。
【0092】
他のいくつかの細胞系におけるp68ECD IIIaの発現を調べた。cDNAにECD IIIa配列を含むガン細胞系(BT474、SKOV−3)もp68HER−2を含んでいた。調べたいくつかの細胞系のうち、正常なヒト胚の腎臓細胞に由来するHEK293細胞が、細胞抽出液中および細胞外マトリックス中で最高レベルのp68ECD IIIaを発現し、SKBR−3細胞よりも約5〜10倍多い量だった。p185HER−2の過剰発現を調べたガン細胞系(SKBR−3、SKOV−3、BT474)と比較すると、HEK293はp185HER−2の含有量が約20分の1であった。したがって、p185HER−2に対するp68HER−2の割合は、HEK293細胞においては、調べたガン細胞系の少なくとも100倍であった。特にHEK293抽出液において明らかなp68HER−2との反応および約120kDaのタンパク質との反応は、抗血清を、配列特異的な反応性を示す精製ECD IIIaペプチドとともに予備培養することによって停止させた。この大きなタンパク質はp68HER−2のダイマーである可能性がある。したがってp68HER−2は、いくつかのガン細胞系から発現して分泌され、HEK293中では5〜10倍大きなレベルになっていた。
【0093】
実施例5
この実施例では、ECD IIIaイントロン配列を含む新規なHER−2転写産物の発現を示す。RT−PCR分析の結果は、ECD IIIa配列が挿入されていなければ正常なサイズであるはずのHER−2のmRNAにECD IIIa配列が挿入されたことを示していた。このデータは、約4.8kbの新規な転写産物が存在していることを示唆している。ECD IIIaの新規な転写産物のサイズと発現を調べるため、ECD IIIaに対して特異的なプローブを用いてノーザンブロット分析を行なった。簡単に説明するならば、ECD IIIa挿入体の全配列にまたがっていて、この挿入体に隣接する5’HER−2エキソン配列を含む389bpの配列をPCRで増幅することにより、アンチセンスRNAプローブを合成するための鋳型をSKOV−3のcDNAから構成した。HER−2のcDNA配列とnt1131〜1152が一致する順プライマーC[配列ID番号5]と、3’BamH1制限エンドヌクレアーゼ部位を含み、ECD IIIa配列の3’スプライス部位近傍の配列と相補的な逆プライマー(5’−GCACGGATCCATAGCAGACTGAGGAGG−3’[配列ID番号9])を用いてPCRを行なった。次に、PCR産物をBamH1で消化させ、375bpの断片を遊離させ、クローニングしてpBluescript SK(ストラタジーン社)に組み込んだ。m13順プライマーと逆プライマーを用い、このプラスミドをヴォラム・インスティチュート・コア・シークエンシング・ファシリティ(ポートランド、オレゴン州)にてシークエンシングした。ECD IIIa配列全体と、挿入体に隣接した5’HER−2エキソン配列の87ntとに相補的なアンチセンスRNAプローブを、(α−32P)CTP、T7RNAポリメラーゼと、T7/SP6リボプローブ合成システム(プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州)とを用いて1μgの直線状鋳型から転写した。このプローブは、ECD IIIaおよびそれと隣接するHER−2エキソン配列を含むmRNAとハイブリダイズするときには370ntの断片を保護し、完全にスプライスされたHER−2のmRNAとハイブリダイズするときには87ntの断片を保護することが予想された。
【0094】
RNAハイブリッドを調製するため、30μgのRNAを、48℃にて16時間にわたり、約50,000cpmのアンチセンスRNAプローブとハイブリダイズさせた。このRNAハイブリッドを、40μg/mlのRNアーゼA(ベーリンガー・マンハイム社)および2μg/mlのRNアーゼT1(ライフ・テクノロジーズ社)を用い、250mMのNaCl、5mMのEDTA、10mMのトリスpH7.5からなる溶液中で、37℃にて30分間にわたって消化させた。プロテイナーゼK(100μg)(ライフ・テクノロジーズ社)を含む20μlの10%SDSを添加して消化を停止させた。サンプルを酸性フェノール(pH4.5;ライフ・テクノロジーズ社)とクロロホルムで抽出し、2容積の100%エタノールで沈殿させ、5μlのRPAサンプル用緩衝液(88%のホルムアルデヒド、10mMのEDTA pH8.0、1mg/mlのキシレンシアノール、1mg/mlのブロモフェノール・ブルー)に分散させた。サンプルを95℃にて10分間にわたって変性させ、TBE(89mMのトリス、89mMのホウ酸エステル、2mMのEDTA pH8.3)の中で5%ポリアクリルアミド/尿素ゲル上にて電気泳動を行なった。このゲルを真空下で乾燥させ、保護された断片をリン光画像分析によって定量した(IPラブ・ゲル、モレキュラー・ダイナミックス社)。
【0095】
約4.8kbの新規な転写産物が、p68ECD IIIaを最高レベルで発現したHEK293細胞の中で検出された。しかしSKBR−3、BT474、SKOV−3というガン細胞系のノーザンブロット分析では、新規な転写産物は検出できなかった。そこで、より高感度のリボヌクレアーゼ保護アッセイ(RPA)により、新規な転写産物の発現レベルを、完全にスプライスされた4.5kbの転写産物と比較して調べた。検出可能なレベルのp68ECD IIIaを含んでいた卵巣ガン細胞系(SKOV−3)および乳ガン細胞系(SKBR−3とBT474)からのRNAと、HER−2のcDNAを安定にトランスフェクトした対照細胞系17−3−1からのRNAを、ECD IIIa(イントロン8)配列全体と、イントロン8に隣接した5’HER−2エキソン配列とにまたがる32P標識アンチセンスRNAプローブとハイブリダイズさせた。RNアーゼで消化させ、電気泳動を行ない、放射能写真を撮影したところ、370個のヌクレオチドからなるバンドが、17−3−1以外の各細胞系で検出された。このサイズは、ECD IIIaを含むHER−2のmRNAによって保護されることが予想されるサイズに対応している。さらに、87個のヌクレオチドが保護された断片が、すべての細胞で検出された。このサイズは、対照となる正常な細胞系と比べてこれらガン細胞系で100倍以上も過剰にHER−2を発現している完全にスプライスされたHER−2の断片に対して予想されるサイズである(Kraus他、EMBO J.、第6巻、605〜610ページ、1987年)。保護されたそれぞれの断片の量を測定し、サイズに関して正規化して新規な転写産物の相対量を推定し、p185HER−2のmRNAに対する百分率として表わした。ECD IIIa挿入体を含む新規なHER−2のmRNAは、SKOV−3細胞では完全にスプライスされた転写産物のレベルの4.2%であり、SKBR−3細胞では5.4%であり、BT474細胞では0.8%であった。
【0096】
実施例6
この実施例では、ECD IIIa挿入体を含む新規な転写産物がヒト胚の腎臓および肝臓で発現したことを示す。ノーザンブロット分析により、ECD IIIa配列を含む新規な転写産物がヒトの正常な組織で発現したかどうかを調べた。ヒト胎児のさまざまな組織からのポリA+mRNAをノーザンブロットとして調製し、新規なECD IIIa配列に対して特異的な放射標識プローブとハイブリダイズさせた。4.8kbのmRNAが腎臓で検出され、2.6kbの転写産物が肝臓で検出された(図2)。4.8kbの転写産物は、274bpの挿入体が付加された完全長4.5kb転写産物に対応しているようである。2.6kbの転写産物は、以前に報告されている2.3kbの別の転写産物(ヤマモト他、Nature、第319巻、230〜234ページ、1986年;Scott他、Mol. Cell. Biol.、第13巻、2247〜2257ページ、1993年)に274bpのECD IIIa挿入体が付加されたものに対応しているのであろう。ブロットを取り出して5’HER−2コード配列に対して特異的なプローブとハイブリダイズさせたところ、4.8kbと4.5kbのmRNAを示す広いバンドが胎児の腎臓組織で検出され、2.6kbの転写産物断片が肝臓で検出された。これは、これらの新規な転写産物が、HER−2のECDをコードする配列を含んでいることを示している。挿入されたECD IIIa配列が終止コドンを含んでいるため、同じタンパク質産物がこれらmRNAのそれぞれから産生される可能性がある。
【0097】
いくつかの細胞系についても、ECD IIIaを含む新規な転写産物をノーザンブロット分析で調べた。4.8kbの新規な転写産物が、ヒト胚の腎臓細胞系であるHEK−293で検出された(図2)。HER−2遺伝子が増幅されているSKBR−3、BT474、SCOV−3というガン細胞系のRT−PCR分析によりECD IIIa配列が検出されたとはいえ、ECD IIIaを含む新規な転写産物は、これらの細胞をノーザンブロット分析しても検出できなかった。そこで、ECD IIIa配列全体と、このECD IIIa挿入体に隣接する5’HER−2エキソン配列とにまたがるアンチセンスプローブを利用して、より高感度のリボヌクレアーゼ保護アッセイ(RPA)を行なった。ECD IIIa挿入体を有する新規なHER−2のmRNAは、SCOV−3細胞、SKBR−3細胞、BT474細胞では、完全にスプライスされた転写産物の5%未満しか検出されなかった。これらの知見は、ECD IIIa配列を含む2つの新規な転写産物がヒトの正常組織で組織特異的に発現したこと、4.8kbの新規な転写産物がHEK−293細胞系で発現したこと、遺伝子が増幅したガン細胞が、新規な転写産物を4.5kbのHER−2転写産物の5%未満という低いレベルで発現していることを示している。
【0098】
実施例7
この実施例では、ECD IIIa配列を含むタンパク質の発現を示す。新規な配列がタンパク質産物に翻訳されるかどうかを調べるため、ECD IIIa配列をポリヒスチジン・タグを有するペプチドとして細菌内で発現させ、ニッケル−アフィニティ・クロマトグラフィにより精製し、この精製ペプチドに対する抗血清を得た。4.8kbの新規なECD IIIaの転写産物を発現したHEK−293細胞がECD IIIaを含むタンパク質を発現するかどうかを、ウエスタンブロット分析で調べた。細胞抽出液と細胞外マトリックスからの68kDaのタンパク質は、抗ECD IIIa抗体と反応したが(図3)、免疫確立前の血清とは反応しなかった。反応は、この抗血清を、精製ECD IIIaペプチドとともに予備培養することによって停止させた(図3)。いくつかの細胞抽出液で検出された大きな約125kDaのタンパク質は、p68HER−2の集合体であろう。新規な転写産物のcDNAの配列(図1)からは、p185HER−2のN末端配列中の5つの共通N結合型グリコシル化部位すべてがグリコシル化されている場合に65〜70kDaの分泌タンパク質産物が予測されることがわかる(Stern他、Mol. Cell. Biol.、第6巻、1729〜1740ページ、1986年)。他のいくつかの細胞系でもp68ECD IIIaを発現するかどうかを調べた。cDNAにECD IIIa配列を含むガン細胞系(BT474、SKOV−3、SKBR−3)も、検出可能なレベルのp68HER−2を含んでいた。
【0099】
実施例8
この実施例では、HER−2遺伝子が増幅されているガン細胞系において、p185HER−2と比べてp68HER−2の発現が顕著に低下していることを示す。HER−2遺伝子が増幅されているガン細胞系ではp185HER−2のmRNAと比べてp68HER−2のmRNAの発現レベルが非常に低いため、HER−2遺伝子が増幅されているいくつかの細胞系と増幅されていないいくつかの細胞系において、p68HER−2タンパク質とp185HER−2タンパク質の相対的な割合を調べた。ウエスタンブロットを調製し、p68HER−2に対して特異的な抗血清とp185HER−2に対して特異的な抗血清の両方について調べた。図4は、HER−2遺伝子が約8倍に増幅されているガン細胞系でp185HER−2が容易に検出できたことを示している(Kraus他、EMBO J.、第6巻、605〜610ページ、1987年)。しかしそれに対応してp68HER−2が増加することはなかった。比較すると、p68HER−2は、HEK−293、IOSEVAN、HBL100という非発ガン性細胞で検出された唯一のHER−2タンパク質であった。それに対してp185HER−2はこれらの細胞中では非常に低いレベルでしか発現せず(Kraus他、EMBO J.、第6巻、605〜610ページ、1987年)、過剰に露出したブロットにおいて検出された。これらのデータは、HER−2遺伝子が増幅されているガン細胞系ではp68HER−2がp185HER−2と比べて少ないことを示しており、p185HER−2が過剰に発現したときにp68HER−2が低レベルに維持される何らかのメカニズムが存在している可能性のあることを示唆している。
【0100】
実施例9
この実施例では、p68HER−2とECD IIIaペプチドがp185HER−2に特異的に結合することを示す。p68HER−2は分泌タンパク質であり、しかもp68HER−2は新規な配列に加えてp185HER−2と一致するサブドメインIとIIを含んでいるため、p68HER−2がp185HER−2と相互作用する可能性を調べた。p185HER−2とp68HER−2のN末端に対する抗ペプチド抗体である抗neu(N)、またはp185HER−2に対して特異的な抗体である抗neu(C)を用い、p68HER−2を低レベルで発現し、p185HER−2を過剰発現しているガン細胞SKBR−3の免疫沈降を行なった。免疫沈降させる物質をウエスタンブロットとして調製し、プローブとして、p68HER−2に対して特異的な抗ECD IIIaと抗neu(C)の両方を用いて調べた。抗neu(N)は、p68HER−2とp185HER−2の両方を免疫沈降させた(図5A)。さらに、p185HER−2のC末端に対して特異的な抗体はp185HER−2を免疫沈降させ、p68HER−2を共同沈降させた(図5A)。この結果は、2つのタンパク質の間に相互作用があることを示唆している。
【0101】
ECD配列同士の結合相互作用は非常に弱いので(Tzahar他、EMBO J.、第16巻、4938〜4950ページ、1997年;Fitzpatrick他、FEBS Letters、第431巻、102〜106ページ、1998年)、結合が、新規なプロリン・リッチなECD IIIa領域によるものかどうかを調べた。新規な79個のアミノ酸からなる領域をヒスチジン・タグを有するタンパク質として精製してニッケル・アガロース上に固定化し、プルダウンアッセイで使用した。対照として、ECD IIIaとは関係のない、ヒスチジン・タグを有する2つの精製ペプチド(すなわち、ウィルソン病の膜タンパク質の600残基からなる断片と、CREBタンパク質のDNA結合領域を含む70残基からなる断片)を、同様にしてニッケル・アガロース樹脂上に固定化した。固定化したペプチドを、HER−2をトランスフェクトした3T3細胞(17−3−1)から調製したタンパク質とともに培養した。十分に洗浄した後、結合したタンパク質を溶離させ、ウエスタンブロットとして調製し、それを、p185HER−2に対して特異的な抗体を用いて調べた。1Mのイミダゾールで溶離させ、溶離した物質をSDSゲル中でクーマシー染色することにより、ヒスチジン・タグを有するECD IIIaペプチドと対照用ペプチドが同じ量だけ樹脂に結合したことが確認された。p185HER−2は、ペプチドなしの樹脂にも対照用ペプチドを有する樹脂にも保持されることがなかったのに対し、ECD IIIaペプチドによってだけ選択的に保持された(図5B)。
【0102】
プルダウンアッセイにおいてECD IIIa領域がp185HER−2に結合したため、このECD IIIa領域が、p185HER−2を過剰発現している細胞に選択的に結合するかどうかを調べた。これは、HER−2をトランスフェクトした17−3−1細胞の単層培養物を用いて3T3親細胞と比較することによって調べた。細胞をさまざまな濃度のヒスチジン−ECD IIIaペプチドとともに培養し、洗浄し、プロテアーゼ阻害剤を用いて変性用緩衝液中に抽出した。結合したペプチドがあるかどうかを検出するため、細胞抽出液を、ECD IIIaに対して特異的な抗体を用いてウエスタンブロット分析により調べた。さらに、ECD IIIaペプチドで処理した細胞を等分した複数のアリコートをウエスタンブロットとし、p185HER−2に対して特異的な抗体と反応させた。するとトランスフェクトされた17−3−1細胞においてp185HER−2が過剰に発現した。ECD IIIaペプチドは、nMオーダーのさまざまな濃度で完全な17−3−1細胞に好んで結合する(図5C)のに対し、同等な量の3T3親細胞にはペプチドがほとんど結合しないか、まったく結合しなかった。これは、ECD IIIaがp185HER−2の細胞外領域と特異的な相互作用をしていることを示唆する。
【0103】
実施例10
p68ECD IIIaとECD IIIaペプチドがp185HER−2のチロシンリン酸化に及ぼす効果を調べた。RTKのチロシンリン酸化は、リガンド活性化とシグナル伝達があることの第1の徴候である。17−3−1細胞の処理を、さまざまな量の精製ECD IIIaペプチドを用いて、またはp68HER−2を高レベルで含むHEK293細胞からのならし培地(CM)(図2A)を用いて、または対照となる、検出できるレベルのp68HER−2を含まないSKOV−3細胞からのならし培地を用いて行ない、この17−3−1細胞のチロシンリン酸化を調べた。ヒスチジン−ECD IIIaまたは濃縮CMで10分間処理したとき(図6)または2時間処理したとき、チロシンリン酸化シグナルは増加しなかった。これは、p185HER−2が活性化されなかったことを示唆している。p68HER−2を含むCMも、ECD IIIaペプチドも、p185HER−2のチロシンリン酸化レベルが低いSKOV−3細胞からのp185HER−2に対応するチロシンリン酸化シグナルを、検出可能になるほど変化させることはなかった。さらに、p68HER−2とECD IIIaペプチドは、17−3−1細胞抽出液から免疫沈降させたp185HER−2の自己リン酸化活性に対して検出可能なほどの影響をインビトロで与えることはなかった。これらの結果は、p68HER−2がp185HER−2のシグナル伝達を活性化させなかったという結論を支持している。
【0104】
実施例11
この実施例では、イントロン8の配列が多型であることを示す。ヒトHER−2遺伝子のイントロン8は、mRNA内に選択的スプライシングが可能な状態で保持されて、p185HER−2の細胞外領域の一部のC末端位置で新規な79残基領域をコードしている。保持されたこのイントロンを有する新規な転写産物の産物である“ハースタチン”は、HER−2ガン遺伝子の自己阻害剤として機能する。イントロン8をコードしている領域は、単独ではnMのアフィニティでp185HER−2に結合することがわかっている(Doherty他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第96巻、10,869〜10,874ページ、1999年)。
【0105】
さらに、HER−2遺伝子のイントロン8のヌクレオチド配列とそこから推定されるアミノ酸配列における多型を、別々の15人のゲノムDNAをシークエンシングすることによって同定した。図8と配列ID番号1は、イントロン8の最も一般的なヌクレオチド配列と、それに対応するアミノ酸配列をそれぞれ示している。この領域は、10通りの多型(配列ID番号10の中には文字W(2箇所)、Y(3箇所)、R、N、M、S(2箇所)で示し、図8には“X”で示してある)を含んでおり、その結果として保存されないアミノ酸置換が起こっている(表1の注を参照のこと)。例えば、ヌクレオチド位置161に多型(G→C)があると(図8;表1)、配列ID番号1のアミノ酸残基#54の位置、または配列ID番号2の残基#394の位置でアルギニン(R)がプロリン(P)に代わるはずである。図8または配列ID番号10の位置1で示されるN末端のグリシン(G)は、“ハースタチン”配列のアミノ酸残基341に対応する(Doherty他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第96巻、10,869〜10,874ページ、1999年)。図1(A)に示したヌクレオチド配列は、図8に示した最も一般的であることがわかった配列と比べてアミノ酸残基#6と#73の位置のアミノ酸が異なる多型になっている。
【0106】
この結果は、ヒトの集団において、イントロン8がコードされている領域にいくつかの違いが存在しており、その結果、ECD IIIaを含むタンパク質変異体相互の間で生化学的特性や生物学的特性が異なる可能性のあることを示している。同定されたいくつかの変異を表1にまとめておく。
【表1】
【0107】
表1。ヒトの集団(別々の15人)でイントロン8がコードされている領域に見られた配列の変異1〜11をリストにしてある。このリストには、図8に示した最も一般的なDNA配列と比べて特定の“X”の位置に塩基の変化があることが示してある。それぞれのXの後ろにある括弧内の数字は、図8に示したDNA配列のヌクレオチドの位置に対応している。ここにリストとして示したDNA配列の変異は、配列ID番号1の可変アミノ酸位置(“Xaa”)に対応している。例えば、X(4)がXaa(2)に;X(14)がXaa(5)に;X(17)がXaa(6)に;X(47)がXaa(16)に;X(54)がXaa(18)に;X(62)がXaa(21)に;X(106)がXaa(36)に;X(161)がXaa(54)に;X(191)がXaa(64)に;X(217)がXaa(73)に対応している。配列ID番号2の可変アミノ酸位置に対応している変異は以下の通りである。X(4)がXaa(342)に;X(14)がXaa(345)に;X(17)がXaa(346)に;X(47)がXaa(356)に;X(54)がXaa(358)に;X(62)がXaa(361)に;X(106)がXaa(376)に;X(161)がXaa(394)に;X(191)がXaa(404)に;X(217)がXaa(413)に対応している。配列ID番号1の可変アミノ酸位置に関する(図8に示した最も一般的なDNA配列と比べた場合の)具体的なアミノ酸の変化は以下の通りである。変異1、Xaa(2)(トレオニン→セリン);変異2、Xaa(5)(ロイシン→プロリン);変異3、Xaa(6)(プロリン→ロイシン);変異4、Xaa(16)(ロイシン→グルタミン);変異5、Xaa(18)(メチオニン→ロイシン);変異6、Xaa(21)(グリシン→アスパラギン酸、またはAlu、またはバリン);変異7、Xaa(36)(ロイシン→イソロイシン);変異8、Xaa(54)(プロリン→アルギニン);変異9、Xaa(64)(プロリン→ロイシン);変異10、Xaa(73)(アスパラギン酸→アスパラギン);変異11、Xaa(6)(プロリン→ロイシン)とXaa(73)(アスパラギン酸→アスパラギン)。同じ置換が、配列ID番号2の対応する可変アミノ酸位置にも適用される。
【0108】
実施例12
トランスフェクトされた細胞内でハースタチンを同時に発現させると、(1)コロニーの形成が抑制されることによりp185HER−2のレベルが抑制され、(2)p185HER−2のチロシンリン酸化が抑制された。
【0109】
Cos−7細胞にハースタチン発現ベクターとp185HER−2発現ベクターを同時にトランスフェクトし、その結果として得られたp185HER−2のレベルを測定し、さらにトランスフェクション後のコロニー形成とp185HER−2のチロシンリン酸化の程度を測定することにより、ハースタチン/p185HER−2結合相互作用の効果を明確にした。
【0110】
方法。Cos−7細胞へのトランスフェクション。Cos−7細胞を6ウエルのプレートに2×105細胞/ウエルの割合で植え、リポフェクタミン(バイオラド社)を用いてトランスフェクションを行なった。Cos−7細胞には、1.5μgのハースタチン発現ベクター+1.5μgのHER−2発現ベクター、または1.5μgのHER−2発現ベクター(すべてインヴィトロジェン社からのpcDNA3.1)をトランスフェクトした。対照用エンプティ・ベクターを用い、それぞれの場合にDNAの合計量が3μgになるようにした。トランスフェクトされた細胞は、48時間後にウエスタンブロット法で分析した。タンパク質の検出は、p185HER−2に対する抗体、抗neu(C)抗体、ハースタチンのイントロン8をコードしているC末端配列に対する抗体(抗Hst)のいずれかを用いて行なった。β−ガラクトシダーゼ・マーカー発現反応に関しては、CMVプロモータにより制御されるβ−ガラクトシダーゼ発現プラスミド0.5μgを組み込んだ所定のプラスミドを3組用意し、トランスフェクションを行なった。48時間後、細胞を抽出し、バイオラド・タンパク質染色キットを用いて細胞タンパク質を定量し、β−ガラクトシダーゼの活性を測定した。β−ガラクトシダーゼの活性はタンパク質の量で規格化し、平均と標準偏差をプロットした。β−ガラクトシダーゼの活性を各ウエルに最初に植えた細胞数で規格化した場合にも、同様の結果が得られた。
【0111】
コロニー形成の測定。CHO細胞を6ウエルのプレートに2×105細胞/ウエルの割合で植え、4組用意したウエルに、3mgの対照用エンプティ・ベクター(pcDNA3.1;インヴィトロジェン社);1.5mgのp185HER−2発現プラスミド+1.5mgの対照DNA;1.5mgのp185HER−2+1.5μgのハースタチン;1.5mgのハースタチン+1.5mgの対照DNAをそれぞれトランスフェクトした。DNAを添加してから48時間後、細胞をトリプシン処理し、0.6mg/mlのG418の存在下で1:10の割合に希釈して6ウエルのプレートに入れた。培地は2日ごとに交換した。14日目にプレートをクリスタルバイオレットで染色した後、洗浄した。50%エタノールに入れた1mlの0.1Mリン酸ナトリウム(pH4.5)を用いて室温にて30分間にわたって振盪することにより、クリスタルバイオレットで染色したプレートを抽出した。抽出したクリスタルバイオレットは、10倍に希釈し、515nMにおける吸光度をもとにして定量した。10倍の希釈により読みが0.1から1になった。この値は、予備研究で決定した吸光度と細胞数の直線関係の範囲に入っていた。
【0112】
p185HER−2のチロシンリン酸化抑制の測定。Cos−7細胞を6ウエルのプレートに植え、上記のようにしてトランスフェクションを行なった。2組用意したウエル中の細胞に、0.25、0.5、1.0、3μgの蛍光グリーン・タンパク質(“FGP”)発現プラスミドをトランスフェクトした。エンプティ・ベクターを添加し、各ウエル内のDNAの合計量が3μgになるようにした。48時間後、蛍光プレート読み取り装置を用い、発光波長520nMと励起波長490nMにおける蛍光信号を定量した。また、細胞に0.5μgのFGPプラスミド+1.5μgのHER−2プラスミド+所定量のハースタチン発現プラスミドをトランスフェクトしたものと、細胞に0.5μgのFGPプラスミド+所定量のハースタチン発現プラスミドをトランスフェクトし、HER−2プラスミドはトランスフェクトしないものを用意した。エンプティ・ベクターを添加し、各ウエル内のDNAの合計量が5μgになるようにした。48時間後、細胞をPBSを用いて2回洗浄し、1mMのフッ化フェニルメチルスルホニルと2mMのオルトバナジン酸塩を含む100μlの修飾RIPAの中に抽出した。バイオラド・タンパク質染色キットを用い、透明な抽出液中のタンパク質の濃度を測定した。抽出したタンパク質20μgを7.5%ポリアクリルアミドSDSゲルを用いて分離し、まず最初に、1μg/mlの抗ホスホチロシン抗体(“抗PTyr”)を用いてウエスタンブロット法で分析した。次に、ブロットを取り出し、p185HER−2に対する抗体(抗neu(C))と反応させた。化学ルミネセンス試薬(ピアス社)を用いてブロットを現像し、コダック社のフィルムに曝露した。
【0113】
(1)異所ハースタチンの発現により、トランスフェクション後の生存率が低下し、トランスフェクトされたCos−7細胞中のp185HER−2のレベルが低下した。p185HER−2のレベルは、Cos−7細胞の中でハースタチンをp185HER−2と同時に発現させると、p185HER−2だけをトランスフェクトした場合と比べて約5分の1に低下した(図9)。マーカー・プラスミドから発現させたβ−ガラクトシダーゼ(“β−gal”)の活性を内部対照としてモニターした。
【0114】
図10は、β−galマーカー・プラスミドをp185HER−2と同時にトランスフェクトした場合にβ−galの活性が最大になったことを示している(β−galプラスミドをエンプティ・プラスミドである“pcDNA”と同時にトランスフェクトした場合よりも約35%大きい)。それとは対照的に、β−galの活性レベルは、p185HER−2とβ−galプラスミドに加えてハースタチンも同時にトランスフェクトした細胞で約3分の1に低下した。同様の低下が、2つの別の細胞系、CHOとHEK−293でも観察された。さらに、ハースタチンとHER−2を同時にトランスフェクトした細胞で別のマーカーである蛍光グリーン・タンパク質(“FGP”)を調べた場合にも、マーカー遺伝子の発現レベルが同様に抑制されることが観察された。したがって、単独のp185HER−2と同時にマーカー・プラスミドをトランスフェクトすることにより、同時にトランスフェクトしたマーカーの発現レベルが増加したが、ハースタチンおよびp185HER−2と同時にマーカー・プラスミドをトランスフェクトすると、マーカーのシグナルは減少した。
【0115】
p185HER−2とマーカー遺伝子の発現レベルが上記のように低下したことは、トランスフェクトした細胞ごとのp185HER−2(またはマーカー)のレベルの全体的低下、あるいはトランスフェクト後に生き延びた細胞数の減少と整合していた(すなわち、p185HER−2の発現により生存が促進され、ハースタチンとp185HER−2を同時に発現させることにより生存が抑制された)。
【0116】
(トランスフェクトされた安定な細胞を早く増殖させるのに適した)CHO細胞にトランスフェクションを行ない、G418で20日間にわたって選択を実施し、生き残った細胞コロニーを染色して定量することにより、コロニー形成に同時トランスフェクションが及ぼす効果を直接測定した。p185HER−2をトランスフェクトすると、対照をトランスフェクトした細胞と比べてコロニー形成が約60%増加したのに対し、ハースタチンだけを発現させた場合には増殖に有意な変化はなかった(図11)。それとは対照的に、ハースタチンを同時にトランスフェクトすると、HER−2をトランスフェクトした場合と比べて細胞のコロニー形成が約7分の1へと劇的に低下した(図11)。
【0117】
ハースタチン発現プラスミドとp185HER−2発現プラスミドをトランスフェクトする割合を変化させることにより、ハースタチンの発現がトランスフェクトされた細胞内のp185HER−2に及ぼす効果をさらに調べた。ハースタチン発現プラスミドをp185HER−2発現ラスミドの5分の1のレベルで導入したときには、p185HER−2の発現レベルに対する影響は実質的になかった。p185HER−2発現プラスミドに対するハースタチン発現プラスミドの相対量を増やしていくと、p185HER−2の発現レベルが低下し(図14のB)、同時にトランスフェクトしたマーカーであるGFP発現プラスミドの発現が図9に示したのと同様に低下した。それとは対照的に、対照であるGFP発現プラスミドだけをトランスフェクトすると、細胞の生存には影響を与えず、添加したプラスミドの量に比例してGFPの発現が増加した(図13)。
【0118】
したがって、ハースタチンを同時にトランスフェクトした細胞中のp185HER−2のレベル低下は、細胞ごとのp185HER−2のレベル低下ではなく、トランスフェクト後の細胞のコロニー形成が減少したことが原因であると結論された。さらに、トランスフェクトされた細胞の生存率は、ハースタチンとp185HER−2の相対的な発現量に依存していた。言い換えるならば、p185HER−2を発現する細胞の生存率は、ハースタチンに曝露することによって実質的に低下した。
【0119】
(2)ハースタチンの発現がp185HER−2のチロシンリン酸化を抑制する。ハースタチンを同時にトランスフェクトしてp185HER−2のレベルが3分の1に低下した場合には、p185HER−2のチロシンリン酸化シグナルが25分の1に低下した。これは、個々の細胞でp185HER−2のチロシンリン酸化のレベルが約8分の1に低下することに相当する(図15)。
【0120】
細胞の生存の場合と同様、p185HER−2のチロシンリン酸化が抑制される程度は、p185HER−2発現プラスミドに対するハースタチン発現プラスミドの割合に影響された。最大の効果は、比が2:1のときに観察された(ハースタチン:p185HER−2)。ハースタチン発現プラスミドだけをトランスフェクトすると、内在性185kDaタンパク質に付随するチロシンリン酸化シグナルが約2分の1に低下した(Cのレーン1とレーン2の比較)。トランスフェクトされたp185HER−2発現プラスミドから発現したp185HER−2と同時にp185タンパク質が移動したが、このp185タンパク質は、内在性p185HER−2に対応しているようである。
【0121】
ハースタチンを異所発現させると、外来性と内在性のp185HER−2のチロシンリン酸化が減少した。さらに、p185HER−2発現プラスミドに対するハースタチンの割合は、p185HER−2のチロシンリン酸化抑制の程度とp185の発現レベルに影響を与える。したがって、減少したp185HER−2のチロシンリン酸化は、HER−2とハースタチンを同時にトランスフェクトした細胞のコロニー形成の減少と関係していた。
【0122】
実施例13
トランスフェクトされた細胞内でハースタチンを同時に発現させると、(1)EGF受容体のレベルが低下し、トランスフェクション後のEGFを媒介とした細胞の生存率の上昇が抑制され、(2)EGFを媒介としたEGF受容体のダウンレギュレーションが抑制され、(3)チロシンリン酸化の測定によって明らかになるEGF受容体の活性化が抑制された。
【0123】
グループIの受容体チロシンキナーゼとしては、p185HER−2(erbB−2)の他に、EGF受容体(HER−1、erbB−1)、HER−3(erbB−3)、HER−4(erbB−4)が挙げられる。内在性EGF受容体を含まないCHO細胞内でハースタチンがEGF受容体に及ぼす効果を調べ、グループIの他の受容体に影響が及ぶかどうかを明らかにした。
【0124】
方法。EGF受容体の活性化の測定。CHO細胞を6ウエルのプレートに2×105細胞/ウエルの割合で植え、24時間後、2組用意した一方のウエルには、0.5μgのFGPマーカー・プラスミド+1.5μgのEGF受容体発現プラスミド+所定量のハースタチン発現ベクターをトランスフェクトした。もう一方のウエルには、0.5μgのFGPマーカー・プラスミド+所定量のハースタチン発現ベクターをトランスフェクトしたが、EGF受容体発現プラスミドはトランスフェクトしなかった。24時間後、細胞をPBSで2回洗浄し、無血清培地の中でさらに24時間にわたって培養した。培養物を100ng/mlのEGFの存在下または不在下で20分間にわたって培養し、次に、図15の場合と同様にして修飾RIPAの中に抽出した。各ウエルからのタンパク質約20μgを7%ポリアクリルアミド−SDS−ゲルを用いて分離し、まず最初に、1μg/mlの抗ホスホチロシン抗体を用いてウエスタンブロット法で分析した。次にブロットを取り出し、抗EGF受容体抗体で調べた。また、培養物を100ng/mlのEGFの存在下または不在下で24時間にわたって培養し、細胞抽出液をウエスタンブロット法で分析し、抗EGF受容体抗体による検出を行なった。
【0125】
EGF受容体とハースタチンがコロニーの増殖に及ぼす効果の測定。CHO細胞を6ウエルのプレートに植え、3組のウエルを用意し、1.5μgのEGF受容体発現プラスミド、1.5μgのEGF受容体発現プラスミド+1.5μgのハースタチン発現プラスミド、1.5μgのハースタチン発現プラスミドのいずれかをトランスフェクトした。各ウエルのDNAの合計量を3μgにするため、エンプティ・ベクターを添加した。DNAを添加してから48時間後、各ウエルの細胞をトリプシン処理して回収し、1:10の割合に希釈し、600μg/mlのG418を含む培地の中にある6ウエルのプレートに入れた。培地は2日ごとに交換した。14日目にプレートをクリスタルバイオレットで染色した。染色された培養物からの色素をすでに説明したようにして抽出し、415nMにおける吸光度をもとにして定量した。3つのウエルの平均値は、対照をトランスフェクトしたウエルに対する百分率で表示し、この平均値と標準偏差をプロットした。3回の独立した実験において同様の結果が得られた。
【0126】
ハースタチンとp185HER−2とp175EGF受容体の間に安定な複合体が形成されたことの測定。Sプロテイン・アガロースの50%懸濁液(ノヴァジェン社)約100μlを、ペプチドなしの場合、TBpex14ペプチド(OHSUのB. Ulman博士から提供された)50μgを添加した場合、イントロン8によってコードされているペプチド50μgを添加した場合、完全長組み換えハースタチン50μgを添加した場合について、室温で1時間にわたって培養した。各ペプチドは、pET30発現プラスミド(ノヴァジェン社)によってコードされているSプロテイン・タグを含んでいた。次に、アガロース・サンプルをPBSで2回洗浄し、1%のノニデット−p40(PBSNP−40)を含むPBSに溶かした100μgのA431細胞抽出液(EGF受容体用)または17−3−1抽出液(p185HER−2用)とともに、室温にて1時間にわたって培養した。アガロース・サンプルは、この細胞抽出液とともに培養した後、500μlのPBS−NP40で2回洗浄し、樹脂に付着したタンパク質を92℃で2分間にわたって40μlのSDS−サンプル緩衝液の中に溶離した。元のペプチドと同じ量がアガロースと複合体を形成していることを確認するため、SDS−サンプル緩衝液の中に抽出したアリコートを、SDS−PAGEとクーマシー染色により分析した(TBpex14と、イントロン8によってコードされているペプチドについては17%ポリアクリルアミド・ゲルを、p50ハースタチンについては10%ポリアクリルアミド・ゲルを用いた)。受容体の結合状態を分析するため、アガロースから溶離したアリコートを、抗EGFRまたは抗p185HER−2を用いてウエスタンブロットとして分析した。
【0127】
(1)〜(3)ハースタチンの異所発現により、トランスフェクトされたCHO細胞内のp175EGF受容体のレベルが低下し、トランスフェクション後のEGFを媒介とした生存率の上昇が抑制された。p185HER−2受容体についてすでに説明したように、図16は、導入するハースタチン発現プラスミドの量をEGF受容体発現プラスミドの2倍にすると、リガンドEGFが存在するかどうかには関係なくEGF受容体のレベルが低下することを示している。GFPマーカーの発現もそれに伴って低下した。ハースタチン発現プラスミドの量をEGF受容体発現プラスミドの3分の1にすると、p175EGF受容体の量は、EGF受容体だけをトランスフェクトした細胞におけるのと同じ程度になった(図16のレーン2、レーン3をレーン6、レーン7と比較のこと)。
【0128】
ハースタチンの発現により、p175EGF受容体のダウンレギュレーションが抑制され、チロシンリン酸化の測定によって明らかになるp175EGF受容体の活性化が抑制された。ハースタチンがEGFによるp175EGF受容体の活性化に及ぼす効果を調べた。図17のレーン2とレーン3に示したように、EGFはp175EGF受容体のチロシンリン酸化を誘起し、80kDaと55kDaのタンパク質に付随するホスホチロシン・シグナルを増大させた。ハースタチンの存在下では、飽和量のEGFを添加した後にp175EGF受容体のチロシンリン酸化が増加することは検出できず、80kDaと55kDaのタンパク質のチロシンリン酸化が増加することも検出できなかった(図17、レーン6とレーン7)。
【0129】
EGFに関して知られている別の効果は、EGF受容体のダウンレギュレーションである。図18は、EGFで処理した48時間後にp175EGF受容体のレベルが予想通り大きく低下したことを示している(レーン2とレーン3)。しかしハースタチンを導入した場合には、レーン4とレーン5に示したように、EGF受容体のダウンレギュレーションが少なくなった。
【0130】
ハースタチンは、EGF受容体を過剰発現している細胞の増殖を抑制した。ハースタチンをEGF受容体と組み合わせたときにコロニー形成に及ぼす効果を調べた。図11の場合と同様にして、CHO細胞にトランスフェクションを行ない、G418を用いて選択を実施した。p175EGF受容体だけを過剰発現させた場合、対照(図11に示したエンプティ・ベクターをトランスフェクトした細胞)と比べて細胞生存率が40%増加した。ハースタチンだけをトランスフェクトしたCHO細胞では、対照をトランスフェクトした細胞と比べると生存率が約20%増加した。これは、図11に示したハースタチンの効果と比べて有意に異なってはいなかった。
【0131】
ハースタチンとEGF受容体を同時に発現させると、EGF受容体だけの場合よりも生存率が低下した。p185HER−2についてすでに明らかにしたように、この抑制は、ハースタチンを媒介としてEGFによるp175EGF受容体の活性化が妨げられることと関係していた。そのことが図16、図17、図18からわかる。
【0132】
ハースタチンは、p185HER−2とEGF受容体の両方と安定な複合体を形成した。
【0133】
本発明によると、完全長ハースタチンと、そのイントロン8によってコードされているC末端領域(組み換えペプチドとして発現)の両方が、nMオーダーのアフィニティでp185HER−2と結合する。さらに実験を行ない、すでに説明したハースタチン/p185HER−2の結合相互作用に加え、ハースタチンとp175EGF受容体の間に結合相互作用が存在しているかどうかを(ハースタチンがEGFによるEGF受容体の活性化を妨げる能力に基づいて)明らかにした。
【0134】
ハースタチンは、p185HER−2とEGF受容体の両方と安定な複合体を形成した。ハースタチン/EGF受容体の相互作用を、“不活性”アッセイで調べた。用いたのは、イントロン8によってコードされていてハースタチンのC末端と一致するポリペプチドを精製したもの、完全長組み換えハースタチン・タンパク質、無関係の配列を有する対照ペプチドであり、これらすべてをSプロテイン・アガロース(ノヴァジェン社)に固定化した。次に、これらタンパク質のうちの1つを用いて誘導体化したアガロースをA431細胞の抽出液とともに培養し、洗浄し、ウエスタンブロット法で分析し、p175EGF受容体に対して特異的な抗体を用いて検出した。
【0135】
図20に示したデータから、p175EGF受容体は、対照である無関係のペプチドが存在しているかどうかには関係なく、イントロン8によってコードされているポリペプチドおよびハースタチンと特異的に結合するが、Sタンパク質アガロースとは結合しないことがわかる。比較のため、p185HER−2を安定にトランスフェクトした17−3−1細胞の抽出液もプルダウンアッセイで調べた。以前にニッケル・アフィニティ樹脂を用いた場合に見られたように(Doherty他、1999年)、p185HER−2は、イントロン8によってコードされているポリペプチドおよびハースタチンと結合するが、無関係なペプチドとは結合しなかった。これらの結果は、p175EGF受容体とp185HER−2の両方が、ハースタチンならびにイントロン8によってコードされているハースタチンのC末端領域との間で安定な複合体を形成することを示している。
【0136】
要するに、p175EGF受容体とp185HER−2の両方が、ハースタチンと複合体を形成した。ハースタチンの発現により、p185HER−2を過剰発現している細胞のコロニー形成が強く抑制された。さらに、ハースタチンはEGF受容体のレベルを低下させ、EGF受容体の過剰発現によって起こる細胞の生存率増加を抑制した。細胞生存率の低下は、p185HER−2のチロシンリン酸化が減少したことと、EGFを媒介としたEGF受容体の活性化が妨害されたことに関係していた。したがって、ハースタチンの負の調節活性は、受容体チロシンキナーゼのグループIファミリーの第2のメンバーであるEGF受容体にも当てはまった。
【0137】
実施例14
ハースタチンは、活性化Aktを媒介としたEGF生存シグナルを阻止した
【0138】
Aktと呼ばれるタンパク質キナーゼは、細胞の生存にとってカギとなる調節分子である。Aktの活性化が、細胞の生存にとっての必要十分条件である。活性化したAktを刺激すると、不適切な細胞が生き延びたり、細胞の正常な死が妨げられたりする。ある種のヒトのガンではこのようなことが起こっていることが見いだされている。HER−2とEGF受容体の両方とも、Akt生存シグナルを活性化させる。現在の理論によると、そのことによってガンが成長すると考えられている(Blume−JensenとHunter、Nature、第411巻、355〜365ページ、2001年;Datta他、Genes and Development、第13巻、2905〜2907ページ、2000年;YardenとSlikowski、Nature Reviews、Molecular Cell Biology、第2巻、127〜137ページ)。
方法。EGFR3T3細胞における活性化したホスホakt(活性化したAKT)の測定。活性化したAKT(ホスホ−akt)の測定を、標準的なウエスタンブロット法を利用し、市販されている抗ホスホakt抗体(サンタ・クルス社)を用いて行なった。細胞に対するトランスフェクションは、この明細書ですでに説明したのと同様にして行なった。
【0139】
結果。EGF受容体(EGFR3T3)を過剰発現している細胞にハースタチンをトランスフェクトして対照細胞とし、その対照細胞をさらにEGF(DMEM中に100ng/ml)または賦形剤(対照)で処理し、さまざまな時間にわたって培養し、ハースタチンがEGFの生存に及ぼす効果を調べた(図21)。活性化したAktを調べるため、細胞抽出液を、活性化した形態のAkt(ホスホakt)に対して特異的な抗体(サンタ・クルス社から入手可能)と反応させた。
【0140】
EGF受容体をEGFで刺激した20分後、活性化したホスホaktが非常に増大した(上図)。重要なことだが、ハースタチンの存在下では活性化したAktのシグナルが消えた。Aktタンパク質の全体的レベルは、対照レーンからわかるように一定であった(図21の下図)。
【0141】
したがって、本発明によれば、低下した細胞生存率は、(上記の実施例に示したように)p185HER−2のチロシンリン酸化が減少したことと、EGFを媒介としたEGF受容体の活性化が妨害されたことに関係しているだけでなく、EGF受容体を媒介とした細胞の生存シグナルの阻止にも関係していた。この結果は、Aktを媒介とした細胞生存シグナルがEGFから発生するのをハースタチンが阻止していることを示している。
【0142】
実施例15
ハースタチンは、トランスフォーミング増殖因子α(TGFα)を媒介としたEGF受容体の活性化、生存シグナル、増殖シグナルを阻止した
【0143】
HERファミリーの受容体を活性化させるあらゆる増殖因子のうちで、TGFαはヒトのガンと最も関係が深い。肺ガン、卵巣ガン、大腸ガン、前立腺ガンにおけるTGFαの発現は、好ましくない結果と関係している。TGFαが発現すると、腫瘍が自身のEGF受容体を連続的に刺激し続けるという自己分泌メカニズムによってガンがより攻撃的になる可能性があると考えられている(YardenとSlikowski、Nature Reviews、Molecular Cell Biology、第2巻、127〜137ページ)。そこで、EGF受容体の活性化とチロシンリン酸化にとって重要なステップと、Aktの活性化からわかる生存シグナルを調べ、TGFαによるEGF受容体の活性化にハースタチンが及ぼす効果を評価した(図22)。
【0144】
さらに、DNA合成を促進すると、TGFαを媒介としたEGF受容体の活性化シグナルが発生する。要するに、TGFαを媒介としたDNA合成の促進にハースタチンが及ぼす効果を、ハースタチンが増殖に及ぼす効果の1つの指標として調べた。
【0145】
方法。EGF受容体のチロシンリン酸化、活性化したAkt生存シグナル、TGFαを媒介とした細胞増殖シグナルの測定。EGFR3T3細胞において、EGF受容体のチロシンリン酸化の測定と活性化したAkt生存シグナル(すなわちホスホakt)の測定を上記のようにして行なった。
【0146】
TGFαを媒介とした細胞増殖シグナルの測定では、トリチウム化したチミジンが細胞DNAにどれくらいの量組み込まれたかを対照値に対する百分率(“規格化したCPM”)として測定するという標準的な方法を利用した。
【0147】
結果。図22は、EGFR3T3細胞において、ハースタチンの存在下で、TGFαを媒介としたEGF受容体の活性化が抑制され(上図)、TGFαを媒介としたAkt生存シグナルが強く抑制された(下図)ことを示している。重要なことだが、過剰量のTGFαは、ハースタチンが受容体の活性化と生存シグナルを阻止する能力を打ち消すことはなかった。これは、腫瘍細胞から大量に自己分泌されるTGFαがハースタチンの効果を妨げないことを示唆している。
【0148】
さらに、図23は、ハースタチンがTGFαを媒介とした細胞増殖シグナルを阻止したことを示している。ハースタチンを発現する細胞、すなわち対照細胞をさまざまな濃度のTGFαで処理し、トリチウム化したチミジンがどれくらいの量組み込まれたかを対照値に対する百分率(“規格化したCPM”)として測定することにより、DNAの合成状態を調べた。TGFαによるDNAの合成促進は、ハースタチンの発現によって阻止された(図23)。
【0149】
要するに、TGFαを媒介とした細胞増殖に関するシグナルは、ハースタチンの発現によって阻止された。
【0150】
実施例16
組み換えハースタチンは、HER−2を過剰発現しているヒトのガン細胞を特異的に抑制した
【0151】
本発明よれば、ハースタチンを用いてガン(中でも乳ガン、卵巣ガン、肺ガン、大腸ガン、グリア細胞ガン、前立腺ガン)を治療することができる。HER−2を過剰発現しているヒトのガン細胞を精製した組み換えハースタチンが特異的に抑制する能力を、卵巣ガン細胞系と乳ガン細胞系の両方で評価した。
【0152】
方法。精製した組み換えハースタチンの産生。組み換えハースタチンを、インヴィトロジェン社の標準的な昆虫発現系を用い、昆虫のS2細胞内でヒスチジン・タグ付きのタンパク質として産生させた。この組み換えタンパク質を無血清培地に分泌させた。この組み換えタンパク質は、1リットルにつき約10mg存在していた。ハースタチン・タンパク質をニッケル・アフィニティ・クロマトグラフィとコンカナバリンAアフィニティ・クロマトグラフィにより精製した。タンパク質を染色することにより、精製したタンパク質が90%を超える純度であるかどうかを判定した。
【0153】
ハースタチンを用いたガン細胞系の処理。ガン細胞系をプレートに植えるとき(すなわち2日目と4日目)、精製した組み換えハースタチンを添加した(濃度240nM)。細胞の増殖および/または生存を、従来技術で知られているMTT生存細胞アッセイによって定量した(Hansen他、Immunol. Methods、第119巻、201〜210ページ、1989年)。
【0154】
結果。図24は、HER−2を過剰発現している卵巣ガン細胞系(SKOV−3)と乳ガン細胞系(SKBR−3)の増殖および/または生存が、ハースタチンで処理していない細胞(左側の2本の棒)と比べて約60%抑制されたことを示している。これとは対照的に、HER−2を低レベルでしか発現していない乳房の正常な細胞系(HBL−100)とMCF−7乳ガン細胞系は、精製した組み換えハースタチンによって有意に抑制されることはなかった(右側の2本の棒)。
【0155】
要するに、ハースタチンを媒介とした増殖抑制の程度は、HER−2の発現レベルを反映していた。ハースタチンによる抑制は、正常細胞と比べると、あるいはHER−2の発現が低レベルか正常レベルである形質転換した細胞と比べると、HER−2を過剰発現しているガン細胞に対して特異性を示した。
【0156】
図25は、SKOV−3ガン細胞の増殖および/または生存(600nMにおける吸光度)は抑制される(左側の3本の棒)が、正常なHBL−100細胞は抑制されず(右側の3本の棒)、しかも抑制が精製した組み換えハースタチンの投与量に依存していることを示している。
【0157】
実施例17
薬理動態
精製した組み換えハースタチンの薬理動態特性を調べるため、ハースタチンを腹腔内に注射して分析した。生物活性のあるハースタチンは、注射したマウスの血液に効果的に吸収されたが、タンパク質分解酵素によって分解されることはなく、1〜3時間にわたって血液中に存在していた。
【0158】
方法。ハースタチンを用いたヌード・マウスの治療。ヌード・マウスの腹腔に、30mg/kg(一匹につき約600μg)の組み換えハースタチン、または対照となる賦形剤を注射した。7日の間にこの量を2回注射したが、毒性の徴候は見られなかった。
【0159】
ヌード・マウスの血清に含まれるハースタチンの分析。ハースタチンを注射してからさまざまな時間が経過した時点でマウスを殺し、凝固した血液から血清を回収した。緩衝液を用いて血清(全部で約2mlあるうちの)20μlを1mlに希釈し、ヒスチジン・タグを付けたハースタチンをアフィニティ・クロマトグラフィによって単離した。サンプルの分析を、非還元条件下でハースタチンに対するモノクローナル抗体(アップステイト・バイオロジカル社)を用いて、あるいは、還元条件下でクリントン・ラブ社が製造したハースタチンに対するウサギのポリクローナル抗体(Doherty他、PNAS、1999年)を用いて、ウエスタンブロット法により行なった。
【0160】
結果。図26は、腹腔内注射したヌード・マウスの血液に含まれる組み換えハースタチンの分析結果を示している。上図が非還元条件下、下図が還元条件下の結果である。ハースタチンを注射してから図示した時間が経過したとき、マウスを殺して凝固した血液から血清を回収した。そしてヒスチジン・タグを付けたハースタチンをアフィニティ・クロマトグラフィによって単離し、分析した。上図のサンプルは、非還元条件下でハースタチンに対するモノクローナル抗体(アップステイト・バイオロジカル社)を用いてウエスタンブロット法により分析した。下図では、サンプルの分析を、還元条件下でクリントン・ラブ社が製造したハースタチンに対するウサギのポリクローナル抗体(Doherty他、PNAS、1999年)を用いてウエスタンブロット法により行なった。
【0161】
ハースタチンの存在は、注射してから30分後と1時間後には検出できたが、注射してから3時間後と18時間後には検出できなかった(図26、上図;非還元条件)。非還元条件下で約55〜60kDaの位置に移動したハースタチンの単一の種が存在していることから、モノマーでジスルフィドにはなっていない架橋した(凝集した)タンパク質が存在していることがわかる。別の研究により、このモノマー・タンパク質が生物活性を有する形態であることがわかった。
【0162】
図26の下図は、還元条件下で、ハースタチンの多数のエピトープと反応するポリクローナル抗体を用い、血清に含まれるハースタチンを分析した結果を示している。これは、検出されたタンパク質がハースタチンであることの強力な証拠となっている。重要なことだが、ハースタチンは、血液中でタンパク質分解酵素によって分解されることはない。その証拠に、どのウエスタンブロットにも、ハースタチンよりも小さな産物は検出されなかった。マウスの血清に含まれるハースタチンの量に関する半定量的分析(既知量のハースタチンからのウエスタンブロット・シグナルとの比較により決定される)により、腹腔内注射したタンパク質の約10〜20%が吸収され、血液中に1〜3時間にわたって存在していることがわかった。モノマーの形態をしたハースタチンは注射した全ハースタチン・サンプルの約20%であるという事実に基づくと、モノマーの形態が90%も吸収されるのに対し、凝集したタンパク質のほとんどは吸収されないというのが最も起こっていそうなことである。
【0163】
要するに、生物活性のあるモノマー形態の組み換えハースタチンは、注射したマウスの血液に効果的に吸収され、血液中でタンパク質分解酵素によって分解されることはなく、血液中に1〜3時間存在してから除去される。
【図面の簡単な説明】
【図1】
HER−2の細胞外領域に挿入されたヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示している。HER−2のECDをコードしているエキソン1〜9からの配列(プライマーAとB)は、SKOV−3細胞からのcDNAライブラリーからPCRによって増幅した。サザンブロット分析により、約1420bpの産物がHER−2に対して特異的であることがわかった。この産物をサブクローニングし、ヌクレオチド配列を決定した。Aの部分には、ヌクレオチド配列が、274bpの挿入体として(ボックスの外)、またその挿入体に直接隣接した5’部位の配列および3’部位の配列を含めた配列として(ボックス内)示されている。この挿入体は、Coussens他のナンバリングを用いると(Science、第230巻、1132〜1139ページ、1985年)、p185HER−2のヌクレオチド残基1171と1172の間で、アミノ酸残基340の後ろに位置している。矢印で示した共通する5’スプライス部位および3’スプライス部位の拡大図が示してある。挿入された配列は、5’HER−2エキソン配列とインフレームであり、アルギニン340(R340)に続く79個のアミノ酸延長部をコードしていることが推定される。この挿入体によってコードされる新規な79個のアミノ酸配列はプロリン・リッチ(19%)であり、アスパラギンが結合する共通グリコシル化部位を有する。その部分に下線を引いてある。終止コドンが、挿入された配列のヌクレオチド236〜238の位置に見つかった。Bの部分には、新たな転写産物が、p185と一致するサブドメインIとIIを含む分泌タンパク質断片であり、膜貫通領域と細胞質領域を欠いていることを示してある。完全にグリコシル化された場合に予想されるサイズは65〜70kDaである。このポリペプチド産物は、p68HER−2と呼ばれる。したがってこの産物は、p185HER−2に見られる膜貫通領域と細胞質領域が欠けた分泌タンパク質断片であろう。
【図2】
ECD IIIaを含む新たなHER−2転写産物をノーザンブロット分析で検出した結果を示す。さまざまなヒト胎児組織(クロンテック社)またはHEK−293細胞からのポリA+mRNA(2.5μg)をホルマリン・アガロース・ゲルで分離し、10×SSC中のブライトスター(登録商標)膜(アンビオン社)に移した。この膜を、ECD III配列と相補的な32P標識アンチセンスRNAプローブとハイブリダイズさせ、分離させ、5’HER−2エキソン配列に対して特異的な32P標識cDNAプローブで再度調べた。膜を非常に厳しい条件下で洗浄し、リン光画像装置(モレキュラー・ダイナミックス社)で分析した。
【図3】
抗ECD IIIaが、ヒト胚性腎臓細胞系(HEK293)の約68kDaのタンパク質に対して配列特異的な反応をすることを示している。細胞抽出タンパク質(20μg)と、HEK293細胞によって調整した20μlの培地とに対してウエスタンブロット分析を行ない、1:10,000に希釈した抗ECD IIIa(レーン1と2)、またはヒスチジン・タグを有する50μg/mlの精製ECD IIIaペプチドを含む、1:10,000に希釈した抗ECD IIa(レーン3と4)をプローブにして調べた。
【図4】
HER−2遺伝子が増幅されたガン細胞系ではp68ECD IIIaの発現と比べてp185HER−2の発現が顕著に増大していることを示している。ヒト胚性腎臓細胞系(HEK293)からの細胞抽出液(タンパク質15μg)、非発ガン性卵巣表面上皮細胞系(IOSEVAN)、HER−2遺伝子が増幅している卵巣ガン細胞系(SKOV−3)、非発ガン性乳房上皮細胞系(HBL100)、HER−2遺伝子が増幅している乳ガン細胞系(BT474とSKBR−3)を7.5%のアクリルアミド・ゲル中でSDS−PAGEによって分離させ、ウエスタンブロット法で分析した。このウエスタンブロット法では、プローブとして、p68HER−2に対して特異的な抗体(抗ECD IIIa)と、p185HER−2に対して特異的な抗体(抗neu(C))の両方を用いた。
【図5】
p68ECD IIIaがp185HER−2に結合している様子を示す。Aの部分では、非変性性緩衝液中に抽出した2mgのSKBR−3細胞を、p68HER−2とp185HER−2のN末端配列に対して特異的な5μlの抗neu(N)とともに、またはp185HER−2のC末端に対して特異的な5μlの抗neu(C)とともに免疫沈降させ、p68HER−2に対して特異的な抗ECD IIIaと、p185HER−2に対して特異的な抗neu(C)の両方を用い、ウエスタンブロット分析を行なった。Bの部分では、100μgの17−3−1細胞抽出液を2組用意し、充填容積が50μlのNiNTAアガロース樹脂(キアジェン社)とともに200μlの洗浄用緩衝液(20mMのトリス pH8.0、300mMのNaCl)中で室温にて振盪しながら1時間にわたって培養した。アガロース樹脂に対し、一方の培養物ではヒスチジン・タグを有する20μgのECD IIIaを結合させ、他方の培養物ではヒスチジン・タグを有する20μgのCREB断片を結合させた。次にこの樹脂を500μlの洗浄用緩衝液で4回洗浄し、50μlのSDS−サンプル緩衝液とともに100℃で2分間培養することにより、タンパク質を溶離させた。溶離したタンパク質は、p185HER−2のC末端に対して特異的な抗体、すなわち抗neu(C)を用いてウエスタンブロット法で分析した。Cの部分では、3T3細胞、またはHER−2をトランスフェクトした17−3−1細胞約105個からなる単層を12ウエルのプレートに入れたものをPBSで2回洗浄し、次に、1%のBSAと、ヒスチジン・タグを有する精製した39、75、150、300nMの組み換えECD IIIaとを含む無血清培地0.5mlとともに4℃で2時間にわたって培養した。細胞を、1%のBSAを含むPBSの中で1回洗浄し、PBSの中で2回洗浄し、変性用緩衝液中に抽出した。等量の複数のアリコート(タンパク質20μg)を、ECD IIIaに対して特異的な抗体(抗ECD IIIa)、またはp185HER−2に対して特異的な抗体(抗neu(C))を用いて(上の列)ウエスタンブロット法で分析した。
【図6】
p68リッチにした培地も、ECD IIIaペプチドも、p185HER−2のチロシンリン酸化を促進できないことを示している。HER−2をトランスフェクトした約105個の17−3−1細胞からなる単層培養物をPBSで2回洗浄し、無血清培地中で37℃にて24時間培養し、ヒスチジン・タグを有する75μMまたは150μMのECD IIIa、または高レベルのp68を分泌するHEK−293細胞からの50×CM、またはp68HER−2が検出できないSKOV−3細胞からの50×CMを用いて10分間処理した。処理した細胞は、ホスホチロシンホスファターゼを阻害するバナジウム塩(2mM)を含む変性用緩衝液で抽出し、各サンプルからの細胞抽出タンパク質20μg/mlを、ホスホチロシンに対するモノクローナル抗体(シグマ社)を用いてウエスタンブロット法で分析した。62.5mMのトリスpH6.7と、2%のSDSと、100mMの2−メルカプトエタノールの中で55℃にて30分間にわたって培養することによりブロットを取り出し、p185HER−2に対して特異的な抗neu(C)をプローブとしてこのブロットを再度調べた。
【図7】
p68HER−2が、基質とは独立な発ガン性細胞の成長を抑制したことを示している。SCOV−3卵巣ガン細胞と、HER−2をトランスフェクトした17−3−1細胞を、0.3%の寒天を含む10%のウシ胎仔血清を加えた培地(対照条件)中に分散させ、この培地に、SCOV−3細胞によって調整した50×濃縮培地(検出可能なレベルのp68HER−2を含まない(−p68CM))、またはHEK−293細胞によって調整した50×濃縮培地(20nMのp68HER−2を含む(+p68CM))を添加した。12ウエルのプレートに0.5%のアガロースを含む0.5mlの培地を入れて層になるようにし、その上に5×103個の細胞を加えたものをそれぞれの実験条件ごとに全部で3組用意した。図示した結果は、3組用意したウエル中の50個を超える細胞からなるコロニーの数を培養開始後21日目のときに数えた平均値と標準偏差をプロットしたものである。同様の結果が3つの別々の実験でも観察された。
【図8】
HER−2のイントロン8についてのヌクレオチド配列と、推定されるアミノ酸配列を示している。ヒトのゲノムDNAに対し、イントロン8に隣接するプライマーを用いてPCRを行なった。PCRのパラメータは、94℃にて1分間、62℃にて1分間、72℃にて30秒間を30サイクルの後、72℃にて7分間を1サイクルであった。410bpの産物をゲルで精製し、順方向と逆方向にシークエンシングした。図示した配列は、別々の約15人からのイントロン8で見つかった最も一般的な配列である。配列が変異してアミノ酸の置換が起こる可能性のある箇所をXで示してある。
【図9】
トランスフェクトされたCos−7細胞において、ハースタチンとp185HER−2の両方を発現させた様子を示している。材料と方法の項に記載したように、Cos−7細胞は、6ウエルのプレートに2×105細胞/ウエルの割合で植え、リポフェクタミン(バイオラド社)を用いてこのCos−7細胞にトランスフェクションを行なった。この細胞には、1.5μgのハースタチン発現ベクター+1.5μgのHER−2発現ベクター、または1.5μgのHER−2発現ベクター(すべてインヴィトロジェン社からのpcDNA3.1)をトランスフェクトした。それぞれの場合において、対照用エンプティ・ベクターを用い、DNAの合計量が3μgになるようにした。図9は、トランスフェクトされた細胞を48時間後の時点でウエスタンブロットとして分析した結果である。上方の図は、トランスフェクトされた細胞をp185HER−2に対する抗体である抗neu(C)と反応させた場合、下方の図は、ハースタチンのイントロン8によってコードされているC末端配列に対する抗体(抗Hst)と反応させた場合である。図10では、3組のサンプルに対し、CMVプロモータによって制御されるガラクトシダーゼ発現プラスミド0.5μgを含む上記のプラスミドを用いてトランスフェクションを行なった。48時間後、細胞を抽出し、バイオラド・タンパク質染色キットで細胞タンパク質を定量し、β−ガラクトシダーゼの活性を測定した。その方法については後述する。β−ガラクトシダーゼの活性は、タンパク質の量で規格化し、平均と標準偏差をプロットした。β−ガラクトシダーゼの活性を各ウエルに最初に植えた細胞の数で規格化したときにも同様の結果が得られた。
【図10】
図9と同。
【図11】
トランスフェクトされた細胞コロニーの増殖にハースタチンが及ぼす効果を示している。CHO細胞を6ウエルのプレートに2×105細胞/ウエルの割合で植え、3組用意したウエルに、材料と方法の項に記載したようにして、3μgの対照用エンプティ・ベクター(pcDNA3.1;インヴィトロジェン社);1.5μgのp185HER−2発現プラスミド+1.5μgの対照DNA;1.5μgのp185HER−2+1.5μgのハースタチン;1.5μgのハースタチン+1.5μgの対照DNAをそれぞれトランスフェクトした。DNAを添加してから48時間後、細胞をトリプシン処理し、0.6mg/mlのG418の存在下で1:10の割合に希釈して6ウエルのプレートに入れた。培地は2日ごとに交換した。14日目にプレートをクリスタルバイオレットで染色した後、洗浄した。上図では、50%エタノールに入れた1mlの0.1Mリン酸ナトリウム(pH4.5)を用いて室温にて30分間にわたって振盪することにより、クリスタルバイオレットで染色したプレートを抽出した。抽出したクリスタルバイオレットは、10倍に希釈し、515nMにおける吸光度をもとにして定量した。10倍の希釈により読みが0.1から1になった。この値は、予備研究で決定した吸光度と細胞数の直線関係の範囲に入っていた。
【図12】
図11と同。
【図13】
ハースタチンの発現により、トランスフェクトされた細胞内でp185HER−2のチロシンリン酸化が抑制されることを示している。Cos−7細胞を6ウエルのプレートに植え、図9と図10の場合と同様にしてトランスフェクトした。図13では、2組用意したウエル中の細胞に、0.25、0.5、1.0、3μgの蛍光グリーン・タンパク質(FGP)発現プラスミドをトランスフェクトした。エンプティ・ベクターを添加し、各ウエル内のDNAの合計量が3μgになるようにした。48時間後、蛍光プレート読み取り装置を用い、発光波長と励起波長における蛍光信号を定量した。図14と図15では、細胞に0.5μgのFGPプラスミド+1.5μgのHER−2プラスミド+所定量のハースタチン発現プラスミドをトランスフェクトしたものと、細胞に0.5μgのFGPプラスミド+所定量のハースタチン発現プラスミドをトランスフェクトし、HER−2プラスミドはトランスフェクトしないものを用意した。エンプティ・ベクターを添加し、各ウエル内のDNAの合計量が5μgになるようにした。48時間後、細胞をPBSを用いて2回洗浄し、1mMのフッ化フェニルメチルスルホニルと2mMのオルトバナジン酸塩を含む100μlの修飾RIPAの中に抽出した。透明な抽出液中のタンパク質の濃度をバイオラド・タンパク質染色キットを用いて測定した。抽出したタンパク質20μgを7.5%ポリアクリルアミドSDSゲルを用いて分離し、まず最初に、1μg/mlの抗ホスホチロシン抗体(抗PTyr)(図15)を用いてウエスタンブロット法で分析した(材料と方法)。次に、ブロットを取り出し、p185HER−2に対する抗体(抗neu(C);図14)と反応させた。化学ルミネセンス試薬(ピアス社)を用いてブロットを現像し、コダック社のフィルムに曝露した。
【図14】
図13と同。
【図15】
図13と同。
【図16】
ハースタチンの発現により、トランスフェクトされた細胞内でEGFによるEGF受容体の活性化が抑制されることを示している。CHO細胞を6−ウエル・プレートに2×105細胞/ウエルの割合で植え、24時間後、2通り用意した一方のウエルに、0.5μgのFGPマーカー・プラスミド+1.5μgのEGF受容体発現プラスミド+所定量のハースタチン発現プラスミドをトランスフェクトした。もう一方のウエルには、0.5μgのFGPマーカー・プラスミド+所定量のハースタチン発現プラスミドをトランスフェクトしたが、EGF受容体発現プラスミドはトランスフェクトしなかった。24時間後、細胞をPBSを用いて2回洗浄し、無血清培地の中でさらに24時間培養した。図16と図17では、培養物を100ng/mlのEGFの存在下または不在下で20分間にわたって培養し、次に、図13〜図15の場合と同様にして修飾RIPAの中に抽出した。各ウエルからのタンパク質20μgを7%ポリアクリルアミドSDSゲルを用いて分離し、まず最初に、1μg/mlの抗ホスホチロシン抗体(図17)を用いてウエスタンブロット法で分析した。次にブロットを取り出し、抗EGF受容体抗体をプローブとして用いて調べた(図18)。図18では、培養物を100ng/mlのEGFの存在下または不在下で24時間にわたって培養した。次に、抗EGF受容体抗体を用い、細胞抽出液をウエスタンブロットとして分析した。
【図17】
図16と同。
【図18】
図16と同。
【図19】
EGF受容体単独の場合と、EGF受容体とハースタチンを組み合わせた場合に、コロニーの増殖にどのような影響があるかを示している。CHO細胞を6ウエルのプレートに植え、3組用意したウエルに、1.5μgのエンプティ・ベクター;1.5μgのEGF受容体発現プラスミド;1.5μgのEGF受容体発現プラスミド+1.5μgのハースタチン発現プラスミド;1.5μgのハースタチン発現プラスミドをそれぞれトランスフェクトした。エンプティ・ベクターを添加し、各ウエル内のDNAの合計量が3μgになるようにした。DNAを添加してから48時間後、各ウエルの細胞をトリプシン処理して回収し、1:10の割合に希釈し、600μg/mlのG418を含む培地の中にある6ウエルのプレートに入れた。培地は2日ごとに交換した。14日目にプレートをクリスタルバイオレットで染色した。染色した培養物からの色素を図11の場合と同様にして抽出し、415nMにおける吸光度をもとにして定量した。3つのウエルの平均値は、対照をトランスフェクトしたウエルに対する百分率で表示し、この平均値と標準偏差をプロットした。3回の独立した実験において同様の結果が得られた。
【図20】
イントロン8によってコードされているペプチド、すなわちハースタチンを固定化したものが、EGF受容体とp185HER−2を“プルダウンする”ことを示している。Sプロテイン・アガロースの50%懸濁液(ノヴァジェン社)約100μlを、ペプチドなしの場合、TBpex14ペプチド(OHSUのB. Ullman博士から提供された)50μgを添加した場合、イントロン8によってコードされているペプチド50μgを添加した場合、完全長組み換えハースタチン50μgを添加した場合について、室温で1時間にわたって培養した。各ペプチドは、pET30発現プラスミド(ノヴァジェン社)によってコードされているSプロテイン・タグを含んでいた。次に、アガロース・サンプルをPBSで2回洗浄し、1%のノニデット−p40(PBSNP−40)を含むPBSに溶かした100μgのA431細胞抽出液(EGF受容体用)または17−3−1抽出液(p185HER−2用)とともに、室温にて1時間にわたって培養した。アガロース・サンプルは、この細胞抽出液とともに培養した後、500μlのPBS−NP40で2回洗浄し、樹脂に付着したタンパク質を92℃で2分間にわたって40μlのSDS−サンプル緩衝液の中に溶離した。元のペプチドと同じ量がアガロースと複合体を形成していることを確認するため、SDS−サンプル緩衝液の中に抽出したアリコートを、SDS−PAGEとクーマシー染色により分析した。そのとき、TBpex14と、イントロン8によってコードされているペプチドについては17%ポリアクリルアミド・ゲルを、p50ハースタチンについては10%ポリアクリルアミド・ゲルを用いた。受容体の結合状態を分析するため、アガロースから溶離したアリコートを、抗EGFRまたは抗p185HER−2を用いてウエスタンブロットとして分析した。
【図21】
本発明により、活性化したホスホ−aktがEGFによりEGF受容体を媒介として刺激されるのをハースタチンが抑制することを示している。上図は、EGF受容体をEGFで刺激した20分後に、活性化したホスホaktが非常に増加している様子を示す。ハースタチンの存在下では、活性化したAktシグナルが消えた。下図は対照であり、Aktタンパク質の全体的レベルが一定であることを示している。この結果は、ハースタチンが、EGFから発生する細胞生存シグナルを阻止するのに有効であることを示している。
【図22】
本発明により、TGFαを媒介としたEGF受容体活性化の促進(上図)と、TGFαを媒介としたAkt生存シグナルの増大(下図)の両方がハースタチンによって強く抑制されることを示している。
【図23】
TGFαによるDNA合成の促進がハースタチンの発現によって阻止されたことを示している。ハースタチンを発現する細胞または対照細胞を異なるさまざまな濃度のTGFαで処理し、トリチウム化したチミジンがどれくらいの量組み込まれたかを対照値に対する百分率(“規格化したCPM”)として測定することにより、DNAの合成状態を調べた。
【図24】
HER−2を過剰発現している卵巣ガン細胞系(SKOV−3)と乳ガン細胞系(SKBR−3)の増殖および/または生存が、ハースタチンで処理していない細胞(左側の2本の棒)と比べて約60%抑制されたことを示している。それとは対照的に、HER−2を低レベルで発現している正常な乳房の細胞系(HBL−100)とMCF−7乳ガン細胞系は、精製した組み換えハースタチンによって有意に抑制されることはなかった(右側の2本の棒)。
【図25】
SKOV−3ガン(左側の3本の棒)の増殖および/または生存(600nMにおける吸光度をもとに測定)は精製した組み換えハースタチンの投与量に応じて異なるが、正常なHBL−100細胞(右側の3本の棒)はその投与量とは無関係であることを示している。
【図26】
ヌード・マウスに組み換えハースタチンを腹腔内注射した後に血液中に含まれている組み換えハースタチンの分析結果を示している。上図のサンプルは、非還元条件下で、ハースタチンに対するモノクローナル抗体(アップステイト・バイオロジカルズ社)を用い、ウエスタンブロット法により分析した。下図では、還元条件下で、ハースタチンの多数のエピトープと反応するポリクローナル抗体を用いて分析した(Doherty他、PNAS、1999年)。ハースタチンの存在は、注射してから30分後と1時間後には検出できるが、注射してから3時間後と18時間後には検出できない。重要なことだが、ハースタチンが血液中でタンパク質分解酵素によって分解されることはない。その証拠に、ハースタチンよりも小さな産物は、どのウエスタンブロットにも検出されなかった。
関連する出願の相互参照
本出願は、HER−2に結合するアンタゴニストという名称で2000年2月16日に出願されたアメリカ合衆国特許出願シリアル番号第09/506,079号の一部継続出願であり、このシリアル番号第09/506,079号の出願は、HER−2に結合するアンタゴニストという名称で1999年1月20日に出願されたアメリカ合衆国特許出願シリアル番号第09/234,208号の一部継続出願となっている。
【0002】
発明の背景
HER−2に結合するアンタゴニストを説明し、提供する。さらに詳細には、イントロンが保持されていることによってHER−2受容体と結合するHER−2の新規なアンタゴニスト・ポリペプチドが生まれる。
【0003】
この仕事は、国防総省(DOD)の乳ガン研究計画からの助成を受けた。アメリカ合衆国政府は、この発明に関して所定の権利を有する。
【0004】
HER−2/neu(erbB−2)ガン遺伝子は、受容体様チロシンキナーゼ(RTK)をコードしている。このRTKは、ヒトの何種類かのガン(HynesとStem、Biochim. et Biophys. Acta、1198巻、165〜184ページ、1994年;Dougall他、Oncogene、第9巻、2109〜2123ページ、1994年)および哺乳類の発生(Lee他、Nature、第378巻、394〜398ページ、1995年)においてある役割を果たしているというので精力的に研究されてきた。HER−2タンパク質の配列は、クローニングされたcDNAが、胎盤(Coussens他、Science、第230巻、1132〜1139ページ、1985年)および胃ガン細胞系(ヤマモト他、Nature、第319巻、230〜234ページ、1986年)からの上皮増殖因子受容体(EGFR)のmRNAと相同性を有することから決定された。HER−2のmRNAは、約4.5kbであることがわかっており(Coussens他、Science、第230巻、1132〜1139ページ、1985年;ヤマモト他、Nature、第319巻、230〜234ページ、1986年)、ヒトの正常組織および悪性組織において185kDaの膜貫通糖タンパク質(p185HER−2)をコードしている(HynesとStem、Biochim. et Biophys. Acta、1198巻、165〜184ページ、1994年;Dougall他、Oncogene、第9巻、2109〜2123ページ、1994年)。HER−2遺伝子の機能は、主として、トランスフェクションされた細胞内で4.5kbの転写産物に対応するcDNAを発現させることによってと、185kDaタンパク質産物の構造ならびに生化学的特性から調べられている。p185HER−2は、大きな細胞外領域と、膜貫通領域と、チロシンキナーゼ活性を有する細胞内領域とからなる(HynesとStem、Biochim. et Biophys. Acta、1198巻、165〜184ページ、1994年;Dougall他、Oncogene、第9巻、2109〜2123ページ、1994年)。p185HER−2を過剰発現させると、培養した細胞の形質転換が起こる(DiFiore他、Science、第237巻、178〜182ページ、1987年;Hudziak他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第84巻、7159〜7163ページ、1987年)。また、p185HER−2の過剰発現には、臨床上、乳ガンと卵巣ガンの急激な進行が伴う(Slamon他、Science、第235巻、177〜182ページ、1987年;Slamon他、Science、第244巻、707〜712ページ、1989年)。p185HER−2は、EGFRと相同性が極めて大きい。しかしp185HER−2に対して高アフィニティで直接結合するリガンドは、まだ同定されていない。しかも、HER−2のシグナル伝達活性は、EGFRファミリーの他のリガンド結合メンバーとのヘテロダイマー化によるらしい(CarrawayとCantley、Cell、第78巻、5〜8ページ、1994年;Earp他、Breast Cancer Res. Treat.、第35巻、115〜132ページ、1995年;Qian他、Oncogene、第10巻、211〜219ページ、1995年)。
【0005】
HERファミリーに属するRTKの細胞外領域のいくつかの領域を含むさまざまなタンパク質の産生は、完全長受容体のタンパク質分解プロセシングを通じて(LinとClinton、Oncogene、第6巻、639〜643ページ、1991年;Zabrecky他、J. Biol. Chem.、第266巻、1716〜1720ページ、1991年;Pupa他、Oncogene、第8巻、2917〜2923ページ、1993年;Vecchi他、J. Biol. Chem.、第271巻、18989〜18995ページ、1996年;VecchiとCarpenter、J. Cell. Biol.、第139巻、995〜1003ページ、1997年)、また選択的RNAプロセシングを通じて(Petch他、Mol. Cell. Biol.、第10巻、2973〜2982ページ、1990年;Scott他、Mol. Cell. Biol.、第13巻、2247〜2257ページ、1993年;LeeとMaihle、Oncogene、第16巻、3243〜3252ページ、1998年)起こる。p185HER−2の細胞外領域は、培養した乳ガン細胞のタンパク質分解によって生まれる(Petch他、Mol. Cell. Biol.、第10巻、2973〜2982ページ、1990年;Scott他、Mol. Cell. Biol.、第13巻、2247〜2257ページ、1993年;LeeとMaihle、Oncogene、第16巻、3243〜3252ページ、1998年)。また、このp185HER−2の細胞外領域は、ある種のガン患者の血清中に見いだされるため(Leitzel他、J. Clin. Oncol.、第10巻、1436〜1443ページ、1992年)、乳ガン転移の血清マーカーとして使えるであろう(Leitzel他、J. Clin. Oncol.、第10巻、1436〜1443ページ、1992年)。さらにこのp185HER−2の細胞外領域は、HER−2リッチな腫瘍を免疫系による監視から逃れさせている可能性もある(Baselga他、J. Clin. Oncol.、第14巻、737〜744ページ、1966年;Brodowicz他、Int. J. Cancer、第73巻、875〜879ページ、1997年)。
【0006】
HER−2の細胞外領域の断片は、選択的スプライシングによる2.3kbの転写産物でもあり、イントロン内のポリアデニル化シグナルを利用して産生される(Scott他、Mol. Cell. Biol.、第13巻、2247〜2257ページ、1993年)。選択的スプライシングによるこの転写産物は、胃ガン細胞系MKN7において最初に同定された(ヤマモト他、Nature、第319巻、230〜234ページ、1986年;Scott他、Mol. Cell. Biol.、第13巻、2247〜2257ページ、1993年)。受容体の断片は、これらガン細胞から分泌されるのではなく、むしろ核周辺の細胞質に位置していた(Scott他、Mol. Cell. Biol.、第13巻、2247〜2257ページ、1993年)。しかしこの細胞外領域ポリペプチド断片には特別な治療上、診断上、研究上の用途が見つかっていない。選択的スプライシングによって産生されるEGFRの細胞外領域断片(Petch他、Mol. Cell. Biol.、第10巻、2973〜2982ページ、1990年)は、分泌されて、リガンドに結合する性質とダイマー化する性質を示し(Basu他、Mol. Cell. Biol.、第9巻、671〜677ページ、1989年)、受容体の機能に対してドミナント・ネガティブな効果を及ぼす可能性がある(Basu他、Mol. Cell. Biol.、第9巻、671〜677ページ、1989年;Flickinger他、Mol. Cell. Biol.、第12巻、883〜893ページ、1992年)。
【0007】
EGF受容体(HER−1、erbB−1)、HER−2(erbB−2)、HER−3(erbB−3)、HER−4(erbB−4)などのグループI受容体チロシンキナーゼは、上皮組織、間充組織、神経組織で広く発現し、増殖と分化において基本的な役割を担っている。p185HER−2は別にして、受容体チロシンキナーゼは、さまざまなEGF関連増殖因子と結合することによって活性化される。リガンドの結合は、受容体のダイマー化、チロシンの自己リン酸化、シグナル活性化と関係している。p185HER−2は、特定の増殖因子と結合することとは無関係に、自らダイマー化するか、あるいは、パートナーとなる好ましいヘテロダイマーとして招集されて他の受容体ファミリーに属するメンバーの転写促進を行なう。
【0008】
細胞膜においてグループI受容体の量が増加すると、ヒトでしばしばガンが発生する。受容体の数がこのように増加することにより、受容体オリゴマーの形成が促進され、シグナルが増幅されるらしい。EGF受容体とp185HER−2は、非常にしばしば、かつ明確に、ヒトの悪性腫瘍に付随している。HER−2は、脳、卵巣、胃、子宮内膜のガンにおいて過剰発現している。乳ガンや卵巣ガンでp185HER−2のレベルが25〜30%が増加すると、生存率が有意に低下し、再発までの時間が短くなることが予測される。EGF受容体遺伝子の増幅と変化は、肺の扁平上皮細胞ガン(Pavelic他、1993年)、グリア細胞腫瘍(Libermann他、1985年)、グリオブラストーマでしばしば観察されるが、その中でも、最も悪性のグリア細胞腫瘍であるグリオブラストーマで観察される頻度が最も高い。
【0009】
受容体の活性化メカニズムを理解し、細胞表面で受容体の作用を阻止することを目的として、グループI受容体の細胞外領域の構造と機能を明らかにする努力が精力的に続けられてきた。細胞外領域と膜アンカーからなる受容体突然変異体は、細胞質領域がない場合には、ダイマー化して(Lemmon他、1997年;Tzahar他、1997年;TannerとKyte、1999年)、細胞表面の受容体との間でキナーゼに対して不活性な複合体を形成することができる(Greene)。グループI受容体の細胞外領域は、(N末端から始まる)サブドメインI〜サブドメインIVに分割されており、膜隣接位置で終わっている。サブドメインIIとIVは多数のシステイン残基を含んでおり、これらシステイン残基は、4つのグループI受容体において保存されている。サブドメインIとIIは、サブドメインIIIとIVの繰り返し単位であるように見える。これは、おそらく遺伝子重複によって生じたのであろう(Ullrich他、1984年)。EGF受容体からサブドメインIとIIが欠失すると、リガンドとは関係なく、構成的ダイマー化が起こるとともにガンに形質転換し(Hayely他、1989年;CarterとKung、1994年;Qian他、1994年;Moscatello他、1996年)、リガンドとは関係なく、膜に固定されたp185neu細胞外領域突然変異体とヘテロダイマーを形成できるようになる(Greene)。サブドメインIIIは、EGFがEGF受容体と結合することからわかるように、高アフィニティのリガンド結合部位を含んでいる(Wu他、1990年;Woltjer他、1992年;Lax他、1989年、1991年)が、サブドメインIのほうは、リガンドの認識に関して相手を特定しない低アフィニティ部位として機能することが示唆されている(Lax他、1989年、1991年;Tzahar他、1997年)。このモデルによると、EGF様リガンドは二面性があり、サブドメインIII内にあって受容体に直接結合する高アフィニティ部位と、サブドメインI内にあって特異性がゆるやかでp185HER−2と相互作用するほうを好む低アフィニティ部位とを有するため、p185HER−2がなぜダイマーの好ましいパートナーとなるかが説明される。これらの結果を合わせて考えると、サブドメインIとIIは、リガンドがない場合にはダイマー化にマイナスの制約を与えているため、受容体を招集してヘテロダイマーを形成するのに重要である可能性があることが示唆される。
【0010】
腫瘍の増殖を制限するのにp185HER−2の細胞外領域とEGF受容体に対するモノクローナル抗体が有効であることがわかった。この抗体は、高アフィニティと高い特異性でもって標的となる対応する受容体と結合するため、毒性は低い。抗体の抗腫瘍効果の裏に隠れているメカニズムははっきりしていない。rhuMAb4D5モノクローナル抗体(ハーセプチン(登録商標))は、p185HER−2をダウンレギュレーションすることによって細胞表面で作用し、HER−2を介した細胞増殖に可逆的な細胞分裂抑制効果を及ぼしている可能性がある(Hurwitz他、1995年)。ハーセプチン(登録商標)を全身投与すると治療効果があることがわかっている。というのも、転移した乳ガン患者のグループで再発までの期間が延びたからである。EGF受容体に対する高アフィニティのヒト化モノクローナル抗体は、抗腫瘍薬としても用いられている。EGF受容体に対して抗体が活性を有することの裏に隠れている分子メカニズムはまだ明らかになっていないが、テストした抗体は、増殖因子の結合と競合した。p185HER−2とEGF受容体を標的とする抗体戦略や、これら2つの受容体間のヘテロダイマーを標的とする抗体戦略も、以前から試みられている。予備的な結果によると、両方の受容体を標的にすると抗増殖効果が有意に増大することが示唆されている。
【0011】
細胞外領域からなる受容体突然変異体が腫瘍発生を抑制する効果を持つことが明らかにされた。膜に固定されたp185neuの細胞外領域は、細胞内で異所発現し、ドミナントネガティブな抑制剤として機能する。これは、この細胞外領域が、グループI受容体の細胞外領域とダイマー化してキナーゼに対して不活性な複合体を形成する能力を有することに基づいている。p185neuの細胞外領域突然変異体は、p185HER−2ホモダイマーのシグナル伝達を特異的に抑制するとともに、EGF受容体のシグナル伝達をトランス抑制することもできる。p185細胞外領域は、すべてのグループI受容体の活性化を抑制することができる。というのも、p185HER−2は、グループIのRTKにとってヘテロダイマーを形成する際の好ましいパートナーだからである。しかしドミナントネガティブ効果を及ぼすには、細胞外領域突然変異体が膜に固定されることが必要である。というのも、可溶性のある細胞外領域と細胞表面受容体の間の相互作用は、複合体を形成するのに弱過ぎるからである。
【0012】
発明のまとめ
本発明は、ハースタチンと呼ばれる、HER−2受容体チロシンキナーゼの天然抑制剤に関する。このハースタチンは、p185HER−2のN末端側のサブドメインIとIIに一致する最初の340個のアミノ酸と、それに続く79個のアミノ酸からなる新規なC末端と、挿入された配列によって特定される終止コドンとで構成されている。可溶性のある細胞外領域とは異なり、ハースタチンは、高アフィニティ(約14nM Kd)でもってp185HER−2の細胞表面に結合する。ハースタチンは分泌されてp185HER−2と細胞表面で複合体を形成するとはいえ、他のEGR様リガンドとは、p185HER−2の活性を抑制する能力が異なる。現在行なっている研究において、われわれは、ハースタチンとp185HER−2の両方を発現させると細胞増殖が顕著に少なくなることを見いだした。これは、p185の自己リン酸化が抑制されたことに対応している。さらに、ハースタチンの抑制活性は、EGFによるEGF受容体の活性化にまで及んでいる。
【0013】
別の実施態様には、EGF受容体の過剰発現を特徴とする固形腫瘍の治療法が開示されている。この治療法には、EGF受容体の細胞外領域(ECD)に結合する薬剤を投与する操作が含まれる。薬剤は、(a)配列ID番号1の配列に由来する約50〜79個のアミノ酸を含み、EGF受容体の細胞外領域ECDに少なくとも108のアフィニティで結合する単離ポリペプチド、(b)配列ID番号2の配列に由来する約80〜419個のアミノ酸を含み、その中にはC末端の79個のアミノ酸と、少なくとも3つのN結合型グリコシル部位とが存在している、グリコシル化された単離ポリペプチド、(c)EGF受容体のECDに結合するモノクローナル抗体、(d)これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択する。薬剤をモノクローナル抗体だけで構成することはできない。
【0014】
さらに別の実施態様には、EGF受容体を過剰発現している固形腫瘍を治療するための薬理学的組成物が開示されている。この薬理学的組成物は、(a)配列ID番号1の配列に由来する約50〜79個のアミノ酸を含み、EGF受容体の細胞外領域ECDに少なくとも108のアフィニティで結合する単離ポリペプチド、(b)配列ID番号2の配列に由来する約80〜419個のアミノ酸を含み、その中にはC末端の79個のアミノ酸と、少なくとも3つのN結合型グリコシル部位とが存在している、グリコシル化された単離ポリペプチド、(c)EGF受容体のECDに結合するモノクローナル抗体、(d)これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択した薬剤と、薬理学的に受容可能な基剤とを含んでいる。なお、薬剤をモノクローナル抗体のみと、薬学上許容される単体から構成することはできない。
【0015】
さらに別の実施態様として、固形腫瘍組織に治療用薬剤を到達させる方法が開示されている。この方法には、EGF受容体の過剰発現を特徴とする固形腫瘍組織に治療用薬剤を到達させる操作が含まれる。この方法には、治療用薬剤を、配列ID番号1の配列に由来する約50〜79個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドに付着させる操作が含まれる。このポリペプチドは、EGF受容体の細胞外領域ECDに少なくとも108のアフィニティで結合する。
【0016】
さらに別の実施態様として、EGF受容体を過剰発現している腫瘍を有する患者の腫瘍を治療した後の予後予測法が開示されている。この方法には、(a)患者の血液、血清、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、胎盤組織、臍帯組織、羊水、絨毛膜絨毛組織、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択した体液サンプルを取得し、(b)ELISA、免疫沈降法、免疫組織化学法、ウエスタンブロット分析法からなるグループの中から選択して抗p68HER−2受容体抗体をベースとしたアッセイを行なうことにより、発現したp68HER−2受容体の量を測定し、(c)体液に含まれるEGF受容体のECDの量を測定し、(d)p68HER−2の量とEGF受容体の量の比を明らかにすることにより、EGF受容体の量よりもp68HER−2の量が多いほど患者の予後がよいと判定する操作が含まれる。
【0017】
ハースタチンの1つの利点は、特に、グループI受容体チロシンキナーゼを含むヒトの腫瘍に対する治療法の開発に役立っていることである。ハースタチンの別の利点は、p185HER−2またはEGF受容体を過剰発現している細胞の増殖を抑制できることである。
【0018】
発明の詳細な説明
本発明は、イントロン8であると同定された274bpの挿入体を有する、選択的スプライシングによるHER−2の4.8kbのmRNAが初めて発見されたことに基づいている。保持されているこのイントロンはイン・フレームであり、79個のアミノ酸[配列ID番号1]をコードした後、ヌクレオチド配列236位に終止コドンを有する。この新規なmRNAからは、膜貫通領域と細胞内領域を欠いたHER−2タンパク質断片が予測される。このタンパク質断片は、419個のアミノ酸[配列ID番号2]を含む。419個のアミノ酸は、p185HER−2のN末端と一致する340個の残基と、C末端の新規な79個の残基[配列ID番号1]からなる。C末端の新規な79個のアミノ酸残基[配列ID番号1]に対して特異的な抗体、またはp185HER−2のN末端に対して特異的な抗体を用い、68kDaのタンパク質産物を同定した[配列ID番号2]。この68kDaのタンパク質は、新規なHER−2転写産物であり、細胞抽出液の中や、いくつかの細胞系からの細胞外マトリックスの中に見いだされる。この新規な転写産物の発現は、トランスフェクトされていないヒト胚性腎臓細胞系で最大であった。
【0019】
ここに提示した結果は、HER−2の新規なmRNAの発現を示している。このmRNAは、274個多いヌクレオチドを含んでおり、それはおそらくイントロン8であろう。この知見に合致するように、約4.8kbの新規な転写産物が、ヒト胎児の腎臓組織とヒト胚性腎臓細胞系HEK293で検出された。さらに、2.6kbの転写産物が、挿入された配列、すなわちHER−2のECDをコードしている配列に対して特異的なプローブを用いたノーザンブロット分析によりヒト胎児の肝臓組織で検出された(図2)。この2.6kbというサイズは、挿入配列がHER−2の2.3kbのmRNA断片(ヤマモト他、Nature、第319巻、230〜234ページ、1986年;Scott他、Mol. Cell. Biol.、第13巻、2247〜2257ページ、1993年)に含まれている場合に予想されるサイズである。挿入された配列には終止コドンが含まれているため、p185HER−2タンパク質の340番目の残基の位置に、ECD IIIaと表記する新規な79個のアミノ酸延長部が含まれることが予測される。したがってこの予測されるタンパク質は、p185HER−2の膜貫通領域と細胞内領域を欠いているが、細胞外領域のサブドメインIとIIを含んでいる。予想されるように、p185HER−2のN末端配列と、新規な配列を含むことで生まれるC末端延長部とを含む分泌タンパク質が検出された(図3と図5)。ECD IIIaタンパク質は68kDaであることがわかった。これは、p185HER−2のサブドメインIとIIに見られる5つのN結合型グリコシル化部位がグリコシル化される場合に新規な転写産物によってコードされるタンパク質として予想されるサイズとほぼ同じである(Stern他、Mol. Cell. Biol.、第6巻、1729〜1740ページ、1986年)。
【0020】
ここに提示したデータは、p68HER−2がp185HER−2に特異的に結合することを示している。p185HER−2との結合は、p68HER−2のN末端のサブドメインIとIIよりは、プロリン・リッチな新規なECD IIIa領域によって生じている可能性がある。インビトロでの欠失突然変異誘発によって生まれるHER−2のECDもサブドメインIとIIを備えているが、より近接した状態にされるのでなければp185HER−2の細胞外領域とは結合しない(Tzahar他、EMBO J.、第16巻、4938〜4950ページ、1997年;O’Rourke他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第94巻、3250〜3255ページ、1997年;Fitzpatrick他、FEBS Letters、第431巻、102〜106ページ、1998年)。しかし新規なECD IIIaペプチドは、p185HER−2に対してと、p185HER−2を過剰発現している形質転換された17−3−1細胞に対して高アフィニティ(nMの濃度)で結合する(図5)。ECD IIIaペプチドが17−3−1細胞に好んで結合するというのは、分泌されたp68HER−2がp185HER−2の細胞外領域と細胞表面で相互作用することを示している。したがって、p68HER−2とその断片は、HER−2遺伝子によってコードされる天然のHER−2結合タンパク質であるように思われる。EGFRファミリーのリガンド(Groenen他、Growth Factors、第11巻、235〜257ページ、1994年)とは異なり、p68HER−2はEGF相同領域を欠いており、p185HERという受容体そのものの最初の340個のアミノ酸を含んでいる。
【0021】
以前に推定されたHER−2のリガンドは、EGFRファミリーのメンバーとヘテロダイマーの形態でのみp185HER−2と間接的に結合することがわかった(HeldinとOstman、Cytokine Growth Factor Rev.、第7巻、33〜40ページ、1996年)。ECD IIIaは共通の受容体を通じてp185HER−2と間接的に結合することが可能であるが、界面活性剤で溶解させたp185HER−2は固定化したECD IIIaペプチドによって特異的かつ効果的に“プルダウンされる”ため、こんなことは起こりそうにない(図5B)。
【0022】
哺乳類のEGFRファミリーのメンバーに対する天然または人工のすべてのリガンドにとって、結合するというのは、受容体のダイマー化促進およびチロシンリン酸化促進と強く結びついている(HynesとStem、Biochim. et Biophys. Acta、1198巻、165〜184ページ、1994年;Dougall他、Oncogene、第9巻、2109〜2123ページ、1994年;Groenen他、Growth Factors、第11巻、235〜257ページ、1994年)。p68HER−2もECD IIIaペプチドもp185HER−2と結合するにもかかわらず、p185HER−2を活性化させないことがわかった。活性化は、p185HER−2のチロシンリン酸化の程度が異なる2つの別々の細胞系、すなわち形質転換した17−3−1細胞と、SKOV−3卵巣ガン細胞において評価した。さらに、p185HER−2がダイマーの形態になることによって増加するインビトロでの自己リン酸化活性(Dougall他、Oncogene、第9巻、2109〜2123ページ、1994年;Lin他、J. Cell. Biochem.、第49巻、290〜295ページ、1992年)は、p68HER−2とECD IIIaにいずれによっても大きくならなかった。同様に、ショウジョウバエのEGF受容体の細胞外阻害剤であり、クラスIのRTKのアンタゴニストとして知られている唯一のものであるアルゴス・タンパク質は、この受容体のチロシンリン酸化を促進しなかった(Schweitzer他、Nature、第376巻、699〜702ページ、1995年)。同様に、タイ2RTKの天然のアンタゴニストであるアンギオポエチン−2は、内皮受容体と結合したが、その受容体を活性化することはなかった(Maisonpierre他、Science、第277巻、55〜60ページ、1997年)。
【0023】
理論に囚われないとすると、p68HER−2はp185HER−2と結合するがp185HER−2を活性化させないのであるから、p68HER−2がp185HER−2のダイマー化を阻止している可能性がある。類推により、RTKへの結合が促進されるようなHER−2のECDを作ったところ、このHER−2のECDは、リン酸基転移と受容体活性化に必要な生産性のあるダイマーの形成を阻止し、ドメイン・ネガティブな効果を示した(O’Rourke他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第94巻、3250〜3255ページ、1997年)。可溶性p68HER−2は、HER−2のECDとは違ってp185HER−2への強い結合力を示したが、ECDのサブドメインIとIIをやはり含んでいる。サブドメインIは、p185HER−2をヘテロマー複合体にするのに必要な、低アフィニティで何とでも結合するリガンド結合部位である可能性があるため(Tzahar他、EMBO J.、第16巻、4938〜4950ページ、1997年)、p68HER−2がこの部位をブロックし、p185HER−2がダイマーになるのを妨げている可能性がある。また、p68HER−2は、p185HER−2に結合するための、まだ特性が同定されていないリガンドと競合する可能性もある。ヒト胎児の肝臓および腎臓においてp68HER−2が組織特異的に発現することによって、これら器官の発達中にp185HER−2が占める程度が変わる可能性がある。しかも、HER−2遺伝子の増幅に伴ってガン細胞中でp68HER−2よりもp185HER−2が過剰に発現するということ(図3)が、p68HER−2などの結合タンパク質の効果を上回るような選択的圧力によって起こる可能性がある。したがって、p68HER−2は、p185HER−2の活性化を妨げる可能性のある天然のp185HER−2結合タンパク質の最初の例である。
【0024】
薬理学的組成物
本発明は、さらに、HER−2を過剰発現している固形ガンを治療するための薬理学的組成物であって、(a)配列ID番号1の配列に由来する約50〜79個のアミノ酸を含み、HER−2の細胞外領域(ECD)に少なくとも108のアフィニティで結合する単離ポリペプチド、(b)配列ID番号2の配列に由来する約300〜419個のアミノ酸を含み、その中にはC末端の79個のアミノ酸と、少なくとも3つのN結合型グリコシル化部位とが存在している、グリコシル化された単離ポリペプチド、(c)HER−2のECDと結合するモノクローナル抗体、(d)これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択した薬剤と、薬理学的に受容可能な基剤とを含むが、上記薬剤がモノクローナル抗体のみからなることはありえないという薬理学的組成物を提供する。上記薬剤は、配列ID番号1の配列に由来する約50〜79個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドであることが好ましい。さらに好ましいのは、この薬剤が、配列ID番号1の配列に由来する約50〜79個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドと、HER−2のECDに結合するモノクローナル抗体の組み合わせになっていることである。
【0025】
本発明のポリペプチドおよび/またはモノクローナル抗体の一方または両方を含む本発明の薬理学的組成物は、そのまま(複合体または組み合わせ)で、または、適切な基剤および添加剤と混合した薬理学的組成物として、患者に投与することができる。本発明のポリペプチドは、静脈内注射または点滴、腹腔内注射、皮下注射、筋肉内注射などの非経口的な方法で投与することができる。本発明のポリペプチドは、基剤と添加剤を加え、錠剤、ピル、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、分散液などの適切な製剤にして、経口的に、または直腸から投与することができる。本発明のポリペプチドは、皮膚パッチなどの方法で局所的に投与することにより、活性成分のレベルが全身で一定となるようにすることができる。本発明のポリペプチドは、局部に使用するクリーム、皮膚または粘膜のパッチ、皮膚または粘膜の表面に局所的に塗布するのに適切な液体またはゲルにされる。本発明のポリペプチドは、HER−2の過剰発現を特徴とするガンの局所的治療または全身治療のため、吸入器を用いて気道に投与することができる。
【0026】
本発明で使用する本発明のポリペプチドの投与量は、この明細書に記載されている内容から当業者が決定することができる。本発明のポリペプチドは、(投与経路と、活性成分の薬物動態に依存する)本発明のポリペプチドの効果的な投与量と、製剤に応じた投与経路(すなわち経口、非経口、局所的、吸入など)に適した薬理学的基剤および添加剤を含むことになる。本発明の活性なポリペプチドは、混合、溶解、粒子化、糖衣形成、乳剤化、カプセル化、包括化、凍結乾燥といった方法で混合して薬理学的製剤にする。非経口投与する薬理学的組成物は、水溶性形態にした本発明のポリペプチドの水溶液を含んでいる。さらに、本発明のポリペプチドの分散液は、油性注射分散液として調製することができる。適切な親油性溶媒または賦形剤としては、ゴマ油などの不揮発性油、オレイン酸エチルやトリグリセライドなどの合成脂肪酸エステル、リポソームなどが挙げられる。水溶性注射分散液は、この分散液の粘性を高める物質、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、デキストランなど含むことができる。分散液は、より濃縮した溶液にできるよう、複合体または組み合わせの溶解性を高めるための安定化剤や薬剤を含んでいてもよい。
【0027】
経口投与する薬理学的組成物は、活性成分を固体添加剤と組み合わせることにより得られる。固体添加剤としては、糖(例えばラクトース、ショ糖、マンニトール、ソルビトール)、セルロース調製物(例えばデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース)、ゼラチン、ガム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。さらに、分解剤や安定化剤を添加することもできる。
【0028】
p68と、C末端領域にある79個のアミノ酸の合成方法
ポリペプチドの合成は、ペプチド合成装置を、製造業者のペプチド合成指示書に従って使用することによりアミノ酸を順次つなげるという、多数ある標準的なポリペプチド合成法による。アミノ酸の数が100未満の短いポリペプチドの場合には、アミノ酸を順次つなげるというポリペプチド合成法が最適である。さらに、異種ポリペプチドは、標準的な組み換えDNA技術を用いて形質転換した細胞で発現させることができる。すなわち、原核細胞または真核細胞のいずれかを形質転換し、発現に適した増殖培地を用意し、使用する細胞のタイプとその細胞の発現特性に応じてその培地または細胞内物質のいずれかから本発明のポリペプチドを精製する。
【0029】
p68、C末端領域にある79個のアミノ酸、またはこれらの組み合わせを用いたガンの治療法
本発明は、HER−2またはHER−2変異体(実施例8を参照のこと)の過剰発現を特徴とする固形ガンを治療するためにHER−2の細胞外領域(ECD)と結合する薬剤を投与する操作を含む方法であって、この薬剤を、(a)配列ID番号1の配列に由来する約50〜79個のアミノ酸を含み、HER−2の細胞外領域(ECD)に少なくとも108のアフィニティで結合する単離ポリペプチド、(b)配列ID番号2の配列に由来する約300〜419個のアミノ酸を含み、その中にはC末端の79個のアミノ酸と、少なくとも3つのN結合型グリコシル化部位とが存在している、グリコシル化された単離ポリペプチド、(c)HER−2のECDに結合するモノクローナル抗体、(d)これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択するが、この薬剤がモノクローナル抗体のみからなることはありえないという方法を提供する。HER−2を過剰発現している固形ガンは、乳ガン、肺小細胞ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、胃ガン、子宮頚ガン、食道ガン、大腸ガンからなるグループの中から選択することが好ましい。上記薬剤は、配列ID番号1の配列に由来する約50〜79個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドであることが好ましい。より好ましいのは、上記薬剤が、配列ID番号1の配列に由来する約50〜79個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドと、HER−2のECDに結合するモノクローナル抗体の組み合わせである。
【0030】
この明細書に記載したp68HER−2ポリペプチドは、HER−2と結合し、キナーゼ領域を通じてシグナル伝達を妨げることが見いだされた。理論に囚われないとすると、新規なECD IIIa領域はp185HER−2との特異的結合に関与し、その結果としてp68ECDI IIIaと相互作用することでp185HER−2のダイマー化を阻止し、その後に続くシグナル伝達を阻止する。したがってp68HER−2はHER−2のアンタゴニストとして機能し、シグナル伝達に不可欠なダイマー化を阻止することでシグナル伝達を阻止する。つまり、HER−2のアンタゴニストとしてのp68HER−2の機能は、この明細書に記載したアミノ酸79個のポリペプチドや、HER−2のECDに結合するモノクローナル抗体などの結合剤の機能とは異なっている。本発明の方法では、HER−2を過剰に発現している腫瘍内で腫瘍細胞に対してp68HER−2が選択的圧力を加えることによってこの腫瘍細胞の成長を抑制する。同様に、結合剤であるHER−2のアンタゴニストも、HER−2を過剰に発現している腫瘍内で腫瘍細胞に対して選択的圧力を加えてリガンドがHER−2のECDと結合することを阻止し、ダイマー化する可能性が生まれる前にすでにシグナル伝達を阻止することにより、この腫瘍細胞の成長を抑制する。
【0031】
C末端領域にある79個のアミノ酸を利用した標的ターゲッティング分子
本発明は、さらに、HER−2の過剰発現を特徴とする固形ガン組織に治療薬をターゲッティングさせる方法であって、この治療薬を、配列ID番号1の配列に由来する約50〜79個のアミノ酸を含み、HER−2の細胞外領域(ECD)に少なくとも108のアフィニティで結合する単離ポリペプチドに付着させる操作を含む方法を提供する。この単離ポリペプチドは、長さがアミノ酸約69〜79個であることが好ましい。この単離ポリペプチドは、HER−2のECD上の部位のうち、ハーセプチン(登録商標)(ガンの治療に用いられる市販のヒト化モノクローナル抗体であり、HER−2のECDと結合する)の結合部位とは異なる部位に結合することが好ましい。アミノ酸79個からなるこのポリペプチド[配列ID番号1]は、HER−2のECDに対して驚くほど高いアフィニティで結合する特性を示すことがわかった。さらに、そのような結合部位は、市販のヒト化モノクローナル抗体(ハーセプチン(登録商標))の結合部位とは異なっていて、このヒト化モノクローナル抗体の影響を受けない。したがって、この高い結合アフィニティにより、アミノ酸79個からなるこのポリペプチドが、HER−2を発現している腫瘍細胞への標的ターゲッティング分子として機能する。
【0032】
診断/予後予測用の薬剤としての抗p68抗体
p68HER−2のグリコシル化されたECD IIIa変異体3ポリペプチド(後出の表1を参照のこと)を発現させ、抗体産生用の抗原として使用した。より詳細には、p68HER−2に対して特異的な抗体を、ポリヒスチジン・タグを有する精製ECD IIIa変異体3ペプチドをウサギに注射することによって調製した。このペプチドは、イントロンがコードしている新規なC末端領域すなわちp68HER−2と同じものであり、この領域が、高いアフィニティでp185HER−2に結合する。単離したポリクローナル抗体により、ECD IIIaペプチドまたはp68HER−2のpM量を高い特異性で検出した(図3と図5を参照のこと)。したがってp68HER−2に対して特異的な抗体は、体液中および腫瘍組織中のp68HER−2を、ELISA、免疫沈降法、免疫組織化学法、ウエスタンブロット分析法などの診断技術を利用して検出するための診断用薬剤として有用である。
【0033】
ECD IIIaの1つ以上のエピトープ、p68HER−2のエピトープ、ペプチド断片のいずれかを特異的に認識し、したがってECD IIIa変異体(後出の表1を参照のこと)相互の違いを区別する抗体も、本発明に含まれる。そのような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAbs)、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片、F(ab’).sub.2断片、Fab発現ライブラリーによって産生された抗体、抗イディオタイプ(抗Id)抗体、これらのうちの任意のもののエピトープ結合断片などが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。本発明の抗体は、例えば、生物サンプル中のp68HER−2の特定のECD IIIa変異体を検出するのに使用できるため、患者のサンプルまたは組織サンプルに特定の変異体が存在しているかどうかや、特定の変異体の量が異常であるかどうかを調べることで、診断法または予後予測法の一部として利用できる。
【0034】
このような抗体は、テスト化合物が特定のp68HER−2変異体の発現および/または活性に対して及ぼす効果を評価するための化合物スクリーニング法と合わせて利用することもできる。さらに、このような抗体は、この明細書に記載したガン治療法と合わせて利用することができる。
【0035】
抗体産生のためには、例えばポリヒスチジン・タグを有するECD IIIa変異体ポリペプチド、ECD IIIa変異体ポリペプチドの断片、ECD IIIa変異体の機能的等価物、ECD IIIa領域の突然変異体などを注射することによってさまざまな宿主動物に免疫を確立するとよい。このような宿主動物の具体例をほんの少しだけ挙げるならば、ウサギ、マウス、ハムスター、ラットであるが、これだけに限定されるわけではない。宿主の種が何であるかに応じ、さまざまなアジュバントを用いて免疫応答を高めることができる。アジュバントとしては、フロイント(完全、不完全)アジュバント、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、リソレシチンなどの界面活性物質、ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシアニン、ジニトロフェノール、役に立つ可能性のあるヒトのアジュバント(BCG(カルメット−ゲランの細菌)など)、コリネバクテリア(Corynebacterium parvum)などが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【0036】
ポリクローナル抗体は、免疫確立した動物の血清に由来する異種混合の抗体群である。モノクローナル抗体は、特定の抗原に対する均一な抗体群であり、培養した継代細胞系によって抗体分子を産生させることのできる任意の方法で得られる。方法としては、ケーラーとミルシュタインのハイブリドーマ法(Nature、第256巻、495〜497ページ、1975年;アメリカ合衆国特許第4,376,110号)、ヒトB細胞ハイブリドーマ法(Kosbor他、Immunology Today、第4巻、72ページ、1983年;Cole他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第80巻、2026〜2030ページ、1983年)、EBV−ハイブリドーマ法(Cole他、『モノクローナル抗体とガン治療』、アラン R. リス社、77〜96ページ、1985年)が挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。このような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDというクラスのうちのどの免疫グロブリンでもよく、そのどのサブクラスでもよい。ハイブリドーマ産生mAbは、インビトロでもインビボでも培養することができる。インビボで大きな力価のmAbを産生させるというのが、現在のところ最も好ましい産生方法である。
【0037】
さらに、“キメラ抗体”を産生させるために開発された方法(Morrison他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第81巻、6851〜6855ページ、1984年;Neuberger他、Nature、第312巻、604〜608ページ、1984年;タケダ他、Nature、第314巻、452〜454ページ、1984年)、すなわち、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子と、適切な生物活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子をスプライスするという方法を利用することができる。キメラ抗体は、個々の部分がそれぞれ異なる動物種に由来する構成の分子であり、例えば、ネズミのmAbに由来する可変領域と、ヒト免疫グロブリンの定常領域とを有する抗体(ヒト化抗体)がそうである。
【0038】
また、一本鎖抗体の産生方法(アメリカ合衆国特許第4,946,778号;Bird、Science、第242巻、423〜426ページ、1988年;Huston他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第85巻、5879〜5883ページ、1988年;Ward他、Nature、第334巻、544〜546ページ、1989年)を改変してECD IIIa変異遺伝子産物に対する一本鎖抗体を産生させることもできる。一本鎖抗体は、Fv領域のH鎖とL鎖の断片をアミノ酸架橋を通じて結合させることによって形成され、一本鎖のポリペプチドになる。
【0039】
特定のエピトープを認識する抗体断片は、公知の方法で産生させることができる。そのような断片としては、例えば、抗体分子をペプシンで消化させて得られるF(ab’).sub.2断片、F(ab’).sub.2断片のジスルフィド結合を還元することにより得られるFab断片が挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。また、Fab発現ライブラリー(Huse他、Science、第246巻、1275〜1281ページ、1989年)を構成して、望む特異性を有するモノクローナルFab断片を迅速かつ容易に同定することもできる。
【0040】
同様に、特定のECD IIIa変異体に対する抗体は、当業者に周知の方法を用い、ECD IIIa変異体を“真似る”抗イディオタイプ抗体を産生させるのに用いることができる(GreenspanとBona、FASEB J、第7巻(5)、437〜444ページ、1993年;Nissinoff、J. Immunol.、第147巻、2429〜2438ページ、1991年)。例えばECD IIIa変異体に結合する一方で、p68HER−2がHER−2受容体に結合するのを競合的に抑制する抗体を用いると、ECD IIIa変異体を“真似し”、したがってHER−2受容体に結合してこのHER−2受容体を中性化する抗イディオタイプ抗体を産生させることができる。このような中性化抗イディオタイプ抗体、またはこのような抗イディオタイプ抗体のFab断片は、ガン治療の投薬計画において利用することができる。
【0041】
また、特定のECD IIIa変異体に対する抗体で、ECD IIIa変異体の活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用しうる抗体を産生させることができる。このような抗体は、ECD IIIa変異体と結合し、p185HER−2受容体を介したシグナル伝達に対するp68HER−2の活性を変化させる。このような抗体は、特定のガンの治療および/または腫瘍の分化の調節に特に役立つ可能性がある。したがって、本発明は、さらに、HER−2を過剰発現しているガンの治療の予後を予測する方法であって、(a)血液、血清、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択した体液サンプルを取得し、(b)ELISA、免疫沈降法、免疫組織化学法、ウエスタンブロット分析法からなるグループの中から選択して抗p68HER−2抗体をベースとしたアッセイを行なうことにより、発現したp68HER−2の量を測定する操作を含む方法を提供する。ガン治療の予後を予測するこの方法は、体液中のp185HER−2のECDの量を測定し、p68HER−2の量とp185HER−2の量の比を決定する操作をさらに含むことが好ましい。p185HER−2に対するp68HER−2の比の値が大きいほど患者の予後が優れている。
【0042】
診断/予後予測用の薬剤としてのECD IIIa領域変異体
実施例11(後出)は、ヒトのイントロン8の配列が、プロリン・リッチかつ多型であることを示している。別々の15人から採取したゲノムDNAをシークエンシングした結果、HER−2のイントロン8に可変配列領域が10箇所あることが同定された。配列ID番号10、図8、表1を参照のこと。図8は、イントロン8の最も一般的なヌクレオチド配列とそれに対応するポリペプチド配列を示している。この領域は、10通りの多型(配列ID番号10の中には文字W(2箇所)、Y(3箇所)、R、N、M、S(2箇所)で示し、図8には“X”で示してある)を含んでおり、その結果として保存されないアミノ酸置換が起こっている(表1の注を参照のこと)。例えば、ヌクレオチド配列の161位に多型(G→C)があると(図8;表1)、配列ID番号1のアミノ酸残基#54の位置、または配列ID番号2の残基#394の位置でアルギニン(R)がプロリン(P)に代わるはずである。図8または配列ID番号10の1位で示されるN末端のグリシン(G)は、“ハースタチン”配列のアミノ酸残基341に対応する(Doherty他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第96巻、10,869〜10,874ページ、1999年)。図1(A)に示したヌクレオチド配列(Doherty他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第96巻、10,869〜10,874ページ、1999年)は、図8に示した最も一般的であることがわかった配列と比べてアミノ酸残基#6と#73の位置のアミノ酸が異なる多型になっている。
【0043】
この結果は、ヒトの集団において、イントロン8がコードされている領域にいくつかのバリエーションが存在していて、ECD IIIaを含むタンパク質変異体相互の間で生化学的特性や生物学的特性が異なる可能性のあることを示している。ヒトは遺伝的に、特に、2つの変異体に関してヘテロ接合になっているか、所定の1つの変異体に関してホモ接合になっているか、1つの二重変異体に関してホモ接合になっているかの可能性がある。腫瘍の進行にせよ最適の治療にせよ、ある一人の人に現われる変異体が何であるかによって異なる可能性がある。
【0044】
この違いは、予後予測と診断のどちらにも役立つ。本発明は、ECD IIIaを含むポリペプチドがHER−2受容体に強固に結合でき、したがってこのHER−2受容体をアンタゴニスト化できることを示している。このような高アフィニティで特異的な相互作用は、ECD IIIaを含むポリペプチドの特殊な一次構造、二次構造、三次構造に依存する。ECD IIIa領域はプロリン・リッチであり、従来からよく知られていることとして、所定のタンパク質のプロリン・リッチ配列中にあるプロリン残基またはそれ以外の残基の保存されない置換は、このタンパク質の二次構造と三次構造に大きな影響を及ぼしうるということがある。したがって、本発明の多型は、(図8に示した)最も一般的な構造と比べて構造特性、生化学的特性、生物学的特性が大きく異なっているであろう。ECD IIIa変異体タンパク質相互間の構造上の違いとしては、例えば、サイズ、電気陰性度、抗原性の違いが挙げられる。ECD IIIa変異体相互間の生物学的特性の違いは、例えば、細胞分泌の程度、HER−2受容体の変化の性質および/または程度、薬物動態(例えば血清半減期、除去特性)、タンパク質分解に対する抵抗力、N結合型グリコシル化のパターンなどに見られるであろう。これら生物学的性質の違いが今度は腫瘍の進行を変化させることが予想され、したがって最適な治療のプロトコルを変化させることが予想される。そのため、ある人が特定の1つまたは複数のECD IIIa変異体を有することがわかっていると(例えば所定の1つの変異体に関してヘテロ接合である人、または表1の変異体11のように化合物変異体を有する人など)、そのことだけで、特定のガンになりやすさの予測ができる可能性がある。
【0045】
ECD IIIa領域の遺伝的違いが明らかになるということは、ある人が有する特定のECD IIIa変異体の性質を、その人の遺伝子診断を試みる前に配列同定アッセイによって確認できるはずであることを意味する。分析は、患者の体液に由来する任意のゲノムDNAについて行なうことができる。体液は、一般には大人または子どもの血液サンプルであるが、その代わりとして、血清、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、胎盤組織、臍帯組織、羊水、絨毛膜絨毛組織が可能である。ハイブリダイゼーションや増幅アッセイなどの標準的な遺伝子診断法を利用できると考えられる。特定のECD IIIa変異体配列を検出するのに、生物サンプルのハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイにおいて、DNAとRNAのいずれかを用いることができる。このような配列同定アッセイとしては、サザンブロット分析法、ノーザンブロット分析法、一本鎖構造多型分析法、インサイチュ・ハイブリダイゼーション・アッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応(“PCR”)分析法などが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。このような分析法により、ECD IIIa変異体配列の発現に関する特徴を定量的にも定性的にも明らかにすることができよう。特徴としては、例えば、点突然変異および/または遺伝子発現の活性化または不活化が挙げられる。標準的なインサイチュ・ハイブリダイゼーション法を利用すると、所定の組織内でどの細胞が特定のECD IIIa変異体配列を発現しているかに関する情報が得られる可能性がある。
【0046】
ECD IIIa変異体の核酸分子を検出する診断法は、分析する細胞種または組織に由来する核酸を、特定のECD IIIa変異体に対して特異的な、標識された1つまたはそれ以上の核酸試薬すなわちプローブと接触させて培養する操作を含んでいることが好ましい。さらに好ましいのは、PCRまたは逆転写PCRを利用してECD IIIa領域内の核酸の違いを同定することである。PCR反応の条件は、増幅された産物の収量と特異性が最適になるように選択するだけでなく、それに加えて、標準的なゲル電気泳動法を利用して分析できる長さを有する増幅産物が生成するように選択せねばならない。このような反応条件は当業者には周知であり、重要な反応パラメータとしては、例えば、オリゴヌクレオチド・プライマーの長さとヌクレオチド配列、アニーリングして伸長させるステップの温度、反応時間が挙げられる。PCR反応の後、PCR産物は、ヘテロ二本鎖検出、RNAアーゼAを利用したRNA−DNAハイブリッドの開裂、一本鎖構造多型、変性用勾配ゲル電気泳動などの方法で分析することができる。
【0047】
さらに、特定のECD IIIa配列変異体が、制限部位を付加したり除去したりすること、また特定の制限断片のサイズを有意に変化させてしまっていることがわかっている場合には、制限断片長多型(“RFLP”)分析に基づいたプロトコルが適切である可能性がある。
【0048】
ECD IIIa変異体は、患者由来の体液に対して配列同定アッセイを行なうことにより、発現レベルで分析することもできる。体液は、一般には大人または子どもの血液サンプルであるが、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、胎盤組織、臍帯組織、羊水、絨毛膜絨毛組織などでもよい。発現を分析するためのよく知られている配列同定アッセイとしては、mRNAをベースとした方法、例えばノーザンブロット法、(関係するcDNAに由来する核酸プローブを利用した)インサイチュ・ハイブリダイゼーション法、(St−Jacques他、Endocrinology、第134巻、2645〜2657ページ、1994年に記載されている)定量的PCR法が挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【0049】
興味の対象であるECD IIIa変異体に対して特異的な抗体を利用することを含む、ポリペプチドをベースとした方法(例えばウエスタンブロット分析法があるが、これだけに限定されるわけではない)も、上に説明したように、利用することができよう。これらの方法により、所定のECD IIIa変異体の発現量を少なくとも正と負の制御に関して定量することができる。さまざまなECD IIIaのエピトープまたは変異体に対して特異的な種々のモノクローナル抗体を利用し、特定のECD IIIa変異体を発現している細胞サンプルまたは組織サンプルを迅速にスクリーニングすること、またはECD IIIa変異体ポリペプチドのレベルを定量することができると好ましい。ECD IIIa変異体ペプチド分子を定量的または定性的に検出するための好ましい診断法としては、例えば、特定のECD IIIaを含むペプチドが、抗ECD IIIa変異体に対して特異的な抗体との相互作用によって検出されるというイムノアッセイが挙げられる。これは、例えば、蛍光標識した抗体を用いる蛍光抗体法を、光学顕微鏡検出、フローサイトメトリー検出、蛍光定量検出のいずれかと組み合わせることによって実現できる。さらに、本発明で有用な抗体(またはその断片)を蛍光抗体法または免疫電子顕微鏡法などにおけるように組織構造を知るのに利用し、ECD IIIaを含むペプチドを本来存在している場所で検出することもできる。このような方法を利用すると、特定のECD IIIaを含むポリペプチドの存在だけでなく、検査している組織内におけるそのペプチドの分布も検出することができる。
【0050】
ECD IIIa変異体ポリペプチドのイムノアッセイには、ECD IIIaを含むペプチドの同定が可能な検出可能標識をした抗体の存在下で培養した生物サンプル(例えば具体例を列挙した上記の体液)を培養し、結合した抗体を従来技術で周知の多数ある方法のうちの任意の方法で検出する操作が含まれていることが好ましい。生物サンプルは、ニトロセルロースなどの固相支持体または担体や、可溶性タンパク質、細胞、細胞粒子を固定することのできる他の固相支持体と接触させて、その上に固定化するとよい。固相支持体を適切な緩衝液で洗浄した後、抗ECD IIIa変異体に特異的な検出可能標識抗体で処理する。次に、緩衝液を用いて固相支持体の2回目の洗浄を行ない、結合していない抗体を除去する。続いて、固相支持体上に結合している標識の量を従来法で検出する。
【0051】
別の方法として、抗ECD IIIa変異体に対して特異的な抗体を、酵素イムノアッセイすなわち固相酵素免疫検定法(“ELISA”)で使用する酵素に結合させることにより、この抗体に検出可能な標識をすることができる。抗体と結合する酵素は、適切な基質、好ましくは発光性基質と反応して化学基を生成させるため、それを例えば分光光度計、蛍光測定手段、目視などによって検出することができる。抗体に対する検出可能な標識として使用できる酵素としては、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカル・ヌクレアーゼ、Δ−5−ステロイド・イソメラーゼ、酵母のアルコール・デヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコース・オキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【0052】
検出は、酵素に対する発光性基質を用いる熱量測定法によって実現することができる。検出は、目視により酵素反応の程度を適切な基準と比較することによって行なうこともできる。検出は、多彩な他のイムノアッセイ法のうちの任意の方法を用いて実現することもできる。例えば、抗体または抗体断片に放射性標識することにより、放射線免疫検定法(RIA)を利用してECD IIIaを含むペプチドを検出することが可能である。放射性同位体は、γ線カウンター、シンチレーション・カウンターなどの手段により、あるいは放射能写真撮影により検出することができる。
【0053】
抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光標識した抗体を適切な波長の光に曝露すると、蛍光のためにその抗体の存在が検出できる。最もよく使われる蛍光標識化合物としては、フルオレセイン・イソチオシアナート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o−フタルアルデヒド、フルオレスカミンがある。
【0054】
抗体に対しては、152Euやランタノイド系列に属する他の蛍光発光金属を用いて検出可能な標識をすることもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)などの金属キレート化剤を用いて抗体に付着させることができる。
【0055】
抗体は、化学発光化合物と結合させることによって検出可能な標識をすることもできる。化学発光体をタグとして有する抗体の存在は、化学反応中に発生する蛍光の存在を検出することによって明らかにされる。特に有用な標識用の化学発光化合物の具体例としては、ルミノール、イソルミノール、セロマティック・アクリジニウム・エステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステルがある。同様に、生物発光化合物を用いて本発明の抗体に標識することもできる。生物発光は、生物系で見つかった化学発光の一種であり、生体内で触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増大させている。生物発光タンパク質の存在は、蛍光の存在を検出することによって明らかにされる。標識の目的で重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、エクオリンである。
【0056】
抗ECD IIIa変異体に対して特異的な所定ロットの抗体の結合活性は、周知の方法で測定することができる。当業者であれば、定法を利用することによりそれぞれの測定におけるアッセイの操作条件や最適条件を決定できるはずである。
【0057】
したがって、本発明は、プロリン・リッチなECD IIIa領域内に複数の可変配列位置が予想外に発見されたこと、また特定のECD IIIa変異体に対して特異的な抗体が予想外に発見されたことに基づき、予後予測および診断に関する重要な情報とアッセイを提供する。
【0058】
したがって、本発明は、さらに、HER−2を過剰に発現しているガン患者のガン治療の予後を予測する方法であって、(a)患者の血液、血清、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、胎盤組織、臍帯組織、羊水、絨毛膜絨毛組織、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択したから体液サンプルを取得し、(b)ELISA、免疫沈降法、免疫組織化学法、ウエスタンブロット分析法からなるグループの中から選択して抗p68HER−2抗体をベースとしたアッセイを行なうことにより、発現したp68HER−2の量を測定する操作を含む方法を提供する。ガン治療の予後を予測するこの方法は、体液に含まれるp185HER−2のECDの量を測定し、p68HER−2の量とp185HER−2の量の比を決定する操作をさらに含むことが好ましい。p185HER−2に対するp68HER−2の比の値が大きいほど患者の予後が優れている。ガン治療の予後を予測するこの方法は、特定のどのECD IIIa変異体が存在しているかを明らかにし、さまざまなECD IIIaタンパク質変異体の個々の生化学的特性と生物学的特性を考慮してガンの治療を最適化する操作をさらに含むことが好ましい。
【0059】
本発明は、さらに、ガン患者のガンの治療、予後予測、または診断を行なう方法であって、(a)患者の血液、血清、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、胎盤組織、臍帯組織、羊水、絨毛膜絨毛組織、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択した体液サンプルを取得し、(b)配列同定アッセイにより、この体液サンプル中に特定のECD IIIa変異体配列が存在しているかどうかを判定し、(c)歴史データベースを用いて、このECD IIIa変異体配列の存在をガンの治療および診断と関連づける操作を含む方法を提供する。上記の配列同定アッセイは、DNAシークエンシング、PCRアッセイ、ELISA免疫アッセイ、イムノアッセイ、ハイブリダイゼーション・アッセイ、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択することが好ましい。
【0060】
本発明は、さらに、患者のガンの治療、予後予測、または診断を行なう方法であって、(a)患者の血液、血清、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、胎盤組織、臍帯組織、羊水、絨毛膜絨毛組織、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択したから体液サンプルを取得し、(b)ELISA、免疫沈降法、免疫組織化学法、ウエスタンブロット分析法からなるグループの中から選択して抗p68HER−2抗体をベースとしたアッセイを行なうことにより、この体液サンプル中にp68HER−2のECD IIIa変異体が存在しているかどうかを判定し、(c)歴史データベースを用いて、このp68HER−2のECD IIIa変異体の存在またはその量をガンの治療および診断と関連づける操作を含む方法を提供する。
【0061】
本発明は、さらに、ガンの治療、予後予測、または診断を行なう上記の方法が、体液サンプルに含まれるp185HER−2のECDの量を測定する操作をさらに含む方法を提供する。
【0062】
本発明は、さらに、ガンの治療、予後予測、または診断を行なう上記の方法が、体液中のp185HER−2のECDの量を測定し、p185HER−2のECDの量と特定のp68HER−2のECD IIIa変異体の量の比を測定する操作をさらに含む方法を提供する。
【0063】
本発明は、さらに、後に示す配列ID番号1または配列ID番号2の配列のECD IIIa変異体に対して特異的な抗体を提供する。
【0064】
治療薬としてのp68HER−2
理論に囚われないとすると、p68HER−2またはECD IIIaペプチドは、細胞表面でp185HER−2に結合することにより、HER−2を過剰に発現している腫瘍細胞の成長を抑制しているように思われる。この仮説の検証を、p68HER−2の存在下および不在下で基質とは独立な細胞の成長をテストすることにより行なった。そのとき用いた細胞の内部では、p185HER−2の過剰発現の程度に応じて悪性腫瘍が成長するが、p68HER−2はほとんど存在しないか検出できない。腫瘍の細胞毒性を予測するモデルとして、柔らかい寒天における、基質とは独立な細胞の成長を用いた。これは、形質転換活性を調べるための一般的な予測方法であり、細胞が腫瘍またはガンを発生させる能力を反映している(DiFiore他、Science、第237巻、178〜182ページ、1987年;Hudziak他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第84巻、7159〜7163ページ、1987年;Baasner他、Oncogene、第13巻、901〜911ページ、1996年)。
【0065】
柔らかい寒天において基質とは独立な細胞の成長にp68HER−2が及ぼす効果を、SKOV−3ガン細胞と、HER−2をトランスフェクトした17−3−1細胞を用いて測定した。両方の細胞とも腫瘍生成能力があり、p185HER−2を過剰発現している。これら細胞を、p68HER−2の存在下および不在下でウシ胎仔血清を補充した培地に分散させ、湿潤な培養器の中で21日間培養した。50個を超える細胞が含まれるコロニーの数を数えることにより、基質とは独立な細胞の成長を定量した。図7は、p68HER−2の存在下で、SKOV−3細胞と17−3−1細胞の両方に関し、基質とは独立な成長が数分の一に抑制されたことを示している。したがって、これらのデータは、p68HER−2が単に細胞毒性だけを有するのではなく、細胞毒性に加え、おそらくアポトーシス誘導性も有することを示している。
【0066】
ハースタチンを同時に発現させることによりp185HER−2のレベルが抑制され、コロニーの形成が抑制される
ハースタチンの異所発現が、トランスフェクトされたCos−7細胞中のp185HER−2に及ぼす効果を調べた。図9は、HER−2のみをトランスフェクトした細胞と比べると、ハースタチンも同時に発現させたときにはp185のレベルが約5分の1に低下したことを示している。ハースタチンの発現によってトランスフェクトされた細胞の生存率が低下するのであれば、そのことにより、同時にトランスフェクトされた細胞中でp185HER−2のレベルが低下することが説明できる。マーカー用ガラクトシダーゼ・プラスミドの発現が、同時にトランスフェクトされた細胞中で変化しているかどうかを調べた。図10は、ガラクトシダーゼ・プラスミドをp185HER−2と同時にトランスフェクトした場合にガラクトシダーゼ活性が最大となり、対照(pcDNAエンプティ・プラスミド)を同時にトランスフェクトした場合よりも約35%大きくなることを示している。p185HER−2とガラクトシダーゼ・プラスミドに加えてハースタチンを細胞に同時にトランスフェクトした場合には、ガラクトシダーゼ活性が約3分の1に低下した。この低下は、別の2つの細胞系、CHOとHEK−293でも観察された。さらに、同程度の抑制が、ハースタチンとHER−2をトランスフェクトした細胞中で別のマーカーである蛍光グリーン・タンパク質(FPG)の発現を調べたときにも観察された(図示せず)。これらの結果は、HER−2のみをトランスフェクトした場合には同時にトランスフェクトしたマーカーのレベルを増加させるのに対し、ハースタチンとHER−2を同時に発現させるとマーカーのシグナルが低下することを示している。1つの可能な説明は、トランスフェクトされた細胞の生存は、p185HER−2の発現によって増大し、ハースタチンとp185HER−2の同時発現によって抑制されるというものである。
【0067】
コロニーの形成に及ぼす直接的な効果を測定するため、CHO細胞に対してトランスフェクションを行ない、20日間にわたってG418による選択を実施し、生き残った細胞のコロニーを染色して定量した。CHO細胞は、安定なトランスフェクションがなされた細胞を素早く増殖させるのに非常に適している。図11に示したように、p185HER−2をトランスフェクトすると、対照をトランスフェクトした細胞と比べてコロニーの増殖が約60%増加したが、ハースタチンだけを発現させた場合には、増殖に有意な変化は見られなかった。しかしハースタチンをHER−2と同時にトランスフェクトすると、HER−2だけをトランスフェクトした細胞と比べてコロニー形成が劇的に約7分の1に低下した(図11)。
【0068】
ハースタチンの発現によりp185HER−2のチロシンリン酸化が抑制される
ハースタチンの発現がp185HER−2に及ぼす効果をさらに評価するため、p185HER−2発現プラスミドに対するハースタチンの割合を変化させた。ハースタチン発現プラスミドをp185HER−2発現プラスミドの5分の1のレベルで導入した場合には、p185に対する影響はほとんどなかった。図14に示したように、HER−2プラスミドに対してハースタチン発現プラスミドの量を増やしていくと、p185HER−2のレベルが低下し、図1に示したように、トランスフェクトしたマーカーGFPプラスミドの発現も低下した。それとは対照的に、図13に示したように、対照であるGFP発現プラスミドだけをトランスフェクトすると、細胞の生存には影響を与えることはなく、添加したプラスミドの量に比例してGFPの発現が増えた。したがって、ウエスタンブロット分析により検出したp185HER−2のレベル低下は、トランスフェクトされた細胞の生存率が低下したことと関係しているように思われる。図15のレーン6に示したように、p185HER−2のレベルが3分の1に低下したのに対し、p185HER−2のチロシンリン酸化シグナルは25分の1に減った。これは、p185HER−2のチロシンリン酸化のレベルが約8分の1に低下したことを示している。p185のチロシンリン酸化が抑制される程度は、HER−2発現プラスミドに対するハースタチンの割合によって影響され、この比が1:2のときに最も強い効果が観察された。図15に示したように、レーン1とレーン6を比較すると、ハースタチン・プラスミドだけをトランスフェクトした場合には185kDaのタンパク質に付随するチロシンリン酸化シグナルが約2分の1に低下したことがわかる。トランスフェクトしたプラスミドから発現したp185HER−2と同時にp185タンパク質が移動したが、このp185タンパク質は内在性p185HER−2である可能性がある。これらの結果は、ハースタチンを異所発現させると外来性p185HER−2のチロシンリン酸化が減少すること、また、HER−2発現プラスミドに対するハースタチンの割合が、p185HER−2のチロシンリン酸化を抑制する程度とp185の発現レベルとに影響を与えることを示している。さらに、これらの知見から、p185HER−2のチロシンリン酸化の減少が、HER−2とハースタチンを同時にトランスフェクトした細胞のコロニー形成の減少と関係していることもわかる。
【0069】
ハースタチンの発現により、p185HER−2を過剰発現している細胞のコロニー形成が強く抑制される。さらに、ハースタチンは、EGF受容体の過剰発現によって増加した生存率を引き下げる。細胞生存率の低下は、p185HER−2のチロシンリン酸化が減少することと、EGFによるEGF受容体の活性化が妨げられることに対応している。さらに別の証拠は、p185HER−2に対する抑制活性として現われており、ハースタチンの負の調節活性は、グループIファミリーに属する受容体チロシンキナーゼの第2のメンバーであるEGF受容体にまで及んでいる。
【0070】
ハースタチンは、p185HER−2のチロシンリン酸化を抑制する。ハースタチンをトランスフェクトすると、異所発現したp185の構成的チロシンリン酸化のレベルが8分の1に低下する。この抑制は、トランスフェクトされたCHO細胞、HEK−293細胞、Cos−7細胞で観察される。ハースタチンによってp185のチロシンリン酸化がどの程度抑制されるかは、ハースタチンの投与量に依存する。というのも、抑制度は、細胞に添加されるHER−2プラスミドの量に対するハースタチンの量の影響を受けるからである。ハースタチンは、受容体のリン酸基転移反応と活性化に不可欠なステップである受容体のダイマー化を妨げることにより、p185HER−2受容体のチロシンリン酸化を抑制できる可能性がある。
【0071】
ハースタチンが異所発現すると、EGFによるEGF受容体(p185HER−2と相同性があるグループIの受容体)の活性化も妨げられた。ハースタチンは、EGFにより誘起される受容体のチロシンリン酸化を減少させ、別の2つの細胞質タンパク質がEGFからの刺激を受けてチロシンリン酸化するのを抑制し、受容体のダウンレギュレーションを妨げた。受容体のチロシンリン酸化とダウンレギュレーションは、EGFによりEGF受容体が活性化されたことの証拠である。ハースタチンによるEGF受容体の抑制は、EGFの飽和濃度で起こった。ハースタチンのC末端に位置する、イントロン8によってコードされている領域は、p185HER−2に対して高アフィニティで結合するらしく、EGF受容体と結合するが、EGFの結合とは競合しない(Doherty他、投稿中)。これらの結果は、ハースタチンが、増殖因子の結合との競合を含まないメカニズムによってEGF受容体の活性化を阻止していることを示唆している。別の研究によれば、ハースタチンは“プルダウン”アッセイにおいてEGF受容体と結合することがわかっている(Doherty他、投稿中)。ハースタチンはEGF受容体と安定な複合体を形成するように見えるため、EGFにより誘起されるホモダイマーの形成を抑制する可能性がある。EGFにより誘起されるホモダイマーの形成をハースタチンが阻止することによって、あるいは受容体との複合体形成を含まない別のメカニズムによって、ハースタチンがEGF受容体を間接的に抑制することもありうる。
【0072】
p185HER−2またはEGF受容体の過剰発現により、細胞の増殖および/または生存が促進される。細胞にp185HER−2をトランスフェクトすると、G418による選択を生き延びたコロニーの数が、対照をトランスフェクトした細胞と比べて約60%増加した。また、EGF受容体をトランスフェクトすると、細胞コロニーの数が対照をトランスフェクトした細胞と比べて約40%増加した。ハースタチンだけをトランスフェクトしても、コロニーの数が有意に変化することはなかったが、CHO細胞内にp185HER−2と同時に移動した内在性タンパク質に付随するチロシンリン酸化は確かに減った。CHO細胞はp185HER−2以外はグループIの受容体をほとんど含んでいないかまったく含んでいないため、これはp185HER−2であろう。ハースタチンをEGF受容体と同時に発現させると、EGF受容体だけをトランスフェクトした細胞と比べてコロニーの形成が抑制された。ハースタチンがEGFによるEGF受容体の活性化も抑制し、EGF受容体と安定な複合体を形成することが見いだされた(Doherty他、投稿中)ため、増殖の抑制は、ハースタチンがEGF受容体と不活性なキナーゼ複合体を形成したため、あるいは内在性p185HER−2と複合体を形成することによりEGF受容体のトランス作用を抑制したためである可能性がある。増殖の抑制は、EGF受容体またはp185HER−2との相互作用とは直接関係しない、ハースタチンの未知の独立な作用によって起こった可能性もある。最も強力な増殖抑制活性は、ハースタチンをp185HER−2と同時に発現させたときに観察された。この組み合わせにすると、コロニーの形成は、p185HER−2だけをトランスフェクトした細胞と比べて7分の1に減り、ハースタチンだけをトランスフェクトした細胞または対照をトランスフェクトした細胞と比べて5分の1に抑制された。過剰発現したp185HER−2は、細胞内で構成的活性を持っており、その活性を止めると、細胞の増殖だけでなく生存まで抑制される可能性がある。
【0073】
ハースタチンは、これまでに知られているグループIの他のRTK抑制剤と比べると、ドミナント・ネガティブな抑制剤として機能するp185neu細胞外領域突然変異体との共通性をいくつか有することがわかる。ハースタチンと同様、膜に固定されたドミナント・ネガティブなneu突然変異体は、受容体の細胞外領域からの配列を含んでおり、RTKと複合体を形成する(Doherty他;Greene)。また、p185neu細胞外領域と異所発現したハースタチンは、p185HER−2とEGF受容体を抑制することが可能である。サブドメインI〜IVと膜へのアンカーとからなる、以前に報告されているp185neu細胞外領域とは異なり、ハースタチンは、p185neu細胞外領域からのサブドメインIとIIしか含んでおらず、胎仔の腎臓細胞と肝臓細胞で発現する天然産物である(Doherty他、1999年)。ハースタチンは分泌されるので、複合体を形成するための膜アンカーは必要なく、抑制活性を及ぼすこともない。
【0074】
実施例1
この実施例では、細胞外領域(ECD)をコードしている配列中のHER−2のmRNAの多様性を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を利用して調べた実験の結果を示す。HER−2遺伝子が8倍に増幅されている卵巣ガン細胞系(Tyson他、Am. J. Obstet. Gynecol.、第165巻、640〜646ページ、1991年)である、(アメリカ基準培養株コレクション(ロックヴィル、メリーランド州)が、10%のウシ胎仔血清と0.05%のゲンタマイシンを補充したDMEM中に維持している)SKOV−3細胞からのcDNAライブラリーを、エキソン1(Tal他、Mol. Cell. Biol.、第7巻、2597〜2601ページ、1987年)に対して特異的でヌクレオチド142〜161と一致する順プライマーと、エキソン9(Scott他、Mol. Cell. Biol.、第13巻、2247〜2257ページ、1993年)のヌクレオチド1265〜1286に相補的な逆プライマーとを用いて調べた。簡単に説明するならば、SKOV−3のcDNAライブラリーは、オリジーン・テクノロジーズ社(ロックヴィル、メリーランド州)から提供してもらうか、SKOV−3細胞から抽出したRNAから調製するかした。トリリージェント(モレキュラー・リサーチ・センター社、シンシナチ、オハイオ州)を製造業者のプロトコルに従って用いることで15cmのプレート上に80%の集密度で成長したSKOV−3細胞からRNAを抽出し、全RNAを得た。RNAは、逆転写およびcDNAライブラリー構成のために10mMのトリスEDTA、pH8.0に再び分散させるか、リボヌクレアーゼ保護アッセイ(RPA)のためにRNAハイブリダイゼーション用緩衝液(80%のホルムアルデヒド、40mMのPIPES、4mMのNaCl、1mMのEDTA、pH7.5)に再び分散させるかした。RNAの濃度は、分光光度計でOD260における値を測定した。mRNA抽出キット(オリゴテックス、キアジェン社)を用いてポリA+mRNAを全RNAから選択した。
【0075】
サザンブロット法によってHER−2に特異的であることがわかった約1420bpの産物は、以前に報告されたcDNA配列(Coussens他、Science、第230巻、1132〜1139ページ、1985年)から予想される1144bpというサイズよりも約270bp大きかった。簡単に説明するならば、サザンブロット法の手続きに従い、真空下(バイオ−ラド・モデル785ヴァキューム・ブロッター)にある0.4MのNaOH中のアガロース・ゲルから核酸を遺伝子スクリーン・プラス・ハイブリダイゼーション・トランスファー膜(ネン・リサーチ・プロダクツ社、ボストン、マサチューセッツ州)に移した。UV−ストラターリンカー(ストラタジーン社、ラ・ジョラ、カリフォルニア州)の中でUV架橋させることにより核酸を膜に固定し、その膜をハイブリダイゼーション用緩衝液(50%のホルムアルデヒド、5×SSC、1%のSDS、10mg/mlのニシンの精子DNA)中で42℃にて2時間にわたってブロックした。ランダム・プライムDNA標識キット(ベーリンガー・マンハイム社)を用い、膜を、ハイブリダイゼーション用緩衝液中で、42℃にて16時間にわたり、(α−32P)dCTP(ネン・ライフ・サイエンシーズ社)で標識したECD IIIaのcDNAからの220bpのKpn−HincII断片107cpmとハイブリダイズさせた。
【0076】
鋳型を、2.5mMのMgCl2、5μgの各プライマー、200μMのdNTPを含む1×ハイ・フィデリティPCR緩衝液とともに、拡張ハイ・フィデリティPCRシステム(ベーリンガー・マンハイム社)を用いてパーキン・エルマー遺伝子増幅PCRシステム2400(パーキン・エルマー・シータス社、エメリーヴィル、カリフォルニア州)の中で増幅した。すべてのプライマーは、GIBCO BRL社(ライフ・テクノロジーズ社)から得られた。ヌクレオチド残基とアミノ酸残基の番号は、Coussens他が報告しているHER−2のcDNA配列(Coussens他、Science、第230巻、1132〜1139ページ、1985年)に従っている。HER−2の細胞外領域を増幅のターゲットとし、順プライマー(A)(5’−TGAGCACCATGGAGCTGGC−3’[配列ID番号3])と、逆プライマー(B)(5’−TCCGGCAGAAATGCCAGGCTCC−3’[配列ID番号4])を用いてSKOV−3のcDNAライブラリー(オリジーン・テクノロジーズ社)から増幅した。順プライマーは、HER−2のcDNAのヌクレオチド(nt)142〜161と一致していて開始コドン(下線部)の周囲に広がっており、逆プライマーは、HER−2のエキソン配列のnt1265〜1286と相補的になっている。サイクルのパラメータは、94℃で30秒間;58℃で45秒間;68℃で3分間を30サイクルである。ゲノムDNAからの(ECD IIIaと表記する)新規な配列の周囲に広がっている領域は、HER−2のエキソンに対して特異的な配列のnt1131〜1152と一致する順プライマー(C)(5’−AACACAGCGGTGTGAGAAGTGC−3’[配列ID番号5])と、報告されている(Bond他、FEBS Letters、第367巻、61〜66ページ、1995年)ようにして調製したDNAに関する逆プライマー(B)[配列ID番号4]を用いて増幅した。サイクルのパラメータは、94℃で30秒間;62℃で30秒間;72℃で60秒間を25サイクルである。
【0077】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)を利用し、ECD IIIa配列を含むmRNAの構造を調べた。まず最初に鎖状cDNAを、0.5μgのオリゴ−dTで処理した5μgのRNAを用いて逆転写した(Bond他、FEBS Letters、第367巻、61〜66ページ、1995年)。ECD IIIa挿入体とそれに隣接する5’HER−2エキソン配列を増幅するため、上記の順プライマー(A)と、3’ECD IIIaに対して特異的な配列に相補的な逆プライマー(D)(5’−ATACCGGGACAGGTCAACAGC−3’[配列ID番号6])を用いた。サイクルのパラメータは、94℃で30秒間;60℃で40秒間;68℃で2分間を30サイクルである。
【0078】
ECD IIIa挿入体とそれに隣接する3’HER−2エキソンに対して特異的な配列の増幅を、順プライマー(E)(5’−TCTGGGTACCCACTCACTGC−3’[配列ID番号7])と、逆プライマー(F)(5’−TTCACACTGGCACGTCCAGACC−3’[配列ID番号8])を用いて行なった。順プライマーは、5’ECD IIIaに対して特異的な配列と一致していてKpn1制限部位を含んでおり、逆プライマーは、HER−2のエキソン配列のnt3898〜3919と相補的で、終止コドン(下線部)のまわりに広がっている。サイクルのパラメータは、94℃で30秒間;60℃で40秒間;68℃で5分間を30サイクルである。
【0079】
PCR産物をサブクローニングしてヌクレオチド配列を決定した。
その結果は、正常なHER−2をコードしている配列が、5’プライマー配列から始まって中断することなくヌクレオチド1171まで続いていることを示していた。そしてこの位置で、274個のヌクレオチドからなる挿入体が見つかり、その後には予想されるコード配列が続き、その中に3’プライマーが含まれていた。予想されるタンパク質産物を分析した結果、274個のヌクレオチドからなる挿入体が、残基番号340から始まる既知のHER−2タンパク質の延長部をコードしており(Coussens他、Science、第230巻、1132〜1139ページ、1985年)、アミノ酸が79個続いた後にイン・フレーム終止コドンが存在していることを示していた(図1)。挿入されたヌクレオチドとそのヌクレオチドから予想されるアミノ酸配列を遺伝子バンクの配列と比較したところ、相同な配列は見つからなかった。この配列の5’接合部と3’接合部を調べたところ、共通するスプライス・ドナー部位とスプライス・アクセプター部位が明らかになり(SharpとBurge、Cell、第91巻、875〜879ページ、1997年)、挿入配列の3’末端近傍に、ピリミジン領域と、分岐点となる可能性のあるアデニン残基が含まれていることがわかった(図1)。したがって、この挿入配列はイントロンらしい。
【0080】
挿入配列によってコードされる新規な79個のアミノ酸として予想されるアミノ酸配列[配列ID番号1]を調べると、共通のN結合型グリコシル化部位があることと、19%という高い割合でプロリンが含まれていることがわかる(図1)。挿入配列は、p185HER−2配列の細胞外領域中のサブドメインIIとIIIの間に位置しているため(Lax他、Mol. Cell. Biol.、第8巻、1831〜1834ページ、1988年)、ECD IIIaと表記した。この挿入配列は、隣接する5’HER−2エキソン配列と236ntにわたってイン・フレームであり、その中に終止コドンが含まれている。
【0081】
実施例2
この実施例では、ゲノム内でHER−2のエキソンと隣接しているECD IIIaの特性を明らかにする実験の結果を示す。ECD IIIa配列が存在する領域におけるHER−2遺伝子の構造を調べるため、ヌクレオチド763〜785と一致する順プライマーと、HER−2のcDNAのヌクレオチド1265〜1286と相補的な逆プライマーを用い、ヒトゲノムDNAについてPCRを行なった。増幅産物は、エキソン5(Tal他、Mol. Cell. Biol.、第7巻、2597〜2601ページ、1987年)からECD IIIa配列の3’に近接するエキソンまで広がっていることが予想された。イントロンの数とサイズは、PCR産物のサイズ、制限消化分析、増幅産物の部分配列の分析に基づいて推定した。
【0082】
次に、HER−2のエキソンに特異的で挿入体に直接接するプライマーを用いてヒトゲノムDNAを調べ、ECD IIIa配列に直接接している配列を決定した。約430bpの産物を、正常なヒトゲノムDNAからと、3種類のガン細胞系SCOV−3、SKBR−3、BT474から抽出したゲノムDNAから増幅した。これらすべてのガン細胞系においてHER−2遺伝子が増幅されており(Kraus他、EMBO J.、第6巻、605〜610ページ、1987年)、cDNAにECD IIIaを発現していることがわかった。PCR産物がHER−2であることが、実施例1に記載した方法を利用したサザンブロット分析によって確認された。ヌクレオチド配列を分析したところ、ヒトゲノムDNAからのPCR産物がECD IIIa挿入体を含んでおり、その両側が、HER−2をコードしている既知の配列に接していることがわかった。突然変異または再配置は見られなかった。これらのデータは、ECD IIIa配列が、完全な状態で保持されたイントロンであることを表わしており、増幅された産物がイントロン4の次に大きなサイズであることと、相同なEGFR遺伝子およびHER−2遺伝子のイントロン8の位置(LeeとMaihle、Oncogene、第16巻、3243〜3252ページ、1998年)とに基づくと、このイントロンがイントロン8であるらしいことを示している。
【0083】
実施例3
この実施例では、ECD IIIaが、HER−2のmRNAのコード配列内に保持されている唯一のイントロンであることを示す。ECD IIIa挿入配列を含むmRNAの中に別のイントロンが含まれているかどうかを明らかにするため、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)を行なった。まず最初に、5’HER−2のcDNA配列の142〜161と一致していて開始コドンを含む順プライマーと、3’ECD IIIa配列と相補的な逆プライマーを、SKBR−3とSKOV−3のcDNAに対して用いた。1.3kbの産物が増幅された。これは、この産物がイントロン8以外のイントロンを含んでいない場合に予想されるサイズである。次に、5’ECD IIIa配列と一致した順プライマーと、3’HER−2のcDNA配列のヌクレオチド3898〜3919に相補的でp185HER−2の終止コドンを含む逆プライマーとを用い、3’HER−2コード配列を増幅した。2.9kbの産物が増幅された。これは、この産物が別のイントロンを含んでいない場合にHER−2のcDNAから予想されるサイズである。
【0084】
制限消化分析とヌクレオチドのシークエンシングにより5’増幅産物(1.3kb)と3’増幅産物(2.9kb)の両方についてキャラクテリゼーションを行なったところ、別のイントロンは保持されていないことがわかった。イントロン配列が含まれているときに増幅される産物のサイズを決定するため、ゲノムDNAをPCR反応の鋳型として用いた。その結果、5’コード配列に対しては約10kbの産物、3’コード配列に対しては約5kbの産物が得られた。これらの結果は、5’非翻訳領域(5’UTR)と3’非翻訳領域(3’UTR)のサイズが以前に報告されている約4.5kbのHER−2のcDNA(Coussens他、Science、第230巻、1132〜1139ページ、1985年)と同じであるならば、274bpのイントロンが保持されていることで生まれるHER−2の新規な転写産物の予想サイズが約4.8kbとなることを示している。
【0085】
実施例4
この実施例では、ECD IIIa配列を含むタンパク質の発現を示す。新規な配列がタンパク質産物に翻訳されるかどうかを調べるため、ECD IIIa配列を細菌内でポリヒスチジン・タグを有するペプチドとして発現させ、このペプチドをニッケル・アフィニティ・クロマトグラフィにより精製し、この精製ペプチドに対する抗血清を得た。簡単に説明するならば、プライマーEと、ECD IIIa挿入配列の3’末端に相補的な逆プライマーとを用いてSKOV−3のcDNAライブラリーからECD IIIaを増幅することによって細菌の発現ベクターを調製した。逆プライマーはBamH1制限部位配列を含んでおり、(実施例1と2に記載した)RPAにおいて鋳型を構成するのに用いたプライマーと同じであった。約280bpというPCR増幅産物をKpn1とBamH1で消化させ、ゲル(キアエックスII、キアジェン社、チャッツワース、カリフォルニア州)で精製し、クローニングしてpET30aベクターに組み込んだ。このベクターは、発現したタンパク質のアミノ末端の位置に6個のヒスチジンからなるタグをコードしている(ノヴァジェン社、マディソン、ウィスコンシン州)。得られたpET−ECD IIIa発現ベクターを利用して細菌株BL21を形質転換した。
【0086】
ECD IIIaタンパク質産物を発現させるため、pET−ECD IIIa発現ベクターで形質転換したBL21細胞をLB培養液の中で30μg/mlのカナマイシンとともに37℃にて4時間にわたって増殖させた。0.1mMのIPTGで3時間にわたって発現を誘導し、回収した細胞を超音波処理して溶解させ、次に39,000×gで20分間遠心分離した。室温で60分間にわたって撹拌しながら上澄みをNi−NTAアガロース樹脂(キアジェン社)に吸収させた。この樹脂を10容積の洗浄用緩衝液(10mMのトリスpH7.9と300mMのNaCl)で洗浄し、次に、50mMのイミダゾールを加えた10容積の洗浄用緩衝液で洗浄した。ヒスチジン・タグを有するECD IIIaタンパク質を、250mMのイミダゾールを加えた洗浄用緩衝液中に溶離させた。ヒスチジン・タグを有するこのタンパク質は、ゲルをクーマシー・ブルーで染色することにより、約90%の純度であると推定された。このタンパク質を用いて抗体を産生させ、その抗体のキャラクタリゼーションを行なった。
【0087】
簡単に説明するならば、コカリコ・バイオロジカルズ社(リームズタウン、ペンシルヴェニア州)に依頼し、2匹のウサギにポリヒスチジン・タグを有する精製ECD IIIaペプチド(以下に記載)を注射することにより抗ECD IIIa抗血清を生産してもらった。p185HER−2のアミノ酸残基151〜165と一致するペプチドに対するポリクローナル抗neu(N)抗体を作った(LinとClinton、Oncogene、第6巻、639〜643ページ、1991年)。p185HER−2のカルボキシ端末の最後の15残基と一致するペプチドに対するポリクローナル抗neu(N)抗体を作った(Lin他、Mol. Cell. Endocrin.、第69巻、111〜119ページ、1990年)。免疫を確立した2匹のウサギからの抗血清をキャラクテリゼーションしたところ、精製ECD IIIaペプチドと反応する高力価の抗体が含まれていることがわかった。
【0088】
ウエスタンブロット分析により、cDNA中に新規な配列を発現したSKBR−3細胞が抗ECD IIIa抗体と反応するタンパク質を産生させたかどうかを調べた。細胞抽出液および細胞外マトリックスからの68kDaのタンパク質は、2匹のウサギからの抗ECD IIIa抗体を少なくとも20,000倍に希釈したものと反応したが、免疫確立前の血清とは反応しなかった。新規な転写産物のcDNA配列(図1)を調べたところ、p185HER−2のN末端配列中の5つの共通N結合型グリコシル化部位すべてがグリコシル化されている場合には、65〜70kDaの分泌タンパク質産物が予測されることがわかった(Stern他、Mol. Cell. Biol.、第6巻、1729〜1740ページ、1986年)。
【0089】
68kDaのECD IIIaタンパク質[配列ID番号2]は、HER−2の新規なmRNAの翻訳産物であり、そのN末端の残基は、p185HER−2のN末端の340個の残基と一致していなくてはならない。そこで、SKBR−3細胞からの細胞抽出液を、HER−2のN末端配列である抗neu(N)(LinとClinton、Oncogene、第6巻、639〜643ページ、1991年)に対する抗ペプチド抗体、または抗ECD IIIaを用いて免疫沈降させ、得られた免疫複合体を両方の抗体を用いてウエスタンブロット分析法で調べた。簡単に説明するならば、3〜5μlの抗血清を、M−RIPA緩衝液(1%のノニデットP−40、50mMのトリスpH7.4、0.1%のデオキシコール酸ナトリウム、150mMのNaCl、1mMのPMSF、1%のアプロチニン)中に調製した細胞溶離液からのタンパク質2mgに添加した。なお細胞溶離液は、遠心分離で核をあらかじめ除去しておいた。報告されている(Lin他、Mol. Cell. Endocrin.、第69巻、111〜119ページ、1990年)ようにして、免疫沈降を、4℃にて撹拌しながら2時間にわたって行なった。免疫複合体を振盪しながら4℃にて1時間培養するとプロテインGセファロース(ファルマシア社)に結合したため、遠心分離により回収し、M−RIPAで4回洗浄した。この免疫複合体を95℃で2分間にわたってSDS−PAGE用サンプル緩衝液中で培養したところ、タンパク質が免疫複合体から放出された。そこでそのタンパク質を、7.5%のゲル中でSDS−PAGEにより分離させた(ミニ−プロティーンII電気泳動細胞、バイオ−ラド社)。
【0090】
SDS−PAGEの後、ウエスタンブロット分析を行なった。ゲル(厚さ0.75mm)1つにつき半乾燥トランスファー・ユニット(バイオ−ラド社)を1つ用い、電気泳動により、15Vの電圧で20分間にわたってタンパク質をニトロセルロース膜(トランス−ブロット、バイオ−ラド社)上にブロットした。なおゲルは、25mMのトリスpH8.3、192mMのグリシン、50mMのNaCl、20%のメタノールで平衡させた。この膜を、5%の脱脂粉乳を用いて25℃にて1時間にわたってブロックした。次に、ブロットを一次抗体とともに培養し、TBS−トゥイーン(0.05%のトゥイーンを含むトリス緩衝液)で15分間ずつ2回にわたって洗浄し、5分間ずつ4回にわたって洗浄し、ヤギの抗ウサギ二次抗体とともに40分間培養し、西洋ワサビのペルオキシダーゼ(バイオ−ラド社)と結合させ、TBS−トゥイーン中に1:10,000となるように希釈した。膜は、二次抗体とともに培養した後に上記のようにして洗浄し、化学発光試薬(ピアース社)と反応させ、コダック社のX−OMAT BLUフィルムに曝露した。
【0091】
免疫沈降とウエスタンブロット分析において抗ECD IIIaを用いたときには、予想通りp68HER−2が検出された。免疫沈降では抗ECD IIIaを用い、ウエスタンブロット分析におけるプローブを抗neu(N)にしたときには、68kDaのタンパク質が検出された。これは、p68ECD IIIaがp185HER−2のN末端配列を含んでいることを示している。さらに、抗neu(N)がp68HER−2を沈降させた。そのことは、抗ECD IIIa抗体をプローブとして調べることにより検出された。これらの結果は、p68HER−2がECD IIIaとHER−2のN末端配列の両方を含んでいることを示している。
【0092】
他のいくつかの細胞系におけるp68ECD IIIaの発現を調べた。cDNAにECD IIIa配列を含むガン細胞系(BT474、SKOV−3)もp68HER−2を含んでいた。調べたいくつかの細胞系のうち、正常なヒト胚の腎臓細胞に由来するHEK293細胞が、細胞抽出液中および細胞外マトリックス中で最高レベルのp68ECD IIIaを発現し、SKBR−3細胞よりも約5〜10倍多い量だった。p185HER−2の過剰発現を調べたガン細胞系(SKBR−3、SKOV−3、BT474)と比較すると、HEK293はp185HER−2の含有量が約20分の1であった。したがって、p185HER−2に対するp68HER−2の割合は、HEK293細胞においては、調べたガン細胞系の少なくとも100倍であった。特にHEK293抽出液において明らかなp68HER−2との反応および約120kDaのタンパク質との反応は、抗血清を、配列特異的な反応性を示す精製ECD IIIaペプチドとともに予備培養することによって停止させた。この大きなタンパク質はp68HER−2のダイマーである可能性がある。したがってp68HER−2は、いくつかのガン細胞系から発現して分泌され、HEK293中では5〜10倍大きなレベルになっていた。
【0093】
実施例5
この実施例では、ECD IIIaイントロン配列を含む新規なHER−2転写産物の発現を示す。RT−PCR分析の結果は、ECD IIIa配列が挿入されていなければ正常なサイズであるはずのHER−2のmRNAにECD IIIa配列が挿入されたことを示していた。このデータは、約4.8kbの新規な転写産物が存在していることを示唆している。ECD IIIaの新規な転写産物のサイズと発現を調べるため、ECD IIIaに対して特異的なプローブを用いてノーザンブロット分析を行なった。簡単に説明するならば、ECD IIIa挿入体の全配列にまたがっていて、この挿入体に隣接する5’HER−2エキソン配列を含む389bpの配列をPCRで増幅することにより、アンチセンスRNAプローブを合成するための鋳型をSKOV−3のcDNAから構成した。HER−2のcDNA配列とnt1131〜1152が一致する順プライマーC[配列ID番号5]と、3’BamH1制限エンドヌクレアーゼ部位を含み、ECD IIIa配列の3’スプライス部位近傍の配列と相補的な逆プライマー(5’−GCACGGATCCATAGCAGACTGAGGAGG−3’[配列ID番号9])を用いてPCRを行なった。次に、PCR産物をBamH1で消化させ、375bpの断片を遊離させ、クローニングしてpBluescript SK(ストラタジーン社)に組み込んだ。m13順プライマーと逆プライマーを用い、このプラスミドをヴォラム・インスティチュート・コア・シークエンシング・ファシリティ(ポートランド、オレゴン州)にてシークエンシングした。ECD IIIa配列全体と、挿入体に隣接した5’HER−2エキソン配列の87ntとに相補的なアンチセンスRNAプローブを、(α−32P)CTP、T7RNAポリメラーゼと、T7/SP6リボプローブ合成システム(プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州)とを用いて1μgの直線状鋳型から転写した。このプローブは、ECD IIIaおよびそれと隣接するHER−2エキソン配列を含むmRNAとハイブリダイズするときには370ntの断片を保護し、完全にスプライスされたHER−2のmRNAとハイブリダイズするときには87ntの断片を保護することが予想された。
【0094】
RNAハイブリッドを調製するため、30μgのRNAを、48℃にて16時間にわたり、約50,000cpmのアンチセンスRNAプローブとハイブリダイズさせた。このRNAハイブリッドを、40μg/mlのRNアーゼA(ベーリンガー・マンハイム社)および2μg/mlのRNアーゼT1(ライフ・テクノロジーズ社)を用い、250mMのNaCl、5mMのEDTA、10mMのトリスpH7.5からなる溶液中で、37℃にて30分間にわたって消化させた。プロテイナーゼK(100μg)(ライフ・テクノロジーズ社)を含む20μlの10%SDSを添加して消化を停止させた。サンプルを酸性フェノール(pH4.5;ライフ・テクノロジーズ社)とクロロホルムで抽出し、2容積の100%エタノールで沈殿させ、5μlのRPAサンプル用緩衝液(88%のホルムアルデヒド、10mMのEDTA pH8.0、1mg/mlのキシレンシアノール、1mg/mlのブロモフェノール・ブルー)に分散させた。サンプルを95℃にて10分間にわたって変性させ、TBE(89mMのトリス、89mMのホウ酸エステル、2mMのEDTA pH8.3)の中で5%ポリアクリルアミド/尿素ゲル上にて電気泳動を行なった。このゲルを真空下で乾燥させ、保護された断片をリン光画像分析によって定量した(IPラブ・ゲル、モレキュラー・ダイナミックス社)。
【0095】
約4.8kbの新規な転写産物が、p68ECD IIIaを最高レベルで発現したHEK293細胞の中で検出された。しかしSKBR−3、BT474、SKOV−3というガン細胞系のノーザンブロット分析では、新規な転写産物は検出できなかった。そこで、より高感度のリボヌクレアーゼ保護アッセイ(RPA)により、新規な転写産物の発現レベルを、完全にスプライスされた4.5kbの転写産物と比較して調べた。検出可能なレベルのp68ECD IIIaを含んでいた卵巣ガン細胞系(SKOV−3)および乳ガン細胞系(SKBR−3とBT474)からのRNAと、HER−2のcDNAを安定にトランスフェクトした対照細胞系17−3−1からのRNAを、ECD IIIa(イントロン8)配列全体と、イントロン8に隣接した5’HER−2エキソン配列とにまたがる32P標識アンチセンスRNAプローブとハイブリダイズさせた。RNアーゼで消化させ、電気泳動を行ない、放射能写真を撮影したところ、370個のヌクレオチドからなるバンドが、17−3−1以外の各細胞系で検出された。このサイズは、ECD IIIaを含むHER−2のmRNAによって保護されることが予想されるサイズに対応している。さらに、87個のヌクレオチドが保護された断片が、すべての細胞で検出された。このサイズは、対照となる正常な細胞系と比べてこれらガン細胞系で100倍以上も過剰にHER−2を発現している完全にスプライスされたHER−2の断片に対して予想されるサイズである(Kraus他、EMBO J.、第6巻、605〜610ページ、1987年)。保護されたそれぞれの断片の量を測定し、サイズに関して正規化して新規な転写産物の相対量を推定し、p185HER−2のmRNAに対する百分率として表わした。ECD IIIa挿入体を含む新規なHER−2のmRNAは、SKOV−3細胞では完全にスプライスされた転写産物のレベルの4.2%であり、SKBR−3細胞では5.4%であり、BT474細胞では0.8%であった。
【0096】
実施例6
この実施例では、ECD IIIa挿入体を含む新規な転写産物がヒト胚の腎臓および肝臓で発現したことを示す。ノーザンブロット分析により、ECD IIIa配列を含む新規な転写産物がヒトの正常な組織で発現したかどうかを調べた。ヒト胎児のさまざまな組織からのポリA+mRNAをノーザンブロットとして調製し、新規なECD IIIa配列に対して特異的な放射標識プローブとハイブリダイズさせた。4.8kbのmRNAが腎臓で検出され、2.6kbの転写産物が肝臓で検出された(図2)。4.8kbの転写産物は、274bpの挿入体が付加された完全長4.5kb転写産物に対応しているようである。2.6kbの転写産物は、以前に報告されている2.3kbの別の転写産物(ヤマモト他、Nature、第319巻、230〜234ページ、1986年;Scott他、Mol. Cell. Biol.、第13巻、2247〜2257ページ、1993年)に274bpのECD IIIa挿入体が付加されたものに対応しているのであろう。ブロットを取り出して5’HER−2コード配列に対して特異的なプローブとハイブリダイズさせたところ、4.8kbと4.5kbのmRNAを示す広いバンドが胎児の腎臓組織で検出され、2.6kbの転写産物断片が肝臓で検出された。これは、これらの新規な転写産物が、HER−2のECDをコードする配列を含んでいることを示している。挿入されたECD IIIa配列が終止コドンを含んでいるため、同じタンパク質産物がこれらmRNAのそれぞれから産生される可能性がある。
【0097】
いくつかの細胞系についても、ECD IIIaを含む新規な転写産物をノーザンブロット分析で調べた。4.8kbの新規な転写産物が、ヒト胚の腎臓細胞系であるHEK−293で検出された(図2)。HER−2遺伝子が増幅されているSKBR−3、BT474、SCOV−3というガン細胞系のRT−PCR分析によりECD IIIa配列が検出されたとはいえ、ECD IIIaを含む新規な転写産物は、これらの細胞をノーザンブロット分析しても検出できなかった。そこで、ECD IIIa配列全体と、このECD IIIa挿入体に隣接する5’HER−2エキソン配列とにまたがるアンチセンスプローブを利用して、より高感度のリボヌクレアーゼ保護アッセイ(RPA)を行なった。ECD IIIa挿入体を有する新規なHER−2のmRNAは、SCOV−3細胞、SKBR−3細胞、BT474細胞では、完全にスプライスされた転写産物の5%未満しか検出されなかった。これらの知見は、ECD IIIa配列を含む2つの新規な転写産物がヒトの正常組織で組織特異的に発現したこと、4.8kbの新規な転写産物がHEK−293細胞系で発現したこと、遺伝子が増幅したガン細胞が、新規な転写産物を4.5kbのHER−2転写産物の5%未満という低いレベルで発現していることを示している。
【0098】
実施例7
この実施例では、ECD IIIa配列を含むタンパク質の発現を示す。新規な配列がタンパク質産物に翻訳されるかどうかを調べるため、ECD IIIa配列をポリヒスチジン・タグを有するペプチドとして細菌内で発現させ、ニッケル−アフィニティ・クロマトグラフィにより精製し、この精製ペプチドに対する抗血清を得た。4.8kbの新規なECD IIIaの転写産物を発現したHEK−293細胞がECD IIIaを含むタンパク質を発現するかどうかを、ウエスタンブロット分析で調べた。細胞抽出液と細胞外マトリックスからの68kDaのタンパク質は、抗ECD IIIa抗体と反応したが(図3)、免疫確立前の血清とは反応しなかった。反応は、この抗血清を、精製ECD IIIaペプチドとともに予備培養することによって停止させた(図3)。いくつかの細胞抽出液で検出された大きな約125kDaのタンパク質は、p68HER−2の集合体であろう。新規な転写産物のcDNAの配列(図1)からは、p185HER−2のN末端配列中の5つの共通N結合型グリコシル化部位すべてがグリコシル化されている場合に65〜70kDaの分泌タンパク質産物が予測されることがわかる(Stern他、Mol. Cell. Biol.、第6巻、1729〜1740ページ、1986年)。他のいくつかの細胞系でもp68ECD IIIaを発現するかどうかを調べた。cDNAにECD IIIa配列を含むガン細胞系(BT474、SKOV−3、SKBR−3)も、検出可能なレベルのp68HER−2を含んでいた。
【0099】
実施例8
この実施例では、HER−2遺伝子が増幅されているガン細胞系において、p185HER−2と比べてp68HER−2の発現が顕著に低下していることを示す。HER−2遺伝子が増幅されているガン細胞系ではp185HER−2のmRNAと比べてp68HER−2のmRNAの発現レベルが非常に低いため、HER−2遺伝子が増幅されているいくつかの細胞系と増幅されていないいくつかの細胞系において、p68HER−2タンパク質とp185HER−2タンパク質の相対的な割合を調べた。ウエスタンブロットを調製し、p68HER−2に対して特異的な抗血清とp185HER−2に対して特異的な抗血清の両方について調べた。図4は、HER−2遺伝子が約8倍に増幅されているガン細胞系でp185HER−2が容易に検出できたことを示している(Kraus他、EMBO J.、第6巻、605〜610ページ、1987年)。しかしそれに対応してp68HER−2が増加することはなかった。比較すると、p68HER−2は、HEK−293、IOSEVAN、HBL100という非発ガン性細胞で検出された唯一のHER−2タンパク質であった。それに対してp185HER−2はこれらの細胞中では非常に低いレベルでしか発現せず(Kraus他、EMBO J.、第6巻、605〜610ページ、1987年)、過剰に露出したブロットにおいて検出された。これらのデータは、HER−2遺伝子が増幅されているガン細胞系ではp68HER−2がp185HER−2と比べて少ないことを示しており、p185HER−2が過剰に発現したときにp68HER−2が低レベルに維持される何らかのメカニズムが存在している可能性のあることを示唆している。
【0100】
実施例9
この実施例では、p68HER−2とECD IIIaペプチドがp185HER−2に特異的に結合することを示す。p68HER−2は分泌タンパク質であり、しかもp68HER−2は新規な配列に加えてp185HER−2と一致するサブドメインIとIIを含んでいるため、p68HER−2がp185HER−2と相互作用する可能性を調べた。p185HER−2とp68HER−2のN末端に対する抗ペプチド抗体である抗neu(N)、またはp185HER−2に対して特異的な抗体である抗neu(C)を用い、p68HER−2を低レベルで発現し、p185HER−2を過剰発現しているガン細胞SKBR−3の免疫沈降を行なった。免疫沈降させる物質をウエスタンブロットとして調製し、プローブとして、p68HER−2に対して特異的な抗ECD IIIaと抗neu(C)の両方を用いて調べた。抗neu(N)は、p68HER−2とp185HER−2の両方を免疫沈降させた(図5A)。さらに、p185HER−2のC末端に対して特異的な抗体はp185HER−2を免疫沈降させ、p68HER−2を共同沈降させた(図5A)。この結果は、2つのタンパク質の間に相互作用があることを示唆している。
【0101】
ECD配列同士の結合相互作用は非常に弱いので(Tzahar他、EMBO J.、第16巻、4938〜4950ページ、1997年;Fitzpatrick他、FEBS Letters、第431巻、102〜106ページ、1998年)、結合が、新規なプロリン・リッチなECD IIIa領域によるものかどうかを調べた。新規な79個のアミノ酸からなる領域をヒスチジン・タグを有するタンパク質として精製してニッケル・アガロース上に固定化し、プルダウンアッセイで使用した。対照として、ECD IIIaとは関係のない、ヒスチジン・タグを有する2つの精製ペプチド(すなわち、ウィルソン病の膜タンパク質の600残基からなる断片と、CREBタンパク質のDNA結合領域を含む70残基からなる断片)を、同様にしてニッケル・アガロース樹脂上に固定化した。固定化したペプチドを、HER−2をトランスフェクトした3T3細胞(17−3−1)から調製したタンパク質とともに培養した。十分に洗浄した後、結合したタンパク質を溶離させ、ウエスタンブロットとして調製し、それを、p185HER−2に対して特異的な抗体を用いて調べた。1Mのイミダゾールで溶離させ、溶離した物質をSDSゲル中でクーマシー染色することにより、ヒスチジン・タグを有するECD IIIaペプチドと対照用ペプチドが同じ量だけ樹脂に結合したことが確認された。p185HER−2は、ペプチドなしの樹脂にも対照用ペプチドを有する樹脂にも保持されることがなかったのに対し、ECD IIIaペプチドによってだけ選択的に保持された(図5B)。
【0102】
プルダウンアッセイにおいてECD IIIa領域がp185HER−2に結合したため、このECD IIIa領域が、p185HER−2を過剰発現している細胞に選択的に結合するかどうかを調べた。これは、HER−2をトランスフェクトした17−3−1細胞の単層培養物を用いて3T3親細胞と比較することによって調べた。細胞をさまざまな濃度のヒスチジン−ECD IIIaペプチドとともに培養し、洗浄し、プロテアーゼ阻害剤を用いて変性用緩衝液中に抽出した。結合したペプチドがあるかどうかを検出するため、細胞抽出液を、ECD IIIaに対して特異的な抗体を用いてウエスタンブロット分析により調べた。さらに、ECD IIIaペプチドで処理した細胞を等分した複数のアリコートをウエスタンブロットとし、p185HER−2に対して特異的な抗体と反応させた。するとトランスフェクトされた17−3−1細胞においてp185HER−2が過剰に発現した。ECD IIIaペプチドは、nMオーダーのさまざまな濃度で完全な17−3−1細胞に好んで結合する(図5C)のに対し、同等な量の3T3親細胞にはペプチドがほとんど結合しないか、まったく結合しなかった。これは、ECD IIIaがp185HER−2の細胞外領域と特異的な相互作用をしていることを示唆する。
【0103】
実施例10
p68ECD IIIaとECD IIIaペプチドがp185HER−2のチロシンリン酸化に及ぼす効果を調べた。RTKのチロシンリン酸化は、リガンド活性化とシグナル伝達があることの第1の徴候である。17−3−1細胞の処理を、さまざまな量の精製ECD IIIaペプチドを用いて、またはp68HER−2を高レベルで含むHEK293細胞からのならし培地(CM)(図2A)を用いて、または対照となる、検出できるレベルのp68HER−2を含まないSKOV−3細胞からのならし培地を用いて行ない、この17−3−1細胞のチロシンリン酸化を調べた。ヒスチジン−ECD IIIaまたは濃縮CMで10分間処理したとき(図6)または2時間処理したとき、チロシンリン酸化シグナルは増加しなかった。これは、p185HER−2が活性化されなかったことを示唆している。p68HER−2を含むCMも、ECD IIIaペプチドも、p185HER−2のチロシンリン酸化レベルが低いSKOV−3細胞からのp185HER−2に対応するチロシンリン酸化シグナルを、検出可能になるほど変化させることはなかった。さらに、p68HER−2とECD IIIaペプチドは、17−3−1細胞抽出液から免疫沈降させたp185HER−2の自己リン酸化活性に対して検出可能なほどの影響をインビトロで与えることはなかった。これらの結果は、p68HER−2がp185HER−2のシグナル伝達を活性化させなかったという結論を支持している。
【0104】
実施例11
この実施例では、イントロン8の配列が多型であることを示す。ヒトHER−2遺伝子のイントロン8は、mRNA内に選択的スプライシングが可能な状態で保持されて、p185HER−2の細胞外領域の一部のC末端位置で新規な79残基領域をコードしている。保持されたこのイントロンを有する新規な転写産物の産物である“ハースタチン”は、HER−2ガン遺伝子の自己阻害剤として機能する。イントロン8をコードしている領域は、単独ではnMのアフィニティでp185HER−2に結合することがわかっている(Doherty他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第96巻、10,869〜10,874ページ、1999年)。
【0105】
さらに、HER−2遺伝子のイントロン8のヌクレオチド配列とそこから推定されるアミノ酸配列における多型を、別々の15人のゲノムDNAをシークエンシングすることによって同定した。図8と配列ID番号1は、イントロン8の最も一般的なヌクレオチド配列と、それに対応するアミノ酸配列をそれぞれ示している。この領域は、10通りの多型(配列ID番号10の中には文字W(2箇所)、Y(3箇所)、R、N、M、S(2箇所)で示し、図8には“X”で示してある)を含んでおり、その結果として保存されないアミノ酸置換が起こっている(表1の注を参照のこと)。例えば、ヌクレオチド位置161に多型(G→C)があると(図8;表1)、配列ID番号1のアミノ酸残基#54の位置、または配列ID番号2の残基#394の位置でアルギニン(R)がプロリン(P)に代わるはずである。図8または配列ID番号10の位置1で示されるN末端のグリシン(G)は、“ハースタチン”配列のアミノ酸残基341に対応する(Doherty他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第96巻、10,869〜10,874ページ、1999年)。図1(A)に示したヌクレオチド配列は、図8に示した最も一般的であることがわかった配列と比べてアミノ酸残基#6と#73の位置のアミノ酸が異なる多型になっている。
【0106】
この結果は、ヒトの集団において、イントロン8がコードされている領域にいくつかの違いが存在しており、その結果、ECD IIIaを含むタンパク質変異体相互の間で生化学的特性や生物学的特性が異なる可能性のあることを示している。同定されたいくつかの変異を表1にまとめておく。
【表1】
【0107】
表1。ヒトの集団(別々の15人)でイントロン8がコードされている領域に見られた配列の変異1〜11をリストにしてある。このリストには、図8に示した最も一般的なDNA配列と比べて特定の“X”の位置に塩基の変化があることが示してある。それぞれのXの後ろにある括弧内の数字は、図8に示したDNA配列のヌクレオチドの位置に対応している。ここにリストとして示したDNA配列の変異は、配列ID番号1の可変アミノ酸位置(“Xaa”)に対応している。例えば、X(4)がXaa(2)に;X(14)がXaa(5)に;X(17)がXaa(6)に;X(47)がXaa(16)に;X(54)がXaa(18)に;X(62)がXaa(21)に;X(106)がXaa(36)に;X(161)がXaa(54)に;X(191)がXaa(64)に;X(217)がXaa(73)に対応している。配列ID番号2の可変アミノ酸位置に対応している変異は以下の通りである。X(4)がXaa(342)に;X(14)がXaa(345)に;X(17)がXaa(346)に;X(47)がXaa(356)に;X(54)がXaa(358)に;X(62)がXaa(361)に;X(106)がXaa(376)に;X(161)がXaa(394)に;X(191)がXaa(404)に;X(217)がXaa(413)に対応している。配列ID番号1の可変アミノ酸位置に関する(図8に示した最も一般的なDNA配列と比べた場合の)具体的なアミノ酸の変化は以下の通りである。変異1、Xaa(2)(トレオニン→セリン);変異2、Xaa(5)(ロイシン→プロリン);変異3、Xaa(6)(プロリン→ロイシン);変異4、Xaa(16)(ロイシン→グルタミン);変異5、Xaa(18)(メチオニン→ロイシン);変異6、Xaa(21)(グリシン→アスパラギン酸、またはAlu、またはバリン);変異7、Xaa(36)(ロイシン→イソロイシン);変異8、Xaa(54)(プロリン→アルギニン);変異9、Xaa(64)(プロリン→ロイシン);変異10、Xaa(73)(アスパラギン酸→アスパラギン);変異11、Xaa(6)(プロリン→ロイシン)とXaa(73)(アスパラギン酸→アスパラギン)。同じ置換が、配列ID番号2の対応する可変アミノ酸位置にも適用される。
【0108】
実施例12
トランスフェクトされた細胞内でハースタチンを同時に発現させると、(1)コロニーの形成が抑制されることによりp185HER−2のレベルが抑制され、(2)p185HER−2のチロシンリン酸化が抑制された。
【0109】
Cos−7細胞にハースタチン発現ベクターとp185HER−2発現ベクターを同時にトランスフェクトし、その結果として得られたp185HER−2のレベルを測定し、さらにトランスフェクション後のコロニー形成とp185HER−2のチロシンリン酸化の程度を測定することにより、ハースタチン/p185HER−2結合相互作用の効果を明確にした。
【0110】
方法。Cos−7細胞へのトランスフェクション。Cos−7細胞を6ウエルのプレートに2×105細胞/ウエルの割合で植え、リポフェクタミン(バイオラド社)を用いてトランスフェクションを行なった。Cos−7細胞には、1.5μgのハースタチン発現ベクター+1.5μgのHER−2発現ベクター、または1.5μgのHER−2発現ベクター(すべてインヴィトロジェン社からのpcDNA3.1)をトランスフェクトした。対照用エンプティ・ベクターを用い、それぞれの場合にDNAの合計量が3μgになるようにした。トランスフェクトされた細胞は、48時間後にウエスタンブロット法で分析した。タンパク質の検出は、p185HER−2に対する抗体、抗neu(C)抗体、ハースタチンのイントロン8をコードしているC末端配列に対する抗体(抗Hst)のいずれかを用いて行なった。β−ガラクトシダーゼ・マーカー発現反応に関しては、CMVプロモータにより制御されるβ−ガラクトシダーゼ発現プラスミド0.5μgを組み込んだ所定のプラスミドを3組用意し、トランスフェクションを行なった。48時間後、細胞を抽出し、バイオラド・タンパク質染色キットを用いて細胞タンパク質を定量し、β−ガラクトシダーゼの活性を測定した。β−ガラクトシダーゼの活性はタンパク質の量で規格化し、平均と標準偏差をプロットした。β−ガラクトシダーゼの活性を各ウエルに最初に植えた細胞数で規格化した場合にも、同様の結果が得られた。
【0111】
コロニー形成の測定。CHO細胞を6ウエルのプレートに2×105細胞/ウエルの割合で植え、4組用意したウエルに、3mgの対照用エンプティ・ベクター(pcDNA3.1;インヴィトロジェン社);1.5mgのp185HER−2発現プラスミド+1.5mgの対照DNA;1.5mgのp185HER−2+1.5μgのハースタチン;1.5mgのハースタチン+1.5mgの対照DNAをそれぞれトランスフェクトした。DNAを添加してから48時間後、細胞をトリプシン処理し、0.6mg/mlのG418の存在下で1:10の割合に希釈して6ウエルのプレートに入れた。培地は2日ごとに交換した。14日目にプレートをクリスタルバイオレットで染色した後、洗浄した。50%エタノールに入れた1mlの0.1Mリン酸ナトリウム(pH4.5)を用いて室温にて30分間にわたって振盪することにより、クリスタルバイオレットで染色したプレートを抽出した。抽出したクリスタルバイオレットは、10倍に希釈し、515nMにおける吸光度をもとにして定量した。10倍の希釈により読みが0.1から1になった。この値は、予備研究で決定した吸光度と細胞数の直線関係の範囲に入っていた。
【0112】
p185HER−2のチロシンリン酸化抑制の測定。Cos−7細胞を6ウエルのプレートに植え、上記のようにしてトランスフェクションを行なった。2組用意したウエル中の細胞に、0.25、0.5、1.0、3μgの蛍光グリーン・タンパク質(“FGP”)発現プラスミドをトランスフェクトした。エンプティ・ベクターを添加し、各ウエル内のDNAの合計量が3μgになるようにした。48時間後、蛍光プレート読み取り装置を用い、発光波長520nMと励起波長490nMにおける蛍光信号を定量した。また、細胞に0.5μgのFGPプラスミド+1.5μgのHER−2プラスミド+所定量のハースタチン発現プラスミドをトランスフェクトしたものと、細胞に0.5μgのFGPプラスミド+所定量のハースタチン発現プラスミドをトランスフェクトし、HER−2プラスミドはトランスフェクトしないものを用意した。エンプティ・ベクターを添加し、各ウエル内のDNAの合計量が5μgになるようにした。48時間後、細胞をPBSを用いて2回洗浄し、1mMのフッ化フェニルメチルスルホニルと2mMのオルトバナジン酸塩を含む100μlの修飾RIPAの中に抽出した。バイオラド・タンパク質染色キットを用い、透明な抽出液中のタンパク質の濃度を測定した。抽出したタンパク質20μgを7.5%ポリアクリルアミドSDSゲルを用いて分離し、まず最初に、1μg/mlの抗ホスホチロシン抗体(“抗PTyr”)を用いてウエスタンブロット法で分析した。次に、ブロットを取り出し、p185HER−2に対する抗体(抗neu(C))と反応させた。化学ルミネセンス試薬(ピアス社)を用いてブロットを現像し、コダック社のフィルムに曝露した。
【0113】
(1)異所ハースタチンの発現により、トランスフェクション後の生存率が低下し、トランスフェクトされたCos−7細胞中のp185HER−2のレベルが低下した。p185HER−2のレベルは、Cos−7細胞の中でハースタチンをp185HER−2と同時に発現させると、p185HER−2だけをトランスフェクトした場合と比べて約5分の1に低下した(図9)。マーカー・プラスミドから発現させたβ−ガラクトシダーゼ(“β−gal”)の活性を内部対照としてモニターした。
【0114】
図10は、β−galマーカー・プラスミドをp185HER−2と同時にトランスフェクトした場合にβ−galの活性が最大になったことを示している(β−galプラスミドをエンプティ・プラスミドである“pcDNA”と同時にトランスフェクトした場合よりも約35%大きい)。それとは対照的に、β−galの活性レベルは、p185HER−2とβ−galプラスミドに加えてハースタチンも同時にトランスフェクトした細胞で約3分の1に低下した。同様の低下が、2つの別の細胞系、CHOとHEK−293でも観察された。さらに、ハースタチンとHER−2を同時にトランスフェクトした細胞で別のマーカーである蛍光グリーン・タンパク質(“FGP”)を調べた場合にも、マーカー遺伝子の発現レベルが同様に抑制されることが観察された。したがって、単独のp185HER−2と同時にマーカー・プラスミドをトランスフェクトすることにより、同時にトランスフェクトしたマーカーの発現レベルが増加したが、ハースタチンおよびp185HER−2と同時にマーカー・プラスミドをトランスフェクトすると、マーカーのシグナルは減少した。
【0115】
p185HER−2とマーカー遺伝子の発現レベルが上記のように低下したことは、トランスフェクトした細胞ごとのp185HER−2(またはマーカー)のレベルの全体的低下、あるいはトランスフェクト後に生き延びた細胞数の減少と整合していた(すなわち、p185HER−2の発現により生存が促進され、ハースタチンとp185HER−2を同時に発現させることにより生存が抑制された)。
【0116】
(トランスフェクトされた安定な細胞を早く増殖させるのに適した)CHO細胞にトランスフェクションを行ない、G418で20日間にわたって選択を実施し、生き残った細胞コロニーを染色して定量することにより、コロニー形成に同時トランスフェクションが及ぼす効果を直接測定した。p185HER−2をトランスフェクトすると、対照をトランスフェクトした細胞と比べてコロニー形成が約60%増加したのに対し、ハースタチンだけを発現させた場合には増殖に有意な変化はなかった(図11)。それとは対照的に、ハースタチンを同時にトランスフェクトすると、HER−2をトランスフェクトした場合と比べて細胞のコロニー形成が約7分の1へと劇的に低下した(図11)。
【0117】
ハースタチン発現プラスミドとp185HER−2発現プラスミドをトランスフェクトする割合を変化させることにより、ハースタチンの発現がトランスフェクトされた細胞内のp185HER−2に及ぼす効果をさらに調べた。ハースタチン発現プラスミドをp185HER−2発現ラスミドの5分の1のレベルで導入したときには、p185HER−2の発現レベルに対する影響は実質的になかった。p185HER−2発現プラスミドに対するハースタチン発現プラスミドの相対量を増やしていくと、p185HER−2の発現レベルが低下し(図14のB)、同時にトランスフェクトしたマーカーであるGFP発現プラスミドの発現が図9に示したのと同様に低下した。それとは対照的に、対照であるGFP発現プラスミドだけをトランスフェクトすると、細胞の生存には影響を与えず、添加したプラスミドの量に比例してGFPの発現が増加した(図13)。
【0118】
したがって、ハースタチンを同時にトランスフェクトした細胞中のp185HER−2のレベル低下は、細胞ごとのp185HER−2のレベル低下ではなく、トランスフェクト後の細胞のコロニー形成が減少したことが原因であると結論された。さらに、トランスフェクトされた細胞の生存率は、ハースタチンとp185HER−2の相対的な発現量に依存していた。言い換えるならば、p185HER−2を発現する細胞の生存率は、ハースタチンに曝露することによって実質的に低下した。
【0119】
(2)ハースタチンの発現がp185HER−2のチロシンリン酸化を抑制する。ハースタチンを同時にトランスフェクトしてp185HER−2のレベルが3分の1に低下した場合には、p185HER−2のチロシンリン酸化シグナルが25分の1に低下した。これは、個々の細胞でp185HER−2のチロシンリン酸化のレベルが約8分の1に低下することに相当する(図15)。
【0120】
細胞の生存の場合と同様、p185HER−2のチロシンリン酸化が抑制される程度は、p185HER−2発現プラスミドに対するハースタチン発現プラスミドの割合に影響された。最大の効果は、比が2:1のときに観察された(ハースタチン:p185HER−2)。ハースタチン発現プラスミドだけをトランスフェクトすると、内在性185kDaタンパク質に付随するチロシンリン酸化シグナルが約2分の1に低下した(Cのレーン1とレーン2の比較)。トランスフェクトされたp185HER−2発現プラスミドから発現したp185HER−2と同時にp185タンパク質が移動したが、このp185タンパク質は、内在性p185HER−2に対応しているようである。
【0121】
ハースタチンを異所発現させると、外来性と内在性のp185HER−2のチロシンリン酸化が減少した。さらに、p185HER−2発現プラスミドに対するハースタチンの割合は、p185HER−2のチロシンリン酸化抑制の程度とp185の発現レベルに影響を与える。したがって、減少したp185HER−2のチロシンリン酸化は、HER−2とハースタチンを同時にトランスフェクトした細胞のコロニー形成の減少と関係していた。
【0122】
実施例13
トランスフェクトされた細胞内でハースタチンを同時に発現させると、(1)EGF受容体のレベルが低下し、トランスフェクション後のEGFを媒介とした細胞の生存率の上昇が抑制され、(2)EGFを媒介としたEGF受容体のダウンレギュレーションが抑制され、(3)チロシンリン酸化の測定によって明らかになるEGF受容体の活性化が抑制された。
【0123】
グループIの受容体チロシンキナーゼとしては、p185HER−2(erbB−2)の他に、EGF受容体(HER−1、erbB−1)、HER−3(erbB−3)、HER−4(erbB−4)が挙げられる。内在性EGF受容体を含まないCHO細胞内でハースタチンがEGF受容体に及ぼす効果を調べ、グループIの他の受容体に影響が及ぶかどうかを明らかにした。
【0124】
方法。EGF受容体の活性化の測定。CHO細胞を6ウエルのプレートに2×105細胞/ウエルの割合で植え、24時間後、2組用意した一方のウエルには、0.5μgのFGPマーカー・プラスミド+1.5μgのEGF受容体発現プラスミド+所定量のハースタチン発現ベクターをトランスフェクトした。もう一方のウエルには、0.5μgのFGPマーカー・プラスミド+所定量のハースタチン発現ベクターをトランスフェクトしたが、EGF受容体発現プラスミドはトランスフェクトしなかった。24時間後、細胞をPBSで2回洗浄し、無血清培地の中でさらに24時間にわたって培養した。培養物を100ng/mlのEGFの存在下または不在下で20分間にわたって培養し、次に、図15の場合と同様にして修飾RIPAの中に抽出した。各ウエルからのタンパク質約20μgを7%ポリアクリルアミド−SDS−ゲルを用いて分離し、まず最初に、1μg/mlの抗ホスホチロシン抗体を用いてウエスタンブロット法で分析した。次にブロットを取り出し、抗EGF受容体抗体で調べた。また、培養物を100ng/mlのEGFの存在下または不在下で24時間にわたって培養し、細胞抽出液をウエスタンブロット法で分析し、抗EGF受容体抗体による検出を行なった。
【0125】
EGF受容体とハースタチンがコロニーの増殖に及ぼす効果の測定。CHO細胞を6ウエルのプレートに植え、3組のウエルを用意し、1.5μgのEGF受容体発現プラスミド、1.5μgのEGF受容体発現プラスミド+1.5μgのハースタチン発現プラスミド、1.5μgのハースタチン発現プラスミドのいずれかをトランスフェクトした。各ウエルのDNAの合計量を3μgにするため、エンプティ・ベクターを添加した。DNAを添加してから48時間後、各ウエルの細胞をトリプシン処理して回収し、1:10の割合に希釈し、600μg/mlのG418を含む培地の中にある6ウエルのプレートに入れた。培地は2日ごとに交換した。14日目にプレートをクリスタルバイオレットで染色した。染色された培養物からの色素をすでに説明したようにして抽出し、415nMにおける吸光度をもとにして定量した。3つのウエルの平均値は、対照をトランスフェクトしたウエルに対する百分率で表示し、この平均値と標準偏差をプロットした。3回の独立した実験において同様の結果が得られた。
【0126】
ハースタチンとp185HER−2とp175EGF受容体の間に安定な複合体が形成されたことの測定。Sプロテイン・アガロースの50%懸濁液(ノヴァジェン社)約100μlを、ペプチドなしの場合、TBpex14ペプチド(OHSUのB. Ulman博士から提供された)50μgを添加した場合、イントロン8によってコードされているペプチド50μgを添加した場合、完全長組み換えハースタチン50μgを添加した場合について、室温で1時間にわたって培養した。各ペプチドは、pET30発現プラスミド(ノヴァジェン社)によってコードされているSプロテイン・タグを含んでいた。次に、アガロース・サンプルをPBSで2回洗浄し、1%のノニデット−p40(PBSNP−40)を含むPBSに溶かした100μgのA431細胞抽出液(EGF受容体用)または17−3−1抽出液(p185HER−2用)とともに、室温にて1時間にわたって培養した。アガロース・サンプルは、この細胞抽出液とともに培養した後、500μlのPBS−NP40で2回洗浄し、樹脂に付着したタンパク質を92℃で2分間にわたって40μlのSDS−サンプル緩衝液の中に溶離した。元のペプチドと同じ量がアガロースと複合体を形成していることを確認するため、SDS−サンプル緩衝液の中に抽出したアリコートを、SDS−PAGEとクーマシー染色により分析した(TBpex14と、イントロン8によってコードされているペプチドについては17%ポリアクリルアミド・ゲルを、p50ハースタチンについては10%ポリアクリルアミド・ゲルを用いた)。受容体の結合状態を分析するため、アガロースから溶離したアリコートを、抗EGFRまたは抗p185HER−2を用いてウエスタンブロットとして分析した。
【0127】
(1)〜(3)ハースタチンの異所発現により、トランスフェクトされたCHO細胞内のp175EGF受容体のレベルが低下し、トランスフェクション後のEGFを媒介とした生存率の上昇が抑制された。p185HER−2受容体についてすでに説明したように、図16は、導入するハースタチン発現プラスミドの量をEGF受容体発現プラスミドの2倍にすると、リガンドEGFが存在するかどうかには関係なくEGF受容体のレベルが低下することを示している。GFPマーカーの発現もそれに伴って低下した。ハースタチン発現プラスミドの量をEGF受容体発現プラスミドの3分の1にすると、p175EGF受容体の量は、EGF受容体だけをトランスフェクトした細胞におけるのと同じ程度になった(図16のレーン2、レーン3をレーン6、レーン7と比較のこと)。
【0128】
ハースタチンの発現により、p175EGF受容体のダウンレギュレーションが抑制され、チロシンリン酸化の測定によって明らかになるp175EGF受容体の活性化が抑制された。ハースタチンがEGFによるp175EGF受容体の活性化に及ぼす効果を調べた。図17のレーン2とレーン3に示したように、EGFはp175EGF受容体のチロシンリン酸化を誘起し、80kDaと55kDaのタンパク質に付随するホスホチロシン・シグナルを増大させた。ハースタチンの存在下では、飽和量のEGFを添加した後にp175EGF受容体のチロシンリン酸化が増加することは検出できず、80kDaと55kDaのタンパク質のチロシンリン酸化が増加することも検出できなかった(図17、レーン6とレーン7)。
【0129】
EGFに関して知られている別の効果は、EGF受容体のダウンレギュレーションである。図18は、EGFで処理した48時間後にp175EGF受容体のレベルが予想通り大きく低下したことを示している(レーン2とレーン3)。しかしハースタチンを導入した場合には、レーン4とレーン5に示したように、EGF受容体のダウンレギュレーションが少なくなった。
【0130】
ハースタチンは、EGF受容体を過剰発現している細胞の増殖を抑制した。ハースタチンをEGF受容体と組み合わせたときにコロニー形成に及ぼす効果を調べた。図11の場合と同様にして、CHO細胞にトランスフェクションを行ない、G418を用いて選択を実施した。p175EGF受容体だけを過剰発現させた場合、対照(図11に示したエンプティ・ベクターをトランスフェクトした細胞)と比べて細胞生存率が40%増加した。ハースタチンだけをトランスフェクトしたCHO細胞では、対照をトランスフェクトした細胞と比べると生存率が約20%増加した。これは、図11に示したハースタチンの効果と比べて有意に異なってはいなかった。
【0131】
ハースタチンとEGF受容体を同時に発現させると、EGF受容体だけの場合よりも生存率が低下した。p185HER−2についてすでに明らかにしたように、この抑制は、ハースタチンを媒介としてEGFによるp175EGF受容体の活性化が妨げられることと関係していた。そのことが図16、図17、図18からわかる。
【0132】
ハースタチンは、p185HER−2とEGF受容体の両方と安定な複合体を形成した。
【0133】
本発明によると、完全長ハースタチンと、そのイントロン8によってコードされているC末端領域(組み換えペプチドとして発現)の両方が、nMオーダーのアフィニティでp185HER−2と結合する。さらに実験を行ない、すでに説明したハースタチン/p185HER−2の結合相互作用に加え、ハースタチンとp175EGF受容体の間に結合相互作用が存在しているかどうかを(ハースタチンがEGFによるEGF受容体の活性化を妨げる能力に基づいて)明らかにした。
【0134】
ハースタチンは、p185HER−2とEGF受容体の両方と安定な複合体を形成した。ハースタチン/EGF受容体の相互作用を、“不活性”アッセイで調べた。用いたのは、イントロン8によってコードされていてハースタチンのC末端と一致するポリペプチドを精製したもの、完全長組み換えハースタチン・タンパク質、無関係の配列を有する対照ペプチドであり、これらすべてをSプロテイン・アガロース(ノヴァジェン社)に固定化した。次に、これらタンパク質のうちの1つを用いて誘導体化したアガロースをA431細胞の抽出液とともに培養し、洗浄し、ウエスタンブロット法で分析し、p175EGF受容体に対して特異的な抗体を用いて検出した。
【0135】
図20に示したデータから、p175EGF受容体は、対照である無関係のペプチドが存在しているかどうかには関係なく、イントロン8によってコードされているポリペプチドおよびハースタチンと特異的に結合するが、Sタンパク質アガロースとは結合しないことがわかる。比較のため、p185HER−2を安定にトランスフェクトした17−3−1細胞の抽出液もプルダウンアッセイで調べた。以前にニッケル・アフィニティ樹脂を用いた場合に見られたように(Doherty他、1999年)、p185HER−2は、イントロン8によってコードされているポリペプチドおよびハースタチンと結合するが、無関係なペプチドとは結合しなかった。これらの結果は、p175EGF受容体とp185HER−2の両方が、ハースタチンならびにイントロン8によってコードされているハースタチンのC末端領域との間で安定な複合体を形成することを示している。
【0136】
要するに、p175EGF受容体とp185HER−2の両方が、ハースタチンと複合体を形成した。ハースタチンの発現により、p185HER−2を過剰発現している細胞のコロニー形成が強く抑制された。さらに、ハースタチンはEGF受容体のレベルを低下させ、EGF受容体の過剰発現によって起こる細胞の生存率増加を抑制した。細胞生存率の低下は、p185HER−2のチロシンリン酸化が減少したことと、EGFを媒介としたEGF受容体の活性化が妨害されたことに関係していた。したがって、ハースタチンの負の調節活性は、受容体チロシンキナーゼのグループIファミリーの第2のメンバーであるEGF受容体にも当てはまった。
【0137】
実施例14
ハースタチンは、活性化Aktを媒介としたEGF生存シグナルを阻止した
【0138】
Aktと呼ばれるタンパク質キナーゼは、細胞の生存にとってカギとなる調節分子である。Aktの活性化が、細胞の生存にとっての必要十分条件である。活性化したAktを刺激すると、不適切な細胞が生き延びたり、細胞の正常な死が妨げられたりする。ある種のヒトのガンではこのようなことが起こっていることが見いだされている。HER−2とEGF受容体の両方とも、Akt生存シグナルを活性化させる。現在の理論によると、そのことによってガンが成長すると考えられている(Blume−JensenとHunter、Nature、第411巻、355〜365ページ、2001年;Datta他、Genes and Development、第13巻、2905〜2907ページ、2000年;YardenとSlikowski、Nature Reviews、Molecular Cell Biology、第2巻、127〜137ページ)。
方法。EGFR3T3細胞における活性化したホスホakt(活性化したAKT)の測定。活性化したAKT(ホスホ−akt)の測定を、標準的なウエスタンブロット法を利用し、市販されている抗ホスホakt抗体(サンタ・クルス社)を用いて行なった。細胞に対するトランスフェクションは、この明細書ですでに説明したのと同様にして行なった。
【0139】
結果。EGF受容体(EGFR3T3)を過剰発現している細胞にハースタチンをトランスフェクトして対照細胞とし、その対照細胞をさらにEGF(DMEM中に100ng/ml)または賦形剤(対照)で処理し、さまざまな時間にわたって培養し、ハースタチンがEGFの生存に及ぼす効果を調べた(図21)。活性化したAktを調べるため、細胞抽出液を、活性化した形態のAkt(ホスホakt)に対して特異的な抗体(サンタ・クルス社から入手可能)と反応させた。
【0140】
EGF受容体をEGFで刺激した20分後、活性化したホスホaktが非常に増大した(上図)。重要なことだが、ハースタチンの存在下では活性化したAktのシグナルが消えた。Aktタンパク質の全体的レベルは、対照レーンからわかるように一定であった(図21の下図)。
【0141】
したがって、本発明によれば、低下した細胞生存率は、(上記の実施例に示したように)p185HER−2のチロシンリン酸化が減少したことと、EGFを媒介としたEGF受容体の活性化が妨害されたことに関係しているだけでなく、EGF受容体を媒介とした細胞の生存シグナルの阻止にも関係していた。この結果は、Aktを媒介とした細胞生存シグナルがEGFから発生するのをハースタチンが阻止していることを示している。
【0142】
実施例15
ハースタチンは、トランスフォーミング増殖因子α(TGFα)を媒介としたEGF受容体の活性化、生存シグナル、増殖シグナルを阻止した
【0143】
HERファミリーの受容体を活性化させるあらゆる増殖因子のうちで、TGFαはヒトのガンと最も関係が深い。肺ガン、卵巣ガン、大腸ガン、前立腺ガンにおけるTGFαの発現は、好ましくない結果と関係している。TGFαが発現すると、腫瘍が自身のEGF受容体を連続的に刺激し続けるという自己分泌メカニズムによってガンがより攻撃的になる可能性があると考えられている(YardenとSlikowski、Nature Reviews、Molecular Cell Biology、第2巻、127〜137ページ)。そこで、EGF受容体の活性化とチロシンリン酸化にとって重要なステップと、Aktの活性化からわかる生存シグナルを調べ、TGFαによるEGF受容体の活性化にハースタチンが及ぼす効果を評価した(図22)。
【0144】
さらに、DNA合成を促進すると、TGFαを媒介としたEGF受容体の活性化シグナルが発生する。要するに、TGFαを媒介としたDNA合成の促進にハースタチンが及ぼす効果を、ハースタチンが増殖に及ぼす効果の1つの指標として調べた。
【0145】
方法。EGF受容体のチロシンリン酸化、活性化したAkt生存シグナル、TGFαを媒介とした細胞増殖シグナルの測定。EGFR3T3細胞において、EGF受容体のチロシンリン酸化の測定と活性化したAkt生存シグナル(すなわちホスホakt)の測定を上記のようにして行なった。
【0146】
TGFαを媒介とした細胞増殖シグナルの測定では、トリチウム化したチミジンが細胞DNAにどれくらいの量組み込まれたかを対照値に対する百分率(“規格化したCPM”)として測定するという標準的な方法を利用した。
【0147】
結果。図22は、EGFR3T3細胞において、ハースタチンの存在下で、TGFαを媒介としたEGF受容体の活性化が抑制され(上図)、TGFαを媒介としたAkt生存シグナルが強く抑制された(下図)ことを示している。重要なことだが、過剰量のTGFαは、ハースタチンが受容体の活性化と生存シグナルを阻止する能力を打ち消すことはなかった。これは、腫瘍細胞から大量に自己分泌されるTGFαがハースタチンの効果を妨げないことを示唆している。
【0148】
さらに、図23は、ハースタチンがTGFαを媒介とした細胞増殖シグナルを阻止したことを示している。ハースタチンを発現する細胞、すなわち対照細胞をさまざまな濃度のTGFαで処理し、トリチウム化したチミジンがどれくらいの量組み込まれたかを対照値に対する百分率(“規格化したCPM”)として測定することにより、DNAの合成状態を調べた。TGFαによるDNAの合成促進は、ハースタチンの発現によって阻止された(図23)。
【0149】
要するに、TGFαを媒介とした細胞増殖に関するシグナルは、ハースタチンの発現によって阻止された。
【0150】
実施例16
組み換えハースタチンは、HER−2を過剰発現しているヒトのガン細胞を特異的に抑制した
【0151】
本発明よれば、ハースタチンを用いてガン(中でも乳ガン、卵巣ガン、肺ガン、大腸ガン、グリア細胞ガン、前立腺ガン)を治療することができる。HER−2を過剰発現しているヒトのガン細胞を精製した組み換えハースタチンが特異的に抑制する能力を、卵巣ガン細胞系と乳ガン細胞系の両方で評価した。
【0152】
方法。精製した組み換えハースタチンの産生。組み換えハースタチンを、インヴィトロジェン社の標準的な昆虫発現系を用い、昆虫のS2細胞内でヒスチジン・タグ付きのタンパク質として産生させた。この組み換えタンパク質を無血清培地に分泌させた。この組み換えタンパク質は、1リットルにつき約10mg存在していた。ハースタチン・タンパク質をニッケル・アフィニティ・クロマトグラフィとコンカナバリンAアフィニティ・クロマトグラフィにより精製した。タンパク質を染色することにより、精製したタンパク質が90%を超える純度であるかどうかを判定した。
【0153】
ハースタチンを用いたガン細胞系の処理。ガン細胞系をプレートに植えるとき(すなわち2日目と4日目)、精製した組み換えハースタチンを添加した(濃度240nM)。細胞の増殖および/または生存を、従来技術で知られているMTT生存細胞アッセイによって定量した(Hansen他、Immunol. Methods、第119巻、201〜210ページ、1989年)。
【0154】
結果。図24は、HER−2を過剰発現している卵巣ガン細胞系(SKOV−3)と乳ガン細胞系(SKBR−3)の増殖および/または生存が、ハースタチンで処理していない細胞(左側の2本の棒)と比べて約60%抑制されたことを示している。これとは対照的に、HER−2を低レベルでしか発現していない乳房の正常な細胞系(HBL−100)とMCF−7乳ガン細胞系は、精製した組み換えハースタチンによって有意に抑制されることはなかった(右側の2本の棒)。
【0155】
要するに、ハースタチンを媒介とした増殖抑制の程度は、HER−2の発現レベルを反映していた。ハースタチンによる抑制は、正常細胞と比べると、あるいはHER−2の発現が低レベルか正常レベルである形質転換した細胞と比べると、HER−2を過剰発現しているガン細胞に対して特異性を示した。
【0156】
図25は、SKOV−3ガン細胞の増殖および/または生存(600nMにおける吸光度)は抑制される(左側の3本の棒)が、正常なHBL−100細胞は抑制されず(右側の3本の棒)、しかも抑制が精製した組み換えハースタチンの投与量に依存していることを示している。
【0157】
実施例17
薬理動態
精製した組み換えハースタチンの薬理動態特性を調べるため、ハースタチンを腹腔内に注射して分析した。生物活性のあるハースタチンは、注射したマウスの血液に効果的に吸収されたが、タンパク質分解酵素によって分解されることはなく、1〜3時間にわたって血液中に存在していた。
【0158】
方法。ハースタチンを用いたヌード・マウスの治療。ヌード・マウスの腹腔に、30mg/kg(一匹につき約600μg)の組み換えハースタチン、または対照となる賦形剤を注射した。7日の間にこの量を2回注射したが、毒性の徴候は見られなかった。
【0159】
ヌード・マウスの血清に含まれるハースタチンの分析。ハースタチンを注射してからさまざまな時間が経過した時点でマウスを殺し、凝固した血液から血清を回収した。緩衝液を用いて血清(全部で約2mlあるうちの)20μlを1mlに希釈し、ヒスチジン・タグを付けたハースタチンをアフィニティ・クロマトグラフィによって単離した。サンプルの分析を、非還元条件下でハースタチンに対するモノクローナル抗体(アップステイト・バイオロジカル社)を用いて、あるいは、還元条件下でクリントン・ラブ社が製造したハースタチンに対するウサギのポリクローナル抗体(Doherty他、PNAS、1999年)を用いて、ウエスタンブロット法により行なった。
【0160】
結果。図26は、腹腔内注射したヌード・マウスの血液に含まれる組み換えハースタチンの分析結果を示している。上図が非還元条件下、下図が還元条件下の結果である。ハースタチンを注射してから図示した時間が経過したとき、マウスを殺して凝固した血液から血清を回収した。そしてヒスチジン・タグを付けたハースタチンをアフィニティ・クロマトグラフィによって単離し、分析した。上図のサンプルは、非還元条件下でハースタチンに対するモノクローナル抗体(アップステイト・バイオロジカル社)を用いてウエスタンブロット法により分析した。下図では、サンプルの分析を、還元条件下でクリントン・ラブ社が製造したハースタチンに対するウサギのポリクローナル抗体(Doherty他、PNAS、1999年)を用いてウエスタンブロット法により行なった。
【0161】
ハースタチンの存在は、注射してから30分後と1時間後には検出できたが、注射してから3時間後と18時間後には検出できなかった(図26、上図;非還元条件)。非還元条件下で約55〜60kDaの位置に移動したハースタチンの単一の種が存在していることから、モノマーでジスルフィドにはなっていない架橋した(凝集した)タンパク質が存在していることがわかる。別の研究により、このモノマー・タンパク質が生物活性を有する形態であることがわかった。
【0162】
図26の下図は、還元条件下で、ハースタチンの多数のエピトープと反応するポリクローナル抗体を用い、血清に含まれるハースタチンを分析した結果を示している。これは、検出されたタンパク質がハースタチンであることの強力な証拠となっている。重要なことだが、ハースタチンは、血液中でタンパク質分解酵素によって分解されることはない。その証拠に、どのウエスタンブロットにも、ハースタチンよりも小さな産物は検出されなかった。マウスの血清に含まれるハースタチンの量に関する半定量的分析(既知量のハースタチンからのウエスタンブロット・シグナルとの比較により決定される)により、腹腔内注射したタンパク質の約10〜20%が吸収され、血液中に1〜3時間にわたって存在していることがわかった。モノマーの形態をしたハースタチンは注射した全ハースタチン・サンプルの約20%であるという事実に基づくと、モノマーの形態が90%も吸収されるのに対し、凝集したタンパク質のほとんどは吸収されないというのが最も起こっていそうなことである。
【0163】
要するに、生物活性のあるモノマー形態の組み換えハースタチンは、注射したマウスの血液に効果的に吸収され、血液中でタンパク質分解酵素によって分解されることはなく、血液中に1〜3時間存在してから除去される。
【図面の簡単な説明】
【図1】
HER−2の細胞外領域に挿入されたヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示している。HER−2のECDをコードしているエキソン1〜9からの配列(プライマーAとB)は、SKOV−3細胞からのcDNAライブラリーからPCRによって増幅した。サザンブロット分析により、約1420bpの産物がHER−2に対して特異的であることがわかった。この産物をサブクローニングし、ヌクレオチド配列を決定した。Aの部分には、ヌクレオチド配列が、274bpの挿入体として(ボックスの外)、またその挿入体に直接隣接した5’部位の配列および3’部位の配列を含めた配列として(ボックス内)示されている。この挿入体は、Coussens他のナンバリングを用いると(Science、第230巻、1132〜1139ページ、1985年)、p185HER−2のヌクレオチド残基1171と1172の間で、アミノ酸残基340の後ろに位置している。矢印で示した共通する5’スプライス部位および3’スプライス部位の拡大図が示してある。挿入された配列は、5’HER−2エキソン配列とインフレームであり、アルギニン340(R340)に続く79個のアミノ酸延長部をコードしていることが推定される。この挿入体によってコードされる新規な79個のアミノ酸配列はプロリン・リッチ(19%)であり、アスパラギンが結合する共通グリコシル化部位を有する。その部分に下線を引いてある。終止コドンが、挿入された配列のヌクレオチド236〜238の位置に見つかった。Bの部分には、新たな転写産物が、p185と一致するサブドメインIとIIを含む分泌タンパク質断片であり、膜貫通領域と細胞質領域を欠いていることを示してある。完全にグリコシル化された場合に予想されるサイズは65〜70kDaである。このポリペプチド産物は、p68HER−2と呼ばれる。したがってこの産物は、p185HER−2に見られる膜貫通領域と細胞質領域が欠けた分泌タンパク質断片であろう。
【図2】
ECD IIIaを含む新たなHER−2転写産物をノーザンブロット分析で検出した結果を示す。さまざまなヒト胎児組織(クロンテック社)またはHEK−293細胞からのポリA+mRNA(2.5μg)をホルマリン・アガロース・ゲルで分離し、10×SSC中のブライトスター(登録商標)膜(アンビオン社)に移した。この膜を、ECD III配列と相補的な32P標識アンチセンスRNAプローブとハイブリダイズさせ、分離させ、5’HER−2エキソン配列に対して特異的な32P標識cDNAプローブで再度調べた。膜を非常に厳しい条件下で洗浄し、リン光画像装置(モレキュラー・ダイナミックス社)で分析した。
【図3】
抗ECD IIIaが、ヒト胚性腎臓細胞系(HEK293)の約68kDaのタンパク質に対して配列特異的な反応をすることを示している。細胞抽出タンパク質(20μg)と、HEK293細胞によって調整した20μlの培地とに対してウエスタンブロット分析を行ない、1:10,000に希釈した抗ECD IIIa(レーン1と2)、またはヒスチジン・タグを有する50μg/mlの精製ECD IIIaペプチドを含む、1:10,000に希釈した抗ECD IIa(レーン3と4)をプローブにして調べた。
【図4】
HER−2遺伝子が増幅されたガン細胞系ではp68ECD IIIaの発現と比べてp185HER−2の発現が顕著に増大していることを示している。ヒト胚性腎臓細胞系(HEK293)からの細胞抽出液(タンパク質15μg)、非発ガン性卵巣表面上皮細胞系(IOSEVAN)、HER−2遺伝子が増幅している卵巣ガン細胞系(SKOV−3)、非発ガン性乳房上皮細胞系(HBL100)、HER−2遺伝子が増幅している乳ガン細胞系(BT474とSKBR−3)を7.5%のアクリルアミド・ゲル中でSDS−PAGEによって分離させ、ウエスタンブロット法で分析した。このウエスタンブロット法では、プローブとして、p68HER−2に対して特異的な抗体(抗ECD IIIa)と、p185HER−2に対して特異的な抗体(抗neu(C))の両方を用いた。
【図5】
p68ECD IIIaがp185HER−2に結合している様子を示す。Aの部分では、非変性性緩衝液中に抽出した2mgのSKBR−3細胞を、p68HER−2とp185HER−2のN末端配列に対して特異的な5μlの抗neu(N)とともに、またはp185HER−2のC末端に対して特異的な5μlの抗neu(C)とともに免疫沈降させ、p68HER−2に対して特異的な抗ECD IIIaと、p185HER−2に対して特異的な抗neu(C)の両方を用い、ウエスタンブロット分析を行なった。Bの部分では、100μgの17−3−1細胞抽出液を2組用意し、充填容積が50μlのNiNTAアガロース樹脂(キアジェン社)とともに200μlの洗浄用緩衝液(20mMのトリス pH8.0、300mMのNaCl)中で室温にて振盪しながら1時間にわたって培養した。アガロース樹脂に対し、一方の培養物ではヒスチジン・タグを有する20μgのECD IIIaを結合させ、他方の培養物ではヒスチジン・タグを有する20μgのCREB断片を結合させた。次にこの樹脂を500μlの洗浄用緩衝液で4回洗浄し、50μlのSDS−サンプル緩衝液とともに100℃で2分間培養することにより、タンパク質を溶離させた。溶離したタンパク質は、p185HER−2のC末端に対して特異的な抗体、すなわち抗neu(C)を用いてウエスタンブロット法で分析した。Cの部分では、3T3細胞、またはHER−2をトランスフェクトした17−3−1細胞約105個からなる単層を12ウエルのプレートに入れたものをPBSで2回洗浄し、次に、1%のBSAと、ヒスチジン・タグを有する精製した39、75、150、300nMの組み換えECD IIIaとを含む無血清培地0.5mlとともに4℃で2時間にわたって培養した。細胞を、1%のBSAを含むPBSの中で1回洗浄し、PBSの中で2回洗浄し、変性用緩衝液中に抽出した。等量の複数のアリコート(タンパク質20μg)を、ECD IIIaに対して特異的な抗体(抗ECD IIIa)、またはp185HER−2に対して特異的な抗体(抗neu(C))を用いて(上の列)ウエスタンブロット法で分析した。
【図6】
p68リッチにした培地も、ECD IIIaペプチドも、p185HER−2のチロシンリン酸化を促進できないことを示している。HER−2をトランスフェクトした約105個の17−3−1細胞からなる単層培養物をPBSで2回洗浄し、無血清培地中で37℃にて24時間培養し、ヒスチジン・タグを有する75μMまたは150μMのECD IIIa、または高レベルのp68を分泌するHEK−293細胞からの50×CM、またはp68HER−2が検出できないSKOV−3細胞からの50×CMを用いて10分間処理した。処理した細胞は、ホスホチロシンホスファターゼを阻害するバナジウム塩(2mM)を含む変性用緩衝液で抽出し、各サンプルからの細胞抽出タンパク質20μg/mlを、ホスホチロシンに対するモノクローナル抗体(シグマ社)を用いてウエスタンブロット法で分析した。62.5mMのトリスpH6.7と、2%のSDSと、100mMの2−メルカプトエタノールの中で55℃にて30分間にわたって培養することによりブロットを取り出し、p185HER−2に対して特異的な抗neu(C)をプローブとしてこのブロットを再度調べた。
【図7】
p68HER−2が、基質とは独立な発ガン性細胞の成長を抑制したことを示している。SCOV−3卵巣ガン細胞と、HER−2をトランスフェクトした17−3−1細胞を、0.3%の寒天を含む10%のウシ胎仔血清を加えた培地(対照条件)中に分散させ、この培地に、SCOV−3細胞によって調整した50×濃縮培地(検出可能なレベルのp68HER−2を含まない(−p68CM))、またはHEK−293細胞によって調整した50×濃縮培地(20nMのp68HER−2を含む(+p68CM))を添加した。12ウエルのプレートに0.5%のアガロースを含む0.5mlの培地を入れて層になるようにし、その上に5×103個の細胞を加えたものをそれぞれの実験条件ごとに全部で3組用意した。図示した結果は、3組用意したウエル中の50個を超える細胞からなるコロニーの数を培養開始後21日目のときに数えた平均値と標準偏差をプロットしたものである。同様の結果が3つの別々の実験でも観察された。
【図8】
HER−2のイントロン8についてのヌクレオチド配列と、推定されるアミノ酸配列を示している。ヒトのゲノムDNAに対し、イントロン8に隣接するプライマーを用いてPCRを行なった。PCRのパラメータは、94℃にて1分間、62℃にて1分間、72℃にて30秒間を30サイクルの後、72℃にて7分間を1サイクルであった。410bpの産物をゲルで精製し、順方向と逆方向にシークエンシングした。図示した配列は、別々の約15人からのイントロン8で見つかった最も一般的な配列である。配列が変異してアミノ酸の置換が起こる可能性のある箇所をXで示してある。
【図9】
トランスフェクトされたCos−7細胞において、ハースタチンとp185HER−2の両方を発現させた様子を示している。材料と方法の項に記載したように、Cos−7細胞は、6ウエルのプレートに2×105細胞/ウエルの割合で植え、リポフェクタミン(バイオラド社)を用いてこのCos−7細胞にトランスフェクションを行なった。この細胞には、1.5μgのハースタチン発現ベクター+1.5μgのHER−2発現ベクター、または1.5μgのHER−2発現ベクター(すべてインヴィトロジェン社からのpcDNA3.1)をトランスフェクトした。それぞれの場合において、対照用エンプティ・ベクターを用い、DNAの合計量が3μgになるようにした。図9は、トランスフェクトされた細胞を48時間後の時点でウエスタンブロットとして分析した結果である。上方の図は、トランスフェクトされた細胞をp185HER−2に対する抗体である抗neu(C)と反応させた場合、下方の図は、ハースタチンのイントロン8によってコードされているC末端配列に対する抗体(抗Hst)と反応させた場合である。図10では、3組のサンプルに対し、CMVプロモータによって制御されるガラクトシダーゼ発現プラスミド0.5μgを含む上記のプラスミドを用いてトランスフェクションを行なった。48時間後、細胞を抽出し、バイオラド・タンパク質染色キットで細胞タンパク質を定量し、β−ガラクトシダーゼの活性を測定した。その方法については後述する。β−ガラクトシダーゼの活性は、タンパク質の量で規格化し、平均と標準偏差をプロットした。β−ガラクトシダーゼの活性を各ウエルに最初に植えた細胞の数で規格化したときにも同様の結果が得られた。
【図10】
図9と同。
【図11】
トランスフェクトされた細胞コロニーの増殖にハースタチンが及ぼす効果を示している。CHO細胞を6ウエルのプレートに2×105細胞/ウエルの割合で植え、3組用意したウエルに、材料と方法の項に記載したようにして、3μgの対照用エンプティ・ベクター(pcDNA3.1;インヴィトロジェン社);1.5μgのp185HER−2発現プラスミド+1.5μgの対照DNA;1.5μgのp185HER−2+1.5μgのハースタチン;1.5μgのハースタチン+1.5μgの対照DNAをそれぞれトランスフェクトした。DNAを添加してから48時間後、細胞をトリプシン処理し、0.6mg/mlのG418の存在下で1:10の割合に希釈して6ウエルのプレートに入れた。培地は2日ごとに交換した。14日目にプレートをクリスタルバイオレットで染色した後、洗浄した。上図では、50%エタノールに入れた1mlの0.1Mリン酸ナトリウム(pH4.5)を用いて室温にて30分間にわたって振盪することにより、クリスタルバイオレットで染色したプレートを抽出した。抽出したクリスタルバイオレットは、10倍に希釈し、515nMにおける吸光度をもとにして定量した。10倍の希釈により読みが0.1から1になった。この値は、予備研究で決定した吸光度と細胞数の直線関係の範囲に入っていた。
【図12】
図11と同。
【図13】
ハースタチンの発現により、トランスフェクトされた細胞内でp185HER−2のチロシンリン酸化が抑制されることを示している。Cos−7細胞を6ウエルのプレートに植え、図9と図10の場合と同様にしてトランスフェクトした。図13では、2組用意したウエル中の細胞に、0.25、0.5、1.0、3μgの蛍光グリーン・タンパク質(FGP)発現プラスミドをトランスフェクトした。エンプティ・ベクターを添加し、各ウエル内のDNAの合計量が3μgになるようにした。48時間後、蛍光プレート読み取り装置を用い、発光波長と励起波長における蛍光信号を定量した。図14と図15では、細胞に0.5μgのFGPプラスミド+1.5μgのHER−2プラスミド+所定量のハースタチン発現プラスミドをトランスフェクトしたものと、細胞に0.5μgのFGPプラスミド+所定量のハースタチン発現プラスミドをトランスフェクトし、HER−2プラスミドはトランスフェクトしないものを用意した。エンプティ・ベクターを添加し、各ウエル内のDNAの合計量が5μgになるようにした。48時間後、細胞をPBSを用いて2回洗浄し、1mMのフッ化フェニルメチルスルホニルと2mMのオルトバナジン酸塩を含む100μlの修飾RIPAの中に抽出した。透明な抽出液中のタンパク質の濃度をバイオラド・タンパク質染色キットを用いて測定した。抽出したタンパク質20μgを7.5%ポリアクリルアミドSDSゲルを用いて分離し、まず最初に、1μg/mlの抗ホスホチロシン抗体(抗PTyr)(図15)を用いてウエスタンブロット法で分析した(材料と方法)。次に、ブロットを取り出し、p185HER−2に対する抗体(抗neu(C);図14)と反応させた。化学ルミネセンス試薬(ピアス社)を用いてブロットを現像し、コダック社のフィルムに曝露した。
【図14】
図13と同。
【図15】
図13と同。
【図16】
ハースタチンの発現により、トランスフェクトされた細胞内でEGFによるEGF受容体の活性化が抑制されることを示している。CHO細胞を6−ウエル・プレートに2×105細胞/ウエルの割合で植え、24時間後、2通り用意した一方のウエルに、0.5μgのFGPマーカー・プラスミド+1.5μgのEGF受容体発現プラスミド+所定量のハースタチン発現プラスミドをトランスフェクトした。もう一方のウエルには、0.5μgのFGPマーカー・プラスミド+所定量のハースタチン発現プラスミドをトランスフェクトしたが、EGF受容体発現プラスミドはトランスフェクトしなかった。24時間後、細胞をPBSを用いて2回洗浄し、無血清培地の中でさらに24時間培養した。図16と図17では、培養物を100ng/mlのEGFの存在下または不在下で20分間にわたって培養し、次に、図13〜図15の場合と同様にして修飾RIPAの中に抽出した。各ウエルからのタンパク質20μgを7%ポリアクリルアミドSDSゲルを用いて分離し、まず最初に、1μg/mlの抗ホスホチロシン抗体(図17)を用いてウエスタンブロット法で分析した。次にブロットを取り出し、抗EGF受容体抗体をプローブとして用いて調べた(図18)。図18では、培養物を100ng/mlのEGFの存在下または不在下で24時間にわたって培養した。次に、抗EGF受容体抗体を用い、細胞抽出液をウエスタンブロットとして分析した。
【図17】
図16と同。
【図18】
図16と同。
【図19】
EGF受容体単独の場合と、EGF受容体とハースタチンを組み合わせた場合に、コロニーの増殖にどのような影響があるかを示している。CHO細胞を6ウエルのプレートに植え、3組用意したウエルに、1.5μgのエンプティ・ベクター;1.5μgのEGF受容体発現プラスミド;1.5μgのEGF受容体発現プラスミド+1.5μgのハースタチン発現プラスミド;1.5μgのハースタチン発現プラスミドをそれぞれトランスフェクトした。エンプティ・ベクターを添加し、各ウエル内のDNAの合計量が3μgになるようにした。DNAを添加してから48時間後、各ウエルの細胞をトリプシン処理して回収し、1:10の割合に希釈し、600μg/mlのG418を含む培地の中にある6ウエルのプレートに入れた。培地は2日ごとに交換した。14日目にプレートをクリスタルバイオレットで染色した。染色した培養物からの色素を図11の場合と同様にして抽出し、415nMにおける吸光度をもとにして定量した。3つのウエルの平均値は、対照をトランスフェクトしたウエルに対する百分率で表示し、この平均値と標準偏差をプロットした。3回の独立した実験において同様の結果が得られた。
【図20】
イントロン8によってコードされているペプチド、すなわちハースタチンを固定化したものが、EGF受容体とp185HER−2を“プルダウンする”ことを示している。Sプロテイン・アガロースの50%懸濁液(ノヴァジェン社)約100μlを、ペプチドなしの場合、TBpex14ペプチド(OHSUのB. Ullman博士から提供された)50μgを添加した場合、イントロン8によってコードされているペプチド50μgを添加した場合、完全長組み換えハースタチン50μgを添加した場合について、室温で1時間にわたって培養した。各ペプチドは、pET30発現プラスミド(ノヴァジェン社)によってコードされているSプロテイン・タグを含んでいた。次に、アガロース・サンプルをPBSで2回洗浄し、1%のノニデット−p40(PBSNP−40)を含むPBSに溶かした100μgのA431細胞抽出液(EGF受容体用)または17−3−1抽出液(p185HER−2用)とともに、室温にて1時間にわたって培養した。アガロース・サンプルは、この細胞抽出液とともに培養した後、500μlのPBS−NP40で2回洗浄し、樹脂に付着したタンパク質を92℃で2分間にわたって40μlのSDS−サンプル緩衝液の中に溶離した。元のペプチドと同じ量がアガロースと複合体を形成していることを確認するため、SDS−サンプル緩衝液の中に抽出したアリコートを、SDS−PAGEとクーマシー染色により分析した。そのとき、TBpex14と、イントロン8によってコードされているペプチドについては17%ポリアクリルアミド・ゲルを、p50ハースタチンについては10%ポリアクリルアミド・ゲルを用いた。受容体の結合状態を分析するため、アガロースから溶離したアリコートを、抗EGFRまたは抗p185HER−2を用いてウエスタンブロットとして分析した。
【図21】
本発明により、活性化したホスホ−aktがEGFによりEGF受容体を媒介として刺激されるのをハースタチンが抑制することを示している。上図は、EGF受容体をEGFで刺激した20分後に、活性化したホスホaktが非常に増加している様子を示す。ハースタチンの存在下では、活性化したAktシグナルが消えた。下図は対照であり、Aktタンパク質の全体的レベルが一定であることを示している。この結果は、ハースタチンが、EGFから発生する細胞生存シグナルを阻止するのに有効であることを示している。
【図22】
本発明により、TGFαを媒介としたEGF受容体活性化の促進(上図)と、TGFαを媒介としたAkt生存シグナルの増大(下図)の両方がハースタチンによって強く抑制されることを示している。
【図23】
TGFαによるDNA合成の促進がハースタチンの発現によって阻止されたことを示している。ハースタチンを発現する細胞または対照細胞を異なるさまざまな濃度のTGFαで処理し、トリチウム化したチミジンがどれくらいの量組み込まれたかを対照値に対する百分率(“規格化したCPM”)として測定することにより、DNAの合成状態を調べた。
【図24】
HER−2を過剰発現している卵巣ガン細胞系(SKOV−3)と乳ガン細胞系(SKBR−3)の増殖および/または生存が、ハースタチンで処理していない細胞(左側の2本の棒)と比べて約60%抑制されたことを示している。それとは対照的に、HER−2を低レベルで発現している正常な乳房の細胞系(HBL−100)とMCF−7乳ガン細胞系は、精製した組み換えハースタチンによって有意に抑制されることはなかった(右側の2本の棒)。
【図25】
SKOV−3ガン(左側の3本の棒)の増殖および/または生存(600nMにおける吸光度をもとに測定)は精製した組み換えハースタチンの投与量に応じて異なるが、正常なHBL−100細胞(右側の3本の棒)はその投与量とは無関係であることを示している。
【図26】
ヌード・マウスに組み換えハースタチンを腹腔内注射した後に血液中に含まれている組み換えハースタチンの分析結果を示している。上図のサンプルは、非還元条件下で、ハースタチンに対するモノクローナル抗体(アップステイト・バイオロジカルズ社)を用い、ウエスタンブロット法により分析した。下図では、還元条件下で、ハースタチンの多数のエピトープと反応するポリクローナル抗体を用いて分析した(Doherty他、PNAS、1999年)。ハースタチンの存在は、注射してから30分後と1時間後には検出できるが、注射してから3時間後と18時間後には検出できない。重要なことだが、ハースタチンが血液中でタンパク質分解酵素によって分解されることはない。その証拠に、ハースタチンよりも小さな産物は、どのウエスタンブロットにも検出されなかった。
Claims (14)
- EGF受容体の発現を特徴とする固形ガンを治療するためにEGF受容体の細胞外領域と結合する薬剤を投与する操作を含む方法であって、この薬剤を、(a)配列ID番号1の配列に由来する約50〜79個のアミノ酸を含み、EGF受容体の細胞外領域に少なくとも108のアフィニティで結合する単離ポリペプチド、(b)配列ID番号2の配列に由来する約80〜419個のアミノ酸を含み、その中にはC末端側の79個のアミノ酸と、少なくとも3つのN結合型グリコシル部位とが存在している、グリコシル化された単離ポリペプチド、(c)EGF受容体の細胞外領域と結合するモノクローナル抗体、(d)これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択するが、この薬剤がモノクローナル抗体のみからなるものではない、という方法。
- EGF受容体を発現している固形ガンを、扁平上皮細胞ガン、肺ガン、大腸ガン、グリア細胞腫瘍からなるグループの中から選択する、請求項1に記載の方法。
- 上記薬剤が、配列ID番号1の配列に由来する約50〜79個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドである、請求項1に記載の方法。
- 上記薬剤が、配列ID番号1の配列に由来する約50〜79個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドと、EGF受容体の細胞外領域に結合するモノクローナル抗体の組み合わせである、請求項1に記載の方法。
- 上記薬剤が、配列ID番号2の配列に由来する約80〜419個のアミノ酸を含み、その中にはC末端側の79個のアミノ酸と、少なくとも3つのN結合型グリコシル部位とが存在している、グリコシル化された単離ポリペプチドである、請求項1に記載の方法。
- 上記薬剤が、配列ID番号2の配列に由来する約80〜419個のアミノ酸を含み、その中にはC末端側の79個のアミノ酸と、少なくとも3つのN結合型グリコシル部位とが存在している、グリコシル化された単離ポリペプチドと、EGF受容体の細胞外領域に結合するモノクローナル抗体の組み合わせである、請求項1に記載の方法。
- EGF受容体の発現を特徴とする固形ガンを治療するための薬理学的組成物であって、(a)配列ID番号1の配列に由来する約50〜79個のアミノ酸を含み、EGF受容体の細胞外領域に少なくとも108のアフィニティで結合する単離ポリペプチド、(b)配列ID番号2の配列に由来する約80〜419個のアミノ酸を含み、その中にはC末端側の79個のアミノ酸と、少なくとも3つのN結合型グリコシル部位とが存在している、グリコシル化された単離ポリペプチド、(c)EGF受容体の細胞外領域に結合するモノクローナル抗体、(d)これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択した薬剤と、薬理学的に受容可能な基剤とを含むが、この薬剤がモノクローナル抗体のみからなるものではない、という薬理学的組成物。
- 上記薬剤が、配列ID番号1の配列に由来する約50〜79個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドである、請求項7に記載の薬理学的組成物。
- 上記薬剤が、配列ID番号1の配列に由来する約50〜79個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドと、EGF受容体の細胞外領域に結合するモノクローナル抗体の組み合わせである、請求項7に記載の薬理学的組成物。
- 上記薬剤が、配列ID番号2の配列に由来する約80〜419個のアミノ酸を含み、その中にはC末端側の79個のアミノ酸と、少なくとも3つのN結合型グリコシル部位とが存在している、グリコシル化された単離ポリペプチドである、請求項7に記載の薬理学的組成物。
- 上記薬剤が、配列ID番号2の配列に由来する約80〜419個のアミノ酸を含み、その中にはC末端側の79個のアミノ酸と、少なくとも3つのN結合型グリコシル部位とが存在している、グリコシル化された単離ポリペプチドと、EGF受容体の細胞外領域に結合するモノクローナル抗体の組み合わせである、請求項7に記載の薬理学的組成物。
- EGF受容体の発現を特徴とする固形ガン組織に治療薬をターゲッティングさせる方法であって、この治療薬を、配列ID番号1の配列に由来する約50〜79個のアミノ酸を含み、EGF受容体の細胞外領域に少なくとも108のアフィニティで結合する単離ポリペプチドに付着させる操作を含む方法。
- 上記単離ポリペプチドが、配列ID番号1の配列に由来する約69〜79個のアミノ酸である、固形ガン組織に治療薬をターゲッティングさせる請求項12に記載の方法。
- EGF受容体を発現している腫瘍を有する患者の腫瘍治療の予後予測を行なう方法であって、(a)患者の血液、血清、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、胎盤組織、臍帯組織、羊水、絨毛膜絨毛組織、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択した体液サンプルを取得し、(b)ELISA、免疫沈降法、免疫組織化学法、ウエスタンブロット分析法からなるグループの中から選択して抗p68HER−2抗体をベースとしたアッセイを行なうことにより、発現しているp68HER−2の量を測定し、(c)EGF受容体の細胞外領域が体液中にどれだけの量含まれているかを測定し、(d)p68HER−2の量とEGF受容体の細胞外領域の量の比を明らかにすることにより、EGF受容体の細胞外領域の量よりもp68HER−2の量が多いほど患者の予後がよいと判定する操作を含む方法。
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