JP2009543071A - ドミナントネガティブリガンド薬物発見システム - Google Patents

Abstract

本発明は、調節異常となった細胞シグナル伝達カスケードの改変および／または調節に有用なポリペプチド系リガンドの新規な設計および最適化方法に関する。本明細書の方法によって設計される治療用ドミナントネガティブリガンド(DNL)およびDNLバリアントは、医学、診断および薬物発見において有用な適用を有する。

Description

（関連出願）
本願は2006年7月6日に出願された米国特許仮出願第60/818,736号の利益を主張する。上記出願の全教示は参照によって本明細書に援用される。

（政府支援）
本発明は全体的または部分的に国立衛生研究所の助成金番号2R44CA095930-04によって支援された。政府は本発明の特定の権利を有する。

（発明の分野）
本発明は、薬物発見の分野に関する。具体的に、本発明は、ユーザーが受容体媒介性経路、特に癌等の過剰増殖状態に関わる経路の調節に有効な治療用ドミナントネガティブリガンドおよびそのバリアントを同定できる生化学ツールおよびアッセイを提供する。

（略語）
DNL、ドミナントネガティブリガンド；DBO、ドメイン結合最適化；HER、ヒト上皮受容体；IR、インシュリン受容体；IGF、インシュリン様成長因子；IFN、インターフェロン；hGH、ヒト成長ホルモン；VEGF、血管内皮成長因子；NGF、神経成長因子；TNF、腫瘍壊死因子；GPCR、G-タンパク質共役型受容体。

（発明の背景）
ポリペプチドリガンドとその同種受容体との間の相互作用は細胞および生体のホメオスタシスの維持、発生、および腫瘍発生を含む様々な生物学的プロセスに重要である。これらのリガンドとリセプター相互作用によって作り出される細胞シグナル伝達ネットワークは、一部の経路から次のものにシグナルを送る細胞外、細胞内および細胞間シグナルの大部分を中継するために重要である。一部の経路の調節はシグナル伝達経路により中継され得、他の経路メンバーの活性の調節および細胞または生体のシグナルに対する表現型および応答に影響をおよぼすこと等のかかるシグナル伝達の調節結果となる。疾患および障害は、調節異常のシグナル伝達経路を伴う場合があり、しばしば伴うものである。治療剤の目標はシグナル伝達経路のより正常な調節を回復するためにかかる調節異常な経路を標的とすることである。多くのリガンドは複数の独立した経路を活性化し得、種々の経路の活性化の強度が他のリガンドまたは受容体によって生じたシグナルの存在または非存在によって調節され得る。細胞シグナル伝達に関わるポリペプチドの合成および発現の現在の方法は、治療特性を有する最適化リガンドまたは受容体を設計する新しい方法の発見、調査および立証のための背景を提供する。これらの最適化分子は次に遺伝子治療を含む薬物発見および医薬の領域で探求され得る。

（発明の概要）
従って、とりわけ、治療剤ならびにリガンド治療剤を設計および同定する方法として、使用のための新規リガンドおよびリガンドバリアントを提供することが本明細書での目的である。

本発明の1つの局面は、治療用ドミナントネガティブリガンド(DNL)およびそのバリアントの設計方法であって、薬にできる(druggable)リガンドを選択する工程を含み、薬にできるリガンドの公知または予測構造が2つ以上の受容体結合表面を提示するかまたは含む方法に関する。薬にできるリガンドが選択され、任意に最適化されると、ドメイン結合最適化(DBO)は、薬にできるリガンドの第一標的受容体ドメインへの結合を阻害するために薬にできるリガンドの第一受容体結合表面の１つ以上の特徴(feature)に対して１つ以上の修飾を行う工程、および薬にできるリガンドの第二標的受容体ドメインへの結合を促進するために薬にできるリガンドの第二受容体結合表面の1つ以上の特徴に対して1つ以上の修飾を行う工程を含む方法によって、薬にできるリガンドに対して行われる。本発明の薬にできるリガンドは、公知の受容体リガンド、または薬にできるリガンドとして機能するように設計されたポリペプチド配列のいずれかから選択される。

薬にできるリガンドは、ドメイン結合最適化を受けると、次に1つ以上の細胞株で生物学的活性を阻害する能力についてアッセイされ、該生物学的活性は受容体媒介性の病状、受容体媒介性細胞シグナル伝達、細胞成長、細胞増殖および腫瘍成長からなる群より選択される。本発明の一態様において、阻害された生物学的活性は受容体媒介性細胞シグナル伝達である。受容体媒介性細胞シグナル伝達のこの阻害は、受容体による下流シグナル伝達の除去となり得、この効果は1つ以上のタンパク質の変化したリン酸化状態を測定することで決定され得る。

本発明の一態様において、受容体媒介性細胞シグナル伝達の阻害は自動リン酸化アッセイまたは遺伝子発現アッセイを用いて測定される。

本発明の一態様において、生物学的活性の阻害は、2つ以上の受容体に対してパノラマ式(panoramic)。さらに、生物学的活性のパノラマ式阻害のレベルまたは程度は、該2つ以上の受容体に対して同じであり得るか、または実質的に同じである。

本発明の一態様において、阻害される生物学的活性は受容体媒介性の病状である。受容体媒介性の病状は、癌、炎症、心臓血管病、脂肪過剰血症、グルコース調節異常、癲癇、アレルギー、慢性痛、アルツハイマー病、メタボリックシンドロ−ム、コルチゾール耐性、クローン病およびハンチントン病からなる群より選択され得る。

本発明の一態様において、１つ以上の細胞株は癌細胞株を含む。癌細胞株としては、限定されないが、肺、乳房、肝臓、心臓、骨、血液、結腸、脳、皮膚、腎臓、膵臓、卵巣、子宮および前立腺の癌が挙げられる。MCF-7は乳癌細胞株を表す。

一局面において、該方法は、治療用ドミナントネガティブリガンドとして生物学的活性を阻害することができる薬にできるリガンドを同定する工程をさらに含む。

本発明の一態様において、薬にできるリガンドの1つ以上の特性を改変するために薬にできるリガンドの1つ以上の特徴に対して修飾を行う工程を含む方法であって、該特性が最適pHまたはpH活性、消化性、抗原性、両親媒性特性、リガンド-受容体相互作用、熱または動力学的安定性、可溶性、フォールディング、翻訳後修飾、疎水性、親水性、等電点、プロテアーゼ耐性、および芳香族性からなる群より選択される方法が提供される。

本発明の一態様は、薬にできるリガンドの第一または第二標的受容体ドメインへの結合の阻害または促進が、標的受容体ドメイン、単離された標的受容体ドメインおよび代表的標的受容体部分を含む天然標的受容体からなる群より選択される1つ以上の分子への薬にできる受容体の結合親和性を測定することで決定される方法である。

本発明の一態様において、前記第一および第二標的受容体ドメインは同じ受容体に位置する。

本発明の一態様において、標的受容体は、HER受容体、インシュリン受容体、IGF受容体、インターフェロン受容体、hGH受容体、VEGF受容体、NGF受容体、TNF受容体、G-タンパク質共役型受容体およびポリペプチドリガンド結合を介して作動、誘発または機能することが公知の任意の他の受容体経路からなる群より選択される。

本発明の一態様において、標的受容体は膜結合しているが、受容体は任意の細胞、または核膜を含む細胞小器官に局在し得ることが理解される。さらに、受容体は、天然で可溶性であり得、ほとんどまたは全く膜アンカーを有さない。

本発明の一態様において、行われる修飾は修飾ポリペプチドライブラリーの作製をもたらす。本発明の一態様において、行われる修飾は修飾ポリペプチドの出発ライブラリーから生じる。修飾ポリペプチドのライブラリーは、ファージライブラリーまたは生じた様式と独立したポリペプチド配列の任意の他の選択もしくはグループを含み得る。

一態様において、リガンドと受容体の結合は、ファージELISAを用いて決定される。多くの結合アッセイが当該技術分野で公知であり、また、これらが本発明によって企図されることが理解される。本発明の方法は、薬にできるリガンドのファージパニング(panning)を繰り返す工程をさらに企図する。この繰り返しは調査される薬にできるリガンドまたはDNLの任意または全ての特性を最適化するために行われ得る。また、繰り返しはドメイン結合が最適化された薬にできるリガンドの集団を増やすために行われ得る。

本発明の一態様において、1つ以上の修飾は、1つ以上の特徴のランダム化、1つ以上の特徴の複製、長さの改変、電荷または芳香族性の改変、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。とりわけ、長さの改変は切断、内部欠失または挿入であり得ることが本発明によって企図される。長さの他の改変は完全長リガンドよりも小さい合成から単純に生じ得る。

本発明の一態様において、1つ以上の特徴は、表面提示、局所構造形状、フォールド、ループ、半ループ、ドメイン、半ドメイン、部位および末端からなる群より選択される。

本発明の一態様において、該方法は、薬にできるリガンドの選択工程、および該選択された薬にできるリガンドに対してDBO中に行われる修飾工程が単独または組み合わせのいずれかで反復して行われる合理的再設計の工程をさらに含み得る。

本発明は、本明細書に開示される方法によって作製される任意の治療用DNLまたはDNLバリアントを包含する。

本発明の一態様は、抗癌剤の同定方法であって、本明細書に記載される方法によって設計される治療用DNLまたはDNLバリアントを腫瘍異種移植片系でアッセイする工程を含み、測定された腫瘍成長速度、腫瘍サイズ、または腫瘍転移の減少が候補癌治療剤として陽性ヒットを表す方法である。

（発明の詳細な説明）
本発明の態様の記載は以下の通りである。

本発明は、調節異常になった細胞シグナル伝達カスケードの改変および／または調節に有用なポリペプチド系リガンドを設計および最適化する新規方法の発見の結果である。従って、本発明は、治療用ドミナントネガティブリガンド(DNL)またはそのバリアントならびにその設計の方法および医薬、診断および創薬における使用を包含する。本発明のDNLは最適化特性および受容体に対するドミナントネガティブ活性を有する。

ドミナントネガティブリガンド(DNL)およびバリアントの設計
本発明の一局面は治療用ドミナントネガティブリガンド(DNL)およびそのバリアントの設計方法を含む。この方法は、薬にできるリガンドを選択する工程、および選択された薬にできるリガンドに対してドメイン結合最適化(DBO)を行う工程を含む。任意に、薬にできるリガンドはDBOの前に最適化を受け得る。薬にできるリガンドがDBOを受けると、次にリガンドはドミナントネガティブリガンドとして生物学的活性についてアッセイされ得る。任意に、DBOの前、DBO間またはDBO中にドミナントネガティブリガンドとして薬にできるリガンドを生物学的活性についてアッセイすることが望ましくあり得る。ドミナントネガティブリガンドとして生物学的活性を阻害することが可能な薬にできるリガンドは、治療用ドミナントネガティブリガンドと同定されるかまたは称される。本発明の方法で同定された治療用DNLは、調節異常の受容体媒介性細胞シグナル伝達から生じるかまたは該シグナル伝達を特徴とする疾患または障害の治療に有用である。

薬にできるリガンドの選択
出発点として、本明細書に開示される設計方法は、薬にできるリガンドの選択で始まる。「薬にできるリガンド」は、本発明の方法のための出発リガンドとして機能し得る任意のリガンドを含む。これらのリガンドは公知の受容体リガンドまたは薬にできるリガンドとして機能するように設計された任意のポリペプチド配列から選択される。例えば、全教示が参照によって本明細書に援用され、2005年6月30日に出願された共係属中出願の米国特許出願番号第11/172,611号で、公知のHERリガンドが調査の出発点として使用される。本発明の選択された薬にできるリガンドの公知または予測構造は、2つ以上の受容体結合表面を提示するか、含むか、または含むように設計される。これらの受容体結合表面は構造特徴または機能特徴のいずれかで同じであり得るが、これらが同じである必要はない。本明細書で使用される場合、用語「同一」は考慮される特性に関して同一であることを意味する。本明細書で使用される場合、用語「類似」は少なくとも1つの方法で類似していることを意味する。同一性または類似性は構造または機能の文脈で使用され得る。

上述で定義された基準を満たす任意のポリペプチド系分子が薬にできるリガンドとみなされる。受容体結合表面は個別および別々の表面、隣接表面であり得るか、または空間または配列中で重複し得る（すなわち、それぞれが表面の構成要素として同一のアミノ酸または共通のアミノ酸を利用し得る）。

「受容体結合表面」は、該用語が本明細書で使用される場合、リガンドと受容体との間での相互作用の部位として機能する本発明の薬にできるリガンドおよびDNL中に見られるモチーフである。受容体結合表面は、特定のアミノ酸配列で定義され得るか、またはタンパク質フォールディングから、例えば、ポリペプチドの全体配列の静電気または熱力学エネルギー最小化により二次元および／または三次元タンパク質構造が生じて非隣接のアミノ酸が近接して表面が作られた場合にもたらされ得る。

薬にできるリガンドまたはDNLリガンドと受容体との間での相互作用の部位として機能する受容体の対応モチーフは、本明細書で「標的受容体ドメイン」と呼ばれる。

本明細書で使用される場合、用語「リガンド」は、本明細書で定義される受容体に特異的に結合できるポリペプチド系分子を示すために使用される。定義は、少なくとも定性的受容体結合能を保持する受容体またはその任意の領域または誘導体に対する任意の天然リガンドを含む。具体的に、この定義から受容体に対する抗体および抗体の非共有結合性コンジュゲートおよび該抗体の抗原が排除される。

用語「天然リガンド」および「野生型リガンド」は、互換的に使用され、天然供給源から精製、化学合成または組み換え生成された、かかるリガンドの成熟、プレプロおよびプロ形態を含む、天然で生じるリガンドのアミノ酸配列（「天然配列リガンド」）のことをいう。受容体を活性化し得る天然リガンドは当該技術分野で周知であるか、または当該技術分野で公知の方法によって調製され得る。

本発明のドミナントネガティブリガンドに関して、用語「ドミナントネガティブ」は、ある型のリガンドが、任意の面で天然または野生型リガンドと異なるように改変または修飾された場合に、野生型結合パートナー(例えば、受容体)に対する結合親和性を保持するが、野生型結合パートナーの機能またはシグナル伝達を阻害するリガンドとなることを説明するために使用される。

本発明はDNLの設計を企図し、それは該用語が前記機能特性に適用されるためであり、また、設計参照点としてDNLを有する「DNLバリアント」を企図する。これらのDNLバリアントは、結合およびシグナル阻害に加えてまたはこれを超えて特性のさらなる最適化の結果物であり得る。例えば、第一DNLに対して最適化されると、次にDNLバリアントは設計スキームでDNLバリアントが次に出発DNLとなるというさらなる最適化の意味のための出発点となり得る。従って、「DNL」は、特定の文脈において、「DNLバリアント」およびその反対のものとして構成され得る。さらに、設計の出発点または参照点として使用される場合、DNLまたはDNLバリアントはまた、薬にできるリガンドと呼ばれ得るかまたはみなされ得る。

本明細書で使用される場合、用語「ドミナントネガティブリガンド活性」とは、ドミナントネガティブリガンドと関連する機能（例えば、通常のリガンド結合部位で受容体と結合するが受容体の機能を阻害する）のことをいう。

本発明の薬にできるリガンドおよびDNLは、ポリペプチド系分子である。これらの分子は「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」であり得る。これらの用語は相対的な大きさを示すことは当該技術分野で公知であるが、本明細書で使用されるこれらの用語は、本明細書で呼ばれ、かつ本発明に包含される様々なポリペプチド系分子の大きさに関して限定されるとみなされるべきではない。従って、本明細書に開示される少なくとも1つのDNLまたはその受容体結合表面を含み、任意の受容体に結合する任意のアミノ酸配列が本発明の範囲内にある。

用語「アミノ酸（１つおよび複数）」は、全て天然L-アルファ-アミノ酸のことをいう。アミノ酸は表1に列挙される1文字または3文字表記のいずれかで同定される。

本発明のDNLのアミノ酸配列は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチドまたはその断片とみなされ得るものなどの天然アミノ酸を含み得る。あるいは、DNLは天然アミノ酸および非天然アミノ酸の両方を含み得る。

用語「アミノ酸配列バリアント」とは、天然配列と比べてアミノ酸配列におけるいくつかの違いを有する分子のことをいう。アミノ酸配列バリアントは天然リガンドのアミノ酸配列内の特定の部位での置換、欠失および／または挿入を有し得る。通常、バリアントは天然リガンドに対して少なくとも約70％の相同性を有し、好ましくはこれらは天然リガンドに対して少なくとも約80％、より好ましくは少なくとも約90％相同である。

アミノ酸配列に適用される「相同性」は、必要である場合に最大割合の相同性を達成するように、配列の整列およびギャップの導入後に天然リガンドのアミノ酸配列の残基と同一である候補アミノ酸配列中の残基割合として定義される。整列のための方法およびコンピュータープログラムは当該技術分野で周知である。相同性は同一性割合の計算に依存するが、計算で導入されたギャップおよびペナルティによる値で異なり得ることが理解される。

「ホモログ」とは、ヒト野生型リガンドまたは受容体に対する実質的な同一性を有する他の種の対応リガンドまたは受容体を意味する。

「アナログ」は、１つ以上のアミノ酸改変、例えば親ポリペプチドのドミナントネガティブ特性をなお維持するアミノ酸残基の置換、付加または欠失で異なるポリペプチドバリアントを含むことを意味する。上記のように、親分子(即ち、比較の参照点)は薬にできるリガンド、DNLまたはDNLバリアントを含み得る。

本明細書で記載される場合、本発明の方法で作製されたDNLおよびDNLバリアント、そのホモログおよびアナログは野生型リガンドに対する実質的な同一性を有し得る。本明細書で使用される場合、「実質的な同一性」は、野生型ヒトリガンドのアミノ酸配列（またはバリアントが交換ドメインで生じたキメラである場合のそのドメイン）に対して、少なくとも60％配列同一性、好ましくは少なくとも70％同一性、好ましくは80％以上の同一性、好ましくは90％配列同一性を意味するが、ドミナントネガティブ活性を維持する。他の態様において、本発明のDNLおよびそのバリアントは野生型ヒトリガンドのアミノ酸配列に対して、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、または少なくとも98％アミノ酸同一性を有するが、ドミナントネガティブリガンド活性を維持する。

2つのアミノ酸配列の同一性割合は、最適比較の目的のための配列（例えば、ギャップは第一配列の配列に導入され得る）を整列することで決定され得る。次に対応する位置のアミノ酸を比較し、2つの配列間の同一性割合は配列に共有される同一位置の数の関数（即ち、％同一性＝同一位置の数／位置の総数×100）である。2つの配列の実際の比較は、周知の方法、例えば、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。かかる数学的アルゴリズムの好ましい非限定例は、Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877(1993)に記載されている。かかるアルゴリズムは、Schaffer et al., Nucleic Acids Res. 29:2994-3005(2001)に記載されるようにBLASTNおよびBLASTXプログラム(バージョン2.2)に組み込まれている。

用語「誘導体」は用語「バリアント」と同義的に使用され、参照分子または出発分子に対して任意の方法で修飾または変化された分子のことをいう。本明細書で使用される場合、誘導体およびバリアントドミナントネガティブリガンドは出発親分子に対して修飾、改変、改善または最適化されたポリペプチド系分子である。

本発明は、数種類のドミナントネガティブリガンドバリアントおよび誘導体を構想する。これらは置換、挿入、欠失および共有結合性のバリアントおよび誘導体を含む。

従って、置換、挿入および／または付加、欠失および共有結合性修飾を含むポリペプチド系分子が本発明の範囲に含まれる。例えば、1つ以上のリジンのような配列タグまたはアミノ酸が本発明のペプチド配列に付加され得る（例えば、N末端またはC末端）。配列タグはペプチド精製または局在化に使用され得る。リジンはペプチド可溶性を高めるためまたはビオチン化を可能にするために使用され得る。あるいは、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ末端およびアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基は、任意に欠失され得、切断配列を提供する。特定のアミノ酸(例えば、C末端またはN末端残基)は代替的に、配列の使用、例えば、可溶性であるか、または固相に結合された大きな配列の一部としての配列の発現に依存して欠失され得る。

「置換バリアント」は天然または出発配列の少なくとも1つのアミノ酸残基が除去され、かつ同じ位置の場所に異なるアミノ酸が挿入されたものである。置換は、分子の１つのアミノ酸だけが置換される場合に1つであり得るか、または2つ以上のアミノ酸が同じ分子で置換される場合に複数であり得る。

本明細書で使用される場合、用語「同類アミノ酸置換」とは、配列に通常存在するアミノ酸と同様な大きさ、電荷または極性の異なるアミノ酸との置換のことをいう。同類置換の例は、イソロイシン、バリンおよびロイシン等の非極性（疎水性）残基の別の非極性残基との置換を含む。同様に、同類置換の例としては、アルギニンとリジンの間、グルタミンとアスパラギンの間およびグリシンとセリンの間のようなある極性（親水性）残基の別のものとの置換が挙げられる。また、リジン、アルギニン、またはヒスチジンのような塩基性残基の別のものとの置換、あるいはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸のようなある酸性残基の別の酸性残基との置換が同類置換のさらなる例である。非同類置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニンのような非極性（疎水性）アミノ酸残基のシステイン、グルタミン、グルタミン酸またはリジンのような極性（親水性）残基との置換、および／または極性残基の非極性残基との置換が挙げられる。

「挿入バリアント」は天然または出発配列の特定の位置でのアミノ酸に直に隣接して挿入された1つ以上のアミノ酸を有するものである。アミノ酸に「直に隣接」はアミノ酸のアルファ-カルボキシまたはアルファ-アミノ官能基のいずれかに結合されることを意味する。

「欠失バリアント」は、天然または出発アミノ酸配列の1つ以上のアミノ酸が除去されたものである。通常、欠失バリアントは分子の特定の領域で1つ以上のアミノ酸が欠失される。

「共有結合性誘導体」は、有機タンパク質性または非タンパク質性誘導体化剤を用いた天然または出発リガンドの修飾、および翻訳後修飾を含む。従来、共有結合性修飾は、リガンドの標的とされるアミノ酸残基と、選択された側鎖または末端残基と反応可能な有機誘導体化剤とを反応させることによって、または選択された組み換え宿主細胞で機能する翻訳後修飾の機構を利用することによって導入される。得られた共有結合性誘導体は生物学的活性、免疫アッセイ、または組み換え糖タンパク質の免疫アフィニティー精製の抗リガンド抗体の作製に重要な残基の同定に指向したプログラムに有用である。かかる修飾は当業者の範囲であり、過度の実験なしで行われる。

特定の翻訳後修飾は発現ポリペプチドに対する組み換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニル残基およびアスパラギニル残基はしばしば、翻訳後に脱アミノ化され、対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基になる。あるいは、これらの残基は温和な酸性条件下で脱アミノ化される。いずれかの形態のこれらの残基は本発明に従って使用されるリガンドに存在し得る。

他の翻訳後修飾としては、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、ヒドロキシル基のセリル残基またはトレオニル残基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のアルファ-アミノ基のメチル化が挙げられる(T.E. Creighton, Proteins:Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86(1983))。

具体的に、共有結合性誘導体としては本発明のリガンドが非タンパク質性ポリマーに共有結合する融合分子が挙げられる。非タンパク質性ポリマーは通常、親水性合成ポリマー、即ち、他の場合で天然では見られないポリマーである。しかし、天然に存在し、組み換えまたはインビトロ法で生成されるポリマーは、天然から単離されるポリマーと同じように有用である。例えば、ポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンの親水性ポリビニルポリマーは本発明の範囲に入る。ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールのようなポリビニルアルキレンエーテルが特に有用である。リガンドは、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,719,192号または第4,179,337号に示される方法で、様々な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンに結合され得る。

本発明の一態様において、結合はポリエチレングリコール(PEG)修飾を用いて除去される。例えば、結合に重要な受容体結合表面に位置するリジンはPEG化され、その表面の結合特性を減衰または除去し得る。任意のアミノ酸が結合を除去するような方法で修飾され得ることは本発明の範囲にあることが企図される。また、PEG化を使用して半減期などの特性を改善することおよび免疫原性を低減することも本発明の範囲である。

また、翻訳後バリアントはグリコシル化バリアントを含む。用語「グリコシル化バリアント」は天然または出発リガンドのものとは異なるグリコシル化プロフィールを有するリガンドのことをいうために使用される。天然または出発リガンドの対応物と比べてドミナントネガティブリガンドに存在する炭水化物部分の位置および／または性質の任意の違いは本明細書の範囲内である。

天然または出発リガンドのグリコシル化パターンはHPAEクロマトグラフィー(Hardy, M. R. et al., Anal. Biochem. 170, 54-62(1988))、グリコシル結合組成を決定するメチル化解析(Lindberg, B., Meth. Enzymol. 28.178-195(1972);Waeghe, T.J. et al., Carbohydr. Res. 123, 281-304(1983))、NMR分光測定、質量分析等を含む、分析化学で周知の技術によって決定され得る。簡易で、天然または出発リガンドのグリコシル化パターンの変化は通常、本質的にアミノ酸配列バリアントに関して当該技術分野で公知の技術を用いて、DNAレベルで行われる。

また、リガンドに存在する炭水化物部分は、化学的または酵素的に除去され得る。また、グリコシドの本発明のリガンドへの化学結合または酵素結合が、炭水化物置換基の数またはプロフィールを修飾または増大するために使用され得る。これらの方法はWO 87/05330(1987年9月11日公開)およびAplinおよびWriston, CRC Crit. Rev, Biochem., pp.259-306に記載されている。

また、本明細書でリガンドのグリコシル化バリアントは適切な宿主細胞の正常プロセスなどのインビボ法で探求することによってもたらされ得る。例えば、酵母は、哺乳動物系のものとは有意に変化するグリコシル化をもたらす。同様に、リガンドの供給源以外の異なる種（例えば、ハムスター、ネズミ、昆虫、ブタ、ウシまたはウマ）または組織（例えば、肺、肝臓、リンパ球、間質または上皮）起源を有する哺乳動物細胞が、バリアントグリコシル化を生じる能力について慣例的にスクリーニングされる。

本発明の薬にできるリガンド、DNL、およびDNLバリアントのアミノ酸配列は、化学合成、ファージディスプレイ、タンパク質またはポリペプチドの断片への切断のような様々な手段、または選択された特性を有するような十分な長さのアミノ酸配列が作製され得るまたは得られ得る任意の手段によって得られ得る。

一態様において、本発明のDNLバリアントは、適切な宿主での関連DNLバリアントをコードする遺伝子の発現によって生じる。かかる遺伝子は、当該技術分野で周知の技術である、野生型遺伝子の部位特異的突然変異誘発法で最も容易に作製される。

従って、また、本発明は、本発明のDNLまたはDNLバリアントをコードする核酸分子を提供する。本発明の核酸分子は、RNA、例えば、mRNAであり得るかまたはDNAであり得る。DNA分子は二本鎖または一本鎖であり得る。また、核酸分子は、マーカー配列、例えば、ポリペプチドの単離または精製を補助するようなポリペプチドをコードする配列に融合され得る。かかる配列としては、限定されないが、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質をコードするもの、インフルエンザ由来のヘマグルチニン(HA)ポリペプチドマーカーをコードするもの、およびHisタグをコードする配列が挙げられる。

発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択および所望されるDNLの発現レベルのような因子に依存し得ることが当業者に理解される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され、本明細書に記載される核酸分子によってコードされる融合ポリペプチドを含む、本発明の修飾ポリペプチドを生じ得る。本発明の修飾ポリペプチドの組み換え生成を行うための分子生物学的技術は当該技術分野で周知であり、例えば、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab Press;第3版, 2000)に記載されている。

あるいは、本発明のDNLバリアントは、Merrifield型合成(J.Am.Chem.Soc. 85:2149(1963)等による化学合成技術によって全体的または部分的に生成され得るが、当該技術分野で公知の他の等価の化学合成が使用され得る。固相合成は保護アルファ-アミノ酸の適切な樹脂への結合によってペプチドのC末端で出発される。アミノ酸はペプチド結合の形成について当該技術分野で周知の技術を用いてペプチド鎖と結合される。本発明のDNLの全てまたは一部の化学合成はDNLバリアントの非天然アミノ酸置換の使用の場合に特に望ましくあり得る。

修飾および操作
本発明の方法によって有効な治療用ドミナントネガティブリガンドを設計するために、選択された薬にできるリガンドを最適化することが必要である。この最適化はドメイン結合最適化の前またはその後に選択された薬にできるリガンドへの修飾を含み得る。最適化のプロセスは、DNLの多くの特性のそれぞれを最適化するために数回の修飾を要して、反復的であり得るか、または連続的な様式で段階的に生じ得る。修飾は、分子の1つ以上の特性を改善または改変するために単独または組み合わせて作製され得る。

本発明の一態様において、薬にできるリガンドの1つ以上の特性を改変するために薬にできるリガンドの1つ以上の特徴に対して修飾を行う工程を含む方法であって、該特性が最適pHまたはpH活性、消化性、抗原性、半減期、生物学的利用可能性、両親媒性特性、リガンド-受容体相互作用、熱的または動力学的安定性、可溶性、フォールディング、翻訳後修飾、疎水性、親水性、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される方法が提供される。列挙された特性が治療、診断および研究ツールの開発における考慮を提示することおよび分子の他の特性も特定の用途に依存して考慮および最適化される必要があり得ることが当業者に理解される。本明細書で使用される場合、用語「最適化されたまたは最適化」は、分子の1つ以上の特徴が出発分子と比べて特定の目的について改善されるような分子の修飾または改変のことをいう。「修飾」は、修飾される物が形態または特徴で変化する修飾の結果である。修飾を介して最適化される本発明の分子としては、薬にできるリガンド、DNLおよびそのバリアントが挙げられる。本発明の目的で、これらの分子は治療、診断または研究試薬の作製の目的で最適化される。

本発明の修飾は、本明細書で薬にできるリガンド、DNLまたはDNLバリアントの1つ以上の特徴に対して行われる。「特徴」は分子の異なるアミノ酸配列系構成要素として定義される。本発明の薬にできるリガンド、DNLおよびDNLバリアントの特徴としては、表面提示、局所構造形状、フォールド、ループ、半ループ、ドメイン、半ドメイン、部位、末端またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

本明細書で使用される場合、用語「表面提示(manifestation)」は、薬にできるリガンドまたはDNLの最外表面に現れたポリペプチド系構成要素のことをいう。

本明細書で使用される場合、用語「局所構造形状」は、薬にできるリガンドまたはDNLの定義可能な空間内に位置する薬にできるリガンドまたはDNLのポリペプチド系構造提示を意味する。

本明細書で使用される場合、用語「フォールド」は、エネルギー最小時のアミノ酸配列の生じた構造を意味する。フォールドは二次元または三次元レベルのフォールディングプロセスで生じ得る。二次元レベルのフォールドの例としてはβシートおよびαヘリックスが挙げられる。三次元フォールドの例としては、エネルギー力の凝集または分離によって形成されるドメインおよび領域が挙げられる。このように形成された領域としては疎水性および親水性ポケット等が挙げられる。

本明細書で使用される場合、タンパク質構造に関する用語「反転」は、ペプチドまたはポリペプチドの骨格の方向を改変する曲がりを意味し、１つ、2つ、3つ以上のアミノ酸残基が関与し得る。

本明細書で使用される場合、用語「ループ」とは、ペプチドまたはポリペプチドの骨格の方向を逆転し、4つ以上のアミノ酸残基を含むペプチドまたはポリペプチドの構造特徴のことをいう。Olivaらは少なくとも5種類のタンパク質ループを同定した(J.Mol Biol 266(4):814-830;1997)。

本明細書で使用される場合、用語「半ループ」とは、由来するループとして少なくとも半数のアミノ酸残基を有する同定ループの一部のことをいう。ループは必ずしも偶数のアミノ酸残基を含むとは限らない場合があることが理解される。従って、ループが奇数のアミノ酸を含むか、またはこれらを含むと同定される場合において、奇数ループである半ループはループの全数部分または次の全数部分を含む(ループのアミノ酸数/2+/-0.5アミノ酸)。例えば、7アミノ酸ループとして同定されたループは3アミノ酸または4アミノ酸の半ループを生じ得る(7/2=3.5+/-0.5は3または4である)。

本明細書で使用される場合、用語「ドメイン」とは、1つ以上の同定可能な構造または機能の特徴または特性(例えば、タンパク質-タンパク質相互作用の部位として機能する結合能)を有するポリペプチドのモチーフのことをいう。

本明細書で使用される場合、用語「半ドメイン」は、由来するドメインとして少なくとも半数のアミノ酸残基を有する同定ドメインの一部を意味する。ドメインは必ずしも偶数のアミノ酸残基を含むとは限らない場合があることが理解される。従って、ドメインが奇数のアミノ酸を含むか、またはこれらを含むと同定される場合において、奇数ドメインである半ドメインがドメインの全数部分または次の全数部分を含む（ドメインのアミノ酸数/2 +/-0.5アミノ酸）。例えば、7アミノ酸ドメインとして同定されたドメインは、3アミノ酸または4アミノ酸の半ドメインを生じ得る(7/2=3.5+/-0.5は3または4である)。また、サブドメインはドメインまたは半ドメイン内で同定され得、これらのサブドメインはこれらが由来するドメインまたは半ドメインで同定された構造または機能特性の全てより少ない特性を有することが理解される。また、本明細書で任意のドメイン型を含むアミノ酸はポリペプチドの骨格に沿って連続的である必要はないこと（即ち、非隣接アミノ酸は構造的に折りたたまれてドメイン、半ドメインまたはサブドメインを生じ得る）が理解される。

本明細書で使用される場合、用語「部位」は「アミノ酸残基」および「アミノ酸側鎖」と同義で使用される。部位は本発明のポリペプチド系分子内で修飾、操作、改変、誘導化、または変化され得るペプチドまたはポリペプチドの位置を表す。

本明細書で使用される場合、用語「末端（１つまたは複数）」とは、ペプチドまたはポリペプチドの末端のことをいう。かかる末端は、ペプチドまたはポリペプチドの出発部位または最終部位だけに限定されるだけでなく、末端領域のさらなるアミノ酸も含み得る。本発明のポリペプチド系分子は、N末端（遊離アミノ基(NH2)を有するアミノ酸で終了する）およびC末端（遊離カルボキシル基(COOH)を有するアミノ酸で終了する）の両方を有するものとして特徴付けられ得る。薬にできるリガンドは、ある場合において、ジスルフィド結合または非共有結合力によってまとめられた複数のポリペプチド鎖から構成される（多量体、オリゴマー）。これらの種類のリガンドは複数のN末端およびC末端を有する。あるいは、ポリペプチドの末端は、当てはまる場合に、有機コンジュゲートのような非ポリペプチド系部分で始まるまたは終了するように修飾され得る。

任意の特徴が本発明の分子の構成要素として同定または定義されたら、これらの特徴のいくつかの操作および／または修飾のいずれかが、移動、交換、反転、欠失、ランダム化または複製によって行われ得る。さらに、操作の特徴は本発明の分子に対する修飾と同じ結果をもたらし得ることが理解される。例えば、ドメイン欠失を伴う操作は、ちょうど完全長分子未満をコードする核酸の修飾のように分子の長さの改変をもたらす。

修飾および操作は部位特異的突然変異誘発法などの当該技術分野で公知の方法によって達成され得る。次に、得られた修飾分子は、本明細書に記載されるものなどのインビトロアッセイもしくはインビボアッセイまたは当該技術分野で公知の任意の他の適切なスクリーニングアッセイを用いて、活性について試験され得る。

ドメイン結合最適化(DBO)
薬にできるリガンドが選択され、かつ任意に修飾または最適化されると、薬にできるリガンドのドメイン結合最適化(DBO)が行われる。

本明細書で使用される場合、「ドメイン結合最適化」は、薬にできるリガンドの第一標的受容体ドメインへの結合を阻害するために薬にできるリガンドの第一受容体結合表面の1つ以上の特徴に対して上記の1つ以上の修飾または操作を行うこと、および薬にできるリガンドの第二標的受容体ドメインへの結合を増強するために薬にできるリガンドの第二受容体結合表面の1つ以上の特徴に対して1つ以上の修飾を行うことを含む。

上記のように、「標的受容体ドメイン」は薬にできるリガンドまたはDNLリガンドと受容体との間での相互作用の部位として機能する受容体の対応モチーフである。

本明細書で使用される場合、用語「受容体」および「標的受容体」は、互換的に使用され得、下流シグナル伝達の改変に影響を及ぼすリガンド-受容体結合対の一員のことをいう。

本発明の目的のために、受容体は、受容体作用活性が誘導される実際の機構に関わらない受容体活性を有する膜結合性受容体（例えば、細胞表面、核および細胞小器官表面）または可溶性受容体から選択される任意の受容体であり得る。本発明の一態様において、標的受容体は膜結合しているが、かかる膜結合受容体は任意の細胞または核膜を含む細胞小器官に局在し得ることが理解される。さらに、受容体は膜アンカーをほとんどまたは全く有さず天然で可溶性であり得る。

受容体の定義は、a)一価リガンド（1つの受容体結合表面を有するリガンド）、b)多価リガンド（2つ以上の受容体結合表面を有するリガンド）、またはc)リガンドと受容体二量体の相互作用、続いて複合体内構造変化によって通常活性化される細胞表面受容体を含む。

リガンドの受容体結合表面および受容体の標的受容体ドメインは、コンピューター解析（例えば、分子モデリング）、X線試験、変異解析、抗体結合試験、ならびにランダムペプチドライブラリーパニングおよび結合試験を含む、当該技術分野で公知の方法によって決定され得る。変異アプローチとしては、部位特異的突然変異誘発法、拡張(escape)変異体の選択と共役したランダム飽和突然変異誘発法、挿入突然変異誘発法、およびホモログスキャニング突然変異誘発法（対応する受容体と結合するヒトリガンド由来の配列と、ヒト受容体と結合しない別の動物種、例えばマウス由来の対応リガンドの保存されていない配列との置換）の技術が挙げられる。

本発明の一態様において、前記第一および第二標的受容体ドメインは同じ受容体に位置する。しかし、標的受容体ドメインは同じ受容体型の別々の分子または2つの別々の型の受容体分子に位置し得る。さらに、結合アッセイの目的で、受容体全体が使用される必要はなく、必要な結合は標的受容体ドメインを含む分子を用いて評価されるだけである。従って、本発明の一態様は、薬にできるリガンドの前記第一または第二標的受容体ドメインへの結合の阻害または増強が標的受容体ドメイン、単離された標的受容体ドメインおよび代表的な標的受容体部分を含む天然標的受容体からなる群より選択される1つ以上の分子に対する薬にできるリガンドの結合親和性を測定することによって決定される方法である。

本発明の一態様において、標的受容体はHER受容体、インシュリン受容体、IGF受容体、インターフェロン受容体、hGH受容体、VEGF受容体、NGF受容体、TNF受容体、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)、およびリガンド結合を介して操作、誘発または機能することが公知の任意の他の受容体経路からなる群より選択される。

結合研究
ドメイン結合最適化は薬にできるリガンドの結合特性の修飾を含むので、DBO後に得られたリガンドの結合特性を評価するために特定の結合アッセイを行うことが必要である。タンパク質-タンパク質結合およびリガンド-受容体結合を評価するための多くの結合アッセイは当該技術分野で公知であり、当業者の能力の範囲であることが理解される。

本発明によって提供されるDNLは意図する目的のために十分な結合を提供するほど十分な受容体に対する親和性を有するべきである。従って、治療剤としての使用のために、本発明によって提供されるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、標的受容体に対して約1〜1000nMの親和性(Kd)を有するべきである。より好ましくは、親和性は10nMである。最も好ましくは、親和性は1nMである。他のリガンドを同定する競合的結合アッセイの試薬としての使用について、アミノ酸配列は、好ましくは本物のリガンドよりも高いまたはこれと等しい受容体に対する親和性を有する。

本明細書で使用される場合、用語「結合」は、本発明の薬にできるリガンドまたはDNLの受容体結合表面と、標的受容体の標的受容体ドメインの1つ以上のアミノ酸との間での1つ以上のイオン性結合、共有結合、疎水性結合、静電気結合、または水素結合の形成を含む。結合は、DNLがインビトロアッセイで実質的に置き換えられない場合に「強固」とみなされ得る。少なくとも50％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは100％などの少なくとも約90％のDNLが天然リガンドと競合的に攻撃(challenge)する際に受容体または受容体部分に結合したままである場合に、DNLは実質的に置き換えられない。また、結合は、DNLが受容体の天然リガンドを実質的に置き換える場合に強固とみなされ得る。少なくとも50％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは100％などの少なくとも約90％の天然リガンドが受容体から置き換えられる場合に、DNLは天然リガンドを実質的に置き換える。

本発明のDNLまたはDNLバリアントの結合活性または対生物作用活性が任意の他の適切なアッセイまたは他の方法によってさらに評価され得、かかるアッセイの結果または活性が野生型ヒトリガンドおよび受容体の結合または受容体活性を測定するアッセイからの結合または受容体活性と比較される。

本発明の一態様において、結合試験は、本発明の化合物のライブラリーで行われる。また、ライブラリーの作製方法は、本発明の薬にできるリガンド出発分子を作製するために使用され得る。

本発明の一態様において、薬にできるリガンドまたはDNLに行われる修飾は、修飾ポリペプチドのライブラリーの作製をもたらすかまたはこの作製から生じる。修飾ポリペプチドのライブラリーは、ファージライブラリーまたは生じた様式と独立したポリペプチド配列の任意の他の選択もしくはグループを含み得る。

本明細書で使用される場合、用語「ライブラリー」は、分子の集合体を意味する。ライブラリーは少数または多数の異なる分子を含み得、約2〜約10¹⁵分子以上の範囲で変化する。ライブラリーの分子の化学構造は互いに関連し得るかまたは多様であり得る。所望される場合、ライブラリーを構成する分子は、分子の回収および／または同定を助長し得る共通または独自のタグに結合され得る。

ファージパニング
ペプチド、タンパク質、ペプトイドおよびペプチド模倣物などの様々な種類の分子の多様な集団を含むライブラリーの作製方法は当該技術分野で周知であり、様々なライブラリーが市販されている（例えば、EckerおよびCrooke, Biotechnology 13:351-360(1995)、ならびにBlondelle et al., Trends Anal. Chem. 14:83-92(1995）、ならびにそこに引用される文献を参照、それぞれは参照によって本明細書に援用される；また、GoodmanおよびRo, Peptidomimetics for Drug Design, in「Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery」Vol.1(M.E. Wolff編; John Wiley & Sons 1995), 803-861ページ、およびGordon et al., J. Med. Chem. 37:1385-1401(1994)を参照、それぞれは参照によって本明細書に援用される)。分子がペプチド、タンパク質またはその断片である場合、分子はインビトロで直接生成され得るかまたは核酸から発現され得、インビトロで生成され得る。合成ぺプチドおよび核酸化学の方法は、当該技術分野で周知である。

また、分子のライブラリーはDNA、RNAまたはそのアナログであり得る核酸分子のライブラリーであり得る。例えば、cDNAライブラリーは目的の細胞、組織、器官または生物から回収したmRNAから、またはゲノムDNAをランダムに断片化する制限エンドヌクレアーゼもしくは方法を用いて適切な大きさとした断片を生成するために処理され得るゲノムDNAを回収することで構築され得る。また、RNA分子を含むライブラリーは細胞からRNAを回収することまたはRNA分子を化学合成することによって構築され得る。かかるライブラリーを作製する方法は当該技術分野で周知である（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)を参照、これは参照によって本明細書に援用される）。核酸分子の多様なライブラリーは分子のランダム化領域の生成を促進する固相合成を用いて作製され得る。所望される場合、ランダム化は分子のある位置での特定の割合の１つ以上のヌクレオチドを含む核酸分子のライブラリーが作製されるように偏向され得る（1993年12月14日に発行された米国特許第5,270,163号、これは参照によって本明細書に援用される）。

本発明の一態様において、リガンドと受容体の結合はリガンドのライブラリーのファージパニングを用いて決定される。例えば、アッセイはファージ発現によって生じた薬にできるリガンドライブラリーまたはDNLライブラリーのスクリーニングで行われ得る。

非常に大きなタンパク質ライブラリーのスクリーニングはウイルスまたは細胞の表面上でのタンパク質のディスプレイに依存する様々な技術によって達成されている。ディスプレイ技術の基礎となる前提は生物学的粒子（即ち、細胞またはウイルス）の外部表面にアンカーされるように設計されたタンパク質が細胞を溶解する必要がなくリガンドへの結合について直接接近可能であるということである。リガンドに対する親和性を有するタンパク質を提示するウイルスまたは細胞は連続吸着／脱着形態固定化リガンドを含む様々な方法で、磁気分離またはフローサイトメトリーによって単離され得る（Ladner et al. 1993, 米国特許第5,223,409号、Ladner et al.1998, 米国特許第5,837,500号、Georgiou et al.1997, Shusta et al. 1999）。

タンパク質ライブラリースクリーニング適用のために最も広く使用されるディスプレイ技術はファージディスプレイである。ファージディスプレイは、特定のリガンドに結合するタンパク質の発見ならびに結合親和性および特異性の設計のための、十分に確立され、かつ強力な技術である（RodiおよびMalowski, Curr. Opin. Biotechnol., 10:87-93;1999; Wilson and Finlay, Canadian Journal of Microbiology, 44:313-329; 1998）。ファージディスプレイにおいて、目的の遺伝子が表面曝露タンパク質をコードするファージ遺伝子、最も一般的にpIIIにインフレームで融合される。遺伝子融合物は２つのドメインが独立してフォールドするキメラタンパク質に翻訳される。リガンドに対する結合親和性を有するタンパク質を提示するファージは、「パニング」として公知のプロセスである固定化リガンド上での選択的吸着によって容易に豊富にされ得る。結合ファージは通常酸溶出によって表面から脱着され、大腸菌細胞の感染によって増幅される。通常、3〜6回のパニングおよび増幅は、特異的ポリペプチドを提示するファージについて、10¹⁵までの多様性を有する非常に大きなライブラリーから選択するほど十分である。各回のパニングは最も強固な結合リガンドを求めるクローンのプールを豊富にする。各ファージ粒子は提示ペプチドおよびこれをコードするDNAの両方を含むので、選択されたペプチドはDNA配列決定によって容易に同定され得る。強固に結合するポリペプチドを提示するクローンの急速な拡充のためのファージディスプレイのいくつかのバリエーションが開発されている（DuenasおよびBorrebaeck, 1994; Malmborg et al.,1996;Kjaer et al.,1998;Burioni et al., 1998; Levitan, 1998; Mutuberria et al.,1999;Johns et al., 2000）。

本発明のファージパニング法は、ファージ粒子表面上での発現のための本発明のDNLおよびDNLバリアントをコードするオリゴヌクレオチドの導入および標的受容体または受容体部分に対するファージ粒子のパニングを含む。ファージパニングは酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）法のような他の結合アッセイと共に使用され得る。

本発明の方法は、薬にできるリガンドのファージパニングを繰り返す工程をさらに企図する。この繰り返しは調査される薬にできるリガンドまたはDNLの特性のいずれかまたは全てを最適化するために行われ得る。また、これはドメイン結合が最適化された薬にできるリガンドの集団を増大するために行われ得る。

合理的再設計
本発明の一態様において、該方法は合理的再設計の工程をさらに含み、薬にできるリガンドの選択工程および選択された薬にできるリガンドに対してDBO工程で行われる修飾工程が単独または組み合わせで反復して行われる。

DNLのドミナントネガティブ活性
本発明の薬にできるリガンドおよびDNLは、多くの公知の方法、アッセイ、デバイスおよび当該技術分野で周知のキットを用いて1つ以上の細胞株で受容体媒介性対生物活性の阻害についてアッセイされ得る。

本発明の一態様において、該1つ以上の細胞株は癌細胞株を含む。癌細胞株としては、限定されないが、肺、乳房、肝臓、心臓、骨、血液、結腸、脳、皮膚、腎臓、膵臓、卵巣、子宮、および前立腺または本明細書に列挙される癌の組織または腫瘍から単離された任意の細胞が挙げられる。

本発明の一態様は、抗癌剤の同定方法であって、本明細書に記載される方法によって設計される治療用DNLまたはDNLバリアントを腫瘍異種移植片系においてアッセイする工程を含み、測定された腫瘍成長速度、腫瘍サイズまたは腫瘍転移の減少が候補癌治療剤として陽性ヒットを表す方法である。

一態様において、細胞シグナル伝達の調節異常と関連する疾患は腫瘍である。特に、腫瘍は固形の腫瘍および／または血液もしくはリンパ節の癌である。より具体的に、上皮または中胚葉起源であり得る腫瘍は、肺、前立腺、膀胱、腎臓、隔膜、胃、膵臓、脳、卵巣、骨格系などの器官の腫瘍の良性または悪性型であり得、乳房、前立腺、肺および腸の腺癌、骨髄の癌、黒色腫、肝癌、耳-鼻-のど腫瘍が特にいわゆる悪性腫瘍の一員として明白に好ましい。

本発明によれば、血液またはリンパ節の癌型の群は、全ての形態の白血病（例えば、B細胞白血病、混合型細胞白血病、ヌル細胞白血病、T細胞白血病、慢性T細胞白血病、HTLV-II-関連白血病、急性リンパ白血病、慢性リンパ白血病、肥満細胞白血病、および骨髄白血病と共に）およびリンパ腫を含む。

間質悪性腫瘍（いわゆる骨および軟組織の肉腫）の例は、線維芽肉腫、悪性組織球腫、脂肪肉腫、血管肉腫、軟骨肉腫および骨芽肉腫、ユーイング肉腫、平滑横紋筋肉腫、滑膜肉腫、癌肉腫である。

また、新生物形成が本発明の範囲に構想される。新生物形成としては、骨新生物形成、乳房新生物形成、消化系の新生物形成、結腸直腸新生物形成、肝臓新生物形成、すい臓新生物形成、下垂体新生物形成、精巣新生物形成、眼窩新生物形成、中枢神経系の頭部およびのどの新生物形成、聴覚器官、骨盤、呼吸器および尿生殖器の新生物形成が挙げられる。

別の態様において、治療または予防される癌疾患または腫瘍は、鼻内部、鼻腔、鼻咽頭、口唇、口腔、口咽頭、咽頭、下咽頭、耳、唾液腺の腫瘍を含む耳-鼻-のど領域の腫瘍、および傍神経節腫、非小細胞気管支癌、小細胞気管支癌を含む肺の腫瘍、縦隔の腫瘍、食動、胃、膵臓、肝臓、胆嚢、および胆管の腫瘍を含む胃腸管の腫瘍、小腸、結腸および直腸の癌ならびに肛門癌、腎臓、尿管、膀胱、前立腺、尿道、ペニスおよび精巣の腫瘍を含む尿生殖器腫瘍、頸、膣、外陰の腫瘍を含む婦人科腫瘍、子宮癌、悪性栄養膜病、卵巣癌、尿管の腫瘍、腹腔の腫瘍、乳癌、甲状腺、副甲状腺、副腎皮質の腫瘍を含む内分泌器官の腫瘍、内分泌膵臓腫瘍、カルチノイド腫瘍およびカルチノイド症候群、多発性内分泌新形成、骨および軟組織肉腫、中皮腫、皮膚腫瘍、皮膚および眼内黒色腫を含む黒色腫、中枢神経系の腫瘍、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経線維腫症、神経芽細胞腫を含む幼児期の腫瘍、ユーイング肉腫腫瘍ファミリー、横紋筋肉腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、中枢神経系の原発リンパ腫、ホジキン病を含むリンパ腫、急性白血病、慢性骨髄およびリンパ白血病を含む白血病、プラズマ細胞新形成、骨髄形成異常症、傍新生物形成症候群、未知の原発腫瘍を有する転移(CUP黒色腫症候群)、腹腔癌、カポジ肉腫、AIDS関連リンパ腫、中枢神経系のAIDS関連リンパ腫、AIDS関連ホジキン病、およびAIDS関連肛門腫瘍等のAIDS関連悪性物を含む免疫抑制関連悪性物、移植関連悪性物、脳転移、肺転移、肝臓転移、骨転移、胸膜および心膜転移を含む転移した腫瘍、ならびに悪性腹水からなる群より選択される。

本発明によれば、アッセイされる生物学的活性としては、限定されないが、本明細書に記載される任意の疾患または状態などの受容体媒介性の病状、受容体媒介性細胞シグナル伝達、細胞成長、細胞増殖および腫瘍成長が挙げられる。

本明細書で使用される場合、本明細書で定義される用語「受容体媒介性の」は、発症が受容体の機能または活性に関連または由来し得る任意の現象または状態のことをいう。

本発明の一態様において、阻害された生物学的活性は、癌(上記に明示したものすべてを含む)、炎症、心血管疾患、高脂血症、グルコース調節異常、てんかん、アレルギー、慢性の痛み、アルツハイマー病、メタボリックシンドローム、コルチソル抵抗性、クローン病およびハンティングトン病からなる群より選択される受容体媒介性の病状である。

本発明の一態様において、阻害された生物学的活性は受容体媒介性細胞シグナル伝達である。この受容体媒介性細胞シグナル伝達の阻害は、受容体による下流シグナル伝達の除去をもたらし得、この効果は、１つ以上のタンパク質の改変されたリン酸化状態を測定することにより測定され得る。

本発明によれば、受容体媒介性細胞シグナル伝達の阻害は、自己リン酸化アッセイまたは遺伝子発現アッセイを用いて測定され得る。細胞シグナル伝達カスケードの測定および定量方法は、mRNAを測定すること(例えば、RT-PCR)またはタンパク質レベルを測定すること(例えば、ウエスタンブロット解析)のいずれかにより遺伝子発現を測定するための方法として当該技術分野で公知である。

２つ以上の受容体にわたってパノラマ式である(すなわち、多数の受容体に同じ種類の効果を有する)ドミナントネガティブ活性能を有する治療用DNLを設計することは本発明の範囲に含まれる。さらに、パノラマ式生物学的活性の阻害のレベルまたは程度は、前記２つ以上の受容体に対して同じであり得るか、または実質的に同じである。任意の薬にできるリガンドまたはDNLのパノラマ式能力の同定は、単純に、薬にできるリガンドまたはDNLを目的の２つ以上の受容体に対する生物学的活性の阻害についてアッセイすることを含む。

本発明のDNLおよびDNLバリアントは、いくつかの用途を有する。例えば、本発明のDNLバリアントは、患者を治療するために使用され得、ここで、細胞シグナル伝達の調節異常は、疾患(例えば、癌、炎症)の病理過程に関与している。本発明の分子はポリペプチド系分子として投与され得るだけでなく、遺伝子療法の状況において核酸分子としても投与され得る。さらに、これらの分子は、診断適用ならびにさらなる基礎研究に使用され得る。

治療製剤および送達
本発明はまた、本明細書に記載の治療用DNLバリアントを含む医薬組成物に関する。例えば、本発明のDNLバリアントは、薬学的に許容され得る担体または賦形剤とともに製剤化され、医薬組成物が調製され得る。担体および組成物は滅菌されたものであり得る。製剤は、投与様式に適しているべきである。本明細書で使用されるように、用語「薬学的に許容され得る」、「生理学的に許容され得る」およびその文法的語尾変化は、組成物、担体、希釈剤および試薬についていう場合、互換的に使用され、その物質が、吐き気、めまい、胃の不調などの望ましくない生理学的結果を起こすことなくヒトに投与され得ることを表す。

適当な薬学的に許容され得る担体としては、限定されないが、水、塩溶液(例えば、NaCl)、生理食塩水、緩衝生理食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロースまたはデンプンなどの炭水化物、デキストロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど、ならびにその組合せが挙げられる。また、リポソームおよびマイクロエマルジョンなどの担体が使用され得る。また、本発明のDNLバリアントは、ポリペプチドが早期に排出されるのを最小限にするために、アルブミンなどのタンパク質担体、またはポリエチレングリコールなどのポリマーに共有結合され得る。医薬調製物は、所望により、組成物中の活性剤(すなわち、本発明のポリペプチドおよび／または核酸分子)と有害な反応をしない補助剤、例えば、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝剤、着色剤、香料および／または芳香族物質などと混合され得る。

該組成物はまた、所望により、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤を含み得る。該組成物は、液体溶液、懸濁剤、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放製剤、または粉末であり得る。該組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドなどの担体とともに坐剤として製剤化され得る。経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含み得る。

これらの組成物の導入方法としては、限定されないが、経皮、筋肉内、腹腔内、眼内、静脈内、皮下、局所、経口、肺内および鼻腔内が挙げられる。一態様において、局所適用としては、瘢痕、皮膚癌、乾癬、湿疹などの状態を治療するためのものが挙げられる。

また、他の適当な導入方法としては、遺伝子療法(下記)、再充填可能なまたは生分解性のデバイス、粒子加速デバイス (「遺伝子銃」)および低速放出ポリマーデバイスが挙げられ得る。また、本発明の医薬組成物は、他のDNLまたは他の化合物との併用療法の一部として投与され得る。

本発明のDNLバリアントは、ヒトへの投与に適合された医薬組成物として通常の手順に従って製剤化され得る。例えば、静脈内投与のための組成物は、典型的に、滅菌等張水性バッファー溶液である。必要な場合は、該組成物はまた、可溶化剤および注射部位での痛みを和らげるための局所麻酔剤を含み得る。一般に、成分は、別々または単位投薬形態で一緒に混合されて、例えば、活性化合物(ポリペプチドおよび／または核酸)の量を示したアンプルまたはサシェなどの密閉シール容器内で凍結乾燥粉末または無水濃縮物としてのいずれかで供給される。該組成物が注入によって投与される場合、滅菌医薬グレード水、生理食塩水またはデキストロース/水を含む注入ビンに分注され得る。該組成物が注射によって投与される場合、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルは、投与前に成分が混合され得るように提供され得る。

本明細書に記載のDNLバリアントは、中性または塩の形態として製剤化され得る。薬学的に許容され得る塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるものなどの遊離アミノ基とともに形成されるもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されるものなどの遊離カルボキシル基とともに形成されるものが挙げられる。

本発明のDNLバリアントは治療有効量で投与される。特定の障害または状態の治療において治療有効であるDNLバリアントの量は、障害または状態の性質に依存し、標準的な臨床技術によって決定され得る。また、最適投薬量範囲の特定を補助するためにインビトロまたはインビボアッセイが任意に使用され得る。また、製剤に使用される正確な用量は、投与経路、および疾患または状態の症状の重篤度に依存し、担当医師の判断および各患者の状況にしたがって決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から誘導される用量応答曲線から推定され得る。

本発明はまた、細胞シグナル伝達の調節異常を特徴とする状態の治療 (予防、診断および／または治療)方法に関する。「細胞シグナル伝達の調節異常を特徴とする状態」は本発明のDNLバリアントの存在が治療的である状態である。かかる状態としては、多くの型の癌が挙げられる。また、細胞シグナル伝達の調節異常は、種々の他の障害に関与している。

用語「治療」は、本明細書で使用されるように、疾患または状態に関連する症状の改善だけでなく、疾患の発症の予防または遅延および疾患または状態の症状の重症度または頻度の低下のこともいう。１種類より多くの本発明のDNLバリアントが所望により同時療法治療計画として同時に使用され得る。本明細書で使用されるように、「同時療法治療計画」は、２種類の治療様式が、別々もしくは併用製剤のいずれかで同時に投与されるか、または数分、数時間または数日あけて異なる時点で逐次投与されるが所望の治療応答を提供するようになんらかの様式で一緒に作用する治療計画を意味する。また、本発明のDNLバリアントは、調節異常細胞シグナル伝達の種々の異常な活性を抑制する他の治療様式と合わせて使用され得る。かかるさらなる治療様式としては、限定されないが、受容体特異的抗体、小分子受容体インヒビター、従来の化学療法剤、および放射線療法が挙げられる。

本発明の治療用化合物(１つまたは複数)は、治療有効量 (すなわち、疾患または状態に関連する症状を改善すること、疾患または状態の発症を予防または遅延すること、および／または疾患もしくは状態の症状の重症度もしくは頻度を低下させることなどによって疾患または状態を治療するのに充分な量)で投与される。特定の個体の疾患または状態の治療において治療有効である量は、疾患の症状および重症度に依存し、標準的な臨床技術によって決定され得る。また、最適投薬量範囲の特定を補助するためにインビトロまたはインビボアッセイが任意に使用され得る。また、製剤に使用される正確な用量は、投与経路、および疾患または状態の症状の重篤度に依存し、担当医師の判断および各患者の状況にしたがって決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から誘導される用量応答曲線から推定され得る。

本発明のDNLバリアントの治療有効量は、典型的に、生理学的に許容され得る組成物で投与された場合、約0.1マイクログラム(ug)/ミリリットル(ml)〜約100ug/ml、好ましくは約1ug/ml〜約10ug/ml、および通常約5ug/mlの血漿濃度が達成されるのに充分であるようなDNLバリアントの量である。つまり、投薬量は、約0.1mg/kg〜約300mg/kg、好ましくは約0.2mg/kg〜約200mg/kg、最も好ましくは約0.5mg/kg〜約20mg/kgで、１つ以上の用量の投与を毎日、１日または数日で異なり得る。

また、投薬量は、天然リガンド、例えば、EGF血清レベルの範囲(0.1〜1 ng/ml)に基づく、および／またはDNLの親和性に対するものであり得る。この出発点を用いて、本発明の化合物は、これらの測定値の10倍までの用量で投与され得る。例えば、DNL親和性が10nMであり、天然リガンドに対する親和性が1nMである場合、投薬範囲は、約10 ng/mL〜約100 ng/mLであり得る。

また、本発明は、治療有効量の計算が出発リガンド、例えば、EGF (約1nM)に対して行なわれ得ることを想定する。また、本発明の化合物の用量は、Erbitux(登録商標)(10.5mg/kg)またはHerceptin(登録商標)(4mg/kg)などの他の薬物の用量を反映し得ることは理解されよう。

本発明のDNLバリアントまたはポリペプチド(polyeptide)を含む治療用組成物は、単位用量によって投与され得る。用語「単位用量」は、本発明の治療用組成物に関して使用される場合、被験体に対する単位投薬量として適当な物理的に独立した単位をいい、各単位は、必要とされる希釈剤；すなわち、担体またはビヒクルと一緒に所望の治療効果が生じるように計算された所定量の活性物質を含有する。

本発明の治療用化合物は、単独または上記の医薬組成物のいずれかで使用され得る。例えば、それ自体またはベクター内に含まれた本発明のDNLバリアントの遺伝子は、細胞が所望のDNLポリペプチドを産生するように細胞内に導入され得る(インビトロまたはインビボいずれかで)。所望により、本発明の核酸分子でトランスフェクトされた細胞は、疾患に罹患した個体に導入(または再導入)され得る。

遺伝子療法
本発明の治療用DNLバリアントはまた、遺伝子療法の状況で使用され得る。本発明の意味において、「遺伝子療法」は、疾患症状および／またはその原因起源の生物学に基づく選択的阻害または逆転の目的で、天然または組換え操作核酸構築物、単独遺伝子配列または完全遺伝子または染色体セクションまたはコード転写領域、その誘導体/修飾体を使用する治療形態である。

例えば、遺伝子療法は、ウイルスベクターなどの適当なベクターまたは／および脂質もしくはデンドリマーとの複合体形成を用いて実施され得る。遺伝子療法はまた、タンパク質被膜内への封入によって進行され得る。さらに、ポリヌクレオチドは、標的部位への指向された輸送、標的細胞内の取込みおよび／または分布を支持する別の分子と融合または複合体形成され得る。投薬量および投与経路の種類は、臨床要件に従って担当医師によって決定され得る。当業者が精通しているように、投薬量の種類は、患者の体格、体表面、年齢、性別、または一般健康状態などの種々の要素だけでなく、投与される特定の薬剤、投与期間および投与の型ならびに特に併用療法でおそらく並行投与される他の投薬物にも依存する。

また、本発明の治療用DNLバリアントは、キット内に含まれ得る。したがって、本発明はまた、治療用DNLバリアントおよび／または医薬組成物を含むキットに関する。さらに、本発明は、治療用DNLバリアントおよび／または医薬組成物を含むアレイに関する。キットおよびアレイは、細胞シグナル伝達の調節異常に関連する疾患の診断および／または治療に使用され得る。本発明はまた、細胞シグナル伝達の調節異常に関連する疾患の診断、予防、低減、治療、追跡および／または後保護における前記治療用DNLバリアント、前記キット、前記アレイの使用に関する。

実施例
実施例1：方法および試薬
クローニングおよび遺伝子発現. ヒト上皮成長因子遺伝子(EGF)を化学合成し、Pet-9aベクター(Novagen)内のNdeIおよびBamHIクローニング部位にライゲートした。EGF遺伝子は、Omp Aリーダー配列、その後ろにN末端6x-ヒスタグ(下線)および必要であれば後のヒス-タグ除去のための第Xa因子切断部位(太字：IEGR)を含み、以下のアミノ酸配列:

に対応する。

pMLPP1で指定されるこのオリジナルのクローンを、QuickChange変異誘発キット(Stratagene)を用いてすべてのPan HERリガンドバリアント(置換、欠失、挿入およびドメインスワップバリアントを含む)をクローニングするためのベースとして使用した。タンパク質産生のため、EGFプラスミドで大腸菌株BL21 (DE3)pLysS (Novagen)を形質転換した。

リガンドバリアントの作製
単一のコロニーを、15ml LB+ Km25 + Cm30を含む振とうフラスコ培養物に接種した。一晩培養後、培養物の試料をストック用およびEGFバリアント遺伝子挿入物の同定を確認するためのプラスミド調製用に凍結させた。残りの培養物は、Terrific Broth + Km25 + Cm30中での産生培養物の播種に使用した。初期対数期の間、0.2mMのIPTGを用いて細胞を誘導し、培養物を一晩培養した。遠心分離によって培養上清を回収し、一次抗体：1：1000マウス抗ペンタヒス抗体(Qiagenカタログ番号34660)とマウスWestern Breeze Chromogenic Immunodection System (Invitrogenカタログ番号WB7103)を使用し、ドットブロットによって産生を確認した。

EGFタンパク質精製
3mlのNi-NTA樹脂(Qiagen #30230)を用いてPBS pH 8.0で平衡化した5mlカラム(Qiagenカタログ番号34964)に充填した。カラムへの負荷前に1N HCLで培養上清をpH 7.5〜8.0に調整した。PBSおよびPBS+10mMイミダゾールでカラムを洗浄し、EGFPBS + 250mMイミダゾールを用いてバリアントタンパク質をカラムから溶出した。Bradfordタンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度をモニターした。

タンパク質濃縮物およびバッファー交換
カラム溶出液を4℃のPBS中で透析し、１回バッファー交換し、次いで、3000 MWCO Macrosep遠心分離装置(ISC# OD003C41)により濃縮した。最終生成物を、BCA方法を用いてタンパク質濃度について、およびSCIS-PAGEによって純度を試験した。

実施例2：Pan-HERアンタゴニストの設計および確認
薬にできるリガンドの選択およびドメイン結合最適化
天然EGFを、薬にできるリガンドの出発物質として使用し、結合が改善される３つのN末端修飾バリアントを作製した。これらの修飾はHER3への結合を改変し、EGFR (HER1)に対する影響はない。バリアントを表2に示す。

表2の修飾された薬にできるリガンドに対し、次いでEGFRおよびHER3の両方において、ドメインIIIへの結合を排除するさらなる修飾を行なった。これらの修飾リガンドを表3に示す。

実施例3：Pan-HERアンタゴニストを作製およびアッセイするためのファージディスプレイベクターの使用
ライブラリーの構築およびファージパニング
Kunkel手順を用いて２つのライブラリーを構築した。各ライブラリーのランダムなクローンの配列決定を行ない、各核酸バリアントは500〜1000倍で提示され、各アミノ酸配列バリアントは10⁴〜10⁵倍で提示されると計算された。

出発点として、EGF受容体のドメインIへの結合に必須であることが知られた
EGFのBループの残基21〜25または26〜30いずれかにおける改変に加えて、実施例2の修飾アゴニストおよびアンタゴニストまたはその組合せを含むようにライブラリーを構築した。ライブラリーの構成員の選択を表4〜7に示す。

ファージパニングは、SmithおよびPetrenko (Smith，G. P.およびV. A.
Petrenko. 1997. Pharge Display. Chem. Rev. 97:391-410)の教示に従って行なった。簡単には、３つのpan-HERアゴニスト(T1E、WVSおよびBiR)の遺伝子を試験に選択した。ドメイン結合が最適化された薬にできるリガンドをコードするこれらの遺伝子を、HER受容体ドメイン(例えば、R41DおよびL47G)への結合を減少させる変異とともに、M13ファージのpIII外皮タンパク質とのN末端融合体としての発現のためのM13KEファージベクターのKpn IおよびEag I制限部位を用いて５価M13ファージディスプレイ系(New England Biolabs)内にクローニングした。

５つのpIIIコピーはすべて、クローニングされたタンパク質を示すはずである。ファージを作製するため、挿入物を有するベクターでエレクトロコンピテントな(electrocompetent)大腸菌10GF'を形質転換した。形質転換の増殖物を大腸菌の感染に使用し、感染細胞をLB+tet20+xgal+IPTG上にプレーティングした。感染により生じる青色のプラークを増幅させ、プラスミドDNAを配列決定して挿入物の同定の確認をした。ファージは、LB培地中で大腸菌に感染させて増幅し、細胞を遠心分離によって除去した。PEG沈殿によってファージを回収した。これらのファージを使用し、HER受容体依存性細胞増殖の刺激による生物学的活性を測定した。

結合親和性の解析のためのファージELISA
EGFR結合のためのA431細胞またはHER3結合のためのT47D細胞を、組織培養フラスコ内のウシ胎児血清を含有する培地中で単層で培養した。細胞をトリプシン処理し、成長培地で中和し、DPBSで２回洗浄し、氷冷PBS-Glu-T中に再懸濁させた。10₅細胞を96ウェルプレートに移し、種々の濃度のファージの存在下、氷上で1時間インキュベートした。細胞を遠心分離し、PBS-Tで5回洗浄し、次いで、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)でコンジュゲートされた抗M13 pVIII外皮タンパク質抗体とともに1時間室温でインキュベートした。再度、細胞を遠心分離し、PGS-Tで5回洗浄した。TMPの後H₂SO₄によって発色させた。細胞をペレット化し、上清を450nmでの吸光度測定のために光学的に透明なプレートに移した。

理論的推定もまた行なった。結果を表8に示す。「N.D.」は、測定不可を示す。EC50は、細胞増殖の50%刺激に必要なファージの濃度である。結合曲線から、wvs-R41DL47Gリガンドバリアントによってリガンド結合が完全に排除されたことが明白である。

リガンドバリアントを示すファージ粒子をA431全細胞懸濁液中のHER3受容体に対する結合親和性について、Abs450における吸光度を測定することにより評価した。結果を表9に示す。結合曲線から、wvs-R41DL47Gおよびwvs-R41Dリガンドバリアントによってリガンド結合が完全に排除されたことが明白である。

受容体へのファージの結合をファージELISAによって解析した。結果は、高親和性結合剤(WVS)、低親和性結合剤(RL、１つの結合面で除去される)および非結合剤(両方の結合面で除去される)間の識別能力を示す。また、EGFをWVSファージと競合させるために使用し、結合ファージの受容体特異性を確認した。

細胞株
HER5細胞
ヒトEGF受容体を発現するように安定にトランスフェクトされたマウス線維芽細胞株(NR-6株由来)であるHER5細胞株は、Dr. M. C. Hung (MD Anderson Cancer Center)によって提供された。

MCF-7細胞
MCF-7細胞は、American Type Culture Collection (ATCC)から得た。MCF-7のストック培養物を、1%ITS-X (Invitrogen)および10%ウシ胎児血清を添加したイーグルMEMに維持した。

T47-D細胞
ヒト腺管癌細胞をATCCから得た。これらを1.5g/Lの炭酸水素ナトリウム、4.5g/Lのグルコース、10mMのHEPES、および1.0mMのピルビン酸ナトリウムを含むように調整され、0.2単位/mlウシインスリン、90%；ウシ胎児血清、10%が添加された2mMのL-グルタミンを有するRPMI 1640培地に維持した。

実施例4：ファージ融合体の生物学的活性
本明細書において、意外にも、ファージ粒子が結合親和性の測定に使用され得ることだけでなく、本発明のリガンドバリアントを示すこれらの同粒子は生物学的活性を測定するためのアッセイにおいて直接使用され得ることも見出された。

本明細書に記載の細胞増殖アッセイにおいて、リガンドバリアントを示すファージ融合粒子を、EGF依存性細胞株HER5およびヘレグリン(heregulin)依存性細胞株MCF-7の両方での細胞増殖を刺激する能力について評価した。データを表10および11にまとめる。

HER5細胞は、EGFおよびBiRによって刺激され得るがHRGには刺激されず、一方、MCF-7細胞はBiRおよびHRGによって刺激され得るが、EGFには刺激されないことがわかる。また、以前に、単離されたリガンドバリアントを使用して、pan-HERアゴニストT1E、WVSおよびBiRがすべて、EGFR-依存性HER5細胞において細胞増殖を刺激し得るが、弱結合変異体T1ER41Dが活性を大きく減衰したこと、MCF-7がWVSによって最も有効に刺激され、BiRによっては刺激されなかったことが示されている。

ここで、EGFバリアントWVSは、操作マウス線維芽細胞株HER5において細胞増殖を刺激することができただけでなく、hEGF自体よりも有効であったことが示される。WVSおよびT1Eファージは、EGFRおよびHER3の精製タンパク質リガンドよりも有効であることに注意されたい。これは、ファージ融合物の５価状態のためであり、アビディティ効果によって見かけ上の親和性の増加がもたらされる。

この効果は、ディスプレイされたEGFバリアントの機能である。不活性なバリアントまたは挿入物のない対照は、細胞増殖を刺激しない。そして、この効果は、この細胞株または成長因子に限定されない。外皮タンパク質融合物としてディスプレイされたヘレグリン-βのバリアントもまた、HER2/HER3依存性細胞株の成長を刺激する。ここで、ファージ自体においてアンタゴニスト特性についてスクリーニングすること、および確認試験として単離されたタンパク質のみを用いて研究することが可能である。

細胞増殖刺激アッセイ
HER5細胞
加湿5%CO₂雰囲気中、37℃のウォータージャケット付きインキュベータ内で、HER5のストック培養物を、10%ウシ胎児血清、100単位/mlのペニシリンおよび100ug/mlのストレプトマイシンを含有するD-MEM/F12培地に増殖させた。

HER5増殖アッセイでは、細胞を、血清を含有しないDMEM/F12に24時間で変更した。次いで、細胞をトリプシン処理し、1E5細胞/mlで懸濁させた。EGF(PeproTech、Rocky Hill、NJ)の連続希釈物、およびHERリガンドポリペプチドバリアントを、無血清DMEM/F12中で最終濃度の2倍で調製し、96ウェルプレートのウェル内に播種した。50マイクロリットルの細胞懸濁液(5000細胞)を適切なウェルに添加し、所望の濃度で全容量を100ulとした。48時間の増殖期間、プレートをインキュベートした。増殖期間の最後の３時間、10ul/ウェルのWST-1細胞増殖試薬(Roche Applied Sciences，Indianapolis，IN)の添加によって細胞増殖を測定した。WST-1は、生存細胞のミトコンドリアデヒドロゲナーゼによってホルマザン色素に切断されるテトラゾリウム塩である。MRX Revelationソフトウェアとともにマイクロプレートリーダー(Dynex Technologies)を使用し、450nmにおいてホルマザンの量を測定した。

MCF-7細胞
増殖アッセイでは、MCF-7細胞を24時間で無血清培地(SFM)に移し、次いで、トリプシン処理し、1E5細胞/mLでSFM中に懸濁した。50マイクロリットルの細胞懸濁液(5000細胞)を、96ウェルマイクロタイタープレートのウェル毎に播種した。HERリガンドまたは変異体タンパク質の連続希釈物をSFM中で最終濃度の2倍で調製し、50ulをウェルに添加し、所望の濃度で最終容量を100ulとした。加湿5%CO2雰囲気中、37Cで72時間、プレートをインキュベートした。増殖期間の最後の３時間、10ul/ウェルのWST-1細胞増殖試薬(Roche Applied Sciences，Indianapolis，IN)の添加によって細胞増殖を測定した。

本発明者らは、Pan-HERアゴニストT1E、WVSおよびBiRはすべて、EGFR-依存性HER5細胞において細胞増殖を刺激し得るが、弱結合性変異体T1ER41Dは、活性を大きく減衰したことを示した。HER2/HER3依存性細胞株MCF-7は、WVSによって最も有効に刺激され、BiRでは全く刺激されない。したがって、本発明者らは、WVSおよびT1EはPan-HERアゴニストとしての機能を果たし、EGFR、HER3およびHER4に結合してこれらを活性化し得ると結論付ける。

実施例5：選択性を改変するためのドメイン交換
EGFのBループ(残基21〜30)内でドメイン交換を行なった。この交換により、特に、EGF受容体およびHER3受容体のドメインIへのリガンドバリアント結合がさらに向上することが予測された。Bループの前半(アミノ酸残基21〜25)、およびBループの後半(残基26〜30)を、表12のバリアントが生じるように合理的に再設計した。バリアントD4、D4-2およびE8はすべて、WVSバックグラウンドにおいて調製した。

次いで、本明細書に記載のアッセイを使用し、A431細胞(EGFR結合を調べるため)およびT47D細胞(HER3受容体結合を調べるため)の両方においてファージ融合リガンドバリアントを結合について評価し、EC50を計算した。結合データを表13および14に示す。

前半に半ループ修飾 (YRVKT)を有するD4-2リガンドバリアントは、HER3受容体のみに結合することが測定され、したがって、多数のEGF受容体にパノラマ式ではない。その結果、D4-2はHER3特異的アンタゴニストである。

結合曲線およびEC50の計算値は、D4およびE8バリアントが両方の受容体に対して、WVSバリアントのものとWVS-R41DL47Gバリアントのものの中間の結合性を有することを示す。

総合すると、これらのデータは、半ループ修飾によって、改善された結合性を有する(修飾後半ループを有するD4を野生型Bループを有するWVS-R41DL47Gと比較)リガンドが得られ得ることを示す。さらに、D4におけるドメインI結合を改善することが見出された半ループ修飾をBループの残基26〜30から残基21〜25に移動させることによりバリアントD4-2が作製され、１つの受容体について別の受容体よりも結合が選択的に向上され得ることが示される。また、この方法を使用すると、受容体結合は治療リガンドの最適化において滴定可能な性質であり得ることが予想される。

特定の場合では、１つの受容体について別の受容体よりも選択的なリガンドバリアントを設計することが重要なことを理解すると、以下の実施例は、IGF-IR受容体を標的化するが、IRを標的化しない抗癌リガンドを作製するための本明細書に記載の設計方法に拡張される。

実施例5〜10は、IGF-IR/IRシグナル伝達系を使用するDNLおよび抗癌リガンド(ACL)の設計および確認に関する。

実施例6：DNL：IGF-IR選択的リガンドの設計および確認
IGF-Iの産生および解析
大腸菌、Staphylococcus aureusおよび酵母などの種々のクローニング宿主において、IGF-Iの高レベル産生が達成された(他者による)(Forsberg，G.，et al.，(1990)Biochem. J. 271：357-363；Moks，T.，et al.，(1987)Biochemistry. 26:5239-5244)。

IGF-Iは、IGF-I欠損疾患を治療するための臨床試験における使用のための少なくとも2つの会社(TercicaおよびInsmed)によって商業的に製造されている。

本明細書のクローニング試験では、重複オリゴを用いてIGF-I遺伝子を構築し、pET-9aベクター(Novagen)のNdeIおよびBamHIクローニング部位にライゲートした。ペリプラズムへの輸送のためにIGF-I遺伝子をOmpAリーダー配列に融合し、また、第Xa因子切断部位を有するN末端ヒス-タグのための配列を含んだ。得られたクローンは、以下のアミノ酸配列:

に対応する。

得られたプラスミドで大腸菌株BL21 (DE3)pLysS (Novagen)を形質転換し、一次抗体：マウス抗ペンタヒス抗体(Qiagen)とマウスWestern Breeze Chromogenic Immunodection System (Invitrogen)を用いるドットブロットによってタンパク質産生を確認した。大腸菌において産生されたIGF-IをNi-IMACカラムクロマトグラフィーによって精製し、細胞密度をWST-1細胞増殖試薬(Roche Applied Sciences)との反応によってモニターしながら２つの感受性細胞株(MCF-7およびHT-29)において細胞増殖を刺激する能力をアッセイで確認した。ヒス-タグ化物質は、市販の調製物(Pepro)と比べてわずかに低下した活性を有するようであったが、ヒス-タグは除去され得、得られる切断生成物(サイズ排除クロマトグラフィーによって精製)は、市販の物質と見分けがつかない。

IGF-I依存性増殖に干渉する化合物の評価のための標準的な細胞株は乳癌細胞株MCF-7である。この細胞株は、細胞あたり43,000コピーを超えるIGF-IRを発現するが、応答のダイナミックレンジは結腸癌細胞株HT-29と比べてかなり低い。

当該技術分野では、スクリーニングに他の細胞株が使用され得ると理解されている。例えば、IGF-Iよりも優れた応答を有する細胞株ならびにIGF-Iに応答しない細胞株が陰性対照として使用され得る。マウス線維芽細胞株NIH/3T3は後者のカテゴリーの一例である。

実施例7：IGF-Iの進化トレースの解析
進化トレース(evolutionary trace)(「ET」)は、関連するDNA配列を比較対照するアルゴリズムである(Lichtarge、O.，et al.，(1996)J Mol Biol 257，342-58；Sowa，M.E.，et al.，(2000)Proc Natl Acad Sci USA 97，1483-8；Lichtarge，O.およびM. E. Sowa. (2002)Curr Opin Struct Biol 12，21-7)。これは、保存アミノ酸残基を同定するが、より重要なことには、タンパク質の特定のサブセットに特有な、結局は特定のタンパク質に特有な残基を同定する。これらの「トレース残基」がタンパク質の表面にマッピングされた場合、しばしば「トレースクラスター」と記載される。報告された場合(試験された数百のうち)の約85%において、これらのトレースクラスターは、機能性部位にマッピングされる。インスリンおよびその関連ファミリーのタンパク質は、機能が分かれた構造的に関連するポリペプチドの群を表す(Lu，C，et al.，(2005)Pediatr Res. 57:70R-73R)。公のデータベースには、ヒトIGF-Iと少なくとも15%の相同性を共有する167のタンパク質配列がある。

ET解析は、種々のインスリン、他のIGF-IおよびIGF-IIを含む関連タンパク質を示す樹大図(dendogram)を作製することにより始まる。特定のアミノ酸は、関連するタンパク質間の分岐点として同定され、統計学的にランク付けされる。最低ランク(最も重要な)トレース残基は、Denley要約(Denley et al.，(2005)Cytokine Growth Factors Reviews 16:421-439)に使用された同じ結晶構造にマッピングされた。低ランク残基はすべて、単一の充分定義された領域にマッピングされた。低ランク残基はいずれも分子の他方の面にはマッピングされなかった。これらは、インスリン/IGF-Iファミリーのタンパク質を他のものと分ける残基であり、共通のドメインを規定し、タンパク質の１つの結合表面を明白に取り決める。トレース解析は、公表された変異試験を確証し、「共通」ドメイン(ドメインAおよびB)の４つの非常に重要な残基：F16、F23、Y24およびV44を示す。

これらの残基を特徴とする結合表面は、IGF-IRおよびIR両方の結合面1への本発明者らのアンタゴニストの結合を排除するため、除去され得る。

また、IGF-Iの第２の結合表面も変異解析によって充分定義されており、ドメインCおよびDの残基で構成されている。これらのドメインにおけるアラニン置換(重要な機能性残基が除去される)により、IGF-IRに対する親和性が減少し、IRに対する親和性が増大することが知られている(Zhang，W.，et al.，(1994)J Biol Chem. 269:10609-10613)。したがって、これらの領域は、２つの受容体に対する結合の違いの原因である。したがって、この領域は、IGF-IR結合面2に対する親和性が向上するように操作され得る。かかる修飾は、IRへの結合親和性を低下させる可能性がある。

IGF-Iが２価のリガンドであるという仮説のさらなる支持は、IGF-I/IGF-IR系とEGF/EGFR系との間の構造および配列類似性に由来する。通常は離れている受容体の２つのドメインを近接会合の安定化において、IGF-IがEGFと同様の役割を果たしている可能性が高い。

実施例8：直接非放射性結合アッセイ
ビオチン化EGFおよびストレプトアビジンに結合させたホースラディッシュペルオキシダーゼを用いてEGFRへのEGFの結合を測定するための非放射性方法(De Wit，R.，et al.，(2000)J Biomol Screen. 5:133-140)を、本明細書では変形した。¹²⁵I標識EGFの置換を追跡するのではなく、Ultra ELISA TMB(Pierce)の酸化を追跡する。このアッセイにより、公表データと同等の結合定数が得られる。

さらなる試験
IGF-Iバリアントとビオチン化野生型IGF-Iとの競合を測定するためのさらなるアッセイの開発が実施され得る。

実施例9：共通の(IRおよびIGF-IR)結合表面(表面1)を除去するIGF-Iの点変異
公表された報告および本発明者らのET解析によると、「共通の」ドメイン内の４つの非常に重要な残基はF16、F23、Y24およびV44である。結晶構造データ(Vajdos，F. F.，et al.，(2001)Biochemistry 40：110221102-9)に基づくと、これらの残基はすべて、IGF-Iの一方の表面上に見られる。点変異体F16A、F23G、Y24L、およびV44Mはすべて、IGF-IRへの結合は大きさがほぼ２次数小さいことが示された。また、F16Aを除くすべてのバリアントもまた、IRへの結合について試験し、この受容体に対する親和性もまた有意に低下した。

さらなる試験
野生型IGF-I遺伝子をM13ファージベクター内にクローニングし、小外皮タンパク質pIIIとの融合タンパク質を作製した(Ph.D. Peptide Display Cloning System，New England BioLabs)。科学文献においてIGF-Iのファージディスプレイおよびパニングの公表された記述はないが、本明細書にその全体が援用される米国特許第6,403,764号にアプローチが詳細に記載されている。Ballinger，M. D.，et al.，は、BP1およびBP3に対して改善された親和性を有するIGF-Iバリアントを同定するためのファージディスプレイの使用を開示した(Ballinger，M. D.，et al.，(1998)J Biol Chem. 273:11675-11684)。

本発明によれば、「５価」M13(１価ではなく)は、アビディティ効果を利用するために使用される。１価の系は、高(nM)親和性で開始される場合、より適切である。減衰された結合剤(結合表面1における結合が除去された後)で開始することが意図されるため、M13の５価系は、本発明者らが遭遇すると予想される結合親和性(μM)においてより良好なダイナミックレンジを有するため、より適切である。本発明者らは、EGFバリアントの５価ディスプレイでこのアビディティ効果を観察し、高親和性ファージ(1nM)、低親和性ファージ(10uM)および挿入物(非結合剤)のない親ファージを識別し得ることを示した。

次いで、上記の変異の順列を作製するためにStratagene製のQuikChange(登録商標)系が使用され得る。これらのバリアントは、野生型とともにファージにおいて産生され得、固定化IGF-IRエクトドメイン(R&D BioScience)および抗pVIII抗体(New England Biolabs)を用いてファージELISAにおいてIGF-IRおよびIRへの結合について試験され得る。ファージは、非特異的結合の限界値を規定するための陰性対照としての挿入物がない。

ファージELISAはまた、特異的結合を確認するためにIGF-Iとの競合的様式で実施され得る。構築された変異体のいくつかは、特に標的残基が結合相互作用ではなく構造的完全性に関与している場合、不正確にフォールディングする可能性がある。これらのバリアントは、非挿入陰性対照に近い親和性で結合することが予想される。目的は、最低の測定可能な結合(場合によっては1〜10uMの範囲)を有するバリアントを同定することである。低いが測定可能な結合は、その後のパニング実験における改善を検出するのに適切な範囲であるため望ましい。ドメインAおよびBに制限された報告された単独または組合せの変異体はいずれも２次数より大きく結合を低下させず(Denley，A.，et al.，(2005)Cytokine Growth Factors Reviews 16:421-439)、ドメインCおよびDによる結合が損なわれていない限り、これが限界値であることが考えられ得る。

最近、本発明者らにより、５価ファージにディスプレイされたEGFRバリアントは、EGF-依存性細胞株において細胞増殖を刺激する能力を保持することが観察され、この観察結果により、産生および精製のために発現系内で再クローニングする必要なくバリアントをアゴニスト性についてスクリーニングすることが可能になるため、この研究プログラムが大きく加速された。また、IGF-IRのファージディスプレイアゴニストバリアントの細胞増殖を刺激する能力に関する試験は、成長因子の大きさの10倍のタンパク質との遺伝的融合物においてIGF-I機能が保持されるため、良好である(Sandoval，C., H. et al.，(2002)Protein Eng.15:413-418)。良好な場合、この結果により、ファージの結合親和性を細胞増殖の刺激における有効性と関連させるファージアゴニストアッセイの開発が可能になる。

実施例10：IGF-IR上の第２の結合部位による改善された結合を有するドメインCバリアントを同定するためのファージディスプレイ
IGF-IのドメインCは残基30〜41からなり、ドメインDは残基63〜70からなる。ファージディスプレイは、非常に大きなライブラリーからの分取(sort)のために使用され得るが、ドメインCのみの完全な無作為化は、この技術では到達し得ない4×10¹⁵アミノ酸配列バリアントのライブラリーサイズをもたらし得る。無作為化された６つの残基を有するライブラリーの構築は、なお技術的に困難であり、6×10⁷しかタンパク質配列を含まないが、それでも、この大きさの無作為化パッチ(patch)は、１次数より大きい親和性の改善をもたらし得る(Ballinger，M. D.，et al.，(1998)J Biol Chem. 273:11675-11684)。

改善された結合剤を同定するため、結合に必須のアミノ酸周囲に集中している残基32〜39および64〜69が無作為化され得る(Zhang，W.，et al.，(1994)J Biol Chem. 269:10609-10613)。ドメインCのR37R38 およびドメインDのK65K68の部位は、特に興味深い。

ファージパニング試験においてM13ベクターにおける出発鋳型として同定された最小限の結合バリアントを使用し、Kunkel変異誘発(Kunkel，T. A.，et al.，(1987)Methods Enzymol. 154:367-382)を用いて、個々のライブラリーにおいて２つの領域が一部無作為化され得る(各コドンの最初の２つの塩基が無作為化され、第３はGまたはTに保持され、遺伝子バリアントの数が減少し、終止コドンにより切断型が排除される)。ライブラリーは大腸菌XL1-Blue(Stratagene)内にエレクトロポレーションされ得る。ランダム形質転換体を配列決定し、バリアントのパーセンテージが測定され得、充分なエレクトロポレーションが行なわれ、各バリアントが少なくとも１コピーで表される90%コンフルエンスレベルを達成するための理論的ライブラリーの遺伝子バリアントの数の３倍が得られる。

次いで、ファージプラスミドが回収され、ファージ増幅について最適化された大腸菌株ER2738 (New England BioLabs)内に形質転換され得る。どのドメインが個々に結合親和性の最大の増加に寄与し得るかを見出すために、ライブラリーが合わされ得る。ドメインAおよびBの変異はIRへの結合を大きく減衰させることが予想されるが、強力な結合剤を排除するために減法結合工程が使用され得る。米国特許第6,403,764号に記載の方法を用いてこの工程が行なわれ得、増幅ファージライブラリーを固定化IRエクトドメイン(R&D Bioscience)とともにインキュベートする。IRに結合しないファージ融合体は上清中に除かれ、固定化IGF-IRエクトドメイン(R&D BioSciences)を用い、IGF-IRに対してパニングされる。

次いで、非結合ファージはバッファー洗浄により排除され得、結合ファージは、0.2Mグリシン-HCl(pH 2.2)、1mg/ml BSAで溶出される。クローンは、配列決定のために溶出液試料から単離され得、残りは、後の回の増幅およびパニングに使用される。

４回のパニング後、結合ファージは単離され得、IGF-IRおよびIRの両方とともにファージELISAを用いて出発変異体および野生型ファージに相対する結合親和性が測定され得る。次いで、IGF-IRに対する改善された親和性およびIRに対して低い親和性を有するファージが、IGF-Iとの競合アッセイにおいて特にIGF-IRへの結合について試験され得る。次いで、該ファージは、受容体活性化との結合の脱カップリングへの進行を示すファージアゴニストアッセイにおいて試験され得る。

これにより親和性/効力比(Kd/EC50)が増加することが予想される。

改善された結合剤がいずれもアンタゴニスト特性を示さない場合、再設計のプロセスにおいてドメインAおよびBにおけるさらなる変異により、結合表面1での結合をさらに減衰させることが必要であり得る。

アンタゴニスト表現型を有するファージが同定された場合、その親和性は野生型IGF-IRファージのものと比較され得る。無作為化されるサブドメインがわずか６残基長であるため、最良の結合剤がいずれもIGF-Iの親和性(<1nM)でIGF-IRに結合しないことがあり得る。その場合、この種の相互作用は、特にかかる小タンパク質の場合はほとんど付加的でないため、各ライブラリーからの最良の結合剤が合わされない場合がある。代わりに、最良の特性を有するクローンが次の出発点として使用され得、残りのサブドメインを新たな回のパニングのために無作為化する。２回の反復で充分であり得るが、その後の回も予想される。このプロセスの最後に、<10 nMの親和性を有する5〜10のアンタゴニストファージが同定されることが予想される。これらは、アンタゴニスト性の確認のために次の段階に移行される。

実施例11：アンタゴニスト性の確認
上記で同定されたヒット物質は、次いで、発現ベクターpET-9a(Novagen)内にクローニングされ、大腸菌株BL21 (DE3)pLysS (Novagen)において発現され得る。この発現系は、OmpAリーダー配列、その後ろにN末端6x-ヒスタグ、および後のヒス-タグ除去のための第Xa因子切断部位を含むように改変した。タンパク質は、振とうフラスコ内で生成され、Ni IMACクロマトグラフィー(Qiagen)により精製され得る。この系は、野生型IGF-Iを作製するために良好に使用されている。封入体を充分発現しない、または形成しないバリアントはいずれも廃棄され得る。許容され得る産生特性を有するバリアントを同定するため、必要であれば、パニング溶出液は戻され得る。

バリアントは、IGF-IRおよびIRへの結合に関してビオチン化IGF-Iおよびビオチン化インスリンと競合する能力について試験され得る。これらの試験により、バリアントタンパク質がIGF-IRに対して大きさが天然IGF-Iの次数以内および大きさがIRより少なくとも３次数小さい結合の親和性を有する(IGF-Iには同じ相対親和性を維持している)ことが確認される。このアッセイにおいてIGF-IRに対して最大の親和性を有するバリアントの結合は、バリアントタンパク質をチップに結合させ、IGF-IRエクトドメインとのインキュベーションによってプラズモン共鳴における変化を測定するBiacore表面プラズモン共鳴解析によって確認される(Denley A.，et al.，(2005)Mol Endocrinol. 19:711-721)。この解析は、任意に、契約により、University of Texas Medical School Molecular Genetics Core Facilityで行なわれ得る。

本明細書の方法または標準的なタンパク質産生方法を使用し、より詳細な解析に充分なタンパク質が産生され得る。これらの精製タンパク質は、以下のアッセイにおいて使用され得る。

MCF-7細胞増殖の阻害:
MCF-7細胞は、増殖アッセイの場合のように増殖されるが、次いで、有意な成長を刺激するのに充分なレベルのIGF-Iを含有する無血清培地または血清を有する培地のいずれかに移される。次いで、種々のレベルのIGF-Iバリアントがウェルに添加され、以前のように細胞増殖を進行させる。バリアント濃度の増大時の吸光度の減少によってIGF-I刺激の干渉が測定される。

IGF-IR自己リン酸化の阻害:
IGF-IRへのIGF-Iの結合により、受容体キナーゼドメインの活性化および自己リン酸化がもたらされる。本発明者らのバリアントの存在下および非存在下でIGF-Iで処理したMCF-7細胞を用いて溶解液を作製する。最初に、全IGF-IR ELISA(R&D Systems)を用いて溶解液をIGF-IRのレベルについて標準化する。次いで、ホスホル-IGF-IR ELISA (R&D Systems)により自己リン酸化をモニターする。バリアントは、チロシン1131のIGF-1-刺激リン酸化に干渉することが予想される。非特異的キナーゼインヒビタースタウロスポリン(Sigma)およびEGFR特異的キナーゼインヒビターAG1478(Sigma)が、陽性および陰性対照として使用される。

IR活性の阻害:
上記のようなウエスタンブロットを使用し、McA-RH7777ラット肝癌細胞(ATCC)を用いてインスリン-依存性IR自己リン酸化ならびにインスリン受容体基質のリン酸化を示すことにより、本発明の化合物はIR関連活性に干渉することができないことが示され得る(Hansson，P. K.，et al.，(2004)Biochim Biophys Acta. 1684:54-62)。

IRのレベルは、抗インスリン受容体βサブユニット(Upstate)によるウエスタンブロットを用いて標準化され得、自己リン酸化のレベルは、ホスホ-IR ELISAキット(R&D Systems)を用いて測定され得る。生理学的に関連する濃度において、本発明者らのバリアントによるIR関連リン酸化の干渉は予想されない。

細胞毒性スクリーニング:
増殖アッセイは当該技術分野で公知である。これは、非IGF-I応答性細胞株、例えばマウス線維芽細胞NIH-3T3ならびにヒト癌細胞株CaLU-1およびSK-BR-3の組により行なわれ、一般毒性についてスクリーニングされ得る。

結合親和性の解析のためのファージELISA
固相ELISAは、IGF-IRへのIGF-Iバリアントファージ結合の解析のために使用される。捕捉抗体(IGF-IRのキナーゼドメインに特異性を有するマウスモノクローナル抗体クローンJBW902 (Upstate))を用いてIGF-IR (R&D Systems)を適正に整列させる。プレートを1%BSAを含有するPBSでブロックし、次いで、種々の濃度のファージとともにインキュベートする。0.1%Tween-20を含有するPBSで数回洗浄後、結合ファージは、HRPにコンジュゲートされた抗M13 pVIII外皮タンパク質抗体により検出される。TMPの後H2SO4によって発色させた後、450nmにおける吸光度を測定する。

細胞増殖アッセイ
細胞を完全培地中で増殖させ、次いで、血清を除去した。細胞を精製成長因子またはファージとともに48〜72時間インキュベートした。増殖期間の最後の３時間、10ul/ウェルのWST-1細胞増殖試薬(Roche Applied Sciences，Indianapolis，IN)の添加によって細胞増殖を測定した。WST-1は、生存細胞のミトコンドリアデヒドロゲナーゼによってホルマザン色素に切断されるテトラゾリウム塩である。MRX Revelationソフトウェアとともにマイクロプレートリーダー(Dynex Technologies)を使用し、450nmにおいてホルマザンの量を測定した。

細胞株
HT-29
ヒト結腸直腸癌細胞をATCCから入手した。これを、1.5mMのL-グルタミンを含み、2.2g/Lの炭酸水素ナトリウム、90%；ウシ胎児血清、10%を含むように調整されたマッコイ5a培地(改変)中で培養した。

NIH-3T3
マウス線維芽細胞細胞をATCCから入手した。これを、4mMのL-グルタミンを含み、1.5g/Lの炭酸水素ナトリウムおよび4.5g/Lのグルコース、90%；ウシ胎児(bovine calf)血清、10%を含むように調整されたダルベッコ改変イーグル培地中で培養した。

CaLU-1
ヒト肺上皮系癌細胞をATCCから入手した。これを、1.5mMのL-グルタミン、90%；ウシ胎児血清、10%を含むマッコイ5a培地中で培養した。

SK-BR-3
ヒト乳癌細胞をATCCから入手した。これを、1.5mMのL-グルタミンを含み、2.2g/Lの炭酸水素ナトリウム、90%；ウシ胎児血清、10%を含むように調整されたマッコイ5a培地(改変)中で培養した。

本明細書で言及した特許および科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本明細書に引用したすべての米国特許および公開または非公開米国特許出願は、参照により援用される。本明細書に引用したすべての公開外国特許および特許出願は、参照により本明細書に援用される。本明細書に引用したすべての他の公開参考文献、マニュスクリプト、原稿および科学文献は参照により本明細書に援用される。

本発明を、その好ましい態様を参照して具体的に示し、記載したが、形態および詳細における種々の変形が、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱せずになされ得ることは、当業者によって理解されよう。

Claims (27)

1. a) 既知受容体リガンドおよび薬にできるリガンドとして機能するように設計されたポリペプチド配列からなる群から薬にできるリガンドを選択する工程、ここで、薬にできるリガンドの既知構造または予測される構造が２つ以上の受容体結合表面を提示するか、または含む、
   b) 前記(a)の薬にできるリガンドに対してドメイン結合最適化(DBO)を、
   i. 第１の標的受容体ドメインへの薬にできるリガンドの結合が破壊されるように、薬にできるリガンドの第１の受容体結合表面の１つ以上の特徴に１つ以上の修飾を行なう工程、および
   ii. 第２の標的受容体ドメインへの薬にできるリガンドの結合が増強されるように、薬にできるリガンドの第２の受容体結合表面の１つ以上の特徴に１つ以上の修飾を行なう工程
   を含む方法によって行なう工程、ならびに
   c) (b)の最適化された薬にできるリガンドを、ドミナントネガティブ活性についてアッセイする工程、ここで、ドミナントネガティブ活性が生物学的活性の阻害である、
   を含む、治療用ドミナントネガティブリガンド(DNL)の設計方法。
2. 生物学的活性が、受容体媒介性の病状、受容体媒介性細胞シグナル伝達、細胞成長、細胞増殖および腫瘍成長からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
3. 治療用ドミナントネガティブリガンドとして生物学的活性を阻害し得る薬にできるリガンドを同定する工程をさらに含む、請求項２記載の方法。
4. 薬にできるリガンドの１つ以上の性質を改変するために、薬にできるリガンドの１つ以上の特徴に修飾を行なう工程をさらに含み、前記性質が、最適pHまたはpH-活性、消化性、抗原性、両親媒性性質、リガンド-受容体相互作用、熱的または動力学的安定性、可溶性、フォールディング、翻訳後修飾、疎水性および親水性からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
5. 前記第１または前記第２の標的受容体ドメインへの薬にできるリガンドの結合の破壊または増強が、標的受容体ドメインを含む天然標的受容体、単離された標的受容体ドメインおよび代表的な標的受容体部分からなる群より選択される１つ以上の分子への薬にできるリガンドの結合親和性を測定することにより測定される、請求項１記載の方法。
6. 前記第１および前記第２の標的受容体ドメインが同じ受容体に位置する、請求項１記載の方法。
7. 標的受容体が、HER受容体、インスリン受容体、IGF受容体、インターフェロン受容体、hGH受容体、VEGF受容体、NGF受容体、TNF 受容体およびG-タンパク質共役型受容体からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
8. 標的受容体が膜結合している、請求項１記載の方法。
9. 行なわれる修飾が、修飾ポリペプチドのライブラリーの作製をもたらす、または該ライブラリーの作製により得られる、請求項１記載の方法。
10. 修飾ポリペプチドのライブラリーがファージライブラリーを含む、請求項９記載の方法。
11. 結合がファージELISAを用いて測定される、請求項１記載の方法。
12. 阻害される生物学的活性が受容体媒介性細胞シグナル伝達である、請求項２記載の方法。
13. 受容体媒介性細胞シグナル伝達の阻害が、受容体による下流シグナル伝達の除去をもたらし、これは、１つ以上のタンパク質の改変されたリン酸化状態によって測定される、請求項１２記載の方法。
14. 受容体媒介性細胞シグナル伝達の阻害が、自己リン酸化アッセイまたは遺伝子発現アッセイを用いて測定される、請求項１２記載の方法。
15. 生物学的活性の阻害が、２つ以上の受容体にわたってパノラマ式である、請求項２記載の方法。
16. パノラマ式生物学的活性の阻害のレベルまたは程度が前記２つ以上の受容体に対して実質的に同じである、請求項１５記載の方法。
17. １つ以上の修飾が、１つ以上の特徴の無作為化、１つ以上の特徴の複製、長さの改変、電荷の改変、およびその任意の組合せからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
18. １つ以上の特徴が、表面提示、局所コンホメーション形状、フォールディング、ループ、半ループ、ドメイン、半ドメイン、部位および末端からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
19. 工程(a)および(b)が、単独または組合せのいずれかで反復的に行なわれる合理的再設計の工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
20. 長さの改変が切断である、請求項１７記載の方法。
21. ドメイン結合が最適化された薬にできるリガンドの集団を増加させるために、薬にできるリガンドのファージパニングを繰返す工程をさらに含む、請求項１１記載の方法。
22. 請求項１〜２１いずれか記載の方法によって作製される治療用DNLまたはDNLバリアント。
23. 阻害される生物学的活性が受容体媒介性の病状の原因である、請求項２記載の方法。
24. 受容体媒介性の病状が、癌、炎症、心血管疾患、高脂血症、グルコース調節異常、てんかん、アレルギー、慢性の痛み、アルツハイマー病、メタボリックシンドローム、コルチソル抵抗性、クローン病およびハンティングトン病からなる群より選択される、請求項２３記載の方法。
25. １つ以上の細胞株が癌細胞株を含む、請求項２記載の方法。
26. 前記癌細胞株の癌の型が、肺、乳房、肝臓、心臓、骨、血液、結腸、脳、皮膚、腎臓、膵臓、卵巣、子宮および前立腺からなる群より選択される、請求項２５記載の方法。
27. 腫瘍異種移植片系において、請求項１記載の方法によって設計される治療用DNLまたはDNLバリアントをアッセイする工程を含み、測定された腫瘍成長速度、腫瘍の大きさまたは腫瘍転移の減少が候補癌治療剤としての陽性ヒットを表す、抗癌剤の同定方法。