JP2004528529A - 未熟児合併症のリスクの決定および治療 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
関連する出願に対する相互参照
本出願は2001年3月3日に出願された仮特許出願第60/274,252号および2000年11月28日に出願されたスウェーデン特許出願第0004405−7号に基づき、その内容を利用し全体を通して参照として援用し、U.S.C.119章に基づく優先権を主張する。
【0002】
発明の技術分野
本発明は全体として早産および低体重による合併症を発症するリスクの決定、そして特にIGF−Iに関連する合併症に関する。本発明はさらにこのような症状を治療する方法に関する。
【0003】
発明の背景
毎年アメリカにおける推定420万例の出産のうち、およそ383,000例(約9%)が未熟児である。早産およびその合併症は現代先進国社会において、周産期の重要な社会的健康問題である。低体重の新生児または未熟で生まれた新生児は、子宮内での成長の非常に重要な期間の主要部分が欠落している。これら新生児は新生児全体の死亡の1/2および長期間罹患の3/4を占める。新生児期および生存者の生涯にわたりどちらも特別なケアに要する高いコストのため、国家経済に重い負担をかけることになる。生存者の多くはまた、未熟児に直接起因する身体的障害によりクオリティーオブライフの低下を課せられてきた。
【0004】
正常な妊娠または在胎期間は受精日から40週(280日)であると考えられている。在胎37週前に生まれた新生児は未熟であると考えられ、合併症のリスクが懸念される。医学技術の進歩により、在胎週数23週(17週未熟)程度の早期に生まれた新生児の生存も可能となった。未熟で生まれた新生児は、その低体重および体のシステムが成熟していないことによる、死亡または重篤な合併症の危険性がより高い。2,500g以下の区切りで定義される低体重は、出生前のリスク因子、分娩時合併症および新生児疾患に相関することより、リスクの高い新生児の1つの指標とみなされており、早期出生の多くを構成する。超低体重に関する研究では、超未熟に関連する重篤な呼吸器合併症および神経学的合併症を高比率で伴う、最もリスクの高い新生児と同定する1,500g未満、または1,000g未満で区切って定義している。(Hack, M., Klein, N. K., & Taylor, H. G.、低体重新生児の長期間の発達の結果、The Future of Children, 5, 176-196(1995))。
【0005】
未熟児では肺、消化系および神経系(脳を含む)が十分に発達しておらず、特に合併症の傷害を受けやすい。早産の新生児に起こる最も一般的な医学的障害は、未熟児網膜症、発達遅滞、精神遅滞、気管支肺の形成不全、壊死性腸炎、および脳室内出血である。
【0006】
未熟児網膜症(ROP)は失明の可能性のある疾患で、未熟な出生後の網膜の血管の成長の欠如に始まる。ROP発症の最大のリスク因子は低体重および在胎週数である。ROPは2段階で起こる。 (Simons, B. D. & Flynn, J. T. (1999) International Ophthalmology Clinics 39, 29-48)。新生児が未熟で生まれる場合、網膜は血管形成が完了していない。ROPを発症する新生児では、無血管であるにもかかわらず出生時に成熟を取り残したまま、血管の成長が遅いかまたは止まってしまうため、末梢の網膜が低酸素になる。(Ashton, N. (1966) Am J Ophthalmol 62, 412-35; Flynn, J. T., O'Grady, G. E., Herrera, J., Kushner, B. J., Cantolino, S. & Milam, W. (1977) Arch Ophthlmol 95, 217-23)。これがROPの第1段階である。
【0007】
ROPの最初の段階での網膜の非潅流の程度が、続いて起こる新生血管形成の程度、すなわち網膜剥離および全盲という付随リスクを伴うROPの後半の破壊的段階を決定するようである。(Penn, J. S., Tolman, B. L. & Henry, M. M. (1994) Invest Ophthalmol Vis Sci 35, 3429-35)。すべての未熟児に子宮内で成長するように正常に血管を成長させることができれば、ROPの障害に至る第2段階の新生血管形成は起こらないだろう。ROPが1942年に最初に報告された当時、病因は分からなかった。しかし未熟児に高濃度酸素の補給を過分に使用することが、直ちにこの疾患に結びつき、高酸素が網膜の血管形成の完了していない新生仔動物におけるROP様の網膜症を誘導することが示された。このことは酸素によって制御される因子が関与することを示唆した。血管内皮成長因子(VGEF)の発現は正常な血管の発達に必要であるが、酸素により制御されており、ROPの双方の段階に重要であることが発見された。(Aiello, L. P., Pierce, E. A., Foley, E. D., Takagi, H., Chen, H., Riddle, L., Ferrara, N., King, G. L. & Smith, L. E. (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92, 10457-61; Robinson, G. S., Pierce, E.A., Rook, S. L., Foley, E., Webb, R. & Smith, L. E. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93, 4851-6; Pierce, E. A., Foley, E. D. & Smith, L. E. (1996) Arch Ophthalmol 114, 1219-28; Stone, J., Itin, A., Alon, T., Pe'er, J., Gnessin, H., Chan-Ling, T. & Keshet, E. (1995) J Neurosci 15, 4738-47; Alon, T., Hemo, I., Itin, A., Pe'er, J., Stone, J. & Keshet, E. (1995) Nature Medisine 1, 1024-8; Ozaki, H., Seo, M. S., Ozaki, K., Yamada, H., Yamada, E., Okamoto, N., Hofmann, F., Wood, J. M. & Campochiaro, P. A. (2000) American Journal of Pathology 156, 697-707)。高濃度酸素の補給はVEGFの発現抑制を通してROP動物モデルの血管成長の第1段階に影響を与える。しかし今日、現在の中程度の濃度の酸素補給の注意深い使用をもってすれば、患児の酸素レベルはROPの有意なリスク因子ではないのであるが、なおこの疾患は存続しており、他の因子も関与することを示唆する。(Kinsey,V.E., Arnold,H.J., Kalina,R.E., Stern,L., Stahlman,M., Odell,G., Driscoll,J.M., Jr., Elliott,J.H., Payne,J. & Patz,A. (1977) Pediatrics 60, 655-68; Lucey, J.F. & Dangman,B. (1984) Pediatrics 73, 82-96)。
【0008】
未熟児は脳の発達が完了していない。脳内の呼吸中枢が未熟であろうことから、多くの未熟児は脳内の出血または脳内酸素供給が不十分なことに起因する神経学的障害を受けやすい。神経学的障害(例えば脳室内または脳室周囲の出血、周産期低酸素障害)および早産による様々な早期感染が、発達遅滞、すなわち発達の評価指標を達成する進歩が遅いというリスクをもたらす。早期に発達遅滞のある小児は精神遅滞の“リスクがある”と考えられる。精神遅滞は、その他の生活技術の全般的欠落と合わせて、18歳前に発達していなければならない一般的な知的機能の障害をいう。超未熟で生まれた小児は、健常の満期産の小児より精神遅滞をはるかに発症しやすい。神経学的障害は、例えば脳波(EEG)により検出することができる。EEGは新生児の脳の機能を反映する有用な情報を提供する。EEGを脳の成熟、病巣または一般的異常を決定する一助とすることができる。EEGは脳神経細胞からの電流を測定することにより脳の外層における脳の活動を検査する。頭の様々な部分に電極を固定し、電気的活動からグラフを作成する。脳波をその振動数(1秒当たりの波の数)およびその波形(1つの波の形、または一群の波の形)により、解釈することができる。
【0009】
脳室内出血(IVH)は現在、未熟な新生児の中枢神経系罹患の最も知られている原因である。ほぼすべての重症のIVHは在胎週数28−30週またはそれ未満で起こる。重篤なIVHの90%は、リスクの高い新生児の約15−40%の生後数日から1週以内に起こる。IVHは未熟で壊れやすい脳内の血管が破裂し、通常は髄液が保持されている空洞な部分(脳室)内およびその周辺組織内に出血する症状である。IVHの重症度はI−IVのスケールにより、Iは破裂した血管周囲の小さな領域に限定された出血、IVは脳室だけでなく脳組織自身にまで血液の貯留が拡大する、という様に段階づけられている。グレードIおよびIIはよく見られ、通常病的な影響を与えることなく乳児の体が血液を再吸収する。しかしより重篤なIVHは、脳室に過剰の体液が貯留され脳圧の増加をきたし、乳児の頭を異常に膨満させる原因となる致死の可能性のある症状である水頭症になり得る。体液を抜いて脳圧を減圧するため医師は、髄腔に針を挿入して液体を抜く腰椎穿刺;脳室から、逃避の下または上の人工的な空間に体液を抜くチューブである、貯留場所の設置;または脳室から腹部に体液を抜き、体で再吸収させるチューブである、脳室シャントの設置、のいずれかを行う。IVHのリスクの高い新生児には、通常生後1週以内に脳の超音波検査を行い、出血が検出された場合はさらに他の検査を行う。現在IVHを予防することはできない;しかしきめ細かくモニターすることは、障害の可能性を最小にするために脳内の体液を減ずる手段を直ちに行うことを確実にする。
【0010】
すべての新生児の約1%は、肺が成熟していないことを反映する呼吸窮迫症候群を発症する。新生児集中治療室(ICU)で呼吸窮迫症候群を治療した新生児のうち約20から30%が、慢性新生児肺疾患の最も一般的な形である気管支肺形成不全(BPD)を発症する。(Northway WH. 気管支肺形成不全:25年後、Pediatrics 1992; 89: 969-973)。毎年約7,000例のBPDの新たな症例が診断されている。(Davis JM, Rosenfeld WN. Chronic lung disease. :Avery GB, Fletcher MA, MacDonald MG編、 Neonatology: pathophysiology and management of the newborn. Philadelphia, PA: JB Lippincott, 1994; 453-477)。BPDの新生児では、主に心肺不全による高頻度の再入院(60%まで)およびその後の死亡(20%まで)が認められている。(Southall DP, Samuels MP、気管支肺形成不全:管理の新しい見解、 Arch Dis Child 1990; 65:1089-1095)。生存は改善されているが、治療の進歩によってもBPD発症の有意な低下には至っていない。(Frank L.、抗酸化剤、栄養摂取および気管支肺形成不全、Clin Perinatol 1992; 19: 541-562; Rush MG, Hazinski TA. 、気管支肺形成不全の現在の治療、Clin Perinatol 1992; 19: 563-590)。未熟、気圧障害および酸素毒性がBPDの病因に寄与しているが、新生児の肺が、構造および機能のこのような重篤な崩壊をきたす正確な機序は完全には解明されていない。
【0011】
インスリン様成長因子I(IGF−I)は生後の成長および代謝の公知の制御物質である。Baker J, Liu JP, Robertson EJ. Efstratiadis A. Role of insulin-like growth factors in embryonic and postnatal growth.(胎児期および生後の成長におけるインスリン様成長因子の役割) Cell 1993; 75: 73-82 を参照のこと。この物質は約7.5キロダルトン(Kd)の分子量を有する。IGF−Iは、様々な他の成長因子による組織の治療がIGF−I産生増加をもたらすことから、このような成長因子の作用に関連づけられてきた。しかし出生前の成長および発達におけるその役割は最近になって理解されたに過ぎない。Guluckman PD, Harding JE. 、子宮内の成長遅滞の生理学および病理生理学、Hormon Research 1997; 48: 11-6を参照のこと。IGF−I-/-マウスで得られた実験データは、IGF−Iが胎仔期の成長の第3三半期およびいくつかの組織の発達に重要な役割を担うことを示唆する。Baker J, Liu JP, Robertson EJ. Efstratiadis A.、胎児期および生後の成長におけるインスリン様成長因子の役割、Cell 1993; 75: 73-82 を参照のこと。マウスのIGF−I-/-のデータを支持するものとして、IGF−I系を遺伝的に欠損する2名の患児が、中枢神経系の出生前の成長障害および発達障害を呈することが示された。1名の女児はIGF−I受容体遺伝子の1つの対立遺伝子の欠損があり、1名の男児はIGF−I受容体遺伝子の部分的欠損があった。Woods KA. Camacho-Hubner C, Savage MO, Clark AJ.インスリン成長因子I遺伝子の欠損に伴う子宮内での成長遅滞および生後の成長不全。New England Journal of Medicine 1996; 335: 1363-7;およびde Lacerda L, Carvalho JA, Stannard B, et al., 1999 環状クロモゾーム15およびタイプ1IGF受容体遺伝子の1つの対立遺伝子欠損を伴う重篤な成長遅滞の女児における短期の組み換えヒトインスリン様成長因子−1(IGF−1)に対するin vitroおよびin vivoにおける反応、Clin. Endocrinol. 51(5): 541-50 を参照のこと。
【0012】
IGF−Iはインスリン様の活性を有し、神経組織、筋肉組織、生殖組織、骨組織およびその他の組織の細胞に対して分裂促進的(細胞分裂を刺激する)および/または栄養性(再生/生存を促進する)である。ほとんどの成長因子とは異なり、IGFは循環系に相当量存在するが、循環系または他の体液中においてこのIGFの非常に少量部分のみが遊離型である。ほとんどの循環しているIGFはIGF結合タンパク質、さらに特にIGFBP−3と結合している。IGF−Iを血清中で測定し、異常な成長に関する症状、例えば脳下垂体性巨人症、末端肥大症、小人症、様々な成長ホルモン欠損症等、を診断することができる。IGF−Iは多くの組織で産生されるが、ほとんどの循環しているIGF−Iは肝臓で合成されると考えられている。
【0013】
ほとんどすべてのIGFはIGF−I、IGFBP−3およびacid labile subunit(ALS)と呼ばれるより大きなタンパク質サブユニットから成る、非共有結合的に会合する三元複合体で血中に存在する。IGF−I/IGFBP−3/ALS三元複合体は三成分それぞれの等モル量で構成される。ALSは直接IGFに結合する活性はなく、IGF−I/IGFBP−3の二元複合体とのみ結合するようである。IGF−I/IGFBP−3/ALS三元複合体は分子量約150Kdである。この三元複合体は “遊離型IGFの濃度の急速な変化を防ぐためのIGF−Iの貯蔵場所およびバッファーとして”血中で機能すると考えられている。(Blum et al., pp.381-393, Modern Concepts In Insulin-Like Growth Factors(E.M.Spencer, ed., Elsevier, New York, 1991) )。
【0014】
IGFBP−3は循環系に最も多量に存在するIGF結合タンパク質であるが、少なくとも5種の他の別個のIGF結合タンパク質(IGFBP)が様々な組織および体液中で同定されている。これらのタンパク質はIGFと結合するが、これらは各々別の遺伝子を起源とし、独自のアミノ酸配列を有する。したがって当該結合タンパク質は単なる共通の前駆体の類似体または誘導体ではない。
【0015】
IGF−IおよびIGF−I結合タンパク質、例えばIGFBP−3は天然の素材から精製するか、または組み換え手段により生成することができる。例えばヒト血清からのIGF−Iの精製は当該技術分野で公知である(Rinderknecht et al.(1976)Proc. Natl.Acad.Sci. USA 73: 2365-2369)。組み換え法によるIGF−Iの生成は1984年12月に発行されたEP 0 128 733に示されている。IGFBP−3は天然の原料から、例えばBaxterらにより示された方法(1986, Biochem.Biophys.Res.Comm. 139: 1256-1261 )を用いて精製することができる。あるいはIGFBP−3はSommerらによりModern Concepts Of Insulin -Like Growth Factors, pp.715-728(E. M. Spencer, ed., Elsevier, New York, 1991)に述べられたように、組み換えにより合成することができる。組み換えIGFBP−3は1:1のモル比でIGF−Iと結合する。
【0016】
未熟児合併症の理解が深められているにもかかわらず、未熟による罹患および死亡が非常に広く認められるように、現在、利用可能な有効な治療またはこれらの生命を脅かす症状を発症するリスクを決定する方法はない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【0017】
発明の概要
本発明のひとつの側面において、在胎40週前または患児の在胎週数の平均体重より10%以上少ない体重で生まれた患児における、早産による合併症の発症リスクを決定する方法を提供する。当方法は、IGF−Iおよび/またはIGF−I結合タンパク質の血清レベルを同患児の出生後に測定して、IGF−IまたはIGF−I結合タンパク質のレベルを得ること;および前記IGF−IまたはIGF−I結合タンパク質レベルを、同じ在胎週数の子宮内での平均レベルに基づくIGF−IまたはIGF−I結合タンパク質の子宮内ベースラインレベルと相関させることを含み、IGF−IまたはIGF−I結合タンパク質のレベルが子宮内在胎週数平均レベル以下の場合は、同患児の早産による合併症を発症するリスクの増加を示すものとする。早産による合併症は未熟児網膜症、発達遅滞、精神遅滞、気管支肺形成不全、および脳室内出血を含む。
【0018】
本発明のもう1つの側面において、早産による合併症の患児を治療する方法、または患児が早産による合併症を発症することを予防する方法を提供する。当方法は、子宮内の基準以下の血清レベルのIGF−Iの患児に、有効量のIGF−I、その類似体、またはそのアゴニストを投与し、同患児のIGF−Iレベルを子宮内ベースラインレベルまで増加させることを含む。子宮内ベースラインレベルとして好ましくは10μg/Lから150μg/Lまでの濃度まで増加させる。本発明の1つの態様においてIGF−Iまたはその類似体を、IGF−Iと結合することのできるIGF結合タンパク質と組み合わせて投与する。好ましい態様において、IGF−Iと結合することのできるIGF結合タンパク質はIGF−I結合タンパク質3(IGFBP−3)である。IGF−Iまたはその類似体(IGF−Iと結合することのできるIGF結合タンパク質と共にまたは伴わずに)またはそのアゴニストは、皮下、静脈内、筋肉内、または経口投与する。経口投与が好ましい。
【0019】
本発明のなおもう1つの側面において、早産による合併症の治療用薬剤の製造におけるIGF−I、その類似体、またはそのアゴニストの使用を提供する。
最後に包装材および同包装材に内包される医薬剤を含む製造品もまた提供する。包装材は、早産に伴う合併症の治療および/または予防するため、同医薬剤を十分な期間有効な用量で投与できることを示すラベルを含む。同医薬剤はIGF−Iまたはその類似体、またはそのアゴニストを、医薬的に受容可能な担体と共に含む。
【0020】
本発明をその好ましい限定された態様と関連させて述べてきたが、先の記述ならびに以下の実施例は本発明を説明するためであり、その範囲を限定する意図はないことは理解されるであろう。本発明の範囲に含まれるその他の側面、利点および修飾は、本発明に関連する当該技術分野の技術者には明らかであろう。
【0021】
詳細な説明
マウスモデルでインスリン様成長因子1(IGF−I)が正常な網膜血管の発達に必要であることを示した。Hellstrom A, Perruzzi C, Ju M, et al.、低レベルIGF−Iは網膜内皮細胞内のVEGFの生存シグナルを抑制する:臨床の未熟児網膜症との直接の相関、Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 5804-8を参照のこと。また以下の実施例#2を参照のこと。未熟児網膜症(ROP)は、網膜の血管の成長が子宮内での発達から遅れる、異常な網膜の発達に関連する。未熟児の血清IGF−Iレベルを、出生(最終月経後週数24から32週)から退院まで毎週測定するプロスペクティブ時系列研究を行った。新生児はROPおよびその他の未熟による罹患:気管支肺形成不全(BPD)、脳室内出血(IVH)および壊死性腸炎(NEC)について評価した。早産後の持続的に低い血清IGF−Iレベルが未熟児合併症、例えばROPに関与することを発見した。これより早産に伴うリスクを決定する方法および合併症を治療する方法を発明した。
【0022】
妊娠第3期に胎児のIGF−Iは子宮内で急速に増加し、この増加が胎児の組織の発達に関与する。Gluckman PD, Harding JE、子宮内成長遅滞の生理学および病理生理学、Hormon Research 1997; 48: 11-6 を参照のこと。早産後のIGF−Iレベルは、最終月経後週数、特に第3期に相当する最終月経後週数の等しい胎児の子宮内レベルより低い。Lineham JD, Smith RM, Dahlenburg GW, et al.、未熟な新生児および満期産新生児における循環インスリン様成長因子Iレベルの時系列的追跡、Early Hum Dev 1986; 13: 37-46 を参照のこと。IGF−I-/-マウスでは、IGF−Iの非存在が正常な網膜の血管の成長を阻害する。Hellstrom A, Perruzzi C, Ju M, et al.、低レベルのIGF−Iは網膜内皮細胞内でのVEGFの生存シグナルを抑制する:臨床の未熟児網膜症との直接の相関、Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 5804-8を参照のこと。ROPを発症する未熟な新生児では、正常な網膜の血管の成長の休止が増殖性の網膜症を引き起こす。未熟な乳児においてROPおよび他の生後罹患は、一部の未熟児が子宮内で正常に認められる血清IGF−Iレベルに匹敵するレベルを獲得することのできないことによる、異常な組織の成熟の結果である可能性があるとの仮説を立てた。
【0023】
IGF−Iが最終月経後週数33週で30μg/L以下の場合、ROPおよびその他の罹患の相対的リスクは5.7倍(95%信頼区間2.2−14.6)に増加した。最終月経後週数調整後、最終月経後週数31−35週中の平均IGF−Iを各々5μg/L増加するとROPのリスクは59%までに低下した。在胎31−35週でのIGF−Iレベルの中央値は、生後罹患を伴わない群(n=29)の38μg/L(範囲20−59)に比較して、ROPおよび他の罹患を伴う新生児(n=19)では26μg/L(範囲17−49)であった、p<0.0001。
【0024】
ROPおよび他の生後罹患(BPD、IVHおよびNEC)を発症する未熟児は、ROPおよび他の合併症を伴わない新生児と比較して生後のIGF−I血清レベルが低い。ROPの新生児のIGF−I血清レベルは、在胎31−36週中の緩やかな比較的直線的な上昇を示した。反対にROPまたは他の生後罹患を伴わない新生児では、IGF−Iの血清レベルは異なるパターンを有する傾向があり、より急速に増加し、在胎31−35週に相当する週数でIGF−Iの最大値となる、子宮内で観察された値に近いレベルに達していた(図2)。したがって血清IGF−Iレベルから早産による合併症、例えばROPを予測することができる。未熟児それ自体(在胎週数または最終月経後週数および出生体重)が歴史的には明らかに最も強いROPのリスク因子であった。Simons BD, Flynn JT、未熟児網膜症および関連因子、International Ophthalmology Clinics 1999; 39: 29-48を参照のこと。しかし最終月経後31−35週でのIGF−Iレベルの平均が、ROPおよび他の未熟児合併症の予測因子として未熟児それ自体の程度(出生時の最終月経後週数)と同じ位重要であることを発見した。
【0025】
罹患を伴わない未熟児で観察されたIGF−Iレベルのピークは、目、肺、腎臓および脳の重要な成熟が正常に起こる、子宮内での極めて重要な発達期間中に表れる。O'Rahilly R, Muller F. Human Embryology and Teratology New York: Wiley-Liss, 1996 を参照のこと。網膜の血管の成長を制御する上で、IGF−Iが血管内皮成長因子(VEGF)の作用に重要であることが最近実験的に示された。網膜の血管内皮細胞において、内皮細胞の生存および増殖に重要であるMAPKおよびAkt経路のVEGFによる最大の活性化に、 最低レベルのIGF−Iが必要である。Hellstrom A, Perruzzi C, Ju M, et al.、低レベルのIGF−Iは網膜内皮細胞内でのVEGFの生存シグナルを抑制する:臨床の未熟児網膜症との直接の相関、Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 5804-8、およびSmith LE, Shen W, Perruzzi C, et al.、インスリン様成長因子−1受容体による血管内皮成長因子依存性網膜新生血管形成の制御、Nature Medisine 1999; 5: 1390-5を参照のこと。Akt経路のVEGFによる最大の活性化に必要なIGF−Iレベルは、ROPを発症しなかった未熟児で認められたレベルと等しい。網膜の血管の発達におけるIGF−I系の重要な役割は、IGF−IまたはIGF−I受容体の遺伝的欠損のある患児が網膜の血管分岐点の数が少ないことが発見された臨床研究(Hellstrom、個人的な観察)で支持された。このようにこれらの新生児で観察されたIGF−Iの血清レベルの低減は、未熟に伴う罹患の一部の原因となり得る。
【0026】
羊水からの摂取も胎児にIGF−Iを提供できるが、胎児のIGF−Iは主に胎盤から得る。Bauer MK, Harding JE, Bassett NS, et al.、胎児の成長および胎盤機能、Molecular & Cellular Endocrinology 1998; 140: 115-20 を参照のこと。いくつかの研究は、子宮内において臍帯のIGF−Iレベルが、同じ最終月経後週数の未熟児の生後の血清レベルより高いことを示した。Lineham JD, Smith RM, Dahlenburg GW, et al.、未熟児および満期産新生児における循環インスリン様成長因子Iレベルの時系列的追跡、Early Hum Dev 1986; 13: 37-46 を参照のこと。未熟児において胃小腸の発達は出生時に十分に完了されておらず、したがって経腸的な栄養摂取には耐えられない可能性がある。IGF−Iは栄養摂取依存性因子であるため、一部の未熟児で見出される低い血清レベルは一般的な栄養摂取の不足で説明することができる。Smith WJ, Underwood LE, Keyes L, Clemmons DR、未熟児の栄養摂取をモニターするためのインスリン様成長因子(IGF−I)およびIGF−結合タンパク質の測定の使用、J Clin Endocrinol Metab 1997; 82: 3982-8 を参照のこと。しかしヒツジ胎仔において、経腸的IGF−I投与が胃小腸の発達を高めることが示されたため、外因的IGF−Iおよび適当な一般的な栄養摂取の併用が、早産後の最適な発達を得るために必要となり得る。Kimble RM, Breier BH, Gluckman PD, Harding JE、食道結さつしたヒツジの胎仔において経腸的なIGF−Iが胎子の成長および胃小腸の発達を高める、Journal of Endocrinology 1999; 162: 227-35を参照のこと。
【0027】
定義
“早産の(preterm)”または“早産(preterm birth)”または“未熟児(prematurity)”は在胎40週前または患児の在胎週数の平均体重より10%以上少ない体重の患児の出生をいう。
【0028】
“IGF−I”はウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、およびヒト、好ましくはヒトを含むあらゆる種から、そして外因的投与を指す場合には天然、合成、または組み換えにかかわらずあらゆる原料から得られるインスリン様成長因子をいうが、ただしIGF−IはIGF結合タンパク質に適当な部位で結合するものとする。IGF−Iは組み換えにより、例えばPCT出願公開WO 95/04076に記載されているように製造することができる。
【0029】
“IGFBP”または“IGF結合タンパク質”はインスリン様成長因子結合タンパク質ファミリーに含まれ、循環系に存在するかどうかにかかわりなく(すなわち血清中または組織中で)IGF−Iと会合または結合または複合体化する、タンパク質またはポリペプチドをいう。前記結合タンパク質は受容体を含まない。本定義にはIGFBP−1、IGFBP−2、IGFBP−3、IGFBP−4、IGFBP−5、IGFBP−6、Mac25(IGFBP−7)、およびプロスタサイクリン刺激因子(PSF)または内皮細胞に特異的な分子(endothelial cell-specific molecule)(ESM−1)、ならびにIGFBP群と高い相同性のあるその他のタンパク質を含む。Mac25は例えばSwisshelm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 4472-4476 (1995)およびOh et al., J. Bio. Chem., 271: 30322-30325 (1996)に記載されている。PSFはYamauchi et al., Biochemical Journal, 303: 591-598 (1994)に記載されている。ESM−1はLassalle et al., J. Biol. Chem., 271: 20458-20464 (1996)に記載されている。同定されているその他のIGFBPについては、例えば1990年6月27日に公開されたEP375,438;1990年5月23日に公開されたEP369,943;1989年10月5日に公開されたWO89/09368;Wood et al., Molecular Endocrinology, 2: 1176-1185 (1988); Brinkman et al., The EMBO J., 7: 2417-2423 (1988); Lee et al., Mol. Endocrinol., 2: 404-411 (1988); Brewer et al., BBRC, 152: 1289-1297 (1988); 1988年12月7日に公開されたEP294,021;Baxter et al., BBRC, 147: 408-415 (1987); Leung et al., Nature, 330: 537-543 (1987); Martin et al., J. Biol. Chem., 261: 8754-8760 (1986); Baxter et al., Comp. Biochem. Physiol., 91B: 229-235 (1988); 1989年9月21日に公開されたWO89/08667;1989年10月19日に公開されたWO89/09792;およびBinkert et al., EMBO J., 8: 2497-2502 (1989)を参照のこと。
【0030】
“IGFBP−3”はインスリン様成長因子結合タンパク質3である。IGFBP−3はインスリン様成長因子結合タンパク質ファミリーのメンバーである。IGFBP−3はウシ、ヒツジ、ブタおよびヒトを含むあらゆる種から、天然の配列または変異体の形(自然に発生する対立遺伝子の変異体を含むがこれに限定されない)で得ることができる。IGFBP−3は、天然、合成または組み換えであるかどうかにかかわらず、あらゆる原料から得られるが、ただし適当な部位でIGF−Iと結合するものとする。IGFBP−3は組み換えにより、例えばPCT出願公開WO95/04076に記載されているように製造することができる。
【0031】
当明細書で使用される場合“治療組成物”は、IGF−I、その類似体、またはその結合タンパク質、IGFBP−3と組み合わせてのIGF−I(IGF−I/IGFBP−3複合体)を含むものと定義する。治療組成物はまた他の物質、例えば水、ミネラル、担体例えばタンパク質、および当該技術分野の技術者に公知のその他の添加物も含むことができる。
【0032】
IGF−Iの“類似体”は、ヒトまたは動物においてIGF−Iと同じ治療効果を有する化合物である。これらは自然に発生するIGF−I類似体(例えばtruncated(切断された)IGF−I)またはIGF−Iのあらゆる公知の合成類似体も存在し得る。例えばIGF−I類似体化合物に関しては米国特許第5,473,054号を参照のこと。
【0033】
IGF−Iの“アゴニスト”は、哺乳類および特にヒトのIGF、特にIGF−Iの血清レベルおよび組織レベルを増加させることのできる、ペプチドを含む化合物である。例えばIGFアゴニスト分子に関しては米国特許第6,251,865号を参照のこと。
【0034】
当明細書で使用される場合“発達遅滞”は、発達の評価指標を達成する精神的な進歩が遅くなる可能性がある、異常な神経発生を意味するものとする。発達遅滞は症例によっては脳波で決定することができる。
【0035】
本発明は1つの側面において、在胎40週前または患児の在胎週数の平均体重より10%以上少ない体重で生まれた同患児における、早産による合併症の発症リスクを決定する方法を提供する。当方法は、血清IGF−Iおよび/またはIGF結合タンパク質レベルを同患児の出生後に測定して、IGF−I、またはIGF−Iと結合することのできるIGF結合タンパク質のレベルを得ること;および前記IGF−I、またはIGF−Iと結合することのできるIGF結合タンパク質のレベルを、子宮内での同じ在胎週数の平均レベルに基づくIGF−IまたはIGF−I結合タンパク質の子宮内ベースラインレベルと相関させることを含み、IGF−IまたはIGF−Iと結合することのできるIGF結合タンパク質のレベルが、子宮内在胎週数平均レベル以下の場合は、同患児は早産による合併症を発症するリスクが増加していることを示すものとする。本発明の方法に適する早産による合併症は、未熟児網膜症、発達遅滞、精神遅滞、気管支肺形成不全、壊死性腸炎および脳室内出血を含む。
【0036】
IGF−IまたはIGF−Iと結合することのできるIGF結合タンパク質のレベルはまた、抗体を用いる方法、いわゆるリガンド仲介免疫機能法(ligand-mediated immunofunctional method)(LIFA)により測定することもできる。この方法は米国特許第5,593,844号に開示されており、同アッセイに使用できる抗体および他の物質および条件に関する同特許の開示を参照として援用する。
【0037】
適切な市販の入手可能なIGF抗体は、Biogenesis Ltd., Poole, Dorset, UKのNo.5345-0329および5345-0209; Chemicon International Inc., Temecula, CA, USAのGF006; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USAのSC-7144およびSC-1422;およびHarlan Sera-Lab Ltd., Loughborough, Leicestershire, UKのMAS974p を含む。
【0038】
本発明のもう1つの側面において、早産による合併症の患児を治療する方法、または早産による合併症を患児が発症することを予防する方法を提供する。当該方法は、子宮内の基準以下の血清IGF−Iレベルの患児に、有効量のIGF−Iまたはその類似体、またはそのアゴニストを投与して、患児のIGF−Iレベルを子宮内ベースラインレベルまで上昇させることを含む。子宮内ベースラインレベルとして好ましくは10μg/Lから150μg/Lの濃度まで上昇させるものとする。本発明の1つの態様において、IGF−Iまたはその類似体はIGF−Iと結合することのできるIGF結合タンパク質と組み合わせて投与する。好ましい態様において、IGF−Iと結合することのできるIGF結合タンパク質はIGF−I結合タンパク質3(IGFBP−3)である。IGF−Iまたはその類似体またはそのアゴニストは、皮下、筋肉内、静脈内、または経口投与することができる。経口投与が好ましい。
【0039】
本発明の方法は、未熟児合併症を有効に予防し正常な血管の発達を促進するため、生後直ちに開始することが好ましい。これはROPの治療に極めて重要である、というのは同疾患の過程におけるIGF−Iの増加の遅れが血管新生の遅れ、ROPの破壊的な段階を促進し得るからである。O'Rahilly R, Muller F. Human Embryology and Teratology. New York: Wiley-Liss, 1996およびSmith LE, Kopchick JJ, Chen W, et al.、虚血誘導性の網膜新生血管形成における成長ホルモンの本質的な役割、Science 1997; 276: 1706-9を参照のこと。血管新生されない網膜が低酸素をきたした後まで治療が遅れると、網膜の異常な新生血管形成を引き起こすことになる。
【0040】
IGF−Iもしくはその類似体もしくはそのアゴニスト、またはIGF結合タンパク質と組み合わせてのIGF−Iもしくはその類似体の投与は、IGF−Iの循環レベルを増加させることができる。したがってIGF−IまたはIGF結合タンパク質と組み合わせてのIGF−Iの投与は、低レベルの循環IGF−Iに伴う症候、障害、および症状の治療または予防に有用である。
【0041】
当該明細書で開示した本発明の方法は、IGF−I、その類似体もしくはそのアゴニスト、またはIGF結合タンパク質と組み合せたIGF−Iもしくはその類似体の複合体の、このような治療を必要とする新生児への非経口および経口投与を提供する。非経口投与は、静脈内(IV)、筋肉内(IM)、皮下(SC)、腹腔内(IP)、鼻腔内、および吸気ルートを含むが、これに限定されない。本発明の方法においてIGF−I、そのアゴニストまたはその類似体は、好ましくは経口投与する。IV、IM、SCおよびIP投与はボーラスでまたは注射により行うことができ、除放性埋め込み式の装置(ポンプ、除放性製剤、および機械的な装置を含むがこれに限定されない)により投与することもできる。製剤、ルートおよび投与法、および投与量は、治療する障害および患児の既往に依存することになる。一般には皮下注投与の用量は、静注または筋注投与する治療的に等価の用量より多くなる。好ましくは投与するIGF−Iまたはその類似体の用量は、体重あたり約25μg/kgから約2mg/kgである。より好ましくはIGF−I、そのアゴニスト、またはその類似体の用量は約50μg/kgから約1mg/kgである。
【0042】
等モル量のIGF−IおよびIGF結合タンパク質を含む組成物を使用することができる。好ましくはIGF−IおよびIGF結合タンパク質は投与前に複合体化させる。好ましくはこの複合体は、生理学的に適合する担体、例えば通常の生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水に溶かした、ほぼ等モル量のIGF−IおよびIGF結合タンパク質を混合することにより形成させる。より好ましくは組み換えヒトIGF−I濃縮液および組み換えヒトIGF結合タンパク質濃縮液を十分に時間をかけて混合し、当モル比の複合体を形成させる。最も好ましくは国際特許出願第WO96/40736号に記載されているように、組み換えヒトIGF−Iおよび組み換えヒトIGF結合タンパク質を結合させて精製中に複合体を形成させる。
【0043】
非経口または経口投与用には複合体の組成物は半固体または液体の製剤、例えば液体、懸濁液等とすることができる。生理学的に適合する担体は、使用する投与量および濃度でレシピエントに毒性のない、そして製剤中の他の成分と適合するものである。例えば製剤は好ましくは、ポリペプチドに有毒であることが知られている酸化剤および他の化合物を含まない。したがって生理学的に適合する担体は、通常の生理食塩水、血清アルブミン、5%デキストロース、血漿製剤、および他のタンパク質含有溶液を含むがこれに限定されない。任意に同担体はまた界面活性剤または表面活性物質を含んでもよい。
【0044】
本発明のなおもうひとつの側面において 早産による合併症を治療するための治療組成物の製造における、IGF−I、そのアゴニスト、またはその類似体の使用を提供する。
最後に包装材および同包装材に内包される医薬剤を含む製造品もまた提供する。包装材には、早産に伴う合併症を治療および/または予防するため、医薬剤を十分な期間有効な用量で投与できることを示すラベルを含む。同医薬剤はIGF−I、そのアゴニストまたはその類似体を、医薬的に受容可能な担体と共に含む。
【0045】
治療への適用としてIGF−Iまたはその類似体を単独で、または1つまたはそれ以上の受容可能なその担体および任意に他の治療成分と共にIGF−Iまたはその類似体を含む医薬組成物の一部として、患児に適切に投与することができる。担体は、製剤の他の成分と適合し、そのレシピエントに有害ではないという意味で“受容可能”でなければならない。
【0046】
本発明の医薬組成物は経口、経鼻、局所(頬からおよび舌下を含む)、または非経口(皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含む)投与に適するものを含む。製剤は簡便なようにユニット投与の形、例えば錠剤および持続的に放出するカプセル、およびリポソーム中にて提供することができ、薬学分野で公知のあらゆる方法で製造することができる。例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA (17th ed. 1985)を参照のこと。
【0047】
このような製造法には投与される成分である分子、例えば1つまたはそれ以上の補助的成分からなる担体と会合させるステップを含む。一般に組成物は活性成分を液体の担体、リポソーム、もしくは微細に粉砕された固体の担体またはその双方と均一および密接に会合させることにより製造し、その後必要なであれば生成物を成形する。
【0048】
経口投与に適する本発明の組成物は、個別のユニット、例えば予め決定された量の活性成分をそれぞれ含むカプセル、カシェ剤もしくは錠剤として;粉末もしくは顆粒として;水溶性の液体もしくは非水溶性の液体中の溶液もしくは懸濁液として;または水中油滴型エマルジョンもしくは油中水滴型エマルジョンとして、もしくはリポソーム中に封入およびボーラスとして、等で提供することができる。
【0049】
錠剤は、所望により1つまたはそれ以上の補助的成分と共に圧縮または成型して、製造することができる。圧縮錠剤は浮遊する形の活性成分、例えば粉末または顆粒を、所望により結合剤、滑剤、不活性希釈剤、保存剤、界面活性剤または分散剤と混合して、適切な機械で圧縮することにより製造することができる。成型錠剤は、不活性な液体希釈剤で湿らせた粉末状の化合物の混合物を適切な機械で成型することにより製造することができる。錠剤は所望により被覆したり刻み目をつけてもよく、また錠剤中の活性成分を徐放性または制御放出性であるように製剤化することもできる。
【0050】
局所投与に適する組成物は、香味性のベース、通常スクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントゴム中に成分を含むロゼンジ(lozenge);および不活性なベース、例えばゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアラビアゴム中に活性成分を含むトローチを含む。
【0051】
非経口投与に適する組成物は、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、および製剤を目的のレシピエントの血液と等張にする溶媒を含むことのできる、水性および非水性の殺菌注射溶液;および懸濁剤および増粘剤を含むことのできる水性および非水性の殺菌懸濁液を含む。製剤は、ユニット用量または複数ユニット用量を含む容器、例えば封入アンプルおよびバイアルにて提供することができ、使用直前に殺菌した液体の担体、例えば注射用の水を添加するだけでよい凍結乾燥の状態で保存することができる。殺菌された粉末、顆粒および錠剤から即席の注射溶液および懸濁液を調製することができる。
【0052】
本発明を例示することを目的とする以下の実施例により、本発明の特徴をさらに明らかにする。
【実施例】
【0053】
実施例1
試験の被験者
対象となり得るすべての患児は、出生時の最終月経後週数を基準としてROPおよび他の罹患を発症するリスクが高いものとした。GoteborgのThe Queen Silvia Children's Hospitalにて1999年12月から2001年5月までの間に最終月経後週数32週未満で生まれたすべての新生児を、本試験の対象となり得るものとした。除外基準は、生後の臨床的な追跡を最終月経後40週に相当する週数まで完了することができないこと、およびあらゆる顕著な先天的奇形とした。
【0054】
GoteborgのThe Queen Silvia Children's Hospitalで1999年12月から2001年5月までの間に99例の対象となり得る乳児が生まれた。48例の新生児は研究開始時までに調査者が両親に連絡を取ることができなかったため除外された(図1)。除外された小児の出生時の最終月経後週数の平均は30週だった;この群には出生時最終月経後週数27週未満の小児は含まれていなかった。51例の新生児が本試験に参加可能であると同定された。これら51例の患児すべての両親からその小児の本研究への参加の承認を得た。データ集積完了後、1例の新生児の両親によりデータ公表の承認が撤回され、結果的に除外された。生後最初の20日間に2例の新生児が死亡した。
【0055】
出生時最終月経後週数の中央値27.0週(範囲24.0−31.8週)の6組の双生児を含む総計48例の乳児が含まれた。すべての小児は新生児集中治療室に入院した。出生時在胎週数は、最終月経後16週に行った胎児の超音波に基づいた。27例の小児は先に報告された横断的IGF−I値およびROPに関する研究に含まれていた。Hellstrom A, Perruzzi C, Ju M, et al.、低レベルのIGF−Iは網膜内皮細胞内のVEGF生存シグナルを抑制する:臨床の未熟児網膜症との直接の相関、Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 5804-8を参照のこと。
【0056】
栄養摂取
すべての新生児は新生児科の未熟児に関するルーチーンにしたがって栄養摂取を行った。ヒト/母乳を増量しながら経口授乳を生後1日または2日の間に導入した。生後3日目に、予定された24時間の必要量の少なくとも半量の経口授乳に小児が耐えられなかった場合には、非経口栄養摂取を導入した。出生体重1500グラム以下の小児に与える母乳には、生後10日から新生児の体重が2000グラムになるまで、100ml母乳あたり0.8gプロテインを強化した(1週間かけて漸次導入した)。
【0057】
IGF−Iの分析
ROPの状態を知らせずに、誕生から新生児の退院まで毎週静脈血サンプル(0.5ml)を採血し、−20から−80℃で保存した。各乳児の血液サンプルはすべて同時に分析した。血清を1:50に希釈し、IGFBPを遮断したRIAにより、抽出を行わずに〜250倍の過剰IGF−II(Mediagnost GmbH, Tubingen, Germany)の存在下で、IGF−Iの測定を二つ組で行った。Blum WF, Breier BH、IGFおよびIGFBPのためのラジオイムノアッセイ、Growth Regulation 1994; 4:11-9を参照のこと。10.2μg/Lおよび34.5μg/Lのアッセイ内変動係数(CV)は各々15.7%および9.6%であった。10.2μg/Lおよび34.5μg/Lのアッセイ間CVは各々23.9%および12.1%であった。
【0058】
IGFBP−3の分析
血清IGFBP−3の本来の濃度を1:300に希釈し、二つ組で測定し、RIAを用いて決定した。Blum WF, Breier BH、IGFおよびIGFBPのためのラジオイムノアッセイ、Growth Regulation 1994; 4:11-9を参照のこと。1773ng/mlのアッセイ内およびアッセイ間CVは、各々6.1%および10.6%であった。
【0059】
罹患の評価
ROPはthe International Classification(著者不明、An International classification of retinopathy of prematurity(未熟児網膜症の国際的分類)an international committee(国際委員会)作成、British Journal of Ophthalmology 1984; 68: 690-7) にしたがって分類し、ステージ1(境界線)、ステージ2(隆線)、ステージ3(網膜外線維性血管の増殖を伴う隆線)、ステージ4(大半の網膜剥離)、およびステージ5(全網膜剥離)にさらに分割した。後部網膜の血管が拡張しているときは疾患“プラス”とした。本研究の目的に関しては、ROPをこの疾患のステージ1より高いあらゆるステージの存在と定義した。ROPの重症度はその最も進行したステージで分類した。ROPを発症していない、またはステージ1のROPの場合は、暦年齢5から6週から眼球が十分に血管新生されるまで、散瞳しての眼底検査を含むルーチーンのプロトコルにしたがって新生児の検査を行った。ROPステージ2またはそれ以上と診断された場合は、治療の有無にかかわらず症状が安定したと考えられるまで、疾患の重症度により週に1回または2回検査を行った。新生児の目は1%シクロジル(cyclogyl)で散瞳した後、間接的な検眼鏡検査により検査した。検査中は疼痛およびストレスを最小にするようにケアを行った。
【0060】
他の罹患の評価
気管支肺形成不全(BPD)の診断は、一連の胸部X線によるBPDの典型的な所見、および在胎36週での酸素補給の必要性に基づいた。Shenman AT, Dumn MS, Ohlsson A, Lennox K, Hoskins EM、未熟児における異常な肺の結果:新生児期の酸素の必要性からの予測、Pediatrics 1988; 82: 527-32を参照のこと。脳室内出血(IVH)(グレード2−4;周産期の脳の超音波による診断(Burstein J, Papile LA, Burstein R、未熟児における脳室内出血および水頭症:CTによるプロスペクティブな試験、AJR. American Journal of Roentgenology 1979; 132: 631-5))および手術にいたる腸穿孔を伴う壊死性腸炎(NEC)については各小児のカルテもまとめた。
【0061】
統計分析
ROPステージ0−1の小児とROPステージ2−3の小児との比較において、IGF−I>30μg/Lに達するまでにかかる生後からの時間、および最終月経後31−35週でのIGF−Iの測定の平均レベルを、Wilcoxon-Mann-WhitneyのU検定により分析した。重ロジスチック回帰分析をROP8について行った。モデルの可能な説明変数は、最終月経後周数または在胎週数(GA)、出生時体重(BW)および最終月経後31−35週中の各小児のIGF−I平均レベルとした。使用したモデルはロジット(ROPステージ>1=1、その他ROP=0)=α+β1×GA(週)+β2×31−35週の平均IGF−I(μg/L)とした。各小児の時系列的血清IGF−IレベルはIGF−Iパターンの評価で使用した。
【0062】
生後罹患は、罹患していない(ROPステージ0−1、BPDなし、IVHステージ0−1、およびNECなし)または生後罹患(ROPステージ2−4、BPD、IVHステージ2−4、またはNEC)に二分した。0.05未満のP値を有意とみなした。
【0063】
参加した新生児のデモグラフィックス
ROPを発症しない新生児(n=31)と比較したROPの新生児(n=17)のベースラインの特徴は、ROPの小児は在胎週数がより早く出生時体重がより低いことを示した(表1)。
【0064】
IGF−IおよびROPおよびその他の周産期罹患
48例の新生児の19例が早産に伴う生後罹患(ROP、IVH、BPDまたはNEC)があった。罹患した新生児19例のうち17例はROPを発症し、ROPの17例のうち13例はさらに他に罹患していた。総計11例がBPD、4例が手術にいたるNEC、そして4例がIVHであった。2例の小児だけがROPをさらに伴わない生後罹患(IVH)であった(表2)。ROPを発症しないまたは最小のROPの未熟児では、ROP群と比較して異なる時系列的IGF−Iパターンが見出された(図2)。ROPステージ0−1の未熟児(n=31)は、在胎週数31−35週にIGF−Iレベルのピークが認められたが、一方ROPステージ2−3の未熟児(n=17)は、ピークは認められずIGF−Iレベルは緩やかに上昇した(図2)。生後からIGF−Iが30μg/Lに達するまでの期間の中央値は、ROPステージ2−3を発症した新生児(n=17)の59日(範囲1−100日)に比較して、ROPステージ0−1(n=31)の新生児では16日(範囲0−53日)であった、(P<0.0001)、図2。在胎31−35週でのIGF−Iレベルの中央値は、生後罹患のない群(n=29)における38μg/L(範囲20−59μg/L)に比較して、ROPまたは他の罹患を伴う新生児(n=19)では26μg/L(範囲17−49μg/L)であった、P<0.0001。在胎週数33週で、ROPまたは他の罹患を伴う小児19例のうち4例はIGF−I値が30μg/L以上であり、一方15例の小児はIGF−I値は30μg/L以下であった。生後罹患のない29例の小児のうち25例の小児はIGF−I値が30μg/L以上であり、一方4例の小児が30μg/L以下であった、図3。したがって在胎33週でIGF−Iが30μg/L以下の未熟児は、ROPまたは他の生後罹患を発症する相対リスクが5.7(95%信頼区間2.2−14.6)であった。本試験の6組の双生児のうち、より重症の罹患を伴う1組は、最も低いIGF−I値を有していた(データは示さない)。
【0065】
最終月経後週数および出生時体重と比較した平均IGF−I
IGF−Iおよび最終月経後GAを含めた重回帰分析の結果は、ロジット(ROPステージ2−3)=23−0.18(31−35週の平均IGF−I μg/L)−0.65(GA/週)であった。最終月経後31−35週中の平均IGF−Iの5μg/L増加に伴うROPの相対リスクは、最終月経後週数を調製するとe-0.9=0.41であった。したがって最終月経後31−35週中の平均IGF−Iの5μg/L増加により、ROPステージ2−3のリスクは59%まで低減されたが、在胎週数を1週増加するとリスクは48%までの減少にとどまった(図4)。IGF−IおよびBWを含めた重回帰分析の結果は、ロジット(ROPステージ2−3)=10−0.16(31−35週の平均IGF−I μg/L)−0.62(BW/100グラム)であった。
【0066】
実施例2
IGF−1ノックアウトマウスにおける血管の成長の測定
これらの研究はARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Researchに准ずる。IGF−I null(欠損)マウス(IGF−I-/-)は、mixed C57/129svバックグラウンド上にヘテロのIGF−I−flox+/-(L/−)を持つマウスを同系交配させて作製した。Liu, J. L. & LeRoith, D. (1999) Endocrinology 140, 5178-84を参照のこと。この種は重篤な発達不全を伴う小型として生まれ、生まれた数頭のうち40%しか生後生存することはできない。これらの同腹子、L/LまたはL/−は実質的に同一で正常である。尻尾のDNAサンプルのPCRによる遺伝子の増幅およびサザンブロット分析は、既に報告されている方法で行った。Liu, J. L., Grinberg, A., Westphal, H., Sauer, B., Accili, D., Karas, M., & LeRoith, D. (1998) Mol Endocrinol 12, 1452-62を参照のこと。生後5日で5頭のIGF1-/-および6頭のIGF1+/+同腹マウスをと殺し、眼球を摘出し、そのままOCT中で冷凍し、連続切片(8μm)を作製した。蛍光Griffonia Bandereiraea Simplicifolia Isolectin B4(Vector Laboratories, Burlingame, California) で染色した瞳孔、視神経および血管より30切片を作製した。血管新生された網膜の長さは、視神経から神経節層表面に沿って血管の先端末までを測定し、視神経から鋸状縁までの網膜の全長さのパーセントで表わした。
【0067】
網膜の平面状の標本 (Flat Mount)
5頭のIGF−1-/-および5頭のIGF−1+/+同腹コントロールマウスを、4%パラホルムアルデヒド中のフルオレセイン−デキストランで心臓内灌流の後、生後5日で眼球を摘出した。D'Amato,R., Wesolowski,E. & Smith,L.E. (1993) Microvasc Res 46, 135-42を参照のこと。網膜を単離し、グリセロール−ゼラチンで平面状の標本を作製し、蛍光顕微鏡で撮影した。VEGF mRNAは標準的なプロトコルにより視覚化した。Pierce,E.A., Foley,E.D. & Smith,L.E. (1996) Arch Ophthalmol 114, 1219-28を参照のこと。
【0068】
レーザー捕獲マイクロダイセクション (Laser Capture Microdissection)
5頭のIGF−1-/-マウスおよび6頭のIGF−1+/+同腹コントロールマウス のOCT固定した眼球をクリオスタット内で8μm切片とし、コートしてないスライドグラスにのせた後、直ちに−80℃に保存した。凍結切片をのせたスライドグラスを直ちに70%エタノールで30秒間固定し、ヘマトキシリン(Meyers)およびエオシン(H/E)で染色し、その後70%、95%および100%エタノールで段階的に5秒間ずつ脱水し、最後にキシレンで10分間脱水した。一度空気乾燥した後、網膜切片の前方の無血管の1/3を、RPEに汚染されないようにPixCell II LCMシステム(Arcturus Engineering, Mountain View, California)でマイクロダイセクションを行った。各母集団は、捉えた細胞を顕微鏡により視覚化して決定したところ、95%以上“均一”であると推定された。4頭より多くのマウスからの40切片の素材を合わせて、RNAを単離し、記載のようにcDNAに変換し、特異的なcDNAをqRT−PCRにより定量した。
【0069】
RNA / cDNAの単離
IGF−1-/-およびコントロールのIGF−1+/+マウスのマイクロダイセクションした網膜をプールしたものから全RNAを単離した。Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J. & Rutter, W. J. (1979) Biochemistry 18, 5294-9を参照のこと。すべてのcDNAサンプルを一定分量取って−80℃で保存した。cyclophillinと比較したVEGF mRNAをIGF−1-/-およびコントロールのIGF−1+/+の網膜について測定した。
【0070】
VEGF発現の分析
VEGFおよび2つの変化していないコントロール遺伝子(cyclophillinおよび18s)を標的とするPCRプライマーを、Primer Express ソフトウェア(Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut)を用いて設計し、合成した(Oligo Therapeutics, Wiosonville, Oregon)。PCR反応中に生成された増副産物はゲルにより精製し、配列決定して所望の配列が選択されていることを確認した。遺伝子発現の定量分析はABI Prism 7700 Sequence Detection System(登録商標TaqMan)およびSYBR Green master mix kit(Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut) を用いて行った。VEGF:フォワードプライマー 5’−GGAGATCCTTCGAGGAGCACTT−3’(SEQ ID NO:1)、リバースプライマー 5’−GGCGATTTAGCAGCAGATATAAGAA−3’(SEQ ID NO:2);Cyclophillin:フォワードプライマー 5’−CAGACGCCACTGTCGCTTT−3’(SEQ ID NO:3)、リバースプライマー 5’−TGTCTTTGGAACTTTGTCTGCAA−3’(SEQ ID NO:4);18SリボソームRNA:フォワードプライマー 5’−CGGCTACCACATCCAAGGAA−3’(SEQ ID NO:5)、リバースプライマー 5’−GCTGGAATTACCGCGGCT−3’(SEQ ID NO:6)。
【0071】
臨床試験
IRBの承認を得たプロトコルにおいて、GoteborgのThe Queen Silvia Children's Hospitalにて1999年12月15日および2000年3月15日の間に生まれた、明らかな異常のない出生時在胎週数32週未満のすべての小児に、本試験への参加を求めた。書面で同意を得て、生後から退院まで毎週0.5mlの血液を採血した。血清IGF−Iは、IGFBPを遮断したRIAにより、抽出を行わずに〜250倍の過剰IGF−II(Blum, W. F., Breier, B. H. (1994) Growth Regulation 4, 11-9)(Mediagnost GmbH, Tubingen, Germany)の存在下で測定を二つ組で行った。濃度55、219および479μg/Lでのアッセイ内CVは各々8.1、4.4および4.5%また濃度55,219および479μg/Lでのアッセイ間CVは各々10.4、7.7、5.3%だった。
【0072】
ROP検査
間接的な検眼鏡を用いての散瞳による網膜検査を、年齢5から6週から網膜が十分に血管新生されるまで、または症状が安定したと考えられるまで、毎週または隔週で行った。プラス病(plus disease)および/またはステージ3 ROPの小児は寄り頻繁に検査を行った。ROPの変化はROPの国際分類にしたがって分類した。
【0073】
網膜内皮細胞およびAKTリン酸化の分析
ウシ網膜内皮細胞 (VEC Technologies, Rensselaer, New York) を用いた実験を4回行い、類似する結果が得られた。さらに先に記載されたように単離した別のウシ網膜内皮細胞の母集団でも類似した結果が得られた。Smith,L.E., Shen,W., Perruzzi,C., Soker,S., Kinose,F., Xu,X., Robinson,G., Driver,S., Bischoff,J., Zhang,B., Schaeffer,J.M. & Senger,D.R. (1999) Nature Medicine 5, 1390-5を参照のこと。AKTリン酸化の分析のため、細胞を完全培養培地(MCDB-131 Complete)(VEC Technologies, Rensselaer, New York)中で、ウシコラーゲンタイプ1(50μg/ml Vitrogen,(Cohesion Co., Palo Alto, California))でコートした24穴プレート上で集密になるまで培養した。集密状態において、細胞を2%ウシ胎児血清を含む内皮の基礎培地(EBM)(Clonetics, San Diego, California)に数日間移して、AKTのリン酸化のベースラインを低下させた。アッセイ当日無血清EBMに細胞を4時間移し、ベースラインをさらに低下させた後、記載のようにVEGF、IGF−1、またはその双方(R & D Systems, Minneapolis, Minnesota)により刺激した。細胞を電気泳動サンプルバッファーで溶解し、10%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動させ、記載されているように(同著書)電気ブロッティングを行った。ブロットはまた記載されているように(同著書)ホスホAKT抗体(Ser-473, Pharmingen, San Diego, California)、二次抗体、および化学発光基質で染色した。すべてのAKTを視覚化するため、追試のブロッティングを行い、リン酸化AKTおよび非リン酸化AKT双方と結合する抗体(H-136,Santa Cruz Biotechnology, San Diego, California)で染色した。
【0074】
IGF−1は正常な網膜の血管の成長に極めて重要である
IGF−1は正常な網膜の血管の成長に極めて重要であり、そのためROPの発症に極めて重要である(Flyme, J. T., O'Grady, G. E., Herrera, J., Kushner, B. J., Cantolino, S. & Milam, W. (1977) Arch Ophthalmol 95, 217-23;およびPenn, J. S., Tolman, B. L. & Henry, M. M.(1994) Invest Ophthlmmol Vis Sci 35, 3429-35)かどうかを検査するため、IGF−1-/-マウス(循環および局所双方のIGF−1を欠失している)およびその正常な同腹のコントロール(IGF−1+/+)の網膜の血管を調べた。IGF−Iの全身レベル(局所産生に対して)が網膜症に最も有意に寄与する。Spranger, J., Buhnen, J., Jansen, V., Krieg, M., Meyer-Schwickerath, R., Blum, W. F., Schatz, H. & Pfeiffer, A. F. H. (2000) Hormon & Metabolic Research 32, 196-200を参照のこと。
【0075】
マウスを生後5日(P5)にFITCデキストランで灌流し、眼球を摘出し、網膜を平面状の標本として横断的に調べた。正常なIGF−1レベルのIGF−1+/+コントロール(図1B)に比してIGF−1-/-マウス(図1A)の眼球には、有意な血管の成長遅滞が認められた。生後5日の視神経から末梢までの血管の長さの割合は、IGF−1-/-網膜では58±4.8%に対してIGF−1+/+コントロールでは70.3±5.8%で(P<0.001)、IGF−1が正常な血管の発達に極めて重要であり、新生仔期の低レベルのIGF−1が血管の成長遅滞の原因となり得ることを示した。
【0076】
VEGFは正常な血管の発達における重要な因子であり、成長する血管の先端の前方に見出される。Pierce, E. A., Foley, E. D., & Smith, L. E. (1996) Arch Ophthalmol 114, 1219-28; Stone, J., Itin, A., Alon, T., Pe'er, J., Gnessin, H., Chan-Ling, T. & Keshet, E. (1995) J Neurosci 15, 4738-47;および Alon, T., Hemo, I., Itin, A., Pe'er, J., Stone, J. & Keshet, E. (1995) Nature Medisine 1, 1024-8を参照のこと。血管は、VEGFが血管新生されていない網膜が前方(生理学的には低酸素)に成熟していく時に誘発され、その後血管が酸素を供給するようになると後方で抑制されるというVEGFの同行に関連して成長する(図2A)。VEGFの阻害は血管の成長遅滞の原因となり得る。Aiello, L. P., Pierce, E. A., Foley, E. D., Takagi, H., Chen, H., Riddle, L., Ferrara, N., King, G. L. & Smith, L. E. (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92, 10457-61; Robinson, G. S., Pierce, E. A., Rook, S. L., Foley, E., Webb, R. & Smith, L. E. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93, 4851-6; およびOzaki, H., Seo, M. S., Ozaki, K., Yamada, H., Yamada, E., Okamoto, N., Hofmann, F., Wood, J. M. & Campochiaro, P. A. (2000) American Journal of Pathology 156, 697-707を参照のこと。低レベルIGF−1の血管の成長阻害への効果がVEGF不在によるのかどうかを検査するため、生後5日のIGF−1-/-およびコントロールIGF−1+/+網膜の血管前方の領域のレーザーマイクロダイセクションを横断的に行い、qRT−PCRによりVEGF mRNAを調べた(図2B)。qRT−PCRによる測定では、IGF−1-/-およびIGF−1+/+コントロールの網膜双方の血管の前方に、cyclophillinのコントロールに匹敵する量でVEGFmRNAが存在していた。したがって低レベルのIGF−1はVEGFの抑制を通して血管の成長を阻害してはいない。Smith, L. E., Shen, W., Perruzzi, C., Soker, S., Kinose, F., Xu, X., Robinson, G., Driver, S., Bischoff, J., Zhang ,B., Schaeffer, J. M. & Senger, D. R. (1999) Nature Medicine 5, 1390-5およびSmith, L. E., Kopchick, J. J., Chen, W., Knapp,J ., Kinose, F., Daley, D., Foley, E., Smith, R. G. & Schaeffer, J. M. (1997) Science 276, 1706-9を参照のこと。IGF−1による調節はVEGFの下流にあるか、または血管の発達におけるVEGFの作用を許容しているかのいずれかである。このデータはまた、IGF−1不在下のVEGFは正常な網膜の血管の発達を刺激できないという仮説を支持する。
【0077】
低レベルIGF−1の長期化は血管の成長の抑制および増殖性ROPの双方に関与する
生後長期間低レベルのIGF−1は、未熟児における血管の成長の消失とそれに続くROPに関与するとの仮説を調べるため、ROPのリスクの高い在胎週数26から30週で生まれたすべての未熟児(n=31)に対して、生後毎週IGF−1血漿レベルをプロスペクティブに測定し、対応して網膜の検査を行った。ROPステージ0−4は国際分類 (Flynn,J.T. (1985) Ophthalmology 92, 987-94)にしたがって定義し、本研究ではROP2−5をROP、ROPステージ0−1をROP発症していないものと定義した。
【0078】
我々は血管の成長の消失が増殖性ROPに関与することを初めて立証した。Flynn, J. T., O'Grady, G. E., Herrera, J., Kushner, B. J., Cantolino, S. & Milam, W. (1977) Arch Ophthalmol 95, 217-23を参照のこと。正常な未成熟な網膜は、半透明の血管新生されている網膜からグレーの血管新生されていない網膜へと、両者間に明確な境界を持たずに漸次移行する。ROPでは、血管新生されている網膜と血管新生されていない網膜との間に、線または隆線(ridge)から成るはっきり観察される固定された境界が認められるようになる。ROPのすべての患児(n=10)に血管の見えない前方に区分線があった。ROPを発症しないすべての新生児(n=19)には隆線または区分線がなく、血管先端のより正常な成長を示していた(データは示さない)。
【0079】
出生からIGF−1が30ng/mlに達するまでの平均期間は、ROPを発症した新生児(n=10)の58日(範囲29−120日)と比較して、ROPを発症しない新生児(n=19)では19日(範囲1−79日)であり(Pは0.0001以下)、低レベルIGF−1の長期化がROPに関与するとの仮説を立証した。IGF−1は、より若い胎児では子宮内でより低レベルであり、そのため単純には在胎週数に関連するのであろう。しかし等しい在胎週数での平均IGF−1レベルは、34週における非ROPの43ng/ml(範囲11−58)に対してROPの25ng/ml(範囲21−35)の差で(P≦0.002)、ROPを発症しなかった新生児よりROPを発症した新生児の方が一貫して低レベルであった。在胎週数30−35週中のIGF−I最大値は、ROPの小児(38ng/ml(範囲28−54ng/ml))はROPのない小児(52ng/ml(範囲29−90ng/ml))より有意に低かった、P<0.04。ROPを発症したすべての小児において、ROPの増殖段階の開始はIGF−1レベルが>30ng/mlまでに増加する以前には起こらなかった。まとめるとROPの発症は長期間の低レベルIGF−1(<30ng/ml)に続いて、〜34−35在胎週に本研究のコホートにおける増殖性ROP開始の平均である、“閾値”(>30ng/ml)まで上昇することに強く関連していた。早期により高いIGF−1レベルの新生児はより正常な血管の発達を遂げ、ROPを発症しなかった(図3)。
【0080】
IGF−1は網膜内皮細胞におけるAKTの生存経路のVEGF活性化を支援する
ROPの後半の段階は、初めの血管の成長の休止に続く、在胎〜34週(新生児の生活週数にかかわりなく)での新生血管形成の突然の増殖を特徴とする。VEGFによる網膜血管の内皮細胞の生存および増殖の制御をIGF−1が支援する効果があるため、IGF−1が低レベルであることがVEGFに誘発される最大の内皮細胞機能を抑制すると仮定した。我々は先に、VEGFによるMAPK経路の最大の刺激にIGF−1が必要であり、細胞増殖に重要であることを示した。Smith, L. E., Shen, W., Perruzzi, C., Soker, S., Kinose, F., Xu, X., Robinson, G., Driver, S., Bischoff, J., Zhang, B., Schaeffer, J. M. & Senger, D. R. (1999) Nature Medicine 5, 1390-5を参照のこと。
【0081】
細胞の生存はROPの双方の段階にもまた極めて重要であるが、十分な濃度のVEGF(Cameliet, P., Lampugnani, M. G., Moons, L., Breviario, F., Compernolle, V., Bono, F., Balconi, G., Spagnuolo, R., Oostuyse, B., Dewerchin, M., Zanetti, A., Angellilo, A., Mattot, V., Nuyens, D., Lutgens, E., Clotman, F., de Ruiter, M. C., Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R., Lupu, F., Herbert, J. M., Collen, D. & Dejana, E. (1999) Cell 98, 147-57; Fujio, Y., & Walsh, K. (1999) Journal of Biological Chemistry 274, 16349-54; およびGerber, H. P., McMurtrey, A., Kowalski, J., Yan, M., Keyt, B. A., Dixit, V. & Ferrara, N. (1998) Journal of Biological Chemistry 273, 30336-43)またはIGF−1(Michell, B. J., Griffiths, J. E., Mitchelhill, K. I., Rodriguez-Crespo, I., Tiganis, T., Bozinovski, S., de Montellano, P. R., Kemp, B. E. & Pearson, R. B. (1999) Current Biology 9, 845-8)の刺激により内皮細胞内で達成することのできるAKT経路の活性化に関連している。しかしこれら2つのサイトカインがAKT活性化に相補的効果を及ぼす可能性については調べられていなかった。したがって網膜内皮細胞でのVEGFによるAKT活性化におけるIGF−1の効果を調べた。VEGF(10ng/ml)およびIGF−1(50ng/ml)は個々にAKTリン酸化の中程度の増加(2.5倍)を刺激するが、双方を合わせて5倍の増加を刺激することを発見した(図4)。しかしAKTリン酸化の刺激に対するVEGFおよびIGF−1の相補的作用は、IGF−1が10ng/mlに減少すると観察されなかった。したがってこれらのデータは、新生児のより正常な生理学的血中濃度にほぼ等しい50ng/mlのIGF−1が、VEGFと共に作用してAKTを活性化し(セリン473のリン酸化により示された)、それにより網膜の内皮細胞の生存を支援することを示す。反対にIGF−1が、ROPを発症するような未熟児に認められる血清レベルに匹敵する10ng/mlに減少すると、このようなVEGFとの相補性は観察されない。結論としてこのような患児において、VEGFが一定レベルで存在しているにもかかわらず、正常レベル以下のIGF−1がAKT活性化の低下および内皮細胞生存の低下をもたらすものと思われる。
【0082】
考察
これらの研究はIGF−1が血管の成長に必要であることを示し、早産後の網膜の血管の成長の休止に始まるROP疾患の過程を説明する。子宮内と生後との血管の成長の重大な相違は、未熟児では生後IGF−1が低下することである。Lineham, J. D., Smith, R. M., Dahlenburg, G.W., King, R., Haslam, R. R., Stuart, M.C. & Faull, L. (1986) Early Hum Dev 13, 37-46 を参照のこと。
本発明の発見は、未熟児において生後直ちにIGF−1が増加すれば、正常に血管を発達させ、ROPは起こらないことを示唆する。
【0083】
VEGFは血管の発達に有意な役割を担うことが示されたが、低レベルのIGF−1の存在下では十分に血管を成長させることはできない。Smith, L. E., Shen, W., Perruzzi, C., Soker, S., Kinose, F., Xu, X., Robinson, G., Driver, S., Bischoff, J., Zhang, B., Schaeffer, J. M. & Senger, D.R. (1999) Nature Medicine 5, 1390-5;およびSmith, L. E., Kopchick, J. J., Chen, W., Knapp, J., Kinose, F., Daley, D., Foley, E., Smith, R. G. & Schaeffer, J. M. (1997) Science 276, 1706-9を参照のこと。発達に伴い代謝の要求が高まると、ますます低酸素化の無血管の網膜内でVEGFが産生され、硝子体中のVEGFレベルが上昇する。Aiello, L. P., Avery, R. L., Arrigg, P. G., Keyt, B. A. Jampel, H. D., Shah, S. T., Pasquale, L. R., Thieme, H., Iwamoto, M. A., Park, J. E. & et al. (1994) N Engl J Med 331, 1480-7;およびMiller, J. W., Adamis, A. P. & Aiello, L. P. (1997) Diabetes Metab Rev 13, 37-50を参照のこと。ROPを発症しない新生児で起こるように、生後より急速にIGF−1が上昇すれば、成熟していく網膜に酸素を提供し、VEGF産生を調整する血管の成長が進行するため、VEGFは蓄積しない。Pierce, E. A., Foley, E. D., & Smith, L. E. (1996) Arch Ophthalmol 114, 1219-28;およびStone, J., Itin, A., Alon, T., Pe'er, J., Gnessin, H., Chan-Ling, T. & Keshet, E. (1995) J Neurosci 15, 4738-47を参照のこと。IGF−1が長期間低レベルであると、血管の成長が止まり、成熟していく無血管の網膜は低酸素になりVEGFが硝子体に蓄積される。高レベルのVEGFが存在する状態でIGF−1が閾値まで上昇すると、新しい血管(網膜の新生血管形成)の急速な成長が引き起こされる(図5)。IGF−1およびVEGFは、MARKおよびAKTシグナル伝達経路を通して内皮細胞の機能に相補的に作用するため、この急速な血管の成長は血管内皮細胞の生存および増殖の亢進に基づくものと思われる。特に今回のデータは、VEGFの最大の機能を促進するため、IGF−1(およびおそらくその他のサイトカイン)が最低レベルで必要であることを示す。
【0084】
本研究は、ROPの診断および治療への直接的な臨床的示唆を与えた。これらの発見は、どの乳児がROPを発症するかの予測に、IGF−1レベルを使用することができることを示唆する。ROPを発症する患児と発症しない患児間のIGF−1レベルのパターンの相違は、生後早期の血清IGF−1の増加がこの疾患を予防し得ることを示唆する。早産後、高レベルのIGF−1を含む羊水の摂取を含むIGF−1の可能な源泉が失われる。カロリー摂取の増加(17)、羊水の摂取を模倣したIGF−1の経口摂取(34)、またはIGF−1をより正常なレベルに上昇させるための静脈内への供給により、ROPを発症しない新生児に認められたレベルにまでIGF−1を増加させることができる。ROPは他の発達の問題にも相関するため、ROPを発症しない新生児のレベルにIGF−1レベルを増加させることはまた、神経学的発達 (Johnston, B. M., Mallard, E. C., Williams, C. E. & Gluckman, P. D. (1996) J Clin Invest 97, 300-8) および身体の成長(Kimble, R. M., Breier, B.H., Gluckman, P. D,. Harding, J. E. (1999)Journal of Endocrinology 162: 227-35)を改善することにもなる。
【0085】
IGF−1およびVEGFの双方はまた、ROPの第2段階または新生血管の段階でも重要である。著者不明、未熟児網膜症の国際的分類、国際委員会作成、British Journal of Ophthalmology 1984; 68: 690-7; Shennan AT, Dunn MS, Ohlsson A, Lennox K, Hoskins EM、未熟児における異常な肺の結果:新生児期の酸素の必要性からの予測、Pediatrics 1988; 82: 527-32; Burstein J, Papile LA, Burstein R、未熟児における脳室内出血および水頭症:CT.によるプロスペクティブな試験、AJR. American Journal of Roentgenology 1979; 132: 631-5; Smith, L. E., Shen, W., Perruzzi, C., Soker, S., Kinose, F., Xu, X., Robinson, G., Driver, S., Bischoff, J., Zhang, B., Schaeffer, J. M. & Senger, D. R. (1999) Nature Medicine 5, 1390-5;およびSmith, L. E., Kopchick, J. J., Chen, W., Knapp, J., Kinose, F., Daley, D., Foley, E., Smith, R. G. & Schaeffer, J. M. (1997) Science 276, 1706-9を参照のこと。IGF−1は網膜の新生血管形成に極めて重要である。Smith, L. E., Shen, W., Perruzzi, C., Soker, S., Kinose, F., Xu, X., Robinson, G., Driver, S., Bischoff, J., Zhang, B., Schaeffer, J. M. & Senger, D. R. (1999) Nature Medicine 5, 1390-5を参照のこと。したがってIGF−1を増加させるための早期の介入が正常な血管を成長させ、ROPの第2の破壊的な段階の可能性への発展を予防すると予測したが、VEGF蓄積後での遅い介入は網膜の新生血管形成を引き起こし、または増悪させることになり得る。
【0086】
本発明の精神および範疇から離れることなく、本発明を様々に修飾し多様化できることは、当該技術分野の技術者には明らかであろう。したがって本発明の修飾および多様化が、付記された請求項およびその均等範囲の範疇にある限り、本発明はそれらを包含するものとする。
【0087】
当該出願を通して引用した参考文献を参照して援用する。
【0088】
【表1】
【0089】
【表2】
【図面の簡単な説明】
【0090】
本明細書に援用しその一部を構成する添付の図は、図中の記述と共に本発明の態様を説明し、本発明の目的、利点、および原理を説明するものである。
【図1】図1は本発明の対象となる被件者を表わす。スキームは成長因子および生後罹患に関する試験に適した超未熟児99例を示す。在胎週数<27週の小児はすべてこの群に含まれた。
【図2】図2Aおよび図2Bは、未熟児網膜症(ROP)のない未熟児(図2A)(n=31)およびROPの未熟児(図2B)(n=17)における、各患児のIGF−Iレベルの時系列的パターンを示す。グレーの領域は、臍帯穿刺(cordo centesis)の技術および本研究で使用したのと類似するIGF−Iアッセイ18によるIGF−I値の90%信頼区間を示す。破線は1組の双生児の個々の時系列的IGF−I値を示す。
【図3】図3は、周産期罹患のない小児29例および周産期罹患の小児19例における、在胎33週の血清IGF−Iレベルを示す。水平の線はIGF−I濃度30μg/Lを示す。生後罹患のない29例の小児のうち25例が、しかし生後罹患の小児19例では4例のみが30μg/L以上の値であった。
【図4】図4は重ロジスティック回帰分析により推定される未熟児網膜症のリスクにおける、IGF−I血清レベルおよび最終月経後GAの相対的な影響を示す。出生時の最終月経後週数(24−32週)をグラフ内に示した。回帰分析は、出生時に最終月経後週数が24週の場合は、31−35週でのIGF−I平均レベル40μg/LでROP発症のリスクが50%(破線)になることを示す。しかし出生時に最終月経後周数が32週の場合には、IGF−Iレベル12μg/LでROP発症リスクが50%になる。
【図5】図5AおよびBは血管の成長におけるIGF−Iの阻害効果を示す。平面状にした全網膜の標本は、IGF−I+/+同腹子コントロール(図5B)と比較してIGF−I-/-マウス(図5A)は、血管の発達(明るい領域)の進行が遅いことを示す。
【図6】図6AおよびBは、成長している血管の前方の網膜のレーザーマイクロダイセクションを示す。図6Aでは、平面状にした網膜の標本で、成長している血管の前方にVEGFmRNAが視覚化されている。図6Bは、IGF−I-/-マウスおよびコントロールIGF−I+/+の双方の網膜の断面について、VEGFを含む領域(囲い部分)をレーザーマイクロダイセクションにより採取し、qRT−PCRによりシクロフィリンをコントロールとしてVEGF mRNA分析を行った結果を示す。
【図7】図7はROPの新生児およびROPを発症しない新生児における、等しい在胎週数での平均血清IGF−Iを示す。ROPの新生児(白丸)およびROPを発症しない新生児(黒丸)の平均IGF−Iレベルを、在胎週数に対して示す。エラーバーは平均の標準誤差を示す。
【図8】図8は全細胞溶解産物から調製し、ホスホAKT(Ser473)抗体、またはリン酸化の状態にかかわりなくAKTを認識する(全AKT)抗体のいずれかで染色した複製ブロットを示す。血清を除去して、AKTリン酸化ベースラインを低下させた後、細胞をVEGFおよびIGF−Iまたはその双方で示した時間で刺激した。
【図9】図9A−Dは、ROPにおけるIGF−I/VEGFによる血管の発達の制御のスキーム表示である。図9Aは、子宮内においてVEGFが血管の成長先端に認められることを示す。血管を成長させる十分量のIGF−1が存在している。図9Bは早産によりIGF−1が子宮内レベルを維持しておらず、血管の成長先端にVEGFが存在しているにもかかわらず、血管の成長が止まっていることを示す。内皮細胞生存経路(AKT)および増殖経路(MAPK)の双方とも抑えられている。低レベルIGF−1および血管の成長の休止により、血管先端に境界線が形成されている。(動物モデルおよび一部の未熟児で起こるように)高濃度酸素の暴露もVEGFを抑制し、血管の成長の阻害にさらに寄与し得る。図9Cは未熟児の成熟に伴い、発達したが血管新生されていない網膜が低酸素になることを示す。VEGFが網膜および硝子体で増加する。成熟に伴いIGF−1レベルが徐々に増加する。図9DはIGF−1レベルが在胎〜34週で閾値に達すると、硝子体中の高レベルVEGFに伴い、VEGFによる内皮細胞の生存および増殖が促進される。境界線で新生血管形成が次々に起こり、硝子体で成長する。VEGF硝子体レベルが低下すれば、正常な網膜の血管の成長を促進することができる。正常な血管の成長および血流により、酸素がVEGFの発現を抑制し、その結果過剰に血管が成長することはなくなる。低酸素(およびVEGFレベルの上昇)が持続すると、さらなる新生血管形成および線維増多による網膜剥離が起こり得る。
【図10】図10は未熟児網膜症における血清IGBF−3およびIGFの濃度を示す。
Claims (21)
- 以下を含む、在胎40週前または患児の在胎週数の平均体重より10%以上少ない体重で生まれた同患児における、早産による合併症の発症リスクを決定する方法:
(a)IGF−Iおよび/またはIGF結合タンパク質(IGF結合タンパク質はIGF−Iに結合することができる)の血清レベルを同患児の出生後に測定して、IGF−IまたはIGF結合タンパク質のレベルを得ること;および
(b)前記IGF−IまたはIGF結合タンパク質のレベルを、同じ在胎週数の子宮内での平均レベルに基づくIGF−IまたはIGF結合タンパク質の子宮内ベースラインレベルと相関させ、IGF−IまたはIGF結合タンパク質のレベルが子宮内在胎週数平均レベル以下の場合は、同患児の早産による合併症を発症するリスクの増加を示すものとする。 - 早産による合併症が、未熟児網膜症、発達遅滞、精神遅滞、気管支肺形成不全、壊死性腸炎、および脳室内出血からなる群から選択される請求項1の方法。
- IGF−Iおよび/またはIGF結合タンパク質の血清レベルが子宮内の基準以下の患児に、有効量のIGF−I、そのアゴニスト、またはその類似体を投与し、同患児のIGF−Iレベルを子宮内ベースラインレベルまで上昇させることを含む、早産による合併症の患者を治療する方法であって、子宮内ベースラインレベルを10μg/Lから150μg/Lとする当該方法。
- IGF−IまたはIGF−I類似体をIGF結合タンパク質(IGF結合タンパク質はIGF−Iに結合することができる)と組み合わせて投与する請求項3の方法。
- IGF結合タンパク質がIGFBP−3である請求項4の方法。
- IGF−I、そのアゴニスト、またはその類似体を皮下投与する請求項3の方法。
- IGF−I、そのアゴニスト、またはその類似体を静脈内投与する請求項3の方法。
- IGF−I、そのアゴニスト、またはその類似体を経口投与する請求項3の方法。
- IGF−I、そのアゴニスト、またはその類似体を筋肉内投与する請求項3の方法。
- 早産による合併症が、未熟児網膜症、発達遅滞、精神遅滞、気管支肺形成不全、壊死性腸炎、および脳室内出血からなる群から選択される請求項3の方法。
- IGF−Iおよび/またはIGF結合タンパク質(IGF結合タンパク質はIGF−Iと結合することができる)の血清レベルが子宮内の基準以下の患児に、有効量のIGF−I、そのアゴニスト、またはその類似体を投与し、同患児のIGF−Iレベルを子宮内ベースラインレベルまで上昇させることを含む、患者が早産による合併症を発症することを予防する方法であって、子宮内ベースラインレベルを10μg/Lから150μg/Lとする当該方法。
- IGF−IまたはIGF−I類似体をIGF結合タンパク質(IGF結合タンパク質はIGF−Iと結合することができる)と組み合わせて投与する請求項11の方法。
- IGF結合タンパク質がIGFBP−3である請求項12の方法。
- IGF−I、そのアゴニスト、またはその類似体を皮下投与する請求項11の方法。
- IGF−I、そのアゴニスト、またはその類似体を筋肉内投与する請求項11の方法。
- IGF−I、そのアゴニスト、またはその類似体を静脈内投与する請求項11の方法。
- IGF−I、そのアゴニスト、またはその類似体を経口投与する請求項11の方法。
- 早産による合併症の治療用医薬剤の製造におけるIGF−I、そのアゴニスト、またはその類似体の使用。
- 包装材および同包装材に内包された医薬剤を含む製造品であって、前記包装材が、早産に伴う合併症を治療および/または予防するために、前記医薬剤を十分な期間有効な用量で投与できることを示すラベルを含み、前記医薬剤がIGF−I、そのアゴニスト、またはその類似体を医薬的に受容可能な担体と共に含む、当該製造品。
- 医薬剤がIGF−Iまたはその類似体をIGF−I結合タンパク質と組み合わせて含む、請求項19の方法。
- IGF−I結合タンパク質がIGFBP−3である請求項20の方法。
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