CN113528688A - 微生物在制备用于诊断生长发育迟缓的产品中的应用 - Google Patents
微生物在制备用于诊断生长发育迟缓的产品中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113528688A CN113528688A CN202111058487.5A CN202111058487A CN113528688A CN 113528688 A CN113528688 A CN 113528688A CN 202111058487 A CN202111058487 A CN 202111058487A CN 113528688 A CN113528688 A CN 113528688A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- crib
- growth
- retardation
- product
- abundance
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pathology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及微生物在制备用于诊断生长发育迟缓的产品中的应用。更具体的,本发明公开了一种可用于预测或诊断生长发育迟缓的产品,所述的产品包括检测受试者的样本中Chlamydiales_bacterium_CRIB_32的含量或丰度的试剂。本发明为预测或诊断生长发育迟缓提供了新方法。本发明还公开了一种预防或治疗生长发育迟缓的药物组合物,所述的药物组合物包括能够降低Chlamydiales_bacterium_CRIB_32的含量或丰度的物质。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体涉及微生物在制备用于诊断生长发育迟缓的产品中的应用。
背景技术
随着早产儿重症监护室的建立及早产儿高级生命支持技术的广泛发展,早产儿的存活率普遍提高。但是,存活的早产儿中很多存在不同程度的宫内及宫外生长发育迟缓的状况。宫内生长发育迟缓使得早产儿早期营养储备不足,生长发育落后,多脏器发育不成熟,导致多种疾病发生,部分继续宫外生长发育迟缓。同样,宫外发育迟缓的早产儿由多种因素导致,不仅影响到体格的生长发育,更会影响疾病的发生发展,最终导致脑发育受影响、住院时间延长、远期发育落后及慢性代谢疾病等。研究早产儿宫内及宫外生长发育迟缓的相关因素,旨在及时进行诊断、干预,减少早产儿宫内,尤其宫外生长发育迟缓的发生,促进早产儿的健康生长,提高生存质量,减少远期疾病的发生。
人体定植着数目庞大、结构复杂的微生物群落,其基因总和称为人体微生物组,也称为“元基因组”。人体微生物在与宿主共进化过程中形成共生关系,在调节宿主的消化吸收、代谢和免疫反应等各方面发挥重要作用。人体微生物与人体多种疾病如感染性疾病、肥胖症、糖尿病、肝病、冠心病以及肿瘤等存在密切关系。从微生物组层面探索人体微生物与感染性疾病和多种慢性疾病发生发展的关系,寻找多种疾病诊断标志物和治疗的潜在靶标,开发新型的针对微生物为靶点的药物,将可能为目前的疾病诊断或治疗提供新的策略。目前关于微生物与生长发育迟缓的相关研究报道较少,研究微生物与生长发育迟缓之间的关系,有望找到合适的、便捷的用于诊断或治疗生长发育迟缓的生物标志物。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种可用于预测或诊断生长发育迟缓的产品;
本发明的第二目的在于提供一种预防或治疗生长发育迟缓的药物组合物;
本发明的第三目的在于提供一种诊断对象是否患有生长发育迟缓或预测对象是否存在患生长发育迟缓的风险的系统或装置。
为实现上述目的,本发明采用了如下技术方案:
本发明一方面提供了一种可用于预测或诊断生长发育迟缓的产品,所述的产品包括检测受试者的样本中Chlamydiales bacterium CRIB 32的含量或丰度的试剂。
进一步,所述的受试者为人。
进一步,所述的人为早产儿。
进一步,所述的早产儿为胎龄小于32周的极早产儿。
进一步,所述的试剂包括通过16S测序、全基因组测序、定量聚合酶链反应、PCR-焦磷酸测序、荧光原位杂交、微阵列或PCR-ELISA检测受试者的样本中Chlamydialesbacterium CRIB 32的含量或丰度的试剂。
进一步,所述的试剂包括对Chlamydiales bacterium CRIB 32具有特异性的引物、探针、反义寡核苷酸、适配体或抗体。
在一些实施方案中,所述样品是来自人类个体的粪便、血液、唾液、颊拭子、尿液或体液。
进一步,所述的样本为粪便。
进一步,所述的产品包括芯片、试剂盒、试纸。
进一步,所述的生长发育迟缓包括宫内生长发育迟缓、宫外生长发育迟缓。
进一步,所述的生长发育迟缓为宫外生长发育迟缓。
本发明另一方面提供了Chlamydiales bacterium CRIB 32在制备前面所述的产品中的应用。
本发明另一方面提供了一种预防或治疗生长发育迟缓的药物组合物,所述的药物组合物包括能够降低Chlamydiales bacterium CRIB 32的含量或丰度的物质。
进一步,所述的生长发育迟缓包括宫内生长发育迟缓、宫外生长发育迟缓。
进一步,所述的生长发育迟缓为宫外生长发育迟缓。
本发明另一方面提供了一种诊断对象是否患有生长发育迟缓或预测对象是否存在患生长发育迟缓的风险的系统或装置,所述的系统或装置包括:
分析单元,所述单元适于测量受试者样本中Chlamydiales bacterium CRIB 32的含量或丰度;和
评估单元,其包含存储的参考和数据处理器,所述数据处理器已经实现了用于比较分析单元测量的Chlamydiales bacterium CRIB 32的含量或丰度与存储的参考的算法,由此诊断受试者是否患有生长发育迟缓或预测对象是否存在患生长发育迟缓的风险。
进一步,所述的生长发育迟缓包括宫内生长发育迟缓、宫外生长发育迟缓,优选为宫外生长发育迟缓。
进一步,所述的受试者为人。
进一步,所述的人为早产儿。
进一步,所述的早产儿为胎龄小于32周的极早产儿。
本发明另一方面提供了一种筛选预防或治疗生长发育迟缓的候选药物的方法,所述的方法包括:
用待筛选物质处理表达或含有Chlamydiales bacterium CRIB 32的体系;检测所述体系Chlamydiales bacterium CRIB 32的含量或丰度;其中,若所述待筛选的物质可以降低Chlamydiales bacterium CRIB 32的含量或丰度,则表明该候选物质是预防或治疗生长发育迟缓的候选药物。
进一步,所述的生长发育迟缓包括宫内生长发育迟缓、宫外生长发育迟缓。
进一步,所述的生长发育迟缓为宫外生长发育迟缓。
本发明另一方面提供了Chlamydiales bacterium CRIB 32在筛选预防或治疗生长发育迟缓的候选药物中的应用。
进一步,所述的生长发育迟缓包括宫内生长发育迟缓、宫外生长发育迟缓。
进一步,所述的生长发育迟缓为宫外生长发育迟缓。
本发明还提供了一种诊断生长发育迟缓的方法,所述方法包括:
确定受试者的样本中Chlamydiales bacterium CRIB 32的丰度或含量,以及基于受试者的样本中Chlamydiales bacterium CRIB 32的丰度或含量确定受试者是否患有生长发育迟缓或存在患生长发育迟缓的风险。
进一步,所述的生长发育迟缓包括宫内生长发育迟缓、宫外生长发育迟缓。
进一步,所述的生长发育迟缓为宫外生长发育迟缓。
本发明的优点和有益效果:
本发明提供了一种可用于诊断生长发育迟缓的产品,所述的产品包括检测受试者的样本中Chlamydiales bacterium CRIB 32的含量或丰度的试剂。
本发明首次公开了Chlamydiales bacterium CRIB 32与生长发育迟缓的相关性,为生长发育迟缓的诊断、预防或治疗提供可靠依据。
附图说明
图1为Chlamydiales bacterium CRIB 32在EUGR患儿中的丰度图。
具体实施方式
以下,将详述本发明。
在本发明中,通过分析微生物群落的组成对生长发育迟缓的影响,结果确认Chlamydiales bacterium CRIB 32的增加会对生长发育迟缓产生影响。因此,在本发明中,可以通过从受试者的样本中检测Chlamydiales bacterium CRIB 32来诊断受试者患生长发育迟缓的风险,为此,提供了可用于预测或诊断生长发育迟缓的产品,所述的产品包括检测受试者的样本中Chlamydiales bacterium CRIB 32的含量或丰度的试剂。
本申请所用的术语“丰度”是指生物样品中目标微生物的数量的量度。“丰度”也被称为“负载”。生物样品内目标核酸序列丰度的定量可能是绝对的或相对的。“相对定量”通常是基于一个或多个内部参考基因,即来自参考菌株的16S rRNA基因,比如使用通用引物并且将目标核酸序列的丰度表达为总细菌16S rRNA基因拷贝的百分比或通过大肠杆菌16SrRNA基因拷贝归一化而测定的总细菌。“绝对定量”通过与DNA标准进行比较或通过DNA浓度归一化来给出目标分子的确切数目。
在本说明书中,所述的检测受试者的样本中Chlamydiales bacterium CRIB 32的含量或丰度的试剂包括对Chlamydiales bacterium CRIB 32具有特异性的引物、探针、反义寡核苷酸、适体、抗体等。
优选地,在本发明中,所述试剂可以是能够检测Chlamydiales bacterium CRIB32的引物。优选地,用所述引物对Chlamydiales bacterium CRIB 32的基因组序列进行特异性检测,并且所述引物不与其他微生物的基因组序列进行特异性结合。
术语“探针”或“引物”是指其与样品的特异性杂交可被检测的一种或多种核酸片段。视探针或引物将被用于的特定技术而定,它可具有任何长度。举例来说,PCR引物的长度通常在10与40个核苷酸之间,而用于例如DNA印迹的核酸探针的长度可超过100个核苷酸。探针或引物可未标记或如下所述标记以使它与靶标序列的结合可被检测(例如用FRET供体或接受体标记)。可基于染色体的一个或多个特定(预先选择)部分(例如一个或多个克隆)、分离的完整染色体或染色体片段、或一批聚合酶链反应(PCR)扩增产物来设计探针或引物。固定于靶标元件上的核酸的长度和复杂度对本发明来说并不是关键的。技术人员可调整这些因素以提供给定杂交和检测程序的最优杂交和信号产生,并且提供在不同基因或基因组位置之间的所需分辨。
在本说明书中,术语“16S rRNA”是指构成原核生物核糖体的30S亚基的、所有物种共有的保守区和能够对特定物种进行分类的高变区的rRNA,因此可以通过碱基序列分析来鉴定微生物的存在。特别地,由于同源物种之间几乎没有多样性,而不同物种之间则具有多样性,因此可以通过比较16S rRNA的序列来有效地鉴定原核生物。此外,由于16S rDNA是编码16S rRNA的基因,因此也可以使用16S rDNA来鉴定微生物。
如本文所用,术语“抗体”是指能够结合存在于抗原上的表位的免疫球蛋白分子。所述术语意图不仅涵盖完整免疫球蛋白分子,如单克隆和多克隆抗体,而且也涵盖双特异性抗体、人源化抗体、嵌合抗体、抗特发性(抗ID)抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab’)片段、融合蛋白和前述各物的包含具有所需特异性的抗原识别点的任何修饰形式。
包含本发明的微生物检测试剂的产品可以试剂盒的形式实现。本发明的试剂盒不仅包含引物、探针、反义寡核苷酸、适体或抗体等用于检测所述微生物的检测试剂,并且还包括一种或多种适用于分析方法的其他成分组合物、溶液或装置。
在一个具体实施例中,在本发明中,包含对Chlamydiales bacterium CRIB 32具有特异性的引物的试剂盒可以是含有用于进行PCR等的扩增反应的基本元件的试剂盒。例如,用于PCR的试剂盒可以包括试管或其他合适的容器、反应缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTP)、酶(如Taq聚合酶和逆转录酶)、脱氧核糖核酸酶(DNase)、核糖核酸酶(RNAse)抑试剂、DEPC-水、或无菌水等。
本发明还提供了一种预防或治疗生长发育迟缓的药物组合物,所述的药物组合物包括能够降低Chlamydiales bacterium CRIB 32的含量或丰度的物质。
所述的药物组合物还包含药学上可接受的载体,所述的药学上可接受的载体包含通常用于制剂的载体,例如盐水、灭菌水、林格氏溶液(Ringer's solution)、缓冲盐水、环糊精、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、脂质体等,但本发明不受限于此,并且如果需要,还可以包含其它一般添加剂,例如抗氧化剂、缓冲溶液等。此外,可以通过另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂、润滑剂或其它来配制注射用制剂,例如水溶液、悬浮液、乳液等,丸剂,胶囊,颗粒剂或片剂。关于合适的药学上可接受的载体和制剂,制剂可优选根据Remington's标准(Remington'Pharmaceutical Science,Mack Publishing Company,Easton PA)中公开的方法根据每种成分进行配制。
根据使用目的,本发明的药物组合物可以口服或肠胃外给药(例如,静脉内给药、皮下给药、腹膜内给药或局部给药),并且其合适的剂量可以根据患者的病症和体重、疾病的严重程度、药物类型、给药途径和给药时间而变化,但可以由本领域普通技术人员适当选择。
本发明的药物组合物以药学有效量给药。本文使用的术语“药学有效量”是指足以以适用于医疗治疗的合理利益/风险比治疗疾病的量,并且有效剂量水平可以根据包含患者疾病类型、疾病严重程度、药物活性、对药物的敏感性、给药时间、给药途径、排泄率、治疗期和同时使用的药物、以及在医疗领域中众所周知的因素来确定。根据本发明的药物组合物可以作为单独的治疗剂或与其它治疗剂组合施用,可以与现有治疗剂连续或同时施用,并且可以以单一剂量或多剂量施用。考虑所有上述因素,以最小量施用所述组合物以实现最大效果而无副作用,这是重要的,并且这可以由本领域普通技术人员容易地确定。
特别地,根据本发明的组合物的有效量可以根据患者的年龄、性别和体重而变化。通常,药物组合物可以每(kg)体重每天或每隔一天0.001mg至150mg,优选0.01mg至100mg的量施用,或可以每日一次或三次施用。然而,该剂量可以根据给药途径、肥胖的严重程度、性别、体重、年龄等而增加或减少,因此该剂量不意图以任何方式限制本发明的范围。
除非另外定义,否则本文所用的技术和科学术语具有与由本领域普通技术人员通常所理解相同的含义。参见例如Lackie,DICTIONARY OF CELL AND MOLECULAR BIOLOGY,Elsevier(第4版2007);Sambrook等,MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL,ColdSprings Harbor Press(Cold Springs Harbor,NY 1989)。
本申请所用的术语“ROC曲线”或“接受者操作特性曲线”是指展示二元分类器系统的性能随着其辨别阈值的变化的图形曲线。通过在各种阈值设置下绘制真阳性率对假阳性率的曲线来创建该曲线。真阳性率也被称为灵敏度。假阳性率计算为1-特异性。因此,ROC曲线是一系列截断值范围内的真阳性率对假阳性率(灵敏度vs(1-特异性))的图形显示以及选择最佳截断值进行临床使用的方式。将准确度表示为ROC曲线下面积(AUC),为比较测试性能提供了有用的参数。接近1的AUC表示该测试高度灵敏并且具有高度特异性,而AUC接近0.5则表明该测试既不灵敏也不具有特异性。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1 宫外生长发育迟缓患儿肠道菌群分析
一、实验方法
1、研究设计
本研究招募了2018年1月至12月首都医科大学附属北京友谊医院新生儿重症监护室收治的胎龄小于32周的极早产儿,最终纳入22名极早产儿。在出生后2周评估身体发育情况,按体重分为宫外生长发育迟缓组(EUGR组)和正常生长组(对照组)。同时,采集粪便样品于-80℃保存,对肠道菌群进行高通量16S rRNA测序,分析极早产儿子宫外生长发育迟缓与肠道微生态的关系。本研究经首都医科大学附属北京友谊医院伦理委员会批准。婴儿的父母(或负责任的亲属)给予书面知情同意。所有婴儿给予相同的喂养策略:所有早产儿在入院后24小时内断奶。早期微量喂养(10-15 mL/kg/d),如可耐受,逐渐增加乳量,速度为15-20 mL/kg/d。当不能完全肠内喂养时给予肠外营养支持。
2、分组标准
根据早产儿Fenton曲线图评估身体发育情况:体重低于相应胎龄的第10百分位水平或从出生至给定时间之间体重下降>2SD的婴儿为被认为患有EUGR,而那些在第10百分位到第90百分位之间的婴儿视为生长正常。
3、纳入和排除标准
(1)纳入标准:
①出生后立即入住新生儿重症监护室;
②胎龄28~32周,单胎;
③住院时间> 28天;
④出生后5天以内抗生素治疗(阿莫西林克拉维酸钾/哌拉西林他唑巴坦)。
(2)排除标准:
①严重先天性畸形和先天性遗传代谢性疾病;
②自动出院,出院后预后不明确;
③数据不完整;
④粪便标本采集过程中接受过益生菌治疗;
⑤混合喂养。
4、样本收集
收集早产婴儿的粪便标本。严格按照无菌操作原则,使用一次性无菌粪便容器于婴儿出生后第14、28天采集粪便标本,将粪便标本置于-80℃保存。然后将它们送到Allwegene技术公司进行DNA提取、测序和生物信息分析。
5、16S rRNA测序
(1)基因DNA的提取
完成基因组DNA抽提后,利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。
(2)PCR扩增
按指定测序区域,合成带有barcode的特异引物,或合成带有错位碱基的融合引物。
PCR 采用TransGen AP221-02:TransStart Fastpfu DNA Polymerase;
全部样本按照正式实验条件进行,每个样本3个重复,将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测,使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物,Tris_HCl洗脱;2%琼脂糖电泳检测。
(3)Miseq文库构建
a.连接“Y”字形接头;
b.使用磁珠筛选去除接头自连片段;
c.利用PCR扩增进行文库模板的富集;
d.氢氧化钠变性,产生单链DNA片段。
(4)Miseq上机测序
a.DNA片段的一端与引物碱基互补,固定在芯片上;
b.另一端随机与附近的另外一个引物互补,也被固定住,形成“桥 (bridge)”;
c.PCR扩增,产生DNA簇;
d.DNA扩增子线性化成为单链;
e.加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP,每次循环只合成一个碱基;
f.用激光扫描反应板表面,读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类;
g.将“荧光基团”和“终止基团”化学切割,恢复3'端粘性,继续聚合第二个核苷酸;
h.统计每轮收集到的荧光信号结果,获知模板DNA片段的序列。
6、数据分析
(1)数据处理过程和参数
Miseq测序得到的是Pair-End(PE)双端序列数据,对测得的Fastq数据进行质控处理,最终得到优质的Fasta数据。
具体参数如下:
a.利用Trimmomatic、Pear对Fastq数据进行质控。对于trimmomatic采用滑动窗口策略,窗口大小设置50bp,平均质量值为20,最小保留序列长度为120,Pear用于去除具有N的序列;
b.利用Flash、Pear根据PE的overlap关系对两端序列进行拼接(merge)处理,最小overlap设置10bp,错配率为0.1,得到Fasta序列;
c.根据已知数据库用uchime方法比对去除Fasta序列的嵌合体,对于未知数据库使用自比对(denovo)方法进行去除,同时去除不合要求的短序列。
软件:Trimmomatic(v0.36)、Pear(v0.9.6)、Flash(v1.20)、Vsearch(v2.7.1)
(2)有效数据统计
下机数据(Raw PE),在去除barcode和primer并拼接后得到raw_tags,raw_tags经进一步去除嵌合体、短序列后得到优质序列clean_tags。
(3)OTUs聚类分析
OTUs(Operational Taxonomic Units)是在系统发生学或群体遗传学研究中,为了便于进行分析,人为给某一个分类单元(品系,属,种、分组等)设置的同一标志。要了解一个样品测序结果中的菌种、菌属等数目信息,就需要对序列进行归类操作(cluster)。通过归类操作,将序列按照彼此的相似性分归为许多小组,一个小组就是一个OTU。可根据不同的相似度水平,对所有序列进行OTU划分,通常对97%相似水平下的OTU进行生物信息统计分析。
平台及软件:
Qiime(Version 1.8.0http://qiime.org/)
vsearch(2.7.1 https://github.com/torognes/vsearch)
分析方法:
将clean tags用聚类(或降噪)方式生成OTUs。聚类方法可选 uparse[1],uclust[2],cdhit[3],ref参照数据库等方法;降噪法为unoise3[4]方法。默认为uparse聚类法。
参考文献
[1] Edgar, R.C. (2013) UPARSE: Highly accurate OTU sequences frommicrobial amplicon reads, Nature Methods [Pubmed:23955772, dx.doi.org/10.1038/nmeth.2604].
[2]Edgar, R.C. (2010) Search and clustering orders of magnitudefaster than BLAST, Bioinformatics 26(19), 2460-2461.doi: 10.1093/bioinformatics/btq461.
[3]Li et al (2006) Cd-hit: a fast program for clustering andcomparing large sets of protein or nucleotide sequences.
[4]Rognes T, Flouri T, Nichols B, Quince C, Mahé F. (2016) VSEARCH: aversatile open source tool for metagenomics. PeerJ 4:e2584. doi: 10.7717/peerj.2584
(4)物种差异分析
物种差异分析根据得到的群落丰度数据,运用相关的分析方法进行分析,检测不同组(或样本)微生物群落表现出的丰度差异。物种差异性分析模块的内容包括:组间差异显著性检验、Lefse多级物种差异判别分析。
组间显著性差异检验根据得到的群落丰度数据,运用严格的统计学方法,对不同组(或样本)微生物群落之间的物种进行假设检验,评估物种丰度差异的显著性水平,获得组(或样本)间显著性差异物种。该分析选择门、纲、目、科、属、种、OTU等不同分类水平。
组间差异显著性检验的内容包括:
a.卡方检验(chi-square test)
b.费舍尔检验(Fisher’exact test)
c.T检验(Student’s t-test(equal variance))
d.Welch T检验(Welch’s t-test(unknow variance))
e.Wilcox秩和检验(Mann-Whitney U test or Wilcoxon rank-sum tes )
f.Kruskal_wallis 秩和检验(Kruskal_Wallis H test)
g.单因素Anova分析(one-way ANOVA)
二、实验结果
实验结果显示,如图1所示,与生长正常的婴儿相比,EUGR患儿样本中Chlamydialesbacterium CRIB 32的丰度显著增加,差异具有统计学意义。
实施例2 诊断效能分析
根据Chlamydiales bacterium CRIB 32的相对丰度,使用SPSS绘制受试者工作特征曲线(ROC),计算二项精确置信空间,分析Chlamydiales bacterium CRIB 32用于宫外生长发育迟缓诊断的灵敏性和特异性。
结果:
如表1、表2所示,ROC曲线下面积为0.750,cutoff值为0.500,特异性为1.000,敏感性为0.500,该结果证明将Chlamydiales bacterium CRIB 32应用于诊断宫外生长发育迟缓具有较高的敏感性、特异性和准确性。
表1 曲线下方的区域
表2 Chlamydiales bacterium CRIB 32诊断效能数据
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种可用于预测或诊断生长发育迟缓的产品,其特征在于,所述的产品包括检测受试者的样本中Chlamydiales bacterium CRIB 32的含量或丰度的试剂。
2.根据权利要求1所述的产品,其特征在于,所述的试剂包括通过16S测序、全基因组测序、定量聚合酶链反应、PCR-焦磷酸测序、荧光原位杂交、微阵列或PCR-ELISA检测受试者的样本中Chlamydiales bacterium CRIB 32的含量或丰度的试剂。
3.根据权利要求1所述的产品,其特征在于,所述的试剂包括对Chlamydialesbacterium CRIB 32具有特异性的引物、探针、反义寡核苷酸、适体或抗体。
4.根据权利要求1所述的产品,其特征在于,所述的样本为粪便。
5.根据权利要求1所述的产品,其特征在于,所述的产品包括芯片、试剂盒、试纸。
6.根据权利要求1-5任一项所述的产品,其特征在于,所述的生长发育迟缓包括宫内生长发育迟缓、宫外生长发育迟缓。
7.Chlamydiales bacterium CRIB 32在制备权利要求1所述的产品中的应用。
8.一种预防或治疗生长发育迟缓的药物组合物,其特征在于,所述的药物组合物包括能够降低Chlamydiales bacterium CRIB 32的含量或丰度的物质。
9.一种诊断受试者是否患有生长发育迟缓或预测受试者是否存在患生长发育迟缓的风险的系统或装置,其特征在于,所述的系统或装置包括:
分析单元,所述单元适于测量受试者样本中Chlamydiales bacterium CRIB 32的含量或丰度;和
评估单元,其包含存储的参考和数据处理器,所述数据处理器已经实现了用于比较分析单元测量的Chlamydiales bacterium CRIB 32的含量或丰度与存储的参考的算法,由此诊断受试者是否患有生长发育迟缓或预测对象是否存在患生长发育迟缓的风险。
10.一种筛选预防或治疗生长发育迟缓的候选药物的方法,其特征在于,所述的方法包括:
用待筛选物质处理表达或含有Chlamydiales bacterium CRIB 32的体系;检测所述体系Chlamydiales bacterium CRIB 32的含量或丰度;其中,若所述待筛选的物质可以降低Chlamydiales bacterium CRIB 32的含量或丰度,则表明该候选物质是预防或治疗生长发育迟缓的候选药物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111058487.5A CN113528688A (zh) | 2021-09-09 | 2021-09-09 | 微生物在制备用于诊断生长发育迟缓的产品中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111058487.5A CN113528688A (zh) | 2021-09-09 | 2021-09-09 | 微生物在制备用于诊断生长发育迟缓的产品中的应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113528688A true CN113528688A (zh) | 2021-10-22 |
Family
ID=78093136
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202111058487.5A Pending CN113528688A (zh) | 2021-09-09 | 2021-09-09 | 微生物在制备用于诊断生长发育迟缓的产品中的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113528688A (zh) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040053838A1 (en) * | 2000-11-28 | 2004-03-18 | Lois Smith | Determination of risk and treatment of complications of prematurity |
US20140363409A1 (en) * | 2011-12-30 | 2014-12-11 | Biogaia Ab | Lactobacillus Reuteri DSM 17938 for the Development of the Enteric Nervous System |
CN106202989A (zh) * | 2015-04-30 | 2016-12-07 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种基于口腔微生物群落获得儿童个体生物年龄的方法 |
WO2020176369A1 (en) * | 2019-02-25 | 2020-09-03 | Biome Health, Inc. | Indices of microbial diversity relating to health |
-
2021
- 2021-09-09 CN CN202111058487.5A patent/CN113528688A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040053838A1 (en) * | 2000-11-28 | 2004-03-18 | Lois Smith | Determination of risk and treatment of complications of prematurity |
US20140363409A1 (en) * | 2011-12-30 | 2014-12-11 | Biogaia Ab | Lactobacillus Reuteri DSM 17938 for the Development of the Enteric Nervous System |
CN106202989A (zh) * | 2015-04-30 | 2016-12-07 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种基于口腔微生物群落获得儿童个体生物年龄的方法 |
WO2020176369A1 (en) * | 2019-02-25 | 2020-09-03 | Biome Health, Inc. | Indices of microbial diversity relating to health |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
YING‑XUE DING等: "Effect of intestinal microecology on postnatal weight gain in very preterm infants in intensive care units", 《GUT PATHOGENS》 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20220325348A1 (en) | Biomarker signature method, and apparatus and kits therefor | |
EP3362579B1 (en) | Methods for diagnosis of tuberculosis | |
CN111440884B (zh) | 源于肠道的诊断肌少症的菌群及其用途 | |
CA3180334A1 (en) | Methods for detection of donor-derived cell-free dna | |
EP3129496B1 (en) | Molecular predictors of sepsis | |
CN111411151B (zh) | 一种肌少症的肠道菌群标志物及其应用 | |
EP3489365A1 (en) | Composition for predicting risk of or diagnosing metabolic syndrome or metabolic syndrome associated disorders by using oral bacterial community | |
US20190360022A1 (en) | Composition containing intravaginal microorganisms | |
CN111647673A (zh) | 微生物菌群在急性胰腺炎中的应用 | |
CN112011607A (zh) | 源于肠道与脑卒中诊断和治疗效果相关的菌群及其应用 | |
CN112553358A (zh) | 微生物菌群在脑卒中中的应用 | |
CN112251507A (zh) | 一种脑卒中诊疗效果评价相关微生物 | |
CN111647670A (zh) | 一种与肾病综合征相关的肠道菌属Faecalitalea及其应用 | |
CN113528688A (zh) | 微生物在制备用于诊断生长发育迟缓的产品中的应用 | |
US11898210B2 (en) | Tools for assessing FimH blockers therapeutic efficiency | |
CN115605608A (zh) | 帕金森氏病的检测方法 | |
CN113493849A (zh) | 一种可用于诊断生长发育迟缓的产品 | |
CN114045353B (zh) | 与诺如病毒感染性腹泻相关的微生物标志物及其用途 | |
CN114839369B (zh) | 急性高原反应微生物标志物及其应用 | |
CN111733206A (zh) | 阴道微生物在复发性流产中的应用 | |
CN115786552A (zh) | 肠道菌群标志物在颅缝早闭辅助诊断中的应用 | |
CN111733265A (zh) | 与复发性流产相关的阴道菌群及其应用 | |
Tyler | Understanding the Etiology of Inflammatory Complications Following Ileal Pouch-Anal Anastomosis |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |