JP2004527524A - 非経口初回抗原刺激後の粘膜追加免疫 - Google Patents

Abstract

１つ以上の抗原を用いる粘膜の免疫が後に続く、同じ抗原または異なる抗原の非経口投与が記載される。被験体における免疫応答を生成する方法が記載されており、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）１つ以上のポリペプチド抗原を含む第１の免疫原性組成物を非経口的に投与する工程、および；（ｂ）１つ以上の抗原を含む第２の免疫原性組成物を粘膜に投与する工程であって、これによって、被験体において免疫応答を誘導する、工程。さらに、腫瘍抗原に対する免疫応答を生成する方法が、記載されており、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）１つ以上の腫瘍抗原を含む第１の免疫原性組成物を非経口的に投与する工程、および；（ｂ）１つ以上の腫瘍抗原を含む第２の免疫原性組成物を粘膜に投与する工程。

Description

【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、一般に、抗原による非経口初回抗原刺激後の１つ以上の同じまたは別の抗原の粘膜免疫に関する。後の免疫応答を誘導するためのこれらの粘膜追加免疫系の使用はまた、記載される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
種々の病原体に対する免疫（特に粘膜免疫）を呼び起こすワクチンの開発は、好ましい。多くの疾患の原因病原体（例えば、細菌、ウイルス、寄生生物、および他の微生物）が、粘膜表面を介して感染される。
【０００３】
粘膜表面を介して感染されると考えられる１つの例は、捕捉された免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）である。ＡＩＤＳは、現代医学が直面している最大の健康脅威の１つとして認識されており、そして世界中のＨＩＶ性感染は、ＡＩＤＳを引き起こす原因である。今なお、ＡＩＤＳの治療もワクチンも存在しない。
【０００４】
１９８３年〜１９８４年において、３つのグループが別々にＡＩＤＳの疑わしい病因因子を同定した。例えば、Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉら、（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２０：８６８−８７１；Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒら、Ｈｕｍａｎ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓｅｓ（Ｇａｌｌｏ，Ｅｓｓｅｘ＆Ｇｒｏｓｓ編、１９８４）；Ｖｉｌｍｅｒら（１９８４）Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ １：７５３；Ｐｏｐｏｖｉｃら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：４９７−５００；Ｌｅｖｙら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２５：８４０−８４２を参照のこと。これらの単離は、様々に、リンパ節症関連ウイルス（ＬＡＶ）、ヒトＴ細胞リンパ増殖性ウイルスＩＩＩ型（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）、またはＡＩＤＳ関連ウイルス（ＡＲＶ）と呼ばれた。これらの単離体全てが、同じウイルス株であり、そして後に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と集合的に名付けられた。関連するＡＩＤＳ原因ウイルスの単離について、当初ＨＩＶと呼ばれた株は、現在ＨＩＶ−１と呼ばれ、そしてその関連ウイルスは、ＨＩＶ−２と呼ばれる。例えば、Ｇｕｙａｄｅｒら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２６：６６２−６６９；Ｂｒｕｎ−Ｖｅｚｉｎｅｔら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：３４３−３４６；Ｃｌａｖｅｌら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２４：６９１−６９５を参照のこと。従って、世界中で、ＨＩＶ感染の処置および／または予防に適する組成物もしくは方法の必要性が、当該分野において存在する。
【０００５】
ＨＩＶウイルスについての多くの情報が集められ、そしてＨＩＶによってコードされるｅｎｖ遺伝子産物、Ｇａｇ遺伝子産物、ｐｏｌ遺伝子産物、またはｔａｔ遺伝子産物を含む、ワクチン開発のためのいくつかの標的が、試験されている。ネイティブＨＩＶおよび合成ＨＩＶがコードしているポリヌクレオチドによる免疫は、例として記載されるように、共有に係るＰＣＴ／ＵＳ９９／３１２４５および本明細書中に引用される文献において記載されている。さらに、ワクチンを同定するための種々の試みにおいて、ＨＩＶをコードするポリヌクレオチドが投与されている。（例えば、Ｂａｇａｒａｚｚｉら（１９９９）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８０：１３５１−１３５５；Ｗａｎｇら（１９９７）Ｖａｃｃｉｎｅ １５：８２１−８２５を参照のこと）。ＣＴＬ応答を誘発し得るＨＩＶのマトリクス／キャプシドドメインを保有している、複製能力を有するベネズエラウマ脳脊髄炎（ＶＥＥ）αウイルスベクターは、動物において皮下に投与されている（Ｃａｌｅｙら（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３０３１−３０３８）。さらに、シンドビスウイルス由来のαウイルスベクターもまた、動物においてＨＩＶ ｇａｇ−特異的応答を誘発することが示されている（Ｇａｒｄｎｅｒら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１１８４９−１１８５７）。同様に、ＨＩＶペプチドもまた、動物被験体に投与されている。（Ｓｔａａｔｓら（１９９７）ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １３：９４５−９５２；Ｂｅｌｙａｋｏｖ（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２：２０７２）。
【０００６】
粘膜表面を介して感染され得る細菌の１つの例は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓまたはＮ．ｍｅｎ．）である。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、細菌性髄膜炎および細菌性敗血症の原因因子である。髄膜炎菌は、被膜抗原および細胞壁抗原免疫学的特性に基づく血清学的群に分類される。現在認識されている血清型としては、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ−１３５、Ｘ、Ｙ、Ｚおよび２９Ｅが挙げられる。血清型特異性の原因であるポリサッカリドは、これらの群のいくつかから精製されており、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ−１３５、およびＹが挙げられる。ＷＯ ００／６６７９１；ＷＯ ９９／２４５７８；ＷＯ ００／７１５７４；ＷＯ ９９／３６５４４；ＷＯ ０１／０４３１６；ＷＯ ９９／５７２８０；ＷＯ ０１／３１０１９；ＷＯ ００／２２４３０；ＷＯ ００／６６７４１；ＷＯ ００／７１７２５；ＷＯ ０１／３７８６３；ＷＯ ０１／３８３５０；ＷＯ ０１／５２８８５；ＷＯ ０１／６４９２２；ＷＯ ０１／６４９２０；ＷＯ ９６／２９４１２；およびＷＯ ００／５００７５をまた参照のこと。
【０００７】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ 血清型Ｂ（本明細書中で、「ＭｅｎＢ」または「ＮｍＢ」と呼ばれる）は、米国およびヨーロッパに住んでいる乳児および子供における細菌性髄膜炎の多きな割合を占めている。この生物はまた、若い成人において致死的な敗血症を引き起こす。思春期に、外部膜タンパク質（ＯＭＰ）ビヒクルからなる試験的なＭｅｎＢワクチンは、幾分か保護性である。しかし、保護は、ワクチン接種を受けた乳児（疾患の最も高い危険性である年齢群）においては観察されなかった。さらに、ＯＭＰワクチンは、血清型−表現型−特異的であり、そして優性のＭｅｎＢ株は、このようなワクチンの有用性を制限する、地理的変動および時間的変動の両方に共される。
【０００８】
有効な被膜ポリサッカリドベースのワクチンは、血清型Ａ、Ｃ、ＹおよびＷ１３５によって引き起こされる髄膜炎菌疾患に対して開発されてきた。さらに、ＭｅｎＢ／ＭｅｎＣワクチンの組み合わせが記載されている。ＷＯ ９９／６１０５３を参照のこと。しかし、ＭｅｎＢポリサッカリドワクチンを開発するための同様の試みは、被膜ＭｅｎＢポリサッカリド（本明細書中で「ＭｅｎＢ ＰＳ」と呼ばれる）の弱い免疫原性に起因して失敗した。ＭｅｎＢ ＰＳは、（Ｎ−アセチル（α２−＞８））ノイラミン酸のホモ単量体である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１は、同一の皮膜ポリサッカリドを有する。ＭｅｎＢ ＰＳによって誘発される抗体は、宿主ポリシアル酸（ＰＳＡ）と交差反応する。ＰＳＡは、胎児および新生児の組織において、特に脳組織において発見された神経細胞接着分子（「ＮＣＡＭ」）上に、大量に発現される。ＰＳＡはまた、腎臓、心臓、および嗅神経を含む成人組織において、より少ない程度で見出される。従って、ほとんどの抗ＭｅｎＢ ＰＳ抗体がまた、自己抗体である。従って、このような抗体は、胎児発達に悪影響を与える可能性、または自己免疫疾患を引き起こす可能性を有する。
【０００９】
ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体は、ＭｅｎＢ ＰＳの弱い免疫原性を回避するための試みにおいて調製されている。例えば、Ｃ_３−Ｃ_８ Ｎ−アシル−置換ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体が、記載されている。ＪｅｎｎｉｎｇｓらへのＥＰ公報第５０４，２０２ Ｂを参照のこと。同様に、Ｊｅｎｎｉｎｇｓらへの米国特許第４，７２７，１３６号は、本明細書中において「ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳ」と称されるＮ−プロピオニル化ＭｅｎＢ ＰＳ分子を記載する。ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳ 複合糖質により免役されたマウスは、高力価のＩｇＧ抗体を誘発することが報告された。Ｊｅｎｎｉｎｇｓら、（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１７０８。ウサギにおいて、２つの異なる抗体の集団が、誘導体を用いて産生され、この２つの異なる抗体は、称するところによれば、２つの異なるエピトープに結合し、一つはネイティブのＭｅｎＢ ＰＳによって共有され、そして１つは共有されない。殺菌活性は、ＭｅｎＢ ＰＳと交差反応しない抗体集団において見出される。Ｊｅｎｎｉｎｇｓら、（１９８７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６５：１２０７。この結合体によって誘発される保護抗体と反応する細菌表面エピトープの本質は、未知のままである。また、このワクチンによって誘発される抗体のサブセットが、宿主のポリシアル酸との自己反応性を有する（Ｇｒａｎｏｆｆら、（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：５０２８）ので、ヒトにおけるこのワクチンの安全性は、不確かなままである。従って、ＭｅｎＢに対する安全かつ効果的なワクチンの産生が特に望ましいことは、容易に理解される。
【００１０】
癌（腫瘍）抗原は、安全かつ効果的なワクチンを有すること望まれる抗原のなお別の多様なクラスを形成する。（例えば、Ｍｏｉｎｇｅｏｎ（２０００）Ｖａｃｃｉｎｅ １９：１３０５−１３２６；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１１：３８０−３８４を参照のこと）。種々の腫瘍特異的抗原が同定されており、そして試みは、細胞全体の溶解物または特徴付けられていない腫瘍溶解物に基づくワクチンの開発するために行われている。Ｍｏｉｎｇｅｏｎ、前出。しかし、現在のところ、種々の癌に対する立証されたワクチンは存在しない。
【００１１】
免疫の特定の初回抗原刺激−追加免疫方法が記載されている。特に、ポリヌクレオチドに関する遺伝的免疫は、記載されているとおりである。（例えば、ＷＯ ０１／８１６０９；ＷＯ ００／１１１４０；Ｃｏｏｎｅｙら、（１９９３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０（５）：１８８２−１８８６（ＨＩＶ−１エンベロープを発現している組換えワクシニア（ｖａｃ／ｅｎｖ）ウイルスによる筋内初回抗原刺激および組換えバキュロウイルス由来のｇｐｌ６０糖タンパク質（ｒｇｐｌ６０）による筋内追加免疫による免疫応答の誘導を記載している）；Ｂｒｕｈｌら、（１９９８）ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １４：４０１−４０７（組換えワクシニアによる、粘膜初回抗原刺激、続いて非経口初回抗原刺激を記載している）；およびＥｏら、（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５４７３−５４７９（ＨＳＶのｇＢタンパク質を発現している組換えワクシニアウイルスによる、粘膜初回抗原刺激および粘膜追加免疫を記載している）を参照のこと）。Ｌｅｅら、（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ １７：３０７２−３０８２は、組換えＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉウレアーゼワクチンを用いた、粘膜初回抗原刺激および非経口の追加免疫のレジメンを記載する。
【００１２】
しかし、これらまたは他の研究にも関わらず、種々の抗原（現在、効果的なワクチンおよび／または処置が有るか無しかの病原体または癌を含む）に対する粘膜および全身の免疫を増強する組成物および方法の必要性が残っている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、非経口初回抗原刺激によって、続いて粘膜追加免疫によって、哺乳動物における免疫応答を生じるための方法を提供する。
【００１４】
１つの局面において、被験体における免疫応答を生成する方法が記載されている。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）１つ以上のポリペプチド抗原を含む第１の免疫原性組成物を非経口的に投与する工程、および；（ｂ）１つ以上の抗原を含む第２の免疫原性組成物を粘膜に投与する工程であって、これによって、被験体において免疫応答を誘導する、工程。
【００１５】
別の局面において、腫瘍抗原に対する免疫応答を生成する方法が記載されており、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）１つ以上の腫瘍抗原を含む第１の免疫原性組成物を非経口的に投与する工程、および；（ｂ）１つ以上の腫瘍抗原を含む第２の免疫原性組成物を粘膜に投与する工程。
【００１６】
この粘膜投与は、例えば、直腸内、鞘膜内または鼻腔内であり得る。さらに、本明細書中に記載されるいずれかの方法において、非経口投与は、例えば、経皮的であり得る。第１および／または第２の免疫原性組成物はさらに、１つ以上のさらなる薬剤（例えば、アジュバンド、および／または送達ビヒクル（例えば、ＰＬＧの様な微粒子）を含み得る。
【００１７】
特定の実施形態において、少なくとも１つの抗原は、細菌（例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの亜群Ａ、亜群Ｂおよび／または亜群Ｃ（例えば、莢膜オリゴ糖抗原単独またはＣＲＭ１９７に結合した）；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）由来である。他の実施形態において、少なくとも１つの抗原は、ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）および／またはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）由来である。なお他の実施形態において、少なくとも１つの抗原は、腫瘍由来である。
【００１８】
本明細書中に記載されるいずれかの方法において、免疫応答は、体液性および／または細胞性であり得、そしてさらに、全身性免疫応答（例えば、ＩｇＧ産生）、粘膜免疫応答（例えば、ＩｇＡ産生）あるいは全身性応答および粘膜応答の組み合わせであり得る。本明細書中に記載される方法は、１つ以上の病原体（例えば、細菌、ウイルス、腫瘍など）に対する免疫応答を生じるために使用され得る。
【００１９】
本明細書中に記載されるいずれかの方法において、第１の免疫原性組成物および第２の免疫原性組成物は、同じ病原体（例えば、細菌、ウイルスおよび／または腫瘍）由来の抗原を含み得る。特定の実施形態において、第１の免疫原性組成物および第２の免疫原性組成物は、同じものである。他の実施形態において、第１の免疫原性組成物および第２の免疫原性組成物は、例えば、同じ病原体由来の異なる抗原、抗原の異なる形態、異なる病原体由来の抗原および／または異なるアジュバンドを有することによって、異なる。
【００２０】
本明細書中に記載されるいずれかの方法において、この免疫原性組成物は、全てまたは一部分の、１つ以上の抗原をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、第１の免疫原性組成物はさらに、１つ以上の抗原をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。他の実施形態において、第２の免疫原性の抗原の全てまたはいくつかが、１つ以上の ポリヌクレオチドによってコードされる。
【００２１】
さらに、本明細書中に記載されるいずれかの方法において、本明細書中に記載される方法はさらに、工程（ａ）および／または工程（ｂ）を含む工程を１回以上繰り返すことを包含する。特定の局面において、工程（ｂ）は、２回以上実施される。工程（ｂ）の粘膜投与の間の時間間隔は、時間、日数、月数または年数であり得る。特定の実施形態において、繰り返される工程は、同じ免疫原性組成物か、あるいは異なる免疫原性組成物を用いて実施される。
【００２２】
従って、本発明の目的は、非経口の免疫応答の初回抗原刺激に続く粘膜の追加免疫のための代替方法または改善された方法を提供することである。本発明は、哺乳動物における免疫応答を引き起こすための方法（第１の免疫原性組成物の非経口投与、続く第２の免疫原性組成物の粘膜投与を含む方法）を提供する。この粘膜投与はさらに、粘膜のアジュバンド（例えば、ＣｐＧ含有オリゴ、生物接着性ポリマー、あるいはＥ．ｃｏｌｉの易熱性エンテロトキシン（ｅｎｔｅｒｔｏｘｉｎ）（「ＬＴ」）またはそれらの無毒化された変異体、あるいはコレラ毒素（「ＣＴ」）またはその無毒化された変異体、あるいは生分解性または無毒の物質から形成された微粒子）の使用を含む。この非経口投与は、好ましくは、非経口アジュバンド（例えば、ミョウバンなど）の使用をさらに含む。特定の実施形態において、微粒子は、免疫原性組成物の送達のために使用される。
【００２３】
第１の免疫原性組成物は、非経口的に投与される。非経口投与の適切な経路としては、筋内経路、皮下経路、静脈内経路、腹腔内経路、真皮内経路、経皮性（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）経路、または経皮性（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）経路、ならびに組織の間質性空間への送達が挙げられる。１つの実施形態において、非経口の初回抗原刺激は、筋内経路を介する。この第１の免疫原性組成物は、好ましくは、代表的に、滅菌されかつ発熱物質を含まない、注射可能な形態において、非経口投与に適応される（例えば、ＷＯ ９９／４３３５０を参照のこと）。特定の実施形態において、この第１の免疫原性組成物は、非経口アジュバンドまたは免疫学的アジュバンドを含む。さらに、この第１の免疫原性組成物は、生分解性または無毒の微粒子上に吸着され得る。第２の免疫原性組成物は、粘膜に投与される。粘膜投与の適切な経路としては、経口経路、経鼻腔経路、胃内経路、肺性経路、腸管経路、直腸経路、眼の経路および腟経路が挙げられる。鼻腔内投与または経口投与が、好ましい。
【００２４】
特定の局面において、第２の免疫原性組成物は、好ましくは、粘膜投与に適応し得る。組成物が、経口投与用である場合、錠剤またはカプセル剤の形態であり得、必要に応じて、腸溶性、液状、トランスジェニック植物などであり得る。この組成物が、経鼻投与用である場合、鼻内噴霧、点鼻液（ｎａｓａｌ ｄｒｏｐｓ）、ゲルまたは散剤の形態であり得る。特定の実施形態において、第２の免疫原性組成物はさらに、粘膜アジュバンドを含む。適切なアジュバンドとしては、以下が挙げられる：ＣｐＧ含有オリゴ、生物接着性ポリマー（ＷＯ ９９／６２５４６およびＷＯ ００／５００７８を参照のこと）；Ｅ．ｃｏｌｉの易熱性エンテロトキシン（「ＬＴ」）またはそれらの無毒化された変異体、あるいはコレラ毒素（「ＣＴ」）またはその無毒化された変異体、あるいは生分解性または無毒の物質から形成された微粒子。好ましいＬＴ変異体としては、Ｋ６３、またはＲ７２が挙げられる。例えば、ＰＣＴ ＥＰ９２／０３０１６；ＰＣＴ ＩＢ９４／０００６８；ＰＣＴ ＩＢ９６／００７０３およびＰＣＴ ＩＢ９７／００１８３を参照のこと。
【００２５】
他の局面において、第１の免疫原性組成物および／または第２の免疫原性組成物は、微粒子に吸着される。特定の実施形態において、第１の免疫原性組成物および／または第２の免疫原性組成物において使用される微粒子は、直径１００ｎｍ〜１５０ｎｍであり、より好ましくは、直径２００ｎｍ〜３０μｍであり、そして最も好ましくは、直径５００ｎｍ〜１０μｍであり、そして、例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなどから作成される。例えば、ＷＯ ００／０６１２３およびＷＯ ９８／３３４８７を参照のこと。
【００２６】
本発明の使用に適切な免疫原性組成物としては、ウイルス、細菌、寄生生物、真菌および／または癌抗原をコードする、タンパク質および／またはポリヌクレオチドが挙げられる。
【００２７】
本発明の種々の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照する際に証拠となる。さらに、種々の参照は、より詳細な特定の手順または組成物（例えば、プラスミドなど）において記載され、以下に示される。
【００２８】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他に示されない限り、当業者の範囲内の従来の化学方法、生化学方法、分子生物学方法、免疫学方法および薬理学方法を利用する。このような技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ならびにＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｉｒｄｉ，Ｋ．Ｓ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９７）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第４版（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９９、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｎ Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ（Ｒｅａｍら編，１９９８，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｓｅｒｉｅｓ）、第２版（Ｎｅｗｔｏｎ ＆ Ｇｒａｈａｍ編，１９９７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ）；ＰｅｔｅｒｓおよびＤａｌｒｙｍｐｌｅ，Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第２版）Ｆｉｅｌｄｓら（編）Ｂ．Ｎ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照のこと。
【００２９】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その文脈が明らかに他を示さない限り、複数形の参照を含む。従って、例えば、「抗原（単数形）」に対する言及は、２つ以上のこのような因子の混合物を含む。
【００３０】
本発明を示す前に、本明細書中以降で使用される特定の用語の定義を最初に示す。
【００３１】
「ポリヌクレオチド」とは、生物学的に活性な（例えば、免疫学的または治療的）タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸分子である。このポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの特性に依存して、ポリヌクレオチドは、１０程度に少ないヌクレオチドを含み得る（例えば、このポリヌクレオチドが抗原をコードする場合）。さらに、「ポリヌクレオチド」は、二本鎖配列および一本鎖配列の両方を含み得、そしてウイルスＭＲＮＡ、原核生物ＭＲＮＡ、または真核生物ＭＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、ウイルス（例えば、ＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルスならびにレトロウイルス）または原核生物ＤＮＡ由来のゲノムＲＮＡ配列およびゲノムＤＮＡ配列、特に、合成ＤＮＡ配列をいうがこれらに限定されない。この用語はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの任意の公知の塩基アナログを含む配列を包含し、そしてその核酸配列が治療タンパク質または抗原性タンパク質をコードする限りので、ネイティブな配列に対する、欠失、付加、および置換（一般的に天然において保存的である）のような改変を含む。これらの改変は、部位特異的変異誘発のように、意図的であり得るか、または抗原を産生する宿主の変異を介してのように偶発的であり得る。ポリヌクレオチドの改変は、任意の数の効果（例えば、宿主細胞におけるポリペプチド産物の発現を促進することが挙げられる）を有し得る。
【００３２】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーをいい、そして最少の長さの産物に限定されない。従って、ペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、マルチマーなどは、この定義内に含まれる。全長タンパク質およびそのフラグメントの両方が、この定義によって含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などを含む。さらに、本発明の目的に関して、「ポリペプチド」は、そのタンパク質が所望の活性を維持する限りは、ネイティブな配列に対する欠失、付加および置換（一般的に、天然において保存的である）などの改変を含むタンパク質をいう。これらの改変は、意図的であり得るか（例えば、部位特異的変異誘発を介して）、または偶発的であり得る（例えば、タンパク質を産生する宿主の変異もしくはＰＣＲ増幅に起因するエラーを介して）。さらに、以下の効果：毒性の軽減；細胞プロセシング（例えば、分泌、抗原提示など）の促進；ならびにＢ細胞および／またはＴ細胞に対する提示の促進、の１つ以上を有する改変がなされ得る。
【００３３】
「融合分子」は、２つ以上のサブユニットの分子が（好ましくは、共有結合で）連結された分子である。このサブユニット分子は、同じ化学的型の分子であり得るか、または異なる化学的型の分子であり得る。これらの融合分子の例としては、融合ポリペプチド（例えば、２つ以上の抗原間の融合物）および融合核酸（例えば、本明細書中に記載される融合ポリペプチドをコードする核酸）が挙げられるが、これらに限定されない。融合分子を作製する方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出およびＡｕｓｕｂｅｌら、前出もまた参照のこと。
【００３４】
「抗原」は、体液性抗原特異的応答および／または細胞性抗原特異的応答を生成するように宿主の免疫系を刺激する１つ以上のエピトープ（線状、コンフォメーショナルのいずれか、または両方）を含む分子をいう。この用語は、用語「免疫原」と交換可能に使用される。通常、エピトープは、約３〜１５アミノ酸、一般的には約５〜１５アミノ酸の間を含む。通常、Ｂ細胞エピトープは、少なくとも５アミノ酸を含むが、これは３〜４アミノ酸ほど小さいものでもあり得る。Ｔ細胞エピトープ（例えば、ＣＴＬエピトープ）は、少なくとも約７〜９アミノ酸を含み、そしてヘルパーＴ細胞エピトープは、少なくとも１２〜２０アミノ酸を含む。通常、エピトープは、約７アミノ酸と１５アミノ酸との間のアミノ酸（例えば、９、１０、１２、または１５アミノ酸）を含む。用語「抗原」は、サブユニット抗原（すなわち、その抗原が天然で会合する生物全体から、隔離または分離されている抗原）、および殺傷されたか、弱毒化されたかまたは不活性化された、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物または他の微生物ならびに細胞表面レセプターの細胞外ドメインおよびＴ細胞エピトープを含み得る細胞内部分を含む腫瘍抗原の両方を示す。抗体（例えば、抗イディオタイプ抗体）またはそのフラグメント、および合成ペプチドミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）（これは、抗原または抗原決定基を模倣し得る）もまた、本明細書中に使用されるような抗原の定義の下に捕えられる。同様に、インビボにおいて（例えば、遺伝子治療およびＤＮＡ免疫適用において）抗原または抗原決定基を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドもまた、本明細書の抗原の定義内に含まれる。
【００３５】
所定のタンパク質のエピトープは、当該分野において周知の任意の数のエピトープマッピング技術を用いて同定され得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．６６（Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編、１９９６）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙを参照のこと。例えば、線状エピトープが、例えば、固体支持体上の多数のポリペプチドを同時に合成し（このペプチドは、このタンパク質分子の部分に対応する）そしてこれらのペプチドがこれらの支持体になお付着したままで、ここれらのペプチドと抗体とを反応させることによって決定され得る。このような技術は、当該分野において公知であり、例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎら、（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２；Ｇｅｙｓｅｎら、（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３：７０９−７１５に記載される。
【００３６】
同様にして、コンフォメーショナルエピトープは、アミノ酸の空間的なコンフォメーションを決定することによって（例えば、Ｘ線結晶学および核磁気共鳴によって）容易に同定され得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ前出を参照のこと。
【００３７】
本発明の目的に関して、抗原は、以下により完全に記載されるように、腫瘍および／または任意のいくつかの既知のウイルス、細菌、寄生生物および真菌から誘導され得る。この用語はまた、種々の腫瘍抗原のいずれかまたは免疫応答が所望される任意の他の抗原を意図する。さらに、本発明の目的に関して、「抗原」は、本明細書中に規定されるように、そのタンパク質が免疫学的応答を誘発する能力を維持する限りは、ネイティブな配列に対する欠失、付加および置換（一般的に、天然において保存的である）のような改変を含むタンパク質をいう。これらの改変は、意図的であり得るか（例えば、部位特異的変異誘発を介して）、または偶発的であり得る（例えば、抗原を産生する宿主の変異を介して）。
【００３８】
抗原または組成物に対する「免疫学的応答」は、目的の組成物中に存在する抗原に対する被験体における体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答の発生である。本発明の目的に関して、「体液性免疫応答」は、抗体分子によって媒介される免疫応答をいい（分泌（ＩｇＡ）分子またはＩｇＧ分子を含む）、一方、「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／もしくは他の白血球によって媒介される免疫応答である。細胞性免疫の１つの重要な局面は、細胞溶解性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）による抗原特異的応答を含む。ＣＴＬは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によってコードされ、そして細胞の表面上に発現されるタンパク質と共に提示されるペプチド抗原に対して、特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の破壊またはこのような微生物で感染された細胞の溶解を、誘導および促進するように補助する。細胞性免疫の別の局面は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を含む。ヘルパーＴ細胞は、その表面上にＭＨＣ分子と共にペプチド抗原を提示する細胞に対して、非特異的なエフェクター細胞の機能を刺激し、そしてその非特異的なエフェクター細胞の活性に焦点をあわせるように補助するように作用する。「細胞性免疫応答」はまた、サイトカイン、ケモカイン、ならびに活性化Ｔ細胞および／または他の白血球によって産生される他のこのような分子の産生をいい、これには、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、およびＣＤ８＋ Ｔ細胞由来の分子が挙げられる。さらに、ケモカイン応答は、投与された抗原に応答して種々の白血球または内皮細胞によって誘導され得る。
【００３９】
細胞性免疫応答を惹起する組成物またはワクチンは、その細胞表面でのＭＨＣ分子と会合した抗原の提示によって、脊椎動物被験体を感作するために役立ち得る。その細胞媒介性免疫応答は、その表面に抗原を提示する細胞にかまたはその細胞付近に対する。さらに、抗原特異的Ｔリンパ球が、免疫された宿主の将来的防御を可能にするために生成され得る。
【００４０】
特定の抗原が細胞媒介性免疫応答を刺激する能力は、多数のアッセイにより決定され得、そのようなアッセイは、例えば、リンパ増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイ、または感作された被験体におけるその抗原に特異的なＴリンパ球についてのアッセイである。そのようなアッセイは、当該分野で周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：４１８９−４１９９；Ｄｏｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２３６９−２３７６を参照のこと。細胞媒介性免疫応答を測定する最近の方法としては、細胞内サイトカインまたはＴ細胞集団によるサイトカイン分泌の測定（例えば、ＥＬＩＳＰＯＴ技術による）、あるいはエピトープ特異的Ｔ細胞の測定（例えば、テトラマー技術による）（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ，Ａ．Ｊ．およびＯ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ，Ｃ．Ａ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７（９）：１３６７−１３７１，１９９８；Ｍｃｈｅｙｚｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５０：５−２１，１９９６；Ｌａｌｖａｎｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８５９−８６５，１９９７により概説される）が、挙げられる。
【００４１】
従って、本明細書中で使用される場合、免疫学的応答は、ＣＴＬおよび／またはヘルパーＴ細胞の生成もしくは活性化を刺激する応答であり得る。ケモカインおよび／またはサイトカインの生成もまた、刺激され得る。目的の抗原は、抗体媒介性免疫応答も惹起し得る。従って、免疫学的応答は、以下の効果のうちの１つ以上を包含し得る：Ｂ細胞による抗体（例えば、ＩｇＡまたはＩｇＧ）の生成；ならびに／あるいは目的の組成物またはワクチン中に存在する抗原に特異的に指向されるサプレッサーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、もしくはヘルパーＴ細胞および／またはγδＴ細胞の活性化。これらの応答は、感染性を中和し、そして／または抗体−補体依存性細胞傷害性または抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介して、免疫された宿主に対して防御を提供するように作用し得る。そのような応答は、当該分野で周知である、標準的免疫アッセイおよび中和アッセイを使用して、決定され得る。
【００４２】
「免疫原性組成物」は、被験体へのその組成物の投与が、目的の抗原性分子に対する体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答の発生を被験体において生じる、抗原性分子を含む組成物である。この免疫原性組成物は、レシピエント被験体中に直接（例えば、注射によって、吸入によって、経口投与経路によって、鼻内投与経路によって、または他の任意の非経口もしくは粘膜（例えば、直腸内もしくは膣内）投与経路によって）導入され得る。
【００４３】
「サブユニットワクチン」によって、目的の病原体（例えば、ウイルス、細菌、寄生生物、または真菌）に由来する抗原に由来するかまたはその抗原と相同である、選択された１つ以上の抗原（しかし、すべての抗原ではない）を含む、ワクチン組成物が意味される。そのような組成物は、インタクトな病原性細胞も病原性粒子も、またはそのような細胞もしくは粒子の溶解物も実質的に含まない。従って、「サブユニットワクチン」は、その病原体から少なくとも部分的に精製された（好ましくは、実質的に精製された）免疫原性ポリペプチド、またはそのアナログから調製され得る。従って、そのサブユニットワクチン中に含まれる抗原を得る方法としては、標準的精製技術、組換え生成、または合成生成が挙げられ得る。
【００４４】
「非経口」によって、消化器管外での（例えば、皮下投与、筋内投与、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与、皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）投与または静脈内投与による）体内への導入が意味される。これは、粘膜表面（例えば、口腔粘膜表面、鼻腔粘膜表面、膣粘膜表面または直腸粘膜表面）への送達と対照的である。従って、「粘膜」とは、任意の粘膜表面を介した（例えば、経鼻腔的、経口的、経膣的、経直腸的などの）体内への導入を意味する。
【００４５】
「同時投与」によって、身体または標的細胞への２つ以上の組成物の導入が意味される。この用語は、任意の順序での投与または同時の投与を含む。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、用語「微粒子」とは、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍの粒子、より好ましくは直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、最も好ましくは直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子をいう。好ましくは、この微粒子は、針およびキャピラリーをふさぐことなく非経口投与を可能とする直径のものである。微粒子の大きさは、当該分野において周知の技術（例えば、光子衝突分光学、レーザーディフラクトメトリー、および／または走査型電子顕微鏡）によって容易に決定される。
【００４７】
本明細書における使用のための微粒子は、滅菌可能であり、非毒性であり、そして生分解性の材料から形成される。そのような材料としては、限定せず、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物が挙げられる。好ましくは、本発明での使用のための微粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、特にポリ（ラクチド）（「ＰＬＡ」）またはＤ，Ｌ−ラクチドおよびグリコリドもしくはグリコール酸のコポリマー（例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（「ＰＬＧ」または「ＰＬＧＡ」））、またはＤ，Ｌ−ラクチドおよびカプロラクトンのコポリマーから誘導される。これらの微粒子は、種々の分子量を有し、そしてコポリマー（例えば、ＰＬＧ）の場合、種々のラクチド：グリコリド比を有する種々の重合出発物質のいずれからも誘導され得、これらの選択は、主として、同時投与される抗原に一部依存する選択である。これらのパラメーターは、以下でより詳細に議論される。
【００４８】
「免疫調節因子」とは、免疫応答を調節（特に増強）し得る分子（例えば、タンパク質）をいう。免疫調節因子の非限定的例としては、リンホカイン（サイトカインとしても公知）（例えば、ＩＬ−６、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３など）；およびケモカイン（例えば、分泌タンパク質（例えば、マクロファージ阻害因子））が、挙げられる。特定のサイトカイン（例えば、ＴＲＡＮＣＥ、ｆｌｔ−３Ｌ、および分泌形態のＣＤ４０Ｌ）は、ＡＰＣの免疫刺激能力を増強し得る。本発明の実施において単独でかまたは組み合わせて使用され得るサイトカインの非限定的例としては、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、Ｇ−ＣＳＦ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、ＭＩＰ−１γ、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、ｃ−ｋｉｔリガンド、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、腫瘍壊死因子関連活性化誘導性サイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）およびｆｌｔ３リガンド（ｆｌｔ−３Ｌ）が、挙げられる。サイトカインは、いくつかの供給業者（例えば、Ｇｅｎｚｙｍｅ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）、Ａｍｇｅｎ（Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｅｘ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ））から市販されている。これらの分子の多くの配列はまた、例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベースから入手可能である。通に明示的に記載されるわけではないが、野生型サイトカインまたは精製サイトカイン（例えば、組換え生成されたサイトカインまたはその変異体）と類似する生物学的活性を有する分子、およびこれらの分子をコードする核酸が、本発明の趣旨および範囲内で使用されるように意図されることが意図される。免疫調節因子は、本明細書中に記載される組成物の１つ、いくつかまたは全てと共に含まれ得るか、あるいは別個の処方物として使用され得る。
【００４９】
「被験体」とは、脊椎動物亜門の任意のメンバーを意味し、脊椎動物亜門としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：チンパンジー、および他のサル、およびサル種のような非ヒト霊長類を含む、ヒトおよび他の霊長類；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマのような家畜；イヌおよびネコのような家庭用哺乳類；マウス、ラット、およびモルモットのようなげっ歯類を含む実験動物；家庭用鳥類、野生の鳥類、およびニワトリ、七面鳥、他のキジ鳥、アヒル、ガチョウのような狩猟鳥類を含む鳥類等を含む。この用語は、特定の年齢を示さない。従って、成体の個体および新生の個体の両方が、網羅されることが意図される。これらの脊椎動物の全ての免疫系は、類似して機能するので、前述の系は、前述の脊椎動物種のいずれかおいて使用することが意図される。
【００５０】
「脊椎動物の被験体」とは、脊椎動物亜門の任意のメンバーを意味する。脊椎動物としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ、およびヒトのような哺乳類；イヌおよびネコのような家庭用動物；ならびに家庭用鳥類、野生の鳥類、およびニワトリ、七面鳥および他のキジ鳥を含む雄鳥および雌鳥のような狩猟鳥類を含む鳥類。この用語は、特定の年齢を示さない。従って、成体の動物および新生の動物の両方が、網羅されることが意図される。
【００５１】
「薬学的に受容可能」または「薬理学的に受容可能」とは、生物学的ではない物質か、またはさもなければ望ましくない物質を意味する。すなわち、この物質は、望ましくない生物学的影響を起こすことがないか、または含まれる組成物の成分のいずれかと有害な様式で相互作用することのない処方物または組成物で個体に投与され得る。
【００５２】
高分子および／または微粒子の用語「有効な量」、または用語「薬学的に有効な量」とは、本明細書中で提供される場合、非毒性であるが、所望の応答（例えば、免疫学的応答、および対応する治療効果、または治療タンパク質の送達の場合、以下に定義される被験体に対する処置を効果的なものにするのに十分な量）を提供する、高分子および／または微粒子の十分な量をいう。以下に示されるように、必要とされる正確な量は、被験体の種、年齢、および一般条件、処置される状態の重症度、および目的の特定の高分子、投与様式等に依存して、被験体ごとに変えられる。任意の個体の場合における適切な「有効な」量は、慣用的実験を使用して当業者によって決定され得る。
【００５３】
「薬学的に受容可能」または「薬理学的に受容可能」とは、生物学的でないか、またはさもなければ望ましくない材料を意味する。すなわち、この材料は、望ましくない生物学的影響を起こすことがないか、または含まれる組成物の成分のいずれかと有害な様式で相互作用することのない微粒子処方物と共に、個体に投与され得る。
【００５４】
「生理学的ｐＨ」または「生理学的な範囲内のｐＨ」とは、約７．２〜８．０の範囲内に含まれるｐＨ、より代表的には約７．２〜７．６の範囲内に含まれるｐＨを意味する。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「処置」とは、任意の（ｉ）伝統的ワクチンのように、感染予防または再感染予防、（ｉｉ）症状の軽減またはその除去、および（ｉｉｉ）問題となる病原体または障害の実質的除去または完全な除去をいう。処置は予防的に（感染前に）、または治療的に（感染後に）もたらされ得る。
【００５６】
（Ａ．抗原）
本明細書に記載される非経口初回抗原刺激粘膜追加免疫（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｐｒｉｍｅ−ｍｕｃｏｓａｌ ｂｏｏｓｔ）法は、１つ以上の抗原（または、これらの抗原をコードするポリヌクレオチド）の非経口投与、および粘膜投与を含み得る。本発明の目的のために、実質的に任意のポリペプチド、またはポリヌクレオチドが使用され得る。抗原は、いくつかの公知のウイルス、細菌、寄生生物および真菌類のいずれか、ならびに種々の腫瘍抗原のいずれか、または免疫応答が所望される任意の他の抗原に由来し得る。さらに、本発明の目的のために、「抗原」とは、タンパク質が、免疫学的応答を惹起する能力を維持する限り、ネイティブの配列に対する欠失、付加、および置換（天然において、一般的に保存的である）のような、改変を含むタンパク質をいう。これらの改変は、あたかも部位特異的変異誘発のように意図的であり得るか、またはあたかも抗原を産生する宿主の突然変異のように偶発的であり得る。本発明の実行において、特に有用である抗原は、感染するか、または粘膜表面を通って伝達される病原体由来のポリペプチド抗原を含む。粘膜表面を通って伝達される病原体、およびそれら由来の抗原の限定されない代表的な例としては、以下が挙げられる：細菌病原体に由来する抗原（例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、クラミジア、淋病、および梅毒）、ウイルス病原体（例えば、ヒト免疫不全症ウイルス（「ＨＩＶ」）、Ｂ型肝炎ウイルス、およびＣ型肝炎ウイルス（それぞれ、「ＨＢＶ」および「ＨＣＶ」）、ヒト乳頭腫（Ｐａｐｉｌｏｍａ）ウイルス（「ＨＰＶ」）、単純ヘルペスウイルス（「ＨＳＶ」）等に由来する抗原、ならびに寄生生物抗原、真菌類抗原、および癌抗原。Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＣｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの考察については、Ｋａｌｍｅｎら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１：３８５−３８９；Ｒｅａｄら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８：１３９７−１４０６；Ｓｈｉｒａｉら（２０００）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８１（補遺３）：Ｓ５２４−Ｓ５２７；ＷＯ ９９／２７１０５；ＷＯ ００／２７９９４；ＷＯ ００／３７４９４；ＷＯ ９９／２８４５７を参照のこと。
【００５７】
本発明の状況において利用される場合、「免疫学的部分」とは、適切な条件下で、免疫応答（例えば、細胞媒介性または体液性）を惹起し得る、各々の抗原の一部分をいう。「部分」は、変わり得る大きさであり得るが、好ましくは、少なくとも９個のアミノ酸の長さであり、そして抗原全体を含み得る。細胞媒介性免疫応答は、主要組織適合遺伝子複合体（「ＭＨＣ」）クラスＩの提示、ＭＨＣクラスＩＩの提示、または両方の提示によって媒介され得る。当業者には明らかであるが、本明細書中で記載されるこれらの抗原の種々の免疫原性の部分は、本明細書中で記載されるように投与される場合、免疫応答を誘導するために合わされ得る。
【００５８】
さらに、免疫原性の部分は、少なくとも９個のアミノ酸の長さであり、そして抗原全体を含み得ることが、一般的に好ましいが、これらの免疫原性の部分は、変化し得る長さであり得る。Ｔ細胞のエピトープは、潜在的なＴヘルパー部位およびＣＴＬ部位についてのコードする領域を走査するために、ＴＳＩＴＥＳ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）のようなコンピュータアルゴリズムを利用して予測され得るが、特定の配列の免疫原性は、しばしば予測することが難しい。この分析から、ペプチドが合成され、そしてインビトロでの細胞傷害性アッセイにおける標的として使用される。しかし、他のアッセイもまた、利用され得、例えば、新たに導入されるベクターに対する抗体の存在を検出するＥＬＩＳＡ、ならびにγ―インターフェロンのアッセイ、ＩＬ−２産生のアッセイ、および増殖のアッセイのような、Ｔヘルパー細胞を試験するアッセイを含む。
【００５９】
任意の抗原のうちの免疫原性の部分はまた、他の方法によっても選択され得る。例えば、ＨＬＡ Ａ２．１トランスジェニックマウスは、ウイルス抗原のヒトＴ細胞認識についてのモデルとして、有用であることが示されている。簡単にいえば、インフルエンザウイルスの系、およびＢ型肝炎ウイルスの系では、マウスＴ細胞レセプターのレパートリーが、ヒトＴ細胞によって認識される同一の抗原決定基を認識する。両方の系では、ＨＬＡ Ａ２．１トランスジェニックマウスにおいて発生するＣＴＬ反応は、ＨＬＡ Ａ２．１ハプロタイプのヒトＣＴＬによって認識されるエピトープと実質的に同一のエピトープに対して指向される。（Ｖｉｔｉｅｌｌｏら（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１００７−１０１５；Ｖｉｔｉｅｌｌｏら（１９９２）Ａｂｓｔｒａｃｔ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｓｙｍｐｏｓｉａ）。
【００６０】
さらなる免疫原性の部分は、例えば、種々の領域（例えば、ＨＩＶゲノムか、または１つ以上のＭｅｎＢエピトープ）に由来する１つ以上のエピトープを含む、種々の部位においてコード配列を短縮化することによって得られ得る。上記のように、このようなドメインは、Ｇａｇ、Ｇａｇ−ポリメラーゼ、Ｇａｇ−プロテアーゼ、逆転写酵素（ＲＴ）、インテグラーゼ（ＩＮ）およびＥｎｖのような、構造的ドメインを含む。この構造的ドメインは、しばしば、以下のポリペプチドにさらに細分化される：例えば、ｐ５５、ｐ２４、ｐ６（Ｇａｇ）；ｐ１６０、ｐ１０、ｐ１５、ｐ３１、ｐ６５（ｐｏｌ，ｐｒｏｔ、ＲＴおよびＩＮ）およびｇｐ１６０，ｇｐ１２０，およびｇｐ４１（Ｅｎｖ．）。ＨＩＶ、および他の性感染病のさらなる、エピトープは、公知であるか、または当業者に公知の方法を使用して、簡単に決定され得る。また、本発明に含まれるものは、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９９／３１２４５、ＰＣＴ／ＵＳ９９／３１２７３、およびＰＣＴ／ＵＳ９９／３１２７２に記載されているような、ポリペプチドの分子改変体である。
【００６１】
抗原は、単独で使用され得るか、または任意の組み合わせで使用され得る。（例えば、細菌抗原の組み合わせの使用を記載しているＷＯ ０２／００２４９を参照のこと）。この組み合わせは、同一の病原体に由来する複数の抗原、異なる病原体に由来する複数の抗原、または同一および異なる病原体に由来する複数の抗原を含み得る。従って、細菌、ウイルス、腫瘍および／または他の抗原が、同一の組成物に含まれ得るか、または別々に同一の被験体に投与され得る。免疫応答を惹起するのに使用される抗原の組み合わせが、組み合わせて使用されることは、一般的に好ましい。複数の病原体、または抗原に対する免疫化は、非経口送達について（投与回数が減少される）両方とも有利であるが、粘膜ワクチン（例えば、鼻腔内ワクチン）および粘膜送達にとってはあまり重要ではない。なぜならば、患者のコンプライアンスが改善され、そして、薬剤の輸送／貯蔵が促進されるからである。さらに、本明細書中で記載される場合、免疫化は、予防的または治療的のいずれかが使用され得る。
【００６２】
（１．細菌に由来する抗原）
本明細書中に記載される本発明は、以下を引き起こす生物体に由来するような、多数の細菌抗原を共に使用することもまた見い出す：ジフテリア（例えば、Ｖａｃｃｉｎｅｓの第３章，１９９８年、ＰｌｏｔｋｉｎおよびＭｏｒｔｉｍｅｒ編（ＩＳＢＮ ０−７２１６−１９４６−０）を参照のこと）、スタフィロコッカス（例えば、Ｋｕｒｏｄａら（２００１）Ｌａｎｃｅｔ ３５７：１２２５−１２４０に記載されているＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、コレラ、結核、破傷風としてもまた公知のＣ．ｔｅｔａｎｉ（例えば、Ｖａｃｃｉｎｅｓの第４章，１９９８年、ＰｌｏｔｋｉｎおよびＭｏｒｔｉｍｅｒ編（ＩＳＢＮ ０−７２１６−１９４６−０）を参照のこと、ストレプトコッカスのＡ群およびＢ群（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓを含み、例えば、以下に記載されている：Ｗａｔｓｏｎら（２０００）Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．１９：３３１−３３２；Ｒｕｂｉｎら（２０００）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．４７：２６９−２８４；Ｊｅｄｒｚｅｊａｓら（２００１）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ ６５：１８７−２０７；Ｓｃｈｕｃｈａｔ（１９９９）Ｌａｎｃｅｔ ３５３：５１−５６；英国特許出願第００２６３３３．５号；同第００２８７２７．６号；同第０１５６４０．７号；Ｄａｌｅら（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ １３：２２７−１２４３；Ｆｅｒｒｅｔｔｉら（２００１）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９８：４６５８−４６６３）、百日咳（例えば、Ｇｕｓｔｔａｆｓｓｏｎら（１９９６）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３４：３４９−３５５；Ｒａｐｐｕｏｌｉら（１９９１）ＴＩＢＴＥＣＨ ９：２３２−２３８を参照のこと）、髄膜炎、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ（例えば、ＭｃＭｉｃｈａｅｌ（２０００）Ｖａｃｃｉｎｅ １９ 補遺１：Ｓ１０１−１０７を参照のこと）および以下のものを含むが、これらに限定されない他の病原性状態：Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｙ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（例えば，ＷＯ ９９／２４５７８；ＷＯ ９９／３６５４４；およびＷＯ ９９／５７２８０を参照のこと）、ヘリコバクター ピロリ（例えば、ＣａｇＡ、ＶａｃＡ、ＮＡＰ、ＨｏｐＸ、ＨｏｐＹおよび／またはウレアーゼ（例えば、ＷＯ ９３／１８１５０；ＷＯ ９９／５３３１０；ＷＯ ９８／０４７０２に記載されている））およびインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）。Ｂ型インフルエンザ（ＨＩＢ）（例えば、Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏら（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ １７：１２５１−１２６３を参照のこと）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（Ｒｏｓｓら（２００１）Ｖａｃｃｉｎｅ １９：４１３５−４１３２）、およびそれらの組み合わせ。
【００６３】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｂ、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃに由来する抗原の例は、以下の共同所有する特許出願に開示されている。ＰＣＴ／ＵＳ９９／０９３４６；ＰＣＴ ＩＢ９８／０１６６５；ＰＣＴ ＩＢ９９／００１０３；ＷＯ ００／６６７９１；ＷＯ ９９／２４５７８；ＷＯ ００／７１５７４；ＷＯ ９９／３６５４４；ＷＯ ０１／０４３１６；ＷＯ ９９／５７２８０；ＷＯ ０１／３１０１９；ＷＯ ００／２２４３０；ＷＯ ００／６６７４１；ＷＯ ００／７１７２５；ＷＯ ０１／３７８６３；ＷＯ ０１／３８３５０；ＷＯ ０１／５２８８５；ＷＯ ０１／６４９２２；ＷＯ ０１／６４９２０；ＷＯ ９６／２９４１２；ＷＯ ００／５００７５。
【００６４】
ＭｅｎＢのＭＣ５８株の完全なゲノム配列は、Ｔｅｔｔｅｌｉｎら Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１８０９に記載されている。血清の殺菌性抗体応答が惹起したいくつかのタンパク質は、全ゲノム配列決定によって同定されている。例えば、免疫原性組成物としては、以下に由来する外膜小胞（ＯＭＶ）調製物を挙げられ得る：Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型のＢ型（例えば、以下に開示されている：Ｂｊｕｎｅら（１９９１）Ｌａｎｃｅｔ ３３８：１０９３−１０９６；Ｆｕｋａｓａｗａら（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ １７：２９５１−２９５８；Ｒｏｓｅｎｑｖｉｓｔら（１９９８）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．９２：３２３−３３３）、またはサッカリド抗原Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型のＡ型、Ｃ型、Ｗ１３５型および／またはＹ型（例えば、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｏら（１９９２）Ｖａｃｃｉｎｅ １０：６９１−６９８；Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｏら（１９９２）Ｖａｃｃｉｎｅ １０：１２５１−１２６３を参照のこと）。これらの病原体に由来する多くのタンパク質は、保存された配列を有しており、そしてカプセル化されたＭｅｎＢ株上で表面曝露されるようである。Ｐｉｚｚａら Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１８１６。これらのタンパク質のうちの１つは、ＧＮＡ３３（ゲノム由来抗原）である。ＧＮＡ３３は、リポタンパク質であり、そしてこの予測されるアミノ酸配列は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．に由来する膜結合溶解性ムレイントランスグリコシラ―ゼ（ＭｌｔＡ）との相同性を示す。Ｌｏｍｍａｔｚｓｃｈら Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９７）１７９：５４６５−５４７０．ＧＮＡ３３は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ間で高度に保存される。Ｐｉｚｚａら Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１８１６。組み換えＧＮＡ３３を用いて、免疫されたマウスは、カプセル化されたＭｅｎＢ株２９９６に対して測定される高い血清殺菌性の力価を生じた。この抗体応答の強さは、株２９９６から調製されたＯＭＰ小胞を用いて免疫された、コントロール動物の抗体応答の強さに類似した。しかし、防御抗体を惹起するＧＮＡ３３による機構は、同定されなかったが、異なるＭｅｎＢ株に対する防御応答の大きさでもなかった。
【００６５】
特定の実施形態においては、カプセルのサッカリドに由来する１つ以上の抗原は、使用される。このような適切なサッカリド抗原の限定されない例としては、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに由来する抗原が挙げられる。キャリアタンパク質に結合体化されたＭｅｎＣオリゴ糖抗原は、例えば、以下に記載されている：米国特許第６，２５２，４０１号；国際公開ＷＯ ００／７１７２５、および同ＷＯ ０１／３７８６３。これらの病原体に由来するサッカリド抗原、および他の病原体に由来するサッカリド抗原は公知であり、一般的にポリサッカリド結合体の調製物である。この結合体のサッカリド部分は、オリゴ糖（例えば、ＭＷ約１ｋＤａ〜約５ｋＤａ）を形成するために、ポリサッカリド（例えば、全長のポリリボシルリビトールホスフェート（ＰＲＰ））、または加水分解されたポリサッカリド（例えば、酸加水分解による）であり得る。加水分解が行われる場合、この加水分解産物は、短すぎて、有効な免疫原性がないオリゴ糖を除去するために、大きさによって分類され得る。大きさで分別されたオリゴ糖は、好ましいサッカリド抗原である。ＣＲＭのようなキャリアに対するサッカリドの結合体は、例えば、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｏら（１９９２）Ｖａｃｃｉｎｅ １０：６９１−６９８に記載されている。
【００６６】
１つより多い病原体に由来する抗原、および／または特定の細菌の１つより多い血清型に由来する抗原が免疫原性組成物の調製に使用され得ることは、理解されるべきである。Ｐｒｅｖｎａｒ^ＴＭは、例えば、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの約２３の血清型に由来する７つの抗原（４，６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ）を含む。
【００６７】
（２．ウイルスに由来する抗原）
粘膜表面を通って伝達され得るウイルスの限定されない例としては、髄膜炎、ライノウイルス、インフルエンザ、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）等が挙げられる。例えば、本発明は、以下を含むヘルペスウイルスファミリーに由来する、広範な種々のタンパク質に対する免疫応答を刺激するための使用を見い出す：ＨＳＶ−１糖タンパク質およびＨＳＶ−２糖タンパク質 ｇＢ、ｇＤ、ｇＨのような、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型、および（ＨＳＶ）２型に由来するタンパク質；帯状ヘルペスウイルス（ＶＺＶ）、ＥＢウイルス（ＥＢＶ）、ＣＭＶ ｇＢおよびｇＨを含むサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来する抗原；ならびにＨＨＶ６およびＨＨＶ７のような、他のヒトヘルペスウイルスに由来する抗原。（例えば、サイトメガロウイルスのタンパク質コード量の総説については、Ｃｈｅｅら Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｊ．Ｋ．ＭｃＤｏｕｇａｌｌ編 Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ １９９０）ｐｐ．１２５−１６９；種々のＨＳＶ−１をコードするタンパク質の考察については、ＭｃＧｅｏｃｈら Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６９：１５３１−１５７４；ＨＳＶ−１、およびＨＳＶ−２のｇＢタンパク質およびｇＤタンパク質、およびこれらをコードする遺伝子の考察については，米国特許第５，１７１，５６８号；ＥＢＶゲノム配列のタンパク質コード配列の同定については、Ｂａｅｒら Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１０：２０７−２１１；そしてＶＺＶの総説については、ＤａｖｉｓｏｎおよびＳｃｏｔｔ Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）６７：１７５９−１８１６を参照のこと）。
【００６８】
肝炎ファミリーのウイルスに由来する抗原は、以下のものが挙げられる：Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）（例えば、Ｂｅｌｌら（２０００）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．Ｊ．１９：１１８７−１１８８；Ｉｗａｒｓｏｎ（１９９５）ＡＰＭＩＳ １０３：３２１−３２６を参照のこと）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）（例えば、Ｇｅｒｌｉｃｈら（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅ ８ 補遺：Ｓ６３−６８および７９−８０を参照のこと）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、デルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、およびＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）もまた、本明細書中に記載される技術において、簡便に使用され得る。例として、ＨＣＶウイルスのゲノム配列は、公知であり、この配列を得る方法も公知である。例えば、国際出願ＷＯ ８９／０４６６９；同ＷＯ ９０／１１０８９；および同ＷＯ ９０／１４４３６を参照のこと。このＨＣＶゲノムは、以下を含むいくつかのウイルスのタンパク質をコードする：Ｅ１（Ｅとしてもまた公知）、およびＥ２（Ｅ２／ＮＳＩとしても公知）およびＮ―末端ヌクレオカプシドタンパク質（「コア」と命名された）（Ｅ１およびＥ２を含む、ＨＣＶタンパク質の考察については、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９１）１４：３８１−３８８を参照のこと）。これらのタンパク質の各々、ならびにこれらの抗原フラグメント、および／またはこれらのタンパク質をコードする核酸は、本発明における用途を見い出す。
【００６９】
同様に、ＨＤＶ由来のδ抗原の配列は公知であり（例えば、米国特許第５，３７８，８１４号を参照のこと）、そしてこの抗原はまた、本発明において都合よく使用され得る。さらに、ＨＢＶ由来抗原（例えば、コア抗原、表面抗原、ｓＡｇ）ならびにプレ表面配列、プレ−Ｓ１およびプレ−Ｓ２（プレ−Ｓと以前に呼ばれていた）、ならびに上記の組み合わせ（例えば、ｓＡｇ／プレ−Ｓ１、ｓＡｇ／プレ−Ｓ２、ｓＡｇ／プレ−ＳＩ／プレ−Ｓ２およびプレ−ＳＩ／プレ−Ｓ２）は、本発明における使用が見出されている。例えば、ＨＢＶ構造の議論については、「ＨＢＶ Ｖａｃｃｉｎｅｓ−ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｏ ｌｉｃｅｎｓｅ：ａ ｃａｓｅ ｓｔｕｄｙ」Ｍａｃｋｅｔｔ，Ｍ．およびＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ，ｐｐ．１５９−１７６，；および米国特許第４，７２２，８４０号、同第５，０９８，７０４号、同第５，３２４，５１３号；Ｂｅａｍｅｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）６９：６８３３−６８３８，Ｂｉｒｎｂａｕｍら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（１９９０）６４：３３１９−３３３０；ならびにＺｈｏｕら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（１９９１）６５：５４５７−５４６４を参照のこと。
【００７０】
より詳細には、上記のいずれかのＨＩＶ単離物（ＨＩＶの種々の遺伝的サブタイプのメンバーを含む）由来のｇｐ１２０エンベロープタンパク質は、公知であり、報告されている（種々のＨＩＶ単離物のエンベロープ配列の比較については、例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ，Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ（１９９２）；Ｍｙｅｒｓら、Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓおよび、４ｉｄｓ，１９９０，Ｌｏｓ Ａｌａｔｉｉｏｓ，Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ：Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；ならびにＭｏｄｒｏｗら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（１９８７）６１：５７０−５７８を参照のこと）。そして任意のこれらの単離物に由来する抗原は、本発明の方法において使用が見出される。さらに、本発明は、任意の種々のＨＩＶ単離物（任意の種々のエンベロープタンパク質（例えば、ｇｐ１６０およびｇｐ４１）、ｇａｇ抗原（例えば、ｐ２４ｇａｇおよびｐ５５ｇａｇ）ならびにｐｏｌ領域由来タンパク質を含む）に由来する他の免疫原性タンパク質に等しく適応可能である。
【００７１】
さらに、異なる地理的地域に見出されるＨＩＶのオープンリーディングフレーム大きな免疫学的多様性に起因して、抗原の特定の組み合わせは、特定の地理的地域における投与が好ましくあり得る。手短に言えば、ＨＩＶの少なくとも８つの異なるサブタイプが同定され、そしてこの８つのうちのサブタイプＢウイルスは、北アメリカ、ラテンアメリカおよびカリブ海、ヨーロッパ、日本およびオートラリアでより流行している。ほとんど全てのサブタイプは、サブサハラアフリカに存在し、サブタイプＡおよびＤは中央アフリカおよび東アフリカを占め、そしてサブタイプＣは、南アフリカを占める。サブタイプＣはまた、インドで流行しており、そして近年、南ブラジルで同定された。サブタイプＥは、タイで初めに同定され、そしてまた中央アフリカ共和国に存在する。サブタイプＦは、ブラジルおよびローマで示された。多くの近年の示されたサブタイプは、Ｇでありロシアおよびガボンで見出され、そしてサブタイプＨは、ザイールおよびカメルーンで見出される。グループＯウイルスは、カメルーンまたガボンで同定されている。従って、当業者に明らかなように、一般的に、投与の地理的地域において流行性である特定のＨＩＶサブタイプに適切である投与のためのベクターを構築することが好ましい。特定の地域のサブタイプは、二次元の二重免疫拡散によってか、またはその地域内の個体から単離されたＨＩＶゲノム（またはそのフラグメント）をスクリーニングすることによって決定され得る。
【００７２】
上記のように、多様なＧａｇ抗原およびＥｎｖ抗原はまた、ＨＩＶによって提示される。ＨＩＶ−１ Ｇａｇタンパク質は、ウイルスのライフサイクル（アセンブリ、粒子放出後のウイルス粒子成熟およびウイルス複製の初期侵入後段階を含む）の多くの段階に関与する。ＨＩＶ−１ Ｇａｇタンパク質の規定は、多数であり、そして複雑である（Ｆｒｅｅｄ，Ｅ．Ｏ．（１９９８）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２５１：１−１５）。
【００７３】
本発明の配列をコードするＥｎｖとしては、限定されないが以下が挙げられる：以下のＨＩＶコードポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列：ｇｐ１６０、ｇｐ１４０およびｇｐ１２０（例えば、ＨＩＶ−１_ＳＦ２（「ＳＦ２」）Ｅｎｖポリペプチドの記述については、米国特許第５，７９２，４５９号を参照のこと）。ＨＩＶ−１のエンベロープタンパク質は、約１６０ｋＤ（ｇｐ１６０）の糖タンパク質である。宿主細胞へのウイルス感染の間、ｇｐ１６０は、宿主細胞のプロテアーゼによって切断されて、ｇｐ１２０および内在性膜タンパク質（ｇｐ４１）を形成する。ｇｐ４１部分は、ウイルス粒子の膜二重層に結合（架橋）するが、ｇｐ１２０セグメントは、周囲の環境へと突出する。ｇｐ１２０とｇｐ４１との間に共有結合が存在しないので、遊離のｇｐ１２０は、ウイルス粒子の表面から放出され、細胞に感染する。従って、ｇｐ１６０は、ｇｐ１２０およびｇｐ４１のコード配列を含む。ポリペプチドｇｐ４１は、オリゴマー化ドメイン（ＯＤ）および膜貫通架橋ドメイン（ＴＭ）を含む様々なドメインからなる。ネイティブなエンベロープにおいて、オリゴマー化ドメインは、３つのｇｐ４１ポリペプチドの非共有結合性の会合に必要とされ、三量体構造を形成する：ｇｐ４１三量体（およびそれ自体）との非共有結合性相互作用を介して、ｇｐ１２０ポリペプチドはまた、三量体構造に組織化される。切断部位（単数または複数）は、ｇｐ１２０のポリペプチド配列とｇｐ４１に対応するポリペプチド配列との間におそらく存在する。この切断部位（単数または複数）は、その部位での切断を防止するように変異され得る。ｇｐ４１の膜貫通スパニングドメインが欠落する場合、この得られたｇｐ１４０ポリペプチドは、ｇｐ１６０の短縮型形態に対応する。このｇｐ１４０ポリペプチドは、ｇｐ４１部分におけるオリゴマー化ドメインの存在によって、モノマー形態およびオリゴマー形態（すなわち三量体）の両方に存在し得、そしてオリゴマー形態は、「ｏ」で示され得、例えば、「ｏｇｐ１４０」はオリゴマーｇｐ１４０をいう。切断部位が切断を防止するように変異され、そしてｇｐ１４０の膜貫通部分が欠損する状況において、ポリペプチド産物は、「変異された」ｇｐ１４０を示し得る。これらの分野で明らかなように、切断部位は様々な方法で変異され得る（ＷＯ００／３９３０２をまた参照のこと）。
【００７４】
インフルエンザウイルスは、本発明が特に有用であるウイルスの別の例である。特に、インフルエンザＡのエンベロープ糖タンパク質ＨＡおよびエンベロープ糖タンパク質ＮＡは、免疫応答を生成するために特に意図されるタンパク質である。インフルエンザＡの多数のＨＡサブタイプが同定されている（（Ｋａｗａｏｋａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９０）１７９：７５９−７６７；Ｗｅｂｓｔｅｒら、「Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｔｙｐｅ Ａ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ」，ｐ．１２７−１６８．：Ｐ．ＰａｌｅｓｅおよびＤ．Ｗ．Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ（編），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。従って、任意のこれらの単離物由来タンパク質はまた、本明細書中に記載される組成物および方法で使用され得る。
【００７５】
他のウイルス由来抗原はまた、限定しないが、本発明における用途（例えば、とりわけ、以下のメンバー由来のタンパク質における用途）が見出される：Ｐｉｃｏｍａｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、ポリオウイルスなど（例えば、Ｓｕｔｔｅｒら（２０００）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ ４７：２８７−３０８；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ＆ Ｓｐａｎｎ（１９９９）Ａｍ Ｆａｍ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ ５９：１１３−１１８；１２５−１２６）に記載されるような）；カルシウイルス科；トガウイルス科（例えば、風疹ウイルス、デング熱ウイルスなど）；フラビウイルス科（フラビウイルス属（例えば、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルスの血清型、ダニ媒介性脳炎ウイルス、西ナイルウイルス）を含む）； ペスチウイルス属（例えば、古典的ブタ熱ウイルス、ウシウイルス性下痢性ウイルス、ボーダー病ウイルス）；およびヘパシウイルス（例えば、米国特許第４，７０２，９０９号；同第５，０１１，９１５号；同第５，６９８，３９０号；同第６，０２７，７２９号；および同第６，２９７，０４８号に記載されるようなＡ型肝炎、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎）；パルボウイルス科（例えば、パルボウイルスＢ１９）；コロナウイルス科；レオウイルス科；ビマウイルス科（Ｂｉｍａｖｉｒｉｄａｅ）；ラボドウイルス科（Ｒｈａｂｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、Ｄｒｅｓｓｅｎら（１９９７）Ｖａｃｃｉｎｅ １５ Ｓｕｐｐｌ：ｓ２−６；ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ Ｍｏｒｔａｌ Ｗｋｌｙ Ｒｅｐ．１９９８ Ｊａｎ １６：４７（１）：１２，１９に記載される狂犬病ウイルスなど）；フィロウイルス科；パラミクソウイルス科（Ｖａｃｃｉｎｅｓ（１９９８，Ｐｌｏｔｋｉｎ ＆ Ｍｏｒｔｉｍｅｒ編（ＩＳＢＮ ０−７２１６−１９４６−０））の９章〜１１章に記載されるような例えば、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹、ＲＳウイルスなど；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルスＡ、ＢおよびＣ（例えば、Ｖａｃｃｉｎｅｓ（１９９８，Ｐｌｏｔｋｉｎ ＆ Ｍｏｒｔｉｍｅｒ編（ＩＳＢＮ ０−７２１６−１９４６−０））の１９章に記載されるような）；ブンヤウイルス科；アレナウイルス科；レトロウイルス科（例えば、ＨＴＬＶ−１；ＨＴＬＶ−１１；ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、ＡＲＶ、ＨＴＩ、Ｒなどとしてもまた公知））、（限定されないが、単離物ＨＩＶＩＩＩｂ、ＨＩＶＳＦ２、ＨＩＶＬＡＶ、ＨＩＶＩ−ＡＬ、Ｉ−ＩＩＶＭＮ由来の抗原を含む）；ＨＩＶ−Ｉ ＣＭ２３５、ＨＩＶ−Ｉ ＩＪＳ４；ＨＩＶ−２；サル免疫欠損ウイルス（ＳＩＶ）の膜由来タンパク質。さらに、抗原はまた、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）およびダニ媒介性脳炎ウイルスに由来し得る。例えば、これらおよび他のウイルスの詳細については、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第３版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編、１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，編、１９９１）を参照のこと。
【００７６】
特定の実施形態において、１つ以上の抗原は、ＨＩＶに由来する。ＨＩＶの遺伝子は、プロウイルスＤＮＡの中央領域に位置し、そして３つの主要なクラス：（１）主要構造タンパク質、Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖ；（２）調節タンパク質、ＴａｔおよびＲｅｖ、ならびに（３）アクセサリータンパク質、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、ＶｉｆおよびＮｅｆに分類される少なくとも９つのタンパク質をコードする。ＨＩＶ_ＳＦ２から得られる抗原に関して本明細書中で例証されるが、他のＨＩＶ改変体から得られる配列は、本明細書の教示に従って同類の様式で操作され得る。このような他の改変体としては、限定されないが以下が挙げられる：ＨＩＶ_ＩＩＩｂ、ＨＩＶ_ＳＦ２、ＨＩＶ−１_{ＳＦ１６２}、ＨＩＶ−１_{ＳＦ１７０}、ＨＩＶ_ＬＡＶ、ＨＩＶ_ＬＡＩ、ＨＩＶ_ＭＮ、ＨＩＶ−１_{ＣＭ２３５}、ＨＩＶ−１_ＵＳ４、多様なサブタイプ由来の他のＨＩＶ−１株（例えば、サブタイプＡ〜Ｇ、およびＯ）、多様なサブタイプ由来の他のＨＩＶ−２（例えば、ＨＩＶ−２_ＵＣ１およびＨＩＶ−２_ＵＣ２）およびサル免疫欠損ウイルス（ＳＩＶ）の単離物から得られた配列をコードするＧａｇタンパク質。（例えば、これらおよび他の関連ウイルスの詳細については、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第３版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編、１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編、１９９１）；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第３版（Ｆｉｅｌｄｓ，ＢＮ，ＤＭ Ｋｎｉｐｅ，ＰＭ Ｈｏｗｌｅｙ，編者、１９９６，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ；を参照のこと）。
【００７７】
寄生抗原の例としては、マラリアおよびライム病を生じる生物に由来する抗原が挙げられる。
【００７８】
（３．腫瘍抗原）
腫瘍抗原に対する変種は、同定されている。例えば、Ｍｏｉｎｇｅｏｎ、前出およびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ、前出を参照のこと。腫瘍抗原の非限定的な例としては、以下が挙げられる：ＣＤ^８＋リンパ球によって認識される抗原（例えば、黒色腫−メラノサイト分化抗原（たとえば、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質−１、チロシナーゼ関連タンパク質−２、メラノサイト刺激ホルモンレセプター）；変異抗原（例えば、β−カテニン、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ−４、カスパーゼ−８、ＫＩＡ ０２０５、ＨＬＡ−Ａ２−Ｒ１７０１）；精巣癌抗原（例えば、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−１２、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥおよびＮＹ−ＥＳＯ−１；および癌において過剰発現した変異していない共通抗原（例えば、αフェトプロテイン、テロメラーゼ触媒タンパク質、Ｇ−２５０、ＭＵＣ−１、癌胎児性抗原、ｐ５３、Ｈｅｒ−２−ｎｅｕ））、ならびにＣＤ^４＋リンパ球に認識される抗原（例えば、ｇｐｌ００、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、チロシナーゼ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ＣＤＣ−２７およびＬＤＬＲ−ＦＵＴ）。例えば、ＷＯ９１／０２０６２、米国特許第６，０１５，５６７号、ＷＯ０１／０８６３６、ＷＯ９６／３０５１４、米国特許第５，８４６，５３８号、米国特許第５，８６９，４４５号もまた参照のこと。
【００７９】
特定の実施形態において、腫瘍抗原は、変異された細胞内成分または改変された細胞内成分から誘導される。改変後、細胞内成分は、これらの調節機能をもはや発揮せず、それ故、細胞は、制御されない増殖を経験する。改変される細胞内成分の代表的な例としては、以下が挙げられる：ｒａｓ、ｐ５３、Ｒｂ、ウイリアムズ腫瘍遺伝子によってコードされた改変されたタンパク質、ユビキチン、ムチン、ＤＣＣ、ＡＰＣおよびＭＣＣによってコードされたタンパク質、ならびにレセプターまたはレセプター様構造（例えば、ｎｅｕ、甲状腺ホルモンレセプター、血小板誘導増殖因子（ＰＤＧＦ）レセプター、インシュリンレセプター、表皮増殖因子（ＥＧＦ）レセプター、およびコロニー刺激因子（ＣＳＦ）レセプター。これらならびに他の細胞内成分は、例えば、米国特許第 ５，６９３，５２２号およびその本文中に引用される参考文献において記載される。
【００８０】
（４．ポリペプチドの調製）
免疫原性組成物中の抗原は、代表的にタンパク質の形態である。タンパク質に基づく予防接種の代替として、免疫原性組成物中の抗原は、核酸分子またはポリヌクレオチドの形態である。
【００８１】
従って、ポリペプチド抗原は、固相タンパク質合成によって構築され得る。所望の場合、ポリペプチドはまた、アミノ酸リンカーまたはシグナル配列ならびにタンパク質の精製に有用なリガンド（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよびブドウ球菌プロテインＡ）のような他のアミノ酸配列を含み得る。あるいは、目的の抗原は、商業的な供給源から購入され得る。
【００８２】
ポリペプチドはまた、所望のポリペプチドをコードする核酸から作製され得る。目的のポリペプチドをコードする配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成され得る。Ｍｕｌｌｉｓら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５：３３５−３５０；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓら（編）Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ Ｊｏｖａｎｏｖｉｃｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ（１９９４））。この技術は、ＤＮＡの所望の領域を複製するために、ＤＮＡポリメラーゼ（通常、熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ）を使用する。複製されるべきＤＮＡ領域は、複製反応を開始するための所望のＤＮＡの反対の末端および反対の鎖に相補的な特定の配列のオリゴヌクレオチドによって同定される。繰り返される連続的な複製のサイクルは、使用されるプライマー対によって定められたＤＮＡフラグメントの増幅を生じる。多数のパラメータが、反応の成功に影響する。これらのパラメータの中には、アニーリング温度およびアニーリング時間、伸長時間、Ｍｇ^２＋およびＡＴＰ濃度、ｐＨ、ならびにプライマー、テンプレートおよびデオキシリボヌクレオチドとの相対濃度がある。
【００８３】
一旦、所望のタンパク質についてのコード配列が、調製されるかまたは単離されると、そのような配列は、任意の適切なベクターまたはレプリコンの中にクローン化され得る。多数のクローニングベクターが、当業者に既知であり、そして適切なクローニングベクターの選択は、設計事項である。他の配列への連結は、当該分野で公知の標準的な手順を用いて行なわれる。
【００８４】
同様に、選択されたコード配列は、発現のための任意の適切な発現ベクターの中にクローン化され得る。この発現産物は、必要に応じて、粘膜投与前に精製され得る。手短に言えば、これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、適切な発現系において発現され得る発現ベクターの中に導入され得る。種々の細菌、酵母、哺乳動物、昆虫および植物の発現系が、当該分野で利用可能であり、そして任意のそのような発現系が、使用され得る。必要に応じて、これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、無細胞翻訳系において翻訳され得る。このような方法は、当該分野で周知である。
【００８５】
（Ｂ．送達）
本明細書中に記載される組成物（例えば、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド）は、任意の適切な手段（例えば、非経口的初回抗原刺激のために静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、経皮的に、および粘膜の追加免疫のために経口的に、直腸に、眼内に、または鼻腔内に）または種々の物理的な方法（例えば、リポフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７）、直接的なＤＮＡ注入（Ａｃｓａｄｉら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：８１５−８１８）；微粒子銃（Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９１）ＰＮＡＳ ８８：２７２６−２７３０）；いくつかの型のリポソーム（例えば、Ｗａｎｇら（１９８７）ＰＮＡＳ ８４：７８５１−７８５５を参照のこと）；ＣａＰＯ_４（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら（１９８４）ＰＮＡＳ ８１：７５２９−７５３３）；ＤＮＡリガンド（Ｗｕら（１９８９）Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５−１６９８７）；ポリペプチド単独での投与；核酸単独での投与（ＷＯ９０／１１０９２）；または死滅したアデノウイルスに連結したＤＮＡの投与（Ｃｕｒｉｅｌら（１９９２）、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４）；ポリリジンのようなポリカチオン化合物を介して、レセプター特異的リガンドを利用して；ならびにセンダイウイルスまたはアデノウイルスのようなソラレン不活性化ウイルスを用いて）を使用して送達され得る。経皮投与は、浸透性エンハンサー、バリア崩壊剤またはその組み合わせを含み得る。例えば、ＷＯ９９／４３３５０を参照のこと。さらに、投与は、直接的に（すなわち、インビボで）投与されてもよく、または取り出された細胞に投与され（エキソビボで）、そして続いて戻されてもよい。
【００８６】
好ましい実施形態において、本発明は、少なくとも１つの第１の免疫原性組成物の非経口投与、そしてその後の少なくとも１つの第２の免疫原性組成物の粘膜投与によって、哺乳動物の免疫応答を増加する方法を提供する。言いかえれば、本発明は、非経口初回抗原刺激、それに続く粘膜の追加免疫を提供する。
【００８７】
ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの非経口投与の方法は、周知であり、例えば、以下が挙げられる：（１）血流への直接的な注入（例えば、静脈内投与）；（２）特定の組織または腫瘍への直接的な注入；（３）皮下投与；（４）経皮的上皮投与；（５）皮内投与（６）腹腔内投与；および／または（７）筋内投与。非経口投与の他の方法は、肺投与、坐薬、針のない（ｎｅｅｄｌｅ−ｌｅｓｓ）注射、経皮的適用および経皮性適用が挙げられる。投薬処置は、単一用量スケジュールまたは複数用量スケジュールであり得る。上記のように、核酸の投与はまた、ペプチドまたは他の物質の投与と組み合わせられ得る。
【００８８】
同様に、粘膜送達方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ（前出）に記載されるように当該分野で公知であり、そして経鼻送達、直腸送達、経口送達および膣送達を含む。直腸および膣を介する組成物の送達は、性的に伝達された病原体の場合、特に好ましく、このような投与方法は、病原体に最初に曝露された細胞へのアクセスを提供する。同様に、鼻腔内投与は、ライノウイルスのように、鼻粘膜を介して感染する疾患において好ましくあり得る。いくつかの例において、鼻腔内投与は、膣粘膜の免疫を誘導し得、そして経口免疫化は、直腸粘膜の免疫を誘導し得る。さらに、種々の粘膜投与経路および／または全身投与経路の組み合わせが、（病原体が侵入する部位と粘膜病原体が広がる全身部位の両方での）適切な免疫および保護を誘導するために使用され得る。さらに、粘膜投与は、注射器または他の投与デバイスを必要としない。投薬処置は、単一回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールであり得る。
【００８９】
本明細書中に開示される組成物は、単一で投与され得るかまたは１つ以上のさらなる高分子（例えば、遺伝子送達ビヒクル、免疫調節因子、アジュバント、および／または１つ以上のタンパク質）と共に投与され得る。このような実施形態において、複数の組成物が、例えば、遺伝子送達ビヒクルに続いてタンパク質；複数の遺伝子送達ビヒクルに続いて複数のタンパク質投与；タンパク質投与に続いて単一または複数の遺伝子送達ビヒクル投与；併用投与などの任意の順序で投与され得る。従って、タンパク質および核酸の混合物が、同じであるかまたは異なるビヒクル、および同じであるかまたは異なる投与方法を使用して投与され得る。
【００９０】
初回抗原刺激と追加免疫との間隔は、患者の年齢および組成物の性質のような因子に従って変化し、そしてこれらの因子は、医師によって評価され得る。最初の初回抗原刺激用量と追加免疫用量の投与は、一般的には少なくとも２週間、典型的には少なくとも４週間あけられる。本発明の方法は、１回より多い非経口的な初回抗原刺激用量および／または１回より多い追加免疫用量（例えば、２回以上の初回抗原刺激用量に続く２回以上の粘膜追加免疫用量）を含み得る（例えば、最初の初回抗原刺激−追加免疫の１８ヶ月後の「記憶（ｍｅｍｏｒｙ）」追加免疫を記載する、以下の実施例４を参照のこと）。用語「記憶」追加免疫は、最初の追加免疫後に与えられる任意の追加免疫用量をいう。「記憶」追加免疫が投与される時間は、最初の追加免疫後、数時間（例えば、１時間〜７２時間またはその間の任意の時点）または数日（例えば、１日〜９０日またはその間の任意の時点）から数ヶ月（例えば、１ヶ月〜３６ヶ月またはその間の任意の時点）あるいは数年にわたってさえ変化し得る。１回より多い記憶追加免疫は、互いに関連して、同じかまたは変化する時間間隔で投与され得る。同一であるかまたは異なる免疫原性組成物が、互いの初回抗原刺激用量のために使用され得る。従って、初回抗原刺激および追加免疫用量は、そのタイミングよりもむしろ投与の経路によって区別され得る。
【００９１】
組成物が投与される哺乳類は、典型的にはヒトのような霊長類である。ヒトは、子供であっても成人であってもよい。適切な下等哺乳類としては、マウスが挙げられ得る。
【００９２】
特定の実施形態において、直接送達は、一般的には、上記のようにＡｃｃｅｌｌ（登録商標）遺伝子送達システム（ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）のような従来の注射器または遺伝子銃のいずれかを用いる注入によってウイルスベクターを伴ってかまたは伴わずに、達成され得る。
【００９３】
（１．微粒子）
特定の実施形態において、１つ以上の選択された抗原が、引き続く送達のために微粒子中に包括されるかまたは微粒子に吸収される。本発明に有用な微粒子を製造するための生分解性ポリマーは、例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ ａｎｄ Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬから簡単に入手可能である。例えば、本明細書中の微粒子を形成するのに有用なポリマーとしては、ポリヒドロキシ酪酸から誘導されたポリマー；ポリカプロラクトン；ポリオルソエステル；ポリ無水物；ならびにポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（これら両方は、本明細書中で「ＰＬＡ」として公知である）、ポリ（ヒドロキシ酪酸塩）のようなポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（本明細書中で「ＰＬＧ」または「ＰＬＧＡ」と表される）のようなＤ，Ｌ−ラクチドとグリコリドのコポリマーまたはＤ，Ｌ−ラクチドとカプロラクトンのコポリマーが挙げられる。本明細書中で使用するのに特に好ましいポリマーは、ＰＬＡポリマーおよびＰＬＧポリマーである。これらのポリマーは、様々な分子量で入手可能であり、そして所定の抗原についての適切な分子量は、当業者によって容易に決定される。従って、例えば、ＰＬＡについて、適切な分子量は、約２０００〜２５０，０００のオーダーである。ＰＬＧについて、適切な分子量は、一般的には約１０，０００〜約２００，０００、好ましくは、約１５，０００〜約１５０，０００、そして最も好ましくは約５０，０００〜約１００，０００の範囲である。
【００９４】
ＰＬＧのようなコポリマーが微粒子を形成するのに使用される場合、種々のラクチド：グリコリド比が、本明細書中での使用を見出され、そしてその比は、同時に投与される抗原の一部および所望の分解速度依存して、大部分が選択される。例えば、５０％のＤ，Ｌ−ラクチドと５０％のグリコリドを含有する５０：５０ＰＬＧポリマーは、早い再吸収コポリマーを提供するが、７５：２５ＰＬＧは、より遅く分解し、そして８５：１５および９０：１０は、増加したラクチド成分に起因してさらにより遅い。ラクチド：グリコリドの適切な比が、抗原の性質および問題の障害に基づいて当業者によって容易に決定されることは、容易に明らかである。さらに、ラクチド：グリコリド比を変化させた微粒子の混合物は、所定の抗原についての所望の放出動力学を達成するためおよび１次免疫応答と２次免疫応答の両方を提供するために処方物中での使用が見出される。本発明の微粒子の分解速度はまた、ポリマー分子量およびポリマー結晶化度のような因子によって制御され得る。ラクチド：グリコリド比および分子量を変化させたＰＬＧコポリマーは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ ａｎｄ Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬを含む多くの販売元から容易に入手可能である。これらのポリマーはまた、Ｔａｂａｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．（１９８８）２２：８３７−８５８に記載されるような当該分野において周知の技術を使用して乳酸成分の単純な重縮合によって合成され得る。
【００９５】
抗原／微粒子は、当該分野で周知の任意のいくつかの方法を使用して調製される。例えば、米国特許第３，５２３，９０７号およびＯｇａｗａら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（１９８８）３６：１０９５−１１０３に記載されるような２重エマルジョン／溶媒蒸発技術が、微粒子を形成するために本明細書中で使用され得る。これらの技術は、抗原（抗原が、微粒子中に包括されるべき場合）を含むポリマー溶液の液滴から成る１次エマルジョンの形成を含み、このエマルジョンは続いて、粒子安定剤／界面活性剤を含む連続的な水相と混合される。
【００９６】
より詳細には、水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）溶媒蒸発システムは、Ｏ’Ｈａｇａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９３）１１：９６５−９６９；Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２およびＰＣＴ／ＵＳ９９／１７３０８（ＷＯ００／０６１３３）によって記載されるように、微粒子を形成するのに使用され得る。この技術において、特定のポリマーは、酢酸エチル、ジメチルクロライド（塩化メチレンおよびジクロロメタンとも呼ばれる）、アセトニトリル、アセトン、クロロホルムなどのような有機溶媒と合わせられる。このポリマーは、有機溶媒中、約２〜１５％、より好ましくは、約４〜１０％および最も好ましくは６％の溶液で提供される。ほとんど等量の抗原溶液（例えば、水溶液）が加えられ、そしてポリマー／抗原溶液は、例えば、ホモジナイザーを使用して乳化される。次いで、このエマルジョンは、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）またはポリビニルピロリドンのような乳化安定剤の大量の水溶液と合わせられる。この乳化安定剤は、典型的には、約２〜１５％溶液、より典型的には、約４〜１０％溶液で提供される。次いで、この混合物は、安定なｗ／ｏ／ｗ２重エマルジョン（ｄｏｕｂｌｅ ｅｍｕｌｓｉｏｎ）を作製するためにホモジナイズされる。次いで、有機溶媒が、蒸発される。
【００９７】
この処方パラメータは、小さい（＜５μｍ）微粒子および大きい（＞３０μｍ）微粒子の調製を可能にするために操作され得る。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；ＭｃＧｅｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐ．（１９９６）を参照のこと。例えば、攪拌を減らすと、内相体積が増加するために大きい微粒子を生じる。小さい微粒子は、高濃度のＰＶＡを含む低い水相体積によって生成される。
【００９８】
微粒子はまた、例えば、Ｔｈｏｍａｓｉｎら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（１９９６）４１：１３１；米国特許第２，８００，４５７号；Ｍａｓｔｅｒｓ，Ｋ．（１９７６）Ｓｐｒａｙ Ｄｒｙｉｎｇ 第２版．Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されるような噴霧乾燥およびコアセルベーション；Ｈａｌｌら，（１９８０）Ｔｈｅ「Ｗｕｒｓｔｅｒ Ｐｒｏｃｅｓｓ」ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｔｈｅｏｒｙ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａ．Ｆ．Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ，（編）），Ｖｏｌ．２，１３３−１５４頁 ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ ａｎｄ Ｄｅａｓｙ，Ｐ．Ｂ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．（１９８８）Ｓ（２）：９９−１３９に記載されるようなパン・コーティングおよびＷｕｒｓｔｅｒコーティングなどのエア−サスペンションコーティング技術；および例えば、Ｌｉｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８０）２１０：９０８−９１０によって記載されるようなイオン性のゲル化を使用して形成され得る。
【００９９】
上記の技術はまた、吸収された抗原を含む微粒子の生成に適用可能である。この実施形態において、微粒子は、上記のように形成されるが、抗原は、以下の構成で微粒子と混合される。
【０１００】
粒径は、例えば、レーザー光散乱（例えば、ヘリウム−ネオンレーザーを組み込む分光計を使用して）によって決定され得る。一般的には、粒径は、室温で決定され、そして粒子直径の平均値を得るために問題のサンプルの複数回の分析（例えば、５〜１０回）を含む。粒径はまた、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用して容易に決定される。
【０１０１】
微粒子の使用の前に、抗原含有量が、一般的に決定され、その結果適切な量の微粒子が適切な免疫応答を刺激するために被験体に送達され得る。
【０１０２】
微粒子の抗原含有量は、微粒子の分裂および包括された抗原の抽出によるような当該分野で公知の方法に従って決定され得る。例えば、微粒子は、例えば、Ｃｏｈｅｎら，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９１）８：７１３；Ｅｌｄｒｉｄｇｅら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９１）５９：２９７８；およびＥｌｄｒｉｄｇｅら，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（１９９０）１１：２０５に記載されるように、ジメチルクロライドおよび蒸留水に抽出されたタンパク質に溶解され得る。あるいは、微粒子は、５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳを含有する０．１Ｍ ＮａＯＨ中に分散され得る。このサンプルは、攪拌され、遠心分離され、そしてその上清は、適切なアッセイを使用して目的の抗原についてアッセイされる。例えば、Ｏ’Ｈａｇａｎら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．（１９９４）１０３：３７−４５を参照のこと。
【０１０３】
調製した微粒子上に高分子を吸収する１つの方法は、以下のとおりである。微粒子を、再水和し、そして再透析可能な陰イオン性界面活性剤または陽イオン性界面活性剤を使用して、基本的に微粒子の単量体懸濁液に分散する。有用な界面活性剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ヘプタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−７）、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−８）、ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−９）、およびデカノイル−Ｎ−メチル−グルカミド（ＭＥＧＡ−１０）のような任意の種々のＮ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡとして公知である）；コール酸；塩化ナトリウム；デオキシコール酸；デオキシコール酸ナトリウム；タウロコール酸；タウロコール酸ナトリウム；タウロデオキシコール酸；タウロデオキシコール酸ナトリウム；３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパン−スルホネート（ＣＨＡＰＳ）；３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパン−スルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）；Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパン−スルホネート（ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ ３−１２）；Ｎ，Ｎ−ビス−（３−Ｄ−グルコネアミドプロピル（ｇｌｕｃｏｎｅａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ））−デオキシコラミド（ＤＥＯＸＹ−ＢＩＧＣＨＡＰ）；Ｎ−オクチルグルコシド；スクロースモノラウレート；グリココール酸／グリココール酸ナトリウム；ラウロサルコシン（ナトリウム塩）；グリコデオキシコール酸／グルコデオキシコール酸ナトリウム；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；およびヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）；ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド；ヘキサデシルトリメチル−アンモニウムブロミド；テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド；ベンジルジメチルドデシルアンモニウムブロミド；ベンジルジメチル−ヘキサデシルアンモニウムクロライド；ベンジルジメチルテトラ−デシルアンモニウムブロミド。上記の界面活性剤は、例えば、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから市販されている。当該分野で公知の種々の陽イオン性脂質もまた、界面活性剤として使用され得る。Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら，１９９６，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１６３−７２およびＧａｏ，Ｘ．，およびＬ．Ｈｕａｎｇ．１９９５，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２：７１１０−７２２を参照のこと。
【０１０４】
次いで、微粒子／界面活性剤混合物を、例えば、セラミック乳鉢および乳棒を使用して、滑らかなスラリーが形成されるまで物理的に挽く。次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはＴｒｉｓ緩衝生理食塩水のような適切な水性緩衝液を加え、得られた混合物を、微粒子が十分に懸濁されるまで超音波処理またはホモジナイズする。次いで、目的の高分子を微粒子懸濁液に加え、その系を透析して界面活性剤を除去する。このポリマー微粒子と界面活性剤の系は、好ましくは、目的の高分子が、高分子の活性を維持したまま微粒子の表面に吸収されるように選択される。表面に吸収された高分子を含む得られた微粒子を、未結合の高分子がないように洗浄し得、そして適切な緩衝液処方物中で懸濁液として保存し得るかまたは以下にさらに記載するように適切な賦形剤で凍結乾燥し得る。
【０１０５】
（２．さらなる粒子キャリア）
微粒子に加えて、組成物もまた、粒子キャリアに包括され得るか、吸収され得るか、また結合され得る。このようなキャリアは、免疫に対して選択された抗原の複数コピーを示し、局所的なリンパ節における抗原の移動、トラップおよび保持を促進する。この粒子は、マクロファージおよび樹状細胞のような特殊な（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎ）抗原掲示細胞によって取りこまれ得、そして／またはサイトカイン放出の刺激のような他の機構を介して抗原掲示を増強し得る。
【０１０６】
特定の実施形態において、組成物は、ポリメチルメタクリレートポリマーから誘導される粒子キャリアを使用して送達される。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；ＭｃＧｅｅ ＪＰら，Ｊ Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．１４（２）：１９７−２１０，１９９７；Ｏ’Ｈａｇａｎ ＤＴら，Ｖａｃｃｉｎｅ １１（２）：１４９−５４，１９９３を参照のこと。
【０１０７】
さらに、他の粒子系およびポリマーが目的の遺伝子のインビボまたはエキソビボ送達のために使用され得る。例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、スペルミジンのようなポリマー、ならびにこれらの分子の結合体が、目的の核酸を送達するのに有用である。同様に、ＤＥＡＥデキストラン−媒介トランスフェクション、リン酸ストロンチウム、ベントナイトおよびカオリンを含有するケイ酸アルミニウム、酸化クロム、ケイ酸マグネシウム、タルクなどのような他の不溶性無機塩を使用するリン酸カルシウム沈殿が、本発明の方法と共に使用される。例えば、遺伝子送達に有用な送達系の総説については、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９０）５：１６３−１８７を参照のこと。ペプトイド（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｎ．，ら，米国特許第５，８３１，００５号，１９９８年１１月３日発行）もまた、本発明の構成物の送達のために使用され得る。
【０１０８】
さらに、金およびタングステンのような粒子キャリアを使用するビオチン送達システムは、本発明の合成発現カセットの送達に特に有用である。この粒子は、送達されるべき合成発現カセットでコーティングされ、そして「遺伝子銃」から発射される黒色火薬（ｇｕｎ ｐｏｗｄｅｒ）を使用して、一般的に低気圧下で高速度に加速される。このような技術の記載およびそのために有用な装置については、米国特許第４，９４５，０５０号；同第５，０３６，００６号；同第５，１００，７９２号；同第５，１７９，０２２号；同第５，３７１，０１５号；および同第５，４７８，７４４号を参照のこと。また、ニードルレス（ｎｅｅｄｌｅ−ｌｅｓｓ）注射システムもまた、使用され得る（Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．，ら，Ｖａｃｃｉｎｅ １２：１５０３−１５０９，１９９４；Ｂｉｏｊｅｃｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）。
【０１０９】
（３．リポソーム／脂質送達ビヒクル）
目的の抗原（またはこれらの抗原をコードするポリヌクレオチド）はまた、リポソームを使用して送達され得る。例えば、目的の抗原は、被験体または被験体由来の細胞への送達の前にリポソーム中にＤＮＡまたはＲＮＡとしてパッケージングされる。脂質封入は、一般的には、核酸を安定に結合または包括し得、そして保持し得るリポソームを使用して達成される。凝集されたＤＮＡ 対 脂質調製物の比は、変化し得るが、一般的には約１：１（ｍｇＤＮＡ：マイクロモル脂質）であるか、または脂質がさらに多いかである。核酸の送達のためのキャリアとしてのリポソームの使用の総説については、ＨｕｇおよびＳｌｅｉｇｈｔ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９９１）１０９７：１−１７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８３），Ｖｏｌ．１０１，５１２−５２７頁を参照のこと。
【０１１０】
陽イオン性リポソームを含む、陽イオン性（正に荷電している）調製物、陰イオン性（負に荷電している）調製物および中性調製物を含む本発明に使用するためのリポソーム調製物が、特に好ましい。陽イオン性リポソームは、機能的形態において、プラスミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１６）；ｍＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：６０７７−６０８１）；および精製された転写因子（Ｄｅｂｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）２６５：１０１８９−１０１９２）の細胞内送達を媒介することが示されている。
【０１１１】
カチオン性リポソームは、容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹからのＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）に基づいて入手可能である（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３〜７４１６もまた参照のこと）。他の市販の脂質としては、（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）が挙げられる。他のカチオン性リポソームは、当該分野で周知の技術を使用して、容易に入手可能な材料から調製され得る。例えば、Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：４１９４〜４１９８；ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記載について、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９０／１１０９２を参照のこと。カチオン性微粒子は、当該分野で周知の技術を使用して、容易に入手可能な材料から調製され得る。例えば、共有に係るＷＯ０１／１３６５９９を参照のこと。
【０１１２】
同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から容易に入手可能であるか、または、容易に入手可能な材料を使用して、容易に調製され得る。このような物質としては、特に、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジル（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｈａｔｉｄｙｌ）エタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの材料はまた、適切な比率で、ＤＯＴＭＡ出発物質およびＤＯＴＡＰ出発物質と混合され得る。これらの材料を使用してリポソームを作製するための方法は、当該分野で周知である。
【０１１３】
リポソームは、多重層小胞（ＭＬＶ）、小単層小胞（ＳＵＶ）または巨大単層小胞（ＬＵＶ）を含み得る。様々なリポソーム核酸複合体は、当該分野で公知の方法を使用して調製される。例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（１９８３），Ｖｏｌ．１０１ ｐｐ．５１２−５２７；Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：４１９４−４１９８；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７５）３９４：４８３；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ（１９７９）１７：７７）；Ｄｅａｍｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｇｈａｍ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７６）４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９７７）７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：３３４８）；Ｅｎｏｃｈ ａｎｄ Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：１４５）；Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；Ｓｚｏｋａ ａｎｄ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：１４５；およびＳｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８２）２１５：１６６を参照のこと。
【０１１４】
ＤＮＡおよび／またはタンパク質抗原はまた、Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９７５）３９４：４８３〜４９１により記載されるものと類似した渦巻形のｃｏｃｈｌｅａｔｅの脂質組成物中に送達され得る。米国特許第４，６６３，１６１号および同第４，８７１，４８８号をまた参照のこと。
【０１１５】
（４．遺伝子送達ビヒクル）
特定の実施形態において、本明細書中に記載される１つ以上の抗原は、標準的遺伝子送達プロトコルを使用する、核酸免疫化などを介して投与される１つ以上の遺伝子ベクターを使用して送達され得る。遺伝子送達のための方法は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号；同第５，５８０，８５９号；同第５，５８９，４６６号を参照のこと。この構築物は、皮下、表皮的、皮内的、筋内的、静脈内的、粘膜的（例えば、鼻腔的、直腸的、および膣的）、腹腔内的、経口的またはこれらの組合せのいずれかで送達、例えば注入され得る。
【０１１６】
本発明の実施で使用され得る、例示的な複製欠損遺伝子送達ビヒクルは、αウイルスベクターのいずれかであり、例えば、共有に係る米国特許第６，３４２，３７２号；同第６，３２９，２０１号および国際公開ＷＯ０１／９２５５２に記載される。
【０１１７】
多数のウイルスベースの系が、哺乳動物細胞への遺伝子移送のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための簡便なプラットフォームを提供する。選択された配列は、当該分野で公知の技術を使用して、ベクター中に挿入され得、そして、レトロウイルス粒子中にパッケージされ得る。次いで、組換えウイルスは、単離され得、そして、インビボまたはエキソビボのいずれかで被験体の細胞に送達され得る。多数のレトロウイルス系が記載されている（米国特許第５，２１９，７４０号；ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８９）７：９８０−９９０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９０）１：５−１４；Ｓｃａｒｐａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１）１８０：８４９−８５２；Ｂｕｒｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０：８０３３−８０３７；ならびにＢｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．（１９９３）３：１０２〜１０９）。
【０１１８】
多数のアデノウイルスベクターもまた記載されている。宿主ゲノムへ組込むレトロウイルスとは異なり、アデノウイルスは、染色体外に存続し、したがって、挿入的突然変異誘発に関連する危険を最小にする（Ｈａｊ−Ａｈｍａｄ ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５７：２６７−２７４；Ｂｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：５９１１−５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：７１７−７２９；Ｓｅｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：９３３−９４０；Ｂａｒｒら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１−５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８８）６：６１６−６２９；およびＲｉｃｈら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９３）４：４６１−４７６）。
【０１１９】
さらに、様々なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系は、遺伝子送達のために開発された。ＡＡＶベクターは、当該分野で周知の技術を使用して容易に構築され得る。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同第５，１３９，９４１号；国際公開番号ＷＯ９２／０１０７０（１９９２年１月２３日公開）およびＷＯ９３／０３７６９（１９９３年３月４日公開）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）８：３９８８〜３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９０（１９９０）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７−１２９；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：７９３−８０１；Ｓｈｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：１６５−１６９；ならびにＺｈｏｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９４）１７９：１８６７−１８７５を参照のこと。
【０１２０】
ポリヌクレオチドを、粘膜的およびその他で送達するために有用な別のベクター系は、Ｓｍａｌｌ，Ｊｒ．，Ｐ．Ａ．ら、（米国特許第５，６７６，９５０号（１９９７年１０月１４日））によって記載された、腸投与された組換えポックスウイルスワクチン、ならびに、ワクシニアウイルスおよびトリポックスウイルスである。一例として、遺伝子を発現するワクシニアウイルス組換え体は、第一に、以下のように構築され得る。特定の合成Ｇａｇ／抗原コード配列をコードするＤＮＡは、ワクシニアプロモーターおよび側方のワクシニアＤＮＡ配列（例えば、チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする配列）に隣接するように、適切なベクターに最初に挿入される。次いで、このベクターを使用して、ワクシニアで同時感染された細胞をトランスフェクトする。相同組み換えは、ワクシニアプロモーターおよび目的のコード配列をコードする遺伝子をウイルスゲノム中に挿入するのに役立つ。得られたＴＫ組換え体は、５−ブロモデオキシウリジンの存在下で細胞を培養すること、および、それらに対するウイルスプラーク耐性を選択することで、選択され得る。
【０１２１】
あるいは、アビポックスウイルス（例えば、鶏痘ウイルスおよびカナリア痘ウイルス）をまた使用して、遺伝子を送達し得る。哺乳動物病原体から免疫源を発現する組換え体アビポックスウイルスは、非トリ種に投与された場合、防御免疫を付与することが知られている。アビポックスベクターの使用は、アビポックス属のメンバーが、感受性のあるトリ種において生産的に複製されるのみであり得、従って、哺乳動物細胞中で感染性でないので、ヒトおよび他の哺乳動物種において特に所望される。組換えアビポックスウイルスを生成する方法は、当該分野で公知であり、そして、ワクシニアウイルスの生成に関して上記のような遺伝的組み換えを使用する。例えば、ＷＯ９１／１２８８２；ＷＯ８９／０３４２９；およびＷＯ９２／０３５４５を参照のこと。ピコナウイルス由来のベクターもまた、使用され得る（例えば、米国特許第５，６１４，４１３号および同第６，０６３，３８４号を参照のこと）。
【０１２２】
分子結合体化ベクター（例えば、ＭｉｃｈａｅｌらＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６８：６８６６〜６８６９およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：６０９９〜６１０３に記載されたアデノウイルスキメラベクター）もまた、遺伝子送達に使用され得る。
【０１２３】
ワクシニアに基づく感染／トランスフェクション系は、宿主細胞で目的のコード配列（例えば、合成Ｇａｇ／ＨＣＶコア発現カセット）の誘導性の一過的発現を提供するために、簡便に使用され得る。この系において、細胞は、第一に、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードするワクシニアウイルス組換体を用いて、インビトロで感染される。このポリメラーゼは、これが、Ｔ７プロモーターを有する鋳型を転写するのみという点で、感受性の強い特異性を示す。感染後、細胞は、Ｔ７プロモーターによって促進された目的のポリヌクレオチドを用いてトランスフェクトされる。ワクシニアウイルス組換え体から細胞質中で発現されたポリメラーゼは、感染されたＤＮＡを、宿主の翻訳機構によって次いでタンパク質に翻訳されるＲＮＡに転写する。この方法は、高レベルで一過性の、大量のＲＮＡおよびその翻訳産物の細胞質性生成物を提供する。例えば、Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎおよびＭｏｓｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：６７４３〜６７４７；Ｆｕｅｒｓｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：８１２２〜８１２６を参照のこと。
【０１２４】
ワクシニアウイルス組換え体もしくはアビポックスウイルス組換え体での感染、または、他のウイスルベクターを使用した遺伝子の送達に対する代替のアプローチとして、宿主細胞への導入後に高レベルの発現を導く増幅系が使用され得る。詳細には、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼについてのコード領域に先立つＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが、操作され得る。この鋳型由来のＲＮＡの翻訳は、次にはそれ以上の鋳型を転写するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを生成する。同時に、発現がＴ７プロモーターの制御下にあるｃＤＮＡが存在する。従って、増幅した鋳型ＲＮＡの翻訳から生成したＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのいくつかは、所望の遺伝子の転写を導く。いくつかのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、増幅を開始するために必要とされるので、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、転写反応を初回抗原刺激するために、鋳型とともに細胞に導入され得る。このポリメラーゼは、タンパク質としてか、または、ＲＮＡポリメラーゼをコードするプラスミド上で導入され得る。Ｔ７系のさらなる討論および形質転換細胞についてのそれらの使用について、例えば、国際公開番号ＷＯ ９４／２６９１１；ＳｔｕｄｉｅｒおよびＭｏｆｆａｔｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８６）１８９：１１３〜１３０；ＤｅｎｇおよびＷｏｌｆｆ，Ｇｅｎｅ（１９９４）１４３：２４５〜２４９；Ｇａｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９４）２００：１２０１〜１２０６；ＧａｏおよびＨｕａｎｇ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９３）２１：２８６７〜２８７２；Ｃｈｅｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．（１９９４）２２：２１１４〜２１２０；ならびに米国特許第５，１３５，８５５号を参照のこと。
【０１２５】
（Ｄ．薬学的組成物）
本発明はまた、薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤またはレシピエントと組合せたポリペプチド抗原またはポリヌクレオチド抗原を含む薬学的組成物を含む。さらに、他の成分（例えば、アジュバント）もまた、存在し得る。米国特許第６，０１５，６９４号により完全に記載されるように、保存安定でかつ容易に投与可能な免疫原性組成物は、冷蔵および／または従来の投与手段（シリンジなど）が容易に利用可能でない第三世界の国々で特に必要とされる。
【０１２６】
特定の実施形態において、この組成物は、１つ以上のポリペプチドを含む。活性成分として免疫原性ポリペプチドを含む免疫原性組成物の調製は、当業者に公知である。代表的には、このような免疫原性化合物は、液体かまたは懸濁液のいずれかとして注入可能に調製され；注入の前の液体中の溶液または懸濁液に適切な固体形態もまた調製され得る。この調製物はまた、乳化されても、リポソーム中にカプセル化されたタンパク質でもよい。
【０１２７】
本発明の組成物は、好ましくは、薬学的に受容可能なキャリアを含む。このキャリアは、宿主に対して有害な抗体の生成を、それ自身が誘導すべきでない。薬学的に受容可能なキャリアは、当業者に周知である。適切なキャリアは、代表的には、巨大で、ゆっくり代謝される高分子であり、例えば、以下のようなものである：タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソーム）および不活性ウイルス粒子。粒子状キャリアの例としては、ポリメチルメタクリレートポリマーから誘導されるキャリア、ならびに、ポリ（ラクチド）およびポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧとして知られる）から誘導される微粒子が挙げられる。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２〜３６８；ＭｃＧｅｅら（１９９７）Ｊ Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．１４（２）：１９７〜２１０；Ｏ’Ｈａｇａｎら（１９９３）Ｖａｃｃｉｎｅ １１（２）：１４９〜５４を参照のこと。このようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、これらのキャリアは、免疫賦活剤（「アジュバント」）として機能し得る。さらに、抗原は、細菌性トキソイド（例えば、ジフテリア由来のトキソイド、破傷風由来のトキソイド、コレラ由来のトキソイドなど、ならびにＥ．ｃｏｌｉ由来の毒素）に結合体化され得る。
【０１２８】
薬学的に受容可能な塩はまた、本発明の組成物中で使用され得、例えば、ヒドロクロリド、ヒドロブロミド、ホスフェートまたはサルフェートのような無機塩類、ならびに、アセテート、プロピオネート、マロネートまたはベンゾエートのような有機酸の塩である。特に有用なタンパク質基質は、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシニアン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミン、破傷風トキソイド、および、当業者に周知の他のタンパク質である。本発明の組成物はまた、液体または賦形剤（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、デキストロース、エタノールなど、単一でかまたは組合せて）、ならびに、物質（例えば、湿潤剤、乳化剤またはｐＨ緩衝剤）を含み得る。リポソームはまた、本発明の組成物のためのキャリアとして使用され得、このようなリポソームは、上記されている。
【０１２９】
さらに、本明細書中で記載される組成物は、種々の賦形剤、アジュバンド、キャリア、補助物質、調節剤などを含み得る。好ましくは、この組成物は、免疫応答をマウントするのに十分な量の抗原を含む。適切な有効量は、当業者によって決定され得る。このような量は、日常的な試験を介して決定され得る比較的広い範囲であり、一般に、粒子／抗原の約０．１μｇから約１０００μｇ、より好ましくは約１μｇ〜約３００μｇ程度の量であり得る。
【０１３０】
このようなアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（１）アルミニウム塩（ミョウバン）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）；（２）（他の特定の免疫腑活剤（例えば、ムラミルペプチド（以下を参照のこと）または細菌細胞壁成分）を含むか、または含まない）例えば、以下のような水中油乳濁処方物：（ａ）ＭＦ５９（国際公開番号ＷＯ９０／１４８３７）、これは、Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙミクロフリューダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）のようなミクロフリューダイザーを使用してサブミクロン粒子に処方された、５％のＳｑｕａｌａｎｅ、０．５％のＴｗｅｅｎ ８０および５％のＳｐａｎ ８５（必要に応じて、必要とはされないが、種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（以下を参照のこと）を含む）を含む（ｂ）ＳＡＦ、これは、より巨大な粒子サイズ乳化剤を生成するためにサブミクロン乳化剤にミクロフリューダイズかまたはボルテックスのいずれかなをされた、１０％のＳｑｕａｌｅｎｅ、０．４％のＴｗｅｅｎ ８０、０．５％のプルロニックブロック化ポリマーＬ １２１およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照のこと）を含む、ならびに（ｃ）Ｒｉｂｉ^ＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）これは、２％のＳｑｕａｌｅｎｅ、０．２％のＴｗｅｅｎ ８０、ならびに、モノホスホリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ^ＴＭ））からなる群由来の１つ以上の細菌細胞壁成分を含む；（３）使用され得るサポニンアジュバント（例えば、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ^ＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ））、またはＩＳＣＯＭ（免疫腑活複合体）のような、それから生成される粒子（例えば、国際公開番号ＷＯ００／００２４９を参照のこと）；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２など））、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、βケモカイン（ＭＩＰ、１−αランテス、１−βランテスなど）；（６）細菌ＡＤＰ−リボシル化毒素（例えば、コレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定毒素（ＬＴ））の解毒変異体（特に、ＬＴ−Ｋ６３（リジンが、野生型アミノ酸の６３位で置換される）、ＬＴ−Ｒ７２（アルギニンが野生型アミノ酸の７２位で置換されている）、ＣＴ−Ｓ１０９（セリンが、野生型アミノ酸の１０９位で置換されている）、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（リジンが、野生型アミノ酸の９位で置換され、そして、グリシンが１２９位で置換される））（例えば、国際公開番号ＷＯ９３／１３２０２；ＷＯ９２／１９２６５；ＷＯ９５／１７２１１；ＷＯ９８／１８９２８；およびＷＯ０１／２２９９３を参照のこと）；（７）オリゴで生物接着性のポリマーを含むＣｐＧ（ＷＯ９９／６２５４６およびＷＯ００／５００７８を参照のこと）；ならびに（８）この組成物の有効性を増強するために免疫腑活剤として作用する他の物質。
【０１３１】
ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ（ｈｕｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）など）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３２】
ムラミルペプチドとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）など。
【０１３３】
サッカリド抗原または糖質抗原が使用される場合、その抗原は、キャリヤタンパク質に結合体化され得る。（例えば、米国特許第５，３０６，４９２号、ＥＰ ０ ４７７ ５０８；ＷＯ９８／４２７２１；Ｒａｍｓａｙら、（２００１）Ｌａｎｃｅｔ ３５７：１９５〜１９６；「Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」Ｃｒｕｓｅら編、ＩＳＢＮ３８０５５４９３２６を参照のこと）。好ましいキャリヤタンパク質としては、細菌毒素または細菌トキソイド（例えば、ジフテリア（例えば、ＣＲＭ_１９７）トキソイドまたは破傷風トキソイド）が挙げられる。他の適切なキャリヤタンパク質としては、以下が挙げられる：Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質（ＥＰ０３７２５０１）；合成ペプチド（ＥＰ０３７８８８１およびＥＰ０４２７３４７）；熱ショックタンパク質（ＷＯ９３／１７７１２）；サイトカイン、リンホカイン、ホルモン、増殖因子、百日咳タンパク質（ＷＯ９８／５８６６８；ＥＰ０４７１１７７）；Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａ由来のプロテインＤ（ＷＯ００／５６３６０）；Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素Ａまたは毒素Ｂ（ＷＯ００／６１７６１）など。キャリヤタンパク質の混合物を使用することは、可能である。混合物が、血清型Ａおよび血清型Ｃの両方に由来する莢膜サッカリドを含む場合、ＭｅｎＡサッカリド：ＭｅｎＣサッカリドの比率（ｗ／ｗ）は、１より大きい（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１以上）ことが好ましい。異なる血清型（例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの異なる血清型）または異なる病原体由来のサッカリドは、同一のキャリヤタンパク質または異なるキャリヤタンパク質に結合体化され得る。
【０１３４】
薬学的組成物はまた、凍結乾燥され得るか、または他の方法で貯蔵安定性にされ得る。
【０１３５】
本明細書中に記載される薬学的組成物の投与は、任意の適切な経路（例えば、上記を参照のこと）によってなされ得る。非経口初回抗原刺激（または複数の初回抗原刺激）およびそれに続く粘膜追加免疫（または複数の粘膜追加免疫）が、特に好ましい。さらに、この投与は、複数回初回抗原刺激追加免疫投与の形態を取り得る。従って、投薬処置は、単回初回抗原刺激／追加免疫投与スケジュールまたは複数回初回抗原刺激／追加免疫投与スケジュールであり得る。複数の投与スケジュールは、ワクチン接種の主な治療単位が、１〜１０の別々の投与であり得、その後、免疫応答を維持および／または強化するために選択された引き続く時間間隔で与えられる他の用量（例えば、第２の投与について１〜４ヶ月、および必要に応じて、数ヵ月後の引き続く用量）であり得るスケジュールである。投薬レジメンはまた、少なくとも部分的には、様式の効力、使用するワクチン送達、被験体の必要性により決定され、そして実施者の判断に依存する。
【０１３６】
複数投与（例えば、初回抗原刺激追加免疫型投与）は、有利に使用される。例えば、目的の抗原を発現する組換えアルファウイルス粒子が、投与される（例えば、ＩＶＡＧまたはＩＲ）。続いて、抗原は、例えば、ポリペプチド抗原および適切なアジュバントを含む組成物で投与される。あるいは、抗原は、遺伝子送達ビヒクルより先に投与される。複数のポリペプチド投与および複数の遺伝子送達ビヒクルの投与（任意の順序）もまた、使用され得る。
【０１３７】
この組成物は、好ましくは、「治療的有効量」の目的の高分子を含有し得る。すなわち、症状を予防、減少、除去または診断するために、十分な応答を被験体に生成させる量の高分子／微粒子が組成物中に含まれる。正確な必要量は、他にも因子はあるが、処置される被験体；処置される被験体の年齢および全身状態；処置される状態の重症度；免疫学的応答の場合、被験体の免疫系が抗体を合成する能力；所望される保護の程度および選択される特定の抗原、ならびにその投与の様式に依存して変動する。適切な有効量は、当業者によって容易に決定され得る。従って、「治療的有効量」は、慣用的な試行を通じて決定され得る比較的広範囲に落ち着く。例えば、本発明の目的について、高分子がポリヌクレオチドである場合、有効用量は、代表的には、１用量あたり約１ｎｇ〜約１ｍｇ、より好ましくは、約１０ｎｇ〜約１μｇ、そして最も好ましくは、約５０ｎｇ〜約５００ｎｇの送達される高分子範囲であり；高分子が抗原である場合、有効用量は、代表的には、１用量あたり約１μｇ〜約１００ｍｇ、より好ましくは、約１０μｇ〜約１ｍｇ、そして最も好ましくは、約５０μｇ〜約５００μｇの送達される高分子範囲である。
【０１３８】
以下の実施例は、例証の目的で提供され、そして限定の目的では提供されない。
【実施例】
【０１３９】
（実施例１）
（ＨＩＶ抗原を用いる非経口初回抗原刺激粘膜追加免疫後の血清ＩｇＧ力価および膣洗浄物ＩｇＡ力価）
マウスを、アニオン性ＰＬＧ ＤＳＳ微粒子上に吸着させたｇｐ１２０タンパク質を用いて、筋肉内に２回初回抗原刺激した。１０μｇのｇｐ１２０／ＰＬＧを、０日目および１４日目に与えた。この動物を、１０日間隔で３回、粘膜追加免疫した。この粘膜追加免疫は、ＡＣＰ、生体接着ポリマー（Ｆｉｄｉａ）、ＬＴＲ７２（Ｃｈｉｒｏｎ Ｓ．ｐ．Ａ）またはオリゴ含有ＣｐＧといった粘膜アジュバントを用いて、膣内、直腸内または鼻腔内で行った（１８２６ Ｈ．Ｃ．Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （１９９８）１６０：８７０〜８７６）。
【０１４０】
非経口初回抗原刺激後の粘膜追加免疫の効果を研究した。そして結果を表１に示す。
【０１４１】
【表１】

ＩＭｘ２ − ２回の筋肉内投与
ＩＶａｇｘ３ − ３回の膣内投与
ＩＲｘ３ − ３回の直腸内投与
ＩＮｘ３ − ３回の鼻腔内投与。
【０１４２】
表１および図１に示されるように、膣洗浄物によって決定されるような粘膜ＩｇＡ力価および血清ＩｇＧ力価は、粘膜追加免疫していない動物と比較して、粘膜追加免疫された動物において増加した。
【０１４３】
（実施例２）
（ＨＩＶ抗原を用いる非経口初回抗原刺激および粘膜追加免疫後の血清力価）
以下の実施例は、ＩＭ初回抗原刺激後の粘膜追加免疫後の増加した血清ＩｇＧ力価を示す。
【０１４４】
マウスを、実施例１に記載されるように、１０μｇのｇｐ１２０／ＰＬＧを用いて筋肉内で免疫した。３回の粘膜（鼻腔内または直腸内）追加免疫を、上記されるように、粘膜アジュバントＬＴＲ７２、ＡＣＰまたはＣｐＧ（１８２６）を用いて与えた。
【０１４５】
【表２】

ＩＭｘ２ − ２回の筋肉内投与；ＩＶａｇｘ３ − ３回の膣内投与；ＩＲｘ３ − ３回の直腸内投与；ＩＮｘ３ − ３回の鼻腔内投与。
【０１４６】
表２は、平均血清ＩｇＧ力価が、粘膜追加免疫を受けた動物について増加されることを示す。
【０１４７】
（実施例３）
（非経口初回抗原刺激および粘膜追加免疫後の膣洗浄物ＩｇＡ力価）
以下の実施例は、ＩＭ初回抗原刺激後の粘膜追加免疫後の増加した粘膜（膣洗浄物）ＩｇＡ力価を示す。マウスを、実施例１および実施例２に記載されるように免疫した。結果を、表３に示す。
【０１４８】
【表３】

表３に示される結果は、膣洗浄物ＩｇＡ力価によって測定されるような粘膜力価が、非経口ポリペプチド投与および粘膜追加免疫後に増加されることを示す。
【０１４９】
（実施例４）
（記憶追加免疫後の血清力価）
以下の実施例は、非経口（筋肉内）初回抗原刺激後の記憶（ｍｅｍｏｒｙ）粘膜（鼻腔内）追加免疫後の増加した血清ＩｇＧ力価を示す。記憶追加免疫を、最初の初回抗原刺激の１８ヶ月後に行ったことを除いて、マウスを、基本的に上記されるように免疫した。結果を、表４および図２に示す。
【０１５０】
【表４】

ＩＭｘ２ − ２回の筋肉内投与
ＩＭ − １回の筋肉内投与
ＩＮ − １回の鼻腔内投与
ＩＮｘ３ − ３回の鼻腔内投与。
【０１５１】
これらの結果は、ＥＬＩＳＡによって測定されるような血清力価が、１８ヵ月目での粘膜記憶追加免疫後に増加されることを示す。力価はまた、非経口初回抗原刺激がＤＮＡを用いる場合、タンパク質と比較して増加される。
【０１５２】
（実施例５）
（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｂ（ＭｅｍＢ）−ＰＬＧを用いる非経口初回抗原刺激粘膜追加免疫後の力価）
マウスを、上記されるように、ＭｅｎＢ２８７抗原（ＷＯ／００／６６７９１を参照のこと）を用いて、初回抗原刺激および追加免疫する。このＭｅｎＢ２８７抗原は、ＰＬＧ微粒子および／またはＣｐＧとともに処方される。結果を、以下の表５に示す。「ＩＭ」とは、筋肉内投与をいい、「ＩＮ」とは、鼻腔内投与をいう。「Ｉｍｍ数（＃）」とは、免疫の数をいう。免疫１を、０日目に与え；免疫２を、２８日目に与え；免疫３を、８４日目に与え；そして免疫４を、９８日目に与えた。「２ｗｐ２」とは、免疫数２の２週間後（４２日目）に採取した血から得られた力価をいい；「２ｗｐ３」とは、免疫数３の２週間後（９８日目）に採取した血から得られた力価をいい；そして「２ｗｐ４」とは、免疫数４の２週間後（１１２日目）に採取した血から得られた力価をいう。
【０１５３】
【表５】

表５に示されるように、力価は、３度目の免疫が鼻腔内である場合、筋肉内と比較して有意に増加する。力価はまた、２度目の粘膜追加免疫（免疫数４）後に、上昇したままである（かまたは増加される）。
【０１５４】
（実施例６）
（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原またはＨｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ（ＨＩＢ）抗原を用いる非経口初回抗原刺激粘膜追加免疫後の血清ＩｇＧ力価および膣洗浄物ＩｇＡ力価）
マウスを、以下のスケジュール：
【０１５５】
【表６】

に従って、ＭｅｎＣ抗原またはＨＩＢ抗原を用いて、初回抗原刺激および追加免疫する。
【０１５６】
ＩＮ − 鼻腔内投与
ＳＣ − 皮下投与
全ての群について、ＥＬＩＳＡを、最初の投与の前（すなわち、０日目の前）および各々の免疫後に、標準的な手順に従って実施する。ＭｅｎＣについて、殺菌性抗体力価アッセイもまた、免疫応答を評価するために使用し得る。群２は、他の群と比較して大きな全身性免疫応答および／または粘膜免疫応答を示す。
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】図１は、全身性初回抗原刺激および粘膜追加免疫免疫の後のＨＩＶエンベロープペプチドに対する血清抗体および膣の抗体の応答の増強を示すグラフを示す。グレーのバーは、膣洗浄液からの力価を示し、一方で斜線のストライプのバーは、血清抗体を示す。種々の様式の送達およびアジュバントが、この水平軸上のバーの下に示される。
【図２】図２は、元の初回抗原刺激追加免疫の１８ヶ月後の１回の筋肉内（ＩＭ）記憶追加免疫または鼻腔内（ＩＮ）記憶追加免疫によるＨＩＶエンベロープ特異的血清ＩｇＧ力価（ＥＬＩＳＡによって測定される）を示すのグラフである。種々の様式の送達およびアジュバントが、この水平軸上のバーの下に示される。

Claims (38)

1. 被験体において免疫応答をもたらす方法であって、
   （ａ）１つ以上のポリペプチド抗原を含む第１の免疫原性組成物を非経口投与する工程、および；
   （ｂ）１つ以上の抗原を含む第２の免疫原性組成物を経粘膜投与する工程、
   を包含し、これらによって被験体における免疫応答を誘導する、方法。
2. 前記経粘膜投与が鼻腔内投与である、請求項１に記載の方法。
3. 前記経粘膜投与が直腸内投与である、請求項１に記載の方法。
4. 前記経粘膜投与が膣内投与である、請求項１に記載の方法。
5. 前記非経口投与が経皮的である、請求項１に記載の方法。
6. 前記第１の免疫原性組成物が、微粒子をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記第２の免疫原性組成物が、微粒子を用いて送達される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記微粒子がＰＬＧを含む、請求項６または７に記載の方法。
9. 前記免疫応答が全身性の免疫応答である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記免疫応答が、粘膜の免疫応答である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記免疫応答が、１つ以上の病原体に由来する抗原に対してもたらされる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記病原体が、細菌である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記細菌が、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓである、請求項１２に記載の方法。
14. 前記細菌が、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのサブグループＢである、請求項１３に記載の方法。
15. 前記細菌が、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのサブグループＣである、請求項１３に記載の方法。
16. 前記抗原がカプセルのオリゴ糖である、請求項１５に記載の方法。
17. 前記サッカリドがＣＲＭ１９７に結合体化される、請求項１６に記載の方法。
18. 前記細菌が、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型（ＨＩＢ）である、請求項１２に記載の方法。
19. 前記細菌が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである、請求項１２に記載の方法。
20. 前記細菌が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅである、請求項１２に記載の方法。
21. 前記病原体が、ウイルスである、請求項１１に記載の方法。
22. 前記ウイルスが、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、およびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
23. 前記ウイルスが、ＨＩＶ−１である、請求項２２に記載の方法。
24. 前記ウイルスが、ＲＳＶである、請求項２２に記載の方法。
25. 前記ウイルスが、ＰＩＶである、請求項２２に記載の方法。
26. 前記ウイルスが、ＨＣＶである、請求項２２に記載の方法。
27. 前記抗原の１つ以上が、腫瘍抗原である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
28. 前記第１および第２の免疫原性組成物が、同じ病原体由来の抗原を含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
29. 前記第１および第２の免疫原性組成物が同じである、請求項２８に記載の方法。
30. 前記第２の免疫原性組成物が、前記第１の免疫原性組成物の抗原とは異なる少なくとも１つの抗原を含む、請求項２８に記載の方法。
31. 前記第１および第２の免疫原性組成物が、異なる病原体由来の抗原を含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
32. 前記第１の免疫原性組成物が、１つ以上の抗原をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
33. 前記第２の免疫原性の抗原の１つ以上が、１つ以上のポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
34. 前記第２の免疫原性組成物の抗原が、ポリヌクレオチドを含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
35. 工程（ａ）が、２回以上実行される、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
36. 工程（ｂ）が、２回以上実行される、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
37. 被験体において腫瘍抗原に対する免疫応答をもたらす方法であって、
    １つ以上の腫瘍抗原を含む第１の免疫原性組成物を非経口投与する工程、および；
    １つ以上の腫瘍抗原を含む第２の免疫原性組成物を経粘膜投与する工程、
    を包含する、方法。
38. 前記第１の免疫原性組成物が、前記腫瘍抗原をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む、請求項３７に記載の方法。

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