JP2004527482A - Ah受容体リガンド、2−(1’H−インドール−3’−カルボニル)−チアゾール−4−カルボン酸メチルエステルの調製物および使用 - Google Patents
Ah受容体リガンド、2−(1’H−インドール−3’−カルボニル)−チアゾール−4−カルボン酸メチルエステルの調製物および使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004527482A JP2004527482A JP2002563932A JP2002563932A JP2004527482A JP 2004527482 A JP2004527482 A JP 2004527482A JP 2002563932 A JP2002563932 A JP 2002563932A JP 2002563932 A JP2002563932 A JP 2002563932A JP 2004527482 A JP2004527482 A JP 2004527482A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ligand
- ahr
- etal
- receptor
- methanol
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
- C07D417/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings
- C07D417/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/08—Bronchodilators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/24—Drugs for disorders of the endocrine system of the sex hormones
- A61P5/28—Antiandrogens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/24—Drugs for disorders of the endocrine system of the sex hormones
- A61P5/32—Antioestrogens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
- C07D413/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
- C07D413/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Virology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Oncology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Child & Adolescent Psychology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
【0001】
本出願は、2001年2月14日に提出された米国仮出願第60/268,809号(この記載内容を本明細書に援用する)に基づく優先権を主張するものである。
【連邦政府により援助を受けた研究または開発に関する記述】
【0002】
−
【背景技術】
【0003】
アリール炭化水素受容体。
アリール炭化水素受容体(AhR)は、そのリガンドと結合することによって広いスペクトル範囲の生物学的プロセスを媒介するリガンド誘導性転写因子である。チトクロムP450ファミリーの酵素を誘導する以外に、この受容体は細胞増殖、腫瘍促進、免疫抑制、ビタミンA減少、ならびに発育異常および生殖異常と関与していることが分かっている(Fletcher,etal., 2001;Safe,2001;Gu,etal., 2000;Poellinger, 2000;SchmidtおよびBradfield, 1996;Whitlock,etal., 1997)。このリガンドと結合した受容体は、細胞周期の停止、アポトーシス、脂肪分化、および抗エストロゲン作用も引き起こす(Bonnesen,etal., 2001;Elferink,etal., 2001;Shimba,etal., 2001,1998;Safe,2001;McDougal,etal., 2001,2000;Elizondo,etal., 2000;Puga,etal., 2000,Alexander,etal., 1998)。受容体の存在は1970年代に提案され立証された(Poland,etal., 1976)。この受容体のコード配列は1990年代にクローン化され、このAhRは新しい塩基性ヘリックス−ループ−ヘリクス/Pas-Arnt-Sim(bHLH/PAS)転写因子スーパーファミリーの一員であることが分かった(Burbach,etal., 1992)。
【0004】
転写因子のbHLH/PASスーパーファミリー。
bHLH/PASスーパーファミリーには、ショウジョウバエ(Drosophila) Per, Arnt(Ah受容体核トランスロケーター、AhRなどと二量体(ダイマー)を形成する)、SIM1、SIM2、TRH、ARNT−2、低酸素誘導性因子−1(HlF−1α)、SRC−1、TIF2、RAC3、MOP2−5(Gu,etal., 2000;Hogenesch,etal., 1997;Wilk,etal., 1996)、および内皮PASドメインタンパク質(EPAS−1)(Tian,etal., 1997)が含まれる。これらのbHLHタンパク質は、50個のアミノ酸の2つの縮合直列反復を含む300個のアミノ酸のPASドメインを有する(Burbach,etal., 1992;Dolwick,etal., 1993)。その塩基性領域はDNAの結合に重要であり、HLHドメインおよびPASドメインは二量体化に関与し、AhRの場合にはリガンド結合に関与する(SwansonおよびBradfield, 1993)。AhRおよびARNTの転写促進ドメインはカルボキシル末端の位置に対応している(Jain,etal., 1994)。このスーパーファミリーのメンバーは主要な発育調節遺伝子であり、AhRおよびARNTと同様の役割を果たすと考えられているため関心が持たれている。AhRと二量体を形成する以外に、ARNTはHIF−1α、PER、SIM、MOP2(Hogenesch,etal., 1997)、およびEPAS−1(Tian,etal., 1997)とも異質二量体を形成し、ARNT関連タンパク質はTRHと異質二量体(ヘテロダイマー)を形成すると考えられている(Wilk,etal., 1996)。ARNTのこの多様な反応性はARNTのAhR依存的な役割を示しており、AhRと他のbHLH/PAS信号経路との間の混乱の可能性を示唆している。
【0005】
低酸素に対する恒常性応答:HIF−1a/ARNT媒介性遺伝子発現の役割。
脊椎動物は生体の代謝過程に分子状酸素が必要である。低酸素によって誘発される恒常性応答としては、赤血球生成、血管形成、および解糖が挙げられる。これらの適応性応答は、酸素伝達を増加させるか、あるいは低酸素組織が酸素を必要としない別の代謝経路を活性化させる役割を果たす。低酸素に応答して、HIF−1αは核に移動して、核内でARNTと異質二量体を形成する(Gradin,etal., 1996;SchmidtおよびBradfield.1996)。HIF−1α/ARNT異質二量体が低酸素応答要素と結合すると、組織の酸素化の維持に関与する遺伝子の転写が増加する。この低酸素によって誘発される遺伝子産物としては、エリスロポエチン(EPO)、血管内皮増殖因子(VEGF)、および解糖系酵素が挙げられる(MaltepeおよびSimon,1998)。
【0006】
AhR / ARNT信号経路の作用形態。
細胞質形態のAhRは、2分子のヒートショックタンパク質(hsp90)と一部の他の細胞要素と関連している(Poellinge,2000;Whitlock,1990)。リガンドと結合した後、hsp90と他の要素は分離して、AhRは活性化する。次に、活性化したAhRは核に移動して、パートナーであるARNTと二量体を形成する(Probst,etal., 1993)。AhR/ARNT異質二量体は、AhRにより制御され遺伝子発現を変化させる遺伝子のプロモーターに見いだされている、いわゆる生体異物応答要素(XRE)を認識しこれと結合する(Whitlock,1990)。別の可能性のある機構としては、ARNTとの二量体化に関するAhRと、HIF−1αおよび/またはEPAS−1のいずれかとの間での競合が挙げられる。標的遺伝子の発現を制御するためにはAhR、HIF−1α、およびEPAS−1はARNTとの二量体化が必要であるので、AhRが活性化することによって、他の信号経路の比率が制限される程度まで遊離のARNTの有効率が低下しうる。ARNTの有効率が減少すると、HIF−1α信号伝達の阻害などによって、生体の低酸素調節遺伝子の発現および血管形成抑制が低下しうる(Gradin,etal., 1996;SchmidtおよびBradfield,1996)。
【0007】
公知のAhRリガンド。
AhRの人工のリガンドとして最初に発見されたものの中には、3−メチルコラントレンおよびベンゾ[α]ピレンなどの多環式芳香族炭化水素として知られる化学物質がある。これよりはるかに強力でより親和性の高いリガンドである2,3,7,8−テトラクロロジベンゾ−p−ダイオキシン(TCDD)も発見された(PolandおよびGlover,1973)。別の構造のグループの化合物であるハロゲン化芳香族炭化水素も受容体リガンドとして確認された。上記のグループとは異なる構造的特徴を有する化合物も、AhRと結合親和性を有することが発見されている。このグループはビリルビン(Phelan,etal., 1998;SinalおよびBend,1997)、リポキシンA(4)(Schaldach,etal., 1999)、ブレベトキシン−6(Washburn,etal., 1997)、ジアミノトルエン(Cheung,etal., 1996)、およびYH439(チアゾニウム化合物の一種)(Lee,etal., 1996)に代表される。大部分の人工AhRリガンドの中では、TCDDはAhRに対する最も強力な物質の1つであり、AhR作用およびダイオキシン毒性の機構の研究に使用されるプロトタイプ化合物である。用語「ダイオキシン類」は、TCDDと同じ機構で同じ生物学的応答を引き起こすPCDD類(ポリ塩化ジベンゾ−p−ダイオキシン類)、PCDF類(ポリ塩化ジベンゾフラン類)、またはPCB類(ポリ塩化ビフェニル類)の任意のものを表すために使用されている。
【0008】
インドール部分を有するAhRリガンド。
インドール部分を有する他の公知のAhRリガンドも特に注目されている。このグループは、トリプタミン、インドール酢酸(Heathpagliuso,etal., 1998)、インドール−3−カルビノールおよびその誘導体(Stephensen,etal., 2000;Chen,etal., 1996;Vasiliou,etal., 1995;Liu,etal., 1994;Jellinck,etal., 1993)、ならびにインドロ[3,2−b]カルバゾール(ICZ)Chen,etal.,1995;Kleman,etal.1994)からなる。UV酸化によってトリプトファンから誘導される6−ホルミルインドロ[3,2−b]カルバゾールは、ICZと非常に関連性が高く、TCDDの受容体に対する親和性よりも高い親和性を有する(Rannug,etal., 1995,1987)。インドールから誘導される一部のAhRリガンドは、受容体に対する結合性、低毒性、抗エストロゲン性、および抗腫瘍形成性という興味深い性質を示した。実際、腫瘍形成の危険性の高い患者に対する抗発癌および抗腫瘍形成治療におけるインドール−3−カルビノールの臨床研究が開始されている(PreobrazhenskayaおよびKorolev,2000)。
【0009】
内因性AhRリガンドの同定およびAh受容体系の生理学的機能については解明されていない。
オカモトら(Okamotoetal., (1993))は、成体雄ラットを高酸素(酸素95%)にさらすことによって、肺でCYP1A1が誘導され、肝臓でCYP1A1および1A2が誘導されることを観察した。CYP1A1/1A2の誘導は、AhRのそのリガンドとの結合と通常は関連がある。高酸素によるCYP1A1/1A2の誘導を説明するための仮説の1つは、AhRの内因性リガンドが高酸素によって生成し、これがCYP1A1/1A2遺伝子の転写を活性化するというものである(Okamoto,etal., 1993)。最近、AhRと結合する2種類のヒト尿生成物が単離された(Adachi,etal., 2001)。同定された化合物はインジゴ(織物染料として一般的に使用される)とインジルビン(インジゴの異性体)であるため、これらの生成物が内因性リガンドであるかどうかは分かっていない。これらの化合物は尿から単離されたので、これらは尿排出生成物であるのかどうかという疑問に対する答えも見つかっていない。同様に、ビリルビン関連化合物(Phelan,etal., 1998;SinalおよびBend, 1997)およびリポキシンA(4)(Schaldach,etal., 1999)は確かに内因性であるが、これらが本当にAhRに対するリガンドであるかどうかは分かっていない。実際、これらの化合物のAhRに対する応答および親和性は非常に低い。
【0010】
AhR欠如マウスの作製によって、この時点では結論は出ていないが、肝臓、心臓、卵巣、および免疫系におけるこの受容体の可能性のある生理学的機能が示されている(Benedict,etal., 2000;Poellinger,2000;Mimura,etal., 1997;Schmidt,etal., 1996;Fernandez-Salguero,etal., 1995)。これらの重要な発見から、動物の生理機能でAhR信号経路が機能する必要があることが分かる。動物組織における内因性AhRリガンドは、このAhR信号機能の実施に関与していると推定される。
【0011】
内因性AhRリガンドの同定の重要性。
この受容体系に対する人工AhRリガンドに関する研究によって、この系に関する我々の理解は大きく前進した。しかし、進化において、製造された化学薬剤と反応するためにAhRが出現したのではないことは明らかである。体内で通常遭遇する組織濃度で非毒性であり、代謝によって迅速に除去され、制御能力において一時的にのみAhRを活性化するために使用される、AhRに対する内因性リガンドであるべきだと考えられる。また、リガンド−受容体の媒介する信号過程が異なる結果となる可能性があり、これがリガンドの性質に依存するという証拠も示されている。リガンド−受容体媒介シグナルトランスダクション系の結果を決める決定的な要因は、リガンドが結合した受容体の最終的な三次元配座であり、この配座が、リガンドが結合した受容体が、信号を変換するための多数の他の因子とどのように相互作用するかを決定すると考えられている。受容体のアミノ酸配列が分かれば、リガンドが結合した受容体の最終三次元構造はリガンドの構造のみに依存し、これによって最終的な信号系の生物学的結果が決定される。Ah受容体の生理学的機能および潜在的な治療効果を完全に理解するため、この系に関して、内因性AhRリガンドの同定が絶対的に必要となりうる。
【発明の要約】
【0012】
本発明者らは、ここにおいて、新規内因性Ah受容体リガンド、2−(1'H−インドール−3'−カルボニル)−チアゾール−4−カルボン酸メチルエステルの抽出、精製、同定、および、用途を開示する。
【0013】
実施態様の1つでは、本発明は、動物組織からの単離または合成のいずれかで得られた内因性Ah受容体リガンドの調製物に関する。好ましくは、本発明の調製物は、24時間煮沸に対して安定であり、80%メタノール:20%水に対して溶解性であり、2規定の酸中で終夜安定であり、塩基中では不安定である。本発明の調製物は、好ましくは少なくとも60%の純度であり、より好ましくは90%の純度であり、最も好ましくは95%の純度であり、実施例に開示されるように紫外スペクトル、赤外スペクトル、質量スペクトル、および核磁気共鳴スペクトルで特徴付けられたものである。
【0014】
本発明の好ましい実施態様では、リガンドの構造は、
【0015】
【化1】
【0016】
に示され、図7Aに開示される構造である。
【0017】
本発明は、動物の体重を減少させる方法、動物の免疫系を調節する方法、動物のエストロゲン作用を阻害する方法、動物のテストステロン産生を減少させる方法、肺疾患の治療方法、あるいは血管形成または浸潤性癌の制御方法に関し、これらすべては内因性Ah受容体リガンド薬剤またはその類似体の有効量を使用して動物を治療するステップを含む。
【0018】
好ましい実施態様では、類似体構造は:
【0019】
【化2】
【0020】
(式中、
R1、R2、R3、R4、R5およびR8=H、低級アルキル(1〜5個の炭素)、Br、F、Cl、O−アシル(1〜5C)、またはOR10(式中、R10=H、低級アルキル(1〜5C)である)であり、
R6およびR7は一緒に=Oを形成するか、あるいは、
R6=Hである場合には、R7はH、OH、Br、F、Cl、OR11(式中、R11はアルキル(1〜5C)である)となることができ、および
R7=Hである場合には、R6はH、OH、Br、F、Cl、OR11(式中、R11はアルキル(1〜5C)である)となることができ、
R9=
【0021】
【化3】
【0022】
(式中、R12=H、アルキル(1〜5C)、アリール、フルオロメチル、ジフルオロメチル、またはトリフルオロメチル)、あるいは、
R9は、
【0023】
【化4】
【0024】
(式中、R13=H、アルキル(1〜5C)、アリール、フルオロメチル、ジフルオロメチル、またはトリフルオロメチル)となることができるか、
R9は、
【0025】
【化5】
【0026】
(式中、R14=H、アルキル(1〜5C)、フルオロメチル、ジフルオロメチル、またはトリフルオロメチル)となることができるか、あるいは、
R9は、
【0027】
【化6】
【0028】
(式中、R15=H、アルキル(1〜5C)、フルオロメチル、ジフルオロメチル、またはトリフルオロメチル)となることができ、および
X、Y、Zは、C、N、O、またはSのいずれかとなることができる)
である。
【0029】
本発明の目的の1つは、動物組織由来の内因性Ah受容体リガンドの調製物を提供することである。
【0030】
本発明の別の目的は、内因性Ah受容体リガンドの合成調製物を提供することである。
【0031】
本発明の目的の1つは、Ah受容体リガンドの類似体の調製物を提供することである。
【0032】
リガンド調製物が前述の生化学的および物理学的性質を有することが本発明の利点である。
【0033】
その他の利点、特徴、および目的は、明細書、特許請求の範囲、および図面を考察することによって当業者に明らかになるであろう。
【発明の説明】
【0034】
実施態様の1つでは、本発明は、内因性Ah受容体リガンドの調製物、該リガンドの類似体の調製物、およびこれらの調製物を使用する治療方法に関する。
【0035】
1.AhRリガンド薬剤の生化学的特徴付け
以下の実施例は、ラットおよびブタの肺から得られるAh受容体リガンドの薬剤について説明する。好ましくは、AhRリガンドは式:
【0036】
【化7】
【0037】
および図7Aに示される。
【0038】
本発明者らは、肝臓、脳、骨、および筋肉などの他の動物器官からも首尾よく調製物が得られることを想定している。以下の実施例ではラットとブタの両方の肺からの調製が成功したことを開示している。本発明の好ましい調製物では、HPLC分析に基づく純度は少なくとも60%であり、より好ましくは90%であり、最も好ましくは少なくとも95%である。
【0039】
以下の実施例では、リガンド抽出および精製の好ましい方法を開示する。簡潔に述べると、動物器官を解剖し、ドライアイスで凍結させる。組織を解凍し、PBS(緩衝食塩水:0.154MのNaCl、約10mMのリン酸緩衝液、pH7.4)中でホモジェナイズして、メタノールで抽出する。この混合物に窒素ガスでフラッシュし、撹拌し、遠心分離を行う。抽出物は、2NのH2SO4を加えて100℃で加熱することによって、クロロホルム溶解活性になる。活性物質はシリカゲルバッチ精製で精製された後、大規模重力流出シリカカラムでメタノールおよびクロロホルムグラジエント溶出により精製され、分取用シリカカラムとメタノール/クロロホルム溶媒溶出液を使用して高速液体クロマトグラフィーで精製される。活性物質はHPLC シリカカラムでイソプロパノール/ヘキサングラジエント溶出によりさらに精製され、次にメタノールおよび水で溶出される逆相C18HPLCカラムに供給される。この材料は、アセトニトリル/水を使用するC18カラムでさらに精製され、続いてイソプロパノール/ヘキサンを使用するシアノカラムでさらに精製される。最終段階では、シアノカラムを使用しメタノール/水で溶出させるHPLCが実施される。
【0040】
リガンド活性は、後述の活性分析によって測定されることが最も好ましい。簡潔に述べると、リガンド抽出物をAh受容体含有リガンドレポーター細胞に加える。次に、これらの細胞を4時間インキュベートし、細胞を溶解させて、生成したルシフェラーゼを放出させる。典型的には、この酵素はプロメガ(Promega)(米国ウィスコンシン州マディソン(Madison))より販売されるキットに従って測定される。ルシフェラーゼ活性は、照度計によって記録される発光によって測定される。基質溶液をウェルに注入した後に照度計の読み取りが行われる。
【0041】
後述の好ましいリガンド調製物は、その溶解性によって特徴づけることができる。リガンドは80%メタノール/20%水によって組織から抽出可能である。煮沸および酸による処理の後では、リガンドはクロロホルムで抽出可能である。
【0042】
本発明のリガンド調製物は塩基中で不安定であるが、2規定までの酸中で少なくとも24時間安定である。この調製物は、37℃での終夜加熱(16時間)で安定であり、100℃で24時間安定である。
【0043】
本発明のリガンド調製物は、紫外スペクトル、赤外スペクトル、質量スペクトル、核磁気共鳴スペクトルなどの実施例に記載されるその物理的性質によってさらに特徴づけることができる。
【0044】
当業者であれば開示される手順によってAhRリガンドを調製可能であるか、あるいは当業者には明らかな修正および最適化を行うことができる。
【0045】
本発明者らは、当業者であれば本明細書で同定されるAhRリガンドの類似体を調製することができ、治療用途に有用なこれらの類似体のスクリーニングを行うことができることを想定している。「類似体」とは、その化合物が天然AhRリガンドど同様の構造を有し、有用な治療効果が得られることを意味する。初期スクリーニングは、本明細書に記載のレポーター遺伝子アッセイによって実施される。さらなるスクリーニングは、対象となる疾患にしたがって計画される。
【0046】
特に好ましい類似体は式:
【0047】
【化8】
【0048】
(式中、
R1、R2、R3、R4、R5およびR8=H、低級アルキル(1〜5個の炭素)、Br、F、Cl、O−アシル(1〜5C)、またはOR10(式中、R10=H、低級アルキル(1〜5C)である)であり、
R6およびR7は一緒に=Oを形成するか、あるいは、
R6=Hである場合には、R7はH、OH、Br、F、Cl、OR11(式中、R11はアルキル(1〜5C)である)となることができ、
R7=Hである場合には、R6はH、OH、Br、F、Cl、OR11(式中、R11はアルキル(1〜5C)である)となることができ、
R9=
【0049】
【化9】
【0050】
(式中、R12=H、アルキル(1〜5C)、アリール、フルオロメチル、ジフルオロメチル、またはトリフルオロメチル)、あるいは、
R9は、
【0051】
【化10】
【0052】
(式中、R13=H、アルキル(1〜5C)、アリール、フルオロメチル、ジフルオロメチル、またはトリフルオロメチル)となることができるか、あるいは、
R9は、
【0053】
【化11】
【0054】
(式中、R14=H、アルキル(1〜5C)、フルオロメチル、ジフルオロメチル、またはトリフルオロメチル)となることができるか、あるいは、
R9は、
【0055】
【化12】
【0056】
(式中、R15=H、アルキル(1〜5C)、フルオロメチル、ジフルオロメチル、またはトリフルオロメチル)となることができ、および
X、Y、Zは、C、N、O、Sのいずれかとなることができる)
に対応する。
【0057】
特に有用な類似体は、以下のものである。
【0058】
【化13】
【0059】
さらに、上記で同定されたリガンドおよびリガンド類似体を含む治療化合物を調製することができる。好ましくは、これらの組成物の医薬上許容される担体が提供される。
【0060】
本発明のリガンドおよびその類似体は、経口でも非経口でも投与が可能であるが、AhRリガンド自体の場合には非経口経路が好ましい。おそらく、これらはカプセル、ロゼンジ、錠剤、または好適な媒体中での静脈内投与で提供することができる。坐剤または経鼻送達を使用することもできる。
【0061】
2.AhRリガンドの使用
動物組織中の内因性AhRリガンドの同定およびそれらの正常な生理学的機能の決定によって、AhRの媒介する生物学的応答の機構に関する重要な新情報が得られる。このような内因性リガンドは、高い組織特異的な方法で細胞増殖および分化を調節し、一部の公知のAhRリガンドによって生じる他のある種の応答を示すと思われる。最も重要なことには、本発明者らは、内因性AhRリガンドの種々の構造類似体の合成および試験によって、広範な治療用途の新しい種類の薬剤が得られるものと考える。
【0062】
組織および種に依存するが、ダイオキシンにさらされることにより、一般に、過形成、形成不全、化生、および異形成からなる反応が起こる。これらの効果は、増殖因子信号経路、ステロイドホルモン信号経路、ならびにこれらの因子およびホルモンの合成および分解と関与する酵素の相互作用によって媒介されるホメオスタシス過程の変化によって調節されると考えられる。細胞、組織、器官、および生物体のレベルでのホメオスタシスに関与する多くの異なった種のホルモンが存在する。ステロイドホルモンは成長発育の制御、性分化、生殖、および細胞代謝と関与する。インスリンなどの他のホルモンは、炭水化物および脂肪代謝を制御する。実験動物をダイオキシンに曝露することによって、エストロゲン受容体、グルココルチコイド受容体、およびインスリン受容体の濃度が低下することが報告されている。本発明者らは、内因性AhRリガンドおよびその類似体が、エストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、ビタミンA、および甲状腺ホルモン、ならびにある組織の黄体形成ホルモンのような下垂体ホルモンなどのいくつかのホルモンの濃度を変化させると考えている。
【0063】
ヒトがAhRアゴニストに対して応答性であることを示す多数の証拠が存在する。機能性AhRは、リンパ球、肝臓、肺、および胎盤などの多くのヒト組織中で発見されている。ヒトCYP1A1はヒトの肺および胎盤で、ダイオキシン類によって誘導可能である。ダイオキシン様化合物に誤ってさらされたヒト女性の胎盤でEGF受容体の活性が低下し、これと同じ応答が齧歯類の組織についても報告されている。血清テストステロン量の減少、および血中黄体形成ホルモン量の増加が、ダイオキシン類にさらされたヒトおよびラットの両方で確認されている。ダイオキシン類にさらされた労働者、ならびに枯葉剤のオレンジ剤(Agent Orenge)中に存在するダイオキシンにさらされたベトナム退役軍人の糖尿病が報告されている。まとめると、これらの発見から、人工AhRリガンドであるダイオキシン類はヒトのホルモン状態を変化させることができ、実験動物と同様の効果が見られることが分かる。したがって、ヒトは、ダイオキシン様AhRアゴニストに対して応答性の種であり、本明細書に開示されるAhRリガンドおよびその類似体に対しても応答すると推測される。本発明の可能性のある治療用途は以下に示す。
【0064】
体重の減少。
ダイオキシン類は体重を減少させ、脂肪組織を減少させる。この効果の正確な機構は不明であるが、おそらく視床下部レベルで体重を制御する「設定点」を減少させることを示唆する根拠が見つかっている。ダイオキシンは、ダイオキシン投与量によって決定された低レベルの制御体重まで食料摂取量を減少させることによる「体重設定点」を低下させると考えられる。本発明者らは、開示されるAhRリガンドおよびその類似体は、類似の生物活性を有し、ヒトの体重減少に関する治療に有用であると考えている。この可能性を支持する現象として、偶発的にダイオキシン類にさらされたヒトは食欲が抑制される。
【0065】
免疫抑制または免疫促進。
ダイオキシン類の免疫毒性効果についてはここ数年間研究されてきているが、ダイオキシン様免疫毒性症候群の説明は困難である。マウスではダイオキシン類は、体液性および細胞媒介性の免疫を抑制する。マウスに発生する免疫抑制によって、種々の感染性因子に対する感受性が増加する。ラットではプラーク形成細胞アッセイでヒツジ赤血球への免疫応答をダイオキシンが向上させ、マウスではダイオキシンによって反対の作用が得られ、応答を抑制する。ヒトでは、ダイオキシンが免疫抑制または免疫促進のいずれを引き起こすかは未知であるが、動物の研究に基づくと、ダイオキシン類およびおそらくは本明細書に開示されるAhRリガンドは免疫機能を変調することは明らかである。内因性AhRリガンドまたはその類似体によって免疫抑制が生じる場合、これらは移植片拒絶の防止および自己免疫疾患の治療に有用である。一方、これらによって免疫促進が起こる場合、これらの物質を後天性免疫不全症候群(AIDS)などの免疫不全および慢性感染症の治療に使用可能となる。
【0066】
抗エストロゲン作用。
治療が行われる状況に依存するが、ダイオキシンは、数種類の実験動物種および培養されたMCF細胞におけるエストロゲンの作用を阻害すると思われる。ダイオキシンにさらされた実験動物では、繁殖能力、産仔数、および子宮重量が減少する。さらに、無排卵および発情周期の抑制によって示されるように卵巣機能が変化する。ラットおよびマウスでは、体重を変化させない用量でダイオキシン類の抗エストロゲン作用が起こる。内因性AhRリガンドおよびその類似体の潜在的な抗エストロゲン作用は、ヒトの乳癌および骨粗鬆症の治療に有用である。
【0067】
抗アンドロゲン作用。
成体雄ラットでは、ダイオキシンは、精巣のステロイド生産の律速段階を阻害することによってテストステロン生産を減少させる。これによって、テストステロンおよびジヒドロテストステロンの血漿濃度が減少し、さらに副生殖器官重量の減少が起こる。職業上ダイオキシン類にさらされた男性労働者の場合、血清テストステロン濃度が減少するとともに、濾胞刺激ホルモンおよび黄体形成ホルモンの血漿濃度が増加することが分かった。開示されるAhRリガンドおよびその類似体の抗アンドロゲン作用は、前立腺の過形成または前立腺癌、男性型脱毛症、女性の男性化症候群、男児の性的早熟、および性犯罪者である男性の性衝動の抑制の処理に有用である。
【0068】
肺疾患の治療。
AhRリガンド調製物は、(a)慢性閉塞性肺疾患、(b)喘息、(c)気腫、(d)気管支炎、(e)RQ不適合、および(f)急性肺機能障害などの肺疾患の治療に有用であると、本発明者らは考えている。
【0069】
侵入性癌の血管形成の制御。
AhRリガンド調製物は、侵入性癌の血管形成の制御に有用であると本発明者らは考えている。米国特許第6,323,228号には、本発明と類似の化合物3−置換インドールカルボヒドラジドが血管形成の阻害に有用であると記載されている。本発明の化合物は、癌腫の原発腫瘍および転移性充実性腫瘍の両方の治療に有用であると本発明者らは考えている。
【実施例】
【0070】
1.リガンド抽出および精製
材料および方法
材料
使用したすべての溶媒は、利用可能である限りはバーディック・アンド・ジャクソン(Burdick & Jackson)グレード(米国ミシガン州マスキーゴンのアライドシグナル・バーディック・アンド・ジャクソン(AlliedSignal Burdick & Jackson, Muskegon, MI, USA))であった。溶媒は、使用前にAhRリガンドを使用せずに試験した。リガンド投与の賦形剤として使用されるジメチルスルホキシド(DMSO、カタログ番号D−2650)、および標準用量作用曲線のAhRリガンドとして使用されるβ−ナフトフラボン(βNF、カタログ番号N−3633)は、シグマ(Sigma)(米国ミズーリ州セントルイス(St. Louis, MO, USA))より購入した。AhRリガンドのレポーター細胞系(H1L1.1C2,Garrison,etal., 1996)は、米国カリフォルニア州デービスのカリフォルニア大学デービス校(University of California-Davis, Davis, CA, USA)のデニソン博士(Dr. Denison)から親切にも提供して頂き、H1L1.1C2細胞系のリガンドリポーター構成要素を維持するために使用される抗生物質のジェネティシン(Geneticin)(G418、カタログ番号11811−031)は米国メリーランド州ロックビルのギブコ・ライフ・テクノロジーズ(GIBCO Life Technologies, Rockville, MD, USA)より購入した。
【0071】
細胞培養
細胞系H1L1.1C2は、G418を濃度400μg/mlで含有する培養培地(DMEM+10%FBS)中に維持し、37℃、6%CO2、および湿度100%の雰囲気下でインキュベートした。G418を含有しない培地200μl中に約30,000細胞/ウェルを含む96ウェル滅菌細胞培養培養プレートを準備し、リガンド活性分析で投与する前に少なくとも12時間インキュベートした。
【0072】
リガンド活性分析
リガンド活性物質の溶媒を蒸発させ、活性物質をDMSOで再構成し、この溶液1μlを、200μlの培養培地を含むウェル中のリガンドレポーター細胞の投与に使用した。各アッセイプレートのレポーター細胞の1列には、標準用量作用曲線を作製するために一連のβNF標準物質のDMSO溶液1μlを投与した。このように投与した細胞を、これらを維持した場合と同じ環境で6時間インキュベートした。インキュベート後に細胞を1×PBS(pH6.9)で2回洗浄し、投与による明らかな細胞数の変化を調べるため倒立顕微鏡で培養ウェルを調べた。50μlの1×細胞溶解試薬(米国ウィスコンシン州マディソンのプロメガ(Promega, Madison, Wl, USA))を加えて細胞を溶解させ、照度計で読み取るためのマイクロライト(Microlite)2プレート(米国バージニア州シャンティリーのダイネックス・テクノロジーズ(Dynex Technologies Inc.,Chantilly, VA, USA))の対応するウェルに各ウェルの溶解物10μlを移した。MLXマイクロタイター・プレート・ルミノメーター(MLX Microtiter Plate Luminometer)(ダイネックス・テクノロジーズ)のプログラムの設定は、50μlのルシフェラーゼ基質溶液(プロメガ)をウェルに注入し、注入後1秒の間隔をおいて5秒間ルシフェラーゼ反応を実施して発生した相対光量単位(RLU)の単位の光強度を読み取り、5秒間の読み取り値の平均を最終RLUとするように行った。
【0073】
データ処理および報告
各プレートからRLU対βNF標準物質の用量(各アッセイウェルでng単位)の用量作用曲線をプロットし、同じプレートから得られたβNF用量作用曲線を調べることで、試料で得られたRLUをリガンド活性としてβNF当量(BEQ)に変換した。リガンド活性(単位BEQ)対処理または精製手順のフラクションとしてデータを報告した。
【0074】
組織採取とホモジェナイズ
人工飼料(飼料11、Suda,etal., 1970)を給餌したスプレーグ・ドーリー(Sprague Dawley)ラットを安楽死させて、組織を外科的に取り出し、清浄なポリプロピレン管に入れ、ドライアイスで凍結させ、使用するまで−80℃で保管した。ウィスコンシン大学マディソン校(University of Wisconsin-Madison)の食肉科学おおび筋肉生物学研究所(Meat Science and Muscle Biology Laboratories)の屠殺場で新しく屠殺した成体ブタ(市場から、平均6か月齢)からブタ肺組織を取り出し、新しいアルミニウム箔で包み、ドライアイスに直接のせて凍結させ、使用するまで−80℃で保管した。次に、冷たいうちに組織を切断し、切断した組織を清浄な氷冷ガラスびんに移した。ホモジェナイズを行う切断組織を秤量して組織堆積を概算し(組織1gの体積が1mlであると仮定)、ホモジェナイズのための清浄なガラスシリンダーに移した。組織と同体積の氷冷1×PBS(10×PBSから新しく希釈、NaClが80g/l、KClが2g/l、KH2PO4が5.8g/l、Na2HPO4・7H2Oが15.5g/l、pH6.2)をホモジェナイズシリンダーに加えた。組織をパワージーン(PowerGene)700ホモジェナイザー(米国ペンシルベニア州ピッツバーグのフィッシャー・サイテンティフィック(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA))でホモジェナイズし、ホモジェネートの体積を測定した。組織を含有せずその代わりに同重量の1×PBSで置き換えたことを除けば、並行したブランク対照試料を試料と同様に処理した。すべてスケールダウンしたことを除けば、より小規模のホモジェナイズを同様の方法で実施した。
【0075】
メタノール抽出
ホモジェネートを、清浄な4L溶媒びんに移した。ホモジェネートの4倍の体積のメタノールを撹拌子ながらホモジェネートに徐々に加えた。抽出混合物をアルゴンでフラッシュし、抽出びんをテフロンでライニングされたふたで密封した。抽出混合物を室温で終夜撹拌した後、1Lグレードのポリプロピレン遠心管に移した。抽出混合物を室温で3分間1,000×gで遠心分離し、上清を残留物と分離した。残留物の2倍の体積のメタノール:0.5×PBS(80:20、v/v)混合物を遠心管の残留物に加えた。遠心管を室温で1時間振とうして組織を再抽出した。混合物を室温で3分間1,000×gで遠心分離し、得られたペレットは廃棄した。第1および第2の上清を集め、40℃の水せんを使用して12Lの減圧フラスコ中で溶媒を蒸発させた。メタノールを使用して抽出物全部を、清浄にした150mlガラス遠心管に移した。抽出物を室温で3分間4,000×gで遠心分離した。上清を別の清浄なガラス遠心管に移した。組織500ml当たり約20mlのメタノールを得られたペレットに加え、残留物の再抽出を行った。再び混合物の遠心分離を行い、ペレットは廃棄した。上清を集め、室温で3分間4,000×gでペレットになるまで再度遠心分離を行い、メタノールに不溶性の粒子は廃棄した。蒸発によって抽出物の体積を減少させ、メタノール1ml当たり新しい組織が10gとなる最終溶液を得た。メタノール抽出物(10g組織/ml)をアルゴンでフラッシュし、さらに操作するまで室温で保管した。すべてをスケールダウンして同様の方法でより小規模の抽出を実施した。
【0076】
塩基処理
約4ngBEQのメタノール抽出物のアリコートを、清浄にしたガラスバイアルに移し、溶媒を蒸発させた。0.1NのKOH水溶液(200μl)をバイアルに加えた。バイアルを37℃で終夜インキュベートした。インキュベート後、管を冷却し、HClでゆっくりと中和した。この処理混合物を200μlのクロロホルムで抽出した。クロロホルム相と水相を分離し、溶媒を蒸発させた。DMSO(10μl)を活性分析用の各管に加えた。βNFおよびブランク抽出物を試料と同量の方法で処理した。初期の結果から、あらゆる処理の水相では活性が見られないことが分かり、そのため後の実験ではクロロホルム相のみについてリガンド活性を分析した。
【0077】
熱処理
メタノール抽出物のメタノール溶液またはDMSO溶液のいずれかを清浄にしたガラスバイアルに入れ、100℃の水浴で30分間加熱し、続いてバイアルを室温まで冷却した。溶媒中の抽出物をそのまま直接分析して活性を調べた。
【0078】
酸および熱処理
抽出物のメタノール溶液(10g組織/ml)を同体積の4NのH2SO4水水溶液と混合した。処理混合物を37℃で終夜インキュベートした後、撹拌しながら24時間還流した。処理混合物を室温まで冷却し、10NのKOHでpH6.5〜6.9に徐々に中和した。処理混合物を同体積の水飽和クロロホルムで3回抽出した。それらのクロロホルム相を集め、蒸発させて体積を減少させ、30g組織当量/mlクロロホルムの最終溶液を得た。処理した抽出物をアルゴンでフラッシュし、4℃で保管した。
【0079】
シリカゲルバッチ精製
シリカゲル(40μm、カタログ番号7024−02、米国ニュージャージー州フィリップスバーグのJ.T.ベーカー(J. T. Baker, Phillipsburg, NJ, USA))を、(各回でシリカゲルの2倍の体積)メタノールで1回、クロロホルムで2回、ヘキサンで2回、クロロホルムで1回、およびメタノールで1回の順で洗浄した。清浄にしたシリカゲルは使用前に120℃で終夜焼成した。50%クロロホルムのヘキサン溶液1.5Lを500gのシリカゲルに加えた。5,000gの組織からの抽出物を含む160mlのクロロホルムを160mlのヘキサンと混合して、抽出物を50%クロロホルムのヘキサン溶液にして、50%クロロホルムのヘキサン溶液中のシリカゲルに撹拌しながら加えた。シリカゲルを室温で30分間撹拌した後、沈降させた。溶媒を取り出し、「充填された」フラクションとして保存した。2Lの50%クロロホルムのヘキサン溶液をシリカゲルに加えた。シリカゲルを室温で5分間撹拌した後、静置し溶媒を取り出し、「第1回洗浄」フラクションとして保存した。このシリカゲルを第1回の清浄に使用しなかった2Lのクロロホルムで洗浄した。溶媒を取り出し、「第2回洗浄」フラクションとして保存した。4%メタノールのクロロホルム溶液2Lをシリカゲルに加えて活性物質を溶出させた。シリカゲルを室温で5分間撹拌した後、沈降させた。溶媒を取り出し、「第1回溶出」フラクションとして保存した。この溶出段階を2回繰り返し、それらの溶媒をそれぞれ「第2回溶出」および「第3回溶出」のフラクションとして保存した。シリカゲルを2Lのメタノールでストリッピングし、その溶媒を「第1回ストリッピング」フラクションとして保存した。50%メタノール水溶液を使用してシリカゲルの第2回目のストリッピングを行い、そのフラクションを「第2回ストリッピング」フラクションと名付けた。各フラクションのアリコートを分析した後、4%メタノールのクロロホルム溶液で溶出させた活性フラクションを集め、その溶媒を蒸発させた。集めたフラクションにクロロホルムを加えて、クロロホルム1ml当たりで10ngのβNF当量(BEQ)の最終溶液を調製した。このバッチ精製した抽出物をアルゴンでフラッシュし、4℃で保管した。
【0080】
シリカゲル重力カラム精製
内径8.1cmのガラス重力カラムに180gの清浄にし、新しく焼成したシリカゲル(バッチ精製と同じものを使用)とクロロホルムの混合物を充填し、少なくとも1時間静置した。ベッド体積の1〜2倍のクロロホルムでカラムを平衡化させた。約400μgBEQのシリカゲルバッチ精製活性物質のクロロホルム溶液を重力カラムに載せた。ベッド体積の3倍(〜900ml)のクロロホルムをカラムに流した。0〜4%凸型グラジエントのメタノールのクロロホルム溶液をベッド体積の8倍(2,400ml)用いて、活性物質を溶出させた。ベッド体積の6倍(1,800ml)のメタノールを使用してカラムのストリッピングを行った。約2%メタノールのクロロホルム溶液で溶出させた活性フラクションを、リガンド活性分析後に混合した。その溶媒を蒸発させ、集めたフラクションにクロロホルムを加え、30ngBEQ/mlの最終溶液を調製した。精製した抽出物をアルゴンでフラッシュし、4℃で保管した。
【0081】
メタノール−クロロホルムを使用する分取用シリカカラムHPLC
分取用シリカHPLCカラム(ゾルバックス・プロ(Zorbax Pro)10シリカ、内径=21.5mm)を、流速10ml/分でクロロホルムを流すことによって平衡化させた。シリカゲル重力カラムで精製した活性物質(50μgBEQ)をクロロホルムと混合したものをカラムに注入した。カラム容積の3倍(150ml)のクロロホルムをカラムに送り込んだ。0〜4%リニアグラジエントのメタノールのクロロホルム溶液をカラム容積の8倍(400ml)用いて活性物質を溶出させた。移動相を徐々に100%メタノールに変化させ、カラム容積の8倍(400ml)のメタノールを使用してカラムのストリッピングを行った。約2%メタノールのクロロホルム溶液で溶出させた活性フラクションを、活性分析後に集めた。精製した活性物質をアルゴンでフラッシュし、−20℃で保管した。
【0082】
イソプロパノール:ヘキサンを使用する分取用シリカカラムHPLC
分取用シリカHPLCカラム(メタノール:クロロホルム系)で精製した活性物質を、2%イソプロパノールのヘキサン溶液と濃度10ngBEQ/μlで混合した。この混合物を室温で5分間12,000×gで遠心分離した。流速10ml/分で2%イソプロパノールのヘキサン溶液で平衡化させたシリカHPLCカラム(ゾルバックスシリカカラム、内径=21.5mm)に4mlの上清を注入した。カラム容積の3倍(150ml)の2%イソプロパノールのヘキサン溶液をポンプによりカラムに流した。2〜15%リニアグラジエントのイソプロパノールのヘキサン溶液を、カラム容積の13倍(650ml)用いて活性物質を溶出させた。移動相を100%メタノールにカラム容積の2倍(100ml)かけて変化させ、カラム容積の8倍(400ml)のメタノールを使用してカラムのストリッピングを行った。約5%イソプロパノールのヘキサン溶液で溶出させた活性フラクションを「5%ピークリガンド」として集めた。約10%イソプロパノールのヘキサン溶液で溶出させた活性フラクションを「10%ピークリガンド」として集めた。これらの活性物質はアルゴンでフラシュし、−20℃で保管した。
【0083】
75%メタノール水溶液を使用する分取用C18カラムHPLC
分取用シリカHPLCカラム(イソプロパノール:ヘキサン系)で精製した「10%ピークリガンド」を、75%メタノール水溶液と、濃度4μgBEQ/mlで混合し、清浄にしたポリプロピレン遠心管に入れて、室温で3分間16,000×gで遠心分離した。その上清を同じ条件でもう1回遠心分離した。5mlの上清を、流速5ml/分の75%メタノール水溶液で平衡化させた分取用C18HPLCカラム(ゾルバックス、内径=21.5mm)に注入した。このHPLCは、75%メタノール水溶液でイソクラティカリーに30分間(150ml)実施し、次に20分間で移動相を100%メタノールに変化させた(100ml)。カラムを100%メタノールで80分間ストリッピングした(400ml)。保持時間が約26分の活性フラクション(各5ml)を集めた。この活性物質はアルゴンでフラッシュし、移動相中−20℃で保管した。
【0084】
50%アセトニトリル水溶液を使用する分析用C18カラムHPLC
分取用C18HPLCカラム(75%メタノール水溶液)で精製した約10μgBEQの活性物質を、250μlの50%アセトニトリル水溶液に溶解し、清浄にしたポリプロピレン遠心管に入れて、室温で3分間16,000×gで遠心分離した。この上清を、流速1ml/分の50%アセトニトリル水溶液で平衡化させた分取用C18HPLCカラム(ゾルバックス、内径=4.6mm)に注入した。この精製段階から、ウォーターズ(Waters)996光ダイオードアレイ(PDA)検出器(米国マサチューセッツ州ミルフォードのウォーターズ(Waters Corp., Milford, MA, U.S.A.))を使用してUV吸収データを取得し、リガンドの生物学的活性とそのUVスペクトルの間の相関を調べた。カラムから流出するすべての物質はPDA検出器のフローセル(経路長10mm、内径0.009インチ)に通した。測定したUV波長は最初200〜800nmに設定した。化合物のスペクトルが明確になってからは、10%ピークリガンドについては200〜450nmでモニタリングした。移動相のUV吸光度は自動的に0になるように設定した。UVスペクトルは、ミレニアム(Millennium)3.2ソフトウェア(ウォーターズ)を使用して1スペクトル/秒の速度で取得した。HPLCは、50%アセトニトリル水溶液でイソクラティカリーに20分間実施し、続いて10分間で移動相を100%アセトニトリルに変化させた。カラムは、100%アセトニトリルで20分間ストリッピングした(20ml)。保持時間約7分で208nm、271nm、277nm、および355nmの4つのピーク吸光度の特徴的UVスペクトルを構成するフラクション(各約0.5ml)を、生物活性の確認後に集めた。集めたフラクションは、アルゴンでフラッシュし、移動相中−20℃で保管した。
【0085】
10%イソプロパノールのヘキサン溶液を使用する分析用シアノカラムHPLC
分析用C18HPLCカラム(50%アセトニトリル水溶液)で精製した約10μgBEQの活性物質を、10%イソプロパノールのヘキサン溶液250μlに溶解し、流速1ml/分の10%イソプロパノールのヘキサン溶液で平衡化させた分析用シアノHPLCカラム(内径=4.6mm、アドソーボスフィア(Adsorbosphere)CN−AQ 5U、米国イリノイ州ディアフィールドのアルテック・アソシエーツ(Alltech Associates, Inc. Deerfield, IL, USA))に注入した。カラムは10%イソプロパノールのヘキサン溶液でイソクラティカリーに20分間作動させ、次に移動相を段階的に100%メタノールに変化させた。カラムは、100%メタノールで20分間ストリッピングした(20ml)。保持時間約12分で208nm、271nm、277nm、および355nmの4つのピーク吸光度の特徴的UVスペクトルを構成するフラクション(各0.5ml)を、生物学的活性の確認後に集めた。これらのリガンドは、アルゴンでフラッシュし移動相中−20℃で保管した。
【0086】
60%メタノール水溶液を使用する分析用シアノカラムHPLC
分析用シアノHPLCカラム(10%イソプロパノールのヘキサン溶液)で精製した約10μgBEQの活性物質を250μlの60%メタノール水溶液に加えた。得られた溶液を、流速0.5ml/分の60%メタノール水溶液で平衡化させた同じシアノカラムに注入した。カラムは、60%メタノール水溶液でイソクラティカリーに20分間作動させ、続いて10分間で移動相を100%メタノールに変化させた。カラムを100%メタノールで40分間(20ml)ストリッピングした。精製したリガンドは、UV吸光度を測定するために注意深く回収した。精製したリガンドのUVスペクトルは、それぞれ208nm、271nm、277nm、および355nmの4つの吸収ピークからなり、保持時間はこの精製系では約10分となるはずである。これらのリガンドは、アルゴンでフラッシュし、移動相中−20℃で保管した。
【0087】
結果
AhRリガンド分析システムおよび抽出手順
本発明者らは、分析の増強、スピードアップ、および半自動化のため、感受性AhRリガンド分析システム(Garrison,etal., 1996)を96ウェルプレートフォーマットに応用した。この応用分析システムでは0.05ngのβNFで高い信頼性で検出することができ、この場合、賦形剤(ビヒクル)コントロールに対して約2〜3倍の誘導(インダクション)を発生させた。区別可能な信号は0.01ngのβNFで得られ、この系の最大誘導は賦形剤の約80〜100倍であった(図1A)。この感受性分析では、本発明者らは、信頼性のあるAhRリガンド抽出手順の開発から開始した。ヒトAhR遺伝子は胎盤以外の器官と比較すると肺で大量に転写されることが分かっているため(Dolwick,etal., 1993)、本発明者らは、リガンド抽出の優れた供給源組織は肺組織であろうと考えた。環境による汚染の可能性を減少させるために人工飼料(飼料11、Suda,etal., 1970)を給餌したスプレーグ・ドーリーラットの肺組織を、試験抽出のために使用した。数回の試験の後、試験の項に概略が示されるような抽出手順が確立された。約50ngBEQのリガンド活性物質は、抽出された1gの肺組織から検出され、ブランク抽出または賦形剤による信号は見られなかった(図1B)。
【0088】
リガンド抽出の供給源組織の決定
抽出手順の確立に関して、本発明者らは、AhR−リガンドの多い器官を同定するために器官の予備調査を実施した。ラットの肺組織は、調査した期間の中でリガンド活性が最も高いことが分かった(図1C)。これらの調査結果に基づくと、当初の推論、およびTCDDの分配が肺以外ではラットおよびマウスの肝臓が優先的であったことから(Santostefano,etal., 1996)、本発明者らはリガンド抽出の供給源組織を肺に決定した。収量を増加させるためにはより大きな器官が必要であったので、本発明者らはブタおよびウシの肺組織のリガンド活性を検査した。どちらの供給源も、人工飼料を給餌したラットと同様のリガンド活性を示した(データは示していない)。本発明者らは、ウィスコンシン大学マディソン校キャンパスで定期的に屠殺される動物であるという単純な理由でブタを供給源動物として選択した。
【0089】
塩基処理
動物組織からリガンド活性物質を抽出した後で、本発明者らはこれらの活性物質の性質を予備的に求めた。環境中に存在するほとんどの非生理学的AhRリガンドは非常に安定であり強塩基または酸の処理に対して抵抗性があるので、この時点で内因性活性物質を環境的夾雑物から区別するための簡単な方法は、抽出したリガンド活性物質を塩基または酸で処理することであると本発明者らは考えた。図1Dに示されるように、塩基処理(0.1NのKOH、37℃、終夜)によって活性の約60〜80%が失われるが、βNFまたはブランク抽出物ではこの処理による影響はなかった。より短いインキュベート時間(2時間)以外は同じ条件で処理を行った場合も活性が失われた(データは示していない)。これらのデータから、本発明者らが動物組織から抽出した活性物質は塩基に対して安定でないことが分かり、これから本発明者らは環境的夾雑物を単離したのではないといえる。
【0090】
熱処理
本発明者らは、熱処理(100℃ウォーターバス、30分間)によって、抽出したリガンドの活性の低下または消失が起こるかどうかを調べた。予期せぬことに熱処理によってメタノール抽出物の活性は3〜4倍に増加したが、賦形剤、ブランク抽出物、およびβNFには変化は見られなかった(図1E)。実際、メタノール抽出物のリガンド活性は、5分間の簡単なインキュベート後には増加し始めた(データは示していない)。本発明者らは、潜在的な担体からのリガンドの放出が熱処理によって促進され、この処理によってリガンドの収量が増加しうると考えている。
【0091】
硫酸および熱処理
同様に、本発明者らは、メタノール抽出物の硫酸処理を試験し、この処理でもリガンド活性の向上が見られた(データは示していない)。硫酸処理と熱処理を組み合わせるとさらに活性が増大する(図1F)。
【0092】
シリカゲルバッチ精製および重力カラム精製
本発明者らは、酸処理および熱処理したリガンドを精製するためのバッチ法と重力カラム法の両方でシリカゲルを使用した。シリカゲルに結合したリガンドは、50%クロロホルムのヘキサン溶液および100%クロロホルムを使用すれば活性を低下させることなく洗浄することができる。活性物質の大部分は4%メタノールのクロロホルムを使用すれば1回で溶出し、活性物質の多量のフラクションを回収するためには2回溶出させれば十分であった(図2A)。5,000gの組織から抽出される活性物質は500gの新しく焼成したシリカゲルで効率的に精製可能である。溶離しクロロホルム中に溶解した活性物質は、同じシリカゲルを充填しクロロホルムで平衡化したガラス重力カラムにかけられる。1つのピークを有するリガンド活性物質は、ピンクから茶色のバンドの材料とともに移動し、2%メタノールのクロロホルム溶液で溶出した(図2B)。約400μgBEQの活性物質は、180g充填されたシリカゲルで精製可能であった。この系の回収率は約25%である。
【0093】
分取用シリカカラムを使用するHPLC精製
本発明者らは、重力カラムで精製した活性物質を、メタノール:クロロホルム移動相を使用する分取用シリカHPLCカラムに注入した。1つのピークを有する活性物質が、メタノールが2%のクロロホルム溶液で溶出した(図3A)。この系の回収率は約90%であった。この系への1回の注入で約50μgのBEQを精製可能であった。この系で精製された活性物質を、イソプロパノール:ヘキサン溶媒系を使用する別の分取用シリカHPLCカラムにリガンドを注入することによりさらに精製した。2つの顕著なピークを有する活性物質が、イソプロパノールが5%および10%のヘキサン溶液でそれぞれ溶出した、さらにいくつかの小さなピークも見られた(図3B)。本発明者らは、5%イソプロパノールのヘキサン溶液で溶出した活性ピークを5%ピークリガンドと名付け、同様に10%イソプロパノールのヘキサン溶液で溶出したものを10%ピークリガンドと名付けた。本発明者らは、10%ピークリガンドをさらに続けた。この系の精製能力は、各注入で40μgのBEQであり、2つの活性ピークの合計の回収率は約20%である。
【0094】
C18カラムを使用するHPLC精製
本発明者らは、75%メタノール水溶液の移動相を使用する分取用C18HPLCカラムに10%ピークリガンドを注入した。約23分の保持時間で1つのピークを有する活性物質(フラクション#23近辺、各フラクションは5ml)が溶出した(図3C)。活性物質の回収率は約80%である。この系で精製した活性物質を、50%アセトニトリル水溶液の移動相を使用する分析用C18HPLCカラムに注入した。356nmにおけるUV吸収ピークは保持時間約7分で溶出し(図3D)、これがリガンド活性物質と一致した。PDAデータから、208nm、271nm、277nm、および356nmの4つの吸収ピークでスペクトルが構成されることが分かった。クロマトグラム(図3D)に示されるように、主要な356nmのUVピークの時間の大部分は、一部のUV吸収性夾雑物を伴っている。別のHPLC系に活性物質を注入する場合にはこれらの不純物の除去が必要であった。この系の回収率は約75%であり、精製能力は各注入で少なくとも15μgBEQである。
【0095】
分析用シアノカラムを使用するHPLC精製
本発明者らは、10%ピークリガンドを、10%イソプロパノールのヘキサン溶液が移動相である分析用シアノHPLCカラムに注入することによってさらに精製した。356nmにおけるUV吸収ピークは保持時間12分(図3E)で溶出し、これは生物学的活性物質と一致した。この保持時間のスペクトルは、前段階の精製(50%アセトニトリル水溶液を使用する分析用C18HPLCカラム)の場合と正確に同じであり、これから、このUVスペクトルは典型的な10%ピークリガンドを表していることが分かった。この系の回収率は約80%であり、精製能力は少なくとも10μgBEQである。別のUV吸収性夾雑物を完全に除去するために図3Eに示されるように別のHPLC精製段階を含むことが必要となる場合がある。本発明者らは、同じシアノカラムを使用し、60%メタノール水溶液の移動相を使用した。356nmにおけるUV吸収ピークは保持時間10分で溶出した(図3F)。この系の回収率約80%であり、精製能力は少なくとも10μgBEQであった。この保持時間のスペクトルも前の2つの段階のHPLC精製と同じであった。予期されるように、UVスペクトルで確認されるリガンドの生物活性物質は、10%ピークリガンドのスペクトルである。三次元クロマトグラム(図4A)から、測定される各波長(200〜800nm、450nm以降は図示していない)において任意のUV吸収性材料からどれだけリガンドが離れているかが分かる。したがってAh受容体の10%ピークリガンドは均一になるまで精製されている。
【0096】
10%ピークリガンドの全体の回収率および収量
バッチ精製から始まりHPLC系で終了する全精製系の全体の回収率は約0.2%である。約0.3μg(絶対量)の10%ピークリガンドが、成体ブタの新しい肺組織約500gから精製することができる。本発明者らは、約70頭の成体ブタから肺組織を連続的に処理し、約20μgの精製10%ピークリガンドを得た。
【0097】
2.リガンド材料の構造的同定
材料および方法
UV分光
約3μgβNF当量(BEQ)の試料を200μlのメタノール:水(60:40)と混合したものを、流速0.5ml/分の60%メタノール水溶液で平衡化させたシアノHPLCカラム(アドソーボスフィアCN−AQ 5U、内径=4.6mm、米国イリノイ州ディアフィールドのアルテック・アソシエーツ)に注入した。カラムから流出する化合物は、ウォーターズ996光ダイオードアレイ(PDA)検出器(米国マサチューセッツ州ミルフォードのウォーターズ)のフローセル(経路長10mm、内径0.009インチ)に通した。移動相のUV吸光度は自動的に0になるように設定した。図4Aに示されるようにUVスペクトルは、ミレニアム3.2ソフトウェア(ウォーターズ)を使用して1スペクトル/秒の速度で取得した。
【0098】
電子衝撃質量分析
新しいガラスプローブを、MS50TC超高分解能質量分析計(Ultrahigh Resolution Mass Spectrometer)(英国マンチェスターのクラトス社(Kratos Inc., Manchester, UK))に、電子エネルギー70eVおよびイオン源温度150℃で挿入した。プローブのバックグラウンドスペクトルを最初に測定した。注入溶媒のブランクスペクトルは、リガンドを含有するフラクションで測定した。クラトスDS−55データ取得システムを使用して、すべてのスペクトルデータを記録した。得られた高分解能スペクトルデータは、ブランクピークを減算した後に再プロットし作表した。
【0099】
約1μgBEQをメタノールに溶解した試料を、テフロンSTI IRカード(Teflon STI IR Card)(米国コネチカット州シェルトンのサーモ・スペクトラ−テック(Thermo Spectra-Tech, Shelton, CT, USA))上にスポットした。最小直径の赤外ビームが通過する領域によって、材料供給の制限によって試料経路が最小から最大まで維持されるように試料をカードに適用した。溶媒を蒸発させ、インフィニティ・60 AR FT−IR分光計(Infinity 60 AR FT-IR Spectrometer)(米国ウィスコンシン州マディソンのサーモ−マットソン(Thermo-Mattson, Madison, Wl, USA))の試料室にカードを取り付けた。スペクトルは、WinFIRST3.00ソフトウェア(解像度: 2、スキャン数:200、絞り開口:1、ウインドウ:KBr)で取得した。ブランクスペクトルは、最後の精製段階で注入した溶媒で測定した。
【0100】
一次元NMR分光法
標準的1H−NMRの単一周波数デカップリングおよび単一周波数NOE差スペクトルを求めるために使用される溶媒の磁化率に調節された磁化率を有する2.5mmNMR試料管(米国ニュージャージー州ブエナのウィルマド−ラボグラス(Wilmad-Labglass, Buena, NJ, USA))、または5mmのシゲミ(Shigemi)管(米国ペンシルベニア州アリソンパークのシゲミ社(Shigemi, Inc. Allison Park, PA, USA))のいずれかに、特定の溶媒に溶解した約2μgの試料を入れた。NMRスペクトルは、マディソン(Madison)の全米磁気共鳴施設(National Magnetic Resonance Facility)にあるブルカー(Bruker)DMX−750およびDMX−500分光計(米国マサチューセッツ州ビルリカのブルカー・バイオスピン(Bruker BioSpin Corp., Billerica, MA, USA))で測定した。ブランク(最後のHPLC精製の溶媒注入で採取したものと同じフラクション)のスペクトルも記録した。
【0101】
二次元NMR分光法
重水素化メタノールに溶解した約12μgの試料を5mmシゲミ管(シゲミ社)に入れた。二次元1H{13C}異核単一量子相関(HSQC)(Schleucher,etal., 1994)および異核多重結合相関(HMBC)(Willker,etal., 1993)測定を、5mmの三重共鳴一軸グラジエント・クリオグローブ(Cryoprobe(商標))(ブルカー・バイオスピン社)を取り付けたDMX−500で実施した。これはDMX−750分光計の2倍の信号対雑音比が得られる。gs−HMBC試験ではわずかな修正を行った。直接のピークは抑制されず、静的な場の不均質性に再度焦点を与える逆位相形成周期の中点で1Hおよび13Cの共鳴の両方で補強の180°パルスを使用した。
【0102】
理論的計算
提案される構造は、ガウスビュー・プログラム(GaussView program)(ガウシアン(Gaussian Inc.))を使用して構成した。これらのモデルは、ジャガー(Jaguar)量子化学プログラム(シュレーディンガー(Schrodinger Inc.))を使用して理論のB3LYP/6-31 g*レベルにおける完全に束縛のない幾何学的最適化が行われる。虚数周波数が存在しないことから、モデルが局所基底状態にあると仮定した。計算した周波数は、最適化構造に関するSQM法を使用してスケール変更した(Baker,etal., 1998)。等方化学シフトは、量子化学プログラムのガウシアン・スイート(Gaussian suite)を使用して最適化モデルから計算した(Frisch,etal., 1998)。ガウシアン(Gaussian)98で実行される理論のB3LYP/6-311++G(2d,2p)レベルにおいてGIAO法を計算に使用した。計算で求めた化学シフトは、数種類のモデル化合物の実験で求めた化学シフトと比較して較正し、経験的に理論値のスケール変更を行い(BaldridgeおよびSiegel),1999;Rablen,etal., 1999; ForsythおよびSebag,1997)、このためには次の一次方程式を使用した。実験で求めた化学シフト(1H,ppm)=計算で求めた化学シフト*0.95+0.26;実験で求めた化学シフト(13C,ppm)=計算で求めた化学シフト#0.95+0.59。直線回帰のR2値は、1Hおよび13Cの両方のフィッティングで0.999であった。較正した理論化学シフトに予測される実験値からのずれは、1Hの場合は0.15ppm以下であり(Rablen,etal., 1999)、13Cの場合は3ppm以下である(BaldridgeおよびSiegel, 1999)。テトラメチルシラン(TMS)のプロトンおよび炭素の理論的化学シフトは0に設定した。
【0103】
結合定数は、単一有限摂動法(single-finite-perturbation method)(Onak,etal., 1999)によって計算した。摂動の大きさは0.02auであり、これは応答の線形領域の範囲内であり、この計算は理論のB3LYP/6-311+g*レベルで実施した。この方法では、これらのフェルミ接触のスカラーカップリングへの寄与のみが有効である。
【0104】
NaBH 4 による還元
反応のためのガラスバイアに規定量の化合物をピペットで入れ、溶媒を蒸発させた。NaBH4の飽和エタノール溶液(100μl)(200プルーフ、米国ケンタッキー州シェルビービルのアーパー・アルコール・アンド・ケミカル(Aaper Alcohol and Chemical Co. Shelbyville, KY, U.S.A.))を各反応管に加えた。混合物を室温で終夜インキュベートした後、200μlの水を加えて反応を停止させた。この反応物を200μlのクロロホルムで2回抽出し、そのクロロホルム相を集めた。水相とクロロホルム相の両方の溶媒を蒸発させ、両方の相について生物学的活性を調べた。単離物質を含有しないことを除けば同様の処理が行われたブランクとしてクロロホルム相を電子衝撃質量分析で分析した。
【0105】
塩基加水分解およびメチル化
3ngBEQの試料を含有する2μlのメタノールに、38μlのメタノールと10μlの0.5mmKOH水溶液とを加え、混合した。反応を37℃で2時間続けた後、10μlの0.5mmolHCl水溶液を加えてpHを約5.0にして反応を停止させた。この反応混合物に、30μlの水、10μlのメタノール、および50μlのクロロホルムを加えて、混合した。遠心分離後、クロロホルム相を分離して保存した。クロロホルム抽出を繰り返し、2つのクロロホルム相をまとめて保存した。このクロロホルム相を2つに分け、1つは生物学的分析に使用し、もう一方はメチル化に使用した。3ngのβNFを2μlメタノールと混合したもの、およびコントロールとしての2μlのメタノールに関しても、同じ操作を実施した。
【0106】
メチル化の場合、加水分解生成物から溶媒を蒸発させ、50μlのクロロホルムを加えた。この溶液を氷で冷却し、ジアゾメタンのエーテル溶液(1mg/1ml、新しく調製した)5μlを加えた。この反応混合物を頻繁に振り混ぜながら氷上で10分間維持した。反応混合物を室温まで温め、遠心分離を行った。溶媒を蒸発させ、この生成物を、メチルを実施していない加水分解生成物とともに分析を行った。
【0107】
構造分析におけるプロトンおよび炭素の同定
化合物中の原子の同定の便宜上、プロトンおよび炭素は、それらの化学シフトにより命名する。例えば、化学シフトが9.25ppmのプロトンは9.25プロトンと呼び、同様に141.05ppmの炭素は141と呼ぶ。
【0108】
結果
UV分光法
試料のUVスペクトルは、多重ピーク吸収特性を示す。第1の吸収ピークは208nmにあらわれ、次の2つのピークは271nmと277nmに見られ、これら2つはより小さいが特徴的である。最後の吸収ピークは356nmにあらわれる(図4B)。このスペクトルは広範囲の共役を示している。興味深いことに、一部のスペクトル(271nmおよび277nmの吸収)はインドールのスペクトル(Pretsch,etal., 2000)と類似している。
【0109】
質量分光分析
高解像度電子衝撃質量スペクトルから、試料の分子イオンは286.0399質量単位であり、分子式はC14H10N2O3Sであることが分かる(図5A、表1)。硫黄の存在は、34Sが大きく寄与するM+2イオンの特徴的な存在度によって示される同位体クラスターの出現により明らかである。基準ピークは質量単位144.0453のイオンであり、C9H6NOで構成される。分子イオンと基準ピーク以外に、COを失うことにより144イオンから派生する116イオン、116イオンからCHNを失った生成物である89イオン、および116イオンからC2HNを失ったことによる77イオンが存在する。CH3を失うことにより分子イオンから派生する271イオン、分子イオンからCOを失うことにより生成する258イオン、および分子イオンからCH3およびCO2を失うことで生成する227イオンなどの存在度が比較的低いイオンも存在し、メチルエステル官能性が存在することを示している。200イオン、169イオン、160イオン、149イオン、147イオン、142イオン、131イオン、および123イオンなどの他の存在度の低いイオンは、1つまたは2つの転位現象を伴う断片化過程であると合理的に説明することができる。表1は、すべてのピークの正確な質量単位、ならびにそれらの分子組成、相対量、および実験質量と理論質量の間の一致の程度を示す偏差を示している。
【0110】
【表1】
【0111】
FT−IR分光法
FT−IRスペクトルでは、1737cm-1に強い吸収ピークが見られ、これはカルボニル、多くの場合にはエステルカルボニルに特徴的なピークである(図5B)。エスエルの存在は約1205cm-1のエステルC−Oピークの存在によってさらに支持される。1435cm-1および2926cm-1のピークは、メチル基およびメトキシ基の存在を示している。これらのピークはメチルエステルの存在をさらに支持しており、高分解能質量スペクトルの分析結果と一致している。1593cm-1のピークは、炭素−炭素二重結合、炭素−窒素二重結合、芳香族骨格、および芳香環中のC=Cからの予想される寄与以外の特殊な構造環境にある別のカルボニルを示している。
【0112】
プロトンNMR分光法
非常に少量の純粋化合物のみが寄与する1d−NMRシグナルを明らかにするため、d−メタノール中で試料とブランク(最後のHPLC精製の溶媒注入から得た試料と同じフラクション)の両方のスペクトルを測定し、続いて、溶媒と試料の間でピークが重なる可能性を排除するためにd−クロロホルム中で試料とブランクの両方のスペクトルを測定した。クロロホルムを使用するとスペクトルが複雑になったが、メタノールスペクトル中に隠れたスペクトルを見つけ出す目的を果たした。試料の1dプロトンNMRスペクトルでは、9個のプロトンが検出され(図6A)、残りの1つは使用した溶媒と交換されたために検出されなかったと思われる。交換可能なプロトン(11.33ppm)は、溶媒としてd−アセトンを使用した場合には見ることができ(データは示していない)、これから高解像度質量スペクトルデータから推測される分子式が裏付けられた。7.27(1H)、7.28(1H)、7.50(1H)、および8.38(1H)の化学シフトを有するプロトンは芳香環上で接近して存在しており、中央の7.27プロトンおよび7.28プロトンはデカップリングおよびNOE法(データは示していない)によりさらに支持される。9.25(1H)、8.67(1H)、および3.99(3H)ppmの化学シフトを有する3つのシングルピークが存在する。これらのピークは互いに分離しており、d−メタノール中のデカップリングおよびNOE法により明らかになる残りのプロトンとも分離している。しかし、d−アセトン中でNOE法を実施すると、11.33プロトンに照射した場合7.50プロトンと9.25プロトンの両方が応答し、これからこれら3つのプロトンが空間的に近くに存在することが分かる。3.99ppmの化学シフトおよび3.99プロトンから、これらのプロトンがメトキシ官能性と関連していることを示しており、高分解能質量スペクトルおよびFT−IRスペクトルの両方で測定されるメチルエステルの存在をさらに支持している。すべてのプロトン化学シフト値から判断して、3.99プロトンを除いたすべてのプロトンは芳香族系と関与している可能性が最も高い(図6A)。
【0113】
HSQC分光法
d−メタノール中で測定したHSQCスペクトルより、7つの炭素13の化学シフトが示され、それぞれの炭素には1または3個のプロトンが結合している(図6B)。9.25プロトンは、化学シフトが141ppmの炭素13(141炭素)と結合している。同様に、8.67プロトン、8.36プロトン、7.50プロトン、7.28プロトン、7.27プロトン、および3.99プロトンは、それぞれ135炭素、124炭素、114炭素、126炭素、125炭素、および55炭素と結合している(図6B)。この場合も、これらの炭素の化学シフトは、55炭素を除けば、芳香族系に関与しており、その一部はヘテロ原子の近くに存在することを示している。
【0114】
125炭素および126炭素とそれぞれ結合した7.27プロトンおよび7.28プロトンは、次元数および収集時間を増加させた場合の解像度にはスペクトルが分離する。これらのそれぞれの隣接するプロトンとのカップリングパターンも確認できる。1d−NMRスペクトルと合わせて考えると、どちらの場合も、これら2つのプロトンが他の2つのプロトン(7.50プロトンおよび8.36プロトン)の間に存在することを示す1つのダブレットダブレットよりも複雑になると予想される。
【0115】
HMBC分光法
d−メタノール中で得られるHMBCスペクトルによって、結合に関するさらに詳細な情報が得られる(図6B)。141炭素と直接結合する9.25プロトンは、おそらくは139ppm、129ppm、および115ppmの化学シフトを有する他の3つの炭素と2〜3個の結合によって連結している。8.36プロトンは124炭素と直接結合しており、同時に、7.28プロトンと直接結合している126炭素、および2〜3個の結合を介して9.25プロトンと結合する139炭素とも結合している。同様に、7.50プロトンは、114炭素と直接結合しており、さらに、7.27プロトンと直接結合する125炭素、および2つ以上の結合を介して9.25プロトンと結合する129炭素とも結合している。これらの関係から、9.25プロトンは、7.5プロトンおよび8.36プロトンの両方から4〜5個の結合が離れていることが分かった。一方、8.67プロトンは、比較的離れた系に存在する。このプロトンは、135炭素と直接結合している以外に、化学シフトが150ppmおよび173ppmの炭素と2〜3個の結合を介して連結している。他のプロトンはいずれも、これらの3つの炭素との関係は検出されていない。3.99プロトンは、55炭素(メチル炭素)と直接結合している以外に、化学シフトが165ppmの別の炭素(エステルカルボニル炭素であると思われる)と関係していることが分かり、このことはメチルエステル官能性と一致する。図6Bは、プロトンと炭素13の間の相関関係に関する詳細な情報を示している。本発明者らは、化合物の合計14個の炭素のうち13個の炭素化学シフト情報を得た。
【0116】
一部の1H−13C結合定数はHMBCスペクトルから直接測定した。9.25プロトンと、これと直接結合する炭素13(141炭素)との間の結合定数は191Hzであり、8.67プロトンと135炭素との間の結合定数は193Hzである。これら2つの結合定数から、両方の炭素が5員複素環式芳香族環のヘテロ原子の近くに存在することが分かる。7.27(または7.28)プロトンと125(または126)炭素との間の1つの結合の結合定数は158Hzであり、これらの元素が6員芳香環に含まれることを示している。3.99プロトンとこれらが直接結合する炭素(55炭素)の結合定数は150Hzであり、これもメトキシ官能基が存在することを示している。
【0117】
還元
NaBH4を使用した還元によって、生物活性が完全に破壊され、化合物のUVスペクトルは大きく変化した(データは示していない)。高分解能質量スペクトルは、反応後の精製前に測定した。スペクトルは複雑であり還元生成物の混合物が存在すると思われたが、分子イオンが260質量単位で分子式C13H12N2O2Sになったことから、還元後にメトキシ基がなくなったことは明らかである。この場合も、メチルエステル官能性が存在することを示している。
【0118】
塩基加水分解およびメチル化
エステルの存在を確認するために、本発明者らは、最初に化合物をKOHで加水分解し、その生成物の生物活性を調べた。加水分解生成物の生物活性は完全に失われた(データは示していない)。本発明者らが加水分解生成物をジアゾメタンメチル化すると、リガンド活性の約60%が回復し(データは示していない)、これよりエステル官能性の推測が裏付けられる。βNFに対して同じ処理を実施しても、生物活性の変化は検出されなかった。さらに、ブランクによる試験から、このような処理で生物活性が生じることはないことが分かった。
【0119】
構造
分子イオン286.0399(C14H10N2O3S)を示す高解像度質量スペクトルから、プロトンが10個しかない高度に縮合した構造であることが分かる。さらに、UV吸収スペクトルから高度の共役が存在することが分かる(図4B)。これらのうちの4つのプロトン(7.27、7.28、7.50、および8.36のプロトン)は6員芳香環と結合しているはずである。この環は、9.25プロトンが結合する5員芳香環と縮合している。144の基準ピーク質量スペクトルはC9H6NOで構成されるので、この5員環は窒素または酸素を有する複素環であるはずである。しかし、2つの炭素が直接酸素が結合した場合の化学シフトは、HSQCおよびHMBCで得られるデータ(図6B)よりも高い値になる必要があるので、酸素が5員環の成分にはなり得ない。したがって、窒素は5員環の成分である必要があり、これによりインドール構造が形成される。組成C9H6NOが144の基準質量ピークを満たすためには、5員環上の位置の1つがC=O部分またはC−O部分のいずれかで置換されている必要がある。9.25プロトンと8.36プロトンの両方が高度に脱遮蔽されてることを考慮すれば、9.5プロトンと8.36プロトンの間に基が存在する必要がある。したがって、9.25プロトンは、窒素と置換炭素の間にある必要があり、このこともインドール構造であることを示している。
【0120】
上記のC−O部分またはC=O部分は、近隣のプロトンを脱遮蔽しない6員環のC−O、あるいは脱遮蔽力を有するケトン結合部分である可能性がある。インドール核に結合した炭素上にケトンが存在することは、インドール近傍の炭素上のケトンに特徴的である1593cm-1の赤外バンド(図5B)によって支持されており、このような特徴は、3−ベンゾイルインドール(SDBSデータベース、BergmanおよびVenemalm,1990)、(シクロヘキサ−1−エン−1−イル)−3−インドリルメタノン、および3−(E−2−メチルブタ−2−エノイル)インドール(BergmanおよびVenemalm,1990)などのモデル化合物により示されている。このケトンは別の5員複素環式芳香族環(チアゾールまたはイソチアゾールのいずれか)に結合する。
【0121】
チアゾールとイソチアゾールのプロトンと炭素の両方の化学シフトと、脱遮蔽能力を有する2つの基で置換されることを考慮すれば、チアゾール構造の場合には8.67プロトンが結合できるのは5位だけであると考えることができる。ケトンおよびメチルエステルのそれぞれの2位および4位に結合する場合、またはその逆の場合があり、チアゾールに関して2つの構造が可能となる。チアゾールの場合と同様に、8.67プロトンは4位のみに結合すると考えることができるので、イソチアゾールに関しても2つの構造が可能となる。
【0122】
HMBCスペクトルから得られる8.67プロトンと、これと直接結合する炭素との1H−13C結合定数は約193Hzである。本発明者らは、チアゾールの5位のプロトンと炭素の間の結合定数、およびイソチアゾールの4位のプロトンと炭素の間の結合定数を調べた。Faure,etal., (1978)およびTseng(1987)は、チアゾールの5位のプロトンと炭素の間の結合定数は約191Hzであり、別の位置で異なる置換基があると188〜200Hzの範囲となり、イソチアゾールの4位のプロトンと炭素の間の結合定数は約173Hzだけであり、別の位置で異なる置換基があると168〜171Hzの範囲になると報告している。さらに、本発明者らは、構造に基づいてチアゾールとイソチアゾールの両方の理論的な結合定数を計算した。チアゾール構造で8.67プロトンと、これと結合する炭素との間の理論的結合定数は185.4Hzであり、イソチアゾール構造に基づいた場合は175.7Hzである。両方の結合定数と、文献による実験値から判断すると、イソチアゾール構造の可能性はなくなった。チアゾール構造の場合、1つの構造は、チアゾールの2位がケトンで置換され4位がメチルエステルで置換されたシステインから誘導される(図7A)。もう1つの構造は、図7Aに示される置換と逆の順序の置換と関連する非システイン関連構造である。
【0123】
化学シフトの理論計算の結果からは、システイン関連構造が実験値と最もよく一致しているといえる。文献の実験データからの根拠もこの推論を支持している。アルデヒド(この場合ではケトンと等価である)がチアゾールの2位と結合する場合、炭素2の化学シフトは166ppmであり炭素4の化学シフトは146ppmである(DondoniおよびPerrone,1995)。メチルエステルがチアゾールの4位に結合する場合、炭素4の化学シフトは146ppmであり、炭素2(メチル基が結合する)の化学シフトは167ppmである(MenschingおよびKalesse,1997)。本発明者らは、アルデヒド(またはケトン)がチアゾールの炭素2に結合し同時にメチルエステルが炭素4に結合する場合、システイン関連構造の配置と同様、炭素2と炭素4の化学シフトはそれぞれ166と146になり、この構造(図7A)の計算値および測定値の両方の化学シフトと一致すると推測することができる。一方、アルデヒド(またはケトン)がチアゾールの4位と結合する場合、炭素4の化学シフトは155(Nicolaou,etal., 1997)または156(Millan,etal., 2000)である。チアゾールの2位がメチルエステルで置換された場合、炭素2の化学シフトは158ppmである(KellyおよびLang,1995)。したがって、アルデヒド(またはケトン)が4位に結合し、同時にメチルエステルが2位に結合する場合(非システイン関連構造の配置と同様)、炭素4と炭素2の化学シフトはそれぞれ155ppmと158ppmになり、この構造の計算値(158ppmと163ppm)とよく一致する。したがって、実験データと計算した化学シフトから、正しい構造は図7Aに示されるシステイン関連構造であることに疑いはなく、この構造が内因性Ah受容体リガンドを表している。
【0124】
図7Aのリガンド構造は、3−ベンゾイルインドールの電子衝撃質量スペクトル(SDBSデータベース、BergmanおよびVenemalm,1990)によってさらに支持される。この化合物の分子イオンは221質量単位である。ベンゼンを失った後に、ケトンと結合するインドールで構成されるイオンが生成すると、安定性が高いためすぐに144の基準ピークが現れる。この公知の化合物のさらに詳細な断片化パターンは本発明者らが精製したリガンドのパターンと正確に同じであり、144ピークからCOが失われて116ピークが現れ、116ピークからCHN(またはC2HN)が失われて89(または77)ピークが現れる(SDBSデータベース)。
【0125】
従って、新規Ah受容体リガンドは2−(1'−H−インドール−3'−カルボニル)−チアゾール−4−カルボン酸メチルエステルであると推定され、本発明者らは略してITEと呼ぶ。この構造を確認するため、化学合成を開始し、その合成化合物は、単離したものと同じ生物活性、および同じ物理的データが得られた。ITEの用量の関数としてのレポーター遺伝子活性を、βNFの場合と比較したものが図7Bに示されており、4時間のインキュベーション後(時間経過実験の最適の時点である)にβNFの約5倍の効力を示した(データは示していない)。Ah受容体を介したITEの作用は、この化合物に対するレポーター遺伝子の応答が用量依存的にAhRアンタゴニストの3'−メトキシ−4'−ニトロフラボン(ヘンリー(Henry),etal., 1999)によって阻害されることで示された(データは示していない)。
【0126】
参考文献
アダチ(Adachi),J.etal., 「インジルビンおよびインジゴはヒト尿中に存在する強力なアリール炭化水素受容体リガンドである(Indirubin and indigo are potent aryl hydrocarbon receptor ligand present in human urine)」,J.Biol.Chem. 276(34):31475-31478 (2001)。
アレクサンダー(Alexander), D. L, ガネム(Ganem), L. G.,フェルナンデス−サルグエロ(Fernandez-Salguero), P.,ゴンザレス(Gonzalez), F.,およびジェフコート(Jefcoate), C. R.「アリール炭化水素受容体は、脂質合成および脂質生成への関与の阻害制御因子である(Aryl-hydrocarbon receptor is an inhibitory regulator of lipid synthesis and of commitment to adipogenesis)」,J.CellSci. 111 (Part 22):3311 -3322 (1998)。
ベーカー(Baker), J.etal.,「基本原子価力定数の直接スケーリング:スケーリングされた量子力学力場の別の方法(Direct Scaling of Primitive Valence Force Constants: An Alternative Approach to Scaled Quantum Mechanical Force Fields)」,J.Phys.Chem.A102:1412-1424,1998。
バルドリッジ(Baldridge), K.K.およびJ.S.ジーゲ(Siege), 「経験的δ(TMS)とアブイニシオ計算により予測される絶対NMR化学シフトの相関関係(Correlation of Empirical .delta. (TMS) and Absolute NMR Chemical Shifts Predicted by ab Initio Computations)」,J.Phys.Chem.A103:4038-4042, 1999。
ベネディクト(Benedict), J. C., リン(Lin), T. M., レフラー(Loeffler), I. K., ピーターソン(Peterson), R. E., およびフラウズ(Flaws), J. A.「マウス卵巣の発達におけるアリール炭化水素受容体の生理学的役割(Physiological role of the aryl hydrocarbon receptor in mouse ovary develoment)」,Toxicol.Sci. 56(2):382-388 (2000)。
バーグマン(Bergman), J. およびL. ベネマルム(Venemalm), 「インドールの亜鉛塩のアシル化(Acylation of the Zinc Salt of Indole)」,Tetrahedron46(17):6061-6066, 1990。
ボネセン(Bonnesen), C., エグルストン(Eggleston), I. M., およびヘイズ(Hayes), J. D. 「アブラナ科植物から生成される食物インドール類おおびイソチオシアネート類は、ヒト大腸細胞系のアポトーシスを促進しDNA損傷を保護しうる(Dietary indoles and isothiocyanates that are generated from cruciferous vegetables can both stimulate apoptosis and confer protection against DNA damage in human colon cell lines)」,CancerRes. 61(16):6120-6130 (2001)。
バルバッハ(Burbach), K.M., ポーランド(Poland), A. およびブラッドフィールド(Bradfield), C.A., 「Ah受容体cDNAのクローンングによって得意なリガンド活性化転写因子が明らかとなった(Cloning of the Ah-receptor cDNA reveals a distinctive ligand-activated transcription factor)」,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:8185-8189(1992)。
チェン(Chen), I., セーフ(Safe), S., およびビェルダンズ(Bjeldanes), L. 「T47Dヒト乳癌細胞におけるアリール炭化水素(Ah)受容体アゴニストおよびアンタゴニストとしてのインドール−3−カルビノールおよびジインドリルメタン(Indole-3-carbinol and diindolylmethane as aryl hydrocarbon (Ah) receptor agonists and antagonists in T47D human breast cancer cells)」,Biochem.Pharmacol. 51(8); 1069-1076 (1996)。
チェン(Chen), Y. H.etal., 「マウス肝腫細胞におけるインドロ[3,2−b]カルバゾールによるCYP1A1の調節(Regulation of CYP1A1 by indolo[3,2-b]carbazole in murine hepatoma cells)」,J.Biol.Chem, 270(38):22548-22555 (1995)。
チェヌング(Cheung), Y. L., スネリング(Snelling), J., モハメド(Mohammed), N, N. D., グレイ(Gray), T. J. B., およびロアニデス(loannides), C. 「一連のジアミノトル塩類の芳香族炭化水素受容体との相互作用、cyp1a誘導、および変位原性−これらの発癌性との関係(Interaction with the aromatic hydrocarbon receptor, cyp1a induction, and mutagenicity of a series of diaminotoluenes - implications for their carcinogenicity)」,Toxicol.Appl.Pharmacol. 139(1 ):203-211 (1996)。
ドルウィック(Dolwick) K.M., シュミット(Schmidt) J.V., カーバー(Carver) L. A., スワンソン(Swanson) H.I., ブラッドフィールド(Bradfield) C.A. 「Ah受容体cDNAのクローニングおよび発現(Cloning and expression of a human Ah receptor cDNA)」,Mol.Pharmacol.44:911-917 (1993)。
ドルウィック(Dolwick), K.M., スワンソン(Swanson) H.I., ブラッドフィールド(Bradfield) C.A. 「リガンド活性化DNA認識と関与するAh受容体ドメインのインビトロ分析(In vitro analysis of Ah receptor domains involved in ligand-activated DNA recognition)」,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 90:8566-70 (1993)。
【0127】
ドンドーニ(Dondoni), A. およびD. ペロン(Perrone), 「(+)−ガラクトスタチンの全合成。チアゾール−アルデヒド合成の有用性の例(Total Synthesis of (+)-Galactostatin. An Illustration of the Utility of the Thiazole-aldehyde Synthesis)」,J.Org.Chem.60:4749-4754 (1995)。
エルフェリンク(Elferink), C. J., ゲー(Ge), N. L, およびレビン(Levine), A. 「最大アリール炭化水素受容体活性は網膜芽細胞腫タンパク質との相互作用に依存する(Maximal aryl hydrocarbon receptor activity depends on an interaction with the retinoblastoma protein)」,Mol.Pharmacol59(4):664-673 (2001)。
エリゾンド(Elizondo), G.etal., 「アリール炭化水素受容体が存在しない胎児線維芽細胞におけるG(2)/M相における細胞周期調節の変化(Altered cell cycle control at the G(2)/M phases in aryl hydrocarbon receptor-null embryo fibroblast)」,Mol.Pharmacol. 57(5)-1056-1063(2000)。
ファウレ(Faure), R., ガリー(Galy), J., ビンセント(Vincent), E., およびエルグエロ(Elguero), J.「チアゾール類とチアゾロ[2,3−e]テトラゾール類の13C核磁気共鳴による複数のヘテロ原子を含有する5員環の研究(Etudes d’heterocycles pentagonaux polyheteroatomiques par resonance magnetique nucleaire du13C, Thiazoles et thiazolo[2,3-e]tetrazoles)」,Can.J.Chem.56:46-55 (1978)。
フェルナンデス−サルグエロ(Fernandez−Salguerro), P.etal., 「ダイオキシン結合性Ah受容体の欠乏したマウスにおける免疫系障害および肝線維症(Immune system impairment and hepatic fibrosis in mice lacking the dioxin-binding Ah receptor)」,Science268:722-726 (1995)。
フレッチャー(Fletcher), N., ハンベルグ(Hanberg), A., およびハカンソン(Hakansson), H. 「4種類の齧歯動物において肝臓のビタミンA不足は2,3,7,8−テトラクロロジベンゾ−p−ダイオキシン(TCDD)曝露の感受性マーカーである(Hepatic vitamin A depletion is a sensitive marker of 2,3,7-8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) exosure in four rodent species)」,Toxicol.Sci. 62(1):166-175.(2001)。
フォルシッシュ(Forsyth), D.A. およびセバッグ(Sebag), A. 「計算による13CNMRのケミカルシフトと経験的にスケール変更したGIAO遮蔽および分子力学的形状。13Cシフトによる配座と配置(Computed 13C NMR Chemical Shifts via Empirically Scaled GIAO Shieldings and Molecular Mechanics Geometries. Conformation and Configuration from 13C Shifts)」,J.Am.Chem.Soc.119:9483-9494 (1997).
フリッシュ(Frisch), M.J.etal., 「ガウシアン98、リビジョンA.9(Gaussian 98, Revision A.9)」,米国ペンシルバニアピッツバーグのガウシアン(Gaussian Inc., Pittsburgh, PA, USA), (1998)。
ガリソン(Garrison), P.M.etal., 「2,3,7,8−テトラクロロジベンゾ−p−ダイオキシン様化学物質の検出の生物検定システムとしての種特異的組み換え細胞系(Species-specific recombinant cell lines as bioassay systems for the detection of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-like chemicals)」,Fund. Appl.Toxicol.30:194-203 (1996)。
グラディン(Gradin), K.etal.,「低酸素とダイオキシン信号伝達経路の機能妨害:Arnt転写因子の増加に対する競合(Functional interference between hypoxia and dioxin signal transduction pathways: competition for recruitment of the Arnt transcription factor)」,Mol.Cell.Biol. 16(10):5221-31 (1996)。
グ(Gu), Y., ホゲネシヒ(Hogenesch), J. B., およびブラッドフィールド(Bradfield), C. A. 「PASスーパーファミリー:環境的および発生的信号のセンサー(The PAS superfamily: sensors of environmental and developmental signals)」,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol. 40:519-561 (2001)。
ヒースパグリウソ(Heathpagliuso), S.etal., 「トリプトファンおよびトリプトファン代謝物によるAh受容体の活性化(Activation of the Ah receptor by tryptophan and tryptophan metabolites」,Biochem. 37(33):11508-11515 (1998)。
ホゲネシヒ(Hogenesch) J.B.etal.,「ダイオキシン信号伝達経路の成分と相互作用する塩基性−へリックス−ループ−へリックス−PASスーパーファミリーのサブセットの特性決定(Characterization of a subset of the basic-helix-loop-helix-PAS super family that interacts with components of the dioxin signaling pathway)」,J.Biol.Chem.272:8581-8593 (1997)。
ジャイン(Jain) S., ドルウィック(Dolwick) K.M., シュミト(Schmidt) J.V, ブラドフィールド(Bradfield) C.A., 「Ah受容体の強力な転写促進ドメインおよびAh受容体核移動物質のカルボキシル末端までの地図(Potent transactivation domains of the Ah receptor and the Ah receptor nuclear translocator map to their carboxyl termini)」,J.Biol.Chem. 269:31518-31524 (1994).
【0128】
ジェリンク(Jellinck), P. H.etal., 「インドールカルビノールのAh受容体結合特性および肝臓エストラジオールヒドロキシル化の誘導(Ah receptor binding properties of indole carbinols and induction of hepatic estradiol hydroxylation)」,Biochem.Pharmacol. 45(5): 1129-1136 (1993)。
ケリー(Kelly), T.R. およびF. ラング(Lang), 「リチオ化によるチアゾール化合物の合成:予期せぬ転位(Synthesis ofThiazole Compounds via Lithiation: An Unexpected Rearrangement)」,TetrahedronLetters36(51):9293-9296 (1995)。
クリーマン(Kleman), M. I., ポーリンガー(Poellinger), L., およびグスタフソン(Gustafsson), J. A.「食品由来の受容体リガンドのインドロカルバゾール類によるヒトダイオキシン受容体機能の調節(Regulation of human dioxin receptor function by indolocarbazoles, receptor ligands of dietary origin)」,J.Biol.Chem. 269(7):5137-5144 (1994)。
リー(Lee), I. J.etal., 「チアゾリウム化合物yh439によるチトクロムp4501a1遺伝子の転写誘導(Transcriptional induction of the cytochrome p4501a1 gene by a thiazolium compound, yh439)」,Mol.Pharmacol. 49(6):980-988 (1996)。
リウ(Liu), R. M.etal.,「マウス肝腫細胞系における5,10−ジヒドロインデノ[1,2−b]インドールによる[Ah]遺伝子電池酵素およびグルタチオン量の調節(Regulation of [Ah] gene battery enzymes and glutathione levels by 5,10-dihydroindeno[1,2-b]indole in mouse hepatoma cell lines)」,Carcinogenesis15(10):2347-2352. (1994)。
マレテペ(Maltepe), E. およびシモン(Simon), M.C. 「酸素、遺伝子、および発生:マウス血管形成中の低酸素遺伝子調節の役割の分析(Oxygen, genes, and development: an analysis of the role of hypoxic gene regulation during murine vascular development)」,J.Mol.Med. 76(6):391-401 (1998)。
マクドゥーガル(McDougal), A., ウォルムク(Wormke), M., カルビン(Calvin), J., およびセーフ(Safe), S. 「選択的アリール炭化水素受容体修飾物質と協同することによってタモキシフェンに誘導される抗腫瘍性/抗エストロゲン性作用(Tamoxifen-induced antitumorigenic/antiestrogenic action synergized by a selective aryl hydrocarbon receptor modulator)」,CancerRes. 61(10):3902-3907 (2001)。
マクドゥーガル(McDougal), A., セチ−グプタ(Sethi-Gupta), M., ラマムールティ(Ramamoorthy), K., サン(Sun), G., およびセーフ(Safe), S. 「ジインドリルメタノの対称的ジハロ置換類似体による発ガン物質誘発性ラット乳腺癌増殖および他のエストロゲン依存性応答の阻害(Inhibition of carcinogen-induced rat mammary tumor growth and other estrogen-dependent responses by symmetrical dihalo-substituted analogs of diindolylmethane)」,CancerLett. 151:169-179(2000)。
メシング(Mensching), S. およびM. カレッセ(Kalesse), 「MnO2を使用したチアゾリジン類のカラム脱水素によるチアゾール類の生成(Generation of Thiazoles by Column Dehydrogenation of Thiazolidines with MnO2)」,J.Prakt.Chem. 339:96-97 (1997)。
ミラン(Millan), D.S.etal., 「ウロカニン酸のオキサゾールおよびチアゾール類似体の合成および活性(The Synthesis and Activity of Oxazole and Thiazole Analogues of Urocanic Acid)」,Tetrahedron56:811-816, (2000)。
ミムラ(Mimura), J.etal., 「Ah(ダイオキシン)受容体を欠損したマウスにおける2,3,7,8−テトラクロロジベンゾ−p−ダイオキシン(TCDD)に対する催奇性応答の減少(Loss of teratogenic response to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) in mice lacking the Ah (dioxin) receptor)」,Gene.Cell.. 2:645-654 (1997)。
ニコラオ(Nicolaou), K.C.etal.,「マクロラクトン化に基づいた方法によるエポチロンAおよびBの全合成(Total Syntheses of Epothilones A and B via a Macrolactonization-based Strategy)」,J.Am.Chem.Soc.119:7974-7991 (1997)。
オカモト(Okamoto), T., ミツハシ(Mitsuhashi), M., フジタ(Fujita), I., シンジュ(Sindhu), R.K., およびキッカワ(Kikkawa), Y., 「高酸素によるシトクロムP450 1A1および1A2の誘導(Induction of cytochrome P450 1A1 and 1A2 by hyperoxia)」,Biochem.Biophys.Res.,Commun.197:878-885(1993)。
オーナック(Onak), T.etal.,「多面体炭酸塩および水素化ホウ素の核スピン−スピン結合定数の密度関数理論/有限摂動理論計算(Density Functional Theory/Finite Perturbation Theory Calculations of Nuclear Spin-Spin Coupling Constant for Polyhedral Carboranes and Boron Hydrides)」,J.Am.Chem.Soc.121:2850-2856 (1999)。
フェラン(Phelan), D., ウィンター(Winter), G. M., ロジャー(Rogers), W. J., ラム(Lam), J. C., およびデニソン(Denison), M. S. 「ビリルビンおよびビリベルジンによるAh受容体信号伝達経路の活性化(Activation of the Ah receptor signal transduction pathway by bilirubin and biliverdin)」,Arc.Biochem.Biophy. 357(1): 155-163 (1998)。
【0129】
ポーリンガー(Poellinger), L. 「機構的側面−ダイオキシン(アリール炭化水素)受容体(Mechanistic aspect the dioxin (aryl hydrocarbon) reseptor)」,FoodAdd.Contam.17(4):261-266 (2000)。
ポーランド(Poland), A., グローバー(Glover), E., およびケンデ(Kende), A. S. 「肝臓サイトゾルによる2,3,7,8−テトラクロロジベンゾ−p−ダイオキシンの立体特異的高親和性結合:結合種がアリール炭化水素ヒドロキシラーゼを誘導することの根拠(Stereospecific, high affinity binding of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin by hepatic cytosol: evidence that the binding species is receptor for induction of aryl hydrocarbon hydroxylase)」,J.Biol.Chem. 251:4936-4946(1976)。
ポーランド(Poland), A. およびグローバー(Glover), E.「塩素化ジベンゾ−p−ダイオキシン:−アミノレブリン酸合成酵素およびアリール炭化水素ヒドロキシラーゼの強力な誘導物質。II.構造と活性の関係の研究(Chlorinated dibenzo-p-dioxin: Potent inducers of −aminolevulinic acid synthetase and aryl hydrocarbon hydroxylase. II. A study of the structure-activity relationship)」,Mol.Pharmacol. 9:736-747 (1973)。
プレオブラゼンスカヤ(Preobrazhenskaya), M. N. およびコロレフ(Korolev), A. M. 「アブラナ科植物のインドール誘導体(Indole derivatives in vegetables of the Cruciferae family)」,BioorganicheskayaKhimiya. 26(2):97-111 (2000)。
プレシヒ(Pretsch), E.etal., 「有機化合物の構造決定:スペクトルデータ表(Structure Determination of Organic Compounds: Tables of Spectral Data)」,第3版、シュプリンガー、ベルリン、ニューヨーク、2000年( 3rd ed., Springer, Berlin, New York, 2000)。
プロブスト(Probst), M.R., ライス−ポルサス(Reisz-Porszasz), S., アグブナグ(Agbunag), R.V., オング(Ong), M.S. およびハンキンソン(Hankinson), O., 「アリール炭化水素(ダイオキシン)受容体作用におけるアリール炭化水素受容体核移動タンパク質の役割(Role of the aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator protein in aryl hydrocarbon (dioxin) receptor action)」,Mol.Pharmacol. 44:511 -518 (1993)。
プガ(Puga), A.etal., 「芳香族炭化水素受容体と網膜芽腫タンパク質の相互作用によってE2F依存性転写および細胞周期休止が促進される(Aromatic hydrocarbon receptor interaction with the retinoblastoma protein potentiates repression of E2F-dependent transcription and cell cycle arrest)」,J.Biol.Chem. 275(4):2943-2950 (2000)。
ラブレン(Rablen), P.R.etal., 「化学的精度を有するプロトン化学シフトの評価のための密度関数法の比較(A Comparison of Density Functional Methods for the Estimation of Proton Chemical Shifts with Chemical Accuracy)」,J.Phys.Chem.A103:7357-7363(1999)。
ラヌング(Rannug), U., ラヌング(Rannug), A., ショーベリ(Sjoberg), U., リー(Li), H., ウェスターホルン(Westerholm), R., およびバルグマン(Bergman), J. 「トリプトファンから誘導される2種類の高親和性Ah受容体リガンドの構造の解明(Structure elucidation of two tryptophan-derived, high affinity Ah receptor ligands)」,Chem.Biol. 2(12):841-845 (1995)。
ラナグ(Rannung), A.etal., 「トリプトファンのある光酸化誘導体はAh受容体と非常に高い親和性で結合し、内因性信号伝達物質である可能性がある(Certain photooxidized derivatives oftryptophan bind with very high affinity to the Ah receptor and are likely to be endogenous signal substances)」,J.Biol.Chem.262:15422-15427 (1987)。
セーフ(Safe), S. 「Ah受容体の分子生物学およびその発癌における役割(Molecular biology of the Ah receptor and its role in carcinogenesis)」,Toxicol.Let. 120:1-7 (2001)。
サントステファノ(Santostefano), M. J.etal., 「急性および亜慢性曝露後のTCDDの細胞内局在化は、肝臓、肺、および腎臓で異なる:種/用量の比較および考え得る機構(Subcellular localization ofTCDD differs between the liver, lungs, and kidneys after acute and subchroni exposure: species/dose comparisons and possible mechanism)」,Fund.Appl.Toxicol. 34:265-275 (1996)。
シャルダッハ(Schaldach), C. M., リビー(Riby), J., およびビェルダンズ(Bjeldanes), L. F..「リポキシンA(4):Ah受容体の新しい種類のリガンド(Lipoxin A(4): A new class of ligand for the Ah receptor)」,Biochem. 38(23):7594-7600 (1999)。
シュロイハー(Schleucher), J.etal.,「パルスフィールドグラジエントを使用する異核多次元NMRの一般的な増強方法(A General Enhancement Scheme in Heteronuclear Multidimensional NMR Employing Pulsed Field Gradients)」,J.BiomolNMR4:301-306(1994)。
【0130】
シュミト(Schmidt), J. V. およびブラッドフィールド(Bradfield), C. A. 「Ah受容体信号伝達経路(Ah receptor signaling pathways)」,Ann.Rev.CellDev.Biol.12:55-89 (1996)。
シュミット(Schmidt), J. V., スー(Su), G. H., レディ(Reddy), J. K., サイモン(Simon), M. C., およびブラッドフィールド(Bradfield), C. A.「マウスAhRヌル対立遺伝子の特性決定:肝臓増殖および発生におけるAh受容体関与(Characterization of a murine AhR null allele: involvement of the Ah receptor in hepatic growth and development)」,Proc.Nat.Acad.Sci.USA.93:6731-6736 (1996)。
SDBSデータベース、有機化合物のスペクトルの総合データベースシステム(Integrated Spectral Data Base System for Organic Compounds), 茨城県筑波の産業技術総合研究所(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Tsukuba, Ibaraki, Japan),SDBSウェブ:http://www/aist.go/jp/riodb/sdbs/。
シンバ(Shimba), S., ワダ(Wada), T., およびテヅカ(Tezuka), M. 「アリール炭化水素受容体(AhR)は3T3−L1細胞の脂肪分化の負の調節と関与している:AhRはダイオキシンとは無関係に脂肪分化を阻害する(Arylhydrocarbon receptor (AhR) is involved in negative regulation of adipose differentiation in 3T3-L1 cells: AhR inhibits adipose differentiation independently of dioxin)」,J.CellSci. 114(15):2809-2817 (2001)。
シンバ(Shimba), S., トドロキ(Todoroki), K., アオヤギ(Aoyagi), T., およびテヅカ(Tezuka), M. 「3T3−L1細胞の脂肪分化中のアリール炭化水素受容体の欠乏(Depletion of arylhydrocarbon receptor during adipose differentiation in 3T3-l1 cells)」,Biochem.Biophy.Res.Com. 249(1):131-137(1998)。
シナル(Sinal), C. J. およびベンド(Bend), J. R.「マウス肝腫ヘパ1c1c7細胞におけるビリルビンによるcyp1a1のアリール炭化水素受容体依存性誘導(Aryl hydrocarbon receptor-dependent induction of cyp1a1 by bilirubin in mouse hepatoma hepa 1c1c7 cells)」,Mol.Pharmacol. 52(4):590-599(1997)。
スティーブンセン(Stephensen), P. U.etal., 「培養細胞ではインドール−3−カルビノールゆよりもN−メトキシインドール−3−カルビノールの方が有効なチトクロムP−450 1A1誘導物質である(N-methoxyindole-3-carbinol is a more efficient inducer of cytochrome P-450 1A1 in cultured cells than indol-3-carbinol)」,NutrCancer Internatl.J. 36(1):112-121 (2000)。
スダ(Suda), T., デルカ(DeLuca), H. F., およびタナカ(Tanaka), Y.「ラットにおける25−ヒドロキシエルゴカルシフェロールの生物活性(Biological activity of 25-hydroxyergocalciferol in rats)」,J.Nutrition. 100(9): 1049-1052 (1970)。
スワンソン(Swanson), H.I. およびブラッドフィールド(Bradfield), C.A., 「Ah受容体:遺伝学、構造、および機能(The Ah-receptor: Genetics, structure and function)」,Pharmacogenetics3:213-230 (1993)。
ティアン(Tian) H., マクナイト(McKnight) S. L, ラッセル(Russell) D. W., 「内皮PASドメインタンパク質1(EPAS1)、内皮細胞で選択的に発現する転写因子(Endothelial PAS domain protein 1 (EPAS1), a transcrption factor selectively expressed in endothelial cells)」,GenesDev.11:72-82(1997)。
ツエング(Tseng), O.K.,「2アミノチアゾール類および2−イミノチアゾール類のプロトンおよび炭素13NMRの研究(Proton and Carbon-13 NMR Studies of 2-Aminothiozoles and 2-Iminothiazolines)」,Magn.Reson.Chem.25:105-108 (1987)。
バシリオ(Vasiliou), V., シャーサー(Shertzer), H. G., リウ(Liu), R. M., セインズブリー(Sainsbury), M., and ネバート(Nebert), D. W. 「メナジオン毒性に対して防護する化合物に対する[Ah]バッテリー遺伝子の応答(Response of [Ah] battery genes to compounds that protect against menadione toxicity)」,Biochem.Pharmacol. 50(11):1885-1891 (1995)。
ウォシュバーン(Washburn), B. S.etal., 「非芳香族性海産神経毒であるブレベトキシン−6(pbtx−6)はアリール炭化水素受容体のリガンドである(Brevetoxin-6 (pbtx-6), a nonaromatic marine neurotoxin)」,Arc.Biochem.Biophy. 343(2):149-156 (1997)。
ホワイトロック(Whitlock), J. P. Jr.etal.,「ダイオキシンによる薬物代謝酵素の誘導(Induction of drug-metabolism enzymes by dioxin)」,DrugMetabol.Rev. 29:1107-1127 (1997)。
ホワイトロック(Whitlock), J.P., Jr.,「2,3,7,8−テトラクロロジベンゾ−p−ダイオキシン作用の遺伝的および分子的側面(Genetic and molecular aspects of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin action)」,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol. 30:251-277 (1990)。
ウィルク(Wilk), R. ワイツマン(Weizman), I. およびシロ(Shilo), B.-Z., 「trachealessは、Drosophilaの器官細胞の運命の誘導物質であるbHLH−PASをコードする(Trachealess encodes a bHLH-PAS protein that is an inducer of tracheal cell fates in Drosophila)」,GenesDev. 10:93-102 (1996)。
ウィルカー(Willker), W.etal.,「反転異核相関分光におけるグラジエントの選択(Gradient Selection in Inverse Heteronuclear Correlation Spectroscopy)」,Magn.Reson.Chem.31:287-292 (1993)。
【図面の簡単な説明】
【0131】
【図1】βNFおよび組織抽出物の細胞応答を示す一連のグラフである。AhRリガンド抽出および分析は実施例に記載されるように実施した。エラーバーは、3つの分析ウェルの結果の間の標準偏差を示している。各プロットは、多数実施した同様の実験を示している。図1Aは、βNF用量作用曲線を示す。縦軸は、相対光量単位(RLU)で表現されるルシフェラーゼ活性である。横軸は、βNF濃度(単位ng/200μl細胞培養液)である。図1Bは、人工飼料を給餌したラットの肺組織1gからのメタノール抽出物のリガンド活性を示す。縦軸は、βNF当量(単位ng)である。横軸は、肺−肺からの抽出物、ブランク−ブランク抽出による抽出物(肺組織を使用せずに肺の抽出と同様に抽出を行った)、DMSO−AhRリガンドの供給に使用したDMSOと同量のDMSOである。図1Cは、Ah受容体リガンド活性のための予備的な器官の検査を示す。縦軸は、組織1g中のBEQ(βNF当量(単位ng))である。横軸は、検査した器官である。図1Dは、組織のメタノール抽出物のリガンド活性に対する塩基処理の影響を示す。処理のクロロホルム相が示される。塩基と表示される処理は、実施例に概略が示される塩基で処理した。中和塩基(中和した塩基)と表示されているデータは、残分または試薬を加える前に最初に塩基を中和したことを除けば、塩基処理と同様に処理した。ブランクは、組織抽出物と同時に得られるブランク抽出物である。抽出物はメタノールによる組織抽出物である。縦軸は、βNF当量(単位ng)である。横軸は、処理である。図1Eは、メタノール抽出物のリガンド活性に対する熱処理単独の影響を示す。縦軸は、人工飼料を給餌したラットの肺組織1gのβNF当量(単位ng)である。横軸は、処理である。図1Fは、メタノール抽出物のリガンド活性に対する酸および熱処理の影響を示す。縦軸は、人工飼料を給餌したラットの肺組織1gのβNF当量(単位ng)である。横軸は、処理である。
【図2】AhRリガンドの予備精製を示す一連のグラフである。図2Aは、組織5,000gからの酸および熱処理抽出物のシリカバッチ精製を示す。この手順の概略は実施例に示される。各フラクションのアリコートについて分析し、各フラクションの全活性を計算した。縦軸は、各フラクションのβNF当量(単位μg)である。横軸は、バッチ精製のフラクションである。図2Bは、AhRリガンドのシリカ重力カラムクロマトグラフィー(120μgBEQ)を示す。実線は、異なるフラクションのリガンド活性である。破線は、クロロホルム中のメタノールの凸型グラジエントである。縦軸は、βNF当量(単位μg)である。横軸は、フラクション番号(フラクション#1〜#7は各125ml、#8〜#88は各25ml、#89〜#106は各125ml)である。第2の縦軸は、クロロホルム中のメタノール%である。
【図3】AhRリガンドのHPLC精製を説明する一連のグラフである。HPLC精製の手順は実施例で説明した。図3Aは、分取用シリカHPLCカラムおよびメタノールクロロホルム移動相による50μgBEQのAhRリガンドの精製を示す。実線は、異なるフラクションのリガンド活性である。破線は、クロロホルム中のメタノールのリニアグラジエントである。縦軸は、BEQ(βNF当量(単位μg))におけるリガンド活性である。横軸は、フラクション番号(フラクション#1〜#55は各10ml、#56〜#75は各20ml、流速=10ml/分)である。第2の縦軸は、クロロホルム中のメタノールの%値である。図3Bは、分取用シリカHPLCカラムおよびイソプロパノール:ヘキサン移動相による40μgBEQのAhRリガンドの精製を示す。実線は、異なるフラクションのリガンド活性である。破線は、ヘキサン中のイソプロパノールのリニアグラジエントである。縦軸は、BEQ(βNF当量(単位μg))におけるリガンド活性である。横軸は、フラクション番号(フラクション#1〜#80は各10ml、#81〜#105は各20ml、流速=10ml/分)である。第2の縦軸は、ヘキサン中のイソプロパノールの%値である。図3Cは、分取用C18HPLCカラムと75%メタノール水溶液を使用した20μgBEQのAhRリガンドの精製を示す。縦軸は、BEQ(単位μg)における異なるフラクションのリガンド活性である。横軸は、フラクション番号(フラクション#1〜#30で各5ml、#31〜#55で各20ml、流速:5ml/分(0〜60分)、10ml/分(60〜95分))である。図3Dは、分析用C18HPLCカラムと50%アセトニトリル水溶液を使用した10μgBEQのAhRリガンドの精製を示す。縦軸は、356nmにおけるUV吸光度単位である。横軸は、保持時間(分)である。図3Eは、シアノHPLCカラムと10%イソパノールのヘキサン溶液を使用した10μgBEQのAhRリガンドの精製を示す。縦軸は、356nmにおけるUV吸光度単位である。横軸は、保持時間(分)である。図3Fは、シアノHPLCカラムと60%メタノール水溶液を使用した10μgBEQのAhRリガンドの精製を示す。縦軸は、356nmにおけるUV吸光度単位である。横軸は、保持時間(分)である。
【図4】精製したAhRリガンドのHPLCクロマトグラムおよびUVスペクトルを示す一連のグラフである。図4Aは、精製したAhRリガンドのHPLCクロマトグラムを示す。HPLC操作条件は、実施例のUV分光法に示される方法と同じであった。X軸は、保持時間(分)である。Y軸は、検出波長(nm)である。Z軸は、UV吸光度である。図4Bは、AhRリガンドのUVスペクトルを示す。データ取得手順の概略は実施例に示した。スペクトルは、UV吸光度が最大に到達する時間である約10分のHPLC保持時間で測定した。X軸は、波長(nm)である。Y軸は、UV吸光度である。
【図5】電子衝撃質量スペクトルおよびFT−IRスペクトルを示す一連のグラフである。図5Aは、AhRリガンドの高解像度電子衝撃質量スペクトルを示す。実施例の質量分析の項に説明するようにデータを取得し再プロットした。X軸は、質量と電荷の比m/zである。Y軸は、イオンの相対量。主要フラグメントの形成を示すためにスペクトルとともに概略構造を示している。提案されるフラグメント化経路をスペクトル下のマップに示している。図5Bは、Ah受容体リガンドのFT−IRスペクトルを示す。データの取得は実施例に説明するように行った。X軸は、波数(cm-1)で表現される赤外ビームの振動数である。1000〜3000cm-1の領域がこの図に示されている。Y軸は、吸光度である。明確な帰属が得られる信号については印を付けている。
【図6】プロトンNMRスペクトル、およびプロトン−炭素13の相関関係を示すグラフおよび表である。図6Aは、d−メタノール中のAhRリガンドの1H−NMRスペクトルを示す。スペクトルは、実施例のNMR分光法に記載のようにして取得した。「溶媒」と印を付けたピークはNMR溶媒に起因する。プロトンの数および位置に起因する信号は印通りである。図6Bは、HSQCスペクトルとHMBCスペクトルの両方からのAhRリガンドの1H−13Cの相関関係の表である。検出可能な関係があるプロトンおよび炭素13を同じ行に記載している。見出しが「HSQC」の列の下に示される炭素13は、対応するプロトン(同じ行)と直接連結する(1つの結合によって)炭素であり、見出しが「HMBC」の列の下の炭素は、2つまたは3つの結合によって対応するプロトンと連結している。
【図7】ITEの構造と、ITEおよびβNFの用量作用曲線を示す構造とグラフである。図7Aは、内因性Ah受容体リガンド2−(1'H−インドール−3'−カルボニル)−チアゾール−4−カルボン酸メチルエステルの構造を示す。AhRリガンドの化学構造には、プロトンおよび炭素13の化学シフト(識別番号と同じ)が記載されている。図7Bは、4時間のインキュベート後のITEおよびβNFの用量作用曲線を示す。X軸は、アゴニスト濃度である。Y軸は、相対光量単位(RLU)で示される、アゴニストに対する受容体遺伝子の応答である。エラーバーは、3つの培養ウェルの結果の標準偏差を表している。
Claims (15)
- 内因性Ah受容体リガンドの調製物。
- 前記調製物の純度が少なくとも90%である請求項1の調製物。
- 前記調製物の純度が少なくとも95%である請求項3の調製物。
- 前記リガンドが動物組織から単離されたものである請求項1の調製物。
- Ah受容体リガンド類似体の調製物であって、前記類似体が、式:
R1、R2、R3、R4、R5およびR8は、H、低級アルキル(1〜5個の炭素)、Br、F、Cl、O−アシル(1〜5C)、およびOR10(式中、R10=H、低級アルキル(1〜5C)である)からなる群より選択され、
R6およびR7は一緒にOを形成するか、あるいは、
R6=Hである場合には、R7はH、OH、Br、F、Cl、OR11(式中、R11はアルキル(1〜5C)である)となることができ、あるいは、
R7=Hである場合には、R6はH、OH、Br、F、Cl、OR11(式中、R11はアルキル(1〜5C)である)となることができ、
R9は、
R9は、
R9は、
R9は、
X、Y、Zは、C、N、O、およびSからなる群より選択される)
である調製物。 - 内因性Ah受容体リガンドの調製方法であって、
a)動物器官を入手してこれをホモジェナイズするステップであって、前記器官が前記Ah受容体リガンドを含有し、これによってホモジェネートが形成されるステップ、
b)ステップ(a)の前記ホモジェネートを溶媒で抽出し、これによって抽出物が形成されるステップ、
c)前記抽出物を加熱するステップ、および、
d)クロロホルムグラジエントによって前記リガンドを精製するステップ
を含む方法。 - 前記動物器官が、肺、肝臓、脳、骨、および、筋肉からなる群より選択される請求項8の方法。
- 前記抽出がメタノールを使用した抽出である請求項8の方法。
- 前記抽出物が窒素ガスでフラッシュされ、撹拌され、および、遠心分離される請求項8の方法。
- 前記抽出物が、H2SO4を加えて90℃〜110℃の間の温度で加熱される請求項8の方法。
- 前記抽出物がシリカバッチ精製によって精製される請求項8の方法。
- 前記リガンドがHPLCカラムでさらに精製される請求項8の方法。
- リガンド活性を測定するステップをさらに含む請求項8の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US26880901P | 2001-02-14 | 2001-02-14 | |
PCT/US2002/004137 WO2002064138A1 (en) | 2001-02-14 | 2002-02-12 | Preparations and use of an ah receptor ligand, 2-(1'h-indole-3'-carbonyl)-thiazole-4-carboxylic acid methyl ester |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004527482A true JP2004527482A (ja) | 2004-09-09 |
JP4509478B2 JP4509478B2 (ja) | 2010-07-21 |
Family
ID=23024571
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002563932A Expired - Lifetime JP4509478B2 (ja) | 2001-02-14 | 2002-02-12 | Ah受容体リガンド、2−(1’H−インドール−3’−カルボニル)−チアゾール−4−カルボン酸メチルエステルの調製物および使用 |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6916834B2 (ja) |
EP (1) | EP1365760B1 (ja) |
JP (1) | JP4509478B2 (ja) |
AT (1) | ATE431823T1 (ja) |
AU (1) | AU2002248422B2 (ja) |
BR (1) | BR0207689A (ja) |
CA (1) | CA2437579C (ja) |
DE (1) | DE60232403D1 (ja) |
ES (1) | ES2327615T3 (ja) |
IL (2) | IL157301A0 (ja) |
MX (1) | MXPA03007245A (ja) |
NZ (1) | NZ527430A (ja) |
WO (1) | WO2002064138A1 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013509411A (ja) * | 2009-11-02 | 2013-03-14 | ソン,ジャシェン | 癌の介入治療および根絶のためのite |
JP2020503385A (ja) * | 2016-12-26 | 2020-01-30 | 深セン創新惠世生物科技術有限公司Shenzhen Immunova Pharmaceutical Co., Ltd. | 芳香族炭化水素受容体調節剤 |
JP2021503498A (ja) * | 2017-11-20 | 2021-02-12 | アリアジェン,インコーポレイテッド | アリール炭化水素受容体(ahr)調節剤としてのインドール化合物 |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4445266B2 (ja) * | 2002-02-12 | 2010-04-07 | ウイスコンシン アラムナイ リサーチ フオンデーシヨン | Ah受容体のリガンドとしてのインドールチアゾール化合物の合成 |
AU2003267773A1 (en) * | 2003-10-14 | 2005-04-27 | Council Of Scientific And Industrial Research | (3r, 4r)-trans-3,4-diarylchroman derivatives with estrogenic activity |
EP1842541A1 (en) * | 2006-03-29 | 2007-10-10 | G.I.M.-Gesellschaft Für Innovative Medizin Gmbh Nfg Ohg | Plant components and extracts and uses thereof |
EP2082736A1 (fr) | 2008-01-23 | 2009-07-29 | Jean Hilaire Saurat | Composition pharmaceutique à usage topique |
US10632106B2 (en) | 2009-11-02 | 2020-04-28 | Ariagen, Inc. | Methods of cancer treatment with 2-(1′H-Indole-3′-carbonyl)-thiazole-4-carboxylic acid methyl ester |
CN102775399A (zh) * | 2011-12-27 | 2012-11-14 | 盛世泰科生物医药技术(苏州)有限公司 | arylhydrocarbon受体(AHR)的内源性配体,2-(1’H3’-吲哚羰基)噻唑-4-羧酸甲酯的合成新方法 |
EP3191481B1 (en) | 2014-09-12 | 2020-11-25 | Ariagen, Inc. | Efficient and scalable systhesis of 2-(1'h-indole-3'-carbonyl)-thiazole-4-carboxylic acid methyl ester and its structural analogs |
US20210347794A1 (en) | 2018-09-21 | 2021-11-11 | Ariagen, Inc. | Phosphate Derivatives of Indole Compounds and Their Use |
WO2020106695A1 (en) * | 2018-11-19 | 2020-05-28 | Ariagen, Inc. | Methods of treating cancer |
KR20210151951A (ko) | 2019-04-15 | 2021-12-14 | 아리아젠, 인크. | 키랄 인돌 화합물 및 그 용도 |
US11136318B2 (en) | 2019-06-21 | 2021-10-05 | Noramco, Llc | Processes for the preparation of aryl hydrocarbon receptor ligands |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3285931A (en) * | 1964-12-21 | 1966-11-15 | Union Carbide Corp | Preparation of substituted pyrrole derivatives |
JPH08502037A (ja) * | 1992-07-20 | 1996-03-05 | ザ・ウエルカム・ファウンデーション・リミテッド | 4環性化合物、これらを調整するための方法及び中間体並びに抗腫瘍剤としてのこれらの使用 |
JP2005525340A (ja) * | 2002-02-12 | 2005-08-25 | ウイスコンシン アラムナイ リサーチ フオンデーシヨン | Ah受容体のリガンドとしてのインドールチアゾール化合物の合成 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5336685A (en) * | 1993-04-12 | 1994-08-09 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Use of flavonoids to treat multidrug resistant cancer cells |
US6323228B1 (en) * | 2000-09-15 | 2001-11-27 | Abbott Laboratories | 3-substituted indole angiogenesis inhibitors |
-
2002
- 2002-02-12 MX MXPA03007245A patent/MXPA03007245A/es active IP Right Grant
- 2002-02-12 DE DE60232403T patent/DE60232403D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-12 JP JP2002563932A patent/JP4509478B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-12 WO PCT/US2002/004137 patent/WO2002064138A1/en active IP Right Grant
- 2002-02-12 IL IL15730102A patent/IL157301A0/xx unknown
- 2002-02-12 US US10/074,102 patent/US6916834B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-12 BR BR0207689-6A patent/BR0207689A/pt not_active Application Discontinuation
- 2002-02-12 ES ES02717416T patent/ES2327615T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-12 NZ NZ527430A patent/NZ527430A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-02-12 EP EP02717416A patent/EP1365760B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-12 AU AU2002248422A patent/AU2002248422B2/en not_active Expired
- 2002-02-12 CA CA2437579A patent/CA2437579C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-12 AT AT02717416T patent/ATE431823T1/de not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-08-07 IL IL157301A patent/IL157301A/en active IP Right Grant
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3285931A (en) * | 1964-12-21 | 1966-11-15 | Union Carbide Corp | Preparation of substituted pyrrole derivatives |
JPH08502037A (ja) * | 1992-07-20 | 1996-03-05 | ザ・ウエルカム・ファウンデーション・リミテッド | 4環性化合物、これらを調整するための方法及び中間体並びに抗腫瘍剤としてのこれらの使用 |
JP2005525340A (ja) * | 2002-02-12 | 2005-08-25 | ウイスコンシン アラムナイ リサーチ フオンデーシヨン | Ah受容体のリガンドとしてのインドールチアゾール化合物の合成 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
JPN6008057974, DHARMASENA P. ET AL, "Antitumour Heterocycles. Part 12. The Synthesis of New Hydroxypyrrolocarbazoles and Hydroxypyridocar", J. Chem. Res. (S), 1996, No.1, 12−13 * |
JPN6008057977, CHUNCHATPRASERT L. ET AL, "A New synthetic Route to Pyrrolo[3,2−b]carbazoles, 1H−Benzofuro[3,2−f]indoles and 1H−[1]Benzothieno[", J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1992, No.14, 1779−1783 * |
JPN6008057978, CHUNCHATPRASERT L. ET AL, "Further Observations on and Novel products from Acid−catalyzed Indole−Pyrrole Condensations: Formati", J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1994, No.13, 1765−1772 * |
JPN7008008220, PHILLIPS A J ET AL, "SYNTHESIS OF FUNCTIONALIZED OXAZOLINES AND OXAZOLES WITH DAST AND DEOXO−FLUOR", Org. Lett., 2000, Vol.2, No.8, 1165−1168 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013509411A (ja) * | 2009-11-02 | 2013-03-14 | ソン,ジャシェン | 癌の介入治療および根絶のためのite |
JP2020503385A (ja) * | 2016-12-26 | 2020-01-30 | 深セン創新惠世生物科技術有限公司Shenzhen Immunova Pharmaceutical Co., Ltd. | 芳香族炭化水素受容体調節剤 |
JP2022024049A (ja) * | 2016-12-26 | 2022-02-08 | アリアジェン,インコーポレイテッド | 芳香族炭化水素受容体調節剤 |
JP2021503498A (ja) * | 2017-11-20 | 2021-02-12 | アリアジェン,インコーポレイテッド | アリール炭化水素受容体(ahr)調節剤としてのインドール化合物 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
MXPA03007245A (es) | 2004-06-30 |
WO2002064138A1 (en) | 2002-08-22 |
BR0207689A (pt) | 2004-03-09 |
IL157301A0 (en) | 2004-02-19 |
AU2002248422B2 (en) | 2006-07-06 |
IL157301A (en) | 2012-03-29 |
JP4509478B2 (ja) | 2010-07-21 |
CA2437579A1 (en) | 2002-08-22 |
US20020183524A1 (en) | 2002-12-05 |
US6916834B2 (en) | 2005-07-12 |
EP1365760A1 (en) | 2003-12-03 |
NZ527430A (en) | 2005-03-24 |
DE60232403D1 (de) | 2009-07-02 |
EP1365760B1 (en) | 2009-05-20 |
ES2327615T3 (es) | 2009-11-02 |
EP1365760A4 (en) | 2004-07-14 |
ATE431823T1 (de) | 2009-06-15 |
CA2437579C (en) | 2012-05-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4509478B2 (ja) | Ah受容体リガンド、2−(1’H−インドール−3’−カルボニル)−チアゾール−4−カルボン酸メチルエステルの調製物および使用 | |
Arun et al. | Novel spirooxindole–pyrrolidine compounds: Synthesis, anticancer and molecular docking studies | |
Nagarsenkar et al. | Synthesis and apoptosis inducing studies of triazole linked 3-benzylidene isatin derivatives | |
AU2002248422A1 (en) | Preparations and use of an Ah receptor ligand, 2-(1' H-indole-3'-carbonyl)-thiazole-4-carboxylic acid methyl ester | |
Parekh et al. | Investigation of anticancer potencies of newly generated Schiff base imidazolylphenylheterocyclic-2-ylmethylenethiazole-2-amines | |
EA033956B1 (ru) | Кристаллическая форма а 4-[7-(6-циано-5-трифторметилпиридин-3-ил)-8-оксо-6-тиоксо-5,7- диазаспиро[3.4]окт-5-ил]-2-фтор-n-метилбензамида для лечения заболевания или состояния, связанного с активностью андрогенных рецепторов, включая рак простаты | |
Angelova et al. | New indole and indazole derivatives as potential antimycobacterial agents | |
Thakur et al. | Novel 3, 5-bis (arylidiene)-4-piperidone based monocarbonyl analogs of curcumin: anticancer activity evaluation and mode of action study | |
Kartsev et al. | Appendix A. dithioloquinolinethiones as new potential multitargeted antibacterial and antifungal agents: Synthesis, biological evaluation and molecular docking studies | |
Zhao et al. | Discover 4β-NH-(6-aminoindole)-4-desoxy-podophyllotoxin with nanomolar-potency antitumor activity by improving the tubulin binding affinity on the basis of a potential binding site nearby colchicine domain | |
WO2003068742A1 (en) | Synthesis of indole thiazole compounds as ligands for the ah receptor | |
Bouchikhi et al. | Synthesis and antiproliferative activities of isoindigo and azaisoindigo derivatives | |
Assis et al. | Design and synthesis of triazole-phthalimide hybrids with anti-inflammatory activity | |
HUT70158A (en) | Process for producing 2-amido-4-phenyl-thiazol derivatives, and pharmaceutical compositions containing them | |
Lin et al. | Cytotoxic and antibacterial polyketide-indole hybrids synthesized from indole-3-carbinol by Daldinia eschscholzii | |
Zhang et al. | Synthesis, structure and biological activities of novel 2‐(trifluoromethyl)‐6‐arylimidazo [2, 1‐b][1, 3, 4]‐thiadiazole (bis‐) Mannich base derivatives containing substitutedpiperazine moiety | |
Höfle et al. | Epothilone AD and their thiazole-modified analogs as novel anticancer agents | |
CN106317057B (zh) | 具有咪唑并吡嗪类衍生物,其制备及其在医药上的应用 | |
de Vasconcelos et al. | 2, 4-Thiazolidinedione as Precursor to the Synthesis of Compounds with Anti-glioma Activities in C6 and GL261 Cells | |
Jaber et al. | Synthesis, structure, and in vitro pharmacological evaluation of some new pyrimidine-2-sulfonamide derivatives and their molecular docking studies on human estrogen receptor alpha and CDK2/Cyclin proteins | |
Srinivas et al. | Development of novel glitazones as antidiabetic agents: molecular design, synthesis, evaluation of glucose uptake activity and SAR studies | |
Hemamalini et al. | Studies on the synthesis of a sugar triazole based ligand for protein and DNA binding | |
SINGAGARI et al. | Novel pyrazole substituted oxazole derivatives: Design, in-silico studies, synthesis & biological activities | |
KR19990082680A (ko) | 5-ht1a 수용체 리간드로서의 헤테로사이클-에르골린유도체 | |
Kommu et al. | Novel Synthesis of Isatin-Thiazole Pharmacophores and their Cytotoxicity Evaluation |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050202 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20050203 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20081209 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20090306 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090306 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090317 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090408 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20090410 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100302 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100305 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100406 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100428 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130514 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Ref document number: 4509478 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130514 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |