JP4509478B2 - Ａｈ受容体リガンド、２−（１’Ｈ−インドール−３’−カルボニル）−チアゾール−４−カルボン酸メチルエステルの調製物および使用 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照

本出願は、２００１年２月１４日に提出された米国仮出願第60/268,809号（この記載内容を本明細書に援用する）に基づく優先権を主張するものである。

連邦政府により援助を受けた研究または開発に関する記述

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アリール炭化水素受容体。
アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）は、そのリガンドと結合することによって広いスペクトル範囲の生物学的プロセスを媒介するリガンド誘導性転写因子である。チトクロムＰ４５０ファミリーの酵素を誘導する以外に、この受容体は細胞増殖、腫瘍促進、免疫抑制、ビタミンＡ減少、ならびに発育異常および生殖異常と関与していることが分かっている（Fletcher, et al., 2001；Safe，2001；Gu, et al., 2000；Poellinger, 2000；SchmidtおよびBradfield, 1996；Whitlock, et al., 1997）。このリガンドと結合した受容体は、細胞周期の停止、アポトーシス、脂肪分化、および抗エストロゲン作用も引き起こす（Bonnesen, et al., 2001；Elferink, et al., 2001；Shimba, et al., 2001，1998；Safe，2001；McDougal, et al., 2001，2000；Elizondo, et al., 2000；Puga, et al., 2000，Alexander, et al., 1998）。受容体の存在は１９７０年代に提案され立証された（Poland, et al., 1976）。この受容体のコード配列は１９９０年代にクローン化され、このＡｈＲは新しい塩基性ヘリックス−ループ−ヘリクス/Pas-Arnt-Sim(bHLH/PAS)転写因子スーパーファミリーの一員であることが分かった（Burbach, et al., 1992）。

転写因子のｂＨＬＨ／ＰＡＳスーパーファミリー。
ｂＨＬＨ／ＰＡＳスーパーファミリーには、ショウジョウバエ（Drosophila） Per, Arnt（Ａｈ受容体核トランスロケーター、ＡｈＲなどと二量体（ダイマー）を形成する）、ＳＩＭ１、ＳＩＭ２、ＴＲＨ、ＡＲＮＴ−２、低酸素誘導性因子−１(ＨｌＦ−１α）、ＳＲＣ−１、ＴＩＦ２、ＲＡＣ３、ＭＯＰ２−５（Gu, et al., 2000；Hogenesch, et al., 1997；Wilk, et al., 1996）、および内皮ＰＡＳドメインタンパク質（ＥＰＡＳ−１）（Tian, et al., 1997）が含まれる。これらのｂＨＬＨタンパク質は、５０個のアミノ酸の２つの縮合直列反復を含む３００個のアミノ酸のＰＡＳドメインを有する（Burbach, et al., 1992；Dolwick, et al., 1993）。その塩基性領域はＤＮＡの結合に重要であり、ＨＬＨドメインおよびＰＡＳドメインは二量体化に関与し、ＡｈＲの場合にはリガンド結合に関与する（SwansonおよびBradfield, 1993）。ＡｈＲおよびＡＲＮＴの転写促進ドメインはカルボキシル末端の位置に対応している（Jain, et al., 1994）。このスーパーファミリーのメンバーは主要な発育調節遺伝子であり、ＡｈＲおよびＡＲＮＴと同様の役割を果たすと考えられているため関心が持たれている。ＡｈＲと二量体を形成する以外に、ＡＲＮＴはＨＩＦ−１α、ＰＥＲ、ＳＩＭ、ＭＯＰ２（Hogenesch, et al., 1997）、およびＥＰＡＳ−１（Tian, et al., 1997）とも異質二量体を形成し、ＡＲＮＴ関連タンパク質はＴＲＨと異質二量体（ヘテロダイマー）を形成すると考えられている（Wilk, et al., 1996）。ＡＲＮＴのこの多様な反応性はＡＲＮＴのＡｈＲ依存的な役割を示しており、ＡｈＲと他のｂＨＬＨ／ＰＡＳ信号経路との間の混乱の可能性を示唆している。

低酸素に対する恒常性応答：ＨＩＦ−１ａ／ＡＲＮＴ媒介性遺伝子発現の役割。
脊椎動物は生体の代謝過程に分子状酸素が必要である。低酸素によって誘発される恒常性応答としては、赤血球生成、血管形成、および解糖が挙げられる。これらの適応性応答は、酸素伝達を増加させるか、あるいは低酸素組織が酸素を必要としない別の代謝経路を活性化させる役割を果たす。低酸素に応答して、ＨＩＦ−１αは核に移動して、核内でＡＲＮＴと異質二量体を形成する（Gradin, et al., 1996；SchmidtおよびBradfield．1996）。ＨＩＦ−１α／ＡＲＮＴ異質二量体が低酸素応答要素と結合すると、組織の酸素化の維持に関与する遺伝子の転写が増加する。この低酸素によって誘発される遺伝子産物としては、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、および解糖系酵素が挙げられる（MaltepeおよびSimon，1998）。

ＡｈＲ/ＡＲＮＴ信号経路の作用形態。
細胞質形態のＡｈＲは、２分子のヒートショックタンパク質(hsp90)と一部の他の細胞要素と関連している（Poellinge，2000；Whitlock，1990）。リガンドと結合した後、hsp90と他の要素は分離して、ＡｈＲは活性化する。次に、活性化したＡｈＲは核に移動して、パートナーであるＡＲＮＴと二量体を形成する（Probst, et al., 1993）。ＡｈＲ/ＡＲＮＴ異質二量体は、ＡｈＲにより制御され遺伝子発現を変化させる遺伝子のプロモーターに見いだされている、いわゆる生体異物応答要素（ＸＲＥ）を認識しこれと結合する（Whitlock，1990）。別の可能性のある機構としては、ＡＲＮＴとの二量体化に関するＡｈＲと、ＨＩＦ−１αおよび／またはＥＰＡＳ−１のいずれかとの間での競合が挙げられる。標的遺伝子の発現を制御するためにはＡｈＲ、ＨＩＦ−１α、およびＥＰＡＳ−１はＡＲＮＴとの二量体化が必要であるので、ＡｈＲが活性化することによって、他の信号経路の比率が制限される程度まで遊離のＡＲＮＴの有効率が低下しうる。ＡＲＮＴの有効率が減少すると、ＨＩＦ−１α信号伝達の阻害などによって、生体の低酸素調節遺伝子の発現および血管形成抑制が低下しうる（Gradin, et al., 1996；SchmidtおよびBradfield，1996）。

公知のＡｈＲリガンド。
ＡｈＲの人工のリガンドとして最初に発見されたものの中には、３−メチルコラントレンおよびベンゾ［α］ピレンなどの多環式芳香族炭化水素として知られる化学物質がある。これよりはるかに強力でより親和性の高いリガンドである２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（ＴＣＤＤ）も発見された（PolandおよびGlover，1973）。別の構造のグループの化合物であるハロゲン化芳香族炭化水素も受容体リガンドとして確認された。上記のグループとは異なる構造的特徴を有する化合物も、ＡｈＲと結合親和性を有することが発見されている。このグループはビリルビン（Phelan, et al., 1998；SinalおよびBend，1997）、リポキシンＡ（４）（Schaldach, et al., 1999）、ブレベトキシン−６（Washburn, et al., 1997）、ジアミノトルエン（Cheung, et al., 1996）、およびＹＨ４３９（チアゾニウム化合物の一種）（Lee, et al., 1996）に代表される。大部分の人工ＡｈＲリガンドの中では、ＴＣＤＤはＡｈＲに対する最も強力な物質の１つであり、ＡｈＲ作用およびダイオキシン毒性の機構の研究に使用されるプロトタイプ化合物である。用語「ダイオキシン類」は、ＴＣＤＤと同じ機構で同じ生物学的応答を引き起こすＰＣＤＤ類（ポリ塩化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン類）、ＰＣＤＦ類（ポリ塩化ジベンゾフラン類）、またはＰＣＢ類（ポリ塩化ビフェニル類）の任意のものを表すために使用されている。

インドール部分を有するＡｈＲリガンド。
インドール部分を有する他の公知のＡｈＲリガンドも特に注目されている。このグループは、トリプタミン、インドール酢酸（Heathpagliuso, et al., 1998）、インドール−３−カルビノールおよびその誘導体（Stephensen, et al., 2000；Chen, et al., 1996；Vasiliou, et al., 1995；Liu, et al., 1994；Jellinck, et al., 1993）、ならびにインドロ［３，２−ｂ］カルバゾール（ＩＣＺ）Chen, et al.,1995；Kleman, et al.1994）からなる。ＵＶ酸化によってトリプトファンから誘導される６−ホルミルインドロ［３，２−ｂ］カルバゾールは、ＩＣＺと非常に関連性が高く、ＴＣＤＤの受容体に対する親和性よりも高い親和性を有する（Rannug, et al., 1995,1987）。インドールから誘導される一部のＡｈＲリガンドは、受容体に対する結合性、低毒性、抗エストロゲン性、および抗腫瘍形成性という興味深い性質を示した。実際、腫瘍形成の危険性の高い患者に対する抗発癌および抗腫瘍形成治療におけるインドール−３−カルビノールの臨床研究が開始されている（PreobrazhenskayaおよびKorolev，2000）。

内因性ＡｈＲリガンドの同定およびＡｈ受容体系の生理学的機能については解明されていない。
オカモトら（Okamoto et al., (1993)）は、成体雄ラットを高酸素（酸素９５％）にさらすことによって、肺でＣＹＰ１Ａ１が誘導され、肝臓でＣＹＰ１Ａ１および１Ａ２が誘導されることを観察した。ＣＹＰ１Ａ１／１Ａ２の誘導は、ＡｈＲのそのリガンドとの結合と通常は関連がある。高酸素によるＣＹＰ１Ａ１／１Ａ２の誘導を説明するための仮説の１つは、ＡｈＲの内因性リガンドが高酸素によって生成し、これがＣＹＰ１Ａ１／１Ａ２遺伝子の転写を活性化するというものである（Okamoto, et al., 1993）。最近、ＡｈＲと結合する２種類のヒト尿生成物が単離された（Adachi, et al., 2001）。同定された化合物はインジゴ（織物染料として一般的に使用される）とインジルビン（インジゴの異性体）であるため、これらの生成物が内因性リガンドであるかどうかは分かっていない。これらの化合物は尿から単離されたので、これらは尿排出生成物であるのかどうかという疑問に対する答えも見つかっていない。同様に、ビリルビン関連化合物（Phelan, et al., 1998；SinalおよびBend, 1997）およびリポキシンＡ（４）（Schaldach, et al., 1999）は確かに内因性であるが、これらが本当にＡｈＲに対するリガンドであるかどうかは分かっていない。実際、これらの化合物のＡｈＲに対する応答および親和性は非常に低い。

ＡｈＲ欠如マウスの作製によって、この時点では結論は出ていないが、肝臓、心臓、卵巣、および免疫系におけるこの受容体の可能性のある生理学的機能が示されている（Benedict, et al., 2000；Poellinger，2000；Mimura, et al., 1997；Schmidt, et al., 1996；Fernandez-Salguero, et al., 1995）。これらの重要な発見から、動物の生理機能でＡｈＲ信号経路が機能する必要があることが分かる。動物組織における内因性ＡｈＲリガンドは、このＡｈＲ信号機能の実施に関与していると推定される。

内因性ＡｈＲリガンドの同定の重要性。
この受容体系に対する人工ＡｈＲリガンドに関する研究によって、この系に関する我々の理解は大きく前進した。しかし、進化において、製造された化学薬剤と反応するためにＡｈＲが出現したのではないことは明らかである。体内で通常遭遇する組織濃度で非毒性であり、代謝によって迅速に除去され、制御能力において一時的にのみＡｈＲを活性化するために使用される、ＡｈＲに対する内因性リガンドであるべきだと考えられる。また、リガンド−受容体の媒介する信号過程が異なる結果となる可能性があり、これがリガンドの性質に依存するという証拠も示されている。リガンド−受容体媒介シグナルトランスダクション系の結果を決める決定的な要因は、リガンドが結合した受容体の最終的な三次元配座であり、この配座が、リガンドが結合した受容体が、信号を変換するための多数の他の因子とどのように相互作用するかを決定すると考えられている。受容体のアミノ酸配列が分かれば、リガンドが結合した受容体の最終三次元構造はリガンドの構造のみに依存し、これによって最終的な信号系の生物学的結果が決定される。Ａｈ受容体の生理学的機能および潜在的な治療効果を完全に理解するため、この系に関して、内因性ＡｈＲリガンドの同定が絶対的に必要となりうる。

発明の要約

本発明者らは、ここにおいて、新規内因性Ａｈ受容体リガンド、２−（１'Ｈ−インドール−３'−カルボニル）−チアゾール−４−カルボン酸メチルエステルの抽出、精製、同定、および、用途を開示する。

実施態様の１つでは、本発明は、動物組織からの単離または合成のいずれかで得られた内因性Ａｈ受容体リガンドの調製物に関する。好ましくは、本発明の調製物は、２４時間煮沸に対して安定であり、８０％メタノール：２０％水に対して溶解性であり、２規定の酸中で終夜安定であり、塩基中では不安定である。本発明の調製物は、好ましくは少なくとも６０％の純度であり、より好ましくは９０％の純度であり、最も好ましくは９５％の純度であり、実施例に開示されるように紫外スペクトル、赤外スペクトル、質量スペクトル、および核磁気共鳴スペクトルで特徴付けられたものである。

本発明の好ましい実施態様では、リガンドの構造は、

に示され、図７Ａに開示される構造である。

本発明は、動物の体重を減少させる方法、動物の免疫系を調節する方法、動物のエストロゲン作用を阻害する方法、動物のテストステロン産生を減少させる方法、肺疾患の治療方法、あるいは血管形成または浸潤性癌の制御方法に関し、これらすべては内因性Ａｈ受容体リガンド薬剤またはその類似体の有効量を使用して動物を治療するステップを含む。

好ましい実施態様では、類似体構造は：

（式中、
Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵およびＲ⁸＝Ｈ、低級アルキル（１〜５個の炭素）、Ｂｒ、Ｆ、Ｃｌ、Ｏ−アシル（１〜５Ｃ）、またはＯＲ¹⁰（式中、Ｒ¹⁰＝Ｈ、低級アルキル（１〜５Ｃ）である）であり、
Ｒ⁶およびＲ⁷は一緒に＝Ｏを形成するか、あるいは、
Ｒ⁶＝Ｈである場合には、Ｒ⁷はＨ、ＯＨ、Ｂｒ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＲ¹¹（式中、Ｒ¹¹はアルキル（１〜５Ｃ）である）となることができ、および
Ｒ⁷＝Ｈである場合には、Ｒ⁶はＨ、ＯＨ、Ｂｒ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＲ¹¹（式中、Ｒ¹¹はアルキル（１〜５Ｃ）である）となることができ、
Ｒ⁹＝

（式中、Ｒ¹²＝Ｈ、アルキル（１〜５Ｃ）、アリール、フルオロメチル、ジフルオロメチル、またはトリフルオロメチル）、あるいは、
Ｒ⁹は、

（式中、Ｒ¹³＝Ｈ、アルキル（１〜５Ｃ）、アリール、フルオロメチル、ジフルオロメチル、またはトリフルオロメチル）となることができるか、
Ｒ⁹は、

（式中、Ｒ¹⁴＝Ｈ、アルキル（１〜５Ｃ）、フルオロメチル、ジフルオロメチル、またはトリフルオロメチル）となることができるか、あるいは、
Ｒ⁹は、

（式中、Ｒ¹⁵＝Ｈ、アルキル（１〜５Ｃ）、フルオロメチル、ジフルオロメチル、またはトリフルオロメチル）となることができ、および
Ｘ、Ｙ、Ｚは、Ｃ、Ｎ、Ｏ、またはＳのいずれかとなることができる）
である。

本発明の目的の１つは、動物組織由来の内因性Ａｈ受容体リガンドの調製物を提供することである。

本発明の別の目的は、内因性Ａｈ受容体リガンドの合成調製物を提供することである。

本発明の目的の１つは、Ａｈ受容体リガンドの類似体の調製物を提供することである。

リガンド調製物が前述の生化学的および物理学的性質を有することが本発明の利点である。

その他の利点、特徴、および目的は、明細書、特許請求の範囲、および図面を考察することによって当業者に明らかになるであろう。

発明の説明

実施態様の１つでは、本発明は、内因性Ａｈ受容体リガンドの調製物、該リガンドの類似体の調製物、およびこれらの調製物を使用する治療方法に関する。

１．ＡｈＲリガンド薬剤の生化学的特徴付け
以下の実施例は、ラットおよびブタの肺から得られるＡｈ受容体リガンドの薬剤について説明する。好ましくは、ＡｈＲリガンドは式：

および図７Ａに示される。

本発明者らは、肝臓、脳、骨、および筋肉などの他の動物器官からも首尾よく調製物が得られることを想定している。以下の実施例ではラットとブタの両方の肺からの調製が成功したことを開示している。本発明の好ましい調製物では、ＨＰＬＣ分析に基づく純度は少なくとも６０％であり、より好ましくは９０％であり、最も好ましくは少なくとも９５％である。

以下の実施例では、リガンド抽出および精製の好ましい方法を開示する。簡潔に述べると、動物器官を解剖し、ドライアイスで凍結させる。組織を解凍し、ＰＢＳ（緩衝食塩水：０．１５４ＭのＮａＣｌ、約１０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）中でホモジェナイズして、メタノールで抽出する。この混合物に窒素ガスでフラッシュし、撹拌し、遠心分離を行う。抽出物は、２ＮのＨ₂ＳＯ₄を加えて１００℃で加熱することによって、クロロホルム溶解活性になる。活性物質はシリカゲルバッチ精製で精製された後、大規模重力流出シリカカラムでメタノールおよびクロロホルムグラジエント溶出により精製され、分取用シリカカラムとメタノール／クロロホルム溶媒溶出液を使用して高速液体クロマトグラフィーで精製される。活性物質はＨＰＬＣ シリカカラムでイソプロパノール／ヘキサングラジエント溶出によりさらに精製され、次にメタノールおよび水で溶出される逆相Ｃ１８ＨＰＬＣカラムに供給される。この材料は、アセトニトリル／水を使用するＣ１８カラムでさらに精製され、続いてイソプロパノール／ヘキサンを使用するシアノカラムでさらに精製される。最終段階では、シアノカラムを使用しメタノール／水で溶出させるＨＰＬＣが実施される。

リガンド活性は、後述の活性分析によって測定されることが最も好ましい。簡潔に述べると、リガンド抽出物をＡｈ受容体含有リガンドレポーター細胞に加える。次に、これらの細胞を４時間インキュベートし、細胞を溶解させて、生成したルシフェラーゼを放出させる。典型的には、この酵素はプロメガ（Promega）（米国ウィスコンシン州マディソン（Madison））より販売されるキットに従って測定される。ルシフェラーゼ活性は、照度計によって記録される発光によって測定される。基質溶液をウェルに注入した後に照度計の読み取りが行われる。

後述の好ましいリガンド調製物は、その溶解性によって特徴づけることができる。リガンドは８０％メタノール／２０％水によって組織から抽出可能である。煮沸および酸による処理の後では、リガンドはクロロホルムで抽出可能である。

本発明のリガンド調製物は塩基中で不安定であるが、２規定までの酸中で少なくとも２４時間安定である。この調製物は、３７℃での終夜加熱（１６時間）で安定であり、１００℃で２４時間安定である。

本発明のリガンド調製物は、紫外スペクトル、赤外スペクトル、質量スペクトル、核磁気共鳴スペクトルなどの実施例に記載されるその物理的性質によってさらに特徴づけることができる。

当業者であれば開示される手順によってＡｈＲリガンドを調製可能であるか、あるいは当業者には明らかな修正および最適化を行うことができる。

本発明者らは、当業者であれば本明細書で同定されるＡｈＲリガンドの類似体を調製することができ、治療用途に有用なこれらの類似体のスクリーニングを行うことができることを想定している。「類似体」とは、その化合物が天然ＡｈＲリガンドど同様の構造を有し、有用な治療効果が得られることを意味する。初期スクリーニングは、本明細書に記載のレポーター遺伝子アッセイによって実施される。さらなるスクリーニングは、対象となる疾患にしたがって計画される。

特に好ましい類似体は式：

（式中、
Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵およびＲ⁸＝Ｈ、低級アルキル（１〜５個の炭素）、Ｂｒ、Ｆ、Ｃｌ、Ｏ−アシル（１〜５Ｃ）、またはＯＲ¹⁰（式中、Ｒ¹⁰＝Ｈ、低級アルキル（１〜５Ｃ）である）であり、
Ｒ⁶およびＲ⁷は一緒に＝Ｏを形成するか、あるいは、
Ｒ⁶＝Ｈである場合には、Ｒ⁷はＨ、ＯＨ、Ｂｒ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＲ¹¹（式中、Ｒ¹¹はアルキル（１〜５Ｃ）である）となることができ、
Ｒ⁷＝Ｈである場合には、Ｒ⁶はＨ、ＯＨ、Ｂｒ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＲ¹¹（式中、Ｒ¹¹はアルキル（１〜５Ｃ）である）となることができ、
Ｒ⁹＝

（式中、Ｒ¹²＝Ｈ、アルキル（１〜５Ｃ）、アリール、フルオロメチル、ジフルオロメチル、またはトリフルオロメチル）、あるいは、
Ｒ⁹は、

（式中、Ｒ¹³＝Ｈ、アルキル（１〜５Ｃ）、アリール、フルオロメチル、ジフルオロメチル、またはトリフルオロメチル）となることができるか、あるいは、
Ｒ⁹は、

（式中、Ｒ¹⁴＝Ｈ、アルキル（１〜５Ｃ）、フルオロメチル、ジフルオロメチル、またはトリフルオロメチル）となることができるか、あるいは、
Ｒ⁹は、

（式中、Ｒ¹⁵＝Ｈ、アルキル（１〜５Ｃ）、フルオロメチル、ジフルオロメチル、またはトリフルオロメチル）となることができ、および
Ｘ、Ｙ、Ｚは、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓのいずれかとなることができる）
に対応する。

特に有用な類似体は、以下のものである。

さらに、上記で同定されたリガンドおよびリガンド類似体を含む治療化合物を調製することができる。好ましくは、これらの組成物の医薬上許容される担体が提供される。

本発明のリガンドおよびその類似体は、経口でも非経口でも投与が可能であるが、ＡｈＲリガンド自体の場合には非経口経路が好ましい。おそらく、これらはカプセル、ロゼンジ、錠剤、または好適な媒体中での静脈内投与で提供することができる。坐剤または経鼻送達を使用することもできる。

２．ＡｈＲリガンドの使用
動物組織中の内因性ＡｈＲリガンドの同定およびそれらの正常な生理学的機能の決定によって、ＡｈＲの媒介する生物学的応答の機構に関する重要な新情報が得られる。このような内因性リガンドは、高い組織特異的な方法で細胞増殖および分化を調節し、一部の公知のＡｈＲリガンドによって生じる他のある種の応答を示すと思われる。最も重要なことには、本発明者らは、内因性ＡｈＲリガンドの種々の構造類似体の合成および試験によって、広範な治療用途の新しい種類の薬剤が得られるものと考える。

組織および種に依存するが、ダイオキシンにさらされることにより、一般に、過形成、形成不全、化生、および異形成からなる反応が起こる。これらの効果は、増殖因子信号経路、ステロイドホルモン信号経路、ならびにこれらの因子およびホルモンの合成および分解と関与する酵素の相互作用によって媒介されるホメオスタシス過程の変化によって調節されると考えられる。細胞、組織、器官、および生物体のレベルでのホメオスタシスに関与する多くの異なった種のホルモンが存在する。ステロイドホルモンは成長発育の制御、性分化、生殖、および細胞代謝と関与する。インスリンなどの他のホルモンは、炭水化物および脂肪代謝を制御する。実験動物をダイオキシンに曝露することによって、エストロゲン受容体、グルココルチコイド受容体、およびインスリン受容体の濃度が低下することが報告されている。本発明者らは、内因性ＡｈＲリガンドおよびその類似体が、エストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、ビタミンＡ、および甲状腺ホルモン、ならびにある組織の黄体形成ホルモンのような下垂体ホルモンなどのいくつかのホルモンの濃度を変化させると考えている。

ヒトがＡｈＲアゴニストに対して応答性であることを示す多数の証拠が存在する。機能性ＡｈＲは、リンパ球、肝臓、肺、および胎盤などの多くのヒト組織中で発見されている。ヒトＣＹＰ１Ａ１はヒトの肺および胎盤で、ダイオキシン類によって誘導可能である。ダイオキシン様化合物に誤ってさらされたヒト女性の胎盤でＥＧＦ受容体の活性が低下し、これと同じ応答が齧歯類の組織についても報告されている。血清テストステロン量の減少、および血中黄体形成ホルモン量の増加が、ダイオキシン類にさらされたヒトおよびラットの両方で確認されている。ダイオキシン類にさらされた労働者、ならびに枯葉剤のオレンジ剤（Ａｇｅｎｔ Ｏｒｅｎｇｅ）中に存在するダイオキシンにさらされたベトナム退役軍人の糖尿病が報告されている。まとめると、これらの発見から、人工ＡｈＲリガンドであるダイオキシン類はヒトのホルモン状態を変化させることができ、実験動物と同様の効果が見られることが分かる。したがって、ヒトは、ダイオキシン様ＡｈＲアゴニストに対して応答性の種であり、本明細書に開示されるＡｈＲリガンドおよびその類似体に対しても応答すると推測される。本発明の可能性のある治療用途は以下に示す。

体重の減少。
ダイオキシン類は体重を減少させ、脂肪組織を減少させる。この効果の正確な機構は不明であるが、おそらく視床下部レベルで体重を制御する「設定点」を減少させることを示唆する根拠が見つかっている。ダイオキシンは、ダイオキシン投与量によって決定された低レベルの制御体重まで食料摂取量を減少させることによる「体重設定点」を低下させると考えられる。本発明者らは、開示されるＡｈＲリガンドおよびその類似体は、類似の生物活性を有し、ヒトの体重減少に関する治療に有用であると考えている。この可能性を支持する現象として、偶発的にダイオキシン類にさらされたヒトは食欲が抑制される。

免疫抑制または免疫促進。
ダイオキシン類の免疫毒性効果についてはここ数年間研究されてきているが、ダイオキシン様免疫毒性症候群の説明は困難である。マウスではダイオキシン類は、体液性および細胞媒介性の免疫を抑制する。マウスに発生する免疫抑制によって、種々の感染性因子に対する感受性が増加する。ラットではプラーク形成細胞アッセイでヒツジ赤血球への免疫応答をダイオキシンが向上させ、マウスではダイオキシンによって反対の作用が得られ、応答を抑制する。ヒトでは、ダイオキシンが免疫抑制または免疫促進のいずれを引き起こすかは未知であるが、動物の研究に基づくと、ダイオキシン類およびおそらくは本明細書に開示されるＡｈＲリガンドは免疫機能を変調することは明らかである。内因性ＡｈＲリガンドまたはその類似体によって免疫抑制が生じる場合、これらは移植片拒絶の防止および自己免疫疾患の治療に有用である。一方、これらによって免疫促進が起こる場合、これらの物質を後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）などの免疫不全および慢性感染症の治療に使用可能となる。

抗エストロゲン作用。
治療が行われる状況に依存するが、ダイオキシンは、数種類の実験動物種および培養されたＭＣＦ細胞におけるエストロゲンの作用を阻害すると思われる。ダイオキシンにさらされた実験動物では、繁殖能力、産仔数、および子宮重量が減少する。さらに、無排卵および発情周期の抑制によって示されるように卵巣機能が変化する。ラットおよびマウスでは、体重を変化させない用量でダイオキシン類の抗エストロゲン作用が起こる。内因性ＡｈＲリガンドおよびその類似体の潜在的な抗エストロゲン作用は、ヒトの乳癌および骨粗鬆症の治療に有用である。

抗アンドロゲン作用。
成体雄ラットでは、ダイオキシンは、精巣のステロイド生産の律速段階を阻害することによってテストステロン生産を減少させる。これによって、テストステロンおよびジヒドロテストステロンの血漿濃度が減少し、さらに副生殖器官重量の減少が起こる。職業上ダイオキシン類にさらされた男性労働者の場合、血清テストステロン濃度が減少するとともに、濾胞刺激ホルモンおよび黄体形成ホルモンの血漿濃度が増加することが分かった。開示されるＡｈＲリガンドおよびその類似体の抗アンドロゲン作用は、前立腺の過形成または前立腺癌、男性型脱毛症、女性の男性化症候群、男児の性的早熟、および性犯罪者である男性の性衝動の抑制の処理に有用である。

肺疾患の治療。
ＡｈＲリガンド調製物は、（ａ）慢性閉塞性肺疾患、（ｂ）喘息、（ｃ）気腫、（ｄ）気管支炎、（ｅ）ＲＱ不適合、および（ｆ）急性肺機能障害などの肺疾患の治療に有用であると、本発明者らは考えている。

侵入性癌の血管形成の制御。
ＡｈＲリガンド調製物は、侵入性癌の血管形成の制御に有用であると本発明者らは考えている。米国特許第6,323,228号には、本発明と類似の化合物３−置換インドールカルボヒドラジドが血管形成の阻害に有用であると記載されている。本発明の化合物は、癌腫の原発腫瘍および転移性充実性腫瘍の両方の治療に有用であると本発明者らは考えている。

１．リガンド抽出および精製
材料および方法
材料
使用したすべての溶媒は、利用可能である限りはバーディック・アンド・ジャクソン(Burdick & Jackson)グレード（米国ミシガン州マスキーゴンのアライドシグナル・バーディック・アンド・ジャクソン(AlliedSignal Burdick & Jackson, Muskegon, MI, USA)）であった。溶媒は、使用前にＡｈＲリガンドを使用せずに試験した。リガンド投与の賦形剤として使用されるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、カタログ番号Ｄ−２６５０）、および標準用量作用曲線のＡｈＲリガンドとして使用されるβ−ナフトフラボン（βＮＦ、カタログ番号Ｎ−３６３３）は、シグマ(Sigma)（米国ミズーリ州セントルイス(St. Louis, MO, USA)）より購入した。ＡｈＲリガンドのレポーター細胞系（Ｈ１Ｌ１．１Ｃ２，Garrison, et al., 1996）は、米国カリフォルニア州デービスのカリフォルニア大学デービス校(University of California-Davis, Davis, CA, USA)のデニソン博士(Dr. Denison)から親切にも提供して頂き、Ｈ１Ｌ１．１Ｃ２細胞系のリガンドリポーター構成要素を維持するために使用される抗生物質のジェネティシン(Geneticin)（Ｇ４１８、カタログ番号１１８１１−０３１）は米国メリーランド州ロックビルのギブコ・ライフ・テクノロジーズ(GIBCO Life Technologies, Rockville, MD, USA)より購入した。

細胞培養
細胞系Ｈ１Ｌ１．１Ｃ２は、Ｇ４１８を濃度４００μｇ／ｍｌで含有する培養培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）中に維持し、３７℃、６％ＣＯ₂、および湿度１００％の雰囲気下でインキュベートした。Ｇ４１８を含有しない培地２００μｌ中に約３０，０００細胞／ウェルを含む９６ウェル滅菌細胞培養培養プレートを準備し、リガンド活性分析で投与する前に少なくとも１２時間インキュベートした。

リガンド活性分析
リガンド活性物質の溶媒を蒸発させ、活性物質をＤＭＳＯで再構成し、この溶液１μｌを、２００μｌの培養培地を含むウェル中のリガンドレポーター細胞の投与に使用した。各アッセイプレートのレポーター細胞の１列には、標準用量作用曲線を作製するために一連のβＮＦ標準物質のＤＭＳＯ溶液１μｌを投与した。このように投与した細胞を、これらを維持した場合と同じ環境で６時間インキュベートした。インキュベート後に細胞を１×ＰＢＳ（ｐＨ６．９）で２回洗浄し、投与による明らかな細胞数の変化を調べるため倒立顕微鏡で培養ウェルを調べた。５０μｌの１×細胞溶解試薬（米国ウィスコンシン州マディソンのプロメガ(Promega, Madison, Wl, USA)）を加えて細胞を溶解させ、照度計で読み取るためのマイクロライト(Microlite)２プレート（米国バージニア州シャンティリーのダイネックス・テクノロジーズ(Dynex Technologies Inc.,Chantilly, VA, USA)）の対応するウェルに各ウェルの溶解物１０μｌを移した。ＭＬＸマイクロタイター・プレート・ルミノメーター(MLX Microtiter Plate Luminometer)（ダイネックス・テクノロジーズ）のプログラムの設定は、５０μｌのルシフェラーゼ基質溶液（プロメガ）をウェルに注入し、注入後１秒の間隔をおいて５秒間ルシフェラーゼ反応を実施して発生した相対光量単位（ＲＬＵ）の単位の光強度を読み取り、５秒間の読み取り値の平均を最終ＲＬＵとするように行った。

データ処理および報告
各プレートからＲＬＵ対βＮＦ標準物質の用量（各アッセイウェルでｎｇ単位）の用量作用曲線をプロットし、同じプレートから得られたβＮＦ用量作用曲線を調べることで、試料で得られたＲＬＵをリガンド活性としてβＮＦ当量（ＢＥＱ）に変換した。リガンド活性（単位ＢＥＱ）対処理または精製手順のフラクションとしてデータを報告した。

組織採取とホモジェナイズ
人工飼料（飼料１１、Suda, et al., 1970）を給餌したスプレーグ・ドーリー(Sprague Dawley)ラットを安楽死させて、組織を外科的に取り出し、清浄なポリプロピレン管に入れ、ドライアイスで凍結させ、使用するまで−８０℃で保管した。ウィスコンシン大学マディソン校(University of Wisconsin-Madison)の食肉科学おおび筋肉生物学研究所(Meat Science and Muscle Biology Laboratories)の屠殺場で新しく屠殺した成体ブタ（市場から、平均６か月齢）からブタ肺組織を取り出し、新しいアルミニウム箔で包み、ドライアイスに直接のせて凍結させ、使用するまで−８０℃で保管した。次に、冷たいうちに組織を切断し、切断した組織を清浄な氷冷ガラスびんに移した。ホモジェナイズを行う切断組織を秤量して組織堆積を概算し（組織１ｇの体積が１ｍｌであると仮定）、ホモジェナイズのための清浄なガラスシリンダーに移した。組織と同体積の氷冷１×ＰＢＳ（１０×ＰＢＳから新しく希釈、ＮａＣｌが８０ｇ／ｌ、ＫＣｌが２ｇ／ｌ、ＫＨ₂ＰＯ₄が５．８ｇ／ｌ、Ｎａ₂ＨＰＯ₄・７Ｈ₂Ｏが１５．５ｇ／ｌ、ｐＨ６．２）をホモジェナイズシリンダーに加えた。組織をパワージーン(PowerGene)７００ホモジェナイザー（米国ペンシルベニア州ピッツバーグのフィッシャー・サイテンティフィック(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA)）でホモジェナイズし、ホモジェネートの体積を測定した。組織を含有せずその代わりに同重量の１×ＰＢＳで置き換えたことを除けば、並行したブランク対照試料を試料と同様に処理した。すべてスケールダウンしたことを除けば、より小規模のホモジェナイズを同様の方法で実施した。

メタノール抽出
ホモジェネートを、清浄な４Ｌ溶媒びんに移した。ホモジェネートの４倍の体積のメタノールを撹拌子ながらホモジェネートに徐々に加えた。抽出混合物をアルゴンでフラッシュし、抽出びんをテフロンでライニングされたふたで密封した。抽出混合物を室温で終夜撹拌した後、１Ｌグレードのポリプロピレン遠心管に移した。抽出混合物を室温で３分間１，０００×ｇで遠心分離し、上清を残留物と分離した。残留物の２倍の体積のメタノール：０．５×ＰＢＳ（８０：２０、ｖ／ｖ）混合物を遠心管の残留物に加えた。遠心管を室温で１時間振とうして組織を再抽出した。混合物を室温で３分間１，０００×ｇで遠心分離し、得られたペレットは廃棄した。第１および第２の上清を集め、４０℃の水せんを使用して１２Ｌの減圧フラスコ中で溶媒を蒸発させた。メタノールを使用して抽出物全部を、清浄にした１５０ｍｌガラス遠心管に移した。抽出物を室温で３分間４，０００×ｇで遠心分離した。上清を別の清浄なガラス遠心管に移した。組織５００ｍｌ当たり約２０ｍｌのメタノールを得られたペレットに加え、残留物の再抽出を行った。再び混合物の遠心分離を行い、ペレットは廃棄した。上清を集め、室温で３分間４，０００×ｇでペレットになるまで再度遠心分離を行い、メタノールに不溶性の粒子は廃棄した。蒸発によって抽出物の体積を減少させ、メタノール１ｍｌ当たり新しい組織が１０ｇとなる最終溶液を得た。メタノール抽出物（１０ｇ組織／ｍｌ）をアルゴンでフラッシュし、さらに操作するまで室温で保管した。すべてをスケールダウンして同様の方法でより小規模の抽出を実施した。

塩基処理
約４ｎｇＢＥＱのメタノール抽出物のアリコートを、清浄にしたガラスバイアルに移し、溶媒を蒸発させた。０．１ＮのＫＯＨ水溶液（２００μｌ）をバイアルに加えた。バイアルを３７℃で終夜インキュベートした。インキュベート後、管を冷却し、ＨＣｌでゆっくりと中和した。この処理混合物を２００μｌのクロロホルムで抽出した。クロロホルム相と水相を分離し、溶媒を蒸発させた。ＤＭＳＯ（１０μｌ）を活性分析用の各管に加えた。βＮＦおよびブランク抽出物を試料と同量の方法で処理した。初期の結果から、あらゆる処理の水相では活性が見られないことが分かり、そのため後の実験ではクロロホルム相のみについてリガンド活性を分析した。

熱処理
メタノール抽出物のメタノール溶液またはＤＭＳＯ溶液のいずれかを清浄にしたガラスバイアルに入れ、１００℃の水浴で３０分間加熱し、続いてバイアルを室温まで冷却した。溶媒中の抽出物をそのまま直接分析して活性を調べた。

酸および熱処理
抽出物のメタノール溶液（１０ｇ組織／ｍｌ）を同体積の４ＮのＨ₂ＳＯ₄水水溶液と混合した。処理混合物を３７℃で終夜インキュベートした後、撹拌しながら２４時間還流した。処理混合物を室温まで冷却し、１０ＮのＫＯＨでｐＨ６．５〜６．９に徐々に中和した。処理混合物を同体積の水飽和クロロホルムで３回抽出した。それらのクロロホルム相を集め、蒸発させて体積を減少させ、３０ｇ組織当量／ｍｌクロロホルムの最終溶液を得た。処理した抽出物をアルゴンでフラッシュし、４℃で保管した。

シリカゲルバッチ精製
シリカゲル（４０μｍ、カタログ番号７０２４−０２、米国ニュージャージー州フィリップスバーグのＪ．Ｔ．ベーカー(J. T. Baker, Phillipsburg, NJ, USA)）を、（各回でシリカゲルの２倍の体積）メタノールで１回、クロロホルムで２回、ヘキサンで２回、クロロホルムで１回、およびメタノールで１回の順で洗浄した。清浄にしたシリカゲルは使用前に１２０℃で終夜焼成した。５０％クロロホルムのヘキサン溶液１．５Ｌを５００ｇのシリカゲルに加えた。５，０００ｇの組織からの抽出物を含む１６０ｍｌのクロロホルムを１６０ｍｌのヘキサンと混合して、抽出物を５０％クロロホルムのヘキサン溶液にして、５０％クロロホルムのヘキサン溶液中のシリカゲルに撹拌しながら加えた。シリカゲルを室温で３０分間撹拌した後、沈降させた。溶媒を取り出し、「充填された」フラクションとして保存した。２Ｌの５０％クロロホルムのヘキサン溶液をシリカゲルに加えた。シリカゲルを室温で５分間撹拌した後、静置し溶媒を取り出し、「第１回洗浄」フラクションとして保存した。このシリカゲルを第１回の清浄に使用しなかった２Ｌのクロロホルムで洗浄した。溶媒を取り出し、「第２回洗浄」フラクションとして保存した。４％メタノールのクロロホルム溶液２Ｌをシリカゲルに加えて活性物質を溶出させた。シリカゲルを室温で５分間撹拌した後、沈降させた。溶媒を取り出し、「第１回溶出」フラクションとして保存した。この溶出段階を２回繰り返し、それらの溶媒をそれぞれ「第２回溶出」および「第３回溶出」のフラクションとして保存した。シリカゲルを２Ｌのメタノールでストリッピングし、その溶媒を「第１回ストリッピング」フラクションとして保存した。５０％メタノール水溶液を使用してシリカゲルの第２回目のストリッピングを行い、そのフラクションを「第２回ストリッピング」フラクションと名付けた。各フラクションのアリコートを分析した後、４％メタノールのクロロホルム溶液で溶出させた活性フラクションを集め、その溶媒を蒸発させた。集めたフラクションにクロロホルムを加えて、クロロホルム１ｍｌ当たりで１０ｎｇのβＮＦ当量（ＢＥＱ）の最終溶液を調製した。このバッチ精製した抽出物をアルゴンでフラッシュし、４℃で保管した。

シリカゲル重力カラム精製
内径８．１ｃｍのガラス重力カラムに１８０ｇの清浄にし、新しく焼成したシリカゲル（バッチ精製と同じものを使用）とクロロホルムの混合物を充填し、少なくとも１時間静置した。ベッド体積の１〜２倍のクロロホルムでカラムを平衡化させた。約４００μｇＢＥＱのシリカゲルバッチ精製活性物質のクロロホルム溶液を重力カラムに載せた。ベッド体積の３倍（〜９００ｍｌ）のクロロホルムをカラムに流した。０〜４％凸型グラジエントのメタノールのクロロホルム溶液をベッド体積の８倍（２，４００ｍｌ）用いて、活性物質を溶出させた。ベッド体積の６倍（１，８００ｍｌ）のメタノールを使用してカラムのストリッピングを行った。約２％メタノールのクロロホルム溶液で溶出させた活性フラクションを、リガンド活性分析後に混合した。その溶媒を蒸発させ、集めたフラクションにクロロホルムを加え、３０ｎｇＢＥＱ／ｍｌの最終溶液を調製した。精製した抽出物をアルゴンでフラッシュし、４℃で保管した。

メタノール−クロロホルムを使用する分取用シリカカラムＨＰＬＣ
分取用シリカＨＰＬＣカラム（ゾルバックス・プロ(Zorbax Pro）１０シリカ、内径＝２１．５ｍｍ）を、流速１０ｍｌ／分でクロロホルムを流すことによって平衡化させた。シリカゲル重力カラムで精製した活性物質（５０μｇＢＥＱ）をクロロホルムと混合したものをカラムに注入した。カラム容積の３倍（１５０ｍｌ）のクロロホルムをカラムに送り込んだ。０〜４％リニアグラジエントのメタノールのクロロホルム溶液をカラム容積の８倍（４００ｍｌ）用いて活性物質を溶出させた。移動相を徐々に１００％メタノールに変化させ、カラム容積の８倍（４００ｍｌ）のメタノールを使用してカラムのストリッピングを行った。約２％メタノールのクロロホルム溶液で溶出させた活性フラクションを、活性分析後に集めた。精製した活性物質をアルゴンでフラッシュし、−２０℃で保管した。

イソプロパノール：ヘキサンを使用する分取用シリカカラムＨＰＬＣ
分取用シリカＨＰＬＣカラム（メタノール：クロロホルム系）で精製した活性物質を、２％イソプロパノールのヘキサン溶液と濃度１０ｎｇＢＥＱ／μｌで混合した。この混合物を室温で５分間１２，０００×ｇで遠心分離した。流速１０ｍｌ／分で２％イソプロパノールのヘキサン溶液で平衡化させたシリカＨＰＬＣカラム（ゾルバックスシリカカラム、内径＝２１．５ｍｍ）に４ｍｌの上清を注入した。カラム容積の３倍（１５０ｍｌ）の２％イソプロパノールのヘキサン溶液をポンプによりカラムに流した。２〜１５％リニアグラジエントのイソプロパノールのヘキサン溶液を、カラム容積の１３倍（６５０ｍｌ）用いて活性物質を溶出させた。移動相を１００％メタノールにカラム容積の２倍（１００ｍｌ）かけて変化させ、カラム容積の８倍（４００ｍｌ）のメタノールを使用してカラムのストリッピングを行った。約５％イソプロパノールのヘキサン溶液で溶出させた活性フラクションを「５％ピークリガンド」として集めた。約１０％イソプロパノールのヘキサン溶液で溶出させた活性フラクションを「１０％ピークリガンド」として集めた。これらの活性物質はアルゴンでフラシュし、−２０℃で保管した。

７５％メタノール水溶液を使用する分取用Ｃ１８カラムＨＰＬＣ
分取用シリカＨＰＬＣカラム（イソプロパノール：ヘキサン系）で精製した「１０％ピークリガンド」を、７５％メタノール水溶液と、濃度４μｇＢＥＱ／ｍｌで混合し、清浄にしたポリプロピレン遠心管に入れて、室温で３分間１６，０００×ｇで遠心分離した。その上清を同じ条件でもう１回遠心分離した。５ｍｌの上清を、流速５ｍｌ／分の７５％メタノール水溶液で平衡化させた分取用Ｃ１８ＨＰＬＣカラム（ゾルバックス、内径＝２１．５ｍｍ）に注入した。このＨＰＬＣは、７５％メタノール水溶液でイソクラティカリーに３０分間（１５０ｍｌ）実施し、次に２０分間で移動相を１００％メタノールに変化させた（１００ｍｌ）。カラムを１００％メタノールで８０分間ストリッピングした（４００ｍｌ）。保持時間が約２６分の活性フラクション（各５ｍｌ）を集めた。この活性物質はアルゴンでフラッシュし、移動相中−２０℃で保管した。

５０％アセトニトリル水溶液を使用する分析用Ｃ１８カラムＨＰＬＣ
分取用Ｃ１８ＨＰＬＣカラム（７５％メタノール水溶液）で精製した約１０μｇＢＥＱの活性物質を、２５０μｌの５０％アセトニトリル水溶液に溶解し、清浄にしたポリプロピレン遠心管に入れて、室温で３分間１６，０００×ｇで遠心分離した。この上清を、流速１ｍｌ／分の５０％アセトニトリル水溶液で平衡化させた分取用Ｃ１８ＨＰＬＣカラム（ゾルバックス、内径＝４．６ｍｍ）に注入した。この精製段階から、ウォーターズ(Waters)９９６光ダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器（米国マサチューセッツ州ミルフォードのウォーターズ(Waters Corp., Milford, MA, U.S.A.)）を使用してＵＶ吸収データを取得し、リガンドの生物学的活性とそのＵＶスペクトルの間の相関を調べた。カラムから流出するすべての物質はＰＤＡ検出器のフローセル（経路長１０ｍｍ、内径０．００９インチ）に通した。測定したＵＶ波長は最初２００〜８００ｎｍに設定した。化合物のスペクトルが明確になってからは、１０％ピークリガンドについては２００〜４５０ｎｍでモニタリングした。移動相のＵＶ吸光度は自動的に０になるように設定した。ＵＶスペクトルは、ミレニアム（Millennium）３．２ソフトウェア（ウォーターズ）を使用して１スペクトル／秒の速度で取得した。ＨＰＬＣは、５０％アセトニトリル水溶液でイソクラティカリーに２０分間実施し、続いて１０分間で移動相を１００％アセトニトリルに変化させた。カラムは、１００％アセトニトリルで２０分間ストリッピングした（２０ｍｌ）。保持時間約７分で２０８ｎｍ、２７１ｎｍ、２７７ｎｍ、および３５５ｎｍの４つのピーク吸光度の特徴的ＵＶスペクトルを構成するフラクション（各約０．５ｍｌ）を、生物活性の確認後に集めた。集めたフラクションは、アルゴンでフラッシュし、移動相中−２０℃で保管した。

１０％イソプロパノールのヘキサン溶液を使用する分析用シアノカラムＨＰＬＣ
分析用Ｃ１８ＨＰＬＣカラム（５０％アセトニトリル水溶液）で精製した約１０μｇＢＥＱの活性物質を、１０％イソプロパノールのヘキサン溶液２５０μｌに溶解し、流速１ｍｌ／分の１０％イソプロパノールのヘキサン溶液で平衡化させた分析用シアノＨＰＬＣカラム（内径＝４．６ｍｍ、アドソーボスフィア(Adsorbosphere)ＣＮ−ＡＱ ５Ｕ、米国イリノイ州ディアフィールドのアルテック・アソシエーツ(Alltech Associates, Inc. Deerfield, IL, USA)）に注入した。カラムは１０％イソプロパノールのヘキサン溶液でイソクラティカリーに２０分間作動させ、次に移動相を段階的に１００％メタノールに変化させた。カラムは、１００％メタノールで２０分間ストリッピングした（２０ｍｌ）。保持時間約１２分で２０８ｎｍ、２７１ｎｍ、２７７ｎｍ、および３５５ｎｍの４つのピーク吸光度の特徴的ＵＶスペクトルを構成するフラクション（各０．５ｍｌ）を、生物学的活性の確認後に集めた。これらのリガンドは、アルゴンでフラッシュし移動相中−２０℃で保管した。

６０％メタノール水溶液を使用する分析用シアノカラムＨＰＬＣ
分析用シアノＨＰＬＣカラム（１０％イソプロパノールのヘキサン溶液）で精製した約１０μｇＢＥＱの活性物質を２５０μｌの６０％メタノール水溶液に加えた。得られた溶液を、流速０．５ｍｌ／分の６０％メタノール水溶液で平衡化させた同じシアノカラムに注入した。カラムは、６０％メタノール水溶液でイソクラティカリーに２０分間作動させ、続いて１０分間で移動相を１００％メタノールに変化させた。カラムを１００％メタノールで４０分間（２０ｍｌ）ストリッピングした。精製したリガンドは、ＵＶ吸光度を測定するために注意深く回収した。精製したリガンドのＵＶスペクトルは、それぞれ２０８ｎｍ、２７１ｎｍ、２７７ｎｍ、および３５５ｎｍの４つの吸収ピークからなり、保持時間はこの精製系では約１０分となるはずである。これらのリガンドは、アルゴンでフラッシュし、移動相中−２０℃で保管した。

結果
ＡｈＲリガンド分析システムおよび抽出手順
本発明者らは、分析の増強、スピードアップ、および半自動化のため、感受性ＡｈＲリガンド分析システム（Garrison, et al., 1996）を９６ウェルプレートフォーマットに応用した。この応用分析システムでは０．０５ｎｇのβＮＦで高い信頼性で検出することができ、この場合、賦形剤（ビヒクル）コントロールに対して約２〜３倍の誘導（インダクション）を発生させた。区別可能な信号は０．０１ｎｇのβＮＦで得られ、この系の最大誘導は賦形剤の約８０〜１００倍であった（図１Ａ）。この感受性分析では、本発明者らは、信頼性のあるＡｈＲリガンド抽出手順の開発から開始した。ヒトＡｈＲ遺伝子は胎盤以外の器官と比較すると肺で大量に転写されることが分かっているため（Dolwick, et al., 1993）、本発明者らは、リガンド抽出の優れた供給源組織は肺組織であろうと考えた。環境による汚染の可能性を減少させるために人工飼料（飼料１１、Suda, et al., 1970）を給餌したスプレーグ・ドーリーラットの肺組織を、試験抽出のために使用した。数回の試験の後、試験の項に概略が示されるような抽出手順が確立された。約５０ｎｇＢＥＱのリガンド活性物質は、抽出された１ｇの肺組織から検出され、ブランク抽出または賦形剤による信号は見られなかった（図１Ｂ）。

リガンド抽出の供給源組織の決定
抽出手順の確立に関して、本発明者らは、ＡｈＲ−リガンドの多い器官を同定するために器官の予備調査を実施した。ラットの肺組織は、調査した期間の中でリガンド活性が最も高いことが分かった（図１Ｃ）。これらの調査結果に基づくと、当初の推論、およびＴＣＤＤの分配が肺以外ではラットおよびマウスの肝臓が優先的であったことから（Santostefano, et al., 1996）、本発明者らはリガンド抽出の供給源組織を肺に決定した。収量を増加させるためにはより大きな器官が必要であったので、本発明者らはブタおよびウシの肺組織のリガンド活性を検査した。どちらの供給源も、人工飼料を給餌したラットと同様のリガンド活性を示した（データは示していない）。本発明者らは、ウィスコンシン大学マディソン校キャンパスで定期的に屠殺される動物であるという単純な理由でブタを供給源動物として選択した。

塩基処理
動物組織からリガンド活性物質を抽出した後で、本発明者らはこれらの活性物質の性質を予備的に求めた。環境中に存在するほとんどの非生理学的ＡｈＲリガンドは非常に安定であり強塩基または酸の処理に対して抵抗性があるので、この時点で内因性活性物質を環境的夾雑物から区別するための簡単な方法は、抽出したリガンド活性物質を塩基または酸で処理することであると本発明者らは考えた。図１Ｄに示されるように、塩基処理（０．１ＮのＫＯＨ、３７℃、終夜）によって活性の約６０〜８０％が失われるが、βＮＦまたはブランク抽出物ではこの処理による影響はなかった。より短いインキュベート時間（２時間）以外は同じ条件で処理を行った場合も活性が失われた（データは示していない）。これらのデータから、本発明者らが動物組織から抽出した活性物質は塩基に対して安定でないことが分かり、これから本発明者らは環境的夾雑物を単離したのではないといえる。

熱処理
本発明者らは、熱処理（１００℃ウォーターバス、３０分間）によって、抽出したリガンドの活性の低下または消失が起こるかどうかを調べた。予期せぬことに熱処理によってメタノール抽出物の活性は３〜４倍に増加したが、賦形剤、ブランク抽出物、およびβＮＦには変化は見られなかった（図１Ｅ）。実際、メタノール抽出物のリガンド活性は、５分間の簡単なインキュベート後には増加し始めた（データは示していない）。本発明者らは、潜在的な担体からのリガンドの放出が熱処理によって促進され、この処理によってリガンドの収量が増加しうると考えている。

硫酸および熱処理
同様に、本発明者らは、メタノール抽出物の硫酸処理を試験し、この処理でもリガンド活性の向上が見られた（データは示していない）。硫酸処理と熱処理を組み合わせるとさらに活性が増大する（図１Ｆ）。

シリカゲルバッチ精製および重力カラム精製
本発明者らは、酸処理および熱処理したリガンドを精製するためのバッチ法と重力カラム法の両方でシリカゲルを使用した。シリカゲルに結合したリガンドは、５０％クロロホルムのヘキサン溶液および１００％クロロホルムを使用すれば活性を低下させることなく洗浄することができる。活性物質の大部分は４％メタノールのクロロホルムを使用すれば１回で溶出し、活性物質の多量のフラクションを回収するためには２回溶出させれば十分であった（図２Ａ）。５，０００ｇの組織から抽出される活性物質は５００ｇの新しく焼成したシリカゲルで効率的に精製可能である。溶離しクロロホルム中に溶解した活性物質は、同じシリカゲルを充填しクロロホルムで平衡化したガラス重力カラムにかけられる。１つのピークを有するリガンド活性物質は、ピンクから茶色のバンドの材料とともに移動し、２％メタノールのクロロホルム溶液で溶出した（図２Ｂ）。約４００μｇＢＥＱの活性物質は、１８０ｇ充填されたシリカゲルで精製可能であった。この系の回収率は約２５％である。

分取用シリカカラムを使用するＨＰＬＣ精製
本発明者らは、重力カラムで精製した活性物質を、メタノール：クロロホルム移動相を使用する分取用シリカＨＰＬＣカラムに注入した。１つのピークを有する活性物質が、メタノールが２％のクロロホルム溶液で溶出した（図３Ａ）。この系の回収率は約９０％であった。この系への１回の注入で約５０μｇのＢＥＱを精製可能であった。この系で精製された活性物質を、イソプロパノール：ヘキサン溶媒系を使用する別の分取用シリカＨＰＬＣカラムにリガンドを注入することによりさらに精製した。２つの顕著なピークを有する活性物質が、イソプロパノールが５％および１０％のヘキサン溶液でそれぞれ溶出した、さらにいくつかの小さなピークも見られた（図３Ｂ）。本発明者らは、５％イソプロパノールのヘキサン溶液で溶出した活性ピークを５％ピークリガンドと名付け、同様に１０％イソプロパノールのヘキサン溶液で溶出したものを１０％ピークリガンドと名付けた。本発明者らは、１０％ピークリガンドをさらに続けた。この系の精製能力は、各注入で４０μｇのＢＥＱであり、２つの活性ピークの合計の回収率は約２０％である。

Ｃ１８カラムを使用するＨＰＬＣ精製
本発明者らは、７５％メタノール水溶液の移動相を使用する分取用Ｃ１８ＨＰＬＣカラムに１０％ピークリガンドを注入した。約２３分の保持時間で１つのピークを有する活性物質（フラクション＃２３近辺、各フラクションは５ｍｌ）が溶出した（図３Ｃ）。活性物質の回収率は約８０％である。この系で精製した活性物質を、５０％アセトニトリル水溶液の移動相を使用する分析用Ｃ１８ＨＰＬＣカラムに注入した。３５６ｎｍにおけるＵＶ吸収ピークは保持時間約７分で溶出し（図３Ｄ）、これがリガンド活性物質と一致した。ＰＤＡデータから、２０８ｎｍ、２７１ｎｍ、２７７ｎｍ、および３５６ｎｍの４つの吸収ピークでスペクトルが構成されることが分かった。クロマトグラム（図３Ｄ）に示されるように、主要な３５６ｎｍのＵＶピークの時間の大部分は、一部のＵＶ吸収性夾雑物を伴っている。別のＨＰＬＣ系に活性物質を注入する場合にはこれらの不純物の除去が必要であった。この系の回収率は約７５％であり、精製能力は各注入で少なくとも１５μｇＢＥＱである。

分析用シアノカラムを使用するＨＰＬＣ精製
本発明者らは、１０％ピークリガンドを、１０％イソプロパノールのヘキサン溶液が移動相である分析用シアノＨＰＬＣカラムに注入することによってさらに精製した。３５６ｎｍにおけるＵＶ吸収ピークは保持時間１２分（図３Ｅ）で溶出し、これは生物学的活性物質と一致した。この保持時間のスペクトルは、前段階の精製（５０％アセトニトリル水溶液を使用する分析用Ｃ１８ＨＰＬＣカラム）の場合と正確に同じであり、これから、このＵＶスペクトルは典型的な１０％ピークリガンドを表していることが分かった。この系の回収率は約８０％であり、精製能力は少なくとも１０μｇＢＥＱである。別のＵＶ吸収性夾雑物を完全に除去するために図３Ｅに示されるように別のＨＰＬＣ精製段階を含むことが必要となる場合がある。本発明者らは、同じシアノカラムを使用し、６０％メタノール水溶液の移動相を使用した。３５６ｎｍにおけるＵＶ吸収ピークは保持時間１０分で溶出した（図３Ｆ）。この系の回収率約８０％であり、精製能力は少なくとも１０μｇＢＥＱであった。この保持時間のスペクトルも前の２つの段階のＨＰＬＣ精製と同じであった。予期されるように、ＵＶスペクトルで確認されるリガンドの生物活性物質は、１０％ピークリガンドのスペクトルである。三次元クロマトグラム（図４Ａ）から、測定される各波長（２００〜８００ｎｍ、４５０ｎｍ以降は図示していない）において任意のＵＶ吸収性材料からどれだけリガンドが離れているかが分かる。したがってＡｈ受容体の１０％ピークリガンドは均一になるまで精製されている。

１０％ピークリガンドの全体の回収率および収量
バッチ精製から始まりＨＰＬＣ系で終了する全精製系の全体の回収率は約０．２％である。約０．３μｇ（絶対量）の１０％ピークリガンドが、成体ブタの新しい肺組織約５００ｇから精製することができる。本発明者らは、約７０頭の成体ブタから肺組織を連続的に処理し、約２０μｇの精製１０％ピークリガンドを得た。

２．リガンド材料の構造的同定
材料および方法
ＵＶ分光
約３μｇβＮＦ当量（ＢＥＱ）の試料を２００μｌのメタノール：水（６０：４０）と混合したものを、流速０．５ｍｌ／分の６０％メタノール水溶液で平衡化させたシアノＨＰＬＣカラム（アドソーボスフィアＣＮ−ＡＱ ５Ｕ、内径＝４．６ｍｍ、米国イリノイ州ディアフィールドのアルテック・アソシエーツ）に注入した。カラムから流出する化合物は、ウォーターズ９９６光ダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器（米国マサチューセッツ州ミルフォードのウォーターズ）のフローセル（経路長１０ｍｍ、内径０．００９インチ）に通した。移動相のＵＶ吸光度は自動的に０になるように設定した。図４Ａに示されるようにＵＶスペクトルは、ミレニアム３．２ソフトウェア（ウォーターズ）を使用して１スペクトル／秒の速度で取得した。

電子衝撃質量分析
新しいガラスプローブを、ＭＳ５０ＴＣ超高分解能質量分析計(Ultrahigh Resolution Mass Spectrometer)（英国マンチェスターのクラトス社(Kratos Inc., Manchester, UK)）に、電子エネルギー７０ｅＶおよびイオン源温度１５０℃で挿入した。プローブのバックグラウンドスペクトルを最初に測定した。注入溶媒のブランクスペクトルは、リガンドを含有するフラクションで測定した。クラトスＤＳ−５５データ取得システムを使用して、すべてのスペクトルデータを記録した。得られた高分解能スペクトルデータは、ブランクピークを減算した後に再プロットし作表した。

約１μｇBEQをメタノールに溶解した試料を、テフロンＳＴＩ ＩＲカード(Teflon STI IR Card)（米国コネチカット州シェルトンのサーモ・スペクトラ−テック(Thermo Spectra-Tech, Shelton, CT, USA)）上にスポットした。最小直径の赤外ビームが通過する領域によって、材料供給の制限によって試料経路が最小から最大まで維持されるように試料をカードに適用した。溶媒を蒸発させ、インフィニティ・６０ ＡＲ ＦＴ−ＩＲ分光計(Infinity 60 AR FT-IR Spectrometer)（米国ウィスコンシン州マディソンのサーモ−マットソン(Thermo-Mattson, Madison, Wl, USA)）の試料室にカードを取り付けた。スペクトルは、WinFIRST３．００ソフトウェア（解像度： ２、スキャン数：２００、絞り開口：１、ウインドウ：KBr）で取得した。ブランクスペクトルは、最後の精製段階で注入した溶媒で測定した。

一次元ＮＭＲ分光法
標準的¹Ｈ−ＮＭＲの単一周波数デカップリングおよび単一周波数ＮＯＥ差スペクトルを求めるために使用される溶媒の磁化率に調節された磁化率を有する２．５ｍｍＮＭＲ試料管（米国ニュージャージー州ブエナのウィルマド−ラボグラス(Wilmad-Labglass, Buena, NJ, USA)）、または５mmのシゲミ(Shigemi)管（米国ペンシルベニア州アリソンパークのシゲミ社(Shigemi, Inc. Allison Park, PA, USA)）のいずれかに、特定の溶媒に溶解した約２μｇの試料を入れた。ＮＭＲスペクトルは、マディソン(Madison)の全米磁気共鳴施設(National Magnetic Resonance Facility)にあるブルカー(Bruker)ＤＭＸ−７５０およびＤＭＸ−５００分光計（米国マサチューセッツ州ビルリカのブルカー・バイオスピン(Bruker BioSpin Corp., Billerica, MA, USA)）で測定した。ブランク（最後のＨＰＬＣ精製の溶媒注入で採取したものと同じフラクション）のスペクトルも記録した。

二次元ＮＭＲ分光法
重水素化メタノールに溶解した約１２μｇの試料を５ｍｍシゲミ管（シゲミ社）に入れた。二次元¹Ｈ｛¹³Ｃ｝異核単一量子相関（ＨＳＱＣ）（Schleucher, et al., 1994）および異核多重結合相関（ＨＭＢＣ）（Willker, et al., 1993）測定を、５ｍｍの三重共鳴一軸グラジエント・クリオグローブ（Cryoprobe（商標））（ブルカー・バイオスピン社）を取り付けたＤＭＸ−５００で実施した。これはＤＭＸ−７５０分光計の２倍の信号対雑音比が得られる。ｇｓ−ＨＭＢＣ試験ではわずかな修正を行った。直接のピークは抑制されず、静的な場の不均質性に再度焦点を与える逆位相形成周期の中点で¹Ｈおよび¹³Ｃの共鳴の両方で補強の１８０°パルスを使用した。

理論的計算
提案される構造は、ガウスビュー・プログラム(GaussView program)（ガウシアン(Gaussian Inc．)）を使用して構成した。これらのモデルは、ジャガー(Jaguar)量子化学プログラム（シュレーディンガー(Schrodinger Inc．)）を使用して理論のB3LYP/6-31 g*レベルにおける完全に束縛のない幾何学的最適化が行われる。虚数周波数が存在しないことから、モデルが局所基底状態にあると仮定した。計算した周波数は、最適化構造に関するＳＱＭ法を使用してスケール変更した（Baker, et al., 1998）。等方化学シフトは、量子化学プログラムのガウシアン・スイート(Gaussian suite)を使用して最適化モデルから計算した（Frisch, et al., 1998）。ガウシアン(Gaussian)９８で実行される理論のB3LYP/6-311++G(2d,2p)レベルにおいてＧＩＡＯ法を計算に使用した。計算で求めた化学シフトは、数種類のモデル化合物の実験で求めた化学シフトと比較して較正し、経験的に理論値のスケール変更を行い（BaldridgeおよびSiegel)，1999；Rablen, et al., 1999； ForsythおよびSebag，1997）、このためには次の一次方程式を使用した。実験で求めた化学シフト（¹Ｈ，ｐｐｍ）＝計算で求めた化学シフト＊０．９５＋０．２６；実験で求めた化学シフト（¹³Ｃ，ｐｐｍ）＝計算で求めた化学シフト＃０．９５+０．５９。直線回帰のＲ²値は、¹Ｈおよび¹³Ｃの両方のフィッティングで０．９９９であった。較正した理論化学シフトに予測される実験値からのずれは、¹Ｈの場合は０．１５ｐｐｍ以下であり（Rablen, et al., 1999）、¹³Ｃの場合は３ｐｐｍ以下である（BaldridgeおよびSiegel， 1999）。テトラメチルシラン（ＴＭＳ）のプロトンおよび炭素の理論的化学シフトは０に設定した。

結合定数は、単一有限摂動法(single-finite-perturbation method)（Onak, et al., 1999）によって計算した。摂動の大きさは０．０２auであり、これは応答の線形領域の範囲内であり、この計算は理論のB3LYP/6-311+g*レベルで実施した。この方法では、これらのフェルミ接触のスカラーカップリングへの寄与のみが有効である。

ＮａＢＨ ₄ による還元
反応のためのガラスバイアに規定量の化合物をピペットで入れ、溶媒を蒸発させた。ＮａＢＨ₄の飽和エタノール溶液（１００μｌ）（２００プルーフ、米国ケンタッキー州シェルビービルのアーパー・アルコール・アンド・ケミカル(Aaper Alcohol and Chemical Co. Shelbyville, KY, U.S.A.)）を各反応管に加えた。混合物を室温で終夜インキュベートした後、２００μｌの水を加えて反応を停止させた。この反応物を２００μｌのクロロホルムで２回抽出し、そのクロロホルム相を集めた。水相とクロロホルム相の両方の溶媒を蒸発させ、両方の相について生物学的活性を調べた。単離物質を含有しないことを除けば同様の処理が行われたブランクとしてクロロホルム相を電子衝撃質量分析で分析した。

塩基加水分解およびメチル化
３ｎｇＢＥＱの試料を含有する２μｌのメタノールに、３８μｌのメタノールと１０μｌの０．５ｍｍＫＯＨ水溶液とを加え、混合した。反応を３７℃で２時間続けた後、１０μｌの０．５ｍｍｏｌＨＣｌ水溶液を加えてｐＨを約５．０にして反応を停止させた。この反応混合物に、３０μｌの水、１０μｌのメタノール、および５０μｌのクロロホルムを加えて、混合した。遠心分離後、クロロホルム相を分離して保存した。クロロホルム抽出を繰り返し、２つのクロロホルム相をまとめて保存した。このクロロホルム相を２つに分け、１つは生物学的分析に使用し、もう一方はメチル化に使用した。３ｎｇのβＮＦを２μｌメタノールと混合したもの、およびコントロールとしての２μｌのメタノールに関しても、同じ操作を実施した。

メチル化の場合、加水分解生成物から溶媒を蒸発させ、５０μｌのクロロホルムを加えた。この溶液を氷で冷却し、ジアゾメタンのエーテル溶液（１ｍｇ／１ｍｌ、新しく調製した）５μｌを加えた。この反応混合物を頻繁に振り混ぜながら氷上で１０分間維持した。反応混合物を室温まで温め、遠心分離を行った。溶媒を蒸発させ、この生成物を、メチルを実施していない加水分解生成物とともに分析を行った。

構造分析におけるプロトンおよび炭素の同定
化合物中の原子の同定の便宜上、プロトンおよび炭素は、それらの化学シフトにより命名する。例えば、化学シフトが９．２５ｐｐｍのプロトンは９．２５プロトンと呼び、同様に１４１．０５ｐｐｍの炭素は１４１と呼ぶ。

結果
ＵＶ分光法
試料のＵＶスペクトルは、多重ピーク吸収特性を示す。第１の吸収ピークは２０８ｎｍにあらわれ、次の２つのピークは２７１ｎｍと２７７ｎｍに見られ、これら２つはより小さいが特徴的である。最後の吸収ピークは３５６ｎｍにあらわれる（図４Ｂ）。このスペクトルは広範囲の共役を示している。興味深いことに、一部のスペクトル（２７１ｎｍおよび２７７ｎｍの吸収）はインドールのスペクトル（Pretsch, et al., 2000）と類似している。

質量分光分析
高解像度電子衝撃質量スペクトルから、試料の分子イオンは２８６．０３９９質量単位であり、分子式はＣ₁₄Ｈ₁₀Ｎ₂Ｏ₃Ｓであることが分かる（図５Ａ、表１）。硫黄の存在は、³⁴Ｓが大きく寄与するＭ＋２イオンの特徴的な存在度によって示される同位体クラスターの出現により明らかである。基準ピークは質量単位１４４．０４５３のイオンであり、Ｃ₉Ｈ₆ＮＯで構成される。分子イオンと基準ピーク以外に、ＣＯを失うことにより１４４イオンから派生する１１６イオン、１１６イオンからＣＨＮを失った生成物である８９イオン、および１１６イオンからＣ₂ＨＮを失ったことによる７７イオンが存在する。ＣＨ₃を失うことにより分子イオンから派生する２７１イオン、分子イオンからＣＯを失うことにより生成する２５８イオン、および分子イオンからＣＨ₃およびＣＯ₂を失うことで生成する２２７イオンなどの存在度が比較的低いイオンも存在し、メチルエステル官能性が存在することを示している。２００イオン、１６９イオン、１６０イオン、１４９イオン、１４７イオン、１４２イオン、１３１イオン、および１２３イオンなどの他の存在度の低いイオンは、１つまたは２つの転位現象を伴う断片化過程であると合理的に説明することができる。表１は、すべてのピークの正確な質量単位、ならびにそれらの分子組成、相対量、および実験質量と理論質量の間の一致の程度を示す偏差を示している。

ＦＴ−ＩＲ分光法
ＦＴ−ＩＲスペクトルでは、１７３７ｃｍ^-1に強い吸収ピークが見られ、これはカルボニル、多くの場合にはエステルカルボニルに特徴的なピークである（図５Ｂ）。エスエルの存在は約１２０５ｃｍ^-1のエステルＣ−Ｏピークの存在によってさらに支持される。１４３５ｃｍ^-1および２９２６ｃｍ^-1のピークは、メチル基およびメトキシ基の存在を示している。これらのピークはメチルエステルの存在をさらに支持しており、高分解能質量スペクトルの分析結果と一致している。１５９３ｃｍ^-1のピークは、炭素−炭素二重結合、炭素−窒素二重結合、芳香族骨格、および芳香環中のＣ＝Ｃからの予想される寄与以外の特殊な構造環境にある別のカルボニルを示している。

プロトンＮＭＲ分光法
非常に少量の純粋化合物のみが寄与する１ｄ−ＮＭＲシグナルを明らかにするため、ｄ−メタノール中で試料とブランク（最後のＨＰＬＣ精製の溶媒注入から得た試料と同じフラクション）の両方のスペクトルを測定し、続いて、溶媒と試料の間でピークが重なる可能性を排除するためにｄ−クロロホルム中で試料とブランクの両方のスペクトルを測定した。クロロホルムを使用するとスペクトルが複雑になったが、メタノールスペクトル中に隠れたスペクトルを見つけ出す目的を果たした。試料の１ｄプロトンＮＭＲスペクトルでは、９個のプロトンが検出され（図６Ａ）、残りの１つは使用した溶媒と交換されたために検出されなかったと思われる。交換可能なプロトン（１１．３３ｐｐｍ）は、溶媒としてｄ−アセトンを使用した場合には見ることができ（データは示していない）、これから高解像度質量スペクトルデータから推測される分子式が裏付けられた。７．２７（１Ｈ）、７．２８（１Ｈ）、７．５０（１Ｈ）、および８．３８（１Ｈ）の化学シフトを有するプロトンは芳香環上で接近して存在しており、中央の７．２７プロトンおよび７．２８プロトンはデカップリングおよびＮＯＥ法（データは示していない）によりさらに支持される。９．２５（１Ｈ）、８．６７（１Ｈ）、および３．９９（３Ｈ）ｐｐｍの化学シフトを有する３つのシングルピークが存在する。これらのピークは互いに分離しており、ｄ−メタノール中のデカップリングおよびＮＯＥ法により明らかになる残りのプロトンとも分離している。しかし、ｄ−アセトン中でＮＯＥ法を実施すると、１１．３３プロトンに照射した場合７．５０プロトンと９．２５プロトンの両方が応答し、これからこれら３つのプロトンが空間的に近くに存在することが分かる。３．９９ｐｐｍの化学シフトおよび３．９９プロトンから、これらのプロトンがメトキシ官能性と関連していることを示しており、高分解能質量スペクトルおよびＦＴ−ＩＲスペクトルの両方で測定されるメチルエステルの存在をさらに支持している。すべてのプロトン化学シフト値から判断して、３．９９プロトンを除いたすべてのプロトンは芳香族系と関与している可能性が最も高い（図６Ａ）。

ＨＳＱＣ分光法
ｄ−メタノール中で測定したＨＳＱＣスペクトルより、７つの炭素１３の化学シフトが示され、それぞれの炭素には１または３個のプロトンが結合している（図６Ｂ）。９．２５プロトンは、化学シフトが１４１ｐｐｍの炭素１３（１４１炭素）と結合している。同様に、８．６７プロトン、８．３６プロトン、７．５０プロトン、７．２８プロトン、７．２７プロトン、および３．９９プロトンは、それぞれ１３５炭素、１２４炭素、１１４炭素、１２６炭素、１２５炭素、および５５炭素と結合している（図６Ｂ）。この場合も、これらの炭素の化学シフトは、５５炭素を除けば、芳香族系に関与しており、その一部はヘテロ原子の近くに存在することを示している。

１２５炭素および１２６炭素とそれぞれ結合した７．２７プロトンおよび７．２８プロトンは、次元数および収集時間を増加させた場合の解像度にはスペクトルが分離する。これらのそれぞれの隣接するプロトンとのカップリングパターンも確認できる。１ｄ−ＮＭＲスペクトルと合わせて考えると、どちらの場合も、これら２つのプロトンが他の２つのプロトン（７．５０プロトンおよび８．３６プロトン）の間に存在することを示す１つのダブレットダブレットよりも複雑になると予想される。

ＨＭＢＣ分光法
ｄ−メタノール中で得られるＨＭＢＣスペクトルによって、結合に関するさらに詳細な情報が得られる（図６Ｂ）。１４１炭素と直接結合する９．２５プロトンは、おそらくは１３９ｐｐｍ、１２９ｐｐｍ、および１１５ｐｐｍの化学シフトを有する他の３つの炭素と２〜３個の結合によって連結している。８．３６プロトンは１２４炭素と直接結合しており、同時に、７．２８プロトンと直接結合している１２６炭素、および２〜３個の結合を介して９．２５プロトンと結合する１３９炭素とも結合している。同様に、７．５０プロトンは、１１４炭素と直接結合しており、さらに、７．２７プロトンと直接結合する１２５炭素、および２つ以上の結合を介して９．２５プロトンと結合する１２９炭素とも結合している。これらの関係から、９．２５プロトンは、７．５プロトンおよび８．３６プロトンの両方から４〜５個の結合が離れていることが分かった。一方、８．６７プロトンは、比較的離れた系に存在する。このプロトンは、１３５炭素と直接結合している以外に、化学シフトが１５０ｐｐｍおよび１７３ｐｐｍの炭素と２〜３個の結合を介して連結している。他のプロトンはいずれも、これらの３つの炭素との関係は検出されていない。３．９９プロトンは、５５炭素（メチル炭素）と直接結合している以外に、化学シフトが１６５ｐｐｍの別の炭素（エステルカルボニル炭素であると思われる）と関係していることが分かり、このことはメチルエステル官能性と一致する。図６Ｂは、プロトンと炭素１３の間の相関関係に関する詳細な情報を示している。本発明者らは、化合物の合計１４個の炭素のうち１３個の炭素化学シフト情報を得た。

一部の¹Ｈ−¹³Ｃ結合定数はＨＭＢＣスペクトルから直接測定した。９．２５プロトンと、これと直接結合する炭素１３（１４１炭素）との間の結合定数は１９１Ｈｚであり、８．６７プロトンと１３５炭素との間の結合定数は１９３Ｈｚである。これら２つの結合定数から、両方の炭素が５員複素環式芳香族環のヘテロ原子の近くに存在することが分かる。７．２７（または７．２８）プロトンと１２５（または１２６）炭素との間の１つの結合の結合定数は１５８Ｈｚであり、これらの元素が６員芳香環に含まれることを示している。３．９９プロトンとこれらが直接結合する炭素（５５炭素）の結合定数は１５０Ｈｚであり、これもメトキシ官能基が存在することを示している。

還元
ＮａＢＨ₄を使用した還元によって、生物活性が完全に破壊され、化合物のＵＶスペクトルは大きく変化した（データは示していない）。高分解能質量スペクトルは、反応後の精製前に測定した。スペクトルは複雑であり還元生成物の混合物が存在すると思われたが、分子イオンが２６０質量単位で分子式Ｃ₁₃Ｈ₁₂Ｎ₂Ｏ₂Ｓになったことから、還元後にメトキシ基がなくなったことは明らかである。この場合も、メチルエステル官能性が存在することを示している。

塩基加水分解およびメチル化
エステルの存在を確認するために、本発明者らは、最初に化合物をＫＯＨで加水分解し、その生成物の生物活性を調べた。加水分解生成物の生物活性は完全に失われた（データは示していない）。本発明者らが加水分解生成物をジアゾメタンメチル化すると、リガンド活性の約６０％が回復し（データは示していない）、これよりエステル官能性の推測が裏付けられる。βＮＦに対して同じ処理を実施しても、生物活性の変化は検出されなかった。さらに、ブランクによる試験から、このような処理で生物活性が生じることはないことが分かった。

構造
分子イオン２８６．０３９９（Ｃ₁₄Ｈ₁₀Ｎ₂Ｏ₃Ｓ）を示す高解像度質量スペクトルから、プロトンが１０個しかない高度に縮合した構造であることが分かる。さらに、ＵＶ吸収スペクトルから高度の共役が存在することが分かる（図４Ｂ）。これらのうちの４つのプロトン（７．２７、７．２８、７．５０、および８．３６のプロトン）は６員芳香環と結合しているはずである。この環は、９．２５プロトンが結合する５員芳香環と縮合している。１４４の基準ピーク質量スペクトルはＣ₉Ｈ₆ＮＯで構成されるので、この５員環は窒素または酸素を有する複素環であるはずである。しかし、２つの炭素が直接酸素が結合した場合の化学シフトは、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣで得られるデータ（図６Ｂ）よりも高い値になる必要があるので、酸素が５員環の成分にはなり得ない。したがって、窒素は５員環の成分である必要があり、これによりインドール構造が形成される。組成Ｃ₉Ｈ₆ＮＯが１４４の基準質量ピークを満たすためには、５員環上の位置の１つがＣ＝Ｏ部分またはＣ−Ｏ部分のいずれかで置換されている必要がある。９．２５プロトンと８．３６プロトンの両方が高度に脱遮蔽されてることを考慮すれば、９．５プロトンと８．３６プロトンの間に基が存在する必要がある。したがって、９．２５プロトンは、窒素と置換炭素の間にある必要があり、このこともインドール構造であることを示している。

上記のＣ−Ｏ部分またはＣ＝Ｏ部分は、近隣のプロトンを脱遮蔽しない６員環のＣ−Ｏ、あるいは脱遮蔽力を有するケトン結合部分である可能性がある。インドール核に結合した炭素上にケトンが存在することは、インドール近傍の炭素上のケトンに特徴的である１５９３ｃｍ^-1の赤外バンド（図５Ｂ）によって支持されており、このような特徴は、３−ベンゾイルインドール（ＳＤＢＳデータベース、BergmanおよびVenemalm，1990）、（シクロヘキサ−１−エン−１−イル）−３−インドリルメタノン、および３−（E−２−メチルブタ−２−エノイル）インドール（BergmanおよびVenemalm，1990）などのモデル化合物により示されている。このケトンは別の５員複素環式芳香族環（チアゾールまたはイソチアゾールのいずれか）に結合する。

チアゾールとイソチアゾールのプロトンと炭素の両方の化学シフトと、脱遮蔽能力を有する２つの基で置換されることを考慮すれば、チアゾール構造の場合には８．６７プロトンが結合できるのは５位だけであると考えることができる。ケトンおよびメチルエステルのそれぞれの２位および４位に結合する場合、またはその逆の場合があり、チアゾールに関して２つの構造が可能となる。チアゾールの場合と同様に、８．６７プロトンは４位のみに結合すると考えることができるので、イソチアゾールに関しても２つの構造が可能となる。

ＨＭＢＣスペクトルから得られる８．６７プロトンと、これと直接結合する炭素との¹Ｈ−¹³Ｃ結合定数は約１９３Ｈｚである。本発明者らは、チアゾールの５位のプロトンと炭素の間の結合定数、およびイソチアゾールの４位のプロトンと炭素の間の結合定数を調べた。Faure, et al., (1978)およびTseng(1987)は、チアゾールの５位のプロトンと炭素の間の結合定数は約１９１Ｈｚであり、別の位置で異なる置換基があると１８８〜２００Ｈｚの範囲となり、イソチアゾールの４位のプロトンと炭素の間の結合定数は約１７３Ｈｚだけであり、別の位置で異なる置換基があると１６８〜１７１Ｈｚの範囲になると報告している。さらに、本発明者らは、構造に基づいてチアゾールとイソチアゾールの両方の理論的な結合定数を計算した。チアゾール構造で８．６７プロトンと、これと結合する炭素との間の理論的結合定数は１８５．４Ｈｚであり、イソチアゾール構造に基づいた場合は１７５．７Ｈｚである。両方の結合定数と、文献による実験値から判断すると、イソチアゾール構造の可能性はなくなった。チアゾール構造の場合、１つの構造は、チアゾールの２位がケトンで置換され４位がメチルエステルで置換されたシステインから誘導される（図７Ａ）。もう１つの構造は、図７Ａに示される置換と逆の順序の置換と関連する非システイン関連構造である。

化学シフトの理論計算の結果からは、システイン関連構造が実験値と最もよく一致しているといえる。文献の実験データからの根拠もこの推論を支持している。アルデヒド（この場合ではケトンと等価である）がチアゾールの２位と結合する場合、炭素２の化学シフトは１６６ｐｐｍであり炭素４の化学シフトは１４６ｐｐｍである（DondoniおよびPerrone，1995）。メチルエステルがチアゾールの４位に結合する場合、炭素４の化学シフトは１４６ｐｐｍであり、炭素２（メチル基が結合する）の化学シフトは１６７ｐｐｍである（MenschingおよびKalesse，1997）。本発明者らは、アルデヒド（またはケトン）がチアゾールの炭素２に結合し同時にメチルエステルが炭素４に結合する場合、システイン関連構造の配置と同様、炭素２と炭素４の化学シフトはそれぞれ１６６と１４６になり、この構造（図７Ａ）の計算値および測定値の両方の化学シフトと一致すると推測することができる。一方、アルデヒド（またはケトン）がチアゾールの４位と結合する場合、炭素４の化学シフトは１５５（Nicolaou, et al., 1997）または１５６（Millan, et al., 2000）である。チアゾールの２位がメチルエステルで置換された場合、炭素２の化学シフトは１５８ｐｐｍである（KellyおよびLang，1995）。したがって、アルデヒド（またはケトン）が４位に結合し、同時にメチルエステルが２位に結合する場合（非システイン関連構造の配置と同様）、炭素４と炭素２の化学シフトはそれぞれ１５５ｐｐｍと１５８ｐｐｍになり、この構造の計算値（１５８ｐｐｍと１６３ｐｐｍ）とよく一致する。したがって、実験データと計算した化学シフトから、正しい構造は図７Ａに示されるシステイン関連構造であることに疑いはなく、この構造が内因性Ａｈ受容体リガンドを表している。

図７Ａのリガンド構造は、３−ベンゾイルインドールの電子衝撃質量スペクトル（ＳＤＢＳデータベース、BergmanおよびVenemalm，1990）によってさらに支持される。この化合物の分子イオンは２２１質量単位である。ベンゼンを失った後に、ケトンと結合するインドールで構成されるイオンが生成すると、安定性が高いためすぐに１４４の基準ピークが現れる。この公知の化合物のさらに詳細な断片化パターンは本発明者らが精製したリガンドのパターンと正確に同じであり、１４４ピークからＣＯが失われて１１６ピークが現れ、１１６ピークからＣＨＮ（またはＣ₂ＨＮ）が失われて８９（または７７）ピークが現れる（ＳＤＢＳデータベース）。

従って、新規Ａｈ受容体リガンドは２−（１'−Ｈ−インドール−３'−カルボニル）−チアゾール−４−カルボン酸メチルエステルであると推定され、本発明者らは略してＩＴＥと呼ぶ。この構造を確認するため、化学合成を開始し、その合成化合物は、単離したものと同じ生物活性、および同じ物理的データが得られた。ＩＴＥの用量の関数としてのレポーター遺伝子活性を、βＮＦの場合と比較したものが図７Ｂに示されており、４時間のインキュベーション後（時間経過実験の最適の時点である）にβＮＦの約５倍の効力を示した（データは示していない）。Ａｈ受容体を介したＩＴＥの作用は、この化合物に対するレポーター遺伝子の応答が用量依存的にＡｈＲアンタゴニストの３'−メトキシ−４'−ニトロフラボン（ヘンリー(Henry), et al., 1999）によって阻害されることで示された（データは示していない）。

参考文献
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βＮＦおよび組織抽出物の細胞応答を示す一連のグラフである。ＡｈＲリガンド抽出および分析は実施例に記載されるように実施した。エラーバーは、３つの分析ウェルの結果の間の標準偏差を示している。各プロットは、多数実施した同様の実験を示している。図１Ａは、βＮＦ用量作用曲線を示す。縦軸は、相対光量単位(ＲＬＵ)で表現されるルシフェラーゼ活性である。横軸は、βＮＦ濃度（単位ｎｇ／２００μｌ細胞培養液）である。図１Ｂは、人工飼料を給餌したラットの肺組織１ｇからのメタノール抽出物のリガンド活性を示す。縦軸は、βＮＦ当量（単位ｎｇ）である。横軸は、肺−肺からの抽出物、ブランク−ブランク抽出による抽出物（肺組織を使用せずに肺の抽出と同様に抽出を行った）、ＤＭＳＯ−ＡｈＲリガンドの供給に使用したＤＭＳＯと同量のＤＭＳＯである。図１Ｃは、Ａｈ受容体リガンド活性のための予備的な器官の検査を示す。縦軸は、組織１ｇ中のＢＥＱ（βＮＦ当量（単位ｎｇ））である。横軸は、検査した器官である。図１Ｄは、組織のメタノール抽出物のリガンド活性に対する塩基処理の影響を示す。処理のクロロホルム相が示される。塩基と表示される処理は、実施例に概略が示される塩基で処理した。中和塩基（中和した塩基）と表示されているデータは、残分または試薬を加える前に最初に塩基を中和したことを除けば、塩基処理と同様に処理した。ブランクは、組織抽出物と同時に得られるブランク抽出物である。抽出物はメタノールによる組織抽出物である。縦軸は、βＮＦ当量（単位ｎｇ）である。横軸は、処理である。図１Ｅは、メタノール抽出物のリガンド活性に対する熱処理単独の影響を示す。縦軸は、人工飼料を給餌したラットの肺組織１ｇのβＮＦ当量（単位ｎｇ）である。横軸は、処理である。図１Ｆは、メタノール抽出物のリガンド活性に対する酸および熱処理の影響を示す。縦軸は、人工飼料を給餌したラットの肺組織１ｇのβＮＦ当量（単位ｎｇ）である。横軸は、処理である。 ＡｈＲリガンドの予備精製を示す一連のグラフである。図２Ａは、組織５，０００ｇからの酸および熱処理抽出物のシリカバッチ精製を示す。この手順の概略は実施例に示される。各フラクションのアリコートについて分析し、各フラクションの全活性を計算した。縦軸は、各フラクションのβＮＦ当量（単位μｇ）である。横軸は、バッチ精製のフラクションである。図２Ｂは、ＡｈＲリガンドのシリカ重力カラムクロマトグラフィー（１２０μｇＢＥＱ）を示す。実線は、異なるフラクションのリガンド活性である。破線は、クロロホルム中のメタノールの凸型グラジエントである。縦軸は、βＮＦ当量（単位μｇ）である。横軸は、フラクション番号（フラクション＃１〜＃７は各１２５ｍｌ、＃８〜＃８８は各２５ｍｌ、＃８９〜＃１０６は各１２５ｍｌ）である。第２の縦軸は、クロロホルム中のメタノール％である。 ＡｈＲリガンドのＨＰＬＣ精製を説明する一連のグラフである。ＨＰＬＣ精製の手順は実施例で説明した。図３Ａは、分取用シリカＨＰＬＣカラムおよびメタノールクロロホルム移動相による５０μｇＢＥＱのＡｈＲリガンドの精製を示す。実線は、異なるフラクションのリガンド活性である。破線は、クロロホルム中のメタノールのリニアグラジエントである。縦軸は、ＢＥＱ（βＮＦ当量（単位μｇ））におけるリガンド活性である。横軸は、フラクション番号（フラクション＃１〜＃５５は各１０ｍｌ、＃５６〜＃７５は各２０ｍｌ、流速＝１０ｍｌ／分）である。第２の縦軸は、クロロホルム中のメタノールの％値である。図３Ｂは、分取用シリカＨＰＬＣカラムおよびイソプロパノール：ヘキサン移動相による４０μｇＢＥＱのＡｈＲリガンドの精製を示す。実線は、異なるフラクションのリガンド活性である。破線は、ヘキサン中のイソプロパノールのリニアグラジエントである。縦軸は、ＢＥＱ（βＮＦ当量（単位μｇ））におけるリガンド活性である。横軸は、フラクション番号（フラクション＃１〜＃８０は各１０ｍｌ、＃８１〜＃１０５は各２０ｍｌ、流速＝１０ｍｌ／分）である。第２の縦軸は、ヘキサン中のイソプロパノールの％値である。図３Ｃは、分取用Ｃ１８ＨＰＬＣカラムと７５％メタノール水溶液を使用した２０μｇＢＥＱのＡｈＲリガンドの精製を示す。縦軸は、ＢＥＱ（単位μｇ）における異なるフラクションのリガンド活性である。横軸は、フラクション番号（フラクション＃１〜＃３０で各５ｍｌ、＃３１〜＃５５で各２０ｍｌ、流速：５ｍｌ／分（０〜６０分）、１０ｍｌ／分（６０〜９５分））である。図３Ｄは、分析用Ｃ１８ＨＰＬＣカラムと５０％アセトニトリル水溶液を使用した１０μｇＢＥＱのＡｈＲリガンドの精製を示す。縦軸は、３５６ｎｍにおけるＵＶ吸光度単位である。横軸は、保持時間（分）である。図３Ｅは、シアノＨＰＬＣカラムと１０％イソパノールのヘキサン溶液を使用した１０μｇＢＥＱのＡｈＲリガンドの精製を示す。縦軸は、３５６ｎｍにおけるＵＶ吸光度単位である。横軸は、保持時間（分）である。図３Ｆは、シアノＨＰＬＣカラムと６０％メタノール水溶液を使用した１０μｇＢＥＱのＡｈＲリガンドの精製を示す。縦軸は、３５６ｎｍにおけるＵＶ吸光度単位である。横軸は、保持時間（分）である。 精製したＡｈＲリガンドのＨＰＬＣクロマトグラムおよびＵＶスペクトルを示す一連のグラフである。図４Ａは、精製したＡｈＲリガンドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。ＨＰＬＣ操作条件は、実施例のＵＶ分光法に示される方法と同じであった。Ｘ軸は、保持時間（分）である。Ｙ軸は、検出波長（ｎｍ）である。Ｚ軸は、ＵＶ吸光度である。図４Ｂは、ＡｈＲリガンドのＵＶスペクトルを示す。データ取得手順の概略は実施例に示した。スペクトルは、ＵＶ吸光度が最大に到達する時間である約１０分のＨＰＬＣ保持時間で測定した。Ｘ軸は、波長（ｎｍ）である。Ｙ軸は、ＵＶ吸光度である。 電子衝撃質量スペクトルおよびＦＴ−ＩＲスペクトルを示す一連のグラフである。図５Ａは、ＡｈＲリガンドの高解像度電子衝撃質量スペクトルを示す。実施例の質量分析の項に説明するようにデータを取得し再プロットした。Ｘ軸は、質量と電荷の比ｍ／ｚである。Ｙ軸は、イオンの相対量。主要フラグメントの形成を示すためにスペクトルとともに概略構造を示している。提案されるフラグメント化経路をスペクトル下のマップに示している。図５Ｂは、Ａｈ受容体リガンドのＦＴ−ＩＲスペクトルを示す。データの取得は実施例に説明するように行った。Ｘ軸は、波数（ｃｍ^-1）で表現される赤外ビームの振動数である。１０００〜３０００ｃｍ^-1の領域がこの図に示されている。Ｙ軸は、吸光度である。明確な帰属が得られる信号については印を付けている。 プロトンＮＭＲスペクトル、およびプロトン−炭素１３の相関関係を示すグラフおよび表である。図６Ａは、ｄ−メタノール中のＡｈＲリガンドの¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。スペクトルは、実施例のＮＭＲ分光法に記載のようにして取得した。「溶媒」と印を付けたピークはＮＭＲ溶媒に起因する。プロトンの数および位置に起因する信号は印通りである。図６Ｂは、ＨＳＱＣスペクトルとＨＭＢＣスペクトルの両方からのＡｈＲリガンドの¹Ｈ−¹³Ｃの相関関係の表である。検出可能な関係があるプロトンおよび炭素１３を同じ行に記載している。見出しが「ＨＳＱＣ」の列の下に示される炭素１３は、対応するプロトン（同じ行）と直接連結する（１つの結合によって）炭素であり、見出しが「ＨＭＢＣ」の列の下の炭素は、２つまたは３つの結合によって対応するプロトンと連結している。 ＩＴＥの構造と、ＩＴＥおよびβＮＦの用量作用曲線を示す構造とグラフである。図７Ａは、内因性Ａｈ受容体リガンド２−（１'Ｈ−インドール−３'−カルボニル）−チアゾール−４−カルボン酸メチルエステルの構造を示す。ＡｈＲリガンドの化学構造には、プロトンおよび炭素１３の化学シフト（識別番号と同じ）が記載されている。図７Ｂは、４時間のインキュベート後のＩＴＥおよびβＮＦの用量作用曲線を示す。Ｘ軸は、アゴニスト濃度である。Ｙ軸は、相対光量単位（ＲＬＵ）で示される、アゴニストに対する受容体遺伝子の応答である。エラーバーは、３つの培養ウェルの結果の標準偏差を表している。

Claims (13)

1. 内因性Ａｈ受容体リガンドの調製物であって、前記内因性Ａｈ受容体リガンドが次式：
   

   

   を有する内因性Ａｈ受容体リガンドの調製物。
2. 前記調製物の純度が少なくとも９０％である請求項１の調整物。
3. 前記調製物の純度が少なくとも９５％である請求項２の調整物。
4. 前記リガンドが動物組織から単離されたものである請求項１の調製物。
5. Ａｈ受容体リガンド類似体の調製物であって、前記類似体が、下記Ｉ、II、およびIIIからなる群より選択される調整物。
   

   
6. 次式：
   

   

   を有する内因性Ａｈ受容体リガンドの調製方法であって、
   ａ）動物器官を入手してこれをホモジェナイズするステップであって、前記器官が前記Ａｈ受容体リガンドを含有し、これによってホモジェネートが形成されるステップ、
   ｂ）ステップ（ａ）の前記ホモジェネートを溶媒で抽出し、これによって抽出物が形成されるステップ、
   ｃ）前記抽出物を加熱するステップ、および、
   ｄ）クロロホルムグラジエントによって前記リガンドを精製するステップ
   を含む方法。
7. 前記動物器官が、肺、肝臓、脳、骨、および、筋肉からなる群より選択される請求項６
   の方法。
8. 前記抽出がメタノールを使用した抽出である請求項６の方法。
9. 前記抽出物が窒素ガスでフラッシュされ、撹拌され、および、遠心分離される請求項６
   の方法。
10. 前記抽出物が、Ｈ₂ＳＯ₄を加えて９０℃〜１１０℃の間の温度で加熱される請求項６の
    方法。
11. 前記抽出物がシリカバッチ精製によって精製される請求項６の方法。
12. 前記リガンドがＨＰＬＣカラムでさらに精製される請求項６の方法。
13. リガンド活性を測定するステップをさらに含む請求項６の方法。

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