JP2004527217A - 所望のコンホメーションで安定させた改変ポリペプチド及び該ポリペプチドの作製方法 - Google Patents

所望のコンホメーションで安定させた改変ポリペプチド及び該ポリペプチドの作製方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、少なくとも一つのジスルフィド結合をポリペプチドに導入することにより、タンパク質を所望のコンホメーションで安定させる方法を提供する。コンピュータ・デザインを用いて、どの位置にシステイン残基を導入すれば、ある一種のタンパク質コンホメーションのみでジスルフィドが形成され、ひいてはこのタンパク質を一定のコンホメーションで固定できるかを、特定する。従って、所望のタンパク質コンホメーションに特異的な抗体及び小分子治療薬が選択される。さらに本発明は、所望のコンホメーションで安定させた改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドも提供する。さらに本発明は、本発明の改変インテグリンＩ−ドメインを利用したスクリーニング検定及び治療法も提供する。

Description

【０００１】
関連出願
本出願は、引用によってその全文をここに援用することとする、２０００年９月１日出願の米国暫定特許出願第６０／２２９，７００号に基づく優先権を主張するものである。
【０００２】
発明の背景
インテグリン・ファミリーの接着分子は非共有結合的に結合したα／βヘテロ二量体である。今日までのところ、少なくとも１４種類の異なるインテグリンαサブユニットと８種類の異なるβサブユニットが報告されている（Ｈｙｎｅｓ， ＲＯ （１９９２） Ｃｅｌｌ ６９：１−２５）。リンパ球機能関連抗原１ （ＬＦＡ−１）は、白血球インテグリンサブファミリーのメンバーの一つである。白血球インテグリンサブファミリのメンバー間では、β２サブユニット（ＣＤ１８）は共通であるが、αサブユニットは異なっており、ＬＦＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐ１５０．９５ 及びαｄ／β２はそれぞれ、αＬ （ＣＤ１１ａ）、αＭ （ＣＤ１１ｂ）、αＸ （ＣＤ１１ｃ）及びαｄ を有する（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， ＴＡ （１９９０） Ｎａｔｕｒｅ ３４６：４２５−４３３； Ｌａｒｓｏｎ， ＲＳ ａｎｄ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， ＴＡ （１９９０） Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ １１４：１８１−２１７； Ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｉｅｒｅｎ， Ｍ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３：６８３−６９０）。これら白血球インテグリンは正常な免疫性及び炎症性応答に必須な幅広い接着上の相互作用を媒介する。
【０００３】
インテグリンα及びβサブユニットは両者とも、タイプＩ膜貫通型糖タンパク質であり、それぞれ大きな細胞外ドメインと、 一回膜貫通領域と、細胞質側の短い尾とを持つ。α及びβサブユニットの細胞外ドメインでは、構造上異なるドメインがいくつか、同定又は予測されてきた。
【０００４】
インテグリンαサブユニットのＮ末端領域は、それぞれ約６０個のアミノ酸が７回繰り返された部分を含有するが、これが折り畳まれて７枚の羽根のあるβ−プロペラドメインを形成していると予測されている（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， ＴＡ （１９９７） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：６５−７２）。白血球インテグリンαサブユニットであるα１、α２、α１０、α１１、及びαＥサブユニットは、約２００個のアミノ酸から成る挿入ドメイン即ちＩ−ドメインを含有する（Ｌａｒｓｏｎ， ＲＳ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０８：７０３−７１２； Ｔａｋａｄａ， Ｙ ｅｔ ａｌ． （１９８９） ＥＭＢＯ Ｊ ８：１３６１−１３６８； Ｂｒｉｅｓｅｗｉｔｚ， Ｒ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８：２９８９−２９９６； Ｓｈａｗ， Ｓ Ｋ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９：６０１６−６０２５； Ｃａｍｐｅｒ， Ｌ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３：２０３８３−２０３８９）。このＩ−ドメインは、β−プロペラドメインのβシート２と３との間に挿入されていると予測されている。αＭ、αＬ、α１及びα２のＩ−ドメインの三次元構造が解明されており、これが、金属イオン依存性接着部位（ＭＩＤＡＳ）と呼ばれる特有の二価陽イオン配位部位を持つジヌクレオチド結合折り畳み構造を採っていることが示されている （Ｌｅｅ， Ｊ−Ｏ， ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３：１３３３−１３４０； Ｌｅｅ， Ｊ−Ｏ， ｅｔ ａｌ． （１９９Ｓ） Ｃｅｌｌ ８０：６３１−６３８； Ｑｕ， Ａ ａｎｄ Ｌｅａｈｙ， ＤＪ （１９９５） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：１０２７７−１０２８１； Ｑｕ， Ａ ａｎｄ Ｌｅａｈｙ， ＤＪ （１９９６） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４：９３１−９４２； Ｅｍｓｌｅｙ， Ｊ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２：２８５１２−２８５１７； Ｂａｌｄｗｉｎ， ＥＴ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６：９２３−９３５； Ｋａｌｌｅｎ， Ｊ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９２：１−９）。αＭサブユニットのＣ末端領域は、βサンドイッチ構造に折り畳まれていると予測されている （Ｌｕ， Ｃ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３：１５１３８−１５１４７）。
【０００５】
インテグリンβサブユニットは、約２５０個のアミノ酸から成る保存ドメインをＮ末端部分に、そしてシステイン−リッチな領域をＣ末端部分に、含有する。β保存ドメイン、又はＩ様ドメインは、「Ｉドメインに似た」折り畳み構造を有していると予測されている （Ｐｕｚｏｎ−ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ， Ｗ ａｎｄ Ｔａｋａｄａ， Ｙ （１９９６） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１：２０４３８−２０４４３； Ｔｕｃｋｗｅｌｌ， ＤＳ ａｎｄ Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ， ＭＪ （１９９７） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４００： ２９７−３０３； Ｈｕａｎｇ， Ｃ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５：２１５１４−２４）。βサブユニットのＣ末端にあるシステイン・リッチな領域は、β１、β２及びβ３サブユニットに対する数多くの活性化抗体がこの領域に結合することから考えても、インテグリンの機能調節に重要であると思われる（Ｐｅｔｒｕｚｚｅｌｌｉ， Ｌ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５５：８５４−８６６； Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， ＭＫ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：１０８０−１０８５； Ｆａｕｌｌ， ＲＪ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１：２５０９９−２５１０６； Ｓｈｉｈ， ＤＴ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２２：１３６１−１３７１； Ｄｕ， Ｘ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８：２３０８７−２３０９２）。
【０００６】
インテグリンの電子顕微鏡像からは、α及びβサブユニットのＮ末端部分同士が折り畳まれて球形の頭部を形成し、この頭部が、α及びβ細胞外ドメインのＣ末端部分に相当する長さ約１６ｎｍの二本の棹状の尾によって、膜に繋がれていることが分かる（Ｎｅｒｍｕｔ， ＭＶ ｅｔ ａｌ． （１９８８）， ＥＭＢＯ Ｊ ７：４０９３−４０９９； Ｗｅｉｓｅｌ， ＪＷ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６７：１６６３７−１６６４３； Ｗｉｐｐｌｅｒ， Ｊ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９： ８７５４−８７６１）。
【０００７】
ＬＦＡ−１ はあらゆる白血球上に発現し、三種類のＩｇスーパーファミリーのメンバーである細胞間接着分子１、２及び３の受容体である （Ｍａｒｌｉｎ， ＳＤ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｃｅｌｌ ５１：８１３−８１９； Ｓｔａｕｎｔｏｎ， ＤＥ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３３９：６１ −６４； ｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ， ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １ ７４： ２５３−２６７）。多くのデータが、ＬＦＡ−１のＩ−ドメインがリガンドとの相互作用にとって重要であることを示している。変異誘発実験では、Ｉ−ドメイン内の残基 Ｍ１４０、Ｅ１４６、Ｔ１７５、Ｌ２０５、Ｅ２４１， Ｔ２４３、Ｓ２４５及びＫ２６３が、リガンド結合にとって重要であることが示唆された（Ｈｕａｎｇ， Ｃ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：１９００８−１９０１６； Ｅｄｗａｒｄｓ， ＣＰ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３：２８９３７−２８９４４）。これらの残基はＩ−ドメイン表面上に位置してＭｇ２＋イオンを取り囲み、Ｉ−ドメインの上側表面上でリガンド結合界面を規定している。リガンド結合におけるこのようなＩ−ドメインの重要性は、さらにｍＡｂ遮断実験でも明らかにされている。ＬＦＡ−１の、そのリガンドとの相互作用を阻害する ｍＡｂの多くはＩ−ドメインの位置に来る（Ｒａｎｄｉ， ＡＭ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９：１２３９５−１２３９８； Ｃｈａｍｐｅ， Ｍ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：１３８８−１３９４； Ｈｕａｎｇ， Ｃ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：１９００８−１９０１６； Ｅｄｗａｒｄｓ， ＣＰ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３：２８９３７−２８９４４）。二つのグループが最近、Ｉ−ドメインを削除したＬＦＡ−１はリガンド認識能及び結合能を欠いていることを示しており、ＬＦＡ−１機能におけるＩ−ドメインの役割がさらに実証された（Ｌｅｉｔｉｎｇｅｒ， Ｂ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ １１， ６７７−６９０； Ｙａｌａｍａｎｃｈｉｌｉ， Ｐ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５：２１８７７−８２）。Ｉ−ドメインを含有する他のインテグリンのＩ−ドメインも、リガンド結合における関与が指摘されている（Ｄｉａｍｏｎｄ， ＭＳ （１９９３） Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２０：５４５５５６； Ｍｉｃｈｉｓｈｉｔａ， Ｍ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｃｅｌｌ ７２：８５７−８６７； Ｍｕｃｈｏｗｓｋｉ， ＰＪ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９：２６４１９−２６４２３； Ｚｈｏｕ， Ｌ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９：１７０７５−１７０７９； Ｕｅｄａ， Ｔ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：１０６８０− １０６８４； Ｋａｍａｔａ， Ｔ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９：９６５９９６６３； Ｋｅｒｎ， Ａ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９：２２８１１−２２８１６）。
【０００８】
ＬＦＡ−１がＩＣＡＭに結合するには、ＬＦＡ−１の活性化が必要である。ＬＦＡ−１は、「インサイド・アウト」シグナリングと呼ばれる細胞質からのシグナルによって活性化する （Ｄｉａｍｏｎｄ， ＭＳ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４：５０６−５１７）。二価の陽イオンＭｎ２＋、Ｍｇ２＋及びＣａ２＋は、ＬＦＡ−１のリガンド結合機能を直接修飾することができる（Ｄｒａｎｓｆｉｅｌｄ， Ｉ ｅｔ ａｌ． （１９８９） ＥＭＢＯ Ｊ ８：３７５９−３７６５； Ｄｒａｎｓｆｉｅｌｄ， Ｉ ｅｔ ａｌ． （１９９２）． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１６：２１９−２２６； Ｓｔｅｗａｒｔ， ＭＰ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５６：１８１０−１８１７）。加えて、ＬＦＡ−１ は、αＬ又はβ２サブユニットの細胞外ドメインに結合するいくつかのｍＡｂによっても活性化する（Ｋｅｉｚｅｒ， ＧＤ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４０：１３９３− １４００； Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， ＭＫ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：１０８０−１０８５； Ａｎｄｒｅｗ， Ｄ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３：２２１７−２２２２； Ｐｅｔｒｕｚｚｅｌｌｉ， Ｌ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５５：８５４−８６６）。インテグリン活性化の分子機序はまだ余り理解が進んではいない。インテグリン活性化を伴うような分子内のコンホメーション上の変化が起きると、リガンドに対するインテグリンの親和性が増すことが提唱されているが、この考えは、活性化後のインテグリンしか認識しない抗体が存在することで裏付けられている （Ｄｒａｎｓｆｉｅｌｄ， Ｉ ｅｔ ａｌ． （１９８９） ＥＭＢＯ Ｊ ８：３７５９−３７６５； Ｄｉａｍｏｎｄ， ＭＳ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２０： ５４５−５５６； Ｓｈａｔｔｉｌ， ＳＪ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６０：１１１０７−１１１１４）。このような抗体の一つであるＣＢＲＬＦＡ−１／５ は、リガンド結合部位に非常に近いＭａｃ−１ Ｉ−ドメインに結合する （Ｏｘｖｉｇ， Ｃ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：２２１５−２２２０）が、このことは、Ｉ−ドメイン自体が、活性化によってコンホメーション上の変化を起こすことの更なる証拠である。
【０００９】
異なる二つの形の結晶型Ｍａｃ−１ Ｉ−ドメインが得られており、これら二つの構造はそれぞれ「活性」及び「不活性」コンホメーションではないかとの仮説が立てられた（Ｌｅｅ， Ｊ−Ｏ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３， １３３３−１３４０； Ｌｅｅ， Ｊ−Ｏ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｃｅｌｌ ８０：６３１−６３８）。Ｍｇ２＋と一緒に結晶化した「活性」型では、隣のＩ−ドメイン由来のグルタミン酸が６番目の金属配位部位となっているが、Ｍｎ２＋と錯体形成した「不活性」型コンホメーションでは、一個の水分子が金属配位領域を完成させる。このような金属配位の変化は、Ｃ末端αへリックスの大幅なシフトに関係がある。即ち、推定「活性」コンホメーションでは、Ｃ末端へリックスはＩ−ドメイン本体の１０オングストローム下に移動する（Ｌｅｅ， Ｊ−Ｏ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３：１３３３−１３４０）。活性化Ｍａｃ−１しか認識しないｍＡｂ ＣＢＲＭ−１／５をエピトープ・マッピングした結果、このコンホメーション上の違いは生理学的なものであることが示唆された （Ｏｘｖｉｇ， Ｃ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：２２１５−２２２０）。ＬＦＡ−１ Ｉ−ドメインの結晶構造及びＮＭＲ構造の有するコンホメーションは、Ｍａｃ１ Ｉ−ドメインの推定「不活性」コンホメーションに類似である（Ｑｕ， Ａ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：１０２７７−１０２８１； Ｑｕ， Ａ （１９９６） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４：， ９３１−９４２； Ｋａｌｌｅｎ， Ｊ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９２：１−９； Ｌｅｇｇｅ， ＧＢ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９５：１２５１−１２６４）。
【００１０】
インテグリンに加え、薬学的に重要な多くのタンパク質は、コンホメーション又はコンホーマと呼ばれる二つの代替的な三次元構造で存在する。これらのタンパク質は、しばしば、例えば小型Ｇタンパク質、三量体Ｇタンパク質αサブユニット、チロシンキナーゼ、及びＧタンパク質共役受容体など、重要なシグナリング機能を有する。典型的には、これらのコンホメーションのうちの一つに酵素活性又はエフェクター機能があって、他のものにはない。従って、例えば活性コンホメーションなど、ある特定のコンホメーションになったタンパク質に特異的な抗体又は小分子治療薬は、非選択的なものに比べて、大きな長所を有するであろう。
【００１１】
発明の概要
コンピュータ・デザインを利用して、あるタンパク質又はポリペプチドに、その分子が所望のコンホメーションで安定するようジスルフィド結合を導入することができる。従って、「開いた」もしくは活性コンホメーション、又は、「閉じた」もしくは不活性コンホメーションなど、ある所望のタンパク質コンホメーションに特異的な、抗ＬＦＡ−１抗体などの抗体又は小分子治療薬を同定することができる。
【００１２】
本発明は、あるタンパク質の機能ドメインを含むポリペプチドなどのポリペプチドを、所望のコンホメーションで安定させる方法に関するものである。本方法は、ポリペプチドが所望のコンホメーションで安定するよう、少なくとも一つのジスルフィド結合を当該ポリペプチドに導入するステップを含む。一の好適な実施態様では、前記ジスルフィド結合は、ポリペプチドのアミノ酸配列に少なくとも一つのシステイン置換を導入することにより、形成される。別の実施態様では、前記ジスルフィド結合のＣβ炭素間の距離が、３．００乃至８．０９オングストロームの範囲内である。別の実施態様では、前記ジスルフィド結合のＣβ炭素間の距離が、３．４１乃至７．０８オングストロームの範囲内である。
【００１３】
コンピュータ・デザインを利用して、あるタンパク質又はポリペプチドに、その分子が所望のコンホメーションで安定するようジスルフィド結合を導入することができる。従って、ある所望のタンパク質コンホメーションに特異的な抗体又は小分子治療薬を同定することができる。
【００１４】
本発明の方法は、インテグリンサブユニット、小型Ｇタンパク質、ヘテロ三量体Ｇタンパク質アルファサブユニット、チロシンキナーゼ、Ｇタンパク質共役受容体、アロステリック調節を受ける酵素、チモーゲン、補体Ｃ３、補体Ｃ４、及びフィブリノーゲンを含め、二つの異なる三次元コンホメーションで存在する多種の生物学的かつ薬学的に重要なタンパク質に幅広く応用できる。ある好適な実施態様では、当該ポリペプチドはインテグリンＩ−ドメインポリペプチドである。
【００１５】
別の局面では、本発明は、少なくとも一つのジスルフィド結合を導入することによって所望のコンホメーションで安定させた改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドを提供する。実施態様の一つでは、改変インテグリンＩ−ドメインは、ジスルフィド結合が形成されるよう野生型配列に比較して少なくとも一つのシステイン置換を含有したアミノ酸配列にコードされている。別の実施態様では、システインに置換する残基のＣβ炭素間の距離は、３．００乃至８．０９オングストロームの範囲内である。さらに別の実施態様では、ジスルフィド結合中のＣβ炭素間の距離は、３．４１乃至７．０８オングストロームの範囲内である。
【００１６】
一の実施態様では、本発明の改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドは、例えばα１、α２、α１０、α１１、αＤ、αＥ、αＬ（ＣＤ１１ａ）、αＭ（ＣＤ１１ｂ）、及びαＸ（ＣＤ１１ｃ）など、インテグリンαサブユニットのＩ−ドメインから誘導される。例えば、本発明の一実施態様では、改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドは、ヒトαＬサブユニットのＩ−ドメインから誘導され、アミノ酸置換Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ、Ｅ２８４Ｃ／Ｅ３０１Ｃ、Ｌ１６１Ｃ／Ｆ２９９Ｃ、Ｋ１６０Ｃ／Ｆ２９９Ｃ、Ｌ１６１Ｃ／Ｔ３００Ｃ、又はＬ２８９Ｃ／Ｋ２９４Ｃを含有する。本発明の別の実施態様では、改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドは、ヒトαＭサブユニットのＩ−ドメインから誘導され、アミノ酸置換 Ｑ１６３Ｃ／Ｑ３０９Ｃ、Ｄ２９４Ｃ／Ｑ３１１Ｃ、又はＱ１６３Ｃ／Ｒ３１３Ｃを含有する。
【００１７】
一の好適な実施態様では、本発明の改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドは、開いたコンホメーションで安定している。別の実施態様では、本発明の改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドは、閉じたコンホメーションで安定している。別の実施態様では、改変インテグリンＩ−ドメインは、リガンドに高親和結合する。さらに別の実施態様では、改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドは、異種ポリペプチドに作動的に連結している。
【００１８】
関連する一の局面では、本発明は、本発明の改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。
【００１９】
本改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド、及び／又は、その生物学的活性もしくは抗原性を有するフラグメントは、例えば、インテグリンが媒介する疾患の治療及び／又は診断に利用できる検定用試薬又は標的などとして、有用である。
【００２０】
従って、ある局面では、本発明は、開いたコンホメーションの改変インテグリンＩ−ドメインに選択的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。別の局面では、本発明は、開いたコンホメーションのインテグリンＩ−ドメインポリペプチド、閉じたコンホメーションのインテグリンＩ−ドメインポリペプチド、又は、改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド、に選択的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。一の実施態様では、本抗体は、インテグリンＩ−ドメイン上にある活性化特異的エピトープに結合する。別の実施態様では、本抗体はインテグリンとコグネイト・リガンドとの間の相互作用を阻害するものである。実施態様の一つでは、本抗体は、開いたもしくは閉じたコンホメーションのＬＦＡ−１ポリペプチド、又は改変ＬＦＡ−１ Ｉ−ドメインインテグリンポリペプチド、又はそのフラグメント、と反応又は結合する抗ＬＦＡ−１抗体など、抗ＬＦＡ−１抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【００２１】
別の局面では、本発明は、開いたコンホメーションで安定させた改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドに対するテスト化合物の結合能を検定するステップを含む、インテグリン活性のモジュレータを同定する方法を提供するものである。別の実施態様では、本発明は、インテグリンとコグネイト・リガンドとの間の相互作用を修飾することのできる化合物を同定する方法を提供し、この方法では、開いたコンホメーションで安定させた改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドに対するリガンドの結合が、テスト化合物の存在下及び非存在下で検定される。
【００２２】
別の局面では、本発明は、改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド又は抗インテグリンＩ−ドメイン抗体（又はその抗原結合フラグメント）を含んで成る組成物を提供するものであり、このような組成物には、さらに薬学的に許容可能な担体を含めることができる。
【００２３】
さらに別の局面では、本発明は、対象においてインテグリン媒介疾患（例えば炎症性又は自己免疫疾患）を治療又は予防する方法、又は、対象においてコグネイト・リガンドに対するインテグリンの結合を阻害する方法、に関するものであり、このとき本方法は、開いたコンホメーションで安定させた改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド、又は、開いたコンホメーションのインテグリンＩ−ドメインに選択的に結合する抗体（又はその抗原結合フラグメント）を、対象に治療上有効量、投与するステップを含む。一実施態様では、本抗体は、開いたコンホメーションのＬＦＡ−１ Ｉ−ドメインと特異的に反応もしくは結合する、又は、改変ＬＦＡ−１ Ｉ−ドメインポリペプチドと特異的に反応もしくは結合する、ＬＦＡ−１抗体又はその抗原結合フラグメントである。ある好適な実施態様では、本改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドは、リガンドに高親和結合する。別の好適な実施態様では、治療用の本改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドは、例えば融合タンパク質などの可溶性ポリペプチドである。
【００２４】
本発明の他の特徴及び長所は、以下の詳細な説明及び請求項から明白となるであろう。
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも部分的には、あるポリペプチドに少なくとも一つのジスルフィド結合を導入することにより、前記ポリペプチドを所望のコンホメーションで安定させる方法に基づくものである。一実施態様では、特定のタンパク質コンホメーションのＮＭＲ又は結晶構造に基づき、コンピュータ・デザインを利用して、前記タンパク質を特定のコンホメーションで固定するようなジスルフィド結合を導入する。ここで用いる「コンホメーション」又は「コンホーマ」とは、タンパク質の三次元構造を言う。「所望の」コンホメーションには、当該ポリペプチドの特定の使用に役立つようなタンパク質コンホメーションがあり、例えば、特定の生物学的機能及び／又は活性、又は治療効果を支えるようなコンホメーションである。ここで用いる用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は全体的に交換可能に用いられている。
【００２６】
ある実施態様では、所望のコンホメーションは、例えば開いたもしくは活性なコンホメーションなど、生物学的機能及び／又は活性を促進又は活性化するようなタンパク質コンホメーションである。別の実施態様では、所望のコンホメーションとは、例えば閉じた又は不活性のコンホメーションなど、生物学的機能及び／又は活性を阻害又は抑制するようなタンパク質コンホメーションである。
【００２７】
具体的には、本発明の方法は、あるタンパク質又はその機能ドメインを、前記タンパク質の所望の三次元構造のテンプレート上でモデル化するステップと、所望のコンホメーションの前記タンパク質上でのみ、ジスルフィド結合を形成できるシステインを導入することで、その特定のコンホメーションで前記タンパク質を安定させるステップと、を含む。ここでのタンパク質は、三次元構造が公知であるか、又は生成できれば、いかなるタンパク質又はそのドメインでもよいが、好ましくは、二つの異なるコンホメーションで存在するタンパク質であるとよい。タンパク質コンホメーションをデザイン及び／又はモデル化するためのコンピュータ・アルゴリズムは、例えばＷＯ ９８／４７０８９に記載されている。ＳＳＢＯＮＤ プログラム（Ｈａｚｅｓ， Ｂ ａｎｄ Ｄｉｊｋｓｔｒａ， ＢＷ （１９８８） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２：１１９−１２５） を用いると、適当な位置にある残基対をシステインに変異させることで、あるタンパク質構造にジスルフィド結合を導入できる位置を特定することができる。
【００２８】
ジスルフィド結合の形成は、あるポリペプチドの三次元構造内で適当な位置にある二つのシステイン残基同士の間で起きる。本発明の一実施態様では、ジスルフィド結合が形成されるよう、少なくとも一つのシステイン置換をアミノ酸配列に導入することにより、ポリペプチドを所望のコンホメーションで安定させる。ポリペプチドの天然アミノ酸配列中に、ジスルフィド結合を形成するのに適当な位置に既に一つのシステイン残基が存在している場合には、一箇所においてシステイン置換が行われる。好適な一実施態様では、ポリペプチドのアミノ酸配列中、ジスルフィド結合の形成が可能な位置で、二箇所のシステイン置換を導入して、このポリペプチドを所望のコンホメーションで安定させる。別の実施態様では、システインに置換する残基のＣβ炭素間の距離は３．００乃至８．０９オングストロームである。さらに別の実施態様では、当該ジスルフィド結合中のＣβ炭素間の距離は３．４１乃至７．０８オングストロームの範囲内である。
【００２９】
本発明の一実施態様では、タンパク質が特定のコンホメーションで安定するようにジスルフィド結合の形成が一のタンパク質コンホメーションでのみ優先的に起きるよう、システイン置換を導入する。
【００３０】
システイン置換の導入による本発明の改変ポリペプチドの調製は、好ましくは、目的のポリペプチド（例えばインテグリンポリペプチド）をコードするＤＮＡの変異誘発によって行われる。例えば、コードされたタンパク質に、一箇所又はそれ以上のアミノ酸置換、例えばシステイン置換、が導入されるよう、インテグリン遺伝子のヌクレオチド配列に一箇所又はそれ以上のヌクレオチド置換を導入することで、改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドをコードする単離された核酸分子を作製することができる。例えば部位指定変異誘発法及びＰＣＲ媒介変異誘発法など、標準的な技術により、変異を核酸配列に導入することができる。
【００３１】
適したタンパク質には、限定はしないが、産業上及び治療上重要なタンパク質、例えば１）小型Ｇタンパク質、三量体Ｇタンパク質アルファサブユニット、チロシンキナーゼ、及びＧタンパク質共役受容体などのシグナリング分子、２）アロステリック調節を受ける酵素、３）タンパク質開裂による活性化後にコンホメーションが変化するチモーゲン、例えば補体及び凝固カスケードのプロテアーゼ（コンバターゼ及び因子）及び４）補体成分Ｃ３及びＣ４やフィブリノーゲンなどのタンパク質分解により活性化するエフェクター分子、がある。一の実施態様では、例えば「開いた」コンホメーションなど、酵素活性があるか、又は、リガンド結合能及び／又はエフェクター機能を有するようなコンホメーションなど、生物学的に活性なコンホメーションでタンパク質を安定させることに本発明の方法を利用できる。別の実施態様では、 例えば「閉じた」コンホメーションなど、酵素として不活性であるか、又は、リガンド結合能及び／又はエフェクター機能を持たないようなコンホメーションなど、生物学的に不活性なコンホメーションでタンパク質を安定させることに本発明の方法を利用できる。
【００３２】
特定のコンホメーションで安定させたタンパク質は、例えば、プロテオーム・スクリーニング・テクノロジーなどに、用途があるであろう。組織及び疾患状態のプロテオーム・スクリーニングでは、活性なタンパク質コンホーマ又は不活性なタンパク質コンホーマなどに特異的な抗体、ポリペプチド及び／又は小分子を、様々な細胞シグナリング経路、代謝経路及び接着経路の活動を評価するのに利用できる。こうして、特定の疾患と、特定の生化学的経路及びシグナリング経路との間の関連性を見出すことができる。さらに本発明は、ここに解説した方法を用いて同定されたポリペプチド、抗体、及び小分子や、炎症性疾患などを治療するなど、同ポリペプチド、抗体、及び小分子の用途にも関するものである。コンホーマ特異的な試薬をチップに載せて、組織抽出物をスクリーニングするのに用いたり、又は組織切片を染色するのにも利用できる。さらに、開いたコンホーマ又は閉じたコンホーマなどの特定のコンホーマに対して選択的な薬物又は抗体、例えば改変ＬＦＡ−１ Ｉ−ドメインポリペプチドを特異的に認識する抗ＬＦＡ−１抗体などの改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドを特異的に認識する抗インテグリン抗体など、は、示差的な治療効果をもたらすであろう。従って、特定のコンホーマで安定させたタンパク質を用いた選択的スクリーニングアッセイを利用すれば、所望の活性を持つ化合物を合理的に得ることができる。
【００３３】
インテグリン
インテグリンは、リガンドを結合させない不活性なコンホメーションで細胞表面上に存在する。細胞が活性化すると、インテグリンは形（コンホメーション）を変えてリガンドを結合させるようになる。体内のすべての細胞で、選択的に発現する様々なインテグリンヘテロ二量体（α及びβサブユニットの組合せが異なる）は２０種を越える。活性化後、インテグリンは、細胞外マトリックス中の、又は、凝固もしくは補体カスケード中で凝集した他の細胞表面上のタンパク質リガンドに特異的に結合する。白血球上のインテグリンは、白血球の遊出や炎症及び免疫応答において中心的な重要性を持つ。 白血球インテグリンＭａｃ−１ （αＭβ２）のリガンドには、炎症関連細胞表面分子ＩＣＡＭ−１、補体成分ｉＣ３ｂ、及び凝固成分フィブリノーゲン、がある。白血球インテグリンＬＦＡ−１ （αＬβ２）のリガンドには、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、及びＩＣＡＭ−３、がある。白血球インテグリンに対する抗体は、細胞対細胞の相互作用や細胞対細胞外マトリックスの相互作用を、阻害するなど修飾するなどにより、多種の炎症性疾患及び自己免疫疾患を遮断することができる。血小板上のインテグリンは凝固及び心疾患で重要であり、認可薬には、抗体アブシキシマブ（ＲｅｏｐｒｏＴＭ） 及びペプチド様アンタゴニスト、エプティフィバチド（ＩｎｔｅｇｒｉｌｉｎＴＭ）がある。結合組織細胞、上皮細胞及び内皮細胞上のインテグリンは、これらの細胞に影響する疾患状態で重要である。これらは細胞成長、分化、創傷治癒、線維症、アポトーシス、及び脈管形成を調節する。癌細胞上のインテグリンは、浸潤及び転移を調節する。
【００３４】
インテグリンに拮抗するには、活性化したリガンド結合性コンホメーションに結合する薬物が必要である。大半の抗体は活性及び不活性のコンホメーションの両方に結合する。なぜなら、インテグリン分子の表面上のごく小さな部分しか形が変わらないからである。不活性なコンホメーションに結合すると、副作用が起きたり、抗イディオタイプ抗体が生成されたり、抗体のクリアランスが起きて、投与量を増やしたりしなければならないため、「開いた」コンホメーションなどの活性なインテグリンコンホメーションにのみ、抗体が結合するのが好ましい。
【００３５】
ここに記載した方法は、ジスルフィド結合を、ＬＦＡ−１及びＭａｃ−１などのインテグリンのＩドメインに導入するのに用いられ、成功を収めている。従って、別の局面では、本発明は、改変Ｉ−ドメインポリペプチドが所望のコンホメーションで安定するように少なくとも一つのジスルフィド結合を含有する改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドを提供するものである。本発明の改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドは、α１、α２、α１０、α１１、αＤ、αＥ、αＬ（ＣＤ１１ａ）、αＭ（ＣＤ１１ｂ）及びαＸ（ＣＤ１１ｃ）などのインテグリンαサブユニットのＩ−ドメインから誘導することができる。
【００３６】
ここで用いる「改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド」又は「改変インテグリンポリペプチド」には、少なくとも一つのジスルフィド結合が当該ポリペプチドに導入されたことで、当該Ｉ−ドメインが所望のコンホメーションで安定しているように、野生型配列、即ち天然状態に比べて変更されたインテグリンＩ−ドメインポリペプチドが含まれる。
【００３７】
ここで交換可能に用いられた用語「誘導された」又は「誘導体」とは、ある配列が、天然に存在する配列などの別の配列と同一であるか、又は、このような別の配列から改変されていることを意味することを意図している。本発明の範囲内の誘導体には、ポリヌクレオチド誘導体及びポリペプチド誘導体が含まれる。ポリペプチド誘導体又はタンパク質誘導体には、アミノ酸配列が記述済みもしくは公知であるか、又は配列に関係しない方法で記述済もしくは公知である、あるいはこれらの両方である、ような配列とは異なるが、当該ポリペプチド又はタンパク質の活性が残っているようなポリペプチド又はタンパク質配列が含まれる。一つ又はそれ以上のアミノ酸を異なる天然アミノ酸、アミノ酸誘導体又は非天然アミノ酸に置換した場合、アミノ酸配列での誘導体が生成される。いくつかの実施態様では、タンパク質誘導体には、一つ又はそれ以上の保存的アミノ酸置換がある点で、野生型配列とは配列が異なるが、当該タンパク質又はペプチドの二次構造又は疎水性に与えた影響は概ね最小限であるような天然発生型のポリペプチドもしくはタンパク質又はその生物学的に活性なフラグメントが包含される。さらに誘導体は、当該ポリペプチド又はタンパク質の生物学的活性を損なわないような一つ又はそれ以上の非保存的アミノ酸置換、欠失又は挿入がある点で異なる配列を含んでいてもよい。
【００３８】
保存的置換（置換基）には、典型的に、類似の特徴（例えば電荷、大きさ、形状、及び他の生物学的性質）を持つ別のアミノ酸に一個のアミノ酸を置換することが含まれる。例えば以下のグループ：バリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リシン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン；同士の置換である。非極性（疎水性）のアミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンがある。極性の中性のアミノ酸にはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンがある。正に耐電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リシン及びヒスチジンが含まれる。負に耐電した（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。
【００３９】
他の実施態様では、比較的保存的でないアミノ酸置換を持つ誘導体により、例えば電荷、コンホメーション及び他の生物学的性質に変化を起こすなどにより、所望の誘導体が得られることもある。このような置換には、例えば、親水性残基を疎水性残基に換える置換、システイン又はプロリンを別の残基に換える置換、小さな側鎖を有する残基を大型の側鎖を有する残基に換える置換、又は、実効正電荷を有する残基を実効負電荷を有する残基に換える置換、があるであろう。ある置換を行った結果を確実に予測できない場合、ここに開示した方法により、所望の特徴の有無を調べれば、その誘導体を容易に検定できよう。さらに本発明のポリペプチド及びタンパク質に、保存的又は非保存的のいずれにしろ、例えば挿入、欠失及び置換などの多種の変更を行うとそれらの使用時に有利である場合、このような改変を行ってもよい。
【００４０】
ある好適な実施態様では、改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドは開いたコンホメーションで安定させてあり、高い親和性でリガンドを結合させる。
【００４１】
一実施態様では、本発明の改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドは、野生型配列に比較して少なくとも一つのシステイン置換、そして好ましくは二つのシステイン置換、を含有するアミノ酸配列にコードされている。別の実施態様では、システインに置換する残基のＣβ炭素間の距離は、例えばタンパク質モデリングで予測したときなどに、３．００乃至８．０９オングストロームの範囲内である。更なる実施態様では、ジスルフィド結合中のＣβ炭素間の距離は、３．４１乃至７．０８オングストロームの範囲内である。
【００４２】
Ｉ−ドメインポリペプチドのアミノ酸配列中の適当な位置にシステイン残基を導入すると、例えば活性な「開いた」コンホメーションや、又は、不活性な「閉じた」コンホメーションなど、特定のコンホメーションでこのドメインを安定させるジスルフィド結合を形成させることができる。例えば、αＬ Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ、Ｅ２８４Ｃ／Ｅ３０１Ｃ、Ｌ１６１Ｃ／Ｆ２９９Ｃ、Ｋ１６０Ｃ／Ｆ２９９Ｃ、Ｌ１６１Ｃ／Ｔ３００Ｃ、及びＬ２８９Ｃ／Ｋ２９４Ｃ 変異型、及びαＭ Ｑ１６３Ｃ／Ｑ３０９Ｃ 及びＤ２９４Ｃ／Ｑ３１１Ｃ 変異型は、高いもしくは中程度の親和性でリガンドを結合させる「開いた」コンホメーションで安定しているが、αＬ Ｌ２８９Ｃ／Ｋ２９４Ｃ 変異型及びαＭ Ｑ１６３Ｃ／Ｒ３１３Ｃ 変異型は、リガンドを結合させない不活性即ち「閉じた」コンホメーションで安定し、一方でＥ２８４Ｃ／Ｅ３０１Ｃの親和性は、高親和性など、Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃのそれにほぼ匹敵する。Ｌ１６１Ｃ／Ｆ２９９Ｃ、Ｋ１６０Ｃ／Ｆ２９９Ｃ、及びＬ１６１Ｃ／Ｔ３００Ｃの親和性は、野生型よりも有意に高いが、高親和性αＬ Ｉ−ドメイン、Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃの２０乃至３０分の１である。Ｌ１６１Ｃ／Ｆ２９９Ｃ、Ｋ１６０Ｃ／Ｆ２９９Ｃ、及びＬ１６１Ｃ／Ｔ３００Ｃをここでは中間親和性αＬ Ｉ−ドメインと呼ぶ。
【００４３】
一の実施態様では、本発明は、インテグリンαサブユニット内に構成され、さらにインテグリンβサブユニットと結合され得る改変インテグリンＩ−ドメインを提供するものである。別の実施態様では、本発明の改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドは可溶性ポリペプチドである。さらに本発明は、異種ポリペプチドに作動的に連結された改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドを提供する。
【００４４】
実験データ（Ｈｕａｎｇ， Ｃ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５：２１５１４−２４） で裏付けられたインテグリンβ−サブユニットのＩ−様ドメインのモデルも作製されている。このデータは、Ｉドメイン中で劇的な１０オングストロームのコンホメーション上の移動を行う重要なＣ末端αへリックスの位置を確認している。Ｉドメイン及びＩ−様ドメインのこの領域でのアライメントは良好である。従って、別の局面では、本発明は、改変Ｉ−様ドメインポリペプチドを所望のコンホメーションで安定させるように、少なくとも一つのジスルフィド結合を含有させた改変インテグリンＩ−様ドメインポリペプチドを提供する。
【００４５】
ある好適な実施態様では、改変インテグリンＩ−様ドメインポリペプチドは、開いたコンホメーションで安定しており、高い親和性でリガンドを結合させる。実施態様の一つでは、本発明の改変インテグリンＩ−様ドメインポリペプチドは、野生型配列に比較して少なくとも一つのシステイン置換、そして好ましくは二つのシステイン置換、を含有するアミノ酸配列にコードされている。
【００４６】
ある実施態様では、本発明は、インテグリンβサブユニット内に構成され、さらにインテグリンαサブユニットと結合され得る改変インテグリンＩ−様ドメインを提供するものである。別の実施態様では、本発明の改変インテグリンＩ−様ドメインポリペプチドは可溶性ポリペプチドである。さらに本発明は、異種ポリペプチドに作動的に連結された改変インテグリンＩ−様ドメインポリペプチドを提供する。
【００４７】
インテグリンは数多くの疾患で鍵となるターゲットである。よって、本発明における分離された高親和Ｉ−ドメインや、活性化した白血球インテグリンに対して選択的な抗体又は小分子アンタゴニストを利用すると、自己免疫及び炎症性疾患、移植片拒絶、及び、血液量減少性ショック、心筋梗塞及び脳ショックの場合の虚血性／再潅流傷害を、阻害又は防止するなど、修飾することができる。さらに、天然のリガンドに結合させた高親和Ｉドメインの共結晶、及び／又は、小分子アンタゴニストを容易に生成でき、またこのような再結晶及び小分子アンタゴニストは、コンピュータ・ドラッグ・デザインを可能にし、薬物開発候補の改良及び向上に進歩をもたらすであろう。
【００４８】
従って、本発明は、開いたコンホメーションで安定させた改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドに対するテスト化合物の結合能を検定するステップを含む、インテグリン活性のモジュレータを同定する方法を提供する。別の実施態様では、本発明は、インテグリンとコグネイト・リガンドとの間の相互作用を修飾することのできる化合物を同定する方法を提供し、当該方法では、開いたコンホメーションで安定させた改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドに対するリガンドの結合を、テスト化合物の存在下及び非存在下で検定する。
【００４９】
さらに本発明は、改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドか、又は、開いたコンホメーションのＩ−ドメインなどの改変インテグリンＩ−ドメインに選択的に結合する高ＬＦＡ−１抗体（又はその抗原結合フラグメント）などの抗インテグリン抗体と、薬学的に許容可能な担体と、を含んで成る組成物を提供する。本発明の組成物は、本発明の治療法に用いられる。例えば本発明は、対象においてインテグリンが媒介する疾患（例えば炎症性又は自己免疫性疾患）を治療又は予防する方法、又は、対象においてコグネイト・リガンドに対するインテグリンの結合を阻害する方法を提供し、当該方法は、開いたコンホメーションで安定させた改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドか、又は、開いたコンホメーションのインテグリンＩ−ドメインに選択的に結合する抗インテグリン抗体（又はその抗原結合フラグメント）、を、治療上有効量、投与するステップを含む。ある好適な実施態様では、本改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドは、リガンドに高親和結合する。別の好適な実施態様では、治療用の本改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドは、融合タンパク質などの可溶性ポリペプチドである。
【００５０】
ここで用いる場合の、インテグリンが媒介する疾患には、例えば炎症性もしくは免疫系疾患、及び／又は、細胞増殖性疾患がある。インテグリンが媒介する疾患の例には、心筋梗塞、卒中、再狭窄、移植片拒絶、移植片対宿主疾患又は宿主対移植片疾患、及び再潅流傷害、がある。炎症性又は免疫系疾患には、限定はしないが、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、敗血症又は外傷に続発する多臓器傷害症候群、ウィルス感染、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、白血球接着欠陥ＩＩ症候群、熱損傷、血液透析、白血球搬出、腹膜炎、慢性閉塞性肺疾患、肺炎、喘息、急性虫垂炎、急性炎症成分を伴う皮膚病、創傷治癒、敗血性ショック、急性腎炎、腎炎、アミロイド症、反応性関節炎、リウマチ性関節炎、慢性気管支炎、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、強皮症、狼瘡、多発性筋炎、ライター症候群、乾癬、皮膚炎、骨盤炎症疾患、炎症性乳房疾患、眼窩炎症性疾患、免疫不全疾患（例えばＨＩＶ、後天性免疫不全、先天性Ｘ染色体小児性低ガンマグロブリン血症、一過性低ガンマグロブリン血症、選択性免疫グロブリンＡ欠損症、壊死性小腸大腸炎、顆粒球輸血随伴性症候群、サイトカイン誘導性傷害、慢性粘膜皮膚カンジダ症、重症複合型免疫不全）、自己免疫疾患、及び急性化膿性髄膜炎又は他の中枢神経系炎症疾患、がある。
【００５１】
「細胞増殖性疾患」には、細胞の増殖、活性化、接着、成長、分化、又は移動のプロセスに影響を与える疾患が含まれる。ここで用いる場合の「細胞の増殖、活性化、接着、成長、分化、又は移動のプロセス」とは、細胞が数、大きさ、活性化状態、又は内容量を増すプロセス、細胞が他の細胞のそれとは異なる一組の特化した特徴を生ずるプロセス、又は、細胞が特定の位置又は刺激に近寄る又は遠ざかるプロセス、である。疾患は、成長、活性化、接着、分化、又は移動の調節異常を特徴とする。このような疾患には、癌、例えば癌腫、肉腫、リンパ腫又は白血病があるが、その例には、限定はしないが、例えば乳房、子宮内膜、卵巣、子宮、肝臓、胃腸管、前立腺、結腸直腸、及び肺の癌、黒色腫、神経線維腫、腺腫様多発結腸ポリープ、ウィルムス腫瘍、腎芽細胞腫、奇形腫、横紋筋肉腫；腫瘍の浸襲、脈管形成及び転移；骨格形成異常；造血系及び／又は骨髄増殖性疾患、がある。
【００５２】
本発明の多様な局面を、以下の小節でさらに詳述することとする。
【００５３】
改変インテグリン Ｉ− ドメインポリペプチド及び抗インテグリン Ｉ− ドメイン抗体
本発明の方法は、分離された改変インテグリンポリペプチド、及びその生物学的活性部分の使用を包む。ここで用いる場合の改変インテグリンポリペプチドは、改変Ｉ−ドメインポリペプチド及び改変Ｉ−様ドメインポリペプチドを包含する。本発明の改変インテグリンポリペプチドは、それぞれインテグリンα又はβサブユニットポリペプチド内に構成された改変インテグリンＩ−ドメイン及びＩ−様ドメインポリペプチド；可溶性の改変インテグリンＩ−ドメイン及びＩ−様ドメインポリペプチド；及び、融合タンパク質など、異種ポリペプチドに作動的に連結された改変インテグリンＩ−ドメイン及びＩ−様ドメインポリペプチド、を包含するものである。
【００５４】
多数のヒトインテグリンα及びβサブユニットポリペプチドのｃＤＮＡのクローンが作製され、配列決定されて、そのポリペプチド配列が決定されている（例えばジェンバンク登録番号：ＮＭ＿００２２０３ （α２）、ＡＦ１１２３４５ （α１０）、ＮＭ＿０１２２１１ （α１１）、ＮＭ＿００５３５３ （αＤ）、ＮＭ＿００２２０８ （αＥ）、ＮＭ＿０００８８７ （αＸ）、ＮＭ＿０００６３２ （αＭ）、ＮＭ＿００２２０９ （αＬ）、Ｘ６８７４２ 及び Ｐ５６１９９ （α１）、ＮＭ＿０００２１１ （β２）、ＮＭ＿０００２１２ （β３）、ＮＭ＿００２２１４ （β８）を参照されたい）。具体的には、ヒトαＬ及びαＭをコードするポリペプチド配列を、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ （ジェンバンク登録番号Ｐ２０７０１）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４ （ジェンバンク登録番号Ｐ１１２１５）に記載してある。加えて、他の種由来のインテグリンα及びβサブユニットポリペプチドをコードする配列も、当該技術分野において入手できる。さらに、前述したように、αＭ、αＬ、α１及びα２ のＩ−ドメインの三次元構造が解明されている（Ｌｅｅ， Ｊ−Ｏ， ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３：１３３３−１３４０； Ｌｅｅ， Ｊ−Ｏ， ｅｔ ａｌ． （１９９Ｓ） Ｃｅｌｌ ８０：６３１−６３８； Ｑｕ， Ａ ａｎｄ Ｌｅａｈｙ， ＤＪ （１９９５） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：１０２７７−１０２８１； Ｑｕ， Ａ ａｎｄ Ｌｅａｈｙ， ＤＪ （１９９６） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４：９３１−９４２； Ｅｍｓｌｅｙ， Ｊ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２：２８５１２−２８５１７； Ｂａｌｄｗｉｎ， ＥＴ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６：９２３−９３５； Ｋａｌｌｅｎ， Ｊ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９２：１−９）。
【００５５】
本発明の分離された改変インテグリンポリペプチドは、好ましくは、天然インテグリンポリペプチドのアミノ酸配列に充分同一であるが、当該ポリペプチドを所望のコンホメーションで安定させるジスルフィド結合が形成されるよう、少なくとも一つ、そして好ましくは二つのシステイン置換を含むようなアミノ酸配列を有するとよい。ここで用いる用語「充分同一である」とは、あるアミノ酸（又はヌクレオチド）配列が、インテグリンアミノ酸（又はヌクレオチド）配列と同一又は同等（例えば類似の側鎖を有するアミノ酸残基など）アミノ酸残基（又はヌクレオチド）を充分もしくは最小限の数、含有する結果、これらポリペプチドが天然インテグリンポリペプチドと共通の構造ドメイン又はモチーフ、及び／又は共通の機能的活性を有することを言う。例えば、少なくとも３０％、４０％、又は５０％、好ましくは６０％、より好ましくは７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％又はそれより大きい同一性を有し、（例えばここに解説した通りの改変インテグリンＩ−ドメイン又はＩ−様ドメインの活性など）共通の機能的活性を有するアミノ酸又はヌクレオチド配列が、充分に同一である、とここに定義しておく。インテグリンＩ−ドメインポリペプチドは、天然のアレルの違い又は変異誘発のために、ここに開示したインテグリンポリペプチドとはアミノ酸配列が異なることもある。
【００５６】
二つのアミノ酸配列又は二つの核酸配列のパーセント同一性を決定するには、最適な比較が行えるように、これら配列をアライメントする（最適なアライメントを行うには第一及び第二のアミノ酸又は核酸配列の一方又は両方にギャップを導入してもよく、同一でない配列は、比較を目的にしたときは無視してもよい）。ある好適な実施態様では、基準配列のうちで比較用にアライメントする長さは、基準配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、又は９０％である。次に、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第一の配列中のある一つの位置に、第二の配列中の対応する位置にあるのと同じアミノ酸残基又はヌクレオチドが来ていれば、それら分子はその位置において同一であることになる（ここで用いる場合のアミノ酸又は核酸の「同一性」は、アミノ酸又は核酸の「ホモロジー」と同等である）。二つの配列間のパーセント同一性は、これら二つの配列を最適にアライメントするのに導入せねばならないギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮に入れたときの、これら配列に共通の同一位置の数の関数である。
【００５７】
二つの配列間の配列の比較及びパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。ある好適な実施態様では、二つのアミノ酸配列間のパーセント同一性を、ＧＣＧソフトウェア・パッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手できる）のＧＡＰプログラムに組み込まれたニードルマン及びワンシュ （Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （４８）：４４４−４５３ （１９７０））のアルゴリズムを用い、Ｂｌｏｓｓｏｍ ６２ 行列又はＰＡＭ２５０行列を用いて、ギャップ・ウェイトを１６、１４、１２、１０、８、６、又は４にし、レングス・ウェイトを１、２、３、４、５、又は６にして、決定する。さらに別の好適な実施態様では、二つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性を、ＧＣＧソフトウェア・パッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手できる）のＧＡＰプログラムを用い、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ 行列を用いて、ギャップ・ウェイトを４０、５０、６０、７０、又は８０ にし、そしてレングス・ウェイトを１、２、３、４、５、又は６にして決定する。別の実施態様では、二つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間のパーセント同一性を、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれた Ｅ． マイヤース及びＷ． ミラーのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ．， ４：１１−１７ （１９８８）） を用い、ＰＡＭ１２０ ウェイト残基表を用いて、ギャップ・レングス・ペナルティを１２、そしてギャップ・ペナルティを４にして、決定する。
【００５８】
ここで用いる場合の、ある改変インテグリンポリペプチド（例えば改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド）の「生物学的活性部分」とは、改変インテグリンポリペプチドの活性を保持した改変インテグリンポリペプチドの一フラグメントを包含するものである。典型的には、改変インテグリンポリペプチドの生物学的活性部分は、リガンド結合など、改変インテグリンポリペプチドの少なくとも一つの活性を持つ少なくとも一つのドメイン又はモチーフを含んで成るものである。ある好適な実施態様では、改変インテグリンポリペプチドの生物学的活性部分には、改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドが含まれる。改変インテグリンポリペプチドの生物学的活性部分は、改変インテグリンポリペプチドのアミノ酸配列と充分同一もしくはそれに由来するアミノ酸配列を含んで成り、完全長改変インテグリンポリペプチドよりも少ないアミノ酸を含有し、改変インテグリンポリペプチドの少なくとも一つの活性を呈するであろう。改変Ｉ−ドメイン又はＩ−様ドメインなど、改変インテグリンポリペプチドの生物学的活性部分は、リガンド結合、細胞間接着や、細胞と細胞外マトリックスの接着などの接着、及び／又は、シグナリング活性などのインテグリンポリペプチド活性を修飾する薬剤を開発するためのターゲットとして利用できる。改変インテグリンポリペプチドの生物学的活性部分は、遺伝子組換え技術で調製でき、かつ、改変インテグリンポリペプチドの機能的活性の一つ以上について評価できる一ポリペプチドを含んで成る。
【００５９】
ある好適な実施態様では、改変インテグリンポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術で調製される。例えば、改変インテグリンポリペプチド（例えばＩ−ドメインポリペプチド又は可溶性Ｉ−ドメイン融合たんぱくなど）をコードするポリヌクレオチド配列をトランスフェクトしたホスト細胞から、標準的なタンパク質精製技術を用いた、適当な精製スキームを利用して改変インテグリンポリペプチドを単離することができる。組換え発現の代わりに、標準的なペプチド合成技術を利用して改変インテグリンポリペプチドを化学合成することもできる。
【００６０】
「単離された」または「精製された」ポリペプチド又はタンパク質、あるいはその生物学的活性部分は、改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドが由来する細胞源などのソースにある細胞性物質又は他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、あるいは、化学合成した場合には前駆化学物質又は他の化学物質を実質的に含まないものである。「細胞性物質を実質的に含まない」という文言は、当該タンパク質が、それが単離もしくは組換え生産された基の細胞の細胞成分から分離されているような、改変インテグリンポリペプチドの調製品を包含するものである。一実施態様では、「細胞性物質を実質的に含まない」という文言は、（未改変のインテグリンポリペプチドここでは「夾雑タンパク質」とも言及された）を約３０％未満（乾燥重量で）、より好ましくは、未改変のインテグリンポリペプチドを約２０％未満、さらにより好ましくは未改変のインテグリンポリペプチドを約１０％未満、そして最も好ましくは未改変のインテグリンポリペプチドを約５％有するような、改変インテグリンポリペプチドの調製品を包含する。改変インテグリンポリペプチド又はその生物学的活性部分を組換え生産した場合、培地を実質的に含まないことが好ましく、即ち、タンパク質調製品の体積のうちで培地の占める割合が、約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、そして最も好ましくは約５％未満であるとよい。
【００６１】
「前駆化学物質又は他の化学物質を実質的に含まない」という文言は、当該タンパク質の合成に関与する前駆化学物質又は他の化学物質から当該タンパク質が分離されている、改変インテグリンポリペプチド調製品を包含する。一実施態様では、文言「前駆化学物質又は他の化学物質を実質的に含まない」は、約３０％未満（乾燥重量で）の前駆化学物質又は未改変インテグリンポリペプチド化学物質、より好ましくは約２０％未満の前駆化学物質又は未改変インテグリンポリペプチド化学物質、さらにより好ましくは約１０％未満の前駆化学物質又は未改変インテグリンポリペプチド化学物質、そして最も好ましくは約５％未満の前駆化学物質又は未改変インテグリンポリペプチド化学物質、を有する改変インテグリンポリペプチドの調製品を包含する。
【００６２】
本発明の方法では、さらにキメラタンパク質又は融合タンパク質である改変インテグリンポリペプチドを使用してもよい。ここで用いる場合の改変インテグリン「キメラタンパク質」又は「融合タンパク質」は、異種ポリペプチドなどの未改変のインテグリンポリペプチドに作動的に連結させた改変インテグリンポリペプチドを含んで成る。ある好適な実施態様では、改変インテグリン融合タンパク質は、少なくとも一つのＩ−ドメイン又は一つのＩ−様ドメインを含んで成る。融合タンパク質内で、「作動的に連結させた」とは、当該改変インテグリンポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とが、相互にインフレームで融合されていることを指すことを意図している。異種ポリペプチドは、改変インテグリンポリペプチドのＮ末端に融合させても、Ｃ末端に融合させてもよい。
【００６３】
例えば、ある好適な実施態様では、前記融合タンパク質は、例えば免疫グロブリン（例えばＩｇＧ１）のヒンジ、Ｃ１及びＣ２配列などのＦｃ領域を、改変インテグリン配列のＣ末端に融合してある改変インテグリンＩ−ドメイン融合タンパク質である。インテグリン免疫グロブリンキメラは、基本的にはＷＯ ９１／０８２９８に解説された通りに構築することができる。このような融合タンパク質があると、組換え改変インテグリンポリペプチドの精製が簡便となる。別の実施態様では、前記融合タンパク質は、当該融合タンパク質が細胞表面上に発現するよう、異種の膜貫通ドメインに融合してある改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドである。
【００６４】
本発明の改変インテグリンポリペプチド及び融合タンパク質を医薬組成物中に組み込み、対象にインビボで投与することもできる。ある実施態様では、開いた、リガンド結合型のコンホメーションで安定させた可溶性の改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドか、又はその融合タンパク質を、対象のインテグリン活性（例えばコグネイト・リガンドに対するインテグリンの結合）を修飾するのに利用され得る。別の実施態様では、可溶性の改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド又は融合タンパク質を、炎症性疾患や、自己免疫疾患などの免疫系の疾患を治療するのに利用できよう。別の実施態様では、可溶性改変インテグリンポリペプチド又は融合タンパク質を、細胞増殖性疾患を治療するのに利用できよう。さらに、可溶性改変インテグリンポリペプチド及び融合タンパク質の使用を利用して、ＩＣＡＭなどインテグリンリガンドの生物学的利用能に影響を与えることもできる。
【００６５】
さらに、本発明の改変インテグリンポリペプチド及び融合タンパク質を、対象において抗ＬＦＡ−１抗体などの抗インテグリン抗体を産生させる免疫原として用いたり、インテグリン活性を修飾する分子、及び／又は、インテグリンリガンド又は受容体とのインテグリンポリペプチドの相互作用を修飾する分子、を同定するスクリーニング検定に用いることもできる。
【００６６】
好ましくは、本発明の改変インテグリン融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術で作製される。例えば、連結に平滑末端又は付着末端を利用すること、制限酵素消化を行って適した末端にすること、付着末端を適宜充填すること、アルカリホスファターゼ処理して不要な接合を防ぐこと、酵素による連結を行うことなどの常法で異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片を相互にインフレームで連結する。別の実施態様では、自動化ＤＮＡ合成装置を含む従来技術により、融合遺伝子を合成することもできる。代替的には、二本の連続した遺伝子断片の間に相補的な張り出し部を生ずるようなアンカー・プライマーを用いて遺伝子断片のＰＣＲ増幅を行い、その後これら断片をアニールし、再増幅してキメラ遺伝子配列を作製することもできる（例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｅｄｓ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ： １９９２を参照されたい）。さらに、最初から一融合成分（例えばＧＳＴポリペプチド）をコードしている多くの発現ベクタが市販されている。このような融合成分が改変インテグリンポリペプチドにインフレームで連結されるよう、改変インテグリンポリペプチドをコードする核酸をこのような発現ベクタ内にクローンすることもできる。
【００６７】
さらに本発明の方法には、インテグリン・アゴニスト（ミメティック）又はインテグリン・アンタゴニストのいずれかとして機能する改変インテグリンポリペプチドの使用を含み得る。インテグリンポリペプチドのアゴニストには、天然発生型のインテグリンポリペプチドの生物学的活性と実質的に同じ活性を維持していても、又は、その一部分を維持していてもよい。インテグリンポリペプチドのアンタゴニストは、例えばインテグリン活性を競合的に修飾するなどにより、天然型のインテグリンポリペプチドの活性のうちの一つ又はそれ以上を阻害することができる。このように、所望のコンホメーションで安定させた改変インテグリンポリペプチドで処理すると、特定の生物学的効果を引き出すことができる。
【００６８】
改変ＬＦＡ−１ポリペプチドなどの分離された改変インテグリンポリペプチド、又はその一部分もしくはフラグメントを免疫原として用い、ポリクローナル及びモノクローナル抗体作製のための標準的な技術を利用すると、インテグリンＩ−ドメインなどの特定のコンホメーションのインテグリンに結合する抗体を生成させることができる（概略的には、Ｒ． Ｈ． Ｋｅｎｎｅｔｈ， ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８０）； Ｅ． Ａ． Ｌｅｒｎｅｒ （１９８１） Ｙａｌｅ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ．， ５４：３８７−４０２； Ｍ． Ｌ． Ｇｅｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９７７） Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ． ３：２３１−３６を参照されたい）。さらに、当業者であれば、このような方法の変更例を数多く知るところであり、このような変法も有用であろう。抗ＬＦＡ−１の調製は、例えば、その内容全文を引用をもってここに援用することとする米国特許第５，６２２，７００号に解説されている。
【００６９】
ここで用いる用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子や、免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、即ち、開いた又は閉じたコンホメーションのインテグリンＩ−ドメイン、又は改変インテグリンＩ−ドメイン、例えばＬＦＡ−１ Ｉ−ドメイン、例えば開いた又は閉じたＬＦＡ−１ Ｉ−ドメイン、又は、ＬＦＡ−１の改変インテグリンＩ−ドメイン、などの抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子、を言う。免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分の例には、抗体をペプシンなどの酵素で消化して生成できる Ｆ（ａｂ）及びＦ（ａｂ）’２フラグメントがある。本発明は、改変ＬＦＡ−１ポリペプチド又はその一部分もしくはフラグメントなどの改変インテグリンポリペプチドに結合するポリクローナル及びモノクローナル抗体を提供する。ここで用いる用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」とは、改変ＬＦＡ−１ポリペプチド又はその一部分もしくはフラグメントなどの改変インテグリンポリペプチドの特定のエピトープと免疫反応できる抗原結合部位を一種しか含まない一集団の抗体分子を言う。従って、モノクローナル抗体組成物は、典型的には、免疫反応する相手である特定の改変インテグリンポリペプチド又はその一部分もしくはフラグメントに対して、単一の結合親和性を呈する。
【００７０】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製する代わりに、組換えコンビナトリアル免疫グロブリン・ライブラリ（例えば抗体ファージディスプレイライブラリ）を、例えば開いたコンホメーションで安定させた改変インテグリンＩ−ドメインなど、改変インテグリンポリペプチドでスクリーニングすれば、モノクローナル抗インテグリン抗体を同定及び単離でき、ひいては開いたコンホメーションなどのインテグリンポリペプチド上のコンホメーション特異的エピトープに結合する免疫グロブリンライブラリメンバを単離することができる。ファージディスプレイライブラリを作製及びスクリーニングするキットは市販されている（例えばファルマシア・リコンビナント・ファージ・アンティボディ・システム、カタログ番号２７−９４００−０１；及びストラタジーンＳｕｒｆＺＡＰＴＭファージ・ディスプレイ・キット、カタログ番号２４０６１２）。ジスルフィド結合によって高親和性コンホメーションで固定されたインテグリンＩ−ドメインを持つファージ・ライブラリをスクリーニングする際は、ジスルフィドを破壊してＩ−ドメインの高親和性コンホメーションを無くす還元試薬を加えたときに、特定のファージを溶離できなければならないことに留意されたい。
【００７１】
加えて、抗体ディスプレイライブラリを作製及びスクリーニングするための使用に特に適する方法及び試薬の例は、例えばラドナー氏らの米国特許第５，２２３，４０９号；カン氏らのＰＣＴ 国際公報Ｎｏ． ＷＯ ９２／１８６１９；ダワー氏らのＰＣＴ国際公報Ｎｏ． ＷＯ ９１／１７２７１；ウィンター氏らのＰＣＴ国際公報ＷＯ ９２／２０７９１；マークランド氏らのＰＣＴ国際公報Ｎｏ． ＷＯ ９２／１５６７９；ブレイトリング氏らのＰＣＴ国際公報ＷＯ ９３／０１２８８；マッカファーティ氏らの ＰＣＴ国際公報Ｎｏ． ＷＯ ９２／０１０４７；ジェラード氏らのＰＣＴ国際公報Ｎｏ． ＷＯ ９２／０９６９０；ラドナー氏らのＰＣＴ 国際公報Ｎｏ． ＷＯ ９０／０２８０９；Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０−１３７２； Ｈａｙ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｈｕｍ． Ａｎｔｉｂｏｄ． Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１−８５； Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１； Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ． （１９９３） ＥＭＢＯ Ｊ １２：７２５−７３４； Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２６：８８９−８９６； Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８； Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：３５７６−３５８０； Ｇａｒｒａｄ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７３−１３７７； Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １９：４１３３−４１３７； Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：７９７８−７９８２； 及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ （１９９０） ３４８：５５２−５５４に見ることができる。
【００７２】
さらに、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製できる、ヒト及び非ヒト部分の両方を含んで成る、キメラ及びヒト化モノクローナル抗体などの組換え抗インテグリン抗体も、本発明の方法に利用できる。このようなキメラ及びヒト化モノクローナル抗体は、例えばロビンソン氏らの国際出願Ｎｏ． ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；アキラ氏らのヨーロッパ特許出願１８４，１８７；タニグチ．Ｍ氏らのヨーロッパ特許出願１７１，４９６；モリソン氏らのヨーロッパ特許出願１７３，４９４；ノイベルガー氏らのＰＣＴ国際公報Ｎｏ． ＷＯ ８６／０１５３３；キャビリー氏らの米国特許第４，８１６，５６７号；キャビリー氏らのヨーロッパ特許出願１２５，０２３；Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３； Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：３４３９−３４４３； Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３９：３５２１−３５２６； Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：２１４−２１８； Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｃａｎｃ． Ｒｅｓ． ４７：９９９−１００５； Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４４９； ａｎｄ Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８０：１５５３−１５５９）； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ． Ｌ． （１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−１２０７； Ｏｉ ｅｔ ａｌ． （１９８６） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４； ウィンター氏らの米国特許第５，２２５，５３９号； Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２−５２５； Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４； 及びＢｅｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４１：４０５３−４０６０に解説された方法を用いるなど、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術によって作製できる。
【００７３】
ある好適な実施態様では、本発明の抗インテグリン抗体は、活性化したインテグリンに固有のエピトープ（ここでは活性化特異的エピトープとも呼ばれる）など、開いた、高親和性コンホメーションのインテグリンＩ−ドメインに選択的に結合する。ある好適な実施態様では、本発明の抗インテグリン抗体は、活性化インテグリンとそのコグネイト・リガンドとの間の結合相互作用を修飾する（例えば阻害するなど）。別の実施態様では、抗インテグリン抗体は、白血球接着及び／又は凝集を阻害する。別の実施態様では、本発明の抗インテグリン抗体は、開いたコンホメーションのＬＦＡ−１ Ｉ−ドメインなどの開いたインテグリンＩ−ドメインや、又は、ＬＦＡ−１分子の改変Ｉ−ドメインなどの改変インテグリンＩ−ドメインに、選択的に結合する。
【００７４】
抗インテグリン抗体（例えばモノクローナル抗体など）は、本発明の方法において、インテグリン又はインテグリンＩ−ドメインポリペプチドの発現及び／又は活性を修飾することにも、利用することができる。また抗インテグリン抗体は、アフィニティクロマトグラフィ又は免疫沈降などの標準的な技術を用いて、改変ＬＦＡ−１ポリペプチド、又は融合タンパク質などの改変インテグリン又はインテグリンＩ−ドメインポリペプチドを単離することにも、利用できる。別の実施態様では、抗インテグリン抗体を用いて、活性化インテグリンを発現している細胞を除去する及び／又は死滅させることもできる。さらに、抗インテグリン抗体を用いて、特定のコンホメーション（活性化インテグリンなど）のインテグリンポリペプチドを検出すると、被刺激白血球及び／又は活性化白血球の局在定位などを行うことができる。さらに、開いたコンホメーションのインテグリンＩ−ドメイン又は改変インテグリンＩ−ドメインと反応もしくは結合する抗体などの抗インテグリン抗体を、ここに解説するように治療上利用することもできる。従って、抗インテグリン抗体を診断に用いて、炎症を検出するなど、臨床検査法の一部として血中のタンパク質レベルを観察することもできる。検出は、抗体を、検出可能な物質に共役（即ち物理的に連結）することで、簡便化できる。検出可能な物質の例には、多様な酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、及び放射性物質がある。適した酵素の例には、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼがある。適した補欠分子団複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンがある。適した蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンジル又はフィコエリトリンがある。発光物質の例にはルミノールがある。生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンがある。適した放射性物質の例には１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ又は３Ｈがある。
【００７５】
単離された核酸分子
本発明は、インテグリンポリペプチド（例えば改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド、例えば改変インテグリンＩ−ドメイン又はＩ−様ドメインポリペプチド）又はその生物学的活性部分をコードする、単離された核酸分子の使用を包含する。
【００７６】
ここで用いる場合の用語「核酸分子」には、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）や、ヌクレオチド類似体を用いて作製したＤＮＡもしくはＲＮＡの類似体が含まれることを、意図している。当該核酸分子は一本鎖でも、二本鎖でもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。野生型ヒトαＬ及びαＭポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ （ジェンバンク登録番号ＮＭ＿００２２０９）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３ （ジェンバンク登録番号Ｎｏ． Ｊ０３９２５）に記載する。本発明の単離された核酸分子は、例えば以下の表９に特定したものなど、ここに解説したαＬ及びαＭ変異型の改変後アミノ酸配列をコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ 及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のヌクレオチド配列を包含する。表９は、ここに解説した改変αＬ及びαＭ変異型になるように変更された特定のヌクレオチド残基を示す。例えば、αＬＫ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ 変異型は改変αＬポリペプチドであり、この場合αＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２） のアミノ酸配列に変更を行った結果、アミノ酸残基２８７位及び２９４位がシステイン残基に置換されている。対応する野生型ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は、それぞれヌクレオチド残基１０２２−１０２４ 及び１１４３−１１４５で改変がある。従って、表９に示すように、αＬ Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ変異型のアミノ酸Ｋ２８７位では、野生型αＬ核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の対応ヌクレオチド残基であるヌクレオチド残基１０２２−１０２４が「ａａａ」から 「ｔｇｔ」に改変されている。
【００７７】
【表９】
Figure 2004527217
【００７８】
αＬ；ジェンバンクＮＭ ００２２０９
αＭ；ジェンバンク Ｊ０３９２５
【００７９】
用語「単離された核酸分子」には、当該核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子が含まれる。例えばゲノムＤＮＡの場合、用語「単離された」には、ゲノムＤＮＡが天然で結合している先の染色体から分離された核酸分子が含まれる。好ましくは「単離された」核酸分子が、当該核酸の由来である生物のゲノムＤＮＡ中で、天然で当該核酸の両側にある配列（即ち当該核酸の５末端及び３末端にある配列）を含まないとよい。例えば、多様な実施態様では、改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドをコードする単離核酸分子が、当該核酸の由来である細胞のゲノムＤＮＡ中で当該核酸分子の両側に天然で存在するヌクレオチド配列を、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ又は０．１ｋｂ未満、含有していてもよい。さらに、ｃＤＮＡ分子などの「単離された」核酸分子は、組換え技術で作製した場合に他の細胞性物質、又は培地を実質的に含まない状態であり得、あるいは、化学合成した場合には前駆化学物質又は他の化学物質を実質的に含まない状態であり得る。
【００８０】
当業者であれば、さらに、改変インテグリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に更なる変更を変異により加えて、コードされた改変インテグリンポリペプチドのアミノ酸配列を、当該改変インテグリンポリペプチドの構造上の特徴又は機能的能力をそれ以上変えることなく、変更できることは認識されるであろう。例えば、「重要でない」アミノ酸残基位置でアミノ酸置換が起きるようなヌクレオチド置換を、改変インテグリンポリペプチドをコードする配列中で行うことができる。「重要でない」アミノ酸残基とは、当該構造及び／又は生物学的活性をそれ以上変化させることなく、改変インテグリンポリペプチドの配列から変更できる残基である。本発明の方法に基づいて、コンピュータ・デザイン及びモデリングを用いて、所望のタンパク質コンホメーションを得るために、いずれのアミノ酸残基が変更に適するかが決定される。
【００８１】
従って、本発明の方法には、活性にとって重要でないアミノ酸残基の変更を含有する改変インテグリンポリペプチドをコードする核酸分子の使用が含まれよう。
【００８２】
好ましくは、保存的アミノ酸置換は、重要でないと予測される一つ又はそれ以上のアミノ酸残基で行うとよい。「保存的アミノ酸置換」とは、類似の側鎖を有する一アミノ酸残基に、当該アミノ酸残基が置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基の系統群が当該分野で定義されている。これらの系統群には、塩基性の側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性の側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷の極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性の側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族の側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、を持つアミノ酸がある。このように、改変インテグリンポリペプチド中で重要でないと予測されるアミノ酸残基を、同じ側鎖系統群の別のアミノ酸残基に置換することが好ましい。
【００８３】
組換え発現ベクタ及びホスト細胞
本発明の別の局面は、インテグリンＩ−ドメインもしくはＩ−様ドメインポリペプチドなどの改変インテグリンポリペプチド（又はその一部分）又は融合タンパク質をコードする核酸を含有する組換え発現ベクタなどのベクタに関するものである。ここで用いる用語「ベクタ」とは、連結された相手である別の核酸を輸送できる核酸分子を言う。ベクタの一つの形は、別のＤＮＡセグメントを途中に連結できる環状の二本鎖ＤＮＡループを言う「プラスミド」である。もう一つの種類のベクタは、別のＤＮＡセグメントをウィルスゲノム中に連結できるウィルスベクタである。いくつかのベクタは、導入された先のホスト細胞で自律的複製が可能である（例えば、細菌由来の複製開始点を有する細菌ベクタ及びエピソームほ乳類ベクタなど）。他のベクタ（例えば非エピソームほ乳類ベクタなど）は、ホスト細胞に導入されると、ホスト細胞中のゲノムに組み込まれて、ホストゲノムと一緒に複製される。さらに、いくつかのベクタは、作動的に連結された先の遺伝子の発現を命令することができる。このようなベクタをここでは「発現ベクタ」と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技術で実用性のある発現ベクタは、プラスミドの形であることが多い。本明細書では、プラスミドが最もよく用いられている形のベクタであるため、「プラスミド」及び「ベクタ」を交換可能に用いている場合がある。しかし、本発明の方法には、例えばウィルスベクタ（複製能欠損レトロウィルス、アデノウィルス及びアデノ随伴ウィルスなど）など、同等の機能を果たす他の形の発現ベクタも含まれよう。
【００８４】
本発明の組換え発現ベクタは、本発明の核酸を、当該核酸がホスト細胞内で発現するのに適した形で含むが、このことは、この組換え発現ベクタには、発現に用いるホスト細胞に基づいて選択され、発現させようとする核酸配列に作動的に連結させた一つ又はそれ以上の調節配列が含まれることを意味する。組換え発現ベクタ内で、「作動的に連結されている」とは、当該ヌクレオチド配列の発現が可能な態様で（例えばインビトロ転写／翻訳系で、又は、ベクタをホスト細胞内に導入した場合にはホスト細胞内で）、目的のヌクレオチド配列が調節配列に連結されていることを意味することを、意図している。用語「調節配列」には、プロモータ、エンハンサ及び他の発現調節配列（例えばポリアデニレーション・シグナル）が包含されることを、意図している。このような調節配列は、例えば Ｇｏｅｄｄｅｌ； Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ （１９９０）に解説がある。調節配列には、多種のホスト細胞でヌクレオチド配列の構成的発現を命令するものや、特定のホスト細胞でのみ、ヌクレオチド配列の発現を命令するもの（例えば組織特異的調節配列）、がある。発現ベクタのデザインは、例えば、形質転換させようとするホスト細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル、等々の因子に応じて様々であろうことは、当業者であれば理解されよう。本発明の発現ベクタをホスト細胞に導入することで、融合タンパク質又はペプチドを含め、ここに解説したように核酸がコードするタンパク質又はペプチド（例えば改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド、融合タンパク質等）を産生させることができる。
【００８５】
従って本発明は、当該タンパク質が産生するよう組換え発現ベクタを含有する本発明のホスト細胞（例えば原核ホスト細胞又は真核ホスト細胞）を適した培地で培養することで、改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドなどの改変インテグリンポリペプチドを生成する方法を提供する。
【００８６】
本発明の組換え発現ベクタは、例えば本発明の方法に用いるためなど、原核細胞又は真核細胞における改変インテグリンポリペプチド又は融合タンパク質の発現用として設計することができる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、（バキュロウィルス発現ベクタを用いて）昆虫細胞、酵母細胞又は哺乳動物細胞などで、改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド又は融合タンパク質を発現させることができる。適したホスト細胞はさらにＧｏｅｄｄｅｌ， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ （１９９０）に解説されている。あるいは、組換え発現ベクタは、Ｔ７プロモータ調節配列及びＴ７ポリメラーゼを用いるなどして、インビトロで転写及び翻訳させることもできる。
【００８７】
原核細胞によるタンパク質の発現は、多くの場合、Ｅ．ｃｏｌｉで、融合タンパク質又は非融合タンパク質の発現を命令する構成的もしくは誘導性プロモータを含有するベクタを用いて行われる。融合ベクタは、数多くのアミノ酸を、それにコードされたタンパク質、通常は組換えタンパク質のアミノ末端、に付加する。このような融合ベクタは、典型的には三つの目的：即ち１）組換えタンパク質の発現を増加させる；２）組換えタンパク質の可溶性及び／又は安定性を増加させる；及び３）アフィニティ精製の際にリガンドとして働くことで、組換えタンパク質の精製を助ける、に役立つ。融合発現ベクタの場合、しばしば、タンパク質分解開裂部位を融合部分と組換えタンパク質との間の接合部位に導入して、融合タンパク質の精製後に、融合部分から組換えタンパク質を切り離せるようにする。このような酵素、及びそれらのコグネイト認識配列には、因子Ｘａ、スロンビン、及びエンテロキナーゼ、がある。典型的な融合発現ベクタには、それぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合たんぱく、又はプロテインＡを標的組換えたんぱくに融合させるｐＧＥＸ （ファルマシア・バイオテック社製； Ｓｍｉｔｈ， Ｄ．Ｂ． ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｋ．Ｓ． （１９８８） Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ （ニューイングランド・バイオラブズ社、マサチューセッツ州ビバリー） 及びｐＲＩＴ５ （ファルマシア社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）がある。精製された改変インテグリンＩ−ドメイン融合タンパク質（例えば可溶性Ｉ−ドメイン−Ｉｇ）は、ここに解説するようにインテグリン活性を修飾するのに利用できる。
【００８８】
適した誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクタの例には、ｐＴｒｃ （Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５） 及びｐＥＴ １１ｄ （Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ （１９９０） ６０−８９）がある。ｐＴｒｃベクタからの標的遺伝子の発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモータからのホストＲＮＡポリメラーゼ転写に依拠するものである。ｐＥＴ １１ｄベクタからの標的遺伝子の発現は、共発現するウィルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ ｇｎ１）が媒介する、Ｔ７ ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモータからの転写に依拠するものである。このウィルスポリメラーゼは、ホスト株ＢＬ２１（ＤＥ３） 又はＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により、Ｔ７ ｇｎ１遺伝子をｌａｃＵＶ ５プロモータの転写制御下に持つ定住プロファージから提供される。
【００８９】
Ｅ．ｃｏｌｉ内での組換えタンパク質の発現を最大にする戦略の一つは、タンパク質分解により組換えタンパク質を開裂する能力を欠損したホスト細菌で当該タンパク質を発現させることである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ， Ｓ．， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ （１９９０） １１９−１２８）。もう一つの戦略は、各アミノ酸に対応する個々のコドンがＥ．ｃｏｌｉ内で優先的に利用されるものとなるよう、発現ベクタに挿入しようとする核酸の核酸配列を変更することである（Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０：２１１１−２１１８）。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準的なＤＮＡ合成技術で行うことができる。
【００９０】
別の実施態様では、前記発現ベクタは酵母発現ベクタである。酵母Ｓ．セレビジエで発現させるためのベクタの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１ （Ｂａｌｄａｒｉ， ｅｔ ａｌ．， （１９８７） ＥＭＢＯ Ｊ． ６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ （Ｋｕｒｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ， （１９８２） Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８ （Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．， （１９８７） Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２ （カリフォルニア州サンジエゴ、インビトロジェン社）及びｐｉｃＺ （カリフォルニア州サンジエゴ、インビトロジェン社）、がある。
【００９１】
あるいは、改変インテグリンポリペプチドは、バキュロウィルス発現ベクタを用いて昆虫細胞で発現させることができる。培養昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）でタンパク質を発現させるのに利用できるバキュロウィルスベクタには、ｐＡｃシリーズ （Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３：２１５６−２１６５） 及びｐＶＬシリーズ （Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ （１９８９） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９）がある。
【００９２】
さらに別の実施態様では、本発明の核酸を、哺乳動物発現ベクタを用いて哺乳動物細胞で発現させる。哺乳動物発現ベクタの例には、ｐＣＤＭ８ （Ｓｅｅｄ， Ｂ． （１９８７） Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ （Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９８７） ＥＭＢＯ Ｊ． ６：１８７−１９５）がある。哺乳動物細胞で用いる場合、発現ベクタの制御機能は、しばしばウィルス調節配列によって提供される。例えば、よく用いられるプロモータは、ポリオーマ、アデノウィルス２、サイトメガロウィルス及びシミアン・ウィルス４０由来のものである。原核細胞及び真核細胞の両方にとって適した他の発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｈ， Ｅ． Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ， ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９の第１６章及び第１７章を参照されたい。
【００９３】
別の実施態様では、前記組換え哺乳動物発現ベクタは、特定の細胞種で優先的に核酸の発現を命令することができる（例えば組織特異的調節配列を用いて核酸を発現させるなど）。組織特異的調節配列は当業で公知である。適した組織特異的プロモータの非限定的な例には、アルブミンプロモータ（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １：２６８−２７７）、リンパ球特異的プロモータ（Ｃａｌａｍｅ ａｎｄ Ｅａｔｏｎ （１９８８） Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４３：２３５−２７５）、特にＴ細胞受容体のプロモータ（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ （１９８９） ＥＭＢＯ Ｊ． ８：７２９−７３３）及び免疫グロブリンのプロモータ （Ｂａｎｅｒｊｉ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｃｅｌｌ ３３：７２９−７４０； Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ （１９８３） Ｃｅｌｌ ３３：７４１−７４８）、神経細胞特異的プロモータ（例えば神経フィラメントプロモータ；Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：５４７３−５４７７）、内皮細胞特異的プロモータ（例えばＫＤＲ／ｆｌｋ プロモータ；米国特許第５，８８８，７６５号）、膵臓特異的プロモータ（Ｅｄｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２−９１６）、及び乳腺特異的プロモータ（例えば乳清プロモータ；米国特許第４，８７３，３１６号及びヨーロッパ特許出願公報第２６４，１６６号）、がある。例えば、マウスホックスプロモータ （Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４−３７９）及びα−フェトタンパク質プロモータ （Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ （１９８９） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ３：５３７−５４６）などの発生調節性プロモータも、包含するところである。
【００９４】
本発明の他の局面は、例えば改変インテグリンＩ−ドメイン核酸分子を含有させた組換え発現ベクタや、又は、ホスト細胞のゲノムの特定の部位で相同組換えが可能なような配列を含有する改変インテグリンＩ−ドメイン核酸分子などの本発明の改変インテグリンポリペプチドをコードする核酸分子を導入する先のホスト細胞に関する。用語「ホスト細胞」及び「組換えホスト細胞」はここでは交換可能に用いられている。このような用語は特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の後代又は潜在的な後代の細胞も言うと理解されたい。突然変異又は環境の影響により、何らかの改変が後の世代に起きることがあるため、このような後代は実際のところ、親細胞と同一でないかも知れないが、それでもなお、ここで用いるこの用語の範囲内に包含される。
【００９５】
ホスト細胞はいかなる原核もしくは真核細胞でもよい。例えば、改変インテグリンポリペプチド又は融合タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞、酵母もしくは哺乳動物細胞（例えば造血細胞、白血球、Ｋ５６２細胞、２９３Ｔ細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）もしくはＣＯＳ細胞など）で、発現させることができる。他の適したホスト細胞は当業者に公知である。
【００９６】
ベクタＤＮＡは、原核もしくは真核細胞に、常法である形質転換もしくはトランスフェクション技術を通じて導入することができる。ここで用いる場合の用語「形質転換」及び「トランスフェクション」とは、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラン−媒介トランスフェクション、リポフェクション、又は電気穿孔法を含め、ホスト細胞に外来の核酸（例えばＤＮＡ）を導入するための、多種の当業者に公知の技術を言うと、意図している。ホスト細胞を形質転換もしくはトランスフェクトする適した方法は、サムブルック氏らの文献（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ， ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９）、及び他の実験用マニュアルに見ることができる。
【００９７】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクトに関しては、用いる発現ベクタ及びトランスフェクション技術によっては、細胞の一部しか、外来のＤＮＡをそのゲノムに組み込まないことがあることが知られている。これらの組み込み体を同定及び選別するには、選択マーカ（例えば抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子を目的の遺伝子と一緒にホスト細胞に導入することが多い。好適な選択マーカには、例えばＧ４１８、ヒグロマイシン及びメトトレキセートなどの薬物に対する耐性をもたらすものがある。選択マーカをコードする核酸をホスト細胞に導入するには、改変インテグリンポリペプチドをコードするのと同じベクタに載せて導入しても、又は別のベクタに載せて導入してもよい。導入した核酸が安定にトランスフェクトした細胞は、薬物選択（例えば選択マーカ遺伝子を取り込んだ細胞は生き残り、他のものは死滅するなど）で判定できる。
【００９８】
培養液中の原核もしくは真核ホスト細胞などの、本発明のホスト細胞を利用すると、本発明の方法で使用できる改変インテグリンポリペプチド、例えば改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド又は融合タンパク質など、を産生（即ち発現）させることができる。一実施態様では、ホスト細胞を（改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド又は融合タンパク質をコードする組換え発現ベクタを導入した）、改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド又は融合タンパク質が産生されるように、適した培地で培養する。別の実施態様では、改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド又は融合タンパク質を培地又はホスト細胞から単離する。さらに、インテグリン活性を修飾するために、改変インテグリンポリペプチド又は融合タンパク質を発現している組換え細胞を対象に投与してもよい。
【００９９】
さらに本発明のホスト細胞は、非ヒトトランスジェニック動物を作製するのにも利用できる。例えば、ある実施態様では、本発明のホスト細胞は、改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドをコードする配列が導入してある受精卵母細胞又は胚性幹細胞である。次に、このようなホスト細胞を用いて、外因性の改変インテグリンＩ−ドメイン配列がそれらのゲノムに導入された非ヒトトランスジェニック動物や、又は、内因性のインテグリンＩ−ドメイン配列が変更された相同組換え動物を作製することができる。このような動物は、改変インテグリンＩ−ドメイン分子の機能及び／又は活性を研究したり、また、改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド活性のモジュレータを同定及び／又は評価するのに、有用である。ここで用いる「トランスジェニック動物」とは、当該動物の一つ又はそれ以上の細胞が導入遺伝子を含有する、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはラットもしくはマウスなどのげっ歯類、である。トランスジェニック動物の他の例には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類等がある。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する元となる細胞のゲノム中に組み込まれ、成熟動物のゲノム中に留まって、そのトランスジェニック動物の一つ又はそれ以上の細胞種又は組織で、コードされた遺伝子産物の発現を命令する外因性のＤＮＡである。ここで用いる「相同組換え動物」とは、当該動物の発生前に、当該動物の胚細胞など、動物の細胞中に導入された外因性ＤＮＡ分子と内因性遺伝子との間で相同組換えが起きることで、内因性インテグリンＩ−ドメイン遺伝子が変更されている非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウス、である。
【０１００】
本発明のトランスジェニック動物は、改変インテグリンＩ−ドメインをコードする核酸を、受精卵母細胞の雄前核に、マイクロインジェクション、レトロウィルス感染などで導入し、この卵母細胞を偽妊娠の借り腹動物で発生させることで、作製できる。導入遺伝子には、導入遺伝子の発現効率を高めるために、イントロン配列及びポリアデニレーションシグナルも含めてもよい。組織特異的調節配列を改変インテグリンＩ−ドメイン導入遺伝子に作動的に連結させると、特定の細胞に改変インテグリンＩ−ドメインタンパク質の発現を命令することができる。胚の操作及びマイクロインジェクションを通じてトランスジェニック動物、特にマウスなどの動物を作製する方法は従来技術となっており、例えば、両者ともレダー氏らの米国特許第 ４，７３６，８６６号及び第４，８７０，００９号、ワグナー氏らの米国特許第４，８７３，１９１号、及びＨｏｇａｎ， Ｂ．， Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ， （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８６）に解説がある。
【０１０１】
相同組換え動物を作製するには、欠失、付加又は置換を導入することで、改変インテグリンＩ−ドメイン遺伝子を機能的に破壊するなど変更してあるような改変インテグリンＩ−ドメイン遺伝子を少なくとも一部分を含有するベクタを作製する。改変インテグリンＩ−ドメイン遺伝子は、ヒト遺伝子でもよいが、より好ましくはヒト改変インテグリンＩ−ドメイン遺伝子の非ヒト相同体である。例えばマウス改変インテグリンＩ−ドメイン遺伝子を用いて、マウスゲノム中の内因性改変インテグリンＩ−ドメイン遺伝子を改変するのに適した、ベクタなどの相同組換え核酸分子を構築することができる。ある好適な実施態様では、相同組換えが起きると、当該内因性改変インテグリンＩ−ドメイン遺伝子が機能的に破壊される（即ち機能タンパク質をもはやコードしていない；ここでは「ノックアウト」ベクタとも呼ぶ）よう、相同組換え核酸分子をデザインする。代替的に、相同組換えが起きると、内因性改変インテグリンＩ−ドメイン遺伝子が変異もしくは変化するが、以前として機能たんぱくをコードしているよう、相同組換え核酸分子をデザインすることができる（例えば、上流の調節領域を変えることで、内因性改変インテグリンＩ−ドメインタンパク質の発現を変えることができる）。相同組換え核酸分子において、改変インテグリンＩ−ドメイン遺伝子のうちで変更された部分は、その５末端及び３末端で、改変インテグリンＩ−ドメイン遺伝子の追加の核酸配列部分でフランクされているため、胚性幹細胞中などの細胞中で、相同組換え核酸分子が持つ外因性改変インテグリンＩ−ドメイン遺伝子と、内因性改変インテグリンＩ−ドメイン遺伝子との間で、相同組換えが起きる。この追加のフランキング改変インテグリンＩ−ドメイン核酸配列は、内因性遺伝子との間の相同組換えが成功するよう、充分な長さのものである。典型的には、数キロベースの（５末端及び３末端の両側の）フランキングＤＮＡが相同組換え核酸分子に含まれる（相同組換えベクタの解説については、例えばＴｈｏｍａｓ， Ｋ．Ｒ． ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｍ． Ｒ． （１９８７） Ｃｅｌｌ ５１：５０３ を参照されたい）。相同組換え核酸分子を胚性幹細胞株などの細胞中に（例えばエレクトロポレーションで）導入し、導入された改変インテグリンＩ−ドメイン遺伝子が、内因性の改変インテグリンＩ−ドメイン遺伝子と相同組換えを起こした細胞を選択する（例えばＬｉ， Ｅ． ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｃｅｌｌ ６９：９１５を参照されたい）。こうして選択された細胞を、動物（マウスなど）の胚盤胞に注射して凝集キメラを形成することができる（例えばＢｒａｄｌｅｙ， Ａ． ｉｎ Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｅ．Ｊ． Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， ｅｄ． （ＩＲＬ， Ｏｘｆｏｒｄ， １９８７） ｐｐ． １１３−１５２）。次に、キメラ胚を適した偽妊娠のメス借り腹動物に移植することができ、この胚を産期に至らせる。相同組換えを起こしたＤＮＡを生殖細胞中に持つ後代を用いれば、導入遺伝子の生殖細胞系伝播により、動物のすべての細胞が相同組換えを起こしたＤＮＡを含有するような動物を育種することができる。例えばベクタ、又は、相同組換え動物など、相同組換え核酸分子を構築する方法は、さらにＢｒａｄｌｅｙ， Ａ． （１９９１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２：８２３−８２９ 及び ル・ムーレック氏らのＰＣＴ 国際公報Ｎｏｓ．： ＷＯ ９０／１１３５４ ； スミシーズ氏らのＷＯ ９１／０１１４０ ； ジズルストラ氏らのＷＯ ９２／０９６８ ； 及びバーンズ氏らのＷＯ ９３／０４１６９に解説されている。
【０１０２】
別の実施態様では、導入遺伝子の発現を調節可能とする所定の系を含有するトランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。このような系の一例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の解説については、例えばＬａｋｓｏ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６を参照されたい。リコンビナーゼ系のもう一つの例は、サッカロミセス−セレビジエのＦＬＰリコンビナーゼ系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１−１３５５）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰ リコンビナーゼ系を用いて導入遺伝子の発現を調節する場合、Ｃｒｅリコンビナーゼ及び所定のタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含有する動物が必要である。このような動物は、例えば一方が所定のタンパク質をコードする導入遺伝子を含有し、他方がリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含有するような二種のトランスジェニック動物を交配するなどにより、「二重」トランスジェニック動物を構築することで、提供できる。
【０１０３】
スクリーニング検定
本発明は、インテグリン活性を修飾するモジュレータ、即ち候補もしくはテスト化合物又は薬剤（例えばペプチド、抗体、ペプチドミメティック、小分子（有機もしくは無機）又は他の薬剤など）を同定する方法（ここでは「スクリーニング検定」とも呼ぶ）を提供するものである。これらの検定を、例えば活性コンホメーションのインテグリンＩ−ドメインポリペプチドなどのインテグリンＩ−ドメインポリペプチドに結合する、インテグリンＩ−ドメインポリペプチドと相互作用する他のタンパク質と結合する、インテグリンＩ−ドメインポリペプチドと他のタンパク質、例えばＩＣＡＭなどのインテグリンリガンド、との結合を誘導し、その相互作用を修飾することで、インテグリン活性を修飾する、などのような化合物を同定するよう、デザインする。
【０１０４】
ここで用いる用語「インテグリン活性のモジュレータ」には、ここに解説するように、少なくとも一つのインテグリン活性を修飾又は調節できる化合物又は作用薬が包含される。インテグリン活性のモジュレータには、限定はしないが、小型の有機もしくは無機分子、核酸分子、ペプチド、抗体等が含まれよう。インテグリン活性のモジュレータは、例えば細胞接着又はリガンド結合など、インテグリン活性の誘導物質又は阻害物質であってよい。ここで用いる「インテグリン活性の誘導物質」は、インテグリン活性を刺激、亢進、及び／又は、模倣するものである。ここで用いる「インテグリン活性の阻害物質」は、インテグリン活性を低減、遮断又は拮抗するものである。
【０１０５】
ここで交換可能に用いられるように、「インテグリン活性」又は「インテグリン媒介活性」とは、インビトロ及びインビボで、標準的手法に従って調べたときに、インテグリンポリペプチド又は核酸分子が、インテグリン応答性細胞、又はインテグリンリガンドもしくは受容体に及ぼす活性を言う。一の実施態様では、インテグリン活性は、例えば細胞間又は細胞と細胞外マトリックス間の接着などの細胞接着事象の媒介能である。別の実施態様では、インテグリン活性は、細胞シグナリング事象の伝達能である。さらに別の実施態様では、インテグリン活性は、ＩＣＡＭなどのリガンドに対する結合能である。
【０１０６】
ある好適な実施態様では、可溶性の組換え高親和インテグリンＩ−ドメインは、インテグリンリガンド結合を阻害する小分子アンタゴニストをスクリーニングするのに、利用できる。さらに、最小限のリガンド結合活性を示す野生型インテグリンＩ−ドメインに対する作用との比較に基づき、直接的／競合的及び間接的／非競合的な阻害の態様を持つ、抗体などのアンタゴニストを区別することができる。例えば、間接的な阻害物質は、活性化野生型インテグリンＩ−ドメインではリガンド結合を阻害するであろうが、ジスルフィドで固定された高親和Ｉ−ドメインではしないはずである。
【０１０７】
別の実施態様では、検定は細胞ベースの検定であり、改変インテグリンポリペプチドを細胞表面上に発現している細胞にテスト化合物を接触させるステップと、テスト化合物のインテグリン活性の修飾（誘導又は阻害など）能を調べるステップとを含む。例えば、開いたコンホメーションで安定した改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドを細胞表面上に発現している細胞を、テスト化合物に接触させ、このテスト化合物の、インテグリンリガンドに対する接着の修飾能を、ここに解説し、例示するように調べる。
【０１０８】
さらに別の実施態様では、例えば開いたコンホメーションで安定させた改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドを検出可能な標識に共役させて、改変インテグリンポリペプチドの結合を、固定化インテグリンリガンドに対する標識付インテグリンＩ−ドメインの結合量を検出することで調べられるようにしても、テスト化合物によるインテグリンリガンド結合の修飾能を調べることができる。
【０１０９】
炎症の動物モデルなど、動物ベースのモデル系を、例えばインテグリン活性のモジュレータである化合物を同定するようデザインされたスクリーニング戦略の一部として使用してもよい。このように、動物ベースのモデルを、炎症を修飾したり、インテグリン媒介疾患を治療するのに効果的であろう薬剤、薬品、治療法及び介入法を判定するのに、用いてもよい。例えば、動物モデルを、インテグリン活性の修飾能を示すと思われる化合物に暴露し、この動物のその暴露に対する応答を、処置前後の炎症性活性を評価することでモニタすることができる。ここに解説したような改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドを発現するトランスジェニックマウスなどのトランスジェニック動物を用いても、炎症を修飾したり、インテグリン媒介疾患を治療するのに効果的であろう薬剤、薬品、治療法及び介入法を判定することができる。
【０１１０】
別の局面では、本発明は、ここに解説した検定法の二つ又はそれ以上の組合せに関する。例えば、インテグリン活性のモジュレータは、細胞ベースの検定法を使用して同定することができ、作用薬のインテグリン活性修飾能を、炎症の動物モデルなどの動物などで、ｉｎ ｖｉｖｏで確認してもよい。
【０１１１】
さらに、スクリーニング検定法を用いてインテグリン活性の誘導物質を同定することができ、例えばインテグリンのリガンド又は受容体への結合などのインテグリンポリペプチド活性を模倣したり、インテグリンのインテグリン応答細胞に対する活性を模倣したりするような誘導物質を同定することができる。このような化合物には、限定はしないが、ペプチド、抗体、又は小有機もしくは無機化合物が含まれるであろう。ある実施態様では、開いた活性化コンホーマに選択的に結合する本発明の抗ＬＦＡ−１抗体など、抗インテグリン抗体を用いても、テスト化合物のインテグリン活性化能を評価することができる。
【０１１２】
テスト化合物は、生物学的ライブラリ；空間指定可能なパラレル固相又は液相ライブラリ；逆重畳積分が必要な合成ライブラリ法；「ワン・ビーズ・ワン・コンパウンドライブラリ法；及びアフィニティ・クロマトグラフィ選別法を用いた合成ライブラリ法を含め、当該分野で公知のコンビナトリアル・ライブラリ法での数多くのアプローチのいずれを用いて得てもよい。生物学的ライブラリ法はペプチド・ライブラリに限られるが、他の四つの方法は、、化合物のペプチド、非ペプチド・オリゴマー又は小分子ライブラリに応用できる（Ｌａｍ， Ｋ．Ｓ． （１９９７） Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． １２：１４５）。
【０１１３】
分子ライブラリの合成法の例は、例えばＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０：６９０９； Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１１４２２； Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４）． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：２６７８； Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３； Ｃａｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３３：２０５９； Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３３：２０６１； 及び Ｇａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：１２３３に見ることができる。
【０１１４】
化合物のライブラリは、溶液中（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ （１９９２） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２−４２１）で提供されても、又はビーズ（Ｌａｍ （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ （１９９３） Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６）、細菌 （ラドナー氏の米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（ラドナー氏の米国特許第’４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１８６５−１８６９）又はファージ （Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０）； （Ｄｅｖｌｉｎ （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６）； （Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８７：６３７８−６３８２）； （Ｆｅｌｉｃｉ （１９９１） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：３０１−３１０）； （ラドナー氏の上記文献．）上でも提供され得る。
【０１１５】
さらに本発明は、上記のスクリーニング検定法で同定された新規な作用薬に関するものである。介入法に関しては、インテグリン活性及び／又は炎症性活性を修飾するあらゆる処置を、ヒトの治療的介入法候補とみなすべきである。
【０１１６】
医薬組成物
本発明の改変インテグリンポリペプチドをコードする核酸分子、改変インテグリンポリペプチド（例えば改変Ｉ−ドメインポリペプチド及び融合タンパク質）、及びそれらの活性フラグメント、抗インテグリンＩ−ドメイン抗体、及びインテグリンモジュレータ（ここでは「有効化合物」ともよぶ）ＤＮＡワクチン、又はＤＮＡベクタは、投与に適した医薬組成物中に組み込むことができる。ここで用いる、インテグリン活性の「モジュレータ」、例えば阻害物質及び誘導物質など、には、例えばインテグリン媒介シグナリング事象、インテグリン媒介接着事象、又は、コグネイト・リガンドに対するインテグリン結合などのインテグリン活性を修飾する化合物が含まれる。インテグリンモジュレータには、本発明の改変インテグリンＩ−ドメイン又はＩ−様ドメインポリペプチド、抗インテグリンＩ−ドメインポリペプチドや、ここで解説したスクリーニング検定で同定された化合物がある。このような組成物は典型的に、当該化合物、核酸分子、ベクタ、タンパク質又は抗体と、薬学的に許容可能な担体とを含んで成る。ここで用いる用語「薬学的に許容可能な担体」は、薬学的投与に適合性ある、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗カビ剤、等張剤及び吸収遅延剤等が含まれることを意図する。薬学的に有効な物質のためのこのような媒質及び薬剤の使用は当該分野で公知である。従来の媒質又は薬剤が有効化合物に対して適合性がない場合を除き、組成物中へのその使用が考慮される。補助的な有効化合物も本組成物中に取り入れてよい。
【０１１７】
本発明の医薬組成物は、意図した投与経路にとって適合性あるように調合される。投与経路の例には、疾患部位への直接的設置を含め、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（局所）、経粘膜、眼内、及び直腸投与がある。非経口、皮内、又は皮下投与用に用いられる溶液又は懸濁液には、以下の成分：注射用の水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒などの無菌の希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸、クエン酸又はリン酸などの緩衝剤や、塩化ナトリウム又はデキストロースなどの張性調節剤、がある。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調節できる。非経口用製剤は、ガラス製又はプラスチック製のアンプル、使い捨ての注射筒又は複数容量用バイアルに封入することができる。
【０１１８】
注射用途に適した医薬組成物には、無菌の水溶液（水溶性の場合）又は分散液や、無菌の注射用溶液又は分散液の即時調合用の無菌粉末がある。静脈内投与の場合、適した担体には、生理食塩水、静菌水、クレモフォールＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ社製、ニュージャージー州パーシパニー）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）がある。いずれの場合も、組成物は無菌でなければならず、注射筒への注入が容易な程度に流動的でなければならない。また、製造及び保管の条件下で安定でなくてはならず、細菌及びカビなどの微生物の汚染作用から守られていなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等や、これらの適した混合物を含有する溶媒又は分散媒であってよい。適当な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングを用いたり、分散液の場合には必要な粒子の大きさを維持したり、そして界面活性剤を利用するなどにより、維持できる。微生物の活動を防ぐには、多種の抗菌剤及び抗カビ剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により、可能である。多くの場合、糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコールや、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物中に含めるのが好ましいであろう。注射用組成物の吸収を長引かせるには、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなど、吸収を遅らせる薬剤を組成物中に含めると可能である。
【０１１９】
無菌の注射用溶液は、有効化合物（例えば可溶性の改変インテグリンＩ−ドメイン融合タンパク質）を必要量、適した溶媒中に、必要に応じて上に列挙した成分のうちの一つ又は組合せと一緒に取り入れた後、濾過滅菌して調製することができる。一般的には、分散液は、塩基性分散媒と、上に列挙したうちで必要な他の成分とを含有する無菌の賦形剤に有効化合物を取り入れることにより、調製されている。無菌の注射用溶液の調製用の無菌粉末の場合、好適な調製法は真空乾燥及び凍結乾燥であり、その結果、有効成分と、予め無菌濾過したその溶液から出た更なる所望の成分とから成る粉末が生じる。
【０１２０】
経口用組成物には、一般に不活性の希釈剤又は食用の担体が含まれる。これらをゼラチンカプセルに封入することができ、又は圧縮して錠剤にしてもよい。経口による治療用投与の場合、有効化合物は医薬品添加物と一緒に組み込み、錠剤、トローチ、又はカプセルの形で用いることができる。経口用組成物はさらに、含嗽剤として利用するために流動性担体を用いて調製してもよく、この場合この流動性担体中の化合物は経口投与され、スイッシュ（原語：ｓｗｉｓｈ）、喀出、又は嚥下される。薬学的に適合性ある結合剤、及び／又はアジュバント材料を、組成物の一部として含めてもよい。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は、以下の成分：即ち、例えば微小結晶セルロース、トラガカントゴム又はゼラチンなどの結合剤；でんぷん又は乳糖などの医薬品添加剤、アルギン酸、プリモゲル、又はコーン・スターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム又はステロートなどの潤滑剤；コロイド状二酸化珪素などの推進剤；ショ糖又はサッカリンなどの甘味料；ペパーミント、サリチル酸メチル、又はオレンジ甘味料などの着香料、か、又は同様な性質の化合物のいずれを含有してもよい。
【０１２１】
吸入による投与の場合、二酸化炭素などの気体などの適した噴射剤を含有する加圧容器又はディスペンサ、又はネブライザから、エーロゾル・スプレーの形で化合物を送達する。
【０１２２】
全身投与は経粘膜もしくは経皮手段によってもよい。経粘膜もしくは経皮投与の場合、透過させようとする障壁に適当な浸透剤を、製剤中に用いる。このような浸透剤は一般に当該分野で公知であるが、例えば経粘膜投与用には、界面活性剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体がある。経粘膜投与は鼻孔用スプレー又は座薬の利用を通じて行うことができる。経皮投与には、有効化合物を当該分野で広く公知の軟膏、軟膏剤、ゲル又はクリームに調合する。
【０１２３】
また化合物を、直腸送達用の座薬（例えばココア・バター及び他のグリセリドなどの従来の座薬用基剤を用いて）又は停留浣腸剤の形で調製することもできる。
【０１２４】
一の実施態様では、インプラント及びマイクロ封入送達系を含め、制御放出製剤など、身体から化合物が急速に失われないようにする担体と一緒に、有効化合物を調製する。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸など、生分解性で生体適合性のあるポリマーを利用してもよい。このような製剤の調製法は当業者に明白である。材料はアルザ・コーポレーション及びノバ・ファーマシューティカルズ社から市販のものを利用できる。リポソーム懸濁液（感染細胞を狙うようウィルス抗原に対するモノクローナル抗体で標的決めしたリポソームを含む）も、薬学的に許容可能な担体として利用できる。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に解説されているように、当業者に公知の方法に基づいて調製できる。
【０１２５】
投与が簡単なよう、かつ投薬量が均一になるように、単位剤形で経口もしくは非経口組成物を調合すると、特に有利である。ここで用いる単位剤形とは、治療しようとする対象の一回ごとの投薬量として合わせた物理的に個別の単位を言う。このとき各単位は、必要な薬剤担体との関連から所望の治療効果を生じるよう計算された所定量の有効化合物を含有する。本発明の単位剤形の詳細は、有効化合物に固有の特徴や、達成しようとする特定の治療効果、及び、個人を治療するためのこのような有効化合物を配合する当業に内在する限界の制約を受け、またこれらに直接依存する。
【０１２６】
本発明の有効化合物の投与は、予防目的又は治療目的のいずれであってもよい。従って、一実施態様では、「治療上有効な用量」とは、投与を受ける患者において生理学的に検出可能な変化をもたらすのに充分な量の有効化合物を言う。一実施態様では、治療上有効な用量とは、炎症及び／又は免疫応答の修飾を得るのに充分な有効化合物量を言う。別の実施態様では、治療上有効な用量とは、炎症及び／又は免疫系疾患の症状を寛解させるのに充分な有効化合物量を言う。別の実施態様では、治療上有効な用量とは、炎症及び／又は免疫系応答を妨げるのに充分な有効化合物量を言う。さらに別の実施態様では、治療上有効な用量とは、ここに解説したインテグリン活性（例えばシグナリング活性、接着活性又はリガンド結合活性）を修飾するのに充分な有効化合物量を言う。
【０１２７】
このような化合物の毒性及び治療効果は、例えばＬＤ５０（集団の５０％にとって致命的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を調べるなどの、細胞培養又は実験動物による標準的な薬学的手法により決定することができる。毒性効果対治療効果の用量比が治療指数であり、比ＬＤ／ＥＤ５０で表すことができる。大きな治療指数を呈する化合物が好適である。毒性の副作用を呈する化合物を用いてもよいが、非感染細胞へのダメージを抑え、ひいては副作用を軽減するためには、感染組織部位へこのような化合物をターゲティングする送達系をデザインするよう、配慮が必要である。
【０１２８】
細胞培養アッセイ及び動物実験で得られるデータは、ヒトで用いる投薬量範囲を設定する上で利用することができる。このような化合物の用量は、好適には、毒性が小さいかもしくはないような、ＥＤ５０を含む血中濃度範囲内であるとよい。投薬量は、用いる剤形及び利用する投与経路に応じて、この範囲内で様々であってよい。本発明の方法で用いる化合物の場合、まず細胞培養アッセイで治療上の有効量を推測することができる。動物モデルで用量を設定して、細胞培養で調べたときにＩＣ５０（即ち、症状の半分−最大を抑制するようなテスト化合物濃度）を含む血中血漿濃度範囲が得られるようにしてもよい。このような情報は、ヒトに応用できる用量をより精確に決定するのに、利用できる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーで測定してもよい。
【０１２９】
ここで定義するように、抗体、タンパク質又はポリペプチドの治療上有効な量（即ち有効量）は、約０．００１乃至３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１乃至２５ｍｇ／体重１ｋｇ、より好ましくは約０．１乃至２０ｍｇ／体重１ｋｇ、そしてさらにより好ましくは約１乃至１０ｍｇ／ｋｇ、２乃至９ｍｇ／ｋｇ、３乃至８ｍｇ／ｋｇ、４乃至７ｍｇ／ｋｇ、又は５乃至６ｍｇ／体重１ｋｇの範囲である。上記の値の中間の範囲も、本発明の一部として意図されたところである。例えば、上に挙げた値のいずれかを、上限及び／又は下限値として組み合わせて用いた範囲も包含されるものと、意図する。
【０１３０】
当業者であれば、疾患又は障害の重症度、治療歴、対象の全身の健康及び／又は年齢、及び現在の他の疾患、を含め、しかしこれらに限らず、いくつかの因子が、対象を効果的に治療するのに必要な投薬量を左右するであろうことを、認識するであろう。さらに、あるタンパク質、ポリペプチド、又は抗体の治療上有効な量による対象の治療には、一回の処置を含めることができるが、又は好ましくは一連の処置を含めることもできる。
【０１３１】
ある好適な実施態様では、約０．１乃至２０ｍｇ／体重１ｋｇの範囲の抗体、タンパク質、又はポリペプチドで、１週当たり１回を約１乃至１０週間、好ましくは２乃至８週間、より好ましくは約３乃至７週間、そしてさらにより好ましくは約４、５、又は６週間、対象を処置する。さらに、処置に用いる抗体、タンパク質、又はポリペプチドの有効量は、特定の処置経過にわたって増減させてもよいことも理解されよう。投薬量を変更してもよく、投薬量の変更は、ここに解説する診断検定の結果から明白となるであろう。
【０１３２】
別の好適な実施態様では例えば、開いたもしくは活性コンホメーションのインテグリンのＩ−ドメインと反応又は結合する抗ＬＦＡ−１抗体などの抗インテグリン抗体か、又は、改変ＬＦＡ−１ Ｉ−ドメインと反応もしくは結合する抗ＬＦＡ−１抗体などの抗インテグリン抗体を、治療上有効量、初回投与して対象を処置し、次に、前記抗体の初回投薬量の１００％未満の治療上有効量の抗体を、日毎で計算して間欠的に投与する。このとき、前記抗体は、後続の投薬中、１週間当たり１回を越えて投与されない。別の実施態様では、後続の投薬は１週間当たり２回以上である。別の実施態様では、後続の投薬は２週間毎に１回以上である。別の実施態様では、後続の投薬は３週間毎に１回以上である。別の実施態様では、後続の投薬は４週間毎に１回以上である。一の実施態様では、後続の投薬は、一日単位で計算して、当該抗体の初回の投薬量の約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満である。一の実施態様では、初回の投薬量は、０．００１ 乃至３０ ｍｇ／体重１ｋｇ、好ましくは約０．０１ 乃至２５ ｍｇ／体重１ｋｇ、より好ましくは約０．１乃至２０ ｍｇ／体重１ｋｇ、そしてさらにより好ましくは約１乃至１０ ｍｇ／ｋｇ、２ 乃至９ ｍｇ／ｋｇ、３ 乃至８ ｍｇ／ｋｇ、４ 乃至７ ｍｇ／ｋｇ、又は５ 乃至６ ｍｇ／体重１ｋｇ、の間である。一の好適な実施態様では、初回の投薬量は、０．３ ｍｇ／体重１ｋｇ未満、例えば０．００１ 乃至０．３０の間、例えば０．１、０．１２５、０．１５、０．１７５、０．２、０．２２５、０．２５、及び０．２７５など、である。上記の値の中間の範囲も、本発明の一部と意図する。
【０１３３】
さらに別の実施態様では、例えば開いたもしくは活性コンホメーションのインテグリンのＩ−ドメインと反応又は結合する、抗ＬＦＡ−１抗体などの抗インテグリン抗体か、又は、改変ＬＦＡ−１ Ｉ−ドメインと反応もしくは結合する抗ＬＦＡ−１抗体などの抗インテグリン抗体を、治療上有効量、初回投与して対象を処置し、次に、前記抗体の初回投薬量の１００％を越える治療上有効量の抗体を、日毎で計算して間欠的に投与する。このとき、前記抗体は、後続の投薬中、１週間当たり１回を越えて当該哺乳動物に投与されない。別の実施態様では、後続の投薬は１週間当たり２回以上である。別の実施態様では、後続の投薬は２週間毎に１回以上である。さらに別の実施態様では、後続の投薬は３週間毎に１回以上である。さらに別の実施態様では、後続の投薬は４週間毎に１回以上である。ある実施態様では、初回の投薬量は、０．００１ 乃至３０ ｍｇ／体重１ｋｇ、好ましくは約０．０１ 乃至２５ ｍｇ／体重１ｋｇ、より好ましくは約０．１乃至２０ ｍｇ／体重１ｋｇ、そしてさらにより好ましくは約１乃至１０ ｍｇ／ｋｇ、２ 乃至９ ｍｇ／ｋｇ、３ 乃至８ ｍｇ／ｋｇ、４ 乃至７ ｍｇ／ｋｇ、又は５ 乃至６ ｍｇ／体重１ｋｇ、の間である。ある好適な実施態様では、初回の投薬量は、０．３ ｍｇ／体重１ｋｇ未満、例えば０．００１ 乃至０．３の間であり、例えば０．１、０．１２５、０．１５、０．１７５、０．２、０．２２５、０．２５、及び０．２７５、である。上記の値の中間の範囲も、本発明の一部と意図する。抗ＬＦＡ−１などの抗インテグリン抗体の投薬量は、例えば米国特許第５，６２２，７００号に解説されている。
【０１３４】
さらに別の実施態様では、初回の投薬量の次に、同じ投薬量を、例えば後続の投薬中、１週間毎に１回を越えずに行う。別の実施態様では、後続の投薬は一週間当たり２回以上である。別の実施態様では、後続の投薬は２週間毎に１回以上である。さらに別の実施態様では、後続の投薬は、３週間毎に１回以上である。さらに別の実施態様では、後続の投薬は、４週間毎に１回以上である。
【０１３５】
抗ＬＦＡ−１などの抗インテグリン抗体の投薬量は、例えば米国特許第５，６２２，７００号に解説されている。
【０１３６】
別の実施態様では、有効量の抗炎症性又は免疫抑制性の薬剤を、哺乳動物に対し、同時又は異なる時点で、本抗体と組み合わせて投与する。
【０１３７】
本発明は、インテグリン活性を修飾する有効な作用薬を包含するものである。作用薬は例えば小分子であるかも知れない。例えば、このような小分子には、限定はしないが、ペプチド、ペプチドミメティック、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、分子量が１モル当たり約１０，０００グラム未満の有機もしくは無機の（即ちヘテロ有機及び有機金属化合物を含む）化合物、分子量が１モル当たり約５，０００グラム未満の有機もしくは無機の化合物、分子量が１モル当たり約１，０００グラム未満の有機もしくは無機の化合物、分子量が１モル当たり約５００グラム未満の有機もしくは無機の化合物、並びにこのような化合物の塩、エステル、及び薬学的に許容可能な他の形、がある。小分子作用薬の適当な用量は、当業の担当医、獣医、又は研究者の知る範囲の数多くの因子に依存すると、思われる。小分子の用量は、例えば、治療しようとする対象又はサンプルのアイデンティティ、大きさ、及び状態に依存し、またさらに該当すれば当該組成物を投与する経路に応じて、さらに本発明の核酸又はポリペプチドに対して当該小分子が有するとよいと担当医が思う作用に応じて変動するであろう。
【０１３８】
用量の例には、対象もしくはサンプルの体重１キログラム当たりの小分子の量ミリグラム又はマイクログラム量（例えば１キログラムあたり約１マイクログラムから、１キログラム当たり約５００ミリグラム、１キログラム当たり約１００マイクログラムから１キログラム当たり約５ミリグラム、又は、１キログラムあたり約１マイクログラムから１キログラム当たり約５０マイクログラム）がある。さらに、小分子の適当な用量は、修飾しようとする発現又は活性に対する、小分子の効力に依存するとも考えられる。このような適当な用量は、ここに解説した検定を用いて調べることができる。本発明のポリペプチド又は核酸の発現又は活性を修飾するために、これらの小分子の一つ又はそれ以上を動物（例えばヒト）に投与する場合、担当医、獣医又は研究者は、例えば、まず比較的に低い用量を処方し、その後適当な応答が得られるまでこの用量を増加させていってもよい。加えて、特定の対象動物にとっての特定の用量レベルは、用いる特定の化合物の活性、対象の年齢、体重、全身の健康状態、性別、及び食事、投与期間、投与経路、排出速度、薬剤の組合せ、及び、修飾しようとする発現又は活性の程度、を含む多様な因子に依存することであろうと理解される。
【０１３９】
本発明のいくつかの実施態様では、インテグリン活性のモジュレータを、他の薬剤（例えば小分子）と組み合わせて、又は別の補足的な治療計画と連携させて、投与する。例えばある実施態様では、インテグリン活性の阻害物質を用いて、炎症性もしくは免疫系疾患を治療する。従って、対象をインテグリン活性の阻害物質で処置し、さらに抗炎症性薬剤又は免疫抑制剤で処置してもよい。
【０１４０】
さらに、例えば抗ＬＦＡ−１抗体などの抗体（又はそのフラグメント）を、細胞毒、治療薬又は放射性金属イオンなどの治療部分に結合させてもよい。本発明の複合体は、任意の生物学的応答を調節するのに利用でき、また当該薬剤部分は、伝統的な化学治療薬に限られるとみなしてはならない。例えば、当該薬剤部分は、所望の生物活性を持つタンパク質又はポリペプチドであってもよい。このようなタンパク質には、例えば、組織因子などの凝固因子；血管内皮細胞成長因子（「ＶＥＧＦ」）、血小板由来成長因子、及び組織プラスミノーゲン活性化因子などのタンパク質、例えばリンホカイン、サイトカイン及び成長因子などの生物学的応答調節因子；又はトキシンなどが含まれよう。
【０１４１】
このような治療部分を抗体に結合させる技術は公知であり、例えば Ａｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．， ”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”， ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， ｐｐ． ２４３−５６ （Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． １９８５）； Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．， ”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”， ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ （２ｎｄ Ｅｄ．）， Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， ｐｐ． ６２３−５３ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ． １９８７）； Ｔｈｏｒｐｅ， ”Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ａ Ｒｅｖｉｅｗ”， ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ’８４： Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｐｉｎｃｈｅｒａ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， ｐｐ． ４７５−５０６ （１９８５）； ”Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｒｅｓｕｌｔｓ， Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”， ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， ｐｐ． ３０３−１６ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）， ａｎｄ Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．， ”Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ．， ６２：１１９−５８ （１９８２）を参照されたい。あるいは、抗体を二次抗体に結合させると、シーガル氏が米国特許第４，６７６，９８０号に解説した抗体ヘテロ結合抗体を形成することができる。
【０１４２】
高親和改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド又はその活性フラグメントなどをコードする核酸分子など、本発明の核酸分子を単独で遺伝子ベースの治療に用いることもできるが、又は、ベクターに挿入して遺伝子治療ベクターとして用いてもよい。遺伝子治療は、患者の細胞に機能遺伝子を挿入して、（ｉ）代謝の先天異常を補正したり、又は（ｉｉ）細胞に新しい機能を提供する、ことである （Ｋｕｌｖｅｒ， Ｋ． Ｗ．， ”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ”， １９９４， ｐ． ｘｉｉ， Ｍａｒｙ Ａｎｎ Ｌｉｅｂｅｒｔ， Ｉｎｃ．， Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．）。ウィルスベクタなどのベクタを用いると、当該遺伝子が天然では存在しないような体内位置などに、哺乳動物で通常発現している遺伝子を導入し、安定に発現させることができよう。遺伝子治療ベクタは、例えば静脈注射、局所投与（例えば米国特許第５，３２８，４７０号を参照されたい）又は定位注射（例えばＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３０５４−３０５７）などにより、対象に送達することができる。遺伝子治療ベクタには、例えば、対象でｉｎ ｖｉｖｏで免疫応答を誘導するための目的抗原をコードするＤＮＡなどを含めることができる。従って、高親和改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド又はその活性フラグメントなどの改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドは、抗原に対する亢進した抗体反応を生ずるアジュバントとして働く。遺伝子治療ベクタの医薬製剤には、許容可能な希釈剤に入れた遺伝子治療ベクタを含めることができ、あるいは、遺伝子送達媒体を包埋した徐放型マトリックスを含めることもできる。あるいは、完全な遺伝子送達ベクタをレトロウィルスベクタなどの組換え細胞からインタクトで作製する場合、当該医薬製剤には、遺伝子送達系を形成する一つ又はそれ以上の細胞を含めてもよい。
【０１４３】
また本発明の核酸分子は、炎症性疾患などのインテグリン媒介疾患の治療的もしくは予防的処置のためのＤＮＡワクチン製剤中にも、利用できる。一の実施態様では、本ＤＮＡワクチン製剤は、改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド又はそのフラグメントなど、改変インテグリンポリペプチドをコードする核酸分子を、抗原性成分をコードするＤＮＡなどの抗原性成分に共役させたものを含んで成る。ここで用いる抗原性成分とは、特異抗体に充分な高親和性で結合することで検出可能な抗原−抗体複合体を形成することのできる部分である。別の実施態様では、本ＤＮＡワクチンは薬学的に許容可能な担体をさらに含んで成る。
【０１４４】
本医薬組成物を、容器、パック、又はディスペンサに、投与の際の注意書きと一緒に封入してもよい。
【０１４５】
処置の方法
本発明は、炎症性もしくは免疫疾患、及び／又は、細胞増殖性疾患など、インテグリン媒介疾患の危険性があるか、又は、インテグリン媒介疾患を有する対象を処置する予防法及び治療法の両方を提供するものである。ここで用いる「処置」とは、疾患もしくは異常、疾患もしくは異常の症状、又は疾患又は異常への素因を有する患者に対し、前記疾患もしくは異常、疾患もしくは異常の症状、又は疾患又は異常への素因を治癒させる、直す、寛解させる、軽減する、変化させる、治療する、改善させる、向上させるもしくは影響を与える目的で、治療薬を適用もしくは投与すること、又は、患者の摘出組織もしくは細胞株へ治療薬を適用もしくは投与すること、と定義される。治療薬には、限定はしないが、核酸分子、ＤＮＡワクチン、遺伝子ベースの治療法、改変Ｉ−ドメインポリペプチドと反応もしくは結合する小分子、ペプチド、抗ＬＦＡ−１抗体などの抗体、リボザイム及びアンチセンスオリゴヌクレオチド、が包含される。
【０１４６】
予防的処置法及び治療的処置法の両方に関しては、このような処置を、ファーマコゲノミクスの分野で得られた知見に基づき、特異的にテーラー・メードにしたり、又は改良してもよい。ここで用いる「ファーマコゲノミクス」とは、遺伝子配列決定、統計学的遺伝学、及び臨床開発中及び市場にある薬剤に対する遺伝子発現解析、などのゲノミクス・テクノロジーの応用を言う。より具体的には、この用語は、ある患者の遺伝子が、薬物に対してどのような応答をするか（例えば、患者の「薬物応答表現型」、又は「薬物応答遺伝子型」など）を調べる研究を言う。このように、本発明の別の局面では、個人の薬物応答遺伝子型に基づいて、本発明のインテグリンＩ−ドメインポリペプチド又はそのモジュレータのいずれかを用いた個人の予防的処置法又は治療的処置法をテーラーする方法を提供する。ファーマコゲノミクスにより、臨床医又は担当医は、当該処置から最も大きな利益を得るであろう患者に予防的もしくは治療的処置のターゲットを決め、そして薬物の関連する毒性の副作用が出るであろう患者の処置を避けることができる。
【０１４７】
１． 予防の方法
一の局面では、本発明は、本発明のインテグリンＩ−ドメインポリペプチド又はそのモジュレータを一種又はそれ以上、対象に投与することにより、対象におけるインテグリン媒介異常に関連する疾患又は状態を防ぐ方法を提供するものである。インテグリン媒介異常の危険性のある対象は、例えば、ここに解説する診断検定又は予後検定のいずれか又は組み合わせで、特定することができる。予防的作用薬の投与は、インテグリン媒介疾患の特徴を示す症状が発現する前に行って、疾患又は異常が防がれるか、又は、その進行が遅れるようにしてもよい。インテグリン媒介疾患の種類に応じて、例えば、本発明の適当なインテグリンＩ−ドメインポリペプチド又はそのモジュレータを、対象を治療するのに利用することができる。この適当な作用薬は、ここに解説するスクリーニング検定に基づいて決定することができる。
【０１４８】
２．治療の方法
本発明の別の局面は、治療を目的として、インテグリンＩ−ドメインポリペプチドの発現又はそれらの活性を修飾する（例えば、炎症性もしくは免疫疾患、及び／又は細胞増殖性疾患などのインテグリン媒介疾患の危険性があるか、又は、インテグリン媒介疾患を有する対象を治療するなど）方法に関するものである。従って、一実施態様では、本発明の修飾法は、本発明の一種又はそれ以上のインテグリンＩ−ドメインポリペプチド、又はその一種又はそれ以上のモジュレータ、例えば、開いたコンホメーションのインテグリンＩ−ドメインと反応又は結合する抗体など、や、開いたコンホメーションのＬＦＡ−１ Ｉ−ドメインもしくは改変ＬＦＡ−１ Ｉ−ドメインポリペプチドに特異的な抗ＬＦＡ−１抗体などの改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドなど、に細胞を接触させるステップを含む。インテグリンＩ−ドメインポリペプチド活性を修飾する作用薬は、例えば核酸又はタンパク質、インテグリンＩ−ドメインポリペプチドの標的分子（例えば基質）、改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドと反応もしくは結合する抗体、インテグリンＩ−ドメインポリペプチドアゴニストもしくはアンタゴニスト、インテグリンＩ−ドメインポリペプチドアゴニストもしくはアンタゴニストのペプチドミメティック、又は他の小分子など、ここに解説した作用薬とすることができる。一実施態様では、本作用薬は一種又はそれ以上のインテグリンＩ−ドメインポリペプチド活性を刺激するものである。このような刺激性作用薬の例には、活性インテグリンＩ−ドメインポリペプチドタンパク質や、細胞に導入してある、インテグリンＩ−ドメインポリペプチドをコードする核酸分子がある。別の実施態様では、本作用薬は、一種又はそれ以上のインテグリンＩ−ドメインポリペプチド活性を阻害するものである。このような阻害性作用薬の例には、アンチセンスインテグリンＩ−ドメインポリペプチド核酸分子、遺伝子治療ベクタ、ＤＮＡワクチン、抗インテグリンＩ−ドメインポリペプチド抗体、及びインテグリンＩ−ドメインポリペプチド阻害剤、がある。これらの修飾法はインビトロで（例えば細胞を当該作用薬と一緒に培養するなどにより）行っても、又はその代わりにインビボで（例えば当該作用薬を対象に投与するなどにより）行ってもよい。従って、本発明は、インテグリン媒介疾患に関連する特徴とする疾患又は異常に罹患した個体を処置する方法を提供するものである。ある実施態様では、本方法は、インテグリンＩ−ドメインポリペプチド発現又は活性を修飾（例えば上方調節又は下方調節）する作用薬（例えばここに解説するスクリーニング検定で同定した作用薬など）又は作用薬の組合せを投与することを含む。
【０１４９】
３． ファーマコゲノミクス
本発明のインテグリンＩ−ドメインポリペプチド分子や、インテグリンＩ−ドメインポリペプチド活性（例えばインテグリンＩ−ドメインポリペプチドの遺伝子発現）に対する刺激性もしくは阻害性作用を有することが、ここに解説するスクリーニング検定で判明した作用薬、又はモジュレータは、炎症性もしくは免疫疾患、及び／又は、細胞増殖性疾患などのインテグリン媒介疾患を処置（予防的もしくは治療的に）するために、個体に投与することができる。このような処置と関連して、ファーマコゲノミクス（即ち、個体の遺伝子型と、その個体の外来化合物又は薬物に対する応答との間の関係の研究）を考慮してもよい。治療薬の代謝の違いが原因で、薬理学的に活性な薬物の用量と血中濃度との関係が変化して、重篤な毒性もしくは治療上の失敗が起きる可能性がある。このように、担当医又は臨床医は、インテグリンＩ−ドメインポリペプチド分子（及び／又はそのモジュレータ）を投与するかどうかを決定したり、このような分子及び／又はモジュレータによる処置の投薬量及び／又は治療計画を調整する上で、関連するファーマコゲノミクス研究で得られた知見を応用することを考慮してもよい。
【０１５０】
ファーマコゲノミクスでは、薬物の性質が変化したり、患者で異常な働きをすることを原因とする、薬物に対する応答の臨床上有意な遺伝的ばらつきを扱う。例えばＥｉｃｈｅｌｂａｕｍ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２３（１０−１１）： ９８３−９８５ ａｎｄ Ｌｉｎｄｅｒ， Ｍ．Ｗ． ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ４３（２）：２５４−２６６を参照されたい。一般的には、二種類の薬理遺伝学的条件を区別できる。即ち、薬物が身体に作用する態様の違いを生ずる（薬物作用の違い）単一の因子として伝えられる遺伝的条件、又は、身体が薬物に働きかける態様の違いを生ずる（薬物代謝の違い）単一の因子として伝えられる遺伝的条件、である。これらの薬理遺伝学的条件は、まれな遺伝的欠陥として起きたり、又は、天然発生型の多型現象として起きたりする。例えば、グルコース−６−リン酸アミノペプチダーゼ欠損症（Ｇ６ＰＤ）は、よくある遺伝性酵素欠損症であり、その主な臨床上の合併症は、酸化剤薬物（抗マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛剤、ニトロフラン）の摂取後及びソラマメ摂取後の溶血である。
【０１５１】
「ゲノム−ワイド−アソシエーション（原語：ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）として公知の、薬物応答を予測する遺伝子を同定するファーマコゲノミクス的アプローチの一つは、既知の遺伝子関連マーカ（例えば、それぞれが二つのバリアントを有する、ヒトゲノム上で６０，０００乃至１００，０００箇所の多型性もしくは可変部位から成る「バイ−アレリック」遺伝子マーカマップなど）から成るヒトゲノムの高解像度マップに主に依拠するものである。このような高解像度遺伝子マップを、第２相／３相薬物治験に参加する統計上有意な数の患者のそれぞれのゲノムのマップに比較すると、観察された特定の薬物応答又は副作用に伴うマーカを特定することができる。あるいは、このような高解像度マップは、ヒトゲノム中の数千万の公知の単一塩基多型（ＳＮＰ）を組み合わせて作製することもできる。ここで用いる「ＳＮＰ」とは、ある範囲のＤＮＡ中の一個のヌクレオチド塩基に起き得るごく普通の変化である。例えば、ＳＮＰはＤＮＡの１０００塩基毎に一回、あると思われる。ＳＮＰは疾患のプロセスに関与していることもあるが、大半は疾患に関係ないであろう。このようなＳＮＰの存在に基づいた遺伝子マップを基に、個々のゲノム中のＳＮＰの特定のパターンに応じて、個体を遺伝子カテゴリーに分類することができる。このような方法で、このような遺伝子上似た個体間で共通であろう形質を考慮に入れながら、遺伝子的に似た個体群に合わせて、治療計画をテーラーメードすることができる。
【０１５２】
実例として、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強さ及び持続性の両方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（例えばＮ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）及びチトクロームＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝子多型の発見により、標準的かつ安全な用量の薬物を摂取した後の患者の中に、予測通りの薬物効果が得られなかったり、又は、過剰な薬物応答が起きて重篤な毒性を呈するような者がなぜいるかが、解明された。これらの多型は、集団中で、高代謝群（ＥＭ）及び低代謝群（ＰＭ）という二つの表現型で表される。ＰＭの頻度は集団によって異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は多型性が高く、いくつかの変異がＰＭで判明しているが、そのいずれも機能的ＣＹＰ２Ｄ６の欠損を起こす。ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｃ１９ による低代謝群は、標準的用量を摂取しても、過剰な薬物応答及び副作用を頻繁に起こす。代謝産物が有効治療成分の場合、ＰＭは、ＣＹＰ２Ｄ６がコデインから形成する代謝産物モルヒネの鎮痛効果で実証されるような、治療上の応答を示さない。反対の極端な例は、標準的用量では応答を生じないいわゆる超高代謝群である。最近、超高代謝群の分子的機序が解明されて、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の増幅が原因であることが分かった。
【０１５３】
あるいは、「遺伝子発現プロファイリング」と呼ばれる方法を用いて、薬物応答を予測する遺伝子を同定することもできる。例えば、ある薬物（例えばインテグリンＩ−ドメインポリペプチド分子又はインテグリンＩ−ドメインポリペプチドモジュレータ）を投薬した動物の遺伝子発現が、毒性に関係する遺伝子経路のスイッチが入ったかどうかを示す指標となることがある。
【０１５４】
上のファーマコゲノミクス的アプローチのうちの二つ以上から得られた情報を、個人の予防的もしくは治療的処置に適当な投薬量及び処置計画を決定するのに利用してもよい。この知見を、投薬量又は薬物の選択に利用すると、インテグリンＩ−ドメインポリペプチド分子や、ここで解説したスクリーニング検定例の一つで同定されたモジュレータなどのそのモジュレータで対象を処置したときの薬害反応又は治療の失敗を防ぎ、ひいては、治療もしくは予防効率を高めることができる。
【０１５５】
以下の実施態様では本発明をさらに解説するが、以下の例を限定的なものと捉えられてはならない。本出願を通じて引用された全参考文献、特許及び公開済み特許出願の内容や、図面及び配列表を、引用をもってここに援用することとする。
【０１５６】
実施例
実施例１ 開いたもしくは閉じたコンホメーションで固定したＬＦＡ−１ 及び Ｍａｃ−１ 変異型のデザイン
ＬＦＡ−１ Ｉドメインの現在の結晶及びＮＭＲ構造（Ｑｕ， Ａ ａｎｄ Ｌｅａｈｙ， ＤＪ （１９９５） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：１０２７７−１０２８１； Ｑｕ， Ａ ａｎｄ Ｌｅａｈｙ， ＤＪ （１９９６） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４：９３１−９４２； Ｋａｌｌｅｎ， Ｊ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９２：１−９） は、Ｍａｃ−１Ｉドメインの低親和性の閉じたコンホーマ（１ｊｌｍ）と類似のコンホメーションを有している（Ｌｅｅ， Ｊ−Ｏ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｃｅｌｌ ８０：６３１−６３８）。従って、Ｍａｃ−１ Ｉ ドメインの高親和性の開いたコンホーマ（１ｉｄｏ） （Ｌｅｅ， Ｊ−Ｏ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３：１３３３−１３４０）を用いて、高親和性の開いたＬＦＡ−１ Ｉ ドメインのモデルを作製した。このモデルのテンプレートは、Ｃα骨格が１ｊｌｍ構造とは著しく異なる領域の１ｉｄｏ構造部分と、１ｉｄｏ 及び１ｊｌｍ が類似である領域の１ｌｆａ構造部分とから成る。
【０１５７】
簡単に説明すると、以下のタンパク質データバンク（ＰＤＢ）同定記号：Ｍａｃ−１、１ｉｄｏ 及び１ｊｌｍ （Ｌｅｅ， Ｊ−Ｏ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３：１３３３−１３４０； Ｌｅｅ， Ｊ−Ｏ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｃｅｌｌ ８０：６３１−６３８）； ＬＦＡ−１、１ｌｆａ 分子Ａ 及び Ｂ （Ｑｕ， Ａ ａｎｄ Ｌｅａｈｙ， ＤＪ （１９９５） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：１０２７７−１０２８１）、１ｚｏｎ 及び １ｚｏｐ （Ｑｕ， Ａ ａｎｄ Ｌｅａｈｙ， ＤＪ （１９９６） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４：９３１−９４２）； 及びＶＬＡ−２、１ａｏｘ （Ｅｍｓｌｅｙ， Ｊ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２：２８５１２−２８５１７） を持つＩドメインを、Ｃαカーボン、ＭＯＤＥＬＬＥＲ ４の ＣＤ ＭＡＬＩＧＮ アルゴリズム（Ｓａｌｉ， Ａ ａｎｄ Ｂｌｕｎｄｅｌｌ， ＴＬ （１９９３） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２３４：７７９−８１５）、１オングストロームのギャップ伸長ペナルティを用いて構造を重層した。このアルゴリズムでは、重層に用いられた１２１のフレームワーク残基が見つかった。次に配列のアラインメントを行った。１ｉｄｏ 及び１ｊｌｍ 構造をそれらの配列でアラインメントし、そして１ｌｆａ 分子 Ａ 及び １ｚｏｎ は１ｊｌｍに対する構造上の類似性でアライメントした。構造の重層と配列のアラインメントを利用して、対応するの配列位置にあるすべてのＣαカーボン同士の距離を、マイクロソフト・エクセル・スプレッドシートを用いて計算した。これは、 １ｊｌｍと １ｉｄｏ を比較するのと同等の意味になるが（Ｌｅｅ， Ｊ−Ｏ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３：１３３３−１３４０）、例外としてＬＦＡ−１ Ｉ ドメイン構造も含めた。高親和性の開いたＬＦＡ−１ Ｉドメインモデルのテンプレートとして用いるために、１ｌｆａ 分子Ａのうちで、四つのＩドメイン同士の間の違いが小さいか、又は、１ｌｆａ及び１ｊｌｍ（低親和性の閉じたＬＦＡ−１及びＭａｃ−１ Ｉドメイン）間の違いが１ｉｄｏ及び１ｊｌｍ間（開いた及び閉じたＭａｃ−１ Ｉドメイン）よりも大きいような、いくつかのセグメントを選び出した。１ｉｄｏからは、１ｉｄｏと１ｊｌｍとの違いが１ｌｆａと１ｊｌｍとの違いよりも大きいいくつかのセグメントを選び出した。これらのセグメントを、骨格ができるだけ同じになるような領域で一緒にスプライスした。このように、当該テンプレートは、１ｌｆａのセグメントＧ１２８ から Ｆ１３６、Ｍ１５４ から Ｌ２０３、Ｆ２０９からＬ２３４、Ｔ２４３ からＩ２５５、及びＥ２７２ からＡ２８２ ；及び１ｉｄｏのセグメント Ｄ１４０ からＦ１５６、Ｇ２０７ からＴ２１１、Ｖ２３８から Ｋ２４５、Ｒ２６６ からＲ２８１、及びＲ２９３からＫ３１５を用いていた。ＬＯＯＫＴＭ（カリフォルニア州パロアルト、モラキュラー・アプリケーション・グループ）では、ｌｆａ−ｍａｃと呼ぶスプライス後のテンプレートに、鎖のちぎれは検出されなかった。高親和性の開いた形のＬＦＡ−１ のモデルを、ＭＯＤＥＬＬＥＲ ４ＴＭで、このテンプレートと、１ｉｄｏのＭｇ２＋、水分子４０３ 及び ４０４ を用い、ヘテロ原子、水、及び水素の添加を「入り」に、そしてクーロン力を「入り」にして、作製した。その結果得られたモデル（ｌｆａ＿ｈｉ．０６３）はテンプレートＣα座標に近似していた （ＲＭＳ ＝ ０．１２オングストローム）。ＱＵＡＣＨＫスコア （Ｖｒｉｅｎｄ， Ｇ （１９９０） Ｊ Ｍｏｌ Ｇｒａｐｈ ８：５２−５６） は優秀 （ｌｆａ−ｍａｃ テンプレートでは−０．２１５、１ｉｄｏでは−０．０８ 、そして１ｌｆａでは０．０とは対照的に、−０．１３５）だった。
【０１５８】
二つの適当な位置にある対の残基をシステインに変異させれば、ジスルフィド結合を導入できそうな位置を、ＳＳＢＯＮＤ プログラム（Ｈａｚｅｓ， Ｂ ａｎｄ Ｄｉｊｋｓｔｒａ， ＢＷ （１９８８） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２：１１９−１２５） を用いて特定した。ＬＦＡ−１ Ｉドメインを開いたもしくは閉じたコンホメーションのいずれかに固定するのに、ジスルフィド結合を利用できるのではないかと、仮説を立てた。
【０１５９】
高親和性の開いたＬＦＡ−１ Ｉ ドメインモデル（１ｆａ＿ｈｉ．０６３ モデル）と、二つの低親和性の閉じたＬＦＡ−１ Ｉ ドメイン構造である１ｌｆａ 及び１ｚｏｎを、ＳＳＢＯＮＤ で調べ、１４乃至１９対のこのような残基を各構造に見出した。これらのうち、高親和性の開いたモデルの一対の残基と、低親和性の閉じた構造中の一対の残基とが、二つのコンホーマのうちで大規模な移動を行った結果、ジスルフィド結合の形成は一方のコンホーマでしか起きなかった（図１）。これらのジスルフィドは、βストランド６をＣ末端αへリックスα６に架橋する。βストランド及びαへリックスの番号は、Ｉドメイン間で異なる。我々は統一した命名法を用いている（Ｈｕａｎｇ， Ｃ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２７５：２１５１４−２４）。へリックスα６はその軸方向に、高親和性の開いた構造のＩドメイン本体を下へ１０オングストローム移動する。この移動には、β６及びα６間のループの完全なリモデリング及び下向きのシフトが伴う。Ｋ２８７及びＫ２９４の代わりに導入されるシステインは、高親和性の開いたコンホーマでのみジスルフィドを形成するため、Ｉドメインを高親和性の開いた状態に固定するだろうと予測した（図２）。Ｋ２８７ 及びＫ２９４のＣβカーボンは、高親和性の開いたモデル （１ｆａ＿ｈｉ．０６３）では、ジスルフィド結合にとって理想的な３．４１乃至４．２５オングストロームの範囲内である３．８オングストローム、離れていると予測でき、Ｃβ−Ｓγ及びＳγ−Ｓγ距離を調べると、四つの好ましい側鎖ジスルフィドコンホメーションを有することが見出された。対照的に、低親和性の閉じたコンホーマ １ｌｆａ 及び１ｚｏｎでは、これらの残基のＣβ原子同士は８．９ 乃至９．２オングストローム、離れている（図２）。
【０１６０】
Ｌ２８９及びＫ２９４ の代わりに導入するシステインは、親和性の低い閉じたコンホーマ（図２）のみでジスルフィドを形成して、このＩドメインを低親和性の閉じた状態に固定すると予測された。Ｌ２８９ 及びＫ２９４ のＣβカーボン同士は、低親和性の閉じた１ｌｆａ及び１ｚｏｎコンホーマでは、好ましい範囲内である３．９乃至４．０オングストローム離れているが、好ましいシステイン側鎖コンホメーションは見つからなかった。しかしながら、残基２９４が存在するαへリックスは、１ｌｆａ、１ｚｏｎ、及び最近のＮＭＲ 構造（Ｑｕ， Ａ ａｎｄ Ｌｅａｈｙ， ＤＪ （１９９５） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：１０２７７−１０２８１； Ｑｕ， Ａ ａｎｄ Ｌｅａｈｙ， ＤＪ （１９９６） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４：９３１−９４２； Ｋａｌｌｅｎ， Ｊ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９２：１−９）間で小さな変位を示し、αへリックスを微調節すればジスルフィドが形成されるのではないかと予測された。対照的に、高親和性の開いたモデルでは、これらの残基のＣβ原子は、８．０オングストローム離れていると予測できる（図２）。
【０１６１】
予測上のシステインが存在し、適当な場合にはジスルフィド結合が形成されているようなモデルも、ＭＯＤＥＬＬＥＲ ４のＰＡＴＣＨ ＤＩＳＵＬＦＩＤＥ ルーチンを用いて構築した（図２）。しかし、ここで報告されているすべてのＣβ原子距離は、ジスルフィドを導入していないモデル又は構造に基づくものであることに注意されたい。
【０１６２】
コンホメーション特異的なジスルフィド架橋を形成するための対のシステイン置換を探すコンピュータ検索に加え、構造を基にした手動的方法（又は視覚的検査）も用いた。開いたコンホメーションと閉じたコンホメーションというコンホメーション間で異なるＩドメインの領域を検査して、一方のコンホメーションが他方のコンホメーションに比べてジスルフィドが形成され易いような、対のシステインを導入できそうな位置を探した。このように、コンホメーション上可動のＣ末端αへリックスの領域と、それに先行するループを調べて、一個のシステインを導入できそうな位置を探し、また構造上隣接する領域を調べて、ジスルフィド結合を形成するであろう第二のシステインを導入できそうな位置を探した。側鎖が互いに向かい合う対の残基を選んだ。これらの対のそれぞれのＣα及びＣβ原子間の距離を、ソフトウェアＬＯＯＫＴＭで、開いた及び閉じたコンホメーションの両方で測定した。ジスルフィド結合が形成されるのに理想的なシステインＣβカーボンの分離は３．４１乃至４．２５オングストロームであると報告されている。しかしながら、これらを測定した結晶構造又はモデルは、平均的なスナップショットの位置を示すものであり、他方、タンパク質は動的であり、その原子は可動性である。さらに、ジスルフィド結合を取り入れるよう、構造調節も可能である。βシートよりもループ及びαへリックスでの方が、はるかに多くの調節が可能であると期待できる。従って、残基の一つがループ内又はへリックス内にあると、ジスルフィド形成に、より長い距離を持たせることができると予測した。
【０１６３】
αＬの場合、Ｃα−Ｃα及びＣβ−Ｃβ距離が、開いたコンホメーションの方が閉じたコンホメーションよりもジスルフィド形成にとって、より好適になっている４対のシステイン置換が見つかった； Ｅ２８４Ｃ／Ｅ３０１Ｃ、Ｌ１６１Ｃ／Ｆ２９９Ｃ、Ｋ１６０Ｃ／Ｆ２９９Ｃ、及びＬ１６１Ｃ／Ｔ３００Ｃ （表１）。
【０１６４】
αＭの場合、Ｃα−Ｃα及びＣβ−Ｃβ距離が、開いたコンホメーションの方が閉じたコンホメーションよりもジスルフィド形成にとって、より好適になっている４対のシステイン置換が見つかった；Ｑ１６３Ｃ／Ｑ３０９Ｃ、Ｑ２９８Ｃ／Ｎ３０１Ｃ、Ｄ２９４Ｃ／Ｔ３０７Ｃ、及びＤ２９４Ｃ／Ｑ３１１ｃ （表７）、そしてＣα−Ｃα及びＣβ−Ｃβの距離が、開いたコンホメーションより閉じたコンホメーションの方がジスルフィド形成にとって好適になっている１対のシステイン置換が見られた：Ｑ１６３Ｃ／Ｒ３１３Ｃ。加えて、αＬでのＫ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃの変異に相似のＦ２９７Ｃ／Ａ３０４Ｃも含めた。
【０１６５】
実施例２ ＬＦＡ−１システイン置換変異型の構築及び発現
５種の開いたαＬ Ｉ−ドメイン変異型を作製した。高親和性の開いた変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃを作製するために、αＬサブユニットのＩ−ドメインのＫ２８７及びＫ２９４をシステインに置換した。高親和性の開いた変異型Ｅ２８４Ｃ／Ｅ３０１Ｃを作製するには、αＬサブユニットのＩ−ドメインのＥ２８４及びＥ３０１をシステインに置換した。加えて、３種類の中間の親和性の開いたαＬ Ｉ−ドメイン変異型を作製したが、ここで以下：Ｌ１６１Ｃ／Ｆ２９９Ｃ、Ｋ１６０Ｃ／Ｆ２９９Ｃ、及びＬ１６１Ｃ／Ｔ３００Ｃと特定しておく。Ｌ１６１Ｃ／Ｆ２９９Ｃは、Ｌ１６１及びＦ２９９をシステインに置換して作製した。Ｋ１６０Ｃ／Ｆ２９９Ｃは、Ｋ１６０及びＦ２９９をシステインに置換して作製した。Ｌ１６１Ｃ／Ｔ３００Ｃは、Ｌ１６１及びＴ３００をシステインに置換して作製した。低親和性の閉じた変異型 Ｌ２８９Ｃ／Ｋ２９４Ｃは、Ｌ２８９ 及びＫ２９４をシステインに置換して作製した。これらの６種類の変異型の変異させた残基同士の距離を下の表１に示す。また、一箇所だけシステインを置換した変異型Ｋ２８７Ｃ、Ｌ２８９Ｃ及びＫ２９４Ｃも作製した。
【０１６６】
【表１】
Figure 2004527217
開いたコンホメーション又は閉じたコンホメーションにおける野生型残基間の距離はＬｏｏｋＴＭソフトウエアで測定した。
【０１６７】
ヒトαＬ ｃＤＮＡをＣＤＭ８の誘導体であるベクタＡｐｒＭ８に入れた（Ｓｅｅｄ， Ｂ ａｎｄ Ａｒｕｆｆｏ， Ａ （１９８７） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４：３３６５−３３６９）。重複伸長ＰＣＲ法を用いてシステイン置換変異をαＬ Ｉ−ドメインに起こした（Ｈｏ， ＳＮ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｇｅｎｅ ７７：５１−５９； Ｈｏｒｔｏｎ， ＲＭ ｅｔ ａｌ． （１９９０） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ８：５２８）。ＰＣＲ伸長反応用の外側左側のプライマは、ベクタの配列に、１８２６位でＥｃｏＲＩ部位の５’末端に相補的であり、外側右側のプライマは、αＬ ｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ部位の３’末端にあった。内側のプライマは、それぞれ個々の変異用にデザインされており、重複配列を含有していた。ＡｐｒＭ８中の野生型αＬ ｃＤＮＡを、一回目のＰＣＲ反応のテンプレートとして用いた。二回目のＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化し、ＡｐｒＭ８中の野生型αＬ ｃＤＮＡの同じ部位に連結した。インサートの方向が正しいかを、制限酵素消化で確認した。変異はすべて、ＤＮＡ配列決定法で確認した。
【０１６８】
安定に発現させるために、αＬ野生型及び変異型のｃＤＮＡのＸｂａＩ断片を、安定発現ベクタｐＥＦｐｕｒｏの同じ部位にサブクローンした （Ｌｕ， Ｃ ａｎｄ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， ＴＡ． （１９９７） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５９：２６８−２７８）。
【０１６９】
変異型のαＬサブユニットを、β２サブユニットと一緒に２９３Ｔ細胞で一過的に共発現させ、αＬ／β２複合体の細胞表面上の発現を、αＬ／β２複合体中のαＬサブユニットに対するモノクローナル抗体ＴＳ２／４を使ったフローサイトメトリで調べた。
【０１７０】
簡単に説明すると、ヒト胚性腎２９３Ｔ細胞（ＳＶ４０で形質転換させたもの）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン及び５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加したＤＭＥＭ培地で培養した。２９３Ｔ細胞をリン酸カルシウム法を用いて一過的にトランスフェクトした （ＤｕＢｒｉｄｇｅ， ＲＢ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ７：３７９−３８７； Ｈｅｉｎｚｅｌ， ＳＳ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６２：３７３８−３７４６）。簡単に説明すると、プラスミドＡｐｒＭ８に入れた７．５μｇの野生型もしくは変異型αＬ ｃＤＮＡと、ＡｐｒＭ８に入れた７．５μｇのβ２ ｃＤＮＡを用いて、７０乃至８０％コンフルエントの細胞の１枚の６ｃｍプレートを同時トランスフェクトした。トランスフェクト後２日目に、５ｍＭのＥＤＴＡを含有するハンクス液（ＨＢＳＳ）を用いてプレートから細胞を剥がし、ＬＦＡ−１の発現を調べ、機能解析を行った。
【０１７１】
既述（Ｌｕ， Ｃ ａｎｄ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， ＴＡ （１９９７） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５９：２６８−２７８）のようにフローサイトメトリ解析を行った。簡単に説明すると、細胞を洗浄し、２．５％ＦＢＳを添加したＬ１５培地（シグマ社製）（Ｌ１５／ＦＢＳ）中に再懸濁させた。１×１０×１０５細胞を、１００μｌのＬ１５／ＦＢＳ内の一次抗体と一緒に氷上で３０分間、インキュベートした。モノクローナル抗体を、１：２０のハイブリドーマ上清、１：２００の腹水、又は１０μｇ／ｍｌ精製ＩｇＧの最終濃度になるように用いた。次に細胞をＬ１５／ＦＢＳで２回、洗浄し、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（重鎖及び軽鎖、カリフォルニア州サンフランシスコ、ザイメッド・ラボラトリーズ社製）と一緒に３０分間、氷上でインキュベートした。洗浄後、細胞を低温のＰＢＳ中に再懸濁させ、ＦＡＣＳｃａｎ （カリフォルニア州サンホセ、ベクトン・ディッキンソン社製）で解析した。
【０１７２】
図３Ａに示すように、推定上の高及び低親和性の変異型と、システイン置換を一箇所のみした変異型とでは、発現した細胞表面αＬ／β２複合体は、同様なレベルであった。
【０１７３】
システインの導入が、Ｉ−ドメインの全体的なコンホメーションに影響を与えるかどうかを調べるために、Ｉ−ドメインの様々な領域に対する一パネルのモノクローナル抗体を、Ｉ−ドメイン変異型との各々の反応性についてテストした。これらの研究で用いたモノクローナル抗体は以下の通りである：
【０１７４】
マウス抗ヒトαＬ（ＣＤ１１ａ） モノクローナル抗体ＴＳ１／１１、ＴＳ１／１２、ＴＳ１／２２、ＴＳ２／４、ＴＳ２／６ 及びＴＳ２／１４；抗−β２（ＣＤ１８）モノクローナル抗体ＴＳ１／１８、ＣＢＲＬＦＡ−１／２、及びＣＢＲＬＦＡ−１／７；ｍＡｂ ＹＦＣ５１；及び非結合性のｍＡｂ Ｘ６３が以前に解説されている（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄ， Ｆ ｅｔ ａｌ． （１９８２） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７９：７４８９−７４９３； Ｈａｌｅ， ＬＰ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ３２：２２−３０； Ｐｅｔｒｕｚｚｅｌｌｉ， Ｌ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５５：８５４−８６６）。モノクローナル抗体ＢＬ５、Ｆ８．８、２５−３−１、Ｍａｙ．０３５、ＣＢＲＬＦＡ−１／９、ＣＢＲＬＦＡ−１／１、Ｓ６Ｆ、及びＭａｙ．０１７ は、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｅ Ｖ に解説されており、フィフス・インターナショナル・ロイコサイト・ワークショップスから入手した。
【０１７５】
モノクローナル抗体Ｘ６３ 及びＴＳ１／１１を、ハイブリドーマ上清の形で、１：２０の希釈度で用い、モノクローナル抗体ＴＳ１／１２、ＤＢＲＬＦＡ−１／２、ＣＢＲＬＦＡ−１／７ 及びＹＦＣ５１を、精製済みＩｇＧとして、１０μｇ／ｍｌ用い、モノクローナル抗体ＴＳ１／２、ＴＳ２／１４、ＴＳ１／１８ 及びＴＳ２／４は腹水の形で、１：２００の希釈度で用い、そしてフィフス・インターナショナル・ロイコサイト・ワークショップスから得たモノクローナル抗体はすべて、１：２００の希釈度で用いた。ＣＢＲＬＦＡ−１／１を除き、抗体はすべて、変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ及びＬ２８９Ｃ／Ｋ２９４Ｃ と野生型 ＬＦＡ−１に同等に良好に結合した（表２）。このことは、当該システイン置換が、Ｉ−ドメイン構造を破壊しなかったことを示唆している。モノクローナル抗体ＣＢＲＬＦＡ−１／１ の、高親和性の開いた変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ への結合は、野生型の４０乃至５０％に低下していたが、この抗体は変異型Ｌ２８９Ｃ／Ｋ２９４Ｃや、一箇所のみシステイン置換した変異型Ｋ２８７Ｃ、Ｌ２８９Ｃ及びＫ２９４Ｃとも、野生型とも反応した。抗体ＣＢＲＬＦＡ−１／１は残基３０１位〜３５９位に位置し （Ｈｕａｎｇ， Ｃ ａｎｄ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， ＴＡ （１９９５） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：１９００８−１９０１６）、Ｋ２８７及びＫ２９４の一箇所のみのシステイン置換は、この抗体の結合に影響しなかったため、ＣＢＲＬＦＡ−１／１の変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃへの結合の低下は間接的な効果であると思われる。従って、変異型 Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４ＣのＩ−ドメインとβ−プロペラドメインとの間の界面におけるコンホメーションは、野生型ＬＦＡ−１のそれとは異なるのであろう。
【０１７６】
αＬのβ−プロペラドメインやβ２サブユニットに対する抗体の、変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ及びＬ２８９Ｃ／Ｋ２９４Ｃとの反応性は、野生型ＬＦＡ−１のそれと同様であり、ＬＦＡ−１分子の他のドメインの構造が変異の影響を受けていないことが確認できた。
【０１７７】
【表２】
Figure 2004527217
【０１７８】
野生型ＬＦＡ−１及びＬＦＡ−１変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ、Ｌ２８９Ｃ／Ｋ２９４Ｃ、Ｋ２８７Ｃ、Ｌ２８９Ｃ、及びＫ２９４Ｃを、２９３Ｔ細胞の表面上に一過的に発現させるか、又はＫ５６２トランスフェクタント上で安定に発現させた。これらトランスフェクタントとの抗体の反応性をフローサイトメトリで調べた。各抗体の結合の平均蛍光をウェルで正規化した。結果を、野生型結合に対するパーセントで表す。データは少なくとも二つの独立したＦＣＡＳ実験の平均±ＳＤである。いくつかの抗体では、実験を一回のみ行った。ＮＤは決定できずを示す。
【０１７９】
実施例３ ＬＦＡ−１システイン置換変異型のリガンド結合活性
ＬＦＡ−１システイン置換変異型のＬＦＡ−１リガンドＩＣＡＭ−１に対する結合能を調べた。野生型ＬＦＡ−１と、推定上の高親和性の開いたＩ−ドメイン変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃを発現する２９３Ｔ細胞トランスフェクタントは、固定化ＩＣＡＭ−１に対して構成的に強い結合を示した（図４Ａ）。対照的に、低親和性の閉じた変異型Ｌ２８９Ｃ／Ｋ２９４ＣはＩＣＡＭ−１に結合しなかった。システイン置換が一箇所である変異型Ｋ２８７Ｃ及びＬ２８９Ｃの呈するＩＣＡＭ−１への結合は低いが、変異型Ｋ２９４Ｃの結合は野生型のそれに匹敵した。変異型Ｋ２８７Ｃ及びＬ２８９Ｃの結合は、活性化モノクローナル抗体ＣＢＲＬＦＡ−１／２により、野生型の結合と同様のレベルまで上昇した。しかしながら、ＣＢＲＬＦＡ−１／２は、低親和性の閉じた変異型Ｌ２８９Ｃ／Ｋ２９４ＣのＩＣＡＭ−１への結合を活性化できなかった（図４Ａ）。同様な結果は、２種の他のＬＦＡ−１活性化モノクローナル抗体Ｋｉｍ１２７及びＫｉｍ１８５でも得られた。推定上の高親和性の変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ及び低親和性の閉じた変異型Ｌ２８９Ｃ／Ｋ２９４Ｃの機能をさらに研究するために、これらの変異型を発現する安定なＫ５６２トランスフェクタントを作製した。
【０１８０】
簡単に説明すると、ヒト赤白血病細胞株Ｋ５６２をＲＰＭＩ １６４０、１０％ ＦＢＳ 及び５０μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン中で培養した。安定なＫ５６２細胞株を作製するために、αＬサブユニットｃＤＮＡを含有する２μｇのＰｖｕＩ−直線化ｐＥＦｐｕｒｏに、β２サブユニットｃＤＮＡを含有する４０μｇのＳｆｉＩ−直線化ＡｐｒＭ８を、２５０Ｖ及び９６０μＦでのエレクトロポレーションで同時トランスフェクトした。４μｇ／ｍｌのプロマイシン（シグマ社製）に対する耐性でトランスフェクタントを選択し、限界希釈でサブクローンした。安定な細胞株をすべて、４μｇ／ｍｌプロマイシンを添加したＲＰＭＩ １６４０、１０％ ＦＢＳ中に維持した。
【０１８１】
モノクローナル抗体ＴＳ２／４を用いたフローサイトメトリで調べたときに同様なレベルの細胞表面ＬＦＡ−１を発現していたトランスフェクタントのクローン（図３Ｂ）を既述（Ｌｕ， Ｃ ａｎｄ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， ＴＡ （１９９７） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５９：２６８−２７８）のように、固定化ＩＣＡＭ−１への結合能についてテストした。
【０１８２】
簡単に説明すると、既述（Ｌｕ， Ｃ ａｎｄ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， ＴＡ （１９９７） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５９：２６８−２７８）のように、ＩＣＡＭ−１をヒト口蓋扁桃から精製し、９６穴プレートにコートした。細胞に蛍光染料 ２’，７’−ビス−（カルボキシエチル）−５（及び−６）−カルボキシフルオレセイン、アセトキシメチルエステル（ＢＣＥＣＦ−ＡＭ）で標識し、１ ×１０６／ｍｌ になるようにＬ１５／ＦＢＳ中に再懸濁させた。５０μｌの細胞懸濁液を、ＩＣＡＭ−１でコートしたたウェルの中で、モノクローナル抗体（ＣＢＲＬＦＡ−１／２、１０μｇ／ｍｌ）を加えてもしくは加えずに、等量のＬ１５／ＦＢＳと混合した。モノクローナル抗体は、最終濃度で、１：２０のハイブリドーマ上清、１：２００の腹水又は１０μｇ／ｍｌの精製済ＩｇＧを用いた。２価陽イオンの効果をテストするために、ＢＣＥＣＦ−ＡＭで標識した細胞を、５ｍＭのＥＤＴＡを含有するＴＳ緩衝液、ｐＨ７．５ （２０ ｍＭ トリス、ｐＨ ７．５、１５０ ｍＭ ＮａＣ１）で２回、洗浄した後、ＴＳ 緩衝液、ｐＨ７．５で２回、洗浄した。次に細胞を、１ ｍＭ ＭｇＣｌ２／ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２又は５ｍＭ ＥＤＴＡを添加した ＴＳ 緩衝液、ｐＨ７．５中に５×１０５／ｍｌ になるように、再懸濁させ、１００μｌの細胞懸濁液を、ＩＣＡＭ−１でコートしたウェルに加えた。３７℃で３０分間インキュベートした後、結合しなかった細胞をマイクロプレート・オートワッシャ（ヴァーモント州ウィヌースキ、バイオ−テック・インスツルメンツ社製）で洗い落とした。各ウェル中の総投入細胞及び結合した細胞の蛍光量を、フルオレセント・コンセントレーション・アナライザ（メーン州ウェストブルック、ＩＤＥＸＸ社製）で定量した。結合した細胞は、サンプルウェル当たりの総投入細胞のパーセンテージで表した。
【０１８３】
野生型ＬＦＡ−１を発現するＫ５６２トランスフェクタントが示したＩＣＡＭ−１への基礎結合量は低かったが、この結合は、活性化モノクローナル抗体 ＣＢＲＬＦＡ−１／２により大きく上昇した（図４Ｂ）。対照的に、推定上の高親和性の開いた変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃを発現している細胞は、ＩＣＡＭ−１に強く結合し、モノクローナル抗体ＣＢＲＬＦＡ−１／２ によっても、この変異型の結合がそれ以上、高められることはなかったが、一方、推定上の低親和性の閉じた変異型 Ｌ２８９Ｃ／Ｋ２９４Ｃは、活性化抗体が存在した場合でも、ＩＣＡＭ−１に結合しなかった。
【０１８４】
Ｋ５６２トランスフェクタントのＩＣＡＭ−１への結合に二価陽イオンが及ぼす作用も調べた。図４Ｃに示すように、変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４ＣのＩＣＡＭ−１への結合はＥＤＴＡがあると妨げられたことから、変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃのリガンド結合は二価イオン依存的であることが裏付けられた。他方、野生型ＬＦＡ−１の結合はＭｎ２＋があると大きく高まり、またＭｇ２＋があっても程度は劣るが高まったが、低親和性の閉じた変異型Ｌ２８９Ｃ／Ｋ２９４Ｃのリガンドへの結合は、Ｍｎ２＋及びＭｇ２＋があっても増加しなかった。
【０１８５】
野生型ＬＦＡ−１、変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ、又は変異型Ｌ２８９Ｃ／Ｋ２９４Ｃを発現したＫ５６２トランスフェクタントへの可溶性ＩＣＡＭ−１の結合も評価した。簡単に説明すると、既述（Ｍａｒｔｉｎ， Ｓ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６７：３５６１−３５６８）のように、ヒトＩＣＡＭ−１の５つのＩｇドメインを含有する可溶性ＩＣＡＭ−１−ＩｇＡキメラを、モノクローナル抗体Ｒ６．５アフィニティ・クロマトグラフィにより、安定なＣＨＯトランスフェクタントの培養上清から精製した。Ｋ５６２トランスフェクタントをＬ１５／ＦＢＳで一回、洗浄し、同じ緩衝液中に１×１０７／ｍｌになるように再懸濁させた。２５μｌの細胞懸濁液を、抗体ＣＢＲＬＦＡ−１／２（１０μｇ／ｍｌ）を加えたもしくは加えない、ＩＣＡＭ−１−ＩｇＡ融合タンパク質を最終濃度１００μｇ／ｍｌで含有する２５μｌのＬ１５／ＦＢＳに混合し、３７℃で３０分間、インキュベートした。インキュベート後、細胞をＬ１５／ＦＢＳで一回、洗浄し、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＡ （シグマ社製）と一緒に室温で２０分間、インキュベートした。２回洗浄後、細胞をＰＢＳ中に再懸濁させ、ＦＡＣＳｃａｎ （カリフォルニア州サンホセ、ベクトン・ディッキンソン社製）で解析した。
【０１８６】
図５に示すように、可溶性のＩＣＡＭ−１−ＩｇＡ融合タンパク質は、高親和性の開いた変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃを発現している細胞に結合し、活性化モノクローナル抗体ＣＢＲＬＦＡ−１／２の存在下では、結合は更に増加した。しかしながら、ＩＣＡＭ−１融合タンパク質は、野生型ＬＦＡ−１を発現していたトランスフェクタントにも、あるいは低親和性の閉じた変異型Ｌ２８９Ｃ／Ｋ２９４Ｃを発現していたトランスフェクタントにも、モノクローナル抗体ＣＢＲＬＦＡ−１／２が存在してもしなくとも結合しなかった。またＩＣＡＭ−１融合タンパク質濃度を高く（３００μｇ／ｍｌ）しても、結合は検出されなかった。
【０１８７】
これらのデータをまとめると、高親和性の開いた変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ は、構成的に活性であるが、他方、低親和性の閉じた変異型Ｌ２８９Ｃ／Ｋ２９４Ｃは、不活性の状態で固定されており、リガンド結合能に欠けると思われる。
【０１８８】
別の研究では、αＬ及びβ２サブユニットの様々なドメインに対する一パネルのモノクローナル抗体を、野生型ＬＦＡ−１及び変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃのリガンド結合に及ぼすそれらの阻害作用について調べた。２９３Ｔ一過性トランスフェクタント及びＫ５６２安定トランスフェクタントで得られた結果は同様であり、表３に要約する。ＣＢＲＬＦＡ−１／１を除くすべての抗体は、高親和性の開いた変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃや野生型と反応した（表２）が、野生型ＬＦＡ−１及び変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃのリガンド結合に対してこれらが示した阻害作用は異なった。
【０１８９】
図３に示すように、Ｉ−ドメイン抗体は、野生型ＬＦＡ−１及び高親和性の開いた変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４ＣのＩＣＡＭ−１への結合を示差的に阻害した。モノクローナル抗体ＢＬ５、Ｆ８．８、ＣＢＲＬＦＡ−１／９、Ｍａｙ．０３５、ＴＳ１／２２及びＴＳ２／６ は、野生型及び変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃの両方の結合を強く阻害し、野生型ＬＦＡ−１と変異型とに対する阻害のレベルは同様であった。モノクローナル抗体ＴＳ１／１１ 及びＴＳ１／１２は、野生型ＬＦＡ−１を発現するトランスフェクタントの結合の９０％を越える結合を阻害した。一方、これらの抗体が、変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃに対して示す結合阻害作用はそれより低かった（４０〜６０％）。野生型の結合に対して９０％を越える阻害を示したモノクローナル抗体ＴＳ２／１４、２５−３−１ 及びＣＢＲＬＦＡ−１／１ は、変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４ＣのＩＣＡＭ−１への結合はほとんど阻害しなかった。β−プロペラドメイン抗体Ｓ６Ｆ１ 及びＴＳ２／４ と、β２サブユニットのＣ末端領域に対する抗体ＣＢＲＬＦＡ−１／７ は、野生型及び変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃの両方で結合を阻害しなかったが、β２保存ドメインに対する５種の抗体ＴＳ１／１８、ＹＦＣ５１、ＣＬＢＬＦＡ−１／１、Ｍａｙ．０１７、及び６．５Ｅはすべて、野生型ＬＦＡ−１の結合は阻害した（９０％を越える阻害）が、変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃの結合は阻害しなかった。
【０１９０】
β−プロペラドメインに対する抗体と、β２のＣ末端領域に対する抗体は、野生型ＬＦＡ−１の結合も、又は変異型Ｋ２８７／Ｋ２９４Ｃの結合も阻害しなかった。βサブユニットのＩ−様ドメインに対する抗体は、野生型ＬＦＡ−１のＩＣＡＭ−１への結合を遮断したが、変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃは遮断しなかった。
【０１９１】
【表３】
Figure 2004527217
【０１９２】
野生型ＬＦＡ−１及びＬＦＡ−１変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃを、２９３Ｔ細胞表面上で一過的に発現させるか、又は、Ｋ５６２トランスフェクタントで安定に発現させた。このトランスフェクタントの固定化ＩＣＡＭ−１への結合を、図示した抗体の存在下で調べた。野生型ＬＦＡ−１を発現するＫ５６２トランスフェクタントの結合については、細胞を、１０μｇ／ｍｌの活性化ｍＡｂ ＣＢＲＬＦＡ−１／２と一緒に３０分間、プレインキュベートした。図示のデータは、少なくとも二つの独立した実験の％阻害±ＳＤである。％阻害は、図示のｍＡｂの存在時に結合した細胞の％／非結合性ｍＡｂＸ６３の存在時に結合した細胞の％×１００、であると定義しておく。いくつかの抗体では、実験を一回のみ行った。しかし、各実験において、各抗体は三重反復試験し、三重試験試料の標準偏差は５％未満であった。ＮＤは決定できずを表す。
【０１９３】
まとめると、これらの結果は、Ｉ−ドメイン抗体の一部と、β２保存ドメインに対する抗体は、ＬＦＡ−１のＩＣＡＭ−１への結合を直接的には遮断しないこと、そして、高親和性の開いた変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃは、高親和性の開いた状態でコンホメーション上固定されていると思われ、従って、間接的な機序でリガンド結合を遮断するような抗体は、変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４ＣのＩＣＡＭ−１への結合を遮断しないであろうこと、を示唆している。
【０１９４】
本発明の高親和性の開いたＩ−ドメインは、ＬＦＡ−１の直接的／競合的な阻害と、間接的／非競合的な阻害との間を区別するのに利用できる。例えば、ＬＦＡ−１阻害剤であるロバスタチンは、Ｉ−ドメインに、βシートとＣ末端αへリックスが形成する疎水性のポケットで結合する（Ｋａｌｌｅｎ， Ｊ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９２：１−９）という、間接的な機序でＬＦＡ−１を阻害する。従って、高親和性Ｉ−ドメイン（Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ）のリガンド結合を阻害する上でのロバスタチンの阻害能を評価した。ＤＭＳＯに溶解させた５０ｍＭのロバスタチンを検定緩衝液中に希釈した。ＢＣＥＣＦ−ＡＭで標識した細胞（１０６／ｍｌ）を、ロバスタチン（０乃至５０μＭ）と一緒に３７℃で１５分間プレインキュベートした後、ＩＣＡＭ−１でコートした９６ウェルプレートに移して、さらに３７℃で３０分間、活性化モノクローナル抗体（ＣＢＲ ＬＦＡ１／２）又はＭｎＣｌ２の存在下又は不在下でインキュベートした。Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含有するウシ胎児血清（Ｌ１５／ＦＢＳ）を添加したＬ１５培地を、抗体ＣＢＲ ＬＦＡ１／２で活性化させた野生型αＬβ２に用い、そして２０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１４０ ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｎＣｌ２、２ ｍｇ／ｍｌ グルコース、１％ ＢＳＡ を、Ｍｎ２ ＋による活性化に用いた。
【０１９５】
図６に示すように、ロバスタチンは、野生型ＬＦＡ−１を発現しており、かつＭｎ２＋又は抗体（ＣＢＲ ＬＦＡ１／２）で刺激を受けた細胞へのＩＣＡＭ−１の結合は阻害するが、高親和性の開いたＫ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ変異型（ＨＡ／ａＬｂ２）へのリガンド結合には干渉しない。
【０１９６】
実施例４ 分離型の野生型及び変異型ＬＦＡ−１ Ｉ−ドメインの発現及び機能
推定上の高親和性及び低親和性変異型の機能をさらに調べるために、野生型Ｉ−ドメインと、変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ及びＬ２８９Ｃ／Ｋ２９４ＣのＩ−ドメインの残基Ｖ１３０からＡ３３８までを、Ｋ５６２細胞の表面上で、ＰＤＧＦ受容体の膜貫通ドメインに発現させた。
【０１９７】
分離型の、細胞表面発現型Ｉドメインを構築するために、シグナルペプチドと、それに続くαＬの反復配列ＩＩの５’末端側から６個のアミノ酸とをコードするＤＮＡ配列を、Ｉドメインを含有する残基Ｖ１３０−Ａ３３８をコードする配列に連結した。ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩ部位をこの断片のそれぞれ５’末端及び３’末端のすぐ隣に導入した。このＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ断片を、インフレームで、ｃ−ｍｙｃ ｔａｇ及びＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ）膜貫通ドメインの５’側にベクタｐＤｉｓｐｌａｙＴＭ（インビトロジェン社製）でサブクローンし、さらに、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏに、ＨｉｎｄＩＩＩ 及びＮｏｔＩを用いてサブクローンした。ＤＮＡの増幅はすべて、Ｐｆｕ ＤＮＡ ポリメラーゼ（ストラタジーン社製）を用いて行い、最終的なコンストラクトはＤＮＡ配列決定で確認した。
【０１９８】
Ｉ−ドメインを表面上に発現する安定なＫ５６２トランスフェクタントを作製するために、ＩドメインとＰＤＧＦＲ膜貫通ドメインとをコードする配列を含有する２０μｇのＳｓｐＩ−直線化ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋）を用いて、Ｋ５６２細胞を上述のようにエレクトロポレーションでトランスフェクトした。１００μｇ／ｍｌのヒグロマイシンＢに対する耐性でトランスフェクタントを選択し、さらに細胞ソーティング及び限界希釈法でサブクローンした。同様なレベルの表面野生型及び変異型Ｉ−ドメインＰＤＧＦＲを発現していたクローンを、機能研究に用いるべく、選び出した。１０％ＦＢＳ及び１００μｇ／ｍｌヒグロマイシンＢを添加したＲＰＭＩ培地１６４０中に安定な細胞株を維持した。分離型のＩ−ドメインの細胞表面発現を、フローサイトメトリにより、Ｉ−ドメインに対する抗体ＴＳ１／２２を用いて調べた（図７）。各トランスフェクタントからクローンを２つ選び出し、固定化ＩＣＡＭ−１に対する結合についてテストしたところ、同様な結果がこれら二つのクローンのそれぞれについて得られた（図８Ａ）。インタクト野生型ＬＦＡ−１を発現していたトランスフェクタントはＩＣＡＭ−１に対して低い基礎結合を見せた。しかし、分離型の野生型Ｉ−ドメイン及び変異型Ｌ２８９Ｃ／Ｋ２９４Ｃ Ｉ−ドメインを発現した細胞は、ＩＣＡＭ−１に結合しなかった。このことは、分離型の野生型Ｉ−ドメインのみでは、リガンドとの強力かつ安定な相互作用を媒介するには充分でないことを示唆している（Ｋｎｏｒｒ， Ｒ ａｎｄ Ｄｕｓｔｉｎ， ＭＬ （１９９７） Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８６：７１９−７３０）。対照的に、変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ Ｉ−ドメインを発現した細胞は、ＩＣＡＭ−１に対して強い結合を示した。
【０１９９】
変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃの構成的リガンド結合活性が、導入されたＣ２８７及びＣ２９４間のジスルフィド結合の形成によるものだとすれば、還元剤でこのジスルフィド結合を破壊すれば、この変異型のリガンド結合能を破壊できるはずである。よって、Ｍｇ２＋及びＣａ２＋を含有するＬ１５／ＦＢＳに還元剤ＤＴＴ（１０ｍＭ）を加えたものでトランスフェクタントを処理して、ＩＣＡＭ−１に対するトランスフェクタントの結合能を評価した。図８Ａに示すように、細胞表面に発現した変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４ＣＩ−ドメインのＩＣＡＭ−１への結合は、ＤＴＴ処理で破壊された。対照的に、インタクト野生型ＬＦＡ−１の結合はＤＴＴにより増加し、同様の結果はインタクトαＩＩｂβ３インテグリンでも観察された。ＤＴＴ処理はおそらく、インテグリンを不活性なコンホメーションに拘束している、インタクト分子中のジスルフィド結合を破壊するのであろう。しかしながら、ＤＴＴ処理では、分離型の野生型Ｉ−ドメインの結合にも、又は、変異型Ｌ２８９Ｃ／Ｋ２９４ＣＩ−ドメインの結合にも、影響を与えなかった。このＩ−ドメイン構造に見られるようなジスルフィド結合は、ＬＦＡ−１ Ｉ−ドメインには他にないため、これらのデータは、導入されたＣｙｓ２８７及びＣｙｓ２９４が、高親和状態にＩ−ドメインを拘束するジスルフィド架橋を形成したことを、強く示唆するものである。
【０２００】
さらに、二価陽イオンが、Ｋ５６２トランスフェクタントの表面上に発現した分離型のＩ−ドメインのリガンド結合に及ぼす作用についても、テストした。結合反応は、１ ｍＭ Ｍｎ２＋、１ ｍＭ Ｍｇ２＋、又は１ ｍＭ ＥＤＴＡを添加したＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌ／グルコース（２０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．５、１４０ ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍｇ／ｍｌ グルコース） 中で行わせた。図８Ｂに示すように、Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ Ｉ−ドメインのＩＣＡＭ−１への結合は、ＥＤＴＡ処理により結合が破壊されたように、二価陽イオン依存的であった。インタクト野生型ＬＦＡ−１とは対照的に、Ｍｎ２＋又はＭｇ２＋は、分離型の野生型Ｉ−ドメインのリガンド結合も、又は、変異型Ｌ２８９Ｃ／Ｋ２９４Ｃ Ｉ−ドメインのリガンド結合も、活性化しなかった。
【０２０１】
Ｉ−ドメイン抗体が、分離型のＫ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ Ｉ−ドメインのリガンド結合に及ぼす作用も調べた。インタクトＬＦＡ−１を発現しているトランスフェクタントを活性化抗体ＣＢＲＬＦＡ−１／２と一緒にプレインキュベートし、この細胞のＩＣＡＭ−１への結合を、Ｉ−ドメイン抗体ＴＳ１／２２、ＴＳ２／６、ＴＳ１／１１、ＴＳ１／１２、ＣＢＲＬＦＡ−１／９、ＣＢＲＬＦＡ−１／１、２５．３．１、ＴＳ２／１４か、又は非結合性抗体Ｘ６３の存在下で、図示のように行わせた。モノクローナル抗体ＴＳ１／２２、ＴＳ２／６、ＴＳ１／１１、ＴＳ１／１２ 及びＣＢＲＬＦＡ−１／９ は、分離型のＫ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ Ｉ−ドメインのＩＣＡＭ−１への結合を阻害したが、抗体２５−３−１、ＴＳ２１４ 及びＣＢＲＬＦＡ−１／１ はしなかった（図８Ｃ）。ＣＢＲＬＦＡ−１／１を除き、抗体はすべて、変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ Ｉ−ドメインや野生型Ｉ−ドメインに、フローサイトメトリで調べたところ、結合した。ＣＢＲＬＦＡ−１／１の変異型Ｉ−ドメインへの結合は、野生型Ｉ−ドメインの８０％まで減少していた。これらの結果は、インタクトＬＦＡ−１ Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ 変異型で観察されたもの（表２及び３）と一致し、分離型のＫ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ Ｉ−ドメインが、インタクト分子と同じような構造上の一体性を留めていることを示唆するものである。
【０２０２】
実施例５ 可溶性Ｉ−ドメイン変異型によるＬＦＡ−１機能のインビトロ及びｉｎ ｖｉｖｏでの阻害
ジスルフィド結合（Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ）で開いたコンホメーションに安定させた可溶性のαＬ Ｉ−ドメイン変異型をＥ．ｃｏｌｉで作製した。
【０２０３】
簡単に説明すると、開いたコンホメーション（Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ）で安定させた組換え変異型αＬ Ｉ−ドメインか、又は、アミノ酸残基Ｇ１２８からＹ３０７までの組換え野生型αＬ Ｉ−ドメインを、ｐＥＴ１１ｂ （ノバジェン社製）内にクローンし、１ ｍＭ ＩＰＴＧ で４時間誘導したＥ．ｃｏｌｉで発現させた。封入体を６ＭグアニジンＨＣＬ中に可溶化させることで、封入体からこれら組換えタンパク質を精製し、０．１ ｍＭ Ｃｕ２＋／フェナントロリンの存在下で希釈してリフォールディングを行わせて、ジスルフィド結合の形成を促した。硫安沈殿法でタンパク質を濃縮し、透析し、モノＱイオン交換カラムで精製した。ジスルフィド結合が形成されていない物質を取り除くために、遊離スルフヒドリルを、活性化ビオチンに反応させ、ストレプトアビジンカラムを通した。次にこれら組換えタンパク質をゲル濾過で精製し、セントリプレップで濃縮した。ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ解析には、組換えＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２及びＩＣＡＭ−３ Ｆｃ キメラをＢＩＡｃｏｒｅＴＭ センサチップ上に、アミン共役法で固定した。組換えαＬ Ｉ−ドメインを流し入れ、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ検定を、１ｍＭのＭｇＣｌ２又は２ｍＭのＥＤＴＡを添加したＴｒｉｓ緩衝生理食塩水で、流速を１０μｌ／分にし、２５℃で行った。
【０２０４】
ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ解析で評価したところ、精製済みの開いたＩ−ドメインは、そのリガンドＩＣＡＭ−１、−２、及び−３に対し、１ｍＭのＭｇＣｌ２の存在下で高い親和性を示した。他方、可溶性の野生型Ｉドメインの結合は、検出不能であった（図９、パネルＡ、Ｃ及びＥ；表４）。開いたＩ−ドメインとリガンドとの相互作用は二価陽イオン依存的であり、２ｍＭのＥＤＴＡの存在下では失われたことから、この相互作用はＭＩＤＡＳに依存することが示された。野生型Ｉ−ドメインはリガンドと何ら相互作用を示さなかったため、その開いたＩ−ドメインにより、ＬＦＡ−１とそのリガンドとの結合動態を詳細に解析できた。結合動態を解析するために、様々な濃度の開いたＩ−ドメインを、リガンド結合についてテストした（図９、パネルＢ、Ｄ及びＦ）。動態解析の結果、内皮細胞上への主要なリガンドであるＩＣＡＭ−１について、会合速度が高く（１．２８ ｘ １０５ Ｍ−１ｓ−１）、解離速度が中間 （０．０２３０ ｓ−１）であることが示された（表４）。ＩＣＡＭ−１ のＫＤはナノモルの範囲であり、ＩＣＡＭ−１が最も高い親和性を示し、次いでＩＣＡＭ−２ 及びＩＣＡＭ−３であった。開いたＩ−ドメインはまた、マウスＩＣＡＭ−１に対してもナノモル範囲の親和性を示した。
【０２０５】
【表４】
Figure 2004527217
【０２０６】
ｋｏｎ、ｋｏｆｆ、及びＫＤは、ＢＩＡエバリュエーションＴＭソフトウェアを用いて１：１の相互作用モデルに基づいて計算した。
【０２０７】
別の研究で、組換え体である可溶性の高親和性αＬ Ｉドメインの、そのリガンドＩＣＡＭ−１に対する親和性を測定したところ、ＢＩＡｃｏｒｅによる評価では２００ｎＭというＫｄを示す。このように、分離型のαＬ Ｉドメインの高親和性コンホーマは、最も活性化したαＬβ２ヘテロ二量体と同じくらい、活性なのである。
【０２０８】
可溶性の開いたＩ−ドメインが、ＬＦＡ−１依存的接着を阻害する活性をテストした。ある研究では、野生型ＬＦＡ−１を安定に発現しているＫ５６２細胞をＢＣＥＣＦで蛍光標識し、この細胞表面上のＬＦＡ−１を、ＦＣＳを添加したＬ１５培地中に入れた活性化モノクローナル抗体ＣＢＲＬＦＡ−１／２で活性化させた。次にこの細胞を、Ｉ−ドメインの存在下又は不在下で、ＩＣＡＭ−１でコートしたプラスチック製９６ウェルプレート内でインキュベートした。３７℃で４０分間インキュベートした後、結合しなかった細胞をマイクロプレート・オートワッシャで洗い落とした。各ウェル中で、総投入細胞の蛍光含有量と、結合した細胞を、フルオレセント・コンセントレーション・アナライザで定量した。結合した細胞は、試料ウェル一つ当たりの総投入細胞のパーセントで表した。野生型Ｉ−ドメインとは対照的に、開いたＩ−ドメイン変異型は、固定化ＩＣＡＭ−１へのＬＦＡ−１発現細胞の接着を強く阻害した（図１０Ａ）。
【０２０９】
別の研究では、マウスＬＦＡ−１と、マウスＩＣＡＭ−１を含むそのリガンドとの両方を発現すると共に、ＰＭＡで活性化したときにＬＦＡ−１依存的同型凝集を示すマウスＴリンパ腫細胞株ＥＬ−４ を用いた。細胞を、９６ウェルプレートで、５０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡと、様々な量の可溶性Ｉ−ドメインとの存在下でインキュベートした。３７℃で２時間、５％ ＣＯ２でインキュベートした後、凝集の程度を、以下のように顕微鏡下で採点した：０は、本質的にどの細胞も凝集しなかったことを示した；１は、細胞の１０％未満が凝集したことを示した；２ は、５０％未満の凝集を示した；３は、細胞の最高１００％が小型であり、緩やかな凝集体となったことを示した；４ は、細胞のほぼ１００％がより大きな凝集体となったことを示した；そして５は、細胞のほぼ１００％が大変大型の密な凝集体になったことを示した。図１０Ｂに示すように、可溶性の開いたＩ−ドメインも、マウスＴ細胞株ＥＬ−４のＰＭＡ誘導性ＬＦＡ−１依存的同型凝集を阻害した。
【０２１０】
さらに、末梢リンパ節（ＬＮ）の微小循環を生体内顕微鏡法で観察することにより、開いたＩ−ドメイン変異型によるＬＦＡ−１機能のｉｎ ｖｉｖｏでの阻害能をテストした。簡単に説明すると、Ｔ−ＧＦＰマウスのＬＮ細胞懸濁液を少量（２０乃至５０μｌ）、大腿動脈カテーテルを通じて逆行注射し、ビデオトリガー式セノン−アーク・ストロボスコープから蛍光落射照射により、腸骨下部ＬＮを観察した。Ｉ−ドメインがない状態でのコントロールＴＧＦＰ細胞挙動を記録した後、マウスにＩ−ドメイン（１０μｇ／体重１ｇ）を動脈内注射して予備処置してから、５分後にＴＧＦＰ細胞を注射した。すべての場面をビデオテープに記録し、オフライン解析を行った。回転する細胞量、対、細静脈に進入したＴＧＦＰ細胞の総数のパーセンテージとして、回転画分を計算した。付着している（接着が強固な）画分は、細静脈中で回転するＴＧＦＰ細胞の数のうちで、２０秒を越えて強固に接着したままのＴＧＦＰ細胞のパーセンテージとして、決定した。結果を準定量的に以下のように採点した−：０％、± ： ０−５％、＋： ５−２０％、＋＋： ２０−４０％、＋＋＋： ４０−６０％、＋＋＋＋： ６０−８０％、＋＋＋＋＋：８０−１００％。
【０２１１】
下の表５に示すように、野生型Ｉ−ドメインでなく、開いたＩ−ドメインを注射すると、高内皮細静脈へのＴリンパ球の強固な接着が効果的に遮断され、この遮断はＬＦＡ−１依存的であった。Ｌ−セレクチン及びＰＮＡｄが媒介するリンパ球の回転は損なわれなかったことから、開いたＩ−ドメインの阻害作用はＬＦＡ−１特異的であることが分かる。
【０２１２】
【表５】
Figure 2004527217
【０２１３】
αＬ変異型Ｉ−ドメインのＩＣＡＭ−１への結合の動態
αＬ Ｉ−ドメインのＩＣＡＭ−１との相互作用の動態をさらに調査するために、組換え可溶性αＬ Ｉ−ドメインをＥ．ｃｏｌｉ内で発現させ、リフォールディングさせ、精製した。下の表６に示すように、Ｅ２８４Ｃ／Ｅ３０１Ｃの親和性はＫ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃにほぼ等しい。Ｌ１６１Ｃ／Ｆ２９９Ｃ、Ｋ１６０Ｃ／Ｆ２９９Ｃ、及びＬ１６１Ｃ／Ｔ３００Ｃ の親和性は、野生型よりも有意に高いが、高親和性の開いたαＬ Ｉ−ドメインである Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃの２０乃至３０分の１である。Ｌ１６１Ｃ／Ｆ２９９Ｃ、Ｋ１６０Ｃ／Ｆ２９９Ｃ、及びＬ１６１Ｃ／Ｔ３００Ｃを中親和性αＬ Ｉ−ドメインと呼ぶ。
【０２１４】
【表６】
Figure 2004527217
【０２１５】
組換え可溶性αＬ Ｉ−ドメインをＥ．ｃｏｌｉ内で発現させ、リフォールディングさせ、精製した。Ｉ−ドメインのＩＣＡＭ−１への結合の動態は ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ装置を用いて測定した。動態はＢＩＡエバリュエーションＴＭソフトウェアを用いて解析した。ＫＤ はスカッチャード・プロットにより、定常期のデータを用いて計算した。Ｋｏｆｆ は、１：１結合モデルを用い、解離相の曲線適合で得た。Ｋｏｎ はＫｏｆｆ／ＫＤで計算した。
【０２１６】
実施例６ Ｍａｃ−１システイン置換変異型の構築及び活性
同様のアプローチを用いて、ジスルフィド結合をＩ−ドメインに導入することにより、開いた高親和性のコンホメーションのＭａｃ−１をデザインした。Ｍａｃ−１システイン置換変異型のデザインは実施例１で説明した。
【０２１７】
【表７】
Figure 2004527217
【０２１８】
野生型残基同士の間の距離を、開いたコンホメーション（１ｉｄｏ）又は閉じた（コンホメーション（１ｊｌｍ）で、ＬｏｏｋＴＭソフトウェアで測定した。
【０２１９】
ジスルフィド結合を形成する可能性のある対のシステインを、αＭβ２のＩ−ドメインに導入すると、ＣＢＲＭ１／５活性化依存的エピトープの発現及びリガンド結合にどのような影響が出るかを評価するために、野生型又は変異型αＭサブユニット及びβ２サブユニットをコードするプラスミドを２９３Ｔ細胞及びＫ５６２細胞に共トランスフェクトした。αβヘテロ二量体の形成は、β２サブユニットと結合して初めてαＭサブユニットの推定β−プロペラドメイン中のエピトープを認識するようになるモノクローナル抗体ＣＢＲＭ１／３２を用いて確認し、さらに抗体ＣＢＲＭ１／５を用いてインテグリン活性化を検出した。
【０２２０】
Ｑ１６３Ｃ／Ｑ３０９Ｃ の対を変異させると良好な結果が得られた（図１１Ｂ、図１２Ｂ及びＣ）。この変異型は、推定上のジスルフィド結合を、Ｉ−ドメインの低部前側近傍の、最後のαへリックスの下側３分の１にある残基と、最初のαへリックスとの間に導入しており、６．３６オングストローム離れたＣβカーボンを１ｉｄｏ構造に有する。対照的に、Ｄ２９４Ｃ／Ｔ３０７Ｃ 及びＤ２９４Ｃ／Ｎ３１１Ｃ置換のＣβカーボンは、それぞれ８．６７オングストローム及び７．０８オングストローム離れている。Ｑ２９８Ｃ／Ｎ３０１Ｃ 及びＦ２９７Ｃ／Ａ３０４Ｃ 置換のＣβカーボンは、理想的な範囲内にあるが、これらの置換は、最後のβストランドとαへリックスとの間のループにより近いため、リガンド結合部位を歪めるなどの望ましくない影響があるに違いない。
【０２２１】
一過的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞内でインタクト二量体内に発現させた場合、このＱ１６３Ｃ／Ｑ３０９Ｃ 変異型は、ＣＢＲＭ１／３２抗体で測定したときに野生型の半分しか、発現されないが、 ＣＢＲＭ１／５ 活性化依存的エピトープ、対、ＣＢＲＭ１／３２ 発現、の比は、著しく高い（図１１Ａ）。加えて、Ｍａｃ−１ Ｑ１６３Ｃ／Ｑ３０９Ｃ 変異型を発現している２９３Ｔ細胞の、プラスチック上にコートしたｉＣ３ｂへの接着は、室温でＬ１５／ＦＢＳ培地内で検定したところ、その発現が低いにもかかわらず、野生型よりも高かった（図１１Ｂ）。
【０２２２】
代わりに、分離型のＭａｃ−１変異型Ｉ−ドメインを、ＰＤＧＦ受容体の人工シグナル配列及び膜貫通ドメインと一緒に、細胞表面上に発現させた。接着はＬ１５／ＦＢＳ／ＭｎＣｌ２ 中で３７℃で検定した。分離型の野生型Ｉ−ドメインは、ｉＣ３ｂへの結合を全く見せなかったが、他方、コンピュータで再デザインした疎水性のコア、ｉｄｏ１ｒ及びｉｄｏ２ｒを持つ、前述の変異型は活性を有していた（図１１Ｃ）（Ｓｈｉｍａｏｋａ， Ｍ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：６７４−６７８）。Ｑ１６３Ｃ／Ｑ３０９Ｃ 変異型Ｉ−ドメインは、強力な特異的リガンド結合を示したが、この結合は、阻害性のＩ−ドメインモノクローナル抗体 ＣＢＲＭ１／５で完全に遮断された（図１２Ｃ）。
【０２２３】
更なる研究では、開いたＩ−ドメイン変異型Ｑ１６３Ｃ／Ｑ３０９Ｃ及びＤ２９４Ｃ／Ｑ３１１Ｃ をＫ５６２細胞で安定に発現させ、同じレベルの受容体を発現しているクローンを選び出した。固定化ｉＣ３ｂに対する接着検定を、Ｌ１５／ＦＢＳで、３７℃で行った。２９３Ｔ細胞とは対照的に、野生型Ｍａｃ−１ はこれらの細胞ではリガンド結合についてほとんど基礎活性を持たない（図１２Ａ及び１２Ｂ）。Ｑ１６３Ｃ／Ｑ３０９Ｃ及びＤ２９４Ｃ／Ｑ３１１Ｃ の両者ともで、インタクトαＭβ２ヘテロ二量体で発現させたとき、野生型に比べてＣＢＲＭ１／５ 活性化依存的エピトープ発現が増加し、またリガンド結合も増加していた（図１２Ａ及び１２Ｂ）。さらに、分離型の開いたＩ−ドメイン変異型を細胞表面上に発現していたＫ５６２細胞は、野生型に比べ、ｉＣ３ｂに対して強い特異的結合を示した（図１２Ｃ）。
【０２２４】
開いたＩ−ドメイン変異型のリガンド結合活性の上昇が、ジスルフィド結合の形成により誘導されることを確認するために、還元剤ＤＴＴの影響をテストした。変異型Ｉ−ドメインを含有するαＭβ２トランスフェクタントの、プラスチック上に固定したｉＣ３ｂへの結合を、ＤＴＴの存在下及び非存在下で調べた。下の表８に要約するように、固定された開いたαＭ Ｉ−ドメイン、 （Ｑ１６３Ｃ／Ｑ３０９Ｃ） 及び （Ｄ２９４Ｃ／Ｑ３１１ｃ）は、活性化がない時には活性であり、これらの活性は、ＤＴＴによるジスルフィド還元により部分的に低下した。対照的に、固定された閉じたαＭ Ｉ−ドメインＱ１６３Ｃ／Ｒ３１３Ｃ は不活性であり、活性化に対して耐性であるが、ＤＴＴによるジスルフィド還元後には活性化可能となる。
【０２２５】
図１２Ｃに示すようにＤＴＴ処理により、分離型の固定された開いたＩ−ドメインのリガンド結合はなくなった。対照的に、ＤＴＴにより、インタクト野生型αＭβ２の結合は増した（図２Ｂ）ことから、この実験で用いたＤＴＴは毒性でなく、開いたＩ−ドメイン変異型のリガンド結合が失われたことは、ＤＴＴの非特異的な作用が原因ではないことが示唆された。まとめると、これらのデータは、システインの導入により、ジスルフィド架橋が形成され、Ｍａｃ−１ Ｉ−ドメインが開いたもしくは閉じたコンホメーションに固定されることを示すものである。
【０２２６】
【表８】
Figure 2004527217
【０２２７】
変異型Ｉ−ドメインを含有するαＭβ２トランスフェクタントの、プラスチック上に固定されたｉＣ３ｂへの結合をテストした。結果は以下のように準定量的に採点した：±：活性化した野生型トランスフェクタントの結合の０−５％、＋：５−２５％、＋＋２５−５０％、＋＋＋：５０−７５％、＋＋＋＋：７５−１００％。
ＮＴ：テストせず
ＤＴＴ：ＤＴＴ処理によるジスルフィド還元
＋活性化：活性化ｍＡＢ ＣＢＲ ＬＦＡ−１／２による活性化
【０２２８】
同等物
当業者であれば、ごく慣例的な実験を用いれば、ここに記載した本発明の具体的な実施例の同等物を数多く認識され、又は確認できることであろう。このような同等物は以下の請求の範囲の包含するところと意図されている。
【０２２９】
【配列表】
Figure 2004527217
Figure 2004527217
Figure 2004527217
Figure 2004527217
Figure 2004527217
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Figure 2004527217
Figure 2004527217
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Figure 2004527217
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Figure 2004527217
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ジスルフィド結合を導入する変異を加えた、ＬＦＡ−１ Ｉドメインの高親和性モデルの立体図である。このモデルは、推定上の高親和性Ｍａｃ−１ Ｉドメイン構造の部分と、推定上の低親和性ＬＦＡ−１ Ｉドメイン構造の部分とを、テンプレートとして用いて作製した。Ｋ２８７Ｃ 及びＫ２９４Ｃ の変異をモデルに含めた。Ｃ２８７及びＣ２９４ の側鎖及びジスルフィド結合を黄色で示した。ＭＩＤＡＳ のＭｇ２＋イオンを金色の球で示す。ＩＣＡＭ−１及びＩＣＡＭ−２への結合に重要な残基の側鎖を、ローズ・ピンクの側鎖及び黄色の硫黄、赤色の酸素及び青色の窒素原子で示す。ＩＣＡＭ−１への種特異的な結合にとって重要である （Ｈｕａｎｇ， Ｃ ａｎｄ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， ＴＡ （１９９５） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：１９００８−１９０１６） か、又は、アラニンに変異させたときにＩＣＡＭ−１又はＩＣＡＭ−２への結合が少なくとも２倍になるという点で重要である （Ｅｄｗａｒｄｓ， ＣＰ ｅｔ ａｌ．， （１９９８） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３：２８９３７−２８９４４）と定義されたこれらの残基は、Ｍ１４０、Ｅ１４６、Ｔ１７５、Ｌ２０５、Ｅ２４１、Ｔ２４３、Ｓ２４５、及びＫ２６３である。これらの残基はＭｇ２＋イオンを取り囲んでおり、ジスルフィドからは遠いことに留意されたい。ＲＩＢＢＯＮＳで作製した （Ｃａｒｓｏｎ， Ｍ （１９９７） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ＲＭ Ｓｗｅｅｔ ａｎｄ ＣＷ Ｃａｒｔｅｒ ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ． ４９３−５０５）。
【図２】図２は、ＬＦＡ−１ Ｉドメインの高親和性もしくは低親和性コンホーマに対して選択的な推定上のジスルフィド結合を示す。Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ変異（パネルＡ、Ｃ）及びＬ２８９Ｃ／Ｋ２９４Ｃ 変異（パネルＢ、Ｄ）を、高親和性（パネルＡ、Ｂ）及び低親和性（パネルＣ、Ｄ）Ｉドメインコンホーマの両方でモデルを作製した。このモデルの残基 ２５４位から３０５位までを示す。これら四つのモデルは、コンホメーション上のシフトに関与しない残基を用いて重ね合わされており、図面の作製には全く同じ方向で用いた。従って、パネルＣ及びＤに比較したときの、パネルＡ及びＢでのα６へリックスの下向きの移動が明白である。β６及びα６をつないでいるループのリモデリングに伴って、残基２８９位の側鎖の配向が逆転している（パネルＤに比較したときのパネルＢ）。ＲＩＢＢＯＮＳで作製した。
【図３】図３は、２９３Ｔ一過性トランスフェクタント（パネルＡ）、及びＫ５６２安定トランスフェクタント（パネルＢ）上でのＬＦＡ−１システイン置換変異型の細胞表面発現を、フローサイトメトリ解析で、αＬ／β２複合体中のαＬに対するモノクローナル抗体ＴＳ２／４（塗りつぶしたヒストグラム）か、又は、非結合性の抗体Ｘ６３（白抜きのヒストグラム）を用いて調べた図である。括弧内の数字は、Ｋ５６２安定トランスフェクタントのクローン数である。
【図４】図４は、固定化ＩＣＡＭ−１へのＬＦＡ−１トランスフェクタントの結合を示す。パネルＡは２９３Ｔ一過性トランスフェクタントであり、そしてパネルＢ及びＣは、Ｋ５６２安定トランスフェクタントである。パネルＡ及びＢでは、固定化ＩＣＡＭ−１へのトランスフェクタントの結合を、１０μｇ／ｍｌの活性化抗体ＣＢＲＬＦＡ−１／２の存在下又は非存在下（コントロール）で、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含有するＬ１５培地内で調べた。パネルＣでは、結合検定を、図示のように二価陽イオン又はＥＤＴＡを添加したＴＢＳ、ｐＨ７．５内で行った。 括弧内の数字は、Ｋ５６２安定トランスフェクタントのクローン数である。結果は、三重式試料の平均±ＳＤ、少なくとも三回の実験の代表である。
【図５】図５は、野生型ＬＦＡ−１、推定上の高親和性変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ、又は変異型Ｌ２８９Ｃ／Ｋ２９４Ｃを発現するＫ５６２トランスフェクタントに対する可溶性ＩＣＡＭ−１−ＩｇＡ融合タンパク質の結合を、フローサイトメトリ解析で評価したものである。ＩＣＡＭ−１−ＩｇＡ結合の平均蛍光強度をヒストグラムの上部右隅に示す。括弧内の数字は、Ｋ５６２安定トランスフェクタントのクローン数である。結果は三回の実験の代表である。
【図６】図６は、活性化した野生型及び高親和性（Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ）ＬＦＡ−１を発現している細胞へのリガンド結合にロバスタチンが及ぼす阻害活性を示す。
【図７】図７は、単離されたＬＦＡ−１ Ｉ−ドメインの細胞表面発現を示す。野生型αＬ Ｉ−ドメイン並びに変異型Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ及びＬ２８９Ｃ／Ｋ２９４Ｃ Ｉ−ドメインを、ＰＤＧＦＲ膜貫通ドメインにより、Ｋ５６２トランスフェクタント表面上に発現させた。細胞表面の該Ｉ−ドメインのレベルを、フローサイトメトリにより、該Ｉ−ドメインに対するモノクローナル抗体ＴＳ１／２２を用いて調べた（塗りつぶしたヒストグラム）。コントロールのｍＡｂ Ｘ６３ の結合を白抜きのヒストグラムで示す。ＴＳ１／２２結合の平均蛍光強度を、ヒストグラムの上部右隅に示した。各Ｉ−ドメイントランスフェクタントのうちの二つの個々のクローン（＃１及び＃２）の結果を示す。
【図８】図８は、細胞表面に発現したＬＦＡ−１ Ｉ−ドメインのリガンド結合活性を示す。パネルＡは、ＤＴＴの存在下又は不在下における、固定化ＩＣＡＭ−１へのＫ５６２トランスフェクタントの結合を示す。結合はＤＴＴの存在下（白バー）又は不在下（黒バー）で行わせた。パネルＢは、Ｋ５６２トランスフェクタントのＩＣＡＭ−１への結合に対する二価陽イオンの影響を示す。結合はＭｎ２＋（黒バー）、Ｍｇ２＋（網掛けバー）はＥＤＴＡの存在下（白棒）で行わせた。パネルＡ及びＢでは、野生型Ｉ−ドメイン又は変異型Ｉ−ドメインを発現しているトランスフェクタントの二つのクローン（＃１及び＃２）をテストした。パネルＣは、ＬＦＡ−１遮断抗体が、Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ Ｉ−ドメインのＩＣＡＭ−１への結合に及ぼす影響を示す。結果は三重試料の平均±ＳＤ、三回の実験の代表である。
【図９】図９は、開いた（Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ）又は野生型Ｉ−ドメインと、リガンドＩＣＡＭ−１（パネルＡ及びＢ）、ＩＣＡＭ−２（パネルＣ及びＤ）及びＩＣＡＭ−３（パネルＥ及びＦ）との間の相互作用を記録したＢＩＡｃｏｒｅＴＭによる表面プラスモン共鳴センソグラムを示す。
【図１０】図１０は、開いたαＬ Ｉ−ドメインによるＬＦＡ−１依存的接着のインビトロでの阻害を示す。パネルＡは、可溶性の野生型（塗りつぶした丸）又は開いた（Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ）Ｉ−ドメイン（白抜き丸）の存在下における、野生型ＬＦＡ−１を発現しているＫ５６２安定トランスフェクタントの固定化ＩＣＡＭ−１への接着を示す。パネルＢは、可溶性の野生型（塗りつぶした丸）又は開いた（Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ）Ｉ−ドメイン（白抜き丸）の存在下における、マウスＥＬ−４ Ｔリンパ腫細胞株の同型凝集を示す。
【図１１】図１１は、一過的にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞におけるＭａｃ−１システイン置換変異型の発現及びリガンド結合活性を示す。パネルＡは、モノクローナル抗体ＣＢＲＭ１／３２ （白バー）及び ＣＢＲＭ１／５ （黒バー） のインタクト Ｍａｃ−１ Ｉ−ドメイン変異型への結合を示す。パネルＢは、インタクトＭａｃ−１システイン置換変異型を発現している２９３Ｔ一過性トランスフェクタントの、プラスチック上に被膜されたｉＣ３ｂへの接着を示す。パネルＣは、単離型Ｍａｃ−１変異型Ｉ−ドメインを発現している２９３Ｔ一過性トランスフェクタントの、ｉＣ３ｂリガンドへの、抗体ＣＢＲＭ１／５の存在下（黒バー）又は非存在下（白バー）での接着を示す。
【図１２】図１２は、Ｋ５６２安定トランスフェクタントにおけるＭａｃ−１システイン置換変異型の発現及びリガンド結合活性を示す。パネルＡは、モノクローナル抗体ＣＢＲＭ１／３２及びＣＢＲＭ１／５の、インタクトＭａｃ−１ Ｉ−ドメイン変異型への結合をフローサイトメトリで評価して示した代表的ヒストグラムである。平均蛍光強度を、ヒストグラムの上部右端に示す。パネルＢは、インタクトＭａｃ−１システイン置換変異型を発現しているＫ５６２安定トランスフェクタントの、プラスチック上にコートされたｉＣ３ｂへの接着を示す。パネルＣは、単離型Ｍａｃ−１ Ｉ−変異型Ｉ−ドメインを発現しているＫ５６２安定トランスフェクタントの、ｉＣ３ｂリガンドへの接着を示す。接着は、モノクローナル抗体 ＣＢＲＭ１／５の存在下（黒バー）もしくは非存在下（白バー）、又は１０ ｍＭ ＤＴＴの存在下 （灰色バー）で検定した。

Claims (72)

  1. 改変Ｉ−ドメインポリペプチドが所望のコンホメーションで安定するよう、少なくとも一つのジスルフィド結合を含有する改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド。
  2. 開いたコンホメーションで安定させた、請求項１に記載の改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド。
  3. 閉じたコンホメーションで安定させた、請求項１に記載の改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド。
  4. リガンドに高親和結合する、請求項２に記載の改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド。
  5. 野生型配列に比較して少なくとも一つのシステイン置換を含有するアミノ酸配列にコードされた、請求項１に記載の改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド。
  6. システインに置換する残基のＣβカーボン同士間の距離が、３．００乃至８．０９オングストロームである、請求項２に記載の改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド。
  7. α１、α２、α１０、α１１、αＤ、αＥ、αＬ（ＣＤ１１ａ）、αＭ（ＣＤ１１ｂ）及びαＸ（ＣＤ１１ｃ）からなる群より選択されるインテグリンαサブユニットのＩ−ドメインから誘導される、請求項１に記載の改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド。
  8. ＬＦＡ−１のαＬサブユニットのＩ−ドメインから誘導される、請求項２に記載の改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド。
  9. ＬＦＡ−１のαＬサブユニットのＩ−ドメインから誘導される、請求項３に記載の改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド。
  10. Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ、Ｅ２８４Ｃ／Ｅ３０１Ｃ、Ｌ１６１Ｃ／Ｆ２９９Ｃ、Ｋ１６０Ｃ／Ｆ２９９Ｃ、及びＬ１６１Ｃ／Ｔ３００Ｃからなる群より選択されるアミノ酸置換を含有する、請求項７に記載の改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド。
  11. アミノ酸置換Ｌ２８９Ｃ／Ｋ２９４Ｃを含有する、請求項８に記載の改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド。
  12. Ｍａｃ−１のαＭサブユニットのＩ−ドメインから誘導される、請求項２に記載の改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド。
  13. Ｍａｃ−１のαＭサブユニットのＩ−ドメインから誘導される、請求項３に記載の改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド。
  14. Ｑ１６３Ｃ／Ｑ３０９Ｃ 及びＤ２９４Ｃ／Ｑ３１１Ｃからなる群より選択されるアミノ酸置換を含有する、請求項１２に記載の改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド。
  15. アミノ酸置換Ｑ１６３Ｃ／Ｒ３１３Ｃを含有する、請求項１３に記載の改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド。
  16. インテグリンαサブユニット内に包含される、請求項１に記載の改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド。
  17. インテグリンβサブユニットにさらに結合された、請求項１６に記載の改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド。
  18. 可溶性のポリペプチドである、請求項１に記載の改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド。
  19. 異種のポリペプチドに作動的に連結された、請求項１に記載の改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド。
  20. 請求項１乃至１５のいずれかに定義された改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離された核酸分子。
  21. 請求項２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、及び１５のいずれかに定義された改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドと、薬学的に許容可能な担体とを含んで成る組成物。
  22. 前記改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドが可溶性のポリペプチドである、請求項２０に記載の組成物。
  23. 抗炎症性もしくは免疫抑制性作用薬をさらに含んで成る、請求項２１に記載の組成物。
  24. 開いたコンホメーションのインテグリンＩ−ドメインに選択的に結合する抗体を生成する免疫原としての、請求項２に記載の改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドの使用。
  25. 開いたコンホメーションの改変インテグリンＩ−ドメインに選択的に結合する、抗体又はその抗原結合フラグメント。
  26. インテグリンＩ−ドメイン上の活性化特異的エピトープに結合する、請求項２５に記載の抗体。
  27. インテグリンとコグネイト・リガンドとの間の相互作用を遮断する、請求項２５に記載の抗体。
  28. 医薬組成物及び薬学的に許容可能な担体をさらに含んで成る、請求項２５に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  29. 前記抗体がＬＦＡ−１抗体である、請求項２５に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  30. 開いたコンホメーションのＬＦＡ−１ Ｉ−ドメインに選択的に結合する、抗ＬＦＡ−１抗体又はその抗原結合フラグメント。
  31. 前記抗ＬＦＡ−１抗体又はその抗原結合フラグメントが、改変ＬＦＡ−１ Ｉ−ドメインに選択的に結合する、請求項３０に記載のＬＦＡ−１抗体。
  32. 改変Ｉ−様ドメインポリペプチドが所望のコンホメーションで安定するよう、少なくとも一つのジスルフィド結合を含有する、改変インテグリンＩ−様ドメインポリペプチド。
  33. 開いたコンホメーションで安定させた、請求項３０に記載の改変インテグリンＩ−様ドメインポリペプチド。
  34. リガンドに高親和結合する、請求項３１に記載の改変インテグリンＩ−様ドメインポリペプチド。
  35. 野生型配列に比較して少なくとも一つのシステイン置換を含有するアミノ酸配列にコードされた、請求項３０に記載の改変インテグリンＩ−様ドメインポリペプチド。
  36. インテグリンβサブユニットのＩ−様ドメインから誘導される、請求項３０に記載の改変インテグリンＩ−様ドメインポリペプチド。
  37. インテグリンβサブユニット内に包含される、請求項３０に記載の改変インテグリンＩ−様ドメインポリペプチド。
  38. ポリペプチドが所望のコンホメーションで安定するよう、ポリペプチド内に少なくとも一つのジスルフィド結合を導入するステップを含む、ポリペプチドを所望のコンホメーションで安定させる方法。
  39. 前記ジスルフィド結合が、ポリペプチドのアミノ酸配列内に少なくとも一つのシステイン置換を導入することにより形成される、請求項３８に記載の方法。
  40. システインに置換する残基中のＣβカーボン同士の間の距離が、３．００乃至８．０９オングストロームである、請求項３８に記載の方法。
  41. 前記ポリペプチドが、ある一個のタンパク質の機能的ドメインを含んで成る、請求項３８に記載の方法。
  42. 前記ポリペプチドがインテグリンＩ−ドメインを含んで成る、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記ポリペプチドが、：インテグリンサブユニット、小型Ｇタンパク質、ヘテロ三量体Ｇタンパク質αサブユニット、チロシンキナーゼ、Ｇタンパク質共役受容体、アロステリックな調節を受ける酵素、チモーゲン、補体Ｃ３、補体Ｃ４、及びフィブリノーゲンからなるポリペプチド群より選択される、請求項３８に記載の方法。
  44. （ａ）請求項２に記載の改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドを提供するステップと、
    （ｂ）前記改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドをテスト化合物に接触させるステップと、
    （ｃ）改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドへの、テスト化合物の結合能を検定することで、インテグリン活性のモジュレータを同定するステップと
    を含む、インテグリン活性のモジュレータを同定する方法。
  45. （ａ）請求項２に記載の改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドを提供するステップと、
    （ｂ）テスト化合物の存在下及び非存在下で、インテグリンのリガンドに、前記改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドを接触させるステップと、
    （ｃ）前記改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドと前記リガンドとの間の結合を検出することで、インテグリンとコグネイト・リガンドとの間の相互作用を修飾することのできる化合物を同定するステップと
    を含む、インテグリンとコグネイト・リガンドとの間の相互作用を修飾することのできる化合物を同定する方法。
  46. 開いたコンホメーションで安定させた、治療上有効量の改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドを対象に投与することにより、対象のインテグリン関連疾患を治療又は予防するステップを含む、対象のインテグリン媒介疾患を治療又は予防する方法。
  47. 前記インテグリン媒介疾患が炎症性疾患である、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記インテグリン媒介疾患が自己免疫疾患である、請求項４６に記載の方法。
  49. 開いたコンホメーションで安定させた、有効量の改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドを対象に投与することにより、対象におけるインテグリンとコグネイト・リガンドとの結合を阻害するステップを含む、対象においてインテグリンとコグネイト・リガンドとの結合を阻害する方法。
  50. 前記改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドがリガンドに高親和結合する、請求項４６及び４９のいずれか一方に記載の方法。
  51. 前記改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドが可溶性ポリペプチドである、請求項４６及び４９のいずれか一方に記載の方法。
  52. 前記改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドが、異種ポリペプチドに作動的に連結されている、請求項５０に記載の方法。
  53. 前記改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドが、αＬ Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ、αＬ Ｅ２８４Ｃ／Ｅ３０１Ｃ、αＬ Ｌ１６１Ｃ／Ｆ２９９Ｃ、αＬ Ｋ１６０Ｃ／Ｆ２９９Ｃ、αＬ Ｌ１６１Ｃ／Ｙ３００Ｃ、αＭ Ｑ１６３Ｃ／Ｑ３０９Ｃ 及びαＭ Ｄ２９４Ｃ／Ｑ３１１Ｃからなる群より選択される、請求項４６及び４９のいずれか一方に記載の方法。
  54. 開いたコンホメーションのインテグリンＩ−ドメインに選択的に結合する、治療上有効量の抗体又はその抗原結合フラグメントを対象に投与することにより、前記対象のインテグリン関連疾患を治療又は予防するステップを含む、対象においてインテグリン媒介疾患を治療又は予防する方法。
  55. 前記抗体が、改変インテグリンＩ−ドメイン又はその抗原結合フラグメントに結合する、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記抗体がＬＦＡ−１抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項５４に記載の方法。
  57. 前記インテグリン媒介疾患が炎症性疾患である、請求項５４に記載の方法。
  58. 前記インテグリン媒介疾患が自己免疫疾患である、請求項５４に記載の方法。
  59. 開いたコンホメーションのインテグリンＩ−ドメインに選択的に結合する、治療上有効量の抗ＬＦＡ−１抗体又はその抗原結合フラグメントを対象に投与することにより、前記対象のインテグリン関連疾患を治療又は予防するステップを含む、対象においてインテグリン媒介疾患を治療する方法。
  60. 前記抗ＬＦＡ−１抗体が、改変ＬＦＡ−１ Ｉ−ドメイン又はその抗原結合フラグメントに結合する、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記インテグリン媒介疾患が炎症性疾患である、請求項５９に記載の方法。
  62. 開いたコンホメーションのインテグリンＩ−ドメインに選択的に結合する、有効量の抗体又はその抗原結合フラグメントを対象に投与することにより、前記対象におけるインテグリンとコグネイト・リガンドとの間の結合を阻害するステップを含む、対象においてインテグリンとコグネイト・リガンドとの間の結合を阻害する方法。
  63. 前記抗体がＬＦＡ−１抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、インテグリンＩ−ドメイン上の活性化特異的エピトープに結合する、請求項５４、５９、又は６２のいずれかに記載の方法。
  65. 改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド又はその活性フラグメントをコードする核酸を有効量含んで成る、炎症性疾患の予防的もしくは治療的処置のためのワクチン製剤。
  66. 抗原性成分をさらに含んで成る、請求項６５に記載のワクチン製剤。
  67. 薬学的に許容可能な担体をさらに含んで成る、請求項６５に記載のワクチン製剤。
  68. ベクタに挿入された、改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチド又はその活性フラグメントをコードする核酸分子を対象に投与するステップを含む、前記対象のインテグリン媒介疾患を治療する方法。
  69. 前記核酸分子が静脈注射により対象に投与される、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記核酸分子が抗原性成分をさらに含んで成る、請求項６８に記載の方法。
  71. 改変インテグリンＩ−ドメインポリペプチドをコードする核酸分子を含んで成る非ヒトトランスジェニック動物。
  72. 前記動物がマウスである、請求項７１に記載のトランスジェニック動物。
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