JP2004504827A - 高親和性インテグリンポリペプチドおよびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
変種インテグリンαサブユニットＡドメインまたは変種インテグリンβサブユニットＡ様ドメインの、全てまたは一部を含むポリペプチドについて記載する。
Description
【０００１】
関連出願の情報
本出願は、その内容が参照として本明細書に組み入れられる、２０００年７月３１日に提出された仮出願第６０／２２１，９５０号、および２００１年１月１１日に提出された米国特許出願第０９／７５８，４９３号からの優先権を主張する。
【０００２】
背景
インテグリンは、リガンドの結合によって細胞間の、および細胞と細胞外マトリクスとの双方の多様な重要な相互作用を媒介するヘテロダイマー受容体である。全てのインテグリンはαサブユニットとβサブユニットとを有する。αサブユニット内において、Ａドメイン（またはＩドメイン）と呼ばれる領域は、リガンド結合の重要なメディエータであることが知られている。類似の領域、Ａ様ドメインが多くのβサブユニットに存在する。多くのインテグリンは二つの配座、すなわち低親和性状態（「閉鎖（ｃｌｏｓｅｄ）」または「非リガンド結合（ｕｎｌｉｇａｎｄｅｄ）」配座）と高親和性状態（「開放（ｏｐｅｎ）」、または「リガンド結合（ｌｉｇａｎｄｅｄ）」配座）で存在すると考えられており、後者が高親和性リガンド結合に関与している。
【０００３】
インテグリンは、細胞の生理活性（例えば、運動性、増殖、および分化）に及ぼすマトリクスの作用を媒介するシグナルを伝達する。その上、インテグリンは、炎症ならびに腫瘍発生的な細胞の形質転換、転移、およびアポトーシスにおいて役割を有する。このように、一つまたは複数のインテグリンを活性化またはその活性を阻害することができる化合物を同定することにかなりの関心が集まっている。
【０００４】
有効なインテグリン−リガンド結合が起こるためには、インテグリンは、その高親和性配座でなければならないと考えられる。細胞が、多様な刺激によって活性化される場合に産生される内側から外へのシグナルが、インテグリンを低親和性状態から高親和性へと切り替えるように思われる。この機能的上方制御は、αサブユニットのＡドメインおよびβサブユニットのＡ様ドメインが含まれるインテグリンの細胞外領域における配座の変化に関連している（スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、１９８８、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：１８７２６）。
【０００５】
インテグリンＡドメインは、その上部に金属イオン依存的接着部位（ＭＩＤＡＳ）を有するジヌクレオチド結合のひだの形状を示し（リー（Ｌｅｅ）ら、１９９５、Ｃｅｌｌ ８０：６３１；エムスレイ（Ｅｍｓｌｅｙ）ら、１９９７、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：２８５１２；リ（Ｌｉ）ら、１９９８、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４３：１５２３；ノルト（Ｎｏｌｔｅ）ら、１９９９、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４５２：３７９；およびレッジェ（Ｌｅｇｇｅ）ら、２０００、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９５：１２５１）、これはその底部でＣ末端のα７ヘリックスによってインテグリンの本体に結合している。ＭＩＤＡＳおよびその周辺の露出した側鎖は、生理的リガンド（リ（Ｌｉ）ら、上記；ミチシタ（Ｍｉｃｈｉｓｈｉｔａ）ら、Ｃｅｌｌ ７２：８５７〜８６７、１９９３；カマタ（Ｋａｍａｔａ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：２６００６〜２６０１０、１９９４；ケルン（Ｋｅｒｎ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：２２８１１〜６、１９９４；エドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：２８９３７〜４４、１９９８；ザング（Ｚｈａｎｇ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：８０６４〜７１、１９９９）および特定のアンタゴニスト（リウ（Ｒｉｅｕ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：１５８５８〜１５８６１、１９９６）の結合部位を形成する。「開放」配座の場合、タンパク質における三つの非荷電残基は、ＭＩＤＡＳにおける金属イオンに直接配位結合する。偽リガンドまたはリガンドグルタメート残基（リー（Ｌｅｅ）ら、上記；リ（Ｌｉ）ら、上記；エムスレイ（Ｅｍｓｌｅｙ）ら、Ｃｅｌｌ １００：４７〜５６、２０００）が、金属の配位結合を完成させる。「閉鎖」型では、両親媒性Ｃ末端のα７ヘリックスが「開放」型と比較して１０ Å上方に移動しており、ドメインの残りを取り巻いている。この大きな移動は金属配位結合の変化に関連しており、この場合、三つの配位結合残基の一つであるトレオニンがアスパラギン酸塩に置換され、金属イオン配位結合の球を完成させるために水分子がグルタミン酸塩をの代わりに存在する（リー（Ｌｅｅ）ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３：１３３３〜１３４０、１９９５）。金属配位結合のこれらの変化およびＭＩＤＡＳの位相学は、構造的に相同なＧタンパク質において記述されるものと類似である（リー（Ｌｅｅ）ら、上記）。
【０００６】
四つのインテグリンＡドメイン（ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ａ、ＣＤ４９ａ、およびＣＤ４９ｂ）の結晶構造が現在までに報告されている（リー（Ｌｅｅ）ら、Ｃｅｌｌ ８０：６３１、１９９５；リー（Ｌｅｅ）ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３：１３３３、１９９５；エムスレイ（Ｅｍｓｌｅｙ）ら、上記；リ（Ｌｉ）ら、上記；エムスレイ（Ｅｍｓｌｅｙ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：２８５１２、１９９７）。インテグリンＣＤ１１ｂ Ａドメイン（１１ｂＡ）の例外を除き、全てが、「閉鎖」型のみで存在することから、「開放」型は有益でない結晶アーチファクトであることが示唆された（ボルディン（Ｂａｌｄｗｉｎ）ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６：９２３〜９３５、１９９８）。インテグリン−Ａドメインの「開放」型が「高」親和性状態と等しいという考え方は、三つの研究によって支持されている（リ（Ｌｉ）ら、１９９８、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４３：１５２３；リウ（Ｒｉｅｕ）ら、上記；オクスビグ（Ｏｘｖｉｇ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：２２１５〜２０、１９９９）。第一の研究において、「閉鎖」構造を脱安定化させ、構造の基礎において予想されるＣＤ１１ｂＡの点突然変異によって、溶液中の「高親和性」型の比率が増加した（リ（Ｌｉ）ら、１９９８、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４３：１５２３）。第二の研究において、「活性化依存的」モノクローナル抗体の結合部位は、Ａドメインの配座感受性領域にマッピングされた（オクスビグ（Ｏｘｖｉｇ）ら、上記）。第三の研究によって、短いコラーゲンペプチドとの複合体においてＡドメインが「開放」配座の形をとることが示され、このことは「開放」型がリガンドの存在下に限って得られうることを示唆した（エムスレイ（Ｅｍｓｌｅｙ）ら、上記）。リガンドがインテグリンの配座の変化を引き起こすことが示唆されているが、インテグリンがリガンドの非存在下においても高親和性状態で存在しうることが、少なくとも一つの研究によって示唆されている（スミスおよびチェレシュ（ＳｍｉｔｈおよびＣｈｅｒｅｓｈ）、１９８８、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：１８７２６〜３１）。さらにいくつかの研究によって、ヘテロダイマーインテグリンにおけるリガンド結合親和性をアロステリックに変化させうることが示唆された（リ（Ｌｉ）ら、１９９８、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４３：１５２３；エドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：２８９３７〜２８９４４、１９８８；カルダーウッド（Ｃａｌｄｅｒｗｏｏｄ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：５６２５、１９８８；ザング（Ｚｈａｎｇ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：２９９５３〜７、１９９６）。
【０００７】
概要
本発明は、変種インテグリンαサブユニットＡドメインまたは変種インテグリンβサブユニットＡ様ドメインの、全てまたは一部を含むポリペプチドを特徴とする。変種インテグリンポリペプチドと呼ばれる本発明のポリペプチドでは、重要なイソロイシン（Ｉｌｅ）残基（下記により詳細に記述）が存在しない。イソロイシンは、欠失させるか、または異なるアミノ酸残基、好ましくはより小さいもしくはより疎水性が低いアミノ酸残基、例えばアラニンまたはグリシンに置換することができる。本発明の変種インテグリンポリペプチドは、溶液中において高親和性配座で存在する傾向があるため、それらはインテグリンに結合する（および／またはその活性を調節する）分子を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて有用である。それらはまた、インテグリンの高親和性型に選択的に結合する抗体、例えば、モノクローナル抗体を作製するためにも有用である。そのような抗体のいくつかは、低親和性配座で存在するインテグリンには存在しないか、またはそのようなインテグリンでは近づくことができないエピトープを認識する。このように、本発明は、対応する野生型インテグリンより大きな親和性により、本発明の変種インテグリンに結合する抗体を特徴とする。本発明の変種インテグリンポリペプチドは、任意のインテグリンαサブユニットまたは任意のインテグリンβサブユニットにも由来しうる。変種インテグリンポリペプチドには、好ましくは、ＡドメインまたはＡ様ドメインのリガンド結合部分が含まれる。
【０００８】
本発明はまた、本発明の変種インテグリンポリペプチドに結合する化合物を同定する方法を特徴とする。そのようなスクリーニング方法は、関係する被験化合物にポリペプチドを曝露すること、および化合物がポリペプチドに結合するか否かを決定することを含みうる。このように、アッセイは、単純な結合アッセイ（例えば、化合物の結合をリガンドの非存在下に限って測定する）、または競合的結合アッセイ（例えば、化合物の結合をリガンドの存在下で測定する）となりうる。本発明はまた、被験化合物の存在下および非存在下で変種インテグリンポリペプチドに対するインテグリンリガンドの結合を測定することによって、インテグリンに対するインテグリンリガンドの結合を妨害する化合物を同定する方法を特徴とする。また、被験化合物がインテグリンに対するインテグリンリガンドの結合を妨害できるか否を試験してもよい。さらに、被験化合物の存在下および非存在下で、第二のインテグリンに対するインテグリンリガンドの結合を測定することによって（またはインテグリンに対する第二のリガンドの結合を測定することによって）、化合物の結合特異性を評価することができる。
【０００９】
本発明はまた、本発明の変種インテグリンポリペプチド、または本発明の変種インテグリンポリペプチドに選択的に結合する抗体を投与することによって、インテグリンリガンドに対するインテグリンの結合を妨害する方法を特徴とする。
【００１０】
本発明はまた、活性なインテグリンに結合するリガンドの有無を同定する目的で、本発明の変種インテグリンポリペプチド、または本発明の変種インテグリンポリペプチドに選択的に結合する抗体を投与する方法を特徴とする。そのようなアッセイは、炎症、例えば潜在性の炎症（例えば、膿瘍、または活性なアテローム性動脈硬化症の病変）を診断するために有用である。
【００１１】
本発明の変種ＡドメインまたはＡ様ドメインに結合する化合物（例えば、活性な配座のＡ様ドメインのＡドメインに比較的選択的に結合する化合物）は、インテグリンによって媒介される炎症障害、例えばＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ａ、またはＣＤ１１ｃによって媒介される障害を治療するための候補化合物である。
【００１２】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドまたは本発明のポリペプチドを含むポリペプチドをコードする核酸分子（例えば、ｍＲＮＡおよびＤＮＡ）を特徴とする。本発明にはまた、本発明のポリペプチドおよび第二のポリペプチド、例えば、免疫グロブリン定常ドメインを含む、融合ポリペプチドをコードする核酸分子も含まれる。
【００１３】
下記の実験は、ＣＤ１１ｂの野生型より活性の高いＣＤ１１ｂの変種型（インテグリンαサブユニット）の設計および調製に関する。いかなる特定の理論にも拘束されないが、溶液中では、開放（活性な）配座であるこの変種サブユニットの分画がサブユニットの対応する野生型より大きいように思われる。
【００１４】
変種ＣＤ１１ｂの作製は、非可逆的なＩｌｅ残基の欠失または置換を含む。Ｉｌｅ残基の欠失または置換は、無傷のＣＤ１１ｂインテグリンのみならず単離されたＣＤ１１ｂ Ａドメインにおいて高親和性表現型を付与する。その上、Ｉｌｅ改変Ａドメインは、「開放」配座で結晶化することができる。このように、いかなる特定の理論にも拘束されることなく、Ｉｌｅに基づくアロステリックスイッチは、インテグリンＡドメインの親和性および配座を制御するように思われる。したがって、対応する高度に保存されたＩｌｅ残基を欠失または置換することによって、他のインテグリンαサブユニット（およびβサブユニット）の変種、すなわち高親和性型を作製することができる。
【００１５】
本発明の一つまたは複数の態様の詳細は、添付の図面および下記の説明に記述する。本発明のその他の特徴、目的、および長所は、説明と図面、および特許請求の範囲から明らかであると考えられる。
【００１６】
詳細な説明
実施例 １ ：欠失による安定な高親和性 ＣＤ１１ｂ 変種 Ａ ドメインの作製
ＣＤ１１ｂのアミノ酸Ｅ１３９〜Ｋ３３１からなる変種ＣＤ１１ｂ Ａドメイン（１１ｂＡ１３９−３３１、１１ｂＡＥ−Ｋとも呼ぶ）を作製した。（ＣＤ１１ｂαドメインに関するアミノ酸の番号付けは、アミノ酸１６個のシグナル配列を含む未成熟タンパク質の番号であることに注意すること）。この変種Ａドメインの特徴を調べて、アミノ酸Ｅ１３９〜Ｇ３３７からなるＣＤ１１ｂ Ａドメイン（１１ｂＡ１３９−３３７、１１ｂＡＥ−Ｇとも呼ぶ）に対して比較した。残基３３２位でイソロイシンがグリシンに変化している変種Ａドメイン（１１ｂＡＩ → Ｇ）も同様に作製した。三つ全てのタンパク質をＧＳＴ融合タンパク質として発現させて、これを切断すると関係するタンパク質が放出された。
【００１７】
変種ポリペプチドは、標準的な組換え型技術を用いて作製した。制限および改変酵素は、ニューイングランドバイオラブスインク（ビバリー、マサチューセッツ州）、ベーリンガーマンハイム社（ドイツ）、またはギブコＢＲＬ社（ガイサースバード、メリーランド州）から購入した。部位特異的変異誘発を、記述されるように（リウ（Ｒｉｅｕ）ら、１９９６、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：１５８５８）ｐＧＥＸ−４Ｔ−１ベクターにおいて行った。以下の変異誘発プライマーを用いた。
それぞれの変異の導入は直接ＤＮＡ配列決定によって確認した。変異を含むＡドメインのＰｖｕＩ−ＢｓｐＥＩ−制限ｃＤＮＡ断片を、ＰｖｕＩ−ＢｓｐＥＩ−制限処理したＣＤ１１ｂ ｃＤＮＡにサブクローニングして、完全長のヒトＣＤ１１ｂ（リウ（Ｒｉｅｕ）ら、１９９６、Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７１：１５８５８）を含む、ｐｃＤＮＡ３プラスミドにクローニングした。１１ｂ Ａ１３９−３３７および１１ｂＡ１３９−３３１ならびに１１ｂＡＩ → Ｇドメインは、大腸菌においてＧＳＴ融合タンパク質として発現させ（ミチシタ（Ｍｉｃｈｉｓｈｉｔａ）ら、１９９３、Ｃｅｌｌ ７２：８５７）、トロンビンによって切断して、リら（Ｌｉ、１９９９、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４３：１５２３）に記載されるように精製した。Ｃ１４５は、トロンビン切断後に溶液中でジスルフィド結合二量体の形成を防止するために（示していない）、発現された全てのＧＳＴ−Ａドメイン融合型においてＳに置換された。純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって確認した。
【００１８】
１１ｂＡ１３９−３３７および１１ｂＡ１３９−３３１の構造は、ｘ線結晶学によって決定した。結晶は、１０ ｍｇ／ｍｌ保存タンパク質溶液、およびリら（Ｌｉ、１９９８、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４３：１５２３）に記載されるように懸滴蒸気拡散法を用いて成長させた。それぞれのＡドメインに関していくつかの結晶条件を試みた。１１ｂＡ１３９−３３１および１１ｂＡＩ → Ｇは、１５％ポリエチレングリコール８Ｋ、０．１０ Ｍトリス、ｐＨ ８．２、１５０ ｍＭ ＣａＣｌ２を含むリザーバー溶液の存在下で室温で結晶を形成した。結晶は一週間以内に形成し始め、二週間で典型的な大きさ０．３ ｍｍ×０．０５ ｍｍ×０．０４ ｍｍに成長して、正方晶系空間群Ｐ４に属し、単位格子はａ＝ｂ＝４５．７Åであった。１１ｂＡ１３９−３３７はこれらの条件では結晶化しなかったが、１０％ポリエチレングリコール４０００、０．１ Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ ４．５、５ｍＭ ＭｎＣｌ２をリザーバー緩衝液に用いると室温で結晶を形成した。１１ｂＡ１３９−３３７は、Ｐ２１２１２１空間群で結晶化して、単位格子はａ＝４８．１Å、ｂ＝１２１．５Å、ｃ＝７４．５Åであった。
【００１９】
１１ｂＡ１３９−３３７単結晶は、１００ Ｋで、ブルックヘイブン国立研究所で国立シンクロトロン光源の光線Ｘ１２Ｂ上でＣＣＤ検出器を用いて２．３Å分解能データセットを収集するために用いた。１１ｂＡ１３９−３３７単結晶は、施設内Ｘ−線を用いて造影板上に１００ Ｋで２．６Å分解能データを収集するために用いた。データはＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥＰＡＣＫによってそれぞれ処理して、Ｒｓｙｍ ８．８％、７．７％を得た。開始モデルはそれぞれ、残基Ｄ１４８〜Ｋ３３１を含む精密化１．８ÅＭｇ２＋構造（ｐｄｂアクセッションコードｌｉｄｏ）（リー（Ｌｅｅ）、１９９５、Ｃｅｌｌ ８０：６３１）、および残基Ｄ１４８〜Ａ３２４を含む精密化２．０ÅＭｇ２＋構造（ｐｄｂアクセッションコード１ｊｌｍ）（リー（Ｌｅｅ）ら、１９９８、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６：９２３）であり、それぞれ金属および水分子を除去した。予備的な剛体精密化は、Ｘ−ｐｌｏｒを用いて行い、回折データは、Ｒフリー計算の場合５％反射で８．０〜３．０Å分解能の範囲であった。位相を徐々に高分解能にして、構造は、ねじれ角の動力学と個々の拘束等方性Ｂ因子精密化プロトコールとを交互に数サイクル行うことによって精密化して、全ての回折データが１１ｂＡ１３９−３３７および１１ｂＡ１３９−３２１構造に関してそれぞれ、分解能８．０〜２．６Å、８．０〜２．３Åとなった（表１）。モデルの点検および手動での調節は、ＳＧＩグラフィックスワークステーション上でＯ（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、１９９１、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ４７：１１０）を用いて行った。溶媒分子の添加は、差分マップにおける適したピーク、妥当な水素結合、および５０Å２未満の精密化温度因子に基づいた。構造は１１ｂＡ１３９−３２１構造に関して最終的なＲ因子が２０．３％（Ｒフリー：２５．６％）、および１１ｂＡ１３９−３３７構造に関して２１．９％（Ｒフリー：３０．０％）となるように精密化した。最終モデルは１１ｂＡ１３９−３３１に関して、残基Ｄ１４８〜Ｋ３３１の全ての非水素原子、水分子３０個、およびＣａ２＋イオン１個、１１ｂＡ１３９−３３７に関して残基Ｄ１４８〜Ｇ３３７、水分子４４個、およびＭｎ２＋イオン１個を含む。結晶学的データを表１に示す。
【００２０】
【表１】
＊ Ｒｍｅｒｇｅ＝Σ｜Ｉ−＜Ｉ＞｜ΣＩ、式中Ｉは認められた強度、＜Ｉ＞は、対称性に関連した反射の複数回観察の平均強度である。
§ ｛｝内の数値は最高の０．１Å解像ビンを示す。
† Ｒ因子＝Σ｜Ｆｏ−Ｆｃ｜ΣＦｏ
‡ Ｒフリー＝ΣＴ｜Ｆｏ−Ｆｃ｜ΣＴ Ｆｏ、式中、Ｔは精密化から省略された反射のうちの、無作為に選択した５％を含む試験セットである。
【００２１】
結晶構造１１ｂＡ１３９−３３７は、「閉鎖」配座の結晶構造であった（図２Ａ、２Ｃ、および２Ｅ）。対照的に１１ｂＡ１３９−３３１は、「開放」型で結晶化した（図２Ｂ、２Ｄ、および２Ｆ）。
【００２２】
ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）（ＢＩＡｃｏｒｅＡＢ、アップサラ、スウェーデン）上で既に記述されている（リ（Ｌｉ）ら、上記）表面プラズモン共鳴を用いて、１１ｂＡ１３９−３３７および１１ｂＡ１３９−３３１のリガンド結合特性を決定した。ＩＣ３ｂ、フィブリノーゲン、またはＣＤ５４はそれぞれ、異なるＣＭ５センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅＡＢ）のデキストランマトリクスに１級アミン基を通して共有結合によって結合した。同じように固定したＢＳＡを対照表面として用いた。１１ｂＡ１３９−３３７、１１ｂＡ１３９−３３１、および１１ｂＡＩ−ＧＡドメインは、異なる時間に５ｍｌ／分でチップ上を流れた。２ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．００５％Ｐ２０（ＢＩＡｃｏｒｅＡＢ）を含むＴＢＳ（２０ ｍＭトリス塩酸、ｐＨ ８．０、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ）を実施緩衝液として用いた。１Ｍ ＮａＣｌの２０ ｍＭトリス塩酸緩衝液溶液、ｐＨ ８．０を用いて結合タンパク質を除去して表面を再生した。結合は時間の関数として測定した。結合データ（ＢＳＡコーティングチップに対するバックグラウンドの結合を差し引いた後）は既に記述されているように（ダルアクア（Ｄａｌｌ’Ａｑｕａ）ら、１９９６、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：９６６７〜９６７６）スキャッチャードプロットを用いて分析した。〜７０％コンフルエンスのＣＯＳ Ｍ７サル線維芽細胞に、記載されているように（ミチシタ（Ｍｉｃｈｉｓｈｉｔａ）ら、上記）ＷＴまたはＣＤ１１ｂＩ → ＧをコードするスーパーコイルｃＤＮＡを完全長のＣＤ１８と共にトランスフェクトした。
【００２３】
トランスフェクトしたＣＯＳ細胞を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、５０ ＩＵ／ｍｌペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したイスコブ改変ダルベッコ培地（バイオウィッタッカーインク、ウォーカーズビル、メリーランド州）において３７℃で２４時間増殖させた。細胞を洗浄して、０．１％トリプシン−ＥＤＴＡによって剥離させ、２４もしくは４８ウェルプレート（コスター社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）、または１００ ｍｍペトリ皿に同じものを播種して２４時間培養した。２４または４８ウェルプレートにおけるコンフルエント単層を細胞表面抗原定量のために用い、ペトリ皿で培養した細胞を免疫沈降試験に用いた。ヘテロダイマー形成および野生型およびＣＲ３Ｉ → Ｇハロ受容体に対するｉＣ３ｂコーティング赤血球の結合は、記載通りに実施した（リウ（Ｒｉｅｕ）ら、１９９６、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：１５８５８）。ハロ受容体に対するｉＣ３ｂの特異的結合は、偽トランスフェクトＣＯＳ細胞に対するバックグラウンド結合を差し引くことによって得た。ＣＲ３Ｉ → Ｇに対する結合は、ｍＡｂ９０４の結合を用いて表面発現の程度を修正した後、野生型に対する結合の百分率として表記した（リウ（Ｒｉｅｕ）ら、１９９６、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：１５８５８）。
【００２４】
図３Ａ〜３Ｊに示すように、１１ｂＡ１３９−３３７は、活性化依存的「生理的」リガンド、補体ｉＣ３ｂ、フィブリノーゲン、およびＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）に対する結合を示さなかった。対照的に、１１ｂＡ１３９−３３１は、３つ全てのリガンドに対する高親和性結合を示した（図３Ａ〜３Ｊ）。双方のドメインは、活性化非依存的「リガンド」ＮＩＦ（好中球阻止因子）（図３Ｄおよび３Ｉ）、ならびにｍＡｂ９０４（図３Ｅおよび３Ｊ）に対して等しく十分に結合し、認められた差がＡドメイン濃度の変化によって引き起こされたものではないことを示した。これらのデータは、「開放」および「閉鎖」結晶構造がインテグリン１１ｂＡの「高」および「低」親和性状態にそれぞれ対応することを決定的に確立する。
【００２５】
実施例 ２ ：置換による安定な高親和性状態 ＣＤ１１ｂ 変種の作製
Ｉｌｅ３３２は、現在までクローニングされた全てのインテグリンαＡドメインにおいて不変である（図５）。イソロイシンからグリシンへの置換を有するＡドメイン（１１ｂＡＩ → Ｇ）は、「高親和性」状態を示した（図４Ａ）。ハロ受容体に同じ置換を作製すると、そのリガンド結合活性は劇的に増加した（図４Ｂ）。結晶構造１１ｂＡＩ → Ｇは、「開放」１１ｂＡ１３９−３３１型の結晶構造と同一であった。これらのデータは、「開放」高親和性配座が、ドメインに固有のイソロイシンに基づくスイッチによって主に指示され、ＭＩＤＡＳ面上のリガンド結合親和性をアロステリックに調節するように作用することを確固として確証する。インテグリンの不活性な活性配座異性体がリガンドの非存在下で存在することは既知である（スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、上記；ヤン（Ｙａｎ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：７２４９〜６０、２０００）。上記の結果に基づいて、リガンドの役割は、最近提唱されているように（エムセリー（Ｅｍｓｅｌｙ）ら、上記）、高親和性状態を開始することではなく、低親和性と高親和性状態との平衡が後者に都合がよいように移動することによって高親和性状態を安定化することであるように思われる（リ（Ｌｉ）ら、上記）。内側から外側へのシグナル伝達によってインテグリンが活性化されると、この平衡が移動して、リガンドの結合に関して「利用可能」になる細胞表面上の高親和性受容体の比率が増加すると考えられる。次に、リガンドが結合すると、おそらくＡドメインに対して外因性であって、外側から内側へのシグナル伝達を開始させる新しいエピトープを形成すると考えられる。
【００２６】
保存された疎水性分子内ソケット（ＳＩＬＥＮ、イソロイシン用ソケット；Ｓｏｃｋｅｔ ｆｏｒ Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）は、「閉鎖」配座におけるＩ３３２のフィンガーを固定し；「開放」構造においてＩ３３２がＬ３２８に置換される（図１Ａおよび１Ｆ）。ＳＩＬＥＮは、「閉鎖」および「開放」配座の双方においてＩ１５１、Ｌ１８０、Ｉ２５２、およびＹ２８３の疎水性側鎖によって形成される（図１Ｃおよび１Ｄ）。いくつかのインテグリンにおいて、外側のＭＩＤＡＳに存在する特定の変異は、ハロ受容体において機能獲得作用を生じ、アロステリックに作用すると考えられている（ザング（Ｚｈａｎｇ）ら、上記；オクスビッヒ（Ｏｘｖｉｇ）ら、上記；ザング（Ｚｈａｎｇ）ら、上記）。これらの試験は、ハロ受容体において行われており、可能性があるドメイン内相互作用および／または他の第四の作用のために、機構の解釈を提供することが難しい。これらの変異は、ＳＩＬＥＮにおいて、またはその周辺で起こる。例えば、ＣＤ１１ｂのα１−βＢループをＣＤ１１ａに置換すると、構成的に活性なインテグリンを生じる（ザング（Ｚｈａｎｇ）ら、上記）。この領域はＳＩＬＥＮ残基Ｌ１８０の一つに及ぶ。インテグリンの活性化も同様に、Ｌ１８０−Ｆ置換（オクスビッヒ（Ｏｘｖｉｇ）ら、上記）において起こり、これはＳＩＬＥＮを予測可能により小さくして、したがって、Ｉ３３２により適応しにくくなる。Ｅ１４７、Ｄ１４８、Ｋ２４７、およびＦ２５０を含む他の活性化変異は、ＳＩＬＥＮの非常に近位の構造の底部に存在し（オクスビッヒ（Ｏｘｖｉｇ）ら、上記）、このように、ＳＩＬＥＮにおいてＩｌｅの「フィンガー」の適切な配座結合を妨害することによってその作用を発揮する可能性がある。ＭＩＤＡＳの反対側上のエピトープによる特定のｍＡｂ（例えば、ｍＡｂ ４４ａ、そのエピトープがＳＩＬＥＮの上部の残基に及ぶ）の阻害作用は、同様に、ＳＩＬＥＮポケットの安定化を通して説明される可能性がある。
【００２７】
Ｎ末端伸張が存在すると、あまり好ましくない高親和性状態へのＡドメインの切り替えが促進される（リ（Ｌｉ）ら、上記）。由来する３−Ｄ構造にはＮ末端伸長部におけるいずれの残基も含まれないことから、この作用の基礎となる構造の基礎は不明である。しかし、この伸長部内の残基がＡドメインにおけるリガンド結合を調節することが認められた。最初に、ｖＷＦ Ａ１ドメインのこのセグメントにおける天然に存在する点突然変異は、野生型ＩＩＢ型ｖＷｆ疾患を有する患者において機能獲得表現型を引き起こす（マツシタ（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７９：１３４０６〜１４、１９９５）。この領域はまたＣＤ１１ｂ Ａドメインにおいて活性化変異を含む（オクスビッヒ（Ｏｘｖｉｇ）ら、上記）。第三に、Ｎ末端の伸長部からの合成ペプチドは、ＣＤ１１ａ−依存的接着を阻害した。ＣＤ４９ｂ Ａドメインからの構造データも同様に、α７ヘリックスを超えて伸張する三つの残基を、Ｎ末端伸長部における残基によってその一部が形成されたくびれた部分に充填することができ、ＮおよびＣ末端を非常に近位に存在させることを示している（エムスレイ（Ｅｍｓｌｅｙ）ら、上記）。α７におけるＣ末端残基の柔軟性も同様に、ＣＤ１１ａ Ａドメインの結晶およびＮＭＲ構造において認められている。併せて考慮すると、これらのデータは、Ｎ末端伸長部がＳＩＬＥＮからイソロイシンを離すように誘導するための不完全な「競合的」表面による代用物を提供し、いくつかの分子を「開放」型で存在させる可能性があることを示唆している。本発明のデータは、そのような機構がハロ受容体において機能する可能性があることを示唆し、内側から外側へのシグナルによってインテグリンが活性化する機構の基礎を提供する。
【００２８】
変種インテグリンポリペプチド
インテグリンαサブユニットにおける配列類似性を考慮して、ＣＤ１１ｂのＩｌｅ３３２に対応する選択されたインテグリンαサブユニットにおけるＩｌｅの置換の欠失によって、サブユニットの野生型より活性な（すなわち、溶液中で、リガンド結合型ポリペプチドの比率がより高くなる）変種インテグリンαサブユニットが形成されるはずである。図５は、９個のインテグリンαサブユニット（ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤ１１ａ、α１、α２、α１０、α１１、およびαＥ）のＡドメインのＣ末端α７ヘリックスのアラインメントを示す。このアラインメントにおいて、他のインテグリンαサブユニットにおけるＣＤ１１ｂのＩｌｅ３３２に対応する不変のＩｌｅを概説する（矢印）。不変のＩｌｅをアラニンもしくはグリシンまたは他のいくつかの適したアミノ酸に置換すると、活性が増加した変種インテグリンポリペプチドが得られるはずである。われわれは、ＣＤ１１ａ Ａドメインにおいてもこれが当てはまることを示した（図６）。ＩｌｅからＧｌｙへの置換を含む変種ＣＤ１１ａ Ａドメインは、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて活性化依存的リガンドＩＣＡＭ−１に対する結合を示す。この置換がない野生型タンパク質には結合が認められなかった。または、不変のＩｌｅと不変のＩｌｅに対してＣ末端の全てのアミノ酸残基を含むインテグリンαサブユニット（またはＡドメイン）の一部を欠失させることができる。表２は、図５において示したインテグリンαサブユニットのそれぞれにおける不変のＩｌｅの位置の一覧を示す。
【００２９】
【表２】
【００３０】
本発明は、不変のＩｌｅ（表２に記載）がＧｌｙ、ＡｌａまたはＩｌｅ以外のいくつかのアミノ酸（例えば、Ｖａｌ）に置換されている変種インテグリンαサブユニットを特徴とする。ポリペプチドは、表示のＡドメインの一部または全て、例えば、不変のＩｌｅの位置を含むＡドメインの１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００連続アミノ酸を含みうる。本発明には、Ｉｌｅが欠失している変種インテグリンαサブユニットも含まれる。同様に、不変Ｉｌｅを除くインテグリンαの完全なＡドメインを含むポリペプチド（例えば、ＣＤ１１ｂのアミノ酸１４４〜１３２位、ＣＤ１１ｃのアミノ酸１４５〜３３２位、ＣＤ１１ｄのアミノ酸１４４〜３３１位、ＣＤ１１ａのアミノ酸１５０〜３３０位）も本発明に含まれるが、インテグリンαサブユニットの残りの部分は含まれない。本発明はまた、不変のＩｌｅまでを含むが不変のＩｌｅを含まず、さらに不変のＩｌｅ以降のアミノ酸５個を欠失するインテグリンαサブニットのＡドメインを含むポリペプチド（例えば、ＣＤ１１ｂのアミノ酸１４４〜３３１位、しかし３３２〜３３６位は含まない；ＣＤ１１ｃのアミノ酸１４５〜３３２位、しかし３３３〜３３７位は含まない；ＣＤ１１ｄのアミノ酸１４４〜３３１位、しかし、３３２〜３３６位は含まない；ＣＤ１１ａのアミノ酸１５０〜３３０位、しかし３３１〜３３５位は含まない；ヒトα１のアミノ酸１３９〜３３０位、しかし３３１〜３３５位は含まない；ヒトα２のアミノ酸１６９〜３６０位、しかし３６１〜３３５位は含まない；ヒトα１０のアミノ酸５７〜２４８位、しかし２４９〜２５３位は含まない；ヒトα１１のアミノ酸１５９〜３４８位、しかし、３４９〜３５３位は含まない；またはヒトαＥのアミノ酸１９６〜３８４位、しかし３８５〜３８９位は含まない）も特徴とする。
【００３１】
ＣＤ１１ｂαサブユニットのＩｌｅ３３２に対応するＩｌｅの変化（置換または欠失）を、一つまたは複数の他の活性化変異、例えば、Ｌ１８０−Ｆ置換またはＥ１４７、Ｄ１４８、Ｋ２４７、もしくはＦ２５０での変異と組み合わせた変種インテグリンも同様に本発明に含まれる。
【００３２】
インテグリンβサブユニットのＡ様ドメインにおける配列類似性を考慮すると、ＣＤ１１ｂのＩｌｅ３３２に対応する選択されたインテグリンβサブユニットにおけるＩｌｅの欠失または置換によって、サブユニットの野生型より活性である（すなわち、溶液中でポリペプチドのリガンド結合型がより大きな比率で存在する）変種インテグリンβサブユニットが得られるはずである。図７はインテグリンβサブユニットのＡ様ドメインのアラインメントである。保存されたＩｌｅをＡｌａもしくはＧｌｙ、または他の適したアミノ酸に置換すると、活性が増加した変種インテグリンポリペプチドが得られるはずである。または、保存されたＩｌｅ（またはＬｅｕ）と不変のＩｌｅに対してＣ末端の全てのアミノ酸残基を含むインテグリンβサブユニット（またはサブユニットのＡ様ドメイン）の一部を欠失させることができる。下記の表３は、図７に示すインテグリンβサブユニットのそれぞれにおける保存されたＩｌｅの位置を記載する。
【００３３】
【表３】
【００３４】
変種インテグリンポリペプチドをコードする核酸分子
本発明は、変種インテグリンポリペプチド、例えば完全長の変種インテグリンサブユニットまたはその断片（例えば、不変のＩｌｅが欠失または置換されている）、例えば生物的に活性な変種インテグリンポリペプチドをコードする単離または精製された核酸分子を特徴とする。
【００３５】
一つの態様において、本発明の単離された核酸分子には、ＣＤ１１ｂαサブユニット（配列番号：１）のアミノ酸１３９〜３２１位またはその一部をコードするヌクレオチド配列が含まれる。核酸分子には、非コード配列またはインテグリン以外のタンパク質の全てもしくは一部をコードする配列が含まれうる。
【００３６】
もう一つの態様において、本発明の単離された核酸分子には、ＣＤ１１ｂαサブユニットのアミノ酸１３９〜３２１位をコードするヌクレオチド配列の相補体である核酸分子が含まれる。
【００３７】
本発明の核酸分子には、配列番号：１の核酸配列の一部のみが含まれうる。例えば、そのような核酸分子には、インテグリンＡドメインまたはＡ様ドメインの全てもしくは一部（例えば、免疫原性もしくは生物学的に活性な部分）をコードする断片が含まれうる。
【００３８】
変種インテグリンポリペプチド
本発明にはまた、変種インテグリンポリペプチドが含まれる。そのようなポリペプチドは、組換えＤＮＡ法を用いて、化学合成によって、または他の技術を用いて産生することができる。ポリペプチドは、インテグリンＡドメインまたはＡ様ドメインの活性型に結合する抗体を作製するための、免疫原または抗原として用いることができる。ポリペプチドは、翻訳後改変、例えばグリコシル化することができる。
【００３９】
変種インテグリンポリペプチドは、変種インテグリンポリペプチドではない第二のポリペプチドの全てまたは一部を含む、融合タンパク質の一部となりうる。この第二のポリペプチドは、変種インテグリンポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に融合させることができる。第三のペプチドの全てまたは一部が存在してもよい。このように、変種インテグリンポリペプチドは、例えば、ＧＳＴ、免疫グロブリン定常領域、異種シグナル配列に融合することができる。
【００４０】
本発明の変種インテグリンポリペプチド融合タンパク質は、薬学的組成物に組み入れて、インビボで被験者に投与することができる。例えば、変種インテグリンポリペプチドは、骨格筋損傷を減少させるために用いることができる。単離されたＣＤ１１ｂ Ａドメインは既に、この型の損傷の動物モデルにおいて障害を減少させることが判明している。簡単に説明すると、機械による骨格筋損傷を誘導する３０分前に、精製した組換え型ラットＣＤ１１ｂ Ａドメインの１回量（１ｍｇ／ｋｇ）を、ルイスラットの７群（１群当たり５匹）に静脈内投与した。同数のラットに機能遮断性の抗ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８ ｍＡｂ（１ｍｇ／ｋｇ）を処置した。対照ラットにおける（ＰＢＳによって処置）創傷領域の定量的組織学的検査によって、浮腫、筋繊維の破壊、壊死、および赤血球の滲出が示された。好中球の流入は創傷の３０分後に検出され、その３時間後に第二波が起こった。同様に、直接の創傷領域（５ｍｍ域）の外側には、活性化好中球の存在に関連して有意な組織壊死を認めた。ＡドメインまたはｍＡｂ−処置ラットは、浸潤ＰＭＮ数（７５±１０％、ｎ＝３５）、および直接の壊死領域外の筋繊維の保護（８０±８％、ｎ＝３５）に同等で有意な減少を示した。これらのデータは、Ａドメインがこの筋損傷モデルにおいて有効な組織保護剤となりうることを示している。変種Ａドメインも等しく有効となりうる。
【００４１】
変種インテグリンポリペプチド融合タンパク質を用いて、変種インテグリンポリペプチドリガンドの生物学的利用率に影響を及ぼすことができる。
【００４２】
変種インテグリンポリペプチド融合タンパク質は、例えば、虚血−再灌流損傷（Ｓｔｒｏｋｅ ３０：１３４〜９、１９９９）、免疫複合体（Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８６：１８５３〜６３、１９９７）、再狭窄、および寄生虫疾患（例えば、鉤虫種（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｓｐｐ）；Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２７：２０８１〜９１、１９９４を参照のこと）によって引き起こされた障害の治療のために、治療的に有用となる可能性がある。
【００４３】
その上、本発明の変種インテグリンポリペプチド−融合タンパク質は、被験者において抗変種インテグリンポリペプチド抗体を産生するため、変種インテグリンポリペプチドリガンドを精製するため、および変種インテグリンポリペプチドリガンドと変種インテグリンポリペプチドとの相互作用を阻害する分子を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて、免疫原として用いることができる。
【００４４】
融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）を既にコードしている発現ベクターが市販されている。変種インテグリンポリペプチドをコードする核酸は、融合部分が変種インテグリンポリペプチドタンパク質にインフレームで結合するように、そのような発現ベクターにクローニングすることができる。
【００４５】
変種インテグリンポリペプチドは、発現ベクター（例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクター）を用いて産生することができる。ベクターは、自律的に増幅することができるか、または宿主ゲノムに組み入れられることができる。発現ベクターには、発現されるべき核酸配列に機能的に結合した少なくとも一つの調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ部位、または細胞もしくは組織特異的転写因子結合部位）が含まれうる。発現ベクターは、原核または真核細胞、例えば植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現されるように設計することができる。変種インテグリンポリペプチドを発現させるために用いる宿主に応じて、宿主細胞にとって最適なコドンを用いてポリペプチドをコードすることが望ましい可能性がある。場合によっては、組織特異的発現を指示することができる発現ベクターを用いることが望ましい可能性がある。
【００４６】
本発明はまた、変種インテグリンポリペプチドをコードする核酸分子を有する、宿主細胞または組換え型細胞を特徴とする。核酸分子は、宿主ゲノムに組み入れられることができ、または自律的に複製するベクターに存在しうる。宿主細胞は任意の原核または真核細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母または哺乳類細胞となりうる。核酸分子は、形質転換またはトランスフェクション技術によって宿主細胞に導入することができる。
【００４７】
本発明の宿主細胞は、ポリペプチドが産生されるような条件で宿主細胞を培養する段階、および次に細胞または培養培地からポリペプチドを単離する段階によって、変種インテグリンポリペプチドを産生（すなわち、発現）するために用いることができる。
【００４８】
変種インテグリンポリペプチドを認識する抗体
本発明はまた、変種インテグリンポリペプチドに対して作製された抗体を特徴とする。そのような抗体は、それらが対応する野生型インテグリンポリペプチドに結合するより大きな親和性によって、変種ポリペプチドに結合する。抗体は標準的な方法を用いて作製することができ、変種インテグリンポリペプチドに対する抗体の結合を、対応する野生型ポリペプチドに対する抗体の結合と比較することによってスクリーニングすることができる。
【００４９】
「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子、またはその免疫学的活性部分、すなわち抗原結合部分を意味する。免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分の例には、Ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２断片が含まれ、これらはペプシンのような酵素によって抗体を処理することによって作製することができる。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え型、例えばキメラまたはヒト化、完全なヒト、非ヒト、例えば、マウス、または一本鎖抗体となりうる。好ましい態様において、これはエフェクター機能を有する。抗体は、潜在的炎症（例えば、膿瘍、または活性アテローム斑）を診断するために用いられる、毒素または造影剤に結合させることができる。
【００５０】
キメラ、ヒト化、しかし最も好ましくは、完全なヒト抗体は、反復投与、例えばヒト患者の治療的処置（およびいくつかの診断的応用）を含む適用にとって望ましい。
【００５１】
抗変種インテグリンポリペプチド抗体は、多価抗体を産生するために選択的に二量体または多量体にすることができる、一本鎖抗体でありうる。抗体は、Ｆｃ受容体にほとんどまたは全く結合しないように設計することができる。
【００５２】
本発明の抗体は、活性配座であるインテグリンサブユニットを検出または精製するために用いることができる。このように、それらを用いて、臨床検査技法の一部としてインテグリンの活性型の量および発現パターンを評価することができる。検出は、抗体を検出可能な物質に結合させる（すなわち、物理的に連結させる）ことによって（すなわち抗体の標識）、容易にすることができる。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子団、蛍光材料、発光材料、生体発光材料、および放射活性材料（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチン、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリン、ルミノール、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、アエコリン、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓおよび３Ｈ）が含まれる。
【００５３】
変種インテグリンポリペプチドと相互作用する化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ
本発明は、化合物が変種インテグリンポリペプチドに結合するか否か、または化合物がインテグリンリガンド（例えば、天然に存在するインテグリンリガンド）の変種インテグリンポリペプチドに対する結合能を阻害するか否かを評価する方法を特徴とする。方法には、リガンドの存在下または非存在下において、化合物を変種インテグリンポリペプチドに接触させる段階、および変種ポリペプチドに対する化合物またはリガンドの結合能を測定する段階が含まれうる。方法は、インビトロで、例えば細胞不含系において、またはインビボで、例えばツーハイブリッド相互作用捕獲アッセイにおいて行うことができる。方法は、インテグリンと相互作用する天然に存在する分子を同定するために用いることができる。同様に、インテグリンとインテグリンリガンドとの相互作用の、天然または合成の阻害剤を発見するために用いることも可能である。
【００５４】
調べる化合物は、例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、ペプトイド、および低分子となりうる。被験化合物は、生物ライブラリ；ペプトイドライブラリ；空間的に位置特定可能な平行固相または液相ライブラリ；逆重畳積分を必要とする合成ライブラリ法；「１ビーズ１化合物」ライブラリを含む組み合わせライブラリから得ることができる。
【００５５】
化合物のライブラリは、溶液中（例えば、ホーテン（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ）、１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２〜４２１）、またはビーズ（ラム（Ｌａｍ）、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２〜８４）、チップ（フォドー（Ｆｏｄｏｒ）、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５〜５５６）、細菌（ラドナー（Ｌａｄｎｅｒ）、米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（ラドナー（Ｌａｄｎｅｒ）、米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド（カル（Ｃｕｌｌ）ら、１９９２、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１８６５〜１８６９）、またはファージ（スコットおよびスミス（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ）、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６〜３９０；デブリン（Ｄｅｖｌｉｎ）、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４〜４０６；クィーラ（Ｃｗｉｒｌａ）ら、１９９０、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：６３７８〜６３８２；フェリチ（Ｆｅｌｉｃｉ）、１９９１、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：３０１〜３１０；ラドナー（Ｌａｄｎｅｒ）、上記）上に存在してもよい。
【００５６】
スクリーニングアッセイは、変種インテグリンポリペプチドタンパク質またはその生物活性部分を発現する細胞を被験化合物に接触させて、被験化合物が変種インテグリンポリペプチド活性を調節できるか否かを決定する細胞に基づくアッセイとなりうる。被験化合物が変種インテグリンポリペプチド活性を調節できるか否かの決定は、例えば、インテグリンリガンドとの結合能をモニターすることによって達成できる。
【００５７】
被験化合物が化合物、例えばインテグリンリガンドに対するインテグリンポリペプチドの結合を調節できるか否か、または変種インテグリンポリペプチドに結合できるか否かも同様に評価することができる。これは、例えば化合物、例えば基質の変種インテグリンポリペプチドに対する結合が、複合体における標識化合物、例えば基質を検出することによって決定されうるように、化合物、例えば基質を放射性同位元素または酵素標識に結合させることによって行うことができる。または、変種インテグリンポリペプチドまたはインテグリンリガンドは、被験化合物がインテグリンリガンドに対する変種インテグリンポリペプチドの結合を調節できるか否かをモニターするために、放射性同位元素または酵素標識に結合させることができる。例えば、化合物は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈによって直接または間接的に標識することができ、放射性同位元素は、放射線放出の直接計数またはシンチレーション計数によって検出することができる。または、化合物は、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼによって酵素的に標識することができ、酵素標識は、適当な基質の産物への変換を測定することによって検出される。
【００５８】
さらにもう一つの態様において、変種インテグリンポリペプチドまたはその生物活性部分を被験化合物に接触させ、変種インテグリンポリペプチドまたはその生物活性部分に化合物が結合するか否かを評価する、細胞不含アッセイが提供される。本発明のアッセイにおいて用いられる変種インテグリンポリペプチドの好ましい生物活性部分には、インテグリンリガンドに結合する断片が含まれる。
【００５９】
単離されたタンパク質（例えば、変種インテグリンポリペプチドタンパク質またはその生物活性部分）の可溶性および／または膜結合型は、本発明の細胞不含アッセイにおいて用いることができる。タンパク質の膜結合型を用いる場合、可溶化剤を用いることが望ましい可能性がある。そのような可溶化剤の例には、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、トライトン（登録商標）Ｘ−１００、トライトン（登録商標）Ｘ−１１４、テジット（登録商標）、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）、またはＮ−ドデシル＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートのような非イオン性洗浄剤が含まれる。
【００６０】
細胞不含アッセイは、標的遺伝子タンパク質と被験化合物との反応混合物を、二つの成分が相互作用して結合するために十分な条件および時間で調製する段階、次に除去および／または検出することができる複合体を形成する段階を含む。
【００６１】
二つの分子間の相互作用も同様に、蛍光エネルギー移動（ＦＥＴ）（例えば、ラコヴィッツ（Ｌａｋｏｗｉｃｚ）ら、米国特許第５，６３１，１６９号；スタブリャノポーロス（Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ）ら、米国特許第４，８６８，１０３号を参照のこと）を用いて検出することができる。第一の「ドナー」分子上での蛍光体標識は、その放出された蛍光エネルギーが第二の「アクセプタ」分子上の蛍光標識によって吸収され、今度は吸収されたエネルギーによって蛍光を発することができるように選択される。または、「ドナー」タンパク質分子は、単にトリプトファン残基の天然の蛍光エネルギーを利用してもよい。「アクセプタ」分子の標識が「ドナー」の標識と区別されるように、異なる波長の光を放出する標識を選択する。二つの標識間でのエネルギー移動効率は分子が離れている距離に関連するため、分子間の空間的関係を評価することができる。結合が分子間で起こる状況では、アッセイにおける「アクセプタ」分子標識の蛍光放出は最大でなければらなない。ＦＥＴ結合事象は、当技術分野で周知である標準的な蛍光検出手段（例えば、蛍光計を用いて）によって従来のように検出することができる。
【００６２】
もう一つの態様において、変種インテグリンポリペプチドタンパク質が標的分子、例えばインテグリンリガンドに結合するか否かを決定することは、上記のようにリアルタイム生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）（例えば、シェランダーおよびウルバニクツキー（ＳｊｏｌａｎｄｅｒおよびＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ）（１９９１）、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６３：２３３８〜２３４５およびスザボ（Ｓｚａｂｏ）ら、（１９９５）、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ５：６９９〜７０５を参照のこと）を用いて行うことができる。「表面プラズモン共鳴」または「ＢＩＡ」は、いかなる相互作用物質も標識せずに、リアルタイムで生体特異的相互作用を検出する（例えば、ビアコア）。結合表面での質量の変化（結合事象を示す）によって、表面近傍の光の屈折指数の変化が起こり（表面プラズモン共鳴の光学現象（ＳＰＲ））、検出可能なシグナルが得られ、これを生体分子間のリアルタイム反応の指標として用いることができる。
【００６３】
一つの態様において、ポリペプチドまたは被験化合物を固相上に固定する。固相に固定したポリペプチド／被験化合物は、反応終了時に検出することができる。好ましくは、ポリペプチドを固相表面に固定することができ、被験化合物（固定していない）を、検出可能な標識によって直接または間接的に標識することができる。
【００６４】
一つまたは双方のタンパク質の非複合体型からの複合体型の分離を容易にするためと共に、アッセイを自動化に適応させるために、変種インテグリンポリペプチド、抗変種インテグリンポリペプチド抗体またはその標的分子を固定することが望ましい可能性がある。変種インテグリンポリペプチドタンパク質に対する被験化合物の結合、または候補化合物の存在下および非存在下で標的分子と変種インテグリンポリペプチドタンパク質との相互作用は、反応物質を含む適した如何なる容器において行うことも可能である。そのような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微量遠心管が含まれる。一つの態様において、一つまたは双方のタンパク質がマトリクスに結合できるようにするドメインを付加する融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／変種インテグリンポリペプチド融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ州）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸収させることができ、次にこれを被験化合物、または被験化合物と吸収されない標的タンパク質もしくは変種インテグリンポリペプチドタンパク質のいずれかと混合して、混合物を複合体を形成する条件（例えば、塩およびｐＨに関して生理的条件）でインキュベートする。インキュベーションの後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、未結合の化合物、ビーズの場合には固定したマトリクスを除去し、複合体は例えば上記のように直接または間接的に決定することができる。または、複合体をマトリクスから解離させて、変種インテグリンポリペプチド結合または活性レベルを標準的な技術を用いて決定することができる。
【００６５】
変種インテグリンポリペプチドまたは標的分子のいずれかをマトリクス上に固定する他の技術には、ビオチンとストレプトアビジンとを用いることが含まれる。ビオチン結合変種インテグリンポリペプチドまたは標的分子は、当技術分野で既知の技術（例えば、ビオチン結合キット、ピアスケミカルズ社、ロックフォード、イリノイ州）を用いてビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシニミド）から調製して、ストレプトアビジンコーティング９６ウェルプレート（ピアスケミカル社）のウェルに固定することができる。
【００６６】
アッセイを行うために、固定成分を含むコーティング表面に非固定成分を加える。反応が終了した後、形成された如何なる複合体も固相表面上に固定されたままであるように未反応成分を除去する（例えば、洗浄によって）。固相表面に固定された複合体の検出は、多くの方法によって行うことができる。先に固定されていない成分が予め標識されている場合、表面上に固定された標識が検出されれば、複合体が形成されたことを示している。先に固定されていない分子が予め標識されていない場合、間接的な標識、例えば固定成分に対して特異的な標識抗体（次に抗体を、例えば標識抗Ｉｇ抗体によって直接または間接的に標識することができる）を用いて、表面上に固定された複合体を検出することができる。
【００６７】
一つの態様において、このアッセイは、変種インテグリンポリペプチドまたは標的分子と反応するが、変種インテグリンポリペプチドのその標的分子に対する結合を妨害しない抗体を利用して行われる。そのような抗体は、プレートのウェルに誘導体化することができ、未結合の標的または変種インテグリンポリペプチドタンパク質は抗体の結合によってウェルに捕獲される。ＧＳＴ固定複合体に関して先に記述した方法の他に、そのような複合体を検出する方法には、変種インテグリンポリペプチドまたは標的分子に反応する抗体を用いて複合体を免疫学的に検出することと共に、変種インテグリンポリペプチドまたは標的分子に関連した酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが含まれる。
【００６８】
または、細胞不含アッセイは液相において行うことができる。そのようなアッセイにおいて、反応産物は、クロマトグラフィー、電気泳動、および免疫沈降を含む多くの標準的な技術によって未反応成分から分離する。
【００６９】
好ましい態様において、アッセイには、変種インテグリンポリペプチドまたはその生物活性部分を、変種インテグリンポリペプチドに結合する既知の化合物に接触させてアッセイ混合物を形成すること、アッセイ混合物を被験化合物に接触させること、および被験化合物が変種インテグリンポリペプチドと相互作用するか否かを決定する段階が含まれ、被験化合物が変種インテグリンポリペプチドと相互作用するか否かを決定することには、被験化合物が選択的に変種インテグリンポリペプチドもしくはその生物活性部分に結合することができるか否か、または既知の化合物と比較して標的分子の活性を調節することができるか否かを決定することが含まれる。
【００７０】
変種インテグリンポリペプチドとインテグリンリガンドとの相互作用を妨害する化合物を同定するために、変種インテグリンポリペプチドとリガンドとを含む反応混合物を、２つの産物が複合体を形成するために十分な条件および時間でインキュベートする。阻害物質を調べるために、反応混合物は被験化合物の存在下および非存在下で提供する。被験化合物は、最初に反応混合物に含めることができ、または一度に加えてから、標的遺伝子およびその細胞もしくは細胞外結合パートナーを加えることができる。対照反応混合物は、被験化合物を加えないで、またはプラセボを加えてインキュベートする。次に、変種インテグリンポリペプチドとインテグリンリガンドとの如何なる複合体の形成も検出する。対照反応において複合体が形成されるが、被験化合物を含む反応混合物において形成されなければ、化合物が相互作用を妨害することを示している。さらに、被験化合物と変種インテグリンポリペプチドとを含む反応混合物における複合体形成を、被験化合物と対応する野生型インテグリンポリペプチドとを含む反応混合物における複合体形成と比較することができる。
【００７１】
これらのアッセイは、不均一または均一フォーマットで行うことができる。不均一アッセイは、変種インテグリンポリペプチドまたは結合パートナー（すなわち、インテグリンリガンド）のいずれかを固相上に固定すること、および反応終了時に固相上に固定された複合体を検出することを含む。均一アッセイでは、反応全体を液相で行う。いずれかのアプローチにおいて、反応物質を加える順序は、調べる化合物に関して異なる情報が得られるように変更することができる。例えば、変種インテグリンポリペプチドと結合パートナー（例えば、インテグリンリガンド）との相互作用を、例えば競合によって妨害する被験化合物は、試験物質の存在下で反応を行うことによって同定することができる。または、予め形成された複合体を破壊する被験化合物、例えば複合体から成分の一つを置換するより高い結合定数を有する化合物は、複合体が形成された後に反応混合物に被験化合物を加えることによって調べることができる。様々なフォーマットを下記に簡単に説明する。
【００７２】
不均一アッセイ系において、変種インテグリンポリペプチドまたはインテグリンリガンドのいずれかを固相表面（例えば、マイクロタイタープレート）に固定して、非結合種は直接または間接的に標識する。固定種は、非共有または共有結合によって固定することができる。または、固定すべき種に特異的な固定抗体を用いて固相にその種を固定することができる。
【００７３】
アッセイを行うために、固定種のパートナーを被験化合物と共にまたは被験化合物の非存在下でコーティング表面に曝露する。反応が終了した後、未反応の成分は除去されるが（例えば、洗浄によって）、形成された如何なる複合体も固相表面に固定されたままである。非固定種が予め標識されている場合、表面上に固定された標識が検出されれば、複合体が形成されたことを示している。非固定種が予め標識されていない場合、間接的な標識を用いて、例えば最初の非固定種に対して特異的な標識抗体（次に抗体を、例えば標識抗Ｉｇ抗体によって直接または間接的に標識することができる）を用いて、表面上に固定された複合体を検出することができる。反応成分を加える順序に応じて、複合体形成を阻害するまたは予め形成された複合体を破壊する被験化合物を検出することができる。
【００７４】
または、反応は、被験化合物の存在下または非存在下で液相で行うことができ、反応産物を未反応成分から分離して、例えば溶液において形成された如何なる複合体も固定するために結合成分の一つに対して特異的な固定抗体と、固定された複合体を検出するための他のパートナーに対して特異的な標識抗体とを用いて、複合体を検出することができる。この場合も、反応物質を液相に加える順序に応じて、複合体を阻害する、または予め形成された複合体を破壊する被験化合物を同定することができる。
【００７５】
本発明のもう一つの態様において、均一アッセイを用いることができる。例えば、変種インテグリンポリペプチドまたはインテグリンリガンドのいずれかが標識されているが、標識によって産生されたシグナルが複合体形成によって消光するような、変種インテグリンポリペプチドとインテグリンリガンドとの予め形成された複合体を調製する（例えば、このアプローチをイムノアッセイに利用する米国特許第４，１０９，４９６号を参照のこと）。種の一つに競合する、または予め形成された複合体から種の一つを置換する試験物質を加えれば、バックグラウンドを超えるシグナルが産生されると考えられる。このようにして、変種インテグリンポリペプチド結合パートナー相互作用を破壊する試験物質を同定することができる。
【００７６】
さらにもう一つの局面において、変種インテグリンポリペプチドタンパク質は、変種インテグリンポリペプチドに結合または相互作用する他のタンパク質を同定するために、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイにおける「ベイト（ｂａｉｔ）」タンパク質として用いることができる（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；ゼルボス（Ｚｅｒｖｏｓ）ら、（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：２２３〜２３２；マデュラ（Ｍａｄｕｒａ）ら（１９９３）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１２０４６〜１２０５４；バーテル（Ｂａｒｔｅｌ）ら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０〜９２４；イワブチ（Ｉｗａｂｕｃｈｉ）ら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３〜１６９６；およびブレント（Ｂｒｅｎｔ）、国際公開公報第９４／１０３００号を参照のこと）。
【００７７】
ツーハイブリッドアッセイは、ベイトタンパク質として変種Ａドメインを用いて行うことができる。簡単に説明すると、変種ＡドメインをＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインに融合させて、これをベイトとして用いる。プレイ（ｐｒｅｙ）は、Ｎ末端核局在シグナル、ＬｅｘＡ活性化ドメイン、およびエピトープタグとの融合タンパク質としてＴｒｘＡ発現の活性部位ループにクローニングした、アプタマーライブラリである（コラス（Ｃｏｌａｓ）ら、１９９６ Ｎａｔｕｒｅ ３８０：５４８；およびギウリス（Ｇｙｕｒｉｓ）ら、Ｃｅｌｌ １９９３、７５：７９１）。酵母細胞をベイトおよびプレイ遺伝子によって形質転換する。アプタマーが変種Ａドメインに結合すれば、ＬｅｘＡ活性化ドメインは、ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインと近位になり、適切に配置されたＬｅｘＡ結合部位を有する遺伝子の発現が増加する。
【００７８】
この系を調べるために、酵母株ＥＧＹ４８をベイトプラスミドおよびｐＳＨ１８−３４（ＵＲＡ３、その中でＧＡＬ１エンハンサー様の上流活性化配列（ＵＡＳＧ）が、８個のＬｅｘＡ二量体の結合部位に置換されているｌａｃＺに融合したＧＡＬ１プロモーターを含む、２μｍプラスミド）によって形質転換した。酵母株は、２つのレポーター遺伝子、ＬｅｘＡｏｐ−ＬＥＵ２（酵母染色体ＬＥＵ２遺伝子を置換）およびＬｅｘＡｏｐ−ｌａｃＺを２μｍ ＨＩＳ３＋プラスミド上に含む。形質転換細胞をＸ−ｇａｌを含む培地上で播種した。ベイトの存在によって、β−ガラクトシダーゼの発現は引き起こされなかった。形質転換細胞はロイシン欠損プレートにおいて増殖しなかったことから、ベイト自身も同様にＥＧＹ４８においてＬｅｘＡｏｐ−Ｌｅｕ２遺伝子を活性化しなかった。次に、抑制型のアッセイにおいて、ベイトプラスミドおよびｐＪＫ１０１レポーターを用いて、ベイトの核輸送を評価した。このアッセイにおいて、転写的に不活性なＬｅｘＡ融合タンパク質によるＤＮＡ結合を検出することができる。ｐＪＫ１０１レポーターは、ＵＲＡ３、すなわちＵＡＳＧのほとんどを含む２μｍプラスミドである。ＬｅｘＡの高親和性部位は、Ｇａｌ１転写開始とＵＡＳＧとのあいだに存在する。ＣＤ１１ｂＡ−ＬｅｘＡベイトは、ガラクトース培地で増殖させるとｐＪＫ１０１プラスミドを有する酵母のガラクトシダーゼ活性を障害し、このベイトが核に入ることを示している。
【００７９】
アプタマーライブラリをＬｅｕおよびｌａｃＺレポーター含有酵母細胞に導入した。ライブラリタンパク質の合成は、ガラクトース培地において酵母を増殖させることによって誘導した。ベイトに結合する適したプレイが存在しない場合、酵母細胞は、Ｌｅｕ−培地上で増殖せず、β−ガラクトシダーゼ活性を有しない。適したプレイを発現する細胞は、Ｌｅｕ培地上でコロニーを形成して、β−ガラクトシダーゼを有する。選択的ガラクトース（しかし、グルコースではない）誘導性発現によって、ＬｅｕおよびＬａｃＺ表現型を決定的にライブラリタンパク質に帰することができ、その後の分析によって除外しなければならないライブラリプラスミドの数を減少させる。陽性コロニー（すなわち、ガラクトース上で増殖することができるコロニー、Ｕｒａ−、Ｔｒｐ−、Ｈｉｓ−、Ｌｅｕ−プレート）由来のプラスミドを救出した（ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ）ら、１９８７、Ｇｅｎｅ ５７：２６７）。それぞれのクローンの特徴をさらに調べる前に、ベイトとの相互作用の特異性を調べた。これは、無関係または非機能的なベイト（例えばそれぞれ、ＣＤ１１ａ Ａドメイン−ＬｅｘＡおよび１１ｂＡ−Ｄ２４２Ａ−ＬｅｘＡ）、ベイトのＤＮＡ結合ドメイン部分と特異的に、または非特異的にプロモーターもしくは他の転写機構のエレメントと相互作用しないことを示すことによって行われた。ライブラリプラスミドは、ガラクトース依存的Ｌｅｕ＋ｌａｃＺ＋酵母から救出して、当初の選択株および異なるベイトを含む他の株に再度導入した。特異的相互作用物質は、ガラクトース依存的Ｌｅｕ＋およびｌａｃＺ＋表現型を、当初のベイトを含む酵母に付与するが、無関係なベイトを含む酵母には付与しない。相互作用交配アッセイを用いて特異性を調べることができる。簡単に説明すると、プレイを含む株を当初のベイトタンパク質または対照ベイトタンパク質のいずれかを発現する異なる酵母株と交配させる。レポーターは、当初のベイトを含む二倍体でのみ活性となるはずである（フィンレー（Ｆｉｎｌｅｙ）ら、（１９９４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１２９８０）。
【００８０】
本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイによって同定される新規作用物質に関する。したがって、そのような作用物質による処置の有効性、毒性、副作用、または作用機序を決定するために、本発明に記載されるように同定された作用物質（例えば、変種インテグリンポリペプチド調節作用物質）を適当な動物モデルにおいてさらに用いることは本発明の範囲内である。さらに、上記のスクリーニングアッセイによって同定された新規作用物質は、本明細書に記載の治療のために用いることができる。
【００８１】
薬学的組成物
変種インテグリンポリペプチド、その断片と共に本発明の抗変種インテグリンポリペプチド抗体（本明細書において「活性化合物」とも呼ばれる）は、薬学的組成物に組み入れることができる。そのような組成物は、典型的にタンパク質または抗体と薬学的に許容される担体とを含む。本明細書において用いられるように、「薬学的に許容される担体」という句には、薬学的投与に適合性の溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤等が含まれる。補助活性化合物も同様に組成物に組み入れることができる。
【００８２】
薬学的組成物は、その意図する投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例には、非経口、静脈内、皮内、皮下、経口、吸入、経皮、経粘膜、および直腸投与が含まれる。非経口、皮内、または皮下適用のために用いられる溶液または懸濁液には、以下の成分が含まれうる：注射用水、生理食塩液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒のような滅菌希釈剤；ベンジルアルコール、またはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、または燐酸塩のような緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような等張性調節剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基によって調節することができる。非経口調製物は、ガラスもしくはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または多数回投与バイアルに封入することができる。
【００８３】
注射可能な使用に適した薬学的組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散剤、および滅菌注射溶液または分散液の即時調合調製物のための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与の場合、適した担体には、生理食塩液、静菌水、クレモフォアＥＬ（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ；商標）（ＢＡＳＦ、パーシッパニー、ニュージャージー州）または燐酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）が含まれる。全ての場合において、組成物は滅菌でなければならず、容易なシリンジ操作性が存在する程度に流動性でなければならない。組成物は、製造および保存条件で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）を含む溶媒または分散媒体、ならびにその適した混合物となりうる。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコーティングを用いることによって、分散剤の場合には必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって行うことができる。多くの場合、等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールのような多価アルコール、塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましいと考えられる。注射可能組成物は、吸収を遅らせる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによって持続的に吸収させることができる。
【００８４】
滅菌注射用溶液は、先に列挙した成分の一つまたは組み合わせと共に適当な溶媒において活性化合物の必要量を組み入れて、必要であれば濾過滅菌を行うことによって調製することができる。一般的に、分散剤は、基礎分散媒体と先に列挙した必要な他の成分とを含む滅菌溶媒に活性化合物を組み入れることによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、先に濾過滅菌したその溶液から、活性成分プラスさらなる所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥である。
【００８５】
経口組成物には一般的に、不活性希釈剤または食用担体が含まれる。経口治療的投与の目的に関して、活性化合物は賦形剤と共に組み入れて、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤、例えばゼラチンカプセルの形で用いることができる。経口組成物は、マウスウォッシュとして用いられる液体担体を用いて調製することも可能である。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント材料を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤等は、以下の成分または類似の特性を有する化合物のいかなるものも含むことができる：微結晶セルロース、トラガカントゴム、もしくはゼラチンのような結合剤；デンプンもしくは乳糖のような賦形剤；アルギン酸、プリモゲル、もしくはコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはステローテスのような潤滑剤；二酸化珪素コロイドのような滑り剤；蔗糖もしくはサッカリンのような甘味料；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料のような香料。
【００８６】
吸入投与の場合、化合物は、適した噴射剤、例えば、二酸化炭素のようなガス含む加圧容器まもしくディスペンサー、またはネブライザーからエアロゾルスプレーの形で輸送される。
【００８７】
全身投与はまた、経粘膜または経皮手段によっても行うことができる。経粘膜または経皮投与の場合、浸透すべき障壁に対して適当な浸透剤を製剤において用いる。そのような浸透剤は一般的に当技術分野で既知であり、例えば、経粘膜投与に関して、洗浄剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻腔内スプレーまたは坐剤を用いて行うことができる。経皮投与の場合、活性化合物は、当技術分野で一般的に既知のように軟膏剤、軟膏、ゲル、またはクリームに製剤化される。
【００８８】
化合物はまた、直腸輸送のために坐剤（例えば、カカオバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤基剤と共に）または浣腸の形で調製することができる。
【００８９】
一つの態様において、活性化合物は、インプラントおよび微量封入輸送系を含む、徐放性製剤のような、化合物が体から迅速に消失しないようにする担体と共に調製される。エチレン酢酸ビニル、多価無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような生体分解性の生体適合性ポリマーを用いることができる。そのような処方を調製する方法は当業者に明らかである。材料はまた、アルザ社およびノバファーマシューティカルズインクから購入することができる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体によって感染細胞にターゲティングされるリポソームを含む）も同様に薬学的に許容される担体として用いることができる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるように当業者に既知の方法に従って調製することができる。
【００９０】
投与を容易にするため、および投与を均一にするために、単位用量で経口または非経口組成物を処方することが都合がよい。本明細書において用いられる用量型は、各単位が必要な薬学的担体に関連して所望の治療効果を生じるように計算された活性化合物の規定量を含む、処置される被験者に関して単位用量として適している物理的に個別の用量を意味する。
【００９１】
そのような化合物の毒性および治療的有効性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的技法、例えばＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定することによって決定することができる。毒性と治療効果の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表記されうる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を用いてもよいが、非罹患細胞に対する可能性がある損傷を最小限にして、それによって副作用を減少させるために、そのような化合物を罹患組織の部位にターゲティングする輸送系を設計するように注意しなければならない。
【００９２】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトにおいて用いられる幅広い用量を処方するために用いることができる。そのような化合物の用量は好ましくは、ほとんどまたは全く毒性を示さないＥＤ５０を含む循環中の濃度範囲内に存在する。用量は、用いる投与剤形および利用する投与経路に応じてこの範囲内で変動してもよい。本発明の方法において用いられる如何なる化合物に関しても、治療的に有効な用量は、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。用量は、細胞培養において決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半量を得る被験化合物の濃度）を含む循環中の血漿濃度範囲を得るように動物モデルにおいて処方してもよい。そのような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。
【００９３】
本明細書において定義されるように、タンパク質またはポリペプチドの治療的有効量（すなわち、有効量）は、約０．００１〜３０ ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１〜２５ ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１〜２０ ｍｇ／ｋｇ体重、およびさらにより好ましくは約１〜１０ ｍｇ／ｋｇ、２〜９ｍｇ／ｋｇ、３〜８ｍｇ／ｋｇ、４〜７ｍｇ／ｋｇ、または５〜６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。タンパク質またはポリペプチドは、約１〜１０週間のあいだに、好ましくは２〜８週間、より好ましくは３〜７週間、およびさらにより好ましくは約４、５、または６週間のあいだに週１回投与することができる。当業者は、疾患または障害の重症度、これまでの治療、被験者の全身健康および／または年齢、および存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない特定の要因が、被験者を有効に治療するために必要な用量および時期に影響を及ぼす可能性があることを認識すると考えられる。その上、タンパク質、ポリペプチド、または抗体の治療的有効量による被験者の治療には、一回治療が含まれうる、または好ましくは一連の治療が含まれうる。
【００９４】
抗体に関して、好ましい用量は０．１ ｍｇ／ｋｇ体重（一般的に１０ ｍｇ／ｋｇ〜２０ ｍｇ／ｋｇ）である。抗体が脳において作用する場合、５０ ｍｇ／ｋｇ〜１００ ｍｇ／ｋｇの用量が通常適当である。一般的に部分的なヒト抗体および完全なヒト抗体は、他の抗体よりヒトの体内において長い半減期を有する。したがって、より低い用量およびあまり頻繁でない投与がしばしば可能である。脂質付加のような改変を用いて抗体を安定化させ、取り込みおよび組織の浸透（例えば、脳への）を増強することができる。抗体の脂質付加方法は、クルイクシャンクら（Ｃｒｕｉｋｓｈａｎｋ、１９９７、Ｊ． Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ １４：１９３）に記載されている。
【００９５】
本発明は、発現または活性を調節する作用物質を含む。作用物質は例えば低分子であってもよい。例えば、そのような低分子には、ペプチド、ペプチド模倣体（例えば、ペプトイド）、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、１モルあたりの分子量が約１０，０００ ｇ未満の有機または無機化合物（すなわち、ヘテロ有機または有機金属化合物を含む）、１分子あたりの分子量が約５，０００ ｇ未満の有機または無機化合物、１分子あたりの分子量が約１，０００ ｇ未満の有機または無機化合物、１分子あたりの分子量が約５００ ｇ未満の有機または無機化合物、ならびにそのような化合物の塩、エステル、および他の薬学的に許容される型が含まれるがこれらに限定されない。
【００９６】
例としての用量には、被験者または試料重量１ｋｇあたり低分子のミリグラムまたはマイクログラム量が含まれる（例えば、約１μｇ／ｋｇ〜約５００ ｍｇ／ｋｇ、約１００ μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、または約１μｇ／ｋｇ〜約５０ μｇ／ｋｇ）。さらに、低分子の適当な用量は、調節すべき発現または活性に関する低分子の有効性に依存する。これらの低分子の一つまたは複数を、本発明のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節するために、動物（例えば、ヒト）に投与する場合、医師、獣医師、または研究者は、例えば最初に比較的低用量を処方して、その後適当な反応が得られるまで用量を増加させてもよい。さらに、任意の特定の動物被験者の特定の用量レベルも、用いる特定の化合物の活性、被験者の年齢、体重、全身体重、全身健康、性別、および食事、投与時期、投与経路、排泄速度、薬剤併用、および調節すべき発現または活性の程度を含む様々な要因に依存すると理解される。
【００９７】
抗体（またはその断片）は、サイトトキシン、治療作用物質、または放射活性金属イオンのような治療部分に結合してもよい。サイトトキシンまたは細胞毒物質には、細胞にとって有害な任意の作用物質も含まれる。例には、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミスラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンならびにその類似体または相同体が含まれる。治療作用物質には、抗代謝剤（例えば、メソトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、デカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロルエタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミンプラチナ（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（これまでダウノマイシン）、およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（これまでアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミスラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が含まれる。
【００９８】
本発明の結合体は、所定の生物反応を改変するために用いることができ、薬剤部分は、古典的な化学治療物質に限定されると解釈すべきではない。例えば、薬剤部分は、所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。そのようなタンパク質には、例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、ジフテリア毒素、またはサイトカインもしくはインターロイキンのようなタンパク質が含まれてもよいが、これらに限定されない。
【００９９】
または、抗体は、シーガル（Ｓｅｇａｌ）らによって米国特許第４，６７６，９８０号に記載されるように、第二の抗体に結合して抗体のヘテロ結合体を形成することができる。
【０１００】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入して、これを遺伝子治療ベクターとして用いることができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）によって、または定位注射（例えば、チェン（Ｃｈｅｎ）ら（１９９４）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３０５４〜３０５７）によって被験者に輸送することができる。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物には、許容される希釈剤における遺伝子治療ベクターが含まれうる、または遺伝子輸送媒体が抱埋される徐放性マトリクスを含みうる。または、完全な遺伝子輸送ベクターを、組換え型細胞、例えばレトロウイルスベクターから無傷で産生することができる場合、薬学的調製物には、遺伝子輸送系を生じる一つまたは複数の細胞が含まれうる。
【０１０１】
薬学的組成物は、投与のための説明書と共に容器、パック、ディスペンサーに含まれうる。
【０１０２】
インテグリンを含むプロセスの動物モデル
可能性がある治療的組成物を調べるために有用となりうる血管損傷モデルは、サイモン（Ｓｉｍｏｎ）ら（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ２０００ １０５：２９３）によって記述される。タン（Ｔａｎｇ）ら（１９９７、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ １８６：１８５３）は、様々なスクリーニングアッセイにおいて有用となりうるＣＤ１１ｂノックアウトマウスを記述している。火傷の損傷に関する動物モデルも同様に有用となる可能性がある（Ｐｌａｓｔ Ｒｅｃｏｎｓｔｒ Ｓｕｒｇ １９９５、９６：１１７７）。
【０１０３】
治療方法
本発明は、異常または望まないインテグリン発現または活性に関連した障害の危険性をもつ（または感受性がある）か、または障害を有する被験者を治療する、予防的および治療的方法を提供する。
【０１０４】
本明細書において用いられる「治療」または「患者を治療する」とは、疾患、疾患の症状、または疾患に対する素因を治療、治癒、緩和、軽減、変化、治療、改善、和らげる、改善もしくは影響を及ぼす目的で、治療物質を患者に適用もしくは投与すること、または疾患、疾患の症状、もしくは疾患に対する素因を有する患者から単離された組織もしくは細胞株に対する治療物質の適用もしくは投与であると定義される。治療物質には、低分子、ペプチド、抗体、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。
【０１０５】
そのような化合物の毒性および治療的有効性は、細胞培養または実験動物において標準的な薬学的技法によって、例えば、ＬＤ５０（集団における５０％に致死的な用量）、およびＥＤ５０（集団における５０％において治療的に有効な用量）を決定することによって決定することができる。毒性と治療効果の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表記することができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を用いてもよいが、非罹患細胞に対する可能性がある損傷を最小限にして、それによって副作用を減少させるために、そのような化合物を罹患組織の部位にターゲティングする輸送系を設計するように注意しなければならない。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａおよび１Ｂ】ＣＤ１１ｂ Ａドメインの結晶構造の表面の略図をその「閉鎖」（図１Ａ）および「開放」（図１Ｂ）状態で示し、Ｃ末端のα７ヘリックスを灰色のリボンで示し、イソロイシン（Ｉ３３２）残基を黒色で示す。矢印はＭＩＤＡＳ表面を指す。ＭＩＤＡＳおよびＳＩＬＥＮ（イソロイシンのためのソケット）は、Ａドメイン構造のほぼ正反対の末端に存在する。これらの図におけるアミノ酸は成熟タンパク質の番号に基づく番号であることに注意すること。ＣＤ１１ｂαサブユニットはアミノ酸１６個のシグナル配列を有する。このように、未成熟なタンパク質におけるＩ３３２は、成熟タンパク質におけるＩ３１６に対応する。
【図１Ｃおよび図１Ｄ】ＳＩＬＥＮ残基（Ｉ３３２から半径４Åの範囲内に存在するＩ１５１、Ｌ１８０、Ｉ２５２、Ｙ２８３）の拡大表面図を「閉鎖」（図１Ｃ）および「開放」（図１Ｄ）配座で示す。「閉鎖」型（図１Ｃ）では、Ｉ３３２側鎖はＳＩＬＥＮに入り込んでおり、Ｌ３２８は上部に認められる。Ｌ３２８は「開放」構造（図１Ｄ）ではＳＩＬＥＮを覆うように移動する。図１Ａ〜１ＤはＧＲＡＳＰ（バリー・ホニヒ（Ｂａｒｒｙ Ｈｏｎｉｇ）、コロンビア大学、ニューヨーク）を用いて作製した。これらの図におけるアミノ酸は、成熟タンパク質の番号に基づく番号であることに注意すること。ＣＤ１１ｂαサブユニットはアミノ酸１６個のシグナル配列を有する。このように、未成熟なタンパク質におけるＩ３３２は、成熟タンパク質におけるＩ３１６に対応する。
【図１Ｅおよび１Ｆ】「閉鎖」（図１Ｅ）および「開放」（図１Ｆ）配座におけるＩ３３２配位結合ソケットの立体図を示す。ＳＩＬＥＮ残基およびＩ３３２およびＬ３２８に印をつけている。これらの図におけるアミノ酸は、成熟タンパク質の番号に基づいて番号をつけていることに注意すること。ＣＤ１１ｂαサブユニットはアミノ酸１６個のシグナル配列を有する。このように、未成熟なタンパク質におけるＩ３３２は、成熟タンパク質におけるＩ３１６に対応する。
【図２Ａおよび２Ｂ】１１ｂＡ１３９−３３７（図２Ａ）および１１ｂＡ１３９−３３１構造のα７のＣ末端部分の２Ｆ０−Ｆｃ電子密度マップを示す。マップは、１．１σで輪郭を示し、Ｏによって作製する。これらの図におけるアミノ酸は、成熟タンパク質の番号に基づいて番号をつけていることに注意すること。ＣＤ１１ｂαサブユニットはアミノ酸１６個のシグナル配列を有する。このように、未成熟なタンパク質におけるＩ３３２は、成熟タンパク質におけるＩ３１６に対応する。
【図２Ｃおよび２Ｄ】ＣＤ１１ｂ Ａドメインについてそれぞれ報告された「閉鎖」（図２Ｃ）および「開放」（図２Ｄ）型に、１１ｂＡ１３９−３３７（図２Ｃ）および１１ｂＡ１３９−３３１（図２Ｄ）構造を完全に重ね合わせて示す、リボン略図を示す。金属イオンを球として示す。これらの図におけるアミノ酸は、成熟タンパク質の番号に基づいて番号をつけていることに注意すること。ＣＤ１１ｂαサブユニットはアミノ酸１６個のシグナル配列を有する。このように、未成熟なタンパク質におけるＩ３３２は、成熟タンパク質におけるＩ３１６に対応する。
【図２Ｅおよび２Ｆ】ＭＩＤＡＳの立体図を１１ｂＡ１３９−３３７（図２Ｅ）および１１ｂＡ１３９−３３１（図２Ｆ）構造で示す。直接のＤ２５８金属結合、および間接的なＴ２２５−水−金属結合（図２Ｅ）が、「閉鎖」配座の特徴である。この場合の金属イオンは、Ｍｎ２＋である。ＭＩＤＡＳ配座（直接のＴ２２５−金属結合、間接的なＤ２５８−水−金属結合、および緑色で示す活性部位を占有する偽リガンドグルタメート、ならびに直接配位結合する金属イオン（Ｃａ２＋）は、「開放」配座のものである）。これらの図におけるアミノ酸は、成熟タンパク質の番号に基づいて番号をつけていることに注意すること。ＣＤ１１ｂαサブユニットはアミノ酸１６個のシグナル配列を有する。このように、未成熟なタンパク質におけるＩ３３２は、成熟タンパク質におけるＩ３１６に対応する。
【図３Ａ−３Ｊ】１１ｂＡＥ−Ｇ（図３Ａ〜３Ｅ）および１１ｂＡ１３９−３３１（図３Ｆ〜３Ｊ）、ならびに活性化依存的リガンドｉＣ３ｂ（図３Ａおよび３Ｆ）、フィブリノーゲン（図３Ｂおよび３Ｇ）、またはＣＤ５４（図３Ｃおよび３Ｈ）との相互作用を記録するために、ビアコア（商標）を用いた１１ｂＡＥ−Ｇおよび１１ｂＡ１３９−３３１Ａドメインの機能的分析の結果を示す。三つのリガンド全てが１１ｂＡ１３９−３３１に結合したが、１１ｂＡ１３９−３３７には結合しなかった。活性化非依存的リガンド、ＮＩＦ（図３Ｄおよび３Ｉ）、ならびにｍＡｂ ９０４に対する結合が同等であったことから、認められた結合の差はタンパク質濃度の差が原因ではなかった。親和性を定量的に決定するために、Ａドメインペプチドの様々な濃度を用いた。結合データは、一次変換によって分析し、解離定数（Ｋｄ、平均値±ＳＤ、ｎ＝２）０．４６±０．１５ μＭ（ｉＣ３ｂに関して）、０．２５±０．０７ μＭ（フィブリノーゲンに関して）、および０．２２±０．０４ μＭ（ＣＤ５４に関して）を得た。
【図４Ａ】１１ｂＡＩ → ＧのｉＣ３ｂに対する結合の分析結果を示す。破線は同じリガンドに対する１１ｂＡ１３９−３３７の結合が存在しないことを表す。計算されたＫｄは０．６６±０．３ μＭ（平均値±ＳＤ、ｎ＝２）である。
【図４Ｂ】野生型受容体と比較して、ＣＯＳ細胞上に発現された１−ＧＣＲ３のｉＣ３ｂに対する相対的結合を示すヒストグラム（平均値±ＳＤ、ｎ＝３）を示す。
【図５】９個のαインテグリンαサブユニット（ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤ１１ａ、α１、α２、α１０、α１１、およびαＥ）のＡドメインのアラインメントを示す。このアラインメントにおいて、不変のＩｌｅ（ＣＤ１１ｂαサブユニットにおけるＩ３３２）を矢印で示す。
【図６】ＣＤ１１ａ Ａドメインにおける不変のイソロイシンのＩからＧへの変異が、このインテグリンにおいて活性化ドメインを誘導することを示し、ＣＤ１１ｂ Ａドメインにおけるこの知見を他のインテグリンＡドメインに適用可能であることを強調する。
【図７】８個のインテグリンβサブユニットのＡ様ドメインのアラインメントである。このアラインメントにおいて、βサブユニットにおける不変のＩｌｅに対応する残基を矢印で示す。
関連出願の情報
本出願は、その内容が参照として本明細書に組み入れられる、２０００年７月３１日に提出された仮出願第６０／２２１，９５０号、および２００１年１月１１日に提出された米国特許出願第０９／７５８，４９３号からの優先権を主張する。
【０００２】
背景
インテグリンは、リガンドの結合によって細胞間の、および細胞と細胞外マトリクスとの双方の多様な重要な相互作用を媒介するヘテロダイマー受容体である。全てのインテグリンはαサブユニットとβサブユニットとを有する。αサブユニット内において、Ａドメイン（またはＩドメイン）と呼ばれる領域は、リガンド結合の重要なメディエータであることが知られている。類似の領域、Ａ様ドメインが多くのβサブユニットに存在する。多くのインテグリンは二つの配座、すなわち低親和性状態（「閉鎖（ｃｌｏｓｅｄ）」または「非リガンド結合（ｕｎｌｉｇａｎｄｅｄ）」配座）と高親和性状態（「開放（ｏｐｅｎ）」、または「リガンド結合（ｌｉｇａｎｄｅｄ）」配座）で存在すると考えられており、後者が高親和性リガンド結合に関与している。
【０００３】
インテグリンは、細胞の生理活性（例えば、運動性、増殖、および分化）に及ぼすマトリクスの作用を媒介するシグナルを伝達する。その上、インテグリンは、炎症ならびに腫瘍発生的な細胞の形質転換、転移、およびアポトーシスにおいて役割を有する。このように、一つまたは複数のインテグリンを活性化またはその活性を阻害することができる化合物を同定することにかなりの関心が集まっている。
【０００４】
有効なインテグリン−リガンド結合が起こるためには、インテグリンは、その高親和性配座でなければならないと考えられる。細胞が、多様な刺激によって活性化される場合に産生される内側から外へのシグナルが、インテグリンを低親和性状態から高親和性へと切り替えるように思われる。この機能的上方制御は、αサブユニットのＡドメインおよびβサブユニットのＡ様ドメインが含まれるインテグリンの細胞外領域における配座の変化に関連している（スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、１９８８、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：１８７２６）。
【０００５】
インテグリンＡドメインは、その上部に金属イオン依存的接着部位（ＭＩＤＡＳ）を有するジヌクレオチド結合のひだの形状を示し（リー（Ｌｅｅ）ら、１９９５、Ｃｅｌｌ ８０：６３１；エムスレイ（Ｅｍｓｌｅｙ）ら、１９９７、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：２８５１２；リ（Ｌｉ）ら、１９９８、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４３：１５２３；ノルト（Ｎｏｌｔｅ）ら、１９９９、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４５２：３７９；およびレッジェ（Ｌｅｇｇｅ）ら、２０００、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９５：１２５１）、これはその底部でＣ末端のα７ヘリックスによってインテグリンの本体に結合している。ＭＩＤＡＳおよびその周辺の露出した側鎖は、生理的リガンド（リ（Ｌｉ）ら、上記；ミチシタ（Ｍｉｃｈｉｓｈｉｔａ）ら、Ｃｅｌｌ ７２：８５７〜８６７、１９９３；カマタ（Ｋａｍａｔａ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：２６００６〜２６０１０、１９９４；ケルン（Ｋｅｒｎ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：２２８１１〜６、１９９４；エドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：２８９３７〜４４、１９９８；ザング（Ｚｈａｎｇ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：８０６４〜７１、１９９９）および特定のアンタゴニスト（リウ（Ｒｉｅｕ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：１５８５８〜１５８６１、１９９６）の結合部位を形成する。「開放」配座の場合、タンパク質における三つの非荷電残基は、ＭＩＤＡＳにおける金属イオンに直接配位結合する。偽リガンドまたはリガンドグルタメート残基（リー（Ｌｅｅ）ら、上記；リ（Ｌｉ）ら、上記；エムスレイ（Ｅｍｓｌｅｙ）ら、Ｃｅｌｌ １００：４７〜５６、２０００）が、金属の配位結合を完成させる。「閉鎖」型では、両親媒性Ｃ末端のα７ヘリックスが「開放」型と比較して１０ Å上方に移動しており、ドメインの残りを取り巻いている。この大きな移動は金属配位結合の変化に関連しており、この場合、三つの配位結合残基の一つであるトレオニンがアスパラギン酸塩に置換され、金属イオン配位結合の球を完成させるために水分子がグルタミン酸塩をの代わりに存在する（リー（Ｌｅｅ）ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３：１３３３〜１３４０、１９９５）。金属配位結合のこれらの変化およびＭＩＤＡＳの位相学は、構造的に相同なＧタンパク質において記述されるものと類似である（リー（Ｌｅｅ）ら、上記）。
【０００６】
四つのインテグリンＡドメイン（ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ａ、ＣＤ４９ａ、およびＣＤ４９ｂ）の結晶構造が現在までに報告されている（リー（Ｌｅｅ）ら、Ｃｅｌｌ ８０：６３１、１９９５；リー（Ｌｅｅ）ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３：１３３３、１９９５；エムスレイ（Ｅｍｓｌｅｙ）ら、上記；リ（Ｌｉ）ら、上記；エムスレイ（Ｅｍｓｌｅｙ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：２８５１２、１９９７）。インテグリンＣＤ１１ｂ Ａドメイン（１１ｂＡ）の例外を除き、全てが、「閉鎖」型のみで存在することから、「開放」型は有益でない結晶アーチファクトであることが示唆された（ボルディン（Ｂａｌｄｗｉｎ）ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６：９２３〜９３５、１９９８）。インテグリン−Ａドメインの「開放」型が「高」親和性状態と等しいという考え方は、三つの研究によって支持されている（リ（Ｌｉ）ら、１９９８、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４３：１５２３；リウ（Ｒｉｅｕ）ら、上記；オクスビグ（Ｏｘｖｉｇ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：２２１５〜２０、１９９９）。第一の研究において、「閉鎖」構造を脱安定化させ、構造の基礎において予想されるＣＤ１１ｂＡの点突然変異によって、溶液中の「高親和性」型の比率が増加した（リ（Ｌｉ）ら、１９９８、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４３：１５２３）。第二の研究において、「活性化依存的」モノクローナル抗体の結合部位は、Ａドメインの配座感受性領域にマッピングされた（オクスビグ（Ｏｘｖｉｇ）ら、上記）。第三の研究によって、短いコラーゲンペプチドとの複合体においてＡドメインが「開放」配座の形をとることが示され、このことは「開放」型がリガンドの存在下に限って得られうることを示唆した（エムスレイ（Ｅｍｓｌｅｙ）ら、上記）。リガンドがインテグリンの配座の変化を引き起こすことが示唆されているが、インテグリンがリガンドの非存在下においても高親和性状態で存在しうることが、少なくとも一つの研究によって示唆されている（スミスおよびチェレシュ（ＳｍｉｔｈおよびＣｈｅｒｅｓｈ）、１９８８、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：１８７２６〜３１）。さらにいくつかの研究によって、ヘテロダイマーインテグリンにおけるリガンド結合親和性をアロステリックに変化させうることが示唆された（リ（Ｌｉ）ら、１９９８、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４３：１５２３；エドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：２８９３７〜２８９４４、１９８８；カルダーウッド（Ｃａｌｄｅｒｗｏｏｄ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：５６２５、１９８８；ザング（Ｚｈａｎｇ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：２９９５３〜７、１９９６）。
【０００７】
概要
本発明は、変種インテグリンαサブユニットＡドメインまたは変種インテグリンβサブユニットＡ様ドメインの、全てまたは一部を含むポリペプチドを特徴とする。変種インテグリンポリペプチドと呼ばれる本発明のポリペプチドでは、重要なイソロイシン（Ｉｌｅ）残基（下記により詳細に記述）が存在しない。イソロイシンは、欠失させるか、または異なるアミノ酸残基、好ましくはより小さいもしくはより疎水性が低いアミノ酸残基、例えばアラニンまたはグリシンに置換することができる。本発明の変種インテグリンポリペプチドは、溶液中において高親和性配座で存在する傾向があるため、それらはインテグリンに結合する（および／またはその活性を調節する）分子を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて有用である。それらはまた、インテグリンの高親和性型に選択的に結合する抗体、例えば、モノクローナル抗体を作製するためにも有用である。そのような抗体のいくつかは、低親和性配座で存在するインテグリンには存在しないか、またはそのようなインテグリンでは近づくことができないエピトープを認識する。このように、本発明は、対応する野生型インテグリンより大きな親和性により、本発明の変種インテグリンに結合する抗体を特徴とする。本発明の変種インテグリンポリペプチドは、任意のインテグリンαサブユニットまたは任意のインテグリンβサブユニットにも由来しうる。変種インテグリンポリペプチドには、好ましくは、ＡドメインまたはＡ様ドメインのリガンド結合部分が含まれる。
【０００８】
本発明はまた、本発明の変種インテグリンポリペプチドに結合する化合物を同定する方法を特徴とする。そのようなスクリーニング方法は、関係する被験化合物にポリペプチドを曝露すること、および化合物がポリペプチドに結合するか否かを決定することを含みうる。このように、アッセイは、単純な結合アッセイ（例えば、化合物の結合をリガンドの非存在下に限って測定する）、または競合的結合アッセイ（例えば、化合物の結合をリガンドの存在下で測定する）となりうる。本発明はまた、被験化合物の存在下および非存在下で変種インテグリンポリペプチドに対するインテグリンリガンドの結合を測定することによって、インテグリンに対するインテグリンリガンドの結合を妨害する化合物を同定する方法を特徴とする。また、被験化合物がインテグリンに対するインテグリンリガンドの結合を妨害できるか否を試験してもよい。さらに、被験化合物の存在下および非存在下で、第二のインテグリンに対するインテグリンリガンドの結合を測定することによって（またはインテグリンに対する第二のリガンドの結合を測定することによって）、化合物の結合特異性を評価することができる。
【０００９】
本発明はまた、本発明の変種インテグリンポリペプチド、または本発明の変種インテグリンポリペプチドに選択的に結合する抗体を投与することによって、インテグリンリガンドに対するインテグリンの結合を妨害する方法を特徴とする。
【００１０】
本発明はまた、活性なインテグリンに結合するリガンドの有無を同定する目的で、本発明の変種インテグリンポリペプチド、または本発明の変種インテグリンポリペプチドに選択的に結合する抗体を投与する方法を特徴とする。そのようなアッセイは、炎症、例えば潜在性の炎症（例えば、膿瘍、または活性なアテローム性動脈硬化症の病変）を診断するために有用である。
【００１１】
本発明の変種ＡドメインまたはＡ様ドメインに結合する化合物（例えば、活性な配座のＡ様ドメインのＡドメインに比較的選択的に結合する化合物）は、インテグリンによって媒介される炎症障害、例えばＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ａ、またはＣＤ１１ｃによって媒介される障害を治療するための候補化合物である。
【００１２】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドまたは本発明のポリペプチドを含むポリペプチドをコードする核酸分子（例えば、ｍＲＮＡおよびＤＮＡ）を特徴とする。本発明にはまた、本発明のポリペプチドおよび第二のポリペプチド、例えば、免疫グロブリン定常ドメインを含む、融合ポリペプチドをコードする核酸分子も含まれる。
【００１３】
下記の実験は、ＣＤ１１ｂの野生型より活性の高いＣＤ１１ｂの変種型（インテグリンαサブユニット）の設計および調製に関する。いかなる特定の理論にも拘束されないが、溶液中では、開放（活性な）配座であるこの変種サブユニットの分画がサブユニットの対応する野生型より大きいように思われる。
【００１４】
変種ＣＤ１１ｂの作製は、非可逆的なＩｌｅ残基の欠失または置換を含む。Ｉｌｅ残基の欠失または置換は、無傷のＣＤ１１ｂインテグリンのみならず単離されたＣＤ１１ｂ Ａドメインにおいて高親和性表現型を付与する。その上、Ｉｌｅ改変Ａドメインは、「開放」配座で結晶化することができる。このように、いかなる特定の理論にも拘束されることなく、Ｉｌｅに基づくアロステリックスイッチは、インテグリンＡドメインの親和性および配座を制御するように思われる。したがって、対応する高度に保存されたＩｌｅ残基を欠失または置換することによって、他のインテグリンαサブユニット（およびβサブユニット）の変種、すなわち高親和性型を作製することができる。
【００１５】
本発明の一つまたは複数の態様の詳細は、添付の図面および下記の説明に記述する。本発明のその他の特徴、目的、および長所は、説明と図面、および特許請求の範囲から明らかであると考えられる。
【００１６】
詳細な説明
実施例 １ ：欠失による安定な高親和性 ＣＤ１１ｂ 変種 Ａ ドメインの作製
ＣＤ１１ｂのアミノ酸Ｅ１３９〜Ｋ３３１からなる変種ＣＤ１１ｂ Ａドメイン（１１ｂＡ１３９−３３１、１１ｂＡＥ−Ｋとも呼ぶ）を作製した。（ＣＤ１１ｂαドメインに関するアミノ酸の番号付けは、アミノ酸１６個のシグナル配列を含む未成熟タンパク質の番号であることに注意すること）。この変種Ａドメインの特徴を調べて、アミノ酸Ｅ１３９〜Ｇ３３７からなるＣＤ１１ｂ Ａドメイン（１１ｂＡ１３９−３３７、１１ｂＡＥ−Ｇとも呼ぶ）に対して比較した。残基３３２位でイソロイシンがグリシンに変化している変種Ａドメイン（１１ｂＡＩ → Ｇ）も同様に作製した。三つ全てのタンパク質をＧＳＴ融合タンパク質として発現させて、これを切断すると関係するタンパク質が放出された。
【００１７】
変種ポリペプチドは、標準的な組換え型技術を用いて作製した。制限および改変酵素は、ニューイングランドバイオラブスインク（ビバリー、マサチューセッツ州）、ベーリンガーマンハイム社（ドイツ）、またはギブコＢＲＬ社（ガイサースバード、メリーランド州）から購入した。部位特異的変異誘発を、記述されるように（リウ（Ｒｉｅｕ）ら、１９９６、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：１５８５８）ｐＧＥＸ−４Ｔ−１ベクターにおいて行った。以下の変異誘発プライマーを用いた。
【００１８】
１１ｂＡ１３９−３３７および１１ｂＡ１３９−３３１の構造は、ｘ線結晶学によって決定した。結晶は、１０ ｍｇ／ｍｌ保存タンパク質溶液、およびリら（Ｌｉ、１９９８、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４３：１５２３）に記載されるように懸滴蒸気拡散法を用いて成長させた。それぞれのＡドメインに関していくつかの結晶条件を試みた。１１ｂＡ１３９−３３１および１１ｂＡＩ → Ｇは、１５％ポリエチレングリコール８Ｋ、０．１０ Ｍトリス、ｐＨ ８．２、１５０ ｍＭ ＣａＣｌ２を含むリザーバー溶液の存在下で室温で結晶を形成した。結晶は一週間以内に形成し始め、二週間で典型的な大きさ０．３ ｍｍ×０．０５ ｍｍ×０．０４ ｍｍに成長して、正方晶系空間群Ｐ４に属し、単位格子はａ＝ｂ＝４５．７Åであった。１１ｂＡ１３９−３３７はこれらの条件では結晶化しなかったが、１０％ポリエチレングリコール４０００、０．１ Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ ４．５、５ｍＭ ＭｎＣｌ２をリザーバー緩衝液に用いると室温で結晶を形成した。１１ｂＡ１３９−３３７は、Ｐ２１２１２１空間群で結晶化して、単位格子はａ＝４８．１Å、ｂ＝１２１．５Å、ｃ＝７４．５Åであった。
【００１９】
１１ｂＡ１３９−３３７単結晶は、１００ Ｋで、ブルックヘイブン国立研究所で国立シンクロトロン光源の光線Ｘ１２Ｂ上でＣＣＤ検出器を用いて２．３Å分解能データセットを収集するために用いた。１１ｂＡ１３９−３３７単結晶は、施設内Ｘ−線を用いて造影板上に１００ Ｋで２．６Å分解能データを収集するために用いた。データはＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥＰＡＣＫによってそれぞれ処理して、Ｒｓｙｍ ８．８％、７．７％を得た。開始モデルはそれぞれ、残基Ｄ１４８〜Ｋ３３１を含む精密化１．８ÅＭｇ２＋構造（ｐｄｂアクセッションコードｌｉｄｏ）（リー（Ｌｅｅ）、１９９５、Ｃｅｌｌ ８０：６３１）、および残基Ｄ１４８〜Ａ３２４を含む精密化２．０ÅＭｇ２＋構造（ｐｄｂアクセッションコード１ｊｌｍ）（リー（Ｌｅｅ）ら、１９９８、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６：９２３）であり、それぞれ金属および水分子を除去した。予備的な剛体精密化は、Ｘ−ｐｌｏｒを用いて行い、回折データは、Ｒフリー計算の場合５％反射で８．０〜３．０Å分解能の範囲であった。位相を徐々に高分解能にして、構造は、ねじれ角の動力学と個々の拘束等方性Ｂ因子精密化プロトコールとを交互に数サイクル行うことによって精密化して、全ての回折データが１１ｂＡ１３９−３３７および１１ｂＡ１３９−３２１構造に関してそれぞれ、分解能８．０〜２．６Å、８．０〜２．３Åとなった（表１）。モデルの点検および手動での調節は、ＳＧＩグラフィックスワークステーション上でＯ（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、１９９１、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ４７：１１０）を用いて行った。溶媒分子の添加は、差分マップにおける適したピーク、妥当な水素結合、および５０Å２未満の精密化温度因子に基づいた。構造は１１ｂＡ１３９−３２１構造に関して最終的なＲ因子が２０．３％（Ｒフリー：２５．６％）、および１１ｂＡ１３９−３３７構造に関して２１．９％（Ｒフリー：３０．０％）となるように精密化した。最終モデルは１１ｂＡ１３９−３３１に関して、残基Ｄ１４８〜Ｋ３３１の全ての非水素原子、水分子３０個、およびＣａ２＋イオン１個、１１ｂＡ１３９−３３７に関して残基Ｄ１４８〜Ｇ３３７、水分子４４個、およびＭｎ２＋イオン１個を含む。結晶学的データを表１に示す。
【００２０】
【表１】
§ ｛｝内の数値は最高の０．１Å解像ビンを示す。
† Ｒ因子＝Σ｜Ｆｏ−Ｆｃ｜ΣＦｏ
‡ Ｒフリー＝ΣＴ｜Ｆｏ−Ｆｃ｜ΣＴ Ｆｏ、式中、Ｔは精密化から省略された反射のうちの、無作為に選択した５％を含む試験セットである。
【００２１】
結晶構造１１ｂＡ１３９−３３７は、「閉鎖」配座の結晶構造であった（図２Ａ、２Ｃ、および２Ｅ）。対照的に１１ｂＡ１３９−３３１は、「開放」型で結晶化した（図２Ｂ、２Ｄ、および２Ｆ）。
【００２２】
ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）（ＢＩＡｃｏｒｅＡＢ、アップサラ、スウェーデン）上で既に記述されている（リ（Ｌｉ）ら、上記）表面プラズモン共鳴を用いて、１１ｂＡ１３９−３３７および１１ｂＡ１３９−３３１のリガンド結合特性を決定した。ＩＣ３ｂ、フィブリノーゲン、またはＣＤ５４はそれぞれ、異なるＣＭ５センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅＡＢ）のデキストランマトリクスに１級アミン基を通して共有結合によって結合した。同じように固定したＢＳＡを対照表面として用いた。１１ｂＡ１３９−３３７、１１ｂＡ１３９−３３１、および１１ｂＡＩ−ＧＡドメインは、異なる時間に５ｍｌ／分でチップ上を流れた。２ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．００５％Ｐ２０（ＢＩＡｃｏｒｅＡＢ）を含むＴＢＳ（２０ ｍＭトリス塩酸、ｐＨ ８．０、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ）を実施緩衝液として用いた。１Ｍ ＮａＣｌの２０ ｍＭトリス塩酸緩衝液溶液、ｐＨ ８．０を用いて結合タンパク質を除去して表面を再生した。結合は時間の関数として測定した。結合データ（ＢＳＡコーティングチップに対するバックグラウンドの結合を差し引いた後）は既に記述されているように（ダルアクア（Ｄａｌｌ’Ａｑｕａ）ら、１９９６、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：９６６７〜９６７６）スキャッチャードプロットを用いて分析した。〜７０％コンフルエンスのＣＯＳ Ｍ７サル線維芽細胞に、記載されているように（ミチシタ（Ｍｉｃｈｉｓｈｉｔａ）ら、上記）ＷＴまたはＣＤ１１ｂＩ → ＧをコードするスーパーコイルｃＤＮＡを完全長のＣＤ１８と共にトランスフェクトした。
【００２３】
トランスフェクトしたＣＯＳ細胞を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、５０ ＩＵ／ｍｌペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したイスコブ改変ダルベッコ培地（バイオウィッタッカーインク、ウォーカーズビル、メリーランド州）において３７℃で２４時間増殖させた。細胞を洗浄して、０．１％トリプシン−ＥＤＴＡによって剥離させ、２４もしくは４８ウェルプレート（コスター社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）、または１００ ｍｍペトリ皿に同じものを播種して２４時間培養した。２４または４８ウェルプレートにおけるコンフルエント単層を細胞表面抗原定量のために用い、ペトリ皿で培養した細胞を免疫沈降試験に用いた。ヘテロダイマー形成および野生型およびＣＲ３Ｉ → Ｇハロ受容体に対するｉＣ３ｂコーティング赤血球の結合は、記載通りに実施した（リウ（Ｒｉｅｕ）ら、１９９６、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：１５８５８）。ハロ受容体に対するｉＣ３ｂの特異的結合は、偽トランスフェクトＣＯＳ細胞に対するバックグラウンド結合を差し引くことによって得た。ＣＲ３Ｉ → Ｇに対する結合は、ｍＡｂ９０４の結合を用いて表面発現の程度を修正した後、野生型に対する結合の百分率として表記した（リウ（Ｒｉｅｕ）ら、１９９６、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：１５８５８）。
【００２４】
図３Ａ〜３Ｊに示すように、１１ｂＡ１３９−３３７は、活性化依存的「生理的」リガンド、補体ｉＣ３ｂ、フィブリノーゲン、およびＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）に対する結合を示さなかった。対照的に、１１ｂＡ１３９−３３１は、３つ全てのリガンドに対する高親和性結合を示した（図３Ａ〜３Ｊ）。双方のドメインは、活性化非依存的「リガンド」ＮＩＦ（好中球阻止因子）（図３Ｄおよび３Ｉ）、ならびにｍＡｂ９０４（図３Ｅおよび３Ｊ）に対して等しく十分に結合し、認められた差がＡドメイン濃度の変化によって引き起こされたものではないことを示した。これらのデータは、「開放」および「閉鎖」結晶構造がインテグリン１１ｂＡの「高」および「低」親和性状態にそれぞれ対応することを決定的に確立する。
【００２５】
実施例 ２ ：置換による安定な高親和性状態 ＣＤ１１ｂ 変種の作製
Ｉｌｅ３３２は、現在までクローニングされた全てのインテグリンαＡドメインにおいて不変である（図５）。イソロイシンからグリシンへの置換を有するＡドメイン（１１ｂＡＩ → Ｇ）は、「高親和性」状態を示した（図４Ａ）。ハロ受容体に同じ置換を作製すると、そのリガンド結合活性は劇的に増加した（図４Ｂ）。結晶構造１１ｂＡＩ → Ｇは、「開放」１１ｂＡ１３９−３３１型の結晶構造と同一であった。これらのデータは、「開放」高親和性配座が、ドメインに固有のイソロイシンに基づくスイッチによって主に指示され、ＭＩＤＡＳ面上のリガンド結合親和性をアロステリックに調節するように作用することを確固として確証する。インテグリンの不活性な活性配座異性体がリガンドの非存在下で存在することは既知である（スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、上記；ヤン（Ｙａｎ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：７２４９〜６０、２０００）。上記の結果に基づいて、リガンドの役割は、最近提唱されているように（エムセリー（Ｅｍｓｅｌｙ）ら、上記）、高親和性状態を開始することではなく、低親和性と高親和性状態との平衡が後者に都合がよいように移動することによって高親和性状態を安定化することであるように思われる（リ（Ｌｉ）ら、上記）。内側から外側へのシグナル伝達によってインテグリンが活性化されると、この平衡が移動して、リガンドの結合に関して「利用可能」になる細胞表面上の高親和性受容体の比率が増加すると考えられる。次に、リガンドが結合すると、おそらくＡドメインに対して外因性であって、外側から内側へのシグナル伝達を開始させる新しいエピトープを形成すると考えられる。
【００２６】
保存された疎水性分子内ソケット（ＳＩＬＥＮ、イソロイシン用ソケット；Ｓｏｃｋｅｔ ｆｏｒ Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）は、「閉鎖」配座におけるＩ３３２のフィンガーを固定し；「開放」構造においてＩ３３２がＬ３２８に置換される（図１Ａおよび１Ｆ）。ＳＩＬＥＮは、「閉鎖」および「開放」配座の双方においてＩ１５１、Ｌ１８０、Ｉ２５２、およびＹ２８３の疎水性側鎖によって形成される（図１Ｃおよび１Ｄ）。いくつかのインテグリンにおいて、外側のＭＩＤＡＳに存在する特定の変異は、ハロ受容体において機能獲得作用を生じ、アロステリックに作用すると考えられている（ザング（Ｚｈａｎｇ）ら、上記；オクスビッヒ（Ｏｘｖｉｇ）ら、上記；ザング（Ｚｈａｎｇ）ら、上記）。これらの試験は、ハロ受容体において行われており、可能性があるドメイン内相互作用および／または他の第四の作用のために、機構の解釈を提供することが難しい。これらの変異は、ＳＩＬＥＮにおいて、またはその周辺で起こる。例えば、ＣＤ１１ｂのα１−βＢループをＣＤ１１ａに置換すると、構成的に活性なインテグリンを生じる（ザング（Ｚｈａｎｇ）ら、上記）。この領域はＳＩＬＥＮ残基Ｌ１８０の一つに及ぶ。インテグリンの活性化も同様に、Ｌ１８０−Ｆ置換（オクスビッヒ（Ｏｘｖｉｇ）ら、上記）において起こり、これはＳＩＬＥＮを予測可能により小さくして、したがって、Ｉ３３２により適応しにくくなる。Ｅ１４７、Ｄ１４８、Ｋ２４７、およびＦ２５０を含む他の活性化変異は、ＳＩＬＥＮの非常に近位の構造の底部に存在し（オクスビッヒ（Ｏｘｖｉｇ）ら、上記）、このように、ＳＩＬＥＮにおいてＩｌｅの「フィンガー」の適切な配座結合を妨害することによってその作用を発揮する可能性がある。ＭＩＤＡＳの反対側上のエピトープによる特定のｍＡｂ（例えば、ｍＡｂ ４４ａ、そのエピトープがＳＩＬＥＮの上部の残基に及ぶ）の阻害作用は、同様に、ＳＩＬＥＮポケットの安定化を通して説明される可能性がある。
【００２７】
Ｎ末端伸張が存在すると、あまり好ましくない高親和性状態へのＡドメインの切り替えが促進される（リ（Ｌｉ）ら、上記）。由来する３−Ｄ構造にはＮ末端伸長部におけるいずれの残基も含まれないことから、この作用の基礎となる構造の基礎は不明である。しかし、この伸長部内の残基がＡドメインにおけるリガンド結合を調節することが認められた。最初に、ｖＷＦ Ａ１ドメインのこのセグメントにおける天然に存在する点突然変異は、野生型ＩＩＢ型ｖＷｆ疾患を有する患者において機能獲得表現型を引き起こす（マツシタ（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７９：１３４０６〜１４、１９９５）。この領域はまたＣＤ１１ｂ Ａドメインにおいて活性化変異を含む（オクスビッヒ（Ｏｘｖｉｇ）ら、上記）。第三に、Ｎ末端の伸長部からの合成ペプチドは、ＣＤ１１ａ−依存的接着を阻害した。ＣＤ４９ｂ Ａドメインからの構造データも同様に、α７ヘリックスを超えて伸張する三つの残基を、Ｎ末端伸長部における残基によってその一部が形成されたくびれた部分に充填することができ、ＮおよびＣ末端を非常に近位に存在させることを示している（エムスレイ（Ｅｍｓｌｅｙ）ら、上記）。α７におけるＣ末端残基の柔軟性も同様に、ＣＤ１１ａ Ａドメインの結晶およびＮＭＲ構造において認められている。併せて考慮すると、これらのデータは、Ｎ末端伸長部がＳＩＬＥＮからイソロイシンを離すように誘導するための不完全な「競合的」表面による代用物を提供し、いくつかの分子を「開放」型で存在させる可能性があることを示唆している。本発明のデータは、そのような機構がハロ受容体において機能する可能性があることを示唆し、内側から外側へのシグナルによってインテグリンが活性化する機構の基礎を提供する。
【００２８】
変種インテグリンポリペプチド
インテグリンαサブユニットにおける配列類似性を考慮して、ＣＤ１１ｂのＩｌｅ３３２に対応する選択されたインテグリンαサブユニットにおけるＩｌｅの置換の欠失によって、サブユニットの野生型より活性な（すなわち、溶液中で、リガンド結合型ポリペプチドの比率がより高くなる）変種インテグリンαサブユニットが形成されるはずである。図５は、９個のインテグリンαサブユニット（ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤ１１ａ、α１、α２、α１０、α１１、およびαＥ）のＡドメインのＣ末端α７ヘリックスのアラインメントを示す。このアラインメントにおいて、他のインテグリンαサブユニットにおけるＣＤ１１ｂのＩｌｅ３３２に対応する不変のＩｌｅを概説する（矢印）。不変のＩｌｅをアラニンもしくはグリシンまたは他のいくつかの適したアミノ酸に置換すると、活性が増加した変種インテグリンポリペプチドが得られるはずである。われわれは、ＣＤ１１ａ Ａドメインにおいてもこれが当てはまることを示した（図６）。ＩｌｅからＧｌｙへの置換を含む変種ＣＤ１１ａ Ａドメインは、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて活性化依存的リガンドＩＣＡＭ−１に対する結合を示す。この置換がない野生型タンパク質には結合が認められなかった。または、不変のＩｌｅと不変のＩｌｅに対してＣ末端の全てのアミノ酸残基を含むインテグリンαサブユニット（またはＡドメイン）の一部を欠失させることができる。表２は、図５において示したインテグリンαサブユニットのそれぞれにおける不変のＩｌｅの位置の一覧を示す。
【００２９】
【表２】
本発明は、不変のＩｌｅ（表２に記載）がＧｌｙ、ＡｌａまたはＩｌｅ以外のいくつかのアミノ酸（例えば、Ｖａｌ）に置換されている変種インテグリンαサブユニットを特徴とする。ポリペプチドは、表示のＡドメインの一部または全て、例えば、不変のＩｌｅの位置を含むＡドメインの１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００連続アミノ酸を含みうる。本発明には、Ｉｌｅが欠失している変種インテグリンαサブユニットも含まれる。同様に、不変Ｉｌｅを除くインテグリンαの完全なＡドメインを含むポリペプチド（例えば、ＣＤ１１ｂのアミノ酸１４４〜１３２位、ＣＤ１１ｃのアミノ酸１４５〜３３２位、ＣＤ１１ｄのアミノ酸１４４〜３３１位、ＣＤ１１ａのアミノ酸１５０〜３３０位）も本発明に含まれるが、インテグリンαサブユニットの残りの部分は含まれない。本発明はまた、不変のＩｌｅまでを含むが不変のＩｌｅを含まず、さらに不変のＩｌｅ以降のアミノ酸５個を欠失するインテグリンαサブニットのＡドメインを含むポリペプチド（例えば、ＣＤ１１ｂのアミノ酸１４４〜３３１位、しかし３３２〜３３６位は含まない；ＣＤ１１ｃのアミノ酸１４５〜３３２位、しかし３３３〜３３７位は含まない；ＣＤ１１ｄのアミノ酸１４４〜３３１位、しかし、３３２〜３３６位は含まない；ＣＤ１１ａのアミノ酸１５０〜３３０位、しかし３３１〜３３５位は含まない；ヒトα１のアミノ酸１３９〜３３０位、しかし３３１〜３３５位は含まない；ヒトα２のアミノ酸１６９〜３６０位、しかし３６１〜３３５位は含まない；ヒトα１０のアミノ酸５７〜２４８位、しかし２４９〜２５３位は含まない；ヒトα１１のアミノ酸１５９〜３４８位、しかし、３４９〜３５３位は含まない；またはヒトαＥのアミノ酸１９６〜３８４位、しかし３８５〜３８９位は含まない）も特徴とする。
【００３１】
ＣＤ１１ｂαサブユニットのＩｌｅ３３２に対応するＩｌｅの変化（置換または欠失）を、一つまたは複数の他の活性化変異、例えば、Ｌ１８０−Ｆ置換またはＥ１４７、Ｄ１４８、Ｋ２４７、もしくはＦ２５０での変異と組み合わせた変種インテグリンも同様に本発明に含まれる。
【００３２】
インテグリンβサブユニットのＡ様ドメインにおける配列類似性を考慮すると、ＣＤ１１ｂのＩｌｅ３３２に対応する選択されたインテグリンβサブユニットにおけるＩｌｅの欠失または置換によって、サブユニットの野生型より活性である（すなわち、溶液中でポリペプチドのリガンド結合型がより大きな比率で存在する）変種インテグリンβサブユニットが得られるはずである。図７はインテグリンβサブユニットのＡ様ドメインのアラインメントである。保存されたＩｌｅをＡｌａもしくはＧｌｙ、または他の適したアミノ酸に置換すると、活性が増加した変種インテグリンポリペプチドが得られるはずである。または、保存されたＩｌｅ（またはＬｅｕ）と不変のＩｌｅに対してＣ末端の全てのアミノ酸残基を含むインテグリンβサブユニット（またはサブユニットのＡ様ドメイン）の一部を欠失させることができる。下記の表３は、図７に示すインテグリンβサブユニットのそれぞれにおける保存されたＩｌｅの位置を記載する。
【００３３】
【表３】
変種インテグリンポリペプチドをコードする核酸分子
本発明は、変種インテグリンポリペプチド、例えば完全長の変種インテグリンサブユニットまたはその断片（例えば、不変のＩｌｅが欠失または置換されている）、例えば生物的に活性な変種インテグリンポリペプチドをコードする単離または精製された核酸分子を特徴とする。
【００３５】
一つの態様において、本発明の単離された核酸分子には、ＣＤ１１ｂαサブユニット（配列番号：１）のアミノ酸１３９〜３２１位またはその一部をコードするヌクレオチド配列が含まれる。核酸分子には、非コード配列またはインテグリン以外のタンパク質の全てもしくは一部をコードする配列が含まれうる。
【００３６】
もう一つの態様において、本発明の単離された核酸分子には、ＣＤ１１ｂαサブユニットのアミノ酸１３９〜３２１位をコードするヌクレオチド配列の相補体である核酸分子が含まれる。
【００３７】
本発明の核酸分子には、配列番号：１の核酸配列の一部のみが含まれうる。例えば、そのような核酸分子には、インテグリンＡドメインまたはＡ様ドメインの全てもしくは一部（例えば、免疫原性もしくは生物学的に活性な部分）をコードする断片が含まれうる。
【００３８】
変種インテグリンポリペプチド
本発明にはまた、変種インテグリンポリペプチドが含まれる。そのようなポリペプチドは、組換えＤＮＡ法を用いて、化学合成によって、または他の技術を用いて産生することができる。ポリペプチドは、インテグリンＡドメインまたはＡ様ドメインの活性型に結合する抗体を作製するための、免疫原または抗原として用いることができる。ポリペプチドは、翻訳後改変、例えばグリコシル化することができる。
【００３９】
変種インテグリンポリペプチドは、変種インテグリンポリペプチドではない第二のポリペプチドの全てまたは一部を含む、融合タンパク質の一部となりうる。この第二のポリペプチドは、変種インテグリンポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に融合させることができる。第三のペプチドの全てまたは一部が存在してもよい。このように、変種インテグリンポリペプチドは、例えば、ＧＳＴ、免疫グロブリン定常領域、異種シグナル配列に融合することができる。
【００４０】
本発明の変種インテグリンポリペプチド融合タンパク質は、薬学的組成物に組み入れて、インビボで被験者に投与することができる。例えば、変種インテグリンポリペプチドは、骨格筋損傷を減少させるために用いることができる。単離されたＣＤ１１ｂ Ａドメインは既に、この型の損傷の動物モデルにおいて障害を減少させることが判明している。簡単に説明すると、機械による骨格筋損傷を誘導する３０分前に、精製した組換え型ラットＣＤ１１ｂ Ａドメインの１回量（１ｍｇ／ｋｇ）を、ルイスラットの７群（１群当たり５匹）に静脈内投与した。同数のラットに機能遮断性の抗ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８ ｍＡｂ（１ｍｇ／ｋｇ）を処置した。対照ラットにおける（ＰＢＳによって処置）創傷領域の定量的組織学的検査によって、浮腫、筋繊維の破壊、壊死、および赤血球の滲出が示された。好中球の流入は創傷の３０分後に検出され、その３時間後に第二波が起こった。同様に、直接の創傷領域（５ｍｍ域）の外側には、活性化好中球の存在に関連して有意な組織壊死を認めた。ＡドメインまたはｍＡｂ−処置ラットは、浸潤ＰＭＮ数（７５±１０％、ｎ＝３５）、および直接の壊死領域外の筋繊維の保護（８０±８％、ｎ＝３５）に同等で有意な減少を示した。これらのデータは、Ａドメインがこの筋損傷モデルにおいて有効な組織保護剤となりうることを示している。変種Ａドメインも等しく有効となりうる。
【００４１】
変種インテグリンポリペプチド融合タンパク質を用いて、変種インテグリンポリペプチドリガンドの生物学的利用率に影響を及ぼすことができる。
【００４２】
変種インテグリンポリペプチド融合タンパク質は、例えば、虚血−再灌流損傷（Ｓｔｒｏｋｅ ３０：１３４〜９、１９９９）、免疫複合体（Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８６：１８５３〜６３、１９９７）、再狭窄、および寄生虫疾患（例えば、鉤虫種（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｓｐｐ）；Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２７：２０８１〜９１、１９９４を参照のこと）によって引き起こされた障害の治療のために、治療的に有用となる可能性がある。
【００４３】
その上、本発明の変種インテグリンポリペプチド−融合タンパク質は、被験者において抗変種インテグリンポリペプチド抗体を産生するため、変種インテグリンポリペプチドリガンドを精製するため、および変種インテグリンポリペプチドリガンドと変種インテグリンポリペプチドとの相互作用を阻害する分子を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて、免疫原として用いることができる。
【００４４】
融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）を既にコードしている発現ベクターが市販されている。変種インテグリンポリペプチドをコードする核酸は、融合部分が変種インテグリンポリペプチドタンパク質にインフレームで結合するように、そのような発現ベクターにクローニングすることができる。
【００４５】
変種インテグリンポリペプチドは、発現ベクター（例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクター）を用いて産生することができる。ベクターは、自律的に増幅することができるか、または宿主ゲノムに組み入れられることができる。発現ベクターには、発現されるべき核酸配列に機能的に結合した少なくとも一つの調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ部位、または細胞もしくは組織特異的転写因子結合部位）が含まれうる。発現ベクターは、原核または真核細胞、例えば植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現されるように設計することができる。変種インテグリンポリペプチドを発現させるために用いる宿主に応じて、宿主細胞にとって最適なコドンを用いてポリペプチドをコードすることが望ましい可能性がある。場合によっては、組織特異的発現を指示することができる発現ベクターを用いることが望ましい可能性がある。
【００４６】
本発明はまた、変種インテグリンポリペプチドをコードする核酸分子を有する、宿主細胞または組換え型細胞を特徴とする。核酸分子は、宿主ゲノムに組み入れられることができ、または自律的に複製するベクターに存在しうる。宿主細胞は任意の原核または真核細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母または哺乳類細胞となりうる。核酸分子は、形質転換またはトランスフェクション技術によって宿主細胞に導入することができる。
【００４７】
本発明の宿主細胞は、ポリペプチドが産生されるような条件で宿主細胞を培養する段階、および次に細胞または培養培地からポリペプチドを単離する段階によって、変種インテグリンポリペプチドを産生（すなわち、発現）するために用いることができる。
【００４８】
変種インテグリンポリペプチドを認識する抗体
本発明はまた、変種インテグリンポリペプチドに対して作製された抗体を特徴とする。そのような抗体は、それらが対応する野生型インテグリンポリペプチドに結合するより大きな親和性によって、変種ポリペプチドに結合する。抗体は標準的な方法を用いて作製することができ、変種インテグリンポリペプチドに対する抗体の結合を、対応する野生型ポリペプチドに対する抗体の結合と比較することによってスクリーニングすることができる。
【００４９】
「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子、またはその免疫学的活性部分、すなわち抗原結合部分を意味する。免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分の例には、Ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２断片が含まれ、これらはペプシンのような酵素によって抗体を処理することによって作製することができる。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え型、例えばキメラまたはヒト化、完全なヒト、非ヒト、例えば、マウス、または一本鎖抗体となりうる。好ましい態様において、これはエフェクター機能を有する。抗体は、潜在的炎症（例えば、膿瘍、または活性アテローム斑）を診断するために用いられる、毒素または造影剤に結合させることができる。
【００５０】
キメラ、ヒト化、しかし最も好ましくは、完全なヒト抗体は、反復投与、例えばヒト患者の治療的処置（およびいくつかの診断的応用）を含む適用にとって望ましい。
【００５１】
抗変種インテグリンポリペプチド抗体は、多価抗体を産生するために選択的に二量体または多量体にすることができる、一本鎖抗体でありうる。抗体は、Ｆｃ受容体にほとんどまたは全く結合しないように設計することができる。
【００５２】
本発明の抗体は、活性配座であるインテグリンサブユニットを検出または精製するために用いることができる。このように、それらを用いて、臨床検査技法の一部としてインテグリンの活性型の量および発現パターンを評価することができる。検出は、抗体を検出可能な物質に結合させる（すなわち、物理的に連結させる）ことによって（すなわち抗体の標識）、容易にすることができる。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子団、蛍光材料、発光材料、生体発光材料、および放射活性材料（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチン、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリン、ルミノール、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、アエコリン、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓおよび３Ｈ）が含まれる。
【００５３】
変種インテグリンポリペプチドと相互作用する化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ
本発明は、化合物が変種インテグリンポリペプチドに結合するか否か、または化合物がインテグリンリガンド（例えば、天然に存在するインテグリンリガンド）の変種インテグリンポリペプチドに対する結合能を阻害するか否かを評価する方法を特徴とする。方法には、リガンドの存在下または非存在下において、化合物を変種インテグリンポリペプチドに接触させる段階、および変種ポリペプチドに対する化合物またはリガンドの結合能を測定する段階が含まれうる。方法は、インビトロで、例えば細胞不含系において、またはインビボで、例えばツーハイブリッド相互作用捕獲アッセイにおいて行うことができる。方法は、インテグリンと相互作用する天然に存在する分子を同定するために用いることができる。同様に、インテグリンとインテグリンリガンドとの相互作用の、天然または合成の阻害剤を発見するために用いることも可能である。
【００５４】
調べる化合物は、例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、ペプトイド、および低分子となりうる。被験化合物は、生物ライブラリ；ペプトイドライブラリ；空間的に位置特定可能な平行固相または液相ライブラリ；逆重畳積分を必要とする合成ライブラリ法；「１ビーズ１化合物」ライブラリを含む組み合わせライブラリから得ることができる。
【００５５】
化合物のライブラリは、溶液中（例えば、ホーテン（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ）、１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２〜４２１）、またはビーズ（ラム（Ｌａｍ）、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２〜８４）、チップ（フォドー（Ｆｏｄｏｒ）、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５〜５５６）、細菌（ラドナー（Ｌａｄｎｅｒ）、米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（ラドナー（Ｌａｄｎｅｒ）、米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド（カル（Ｃｕｌｌ）ら、１９９２、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１８６５〜１８６９）、またはファージ（スコットおよびスミス（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ）、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６〜３９０；デブリン（Ｄｅｖｌｉｎ）、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４〜４０６；クィーラ（Ｃｗｉｒｌａ）ら、１９９０、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：６３７８〜６３８２；フェリチ（Ｆｅｌｉｃｉ）、１９９１、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：３０１〜３１０；ラドナー（Ｌａｄｎｅｒ）、上記）上に存在してもよい。
【００５６】
スクリーニングアッセイは、変種インテグリンポリペプチドタンパク質またはその生物活性部分を発現する細胞を被験化合物に接触させて、被験化合物が変種インテグリンポリペプチド活性を調節できるか否かを決定する細胞に基づくアッセイとなりうる。被験化合物が変種インテグリンポリペプチド活性を調節できるか否かの決定は、例えば、インテグリンリガンドとの結合能をモニターすることによって達成できる。
【００５７】
被験化合物が化合物、例えばインテグリンリガンドに対するインテグリンポリペプチドの結合を調節できるか否か、または変種インテグリンポリペプチドに結合できるか否かも同様に評価することができる。これは、例えば化合物、例えば基質の変種インテグリンポリペプチドに対する結合が、複合体における標識化合物、例えば基質を検出することによって決定されうるように、化合物、例えば基質を放射性同位元素または酵素標識に結合させることによって行うことができる。または、変種インテグリンポリペプチドまたはインテグリンリガンドは、被験化合物がインテグリンリガンドに対する変種インテグリンポリペプチドの結合を調節できるか否かをモニターするために、放射性同位元素または酵素標識に結合させることができる。例えば、化合物は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈによって直接または間接的に標識することができ、放射性同位元素は、放射線放出の直接計数またはシンチレーション計数によって検出することができる。または、化合物は、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼによって酵素的に標識することができ、酵素標識は、適当な基質の産物への変換を測定することによって検出される。
【００５８】
さらにもう一つの態様において、変種インテグリンポリペプチドまたはその生物活性部分を被験化合物に接触させ、変種インテグリンポリペプチドまたはその生物活性部分に化合物が結合するか否かを評価する、細胞不含アッセイが提供される。本発明のアッセイにおいて用いられる変種インテグリンポリペプチドの好ましい生物活性部分には、インテグリンリガンドに結合する断片が含まれる。
【００５９】
単離されたタンパク質（例えば、変種インテグリンポリペプチドタンパク質またはその生物活性部分）の可溶性および／または膜結合型は、本発明の細胞不含アッセイにおいて用いることができる。タンパク質の膜結合型を用いる場合、可溶化剤を用いることが望ましい可能性がある。そのような可溶化剤の例には、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、トライトン（登録商標）Ｘ−１００、トライトン（登録商標）Ｘ−１１４、テジット（登録商標）、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）、またはＮ−ドデシル＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートのような非イオン性洗浄剤が含まれる。
【００６０】
細胞不含アッセイは、標的遺伝子タンパク質と被験化合物との反応混合物を、二つの成分が相互作用して結合するために十分な条件および時間で調製する段階、次に除去および／または検出することができる複合体を形成する段階を含む。
【００６１】
二つの分子間の相互作用も同様に、蛍光エネルギー移動（ＦＥＴ）（例えば、ラコヴィッツ（Ｌａｋｏｗｉｃｚ）ら、米国特許第５，６３１，１６９号；スタブリャノポーロス（Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ）ら、米国特許第４，８６８，１０３号を参照のこと）を用いて検出することができる。第一の「ドナー」分子上での蛍光体標識は、その放出された蛍光エネルギーが第二の「アクセプタ」分子上の蛍光標識によって吸収され、今度は吸収されたエネルギーによって蛍光を発することができるように選択される。または、「ドナー」タンパク質分子は、単にトリプトファン残基の天然の蛍光エネルギーを利用してもよい。「アクセプタ」分子の標識が「ドナー」の標識と区別されるように、異なる波長の光を放出する標識を選択する。二つの標識間でのエネルギー移動効率は分子が離れている距離に関連するため、分子間の空間的関係を評価することができる。結合が分子間で起こる状況では、アッセイにおける「アクセプタ」分子標識の蛍光放出は最大でなければらなない。ＦＥＴ結合事象は、当技術分野で周知である標準的な蛍光検出手段（例えば、蛍光計を用いて）によって従来のように検出することができる。
【００６２】
もう一つの態様において、変種インテグリンポリペプチドタンパク質が標的分子、例えばインテグリンリガンドに結合するか否かを決定することは、上記のようにリアルタイム生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）（例えば、シェランダーおよびウルバニクツキー（ＳｊｏｌａｎｄｅｒおよびＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ）（１９９１）、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６３：２３３８〜２３４５およびスザボ（Ｓｚａｂｏ）ら、（１９９５）、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ５：６９９〜７０５を参照のこと）を用いて行うことができる。「表面プラズモン共鳴」または「ＢＩＡ」は、いかなる相互作用物質も標識せずに、リアルタイムで生体特異的相互作用を検出する（例えば、ビアコア）。結合表面での質量の変化（結合事象を示す）によって、表面近傍の光の屈折指数の変化が起こり（表面プラズモン共鳴の光学現象（ＳＰＲ））、検出可能なシグナルが得られ、これを生体分子間のリアルタイム反応の指標として用いることができる。
【００６３】
一つの態様において、ポリペプチドまたは被験化合物を固相上に固定する。固相に固定したポリペプチド／被験化合物は、反応終了時に検出することができる。好ましくは、ポリペプチドを固相表面に固定することができ、被験化合物（固定していない）を、検出可能な標識によって直接または間接的に標識することができる。
【００６４】
一つまたは双方のタンパク質の非複合体型からの複合体型の分離を容易にするためと共に、アッセイを自動化に適応させるために、変種インテグリンポリペプチド、抗変種インテグリンポリペプチド抗体またはその標的分子を固定することが望ましい可能性がある。変種インテグリンポリペプチドタンパク質に対する被験化合物の結合、または候補化合物の存在下および非存在下で標的分子と変種インテグリンポリペプチドタンパク質との相互作用は、反応物質を含む適した如何なる容器において行うことも可能である。そのような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微量遠心管が含まれる。一つの態様において、一つまたは双方のタンパク質がマトリクスに結合できるようにするドメインを付加する融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／変種インテグリンポリペプチド融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ州）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸収させることができ、次にこれを被験化合物、または被験化合物と吸収されない標的タンパク質もしくは変種インテグリンポリペプチドタンパク質のいずれかと混合して、混合物を複合体を形成する条件（例えば、塩およびｐＨに関して生理的条件）でインキュベートする。インキュベーションの後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、未結合の化合物、ビーズの場合には固定したマトリクスを除去し、複合体は例えば上記のように直接または間接的に決定することができる。または、複合体をマトリクスから解離させて、変種インテグリンポリペプチド結合または活性レベルを標準的な技術を用いて決定することができる。
【００６５】
変種インテグリンポリペプチドまたは標的分子のいずれかをマトリクス上に固定する他の技術には、ビオチンとストレプトアビジンとを用いることが含まれる。ビオチン結合変種インテグリンポリペプチドまたは標的分子は、当技術分野で既知の技術（例えば、ビオチン結合キット、ピアスケミカルズ社、ロックフォード、イリノイ州）を用いてビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシニミド）から調製して、ストレプトアビジンコーティング９６ウェルプレート（ピアスケミカル社）のウェルに固定することができる。
【００６６】
アッセイを行うために、固定成分を含むコーティング表面に非固定成分を加える。反応が終了した後、形成された如何なる複合体も固相表面上に固定されたままであるように未反応成分を除去する（例えば、洗浄によって）。固相表面に固定された複合体の検出は、多くの方法によって行うことができる。先に固定されていない成分が予め標識されている場合、表面上に固定された標識が検出されれば、複合体が形成されたことを示している。先に固定されていない分子が予め標識されていない場合、間接的な標識、例えば固定成分に対して特異的な標識抗体（次に抗体を、例えば標識抗Ｉｇ抗体によって直接または間接的に標識することができる）を用いて、表面上に固定された複合体を検出することができる。
【００６７】
一つの態様において、このアッセイは、変種インテグリンポリペプチドまたは標的分子と反応するが、変種インテグリンポリペプチドのその標的分子に対する結合を妨害しない抗体を利用して行われる。そのような抗体は、プレートのウェルに誘導体化することができ、未結合の標的または変種インテグリンポリペプチドタンパク質は抗体の結合によってウェルに捕獲される。ＧＳＴ固定複合体に関して先に記述した方法の他に、そのような複合体を検出する方法には、変種インテグリンポリペプチドまたは標的分子に反応する抗体を用いて複合体を免疫学的に検出することと共に、変種インテグリンポリペプチドまたは標的分子に関連した酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが含まれる。
【００６８】
または、細胞不含アッセイは液相において行うことができる。そのようなアッセイにおいて、反応産物は、クロマトグラフィー、電気泳動、および免疫沈降を含む多くの標準的な技術によって未反応成分から分離する。
【００６９】
好ましい態様において、アッセイには、変種インテグリンポリペプチドまたはその生物活性部分を、変種インテグリンポリペプチドに結合する既知の化合物に接触させてアッセイ混合物を形成すること、アッセイ混合物を被験化合物に接触させること、および被験化合物が変種インテグリンポリペプチドと相互作用するか否かを決定する段階が含まれ、被験化合物が変種インテグリンポリペプチドと相互作用するか否かを決定することには、被験化合物が選択的に変種インテグリンポリペプチドもしくはその生物活性部分に結合することができるか否か、または既知の化合物と比較して標的分子の活性を調節することができるか否かを決定することが含まれる。
【００７０】
変種インテグリンポリペプチドとインテグリンリガンドとの相互作用を妨害する化合物を同定するために、変種インテグリンポリペプチドとリガンドとを含む反応混合物を、２つの産物が複合体を形成するために十分な条件および時間でインキュベートする。阻害物質を調べるために、反応混合物は被験化合物の存在下および非存在下で提供する。被験化合物は、最初に反応混合物に含めることができ、または一度に加えてから、標的遺伝子およびその細胞もしくは細胞外結合パートナーを加えることができる。対照反応混合物は、被験化合物を加えないで、またはプラセボを加えてインキュベートする。次に、変種インテグリンポリペプチドとインテグリンリガンドとの如何なる複合体の形成も検出する。対照反応において複合体が形成されるが、被験化合物を含む反応混合物において形成されなければ、化合物が相互作用を妨害することを示している。さらに、被験化合物と変種インテグリンポリペプチドとを含む反応混合物における複合体形成を、被験化合物と対応する野生型インテグリンポリペプチドとを含む反応混合物における複合体形成と比較することができる。
【００７１】
これらのアッセイは、不均一または均一フォーマットで行うことができる。不均一アッセイは、変種インテグリンポリペプチドまたは結合パートナー（すなわち、インテグリンリガンド）のいずれかを固相上に固定すること、および反応終了時に固相上に固定された複合体を検出することを含む。均一アッセイでは、反応全体を液相で行う。いずれかのアプローチにおいて、反応物質を加える順序は、調べる化合物に関して異なる情報が得られるように変更することができる。例えば、変種インテグリンポリペプチドと結合パートナー（例えば、インテグリンリガンド）との相互作用を、例えば競合によって妨害する被験化合物は、試験物質の存在下で反応を行うことによって同定することができる。または、予め形成された複合体を破壊する被験化合物、例えば複合体から成分の一つを置換するより高い結合定数を有する化合物は、複合体が形成された後に反応混合物に被験化合物を加えることによって調べることができる。様々なフォーマットを下記に簡単に説明する。
【００７２】
不均一アッセイ系において、変種インテグリンポリペプチドまたはインテグリンリガンドのいずれかを固相表面（例えば、マイクロタイタープレート）に固定して、非結合種は直接または間接的に標識する。固定種は、非共有または共有結合によって固定することができる。または、固定すべき種に特異的な固定抗体を用いて固相にその種を固定することができる。
【００７３】
アッセイを行うために、固定種のパートナーを被験化合物と共にまたは被験化合物の非存在下でコーティング表面に曝露する。反応が終了した後、未反応の成分は除去されるが（例えば、洗浄によって）、形成された如何なる複合体も固相表面に固定されたままである。非固定種が予め標識されている場合、表面上に固定された標識が検出されれば、複合体が形成されたことを示している。非固定種が予め標識されていない場合、間接的な標識を用いて、例えば最初の非固定種に対して特異的な標識抗体（次に抗体を、例えば標識抗Ｉｇ抗体によって直接または間接的に標識することができる）を用いて、表面上に固定された複合体を検出することができる。反応成分を加える順序に応じて、複合体形成を阻害するまたは予め形成された複合体を破壊する被験化合物を検出することができる。
【００７４】
または、反応は、被験化合物の存在下または非存在下で液相で行うことができ、反応産物を未反応成分から分離して、例えば溶液において形成された如何なる複合体も固定するために結合成分の一つに対して特異的な固定抗体と、固定された複合体を検出するための他のパートナーに対して特異的な標識抗体とを用いて、複合体を検出することができる。この場合も、反応物質を液相に加える順序に応じて、複合体を阻害する、または予め形成された複合体を破壊する被験化合物を同定することができる。
【００７５】
本発明のもう一つの態様において、均一アッセイを用いることができる。例えば、変種インテグリンポリペプチドまたはインテグリンリガンドのいずれかが標識されているが、標識によって産生されたシグナルが複合体形成によって消光するような、変種インテグリンポリペプチドとインテグリンリガンドとの予め形成された複合体を調製する（例えば、このアプローチをイムノアッセイに利用する米国特許第４，１０９，４９６号を参照のこと）。種の一つに競合する、または予め形成された複合体から種の一つを置換する試験物質を加えれば、バックグラウンドを超えるシグナルが産生されると考えられる。このようにして、変種インテグリンポリペプチド結合パートナー相互作用を破壊する試験物質を同定することができる。
【００７６】
さらにもう一つの局面において、変種インテグリンポリペプチドタンパク質は、変種インテグリンポリペプチドに結合または相互作用する他のタンパク質を同定するために、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイにおける「ベイト（ｂａｉｔ）」タンパク質として用いることができる（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；ゼルボス（Ｚｅｒｖｏｓ）ら、（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：２２３〜２３２；マデュラ（Ｍａｄｕｒａ）ら（１９９３）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１２０４６〜１２０５４；バーテル（Ｂａｒｔｅｌ）ら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０〜９２４；イワブチ（Ｉｗａｂｕｃｈｉ）ら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３〜１６９６；およびブレント（Ｂｒｅｎｔ）、国際公開公報第９４／１０３００号を参照のこと）。
【００７７】
ツーハイブリッドアッセイは、ベイトタンパク質として変種Ａドメインを用いて行うことができる。簡単に説明すると、変種ＡドメインをＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインに融合させて、これをベイトとして用いる。プレイ（ｐｒｅｙ）は、Ｎ末端核局在シグナル、ＬｅｘＡ活性化ドメイン、およびエピトープタグとの融合タンパク質としてＴｒｘＡ発現の活性部位ループにクローニングした、アプタマーライブラリである（コラス（Ｃｏｌａｓ）ら、１９９６ Ｎａｔｕｒｅ ３８０：５４８；およびギウリス（Ｇｙｕｒｉｓ）ら、Ｃｅｌｌ １９９３、７５：７９１）。酵母細胞をベイトおよびプレイ遺伝子によって形質転換する。アプタマーが変種Ａドメインに結合すれば、ＬｅｘＡ活性化ドメインは、ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインと近位になり、適切に配置されたＬｅｘＡ結合部位を有する遺伝子の発現が増加する。
【００７８】
この系を調べるために、酵母株ＥＧＹ４８をベイトプラスミドおよびｐＳＨ１８−３４（ＵＲＡ３、その中でＧＡＬ１エンハンサー様の上流活性化配列（ＵＡＳＧ）が、８個のＬｅｘＡ二量体の結合部位に置換されているｌａｃＺに融合したＧＡＬ１プロモーターを含む、２μｍプラスミド）によって形質転換した。酵母株は、２つのレポーター遺伝子、ＬｅｘＡｏｐ−ＬＥＵ２（酵母染色体ＬＥＵ２遺伝子を置換）およびＬｅｘＡｏｐ−ｌａｃＺを２μｍ ＨＩＳ３＋プラスミド上に含む。形質転換細胞をＸ−ｇａｌを含む培地上で播種した。ベイトの存在によって、β−ガラクトシダーゼの発現は引き起こされなかった。形質転換細胞はロイシン欠損プレートにおいて増殖しなかったことから、ベイト自身も同様にＥＧＹ４８においてＬｅｘＡｏｐ−Ｌｅｕ２遺伝子を活性化しなかった。次に、抑制型のアッセイにおいて、ベイトプラスミドおよびｐＪＫ１０１レポーターを用いて、ベイトの核輸送を評価した。このアッセイにおいて、転写的に不活性なＬｅｘＡ融合タンパク質によるＤＮＡ結合を検出することができる。ｐＪＫ１０１レポーターは、ＵＲＡ３、すなわちＵＡＳＧのほとんどを含む２μｍプラスミドである。ＬｅｘＡの高親和性部位は、Ｇａｌ１転写開始とＵＡＳＧとのあいだに存在する。ＣＤ１１ｂＡ−ＬｅｘＡベイトは、ガラクトース培地で増殖させるとｐＪＫ１０１プラスミドを有する酵母のガラクトシダーゼ活性を障害し、このベイトが核に入ることを示している。
【００７９】
アプタマーライブラリをＬｅｕおよびｌａｃＺレポーター含有酵母細胞に導入した。ライブラリタンパク質の合成は、ガラクトース培地において酵母を増殖させることによって誘導した。ベイトに結合する適したプレイが存在しない場合、酵母細胞は、Ｌｅｕ−培地上で増殖せず、β−ガラクトシダーゼ活性を有しない。適したプレイを発現する細胞は、Ｌｅｕ培地上でコロニーを形成して、β−ガラクトシダーゼを有する。選択的ガラクトース（しかし、グルコースではない）誘導性発現によって、ＬｅｕおよびＬａｃＺ表現型を決定的にライブラリタンパク質に帰することができ、その後の分析によって除外しなければならないライブラリプラスミドの数を減少させる。陽性コロニー（すなわち、ガラクトース上で増殖することができるコロニー、Ｕｒａ−、Ｔｒｐ−、Ｈｉｓ−、Ｌｅｕ−プレート）由来のプラスミドを救出した（ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ）ら、１９８７、Ｇｅｎｅ ５７：２６７）。それぞれのクローンの特徴をさらに調べる前に、ベイトとの相互作用の特異性を調べた。これは、無関係または非機能的なベイト（例えばそれぞれ、ＣＤ１１ａ Ａドメイン−ＬｅｘＡおよび１１ｂＡ−Ｄ２４２Ａ−ＬｅｘＡ）、ベイトのＤＮＡ結合ドメイン部分と特異的に、または非特異的にプロモーターもしくは他の転写機構のエレメントと相互作用しないことを示すことによって行われた。ライブラリプラスミドは、ガラクトース依存的Ｌｅｕ＋ｌａｃＺ＋酵母から救出して、当初の選択株および異なるベイトを含む他の株に再度導入した。特異的相互作用物質は、ガラクトース依存的Ｌｅｕ＋およびｌａｃＺ＋表現型を、当初のベイトを含む酵母に付与するが、無関係なベイトを含む酵母には付与しない。相互作用交配アッセイを用いて特異性を調べることができる。簡単に説明すると、プレイを含む株を当初のベイトタンパク質または対照ベイトタンパク質のいずれかを発現する異なる酵母株と交配させる。レポーターは、当初のベイトを含む二倍体でのみ活性となるはずである（フィンレー（Ｆｉｎｌｅｙ）ら、（１９９４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１２９８０）。
【００８０】
本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイによって同定される新規作用物質に関する。したがって、そのような作用物質による処置の有効性、毒性、副作用、または作用機序を決定するために、本発明に記載されるように同定された作用物質（例えば、変種インテグリンポリペプチド調節作用物質）を適当な動物モデルにおいてさらに用いることは本発明の範囲内である。さらに、上記のスクリーニングアッセイによって同定された新規作用物質は、本明細書に記載の治療のために用いることができる。
【００８１】
薬学的組成物
変種インテグリンポリペプチド、その断片と共に本発明の抗変種インテグリンポリペプチド抗体（本明細書において「活性化合物」とも呼ばれる）は、薬学的組成物に組み入れることができる。そのような組成物は、典型的にタンパク質または抗体と薬学的に許容される担体とを含む。本明細書において用いられるように、「薬学的に許容される担体」という句には、薬学的投与に適合性の溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤等が含まれる。補助活性化合物も同様に組成物に組み入れることができる。
【００８２】
薬学的組成物は、その意図する投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例には、非経口、静脈内、皮内、皮下、経口、吸入、経皮、経粘膜、および直腸投与が含まれる。非経口、皮内、または皮下適用のために用いられる溶液または懸濁液には、以下の成分が含まれうる：注射用水、生理食塩液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒のような滅菌希釈剤；ベンジルアルコール、またはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、または燐酸塩のような緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような等張性調節剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基によって調節することができる。非経口調製物は、ガラスもしくはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または多数回投与バイアルに封入することができる。
【００８３】
注射可能な使用に適した薬学的組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散剤、および滅菌注射溶液または分散液の即時調合調製物のための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与の場合、適した担体には、生理食塩液、静菌水、クレモフォアＥＬ（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ；商標）（ＢＡＳＦ、パーシッパニー、ニュージャージー州）または燐酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）が含まれる。全ての場合において、組成物は滅菌でなければならず、容易なシリンジ操作性が存在する程度に流動性でなければならない。組成物は、製造および保存条件で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）を含む溶媒または分散媒体、ならびにその適した混合物となりうる。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコーティングを用いることによって、分散剤の場合には必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって行うことができる。多くの場合、等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールのような多価アルコール、塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましいと考えられる。注射可能組成物は、吸収を遅らせる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによって持続的に吸収させることができる。
【００８４】
滅菌注射用溶液は、先に列挙した成分の一つまたは組み合わせと共に適当な溶媒において活性化合物の必要量を組み入れて、必要であれば濾過滅菌を行うことによって調製することができる。一般的に、分散剤は、基礎分散媒体と先に列挙した必要な他の成分とを含む滅菌溶媒に活性化合物を組み入れることによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、先に濾過滅菌したその溶液から、活性成分プラスさらなる所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥である。
【００８５】
経口組成物には一般的に、不活性希釈剤または食用担体が含まれる。経口治療的投与の目的に関して、活性化合物は賦形剤と共に組み入れて、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤、例えばゼラチンカプセルの形で用いることができる。経口組成物は、マウスウォッシュとして用いられる液体担体を用いて調製することも可能である。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント材料を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤等は、以下の成分または類似の特性を有する化合物のいかなるものも含むことができる：微結晶セルロース、トラガカントゴム、もしくはゼラチンのような結合剤；デンプンもしくは乳糖のような賦形剤；アルギン酸、プリモゲル、もしくはコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはステローテスのような潤滑剤；二酸化珪素コロイドのような滑り剤；蔗糖もしくはサッカリンのような甘味料；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料のような香料。
【００８６】
吸入投与の場合、化合物は、適した噴射剤、例えば、二酸化炭素のようなガス含む加圧容器まもしくディスペンサー、またはネブライザーからエアロゾルスプレーの形で輸送される。
【００８７】
全身投与はまた、経粘膜または経皮手段によっても行うことができる。経粘膜または経皮投与の場合、浸透すべき障壁に対して適当な浸透剤を製剤において用いる。そのような浸透剤は一般的に当技術分野で既知であり、例えば、経粘膜投与に関して、洗浄剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻腔内スプレーまたは坐剤を用いて行うことができる。経皮投与の場合、活性化合物は、当技術分野で一般的に既知のように軟膏剤、軟膏、ゲル、またはクリームに製剤化される。
【００８８】
化合物はまた、直腸輸送のために坐剤（例えば、カカオバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤基剤と共に）または浣腸の形で調製することができる。
【００８９】
一つの態様において、活性化合物は、インプラントおよび微量封入輸送系を含む、徐放性製剤のような、化合物が体から迅速に消失しないようにする担体と共に調製される。エチレン酢酸ビニル、多価無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような生体分解性の生体適合性ポリマーを用いることができる。そのような処方を調製する方法は当業者に明らかである。材料はまた、アルザ社およびノバファーマシューティカルズインクから購入することができる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体によって感染細胞にターゲティングされるリポソームを含む）も同様に薬学的に許容される担体として用いることができる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるように当業者に既知の方法に従って調製することができる。
【００９０】
投与を容易にするため、および投与を均一にするために、単位用量で経口または非経口組成物を処方することが都合がよい。本明細書において用いられる用量型は、各単位が必要な薬学的担体に関連して所望の治療効果を生じるように計算された活性化合物の規定量を含む、処置される被験者に関して単位用量として適している物理的に個別の用量を意味する。
【００９１】
そのような化合物の毒性および治療的有効性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的技法、例えばＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定することによって決定することができる。毒性と治療効果の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表記されうる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を用いてもよいが、非罹患細胞に対する可能性がある損傷を最小限にして、それによって副作用を減少させるために、そのような化合物を罹患組織の部位にターゲティングする輸送系を設計するように注意しなければならない。
【００９２】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトにおいて用いられる幅広い用量を処方するために用いることができる。そのような化合物の用量は好ましくは、ほとんどまたは全く毒性を示さないＥＤ５０を含む循環中の濃度範囲内に存在する。用量は、用いる投与剤形および利用する投与経路に応じてこの範囲内で変動してもよい。本発明の方法において用いられる如何なる化合物に関しても、治療的に有効な用量は、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。用量は、細胞培養において決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半量を得る被験化合物の濃度）を含む循環中の血漿濃度範囲を得るように動物モデルにおいて処方してもよい。そのような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。
【００９３】
本明細書において定義されるように、タンパク質またはポリペプチドの治療的有効量（すなわち、有効量）は、約０．００１〜３０ ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１〜２５ ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１〜２０ ｍｇ／ｋｇ体重、およびさらにより好ましくは約１〜１０ ｍｇ／ｋｇ、２〜９ｍｇ／ｋｇ、３〜８ｍｇ／ｋｇ、４〜７ｍｇ／ｋｇ、または５〜６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。タンパク質またはポリペプチドは、約１〜１０週間のあいだに、好ましくは２〜８週間、より好ましくは３〜７週間、およびさらにより好ましくは約４、５、または６週間のあいだに週１回投与することができる。当業者は、疾患または障害の重症度、これまでの治療、被験者の全身健康および／または年齢、および存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない特定の要因が、被験者を有効に治療するために必要な用量および時期に影響を及ぼす可能性があることを認識すると考えられる。その上、タンパク質、ポリペプチド、または抗体の治療的有効量による被験者の治療には、一回治療が含まれうる、または好ましくは一連の治療が含まれうる。
【００９４】
抗体に関して、好ましい用量は０．１ ｍｇ／ｋｇ体重（一般的に１０ ｍｇ／ｋｇ〜２０ ｍｇ／ｋｇ）である。抗体が脳において作用する場合、５０ ｍｇ／ｋｇ〜１００ ｍｇ／ｋｇの用量が通常適当である。一般的に部分的なヒト抗体および完全なヒト抗体は、他の抗体よりヒトの体内において長い半減期を有する。したがって、より低い用量およびあまり頻繁でない投与がしばしば可能である。脂質付加のような改変を用いて抗体を安定化させ、取り込みおよび組織の浸透（例えば、脳への）を増強することができる。抗体の脂質付加方法は、クルイクシャンクら（Ｃｒｕｉｋｓｈａｎｋ、１９９７、Ｊ． Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ １４：１９３）に記載されている。
【００９５】
本発明は、発現または活性を調節する作用物質を含む。作用物質は例えば低分子であってもよい。例えば、そのような低分子には、ペプチド、ペプチド模倣体（例えば、ペプトイド）、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、１モルあたりの分子量が約１０，０００ ｇ未満の有機または無機化合物（すなわち、ヘテロ有機または有機金属化合物を含む）、１分子あたりの分子量が約５，０００ ｇ未満の有機または無機化合物、１分子あたりの分子量が約１，０００ ｇ未満の有機または無機化合物、１分子あたりの分子量が約５００ ｇ未満の有機または無機化合物、ならびにそのような化合物の塩、エステル、および他の薬学的に許容される型が含まれるがこれらに限定されない。
【００９６】
例としての用量には、被験者または試料重量１ｋｇあたり低分子のミリグラムまたはマイクログラム量が含まれる（例えば、約１μｇ／ｋｇ〜約５００ ｍｇ／ｋｇ、約１００ μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、または約１μｇ／ｋｇ〜約５０ μｇ／ｋｇ）。さらに、低分子の適当な用量は、調節すべき発現または活性に関する低分子の有効性に依存する。これらの低分子の一つまたは複数を、本発明のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節するために、動物（例えば、ヒト）に投与する場合、医師、獣医師、または研究者は、例えば最初に比較的低用量を処方して、その後適当な反応が得られるまで用量を増加させてもよい。さらに、任意の特定の動物被験者の特定の用量レベルも、用いる特定の化合物の活性、被験者の年齢、体重、全身体重、全身健康、性別、および食事、投与時期、投与経路、排泄速度、薬剤併用、および調節すべき発現または活性の程度を含む様々な要因に依存すると理解される。
【００９７】
抗体（またはその断片）は、サイトトキシン、治療作用物質、または放射活性金属イオンのような治療部分に結合してもよい。サイトトキシンまたは細胞毒物質には、細胞にとって有害な任意の作用物質も含まれる。例には、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミスラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンならびにその類似体または相同体が含まれる。治療作用物質には、抗代謝剤（例えば、メソトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、デカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロルエタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミンプラチナ（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（これまでダウノマイシン）、およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（これまでアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミスラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が含まれる。
【００９８】
本発明の結合体は、所定の生物反応を改変するために用いることができ、薬剤部分は、古典的な化学治療物質に限定されると解釈すべきではない。例えば、薬剤部分は、所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。そのようなタンパク質には、例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、ジフテリア毒素、またはサイトカインもしくはインターロイキンのようなタンパク質が含まれてもよいが、これらに限定されない。
【００９９】
または、抗体は、シーガル（Ｓｅｇａｌ）らによって米国特許第４，６７６，９８０号に記載されるように、第二の抗体に結合して抗体のヘテロ結合体を形成することができる。
【０１００】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入して、これを遺伝子治療ベクターとして用いることができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）によって、または定位注射（例えば、チェン（Ｃｈｅｎ）ら（１９９４）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３０５４〜３０５７）によって被験者に輸送することができる。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物には、許容される希釈剤における遺伝子治療ベクターが含まれうる、または遺伝子輸送媒体が抱埋される徐放性マトリクスを含みうる。または、完全な遺伝子輸送ベクターを、組換え型細胞、例えばレトロウイルスベクターから無傷で産生することができる場合、薬学的調製物には、遺伝子輸送系を生じる一つまたは複数の細胞が含まれうる。
【０１０１】
薬学的組成物は、投与のための説明書と共に容器、パック、ディスペンサーに含まれうる。
【０１０２】
インテグリンを含むプロセスの動物モデル
可能性がある治療的組成物を調べるために有用となりうる血管損傷モデルは、サイモン（Ｓｉｍｏｎ）ら（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ２０００ １０５：２９３）によって記述される。タン（Ｔａｎｇ）ら（１９９７、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ １８６：１８５３）は、様々なスクリーニングアッセイにおいて有用となりうるＣＤ１１ｂノックアウトマウスを記述している。火傷の損傷に関する動物モデルも同様に有用となる可能性がある（Ｐｌａｓｔ Ｒｅｃｏｎｓｔｒ Ｓｕｒｇ １９９５、９６：１１７７）。
【０１０３】
治療方法
本発明は、異常または望まないインテグリン発現または活性に関連した障害の危険性をもつ（または感受性がある）か、または障害を有する被験者を治療する、予防的および治療的方法を提供する。
【０１０４】
本明細書において用いられる「治療」または「患者を治療する」とは、疾患、疾患の症状、または疾患に対する素因を治療、治癒、緩和、軽減、変化、治療、改善、和らげる、改善もしくは影響を及ぼす目的で、治療物質を患者に適用もしくは投与すること、または疾患、疾患の症状、もしくは疾患に対する素因を有する患者から単離された組織もしくは細胞株に対する治療物質の適用もしくは投与であると定義される。治療物質には、低分子、ペプチド、抗体、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。
【０１０５】
そのような化合物の毒性および治療的有効性は、細胞培養または実験動物において標準的な薬学的技法によって、例えば、ＬＤ５０（集団における５０％に致死的な用量）、およびＥＤ５０（集団における５０％において治療的に有効な用量）を決定することによって決定することができる。毒性と治療効果の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表記することができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を用いてもよいが、非罹患細胞に対する可能性がある損傷を最小限にして、それによって副作用を減少させるために、そのような化合物を罹患組織の部位にターゲティングする輸送系を設計するように注意しなければならない。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａおよび１Ｂ】ＣＤ１１ｂ Ａドメインの結晶構造の表面の略図をその「閉鎖」（図１Ａ）および「開放」（図１Ｂ）状態で示し、Ｃ末端のα７ヘリックスを灰色のリボンで示し、イソロイシン（Ｉ３３２）残基を黒色で示す。矢印はＭＩＤＡＳ表面を指す。ＭＩＤＡＳおよびＳＩＬＥＮ（イソロイシンのためのソケット）は、Ａドメイン構造のほぼ正反対の末端に存在する。これらの図におけるアミノ酸は成熟タンパク質の番号に基づく番号であることに注意すること。ＣＤ１１ｂαサブユニットはアミノ酸１６個のシグナル配列を有する。このように、未成熟なタンパク質におけるＩ３３２は、成熟タンパク質におけるＩ３１６に対応する。
【図１Ｃおよび図１Ｄ】ＳＩＬＥＮ残基（Ｉ３３２から半径４Åの範囲内に存在するＩ１５１、Ｌ１８０、Ｉ２５２、Ｙ２８３）の拡大表面図を「閉鎖」（図１Ｃ）および「開放」（図１Ｄ）配座で示す。「閉鎖」型（図１Ｃ）では、Ｉ３３２側鎖はＳＩＬＥＮに入り込んでおり、Ｌ３２８は上部に認められる。Ｌ３２８は「開放」構造（図１Ｄ）ではＳＩＬＥＮを覆うように移動する。図１Ａ〜１ＤはＧＲＡＳＰ（バリー・ホニヒ（Ｂａｒｒｙ Ｈｏｎｉｇ）、コロンビア大学、ニューヨーク）を用いて作製した。これらの図におけるアミノ酸は、成熟タンパク質の番号に基づく番号であることに注意すること。ＣＤ１１ｂαサブユニットはアミノ酸１６個のシグナル配列を有する。このように、未成熟なタンパク質におけるＩ３３２は、成熟タンパク質におけるＩ３１６に対応する。
【図１Ｅおよび１Ｆ】「閉鎖」（図１Ｅ）および「開放」（図１Ｆ）配座におけるＩ３３２配位結合ソケットの立体図を示す。ＳＩＬＥＮ残基およびＩ３３２およびＬ３２８に印をつけている。これらの図におけるアミノ酸は、成熟タンパク質の番号に基づいて番号をつけていることに注意すること。ＣＤ１１ｂαサブユニットはアミノ酸１６個のシグナル配列を有する。このように、未成熟なタンパク質におけるＩ３３２は、成熟タンパク質におけるＩ３１６に対応する。
【図２Ａおよび２Ｂ】１１ｂＡ１３９−３３７（図２Ａ）および１１ｂＡ１３９−３３１構造のα７のＣ末端部分の２Ｆ０−Ｆｃ電子密度マップを示す。マップは、１．１σで輪郭を示し、Ｏによって作製する。これらの図におけるアミノ酸は、成熟タンパク質の番号に基づいて番号をつけていることに注意すること。ＣＤ１１ｂαサブユニットはアミノ酸１６個のシグナル配列を有する。このように、未成熟なタンパク質におけるＩ３３２は、成熟タンパク質におけるＩ３１６に対応する。
【図２Ｃおよび２Ｄ】ＣＤ１１ｂ Ａドメインについてそれぞれ報告された「閉鎖」（図２Ｃ）および「開放」（図２Ｄ）型に、１１ｂＡ１３９−３３７（図２Ｃ）および１１ｂＡ１３９−３３１（図２Ｄ）構造を完全に重ね合わせて示す、リボン略図を示す。金属イオンを球として示す。これらの図におけるアミノ酸は、成熟タンパク質の番号に基づいて番号をつけていることに注意すること。ＣＤ１１ｂαサブユニットはアミノ酸１６個のシグナル配列を有する。このように、未成熟なタンパク質におけるＩ３３２は、成熟タンパク質におけるＩ３１６に対応する。
【図２Ｅおよび２Ｆ】ＭＩＤＡＳの立体図を１１ｂＡ１３９−３３７（図２Ｅ）および１１ｂＡ１３９−３３１（図２Ｆ）構造で示す。直接のＤ２５８金属結合、および間接的なＴ２２５−水−金属結合（図２Ｅ）が、「閉鎖」配座の特徴である。この場合の金属イオンは、Ｍｎ２＋である。ＭＩＤＡＳ配座（直接のＴ２２５−金属結合、間接的なＤ２５８−水−金属結合、および緑色で示す活性部位を占有する偽リガンドグルタメート、ならびに直接配位結合する金属イオン（Ｃａ２＋）は、「開放」配座のものである）。これらの図におけるアミノ酸は、成熟タンパク質の番号に基づいて番号をつけていることに注意すること。ＣＤ１１ｂαサブユニットはアミノ酸１６個のシグナル配列を有する。このように、未成熟なタンパク質におけるＩ３３２は、成熟タンパク質におけるＩ３１６に対応する。
【図３Ａ−３Ｊ】１１ｂＡＥ−Ｇ（図３Ａ〜３Ｅ）および１１ｂＡ１３９−３３１（図３Ｆ〜３Ｊ）、ならびに活性化依存的リガンドｉＣ３ｂ（図３Ａおよび３Ｆ）、フィブリノーゲン（図３Ｂおよび３Ｇ）、またはＣＤ５４（図３Ｃおよび３Ｈ）との相互作用を記録するために、ビアコア（商標）を用いた１１ｂＡＥ−Ｇおよび１１ｂＡ１３９−３３１Ａドメインの機能的分析の結果を示す。三つのリガンド全てが１１ｂＡ１３９−３３１に結合したが、１１ｂＡ１３９−３３７には結合しなかった。活性化非依存的リガンド、ＮＩＦ（図３Ｄおよび３Ｉ）、ならびにｍＡｂ ９０４に対する結合が同等であったことから、認められた結合の差はタンパク質濃度の差が原因ではなかった。親和性を定量的に決定するために、Ａドメインペプチドの様々な濃度を用いた。結合データは、一次変換によって分析し、解離定数（Ｋｄ、平均値±ＳＤ、ｎ＝２）０．４６±０．１５ μＭ（ｉＣ３ｂに関して）、０．２５±０．０７ μＭ（フィブリノーゲンに関して）、および０．２２±０．０４ μＭ（ＣＤ５４に関して）を得た。
【図４Ａ】１１ｂＡＩ → ＧのｉＣ３ｂに対する結合の分析結果を示す。破線は同じリガンドに対する１１ｂＡ１３９−３３７の結合が存在しないことを表す。計算されたＫｄは０．６６±０．３ μＭ（平均値±ＳＤ、ｎ＝２）である。
【図４Ｂ】野生型受容体と比較して、ＣＯＳ細胞上に発現された１−ＧＣＲ３のｉＣ３ｂに対する相対的結合を示すヒストグラム（平均値±ＳＤ、ｎ＝３）を示す。
【図５】９個のαインテグリンαサブユニット（ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤ１１ａ、α１、α２、α１０、α１１、およびαＥ）のＡドメインのアラインメントを示す。このアラインメントにおいて、不変のＩｌｅ（ＣＤ１１ｂαサブユニットにおけるＩ３３２）を矢印で示す。
【図６】ＣＤ１１ａ Ａドメインにおける不変のイソロイシンのＩからＧへの変異が、このインテグリンにおいて活性化ドメインを誘導することを示し、ＣＤ１１ｂ Ａドメインにおけるこの知見を他のインテグリンＡドメインに適用可能であることを強調する。
【図７】８個のインテグリンβサブユニットのＡ様ドメインのアラインメントである。このアラインメントにおいて、βサブユニットにおける不変のＩｌｅに対応する残基を矢印で示す。
Claims (68)
- ３３２位のイソロイシンがグリシンおよびアラニンから選択されるアミノ酸で置換されている、変種ＣＤ１１ｂαサブユニットをコードする、単離された核酸分子。
- ３３２位のイソロイシンがグリシンおよびアラニンから選択されるアミノ酸で置換されている、変種ＣＤ１１ｂαサブユニットポリペプチド。
- ＣＤ１１ｂαサブユニットのアミノ酸１４４位から３３１位からなるポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
- アミノ酸３３２位のイソロイシンがグリシンおよびアラニンから選択されるアミノ酸によって置換されている、ＣＤ１１ｂαサブユニットのアミノ酸１４４位から３３２位を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
- ３３２位のイソロイシンがグリシンおよびアラニンから選択されるアミノ酸によって置換されている、ＣＤ１１ｂαサブユニットのアミノ酸１４４位から３３２位を含むポリペプチド。
- ＣＤ１１ｂαサブユニットのアミノ酸３３２位から１１５２位を含まない、ＣＤ１１ｂαサブユニットのアミノ酸１４４位から３３１位を含むポリペプチド。
- ３３１位のイソロイシンがグリシンおよびアラニンから選択されるアミノ酸で置換されている、変種ＣＤ１１ａαサブユニットをコードする、単離された核酸分子。
- ３３１位のイソロイシンがグリシンおよびアラニンから選択されるアミノ酸で置換されている、変種ＣＤ１１ａαサブユニット。
- ＣＤ１１ａαサブユニットのアミノ酸１５０位から３３０位からなるポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
- アミノ酸３３１位のイソロイシンがグリシンおよびアラニンから選択されるアミノ酸によって置換されている、ＣＤ１１ａαサブユニットのアミノ酸１５０位から３３１位を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
- ３３１位のイソロイシンがグリシンおよびアラニンから選択されるアミノ酸によって置換されている、ＣＤ１１ａαサブユニットのアミノ酸１５０位から３３１位を含むポリペプチド。
- ＣＤ１１ａのアミノ酸３３１位から１２２３位を含まない、ＣＤ１１ａαサブユニットのアミノ酸１５０位から３３０位を含むポリペプチド。
- （ａ）アミノ酸３３２位のイソロイシンがグリシンおよびアラニンから選択されるアミノ酸によって置換されている、ＣＤ１１ｂαサブユニットのアミノ酸１４４位から３３２位を含むポリペプチドに、被験化合物を接触させる段階；ならびに
（ｂ）被験化合物がポリペプチドに結合するか否かを決定する段階
を含む、被験化合物がＣＤ１１ｂに結合する候補化合物であるか否かを決定する方法であって、ポリペプチドに結合する化合物が、ＣＤ１１ｂに結合する候補化合物である方法。 - ３３２位のイソロイシンがグリシンおよびアラニンから選択されるアミノ酸によって置換されている、ＣＤ１１ｂαサブユニットのアミノ酸１４４位から３３２位を含むポリペプチドを非ヒト哺乳類に接種する段階；ならびに
ＣＤ１１ｂの開放型を含むポリペプチドに選択的に結合する抗体を、哺乳類から単離する段階
を含む、ＣＤ１１ｂの開放型を含むポリペプチドに選択的に結合する抗体を作製する方法。 - アミノ酸３３２位のイソロイシンがグリシンおよびアラニンから選択されるアミノ酸によって置換されている、ＣＤ１１ｂαサブユニットのアミノ酸１４４位から３３２位からなるポリペプチドに、選択的に結合する抗体。
- モノクローナル抗体である、請求項１５記載の抗体。
- （ａ）アミノ酸３３２位のイソロイシンがグリシンおよびアラニンから選択されるアミノ酸によって置換されている、ＣＤ１１ｂαサブユニットのアミノ酸１４４位から３３２位を含むポリペプチドを被験化合物に接触させる段階；ならびに
（ｂ）被験化合物がポリペプチドに結合するか否かを決定する段階
を含む、被験化合物が炎症障害を治療するための候補化合物であるか否かを決定する方法であって、ポリペプチドに結合する化合物が、炎症障害を治療するための候補化合物である方法。 - アミノ酸３１３位のフェニルアラニンおよびアミノ酸３２０位のアラニンがシステインに置換されている、ＣＤ１１ｂαサブユニットのアミノ酸１４４位から３２０位を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
- アミノ酸３１３位のフェニルアラニンおよびアミノ酸３２０位のアラニンがシステインに置換されている、ＣＤ１１ｂαサブユニットのアミノ酸１４４位から３２０位を含むポリペプチド。
- アミノ酸３１５位のバリンおよびアミノ酸３２０位のアラニンがシステインに置換されている、ＣＤ１１ｂαサブユニットのアミノ酸１４４位から３２０位を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
- アミノ酸３１５位のバリンおよびアミノ酸３２０位のアラニンがシステインに置換されている、ＣＤ１１ｂαサブユニットのアミノ酸１４４位から３２０位を含むポリペプチド。
- （ａ）アミノ酸３１３位のフェニルアラニンおよびアミノ酸３２０位のアラニンがシステインに置換されている、ＣＤ１１ｂαサブユニットのアミノ酸１４４位から３２０位を含むポリペプチドに、被験化合物を接触させる段階；ならびに
（ｂ）被験化合物がポリペプチドに結合するか否かを決定する段階
を含む、被験化合物がＣＤ１１ｂに結合する候補化合物であるか否かを決定する方法であって、ポリペプチドに結合する化合物が、ＣＤ１１ｂに結合する候補化合物である方法。 - アミノ酸３１３位のフェニルアラニンおよびアミノ酸３２０位のアラニンがシステインに置換されている、ＣＤ１１ｂαサブユニットのアミノ酸１４４位から３２０位を含むポリペプチドを、非ヒト哺乳類に接種する段階；ならびに
ＣＤ１１ｂの開放型を含むポリペプチドに選択的に結合する抗体を、哺乳類から単離する段階
を含む、ＣＤ１１ｂの開放型を含むポリペプチドに選択的に結合する抗体を作製する方法。 - アミノ酸３１３位のフェニルアラニンおよびアミノ酸３２０位のアラニンがシステインに置換されている、ＣＤ１１ｂαサブユニットのアミノ酸１４４位から３２０位からなるポリペプチドに選択的に結合する抗体。
- モノクローナル抗体である、請求項２４記載の抗体。
- （ａ）アミノ酸３１３位のフェニルアラニンおよびアミノ酸３２０位のアラニンがシステインに置換されている、ＣＤ１１ｂαサブユニットのアミノ酸１４４位から３２０位を含むポリペプチドに、被験化合物を接触させる段階；ならびに
（ｂ）被験化合物がポリペプチドに結合するか否かを決定する段階
を含む、被験化合物が炎症障害を治療する候補化合物であるか否かを決定する方法であって、ポリペプチドに結合する化合物が、炎症障害を治療する候補化合物である方法。 - （ａ）アミノ酸３１５位のバリンおよびアミノ酸３２０位のアラニンがシステインに置換されている、ＣＤ１１ｂαサブユニットのアミノ酸１４４位から３２０位を含むポリペプチドに、被験化合物を接触させる段階；ならびに
（ｂ）被験化合物がポリペプチドに結合するか否かを決定する段階
を含む、被験化合物がＣＤ１１ｂに結合する候補化合物であるか否かを決定する方法であって、ポリペプチドに結合する化合物が、ＣＤ１１ｂに結合する候補化合物である方法。 - アミノ酸３１５位のバリンおよびアミノ酸３２０位のアラニンがシステインに置換されている、ＣＤ１１ｂαサブユニットのアミノ酸１４４位から３２０位を含むポリペプチドを、非ヒト哺乳類に接種する段階；ならびに
ＣＤ１１ｂの開放型を含むポリペプチドに選択的に結合する抗体を、哺乳類から単離する段階
を含む、ＣＤ１１ｂの開放型を含むポリペプチドに選択的に結合する抗体を作製する方法。 - アミノ酸３１５位のバリンおよびアミノ酸３２０位のアラニンがシステインに置換されている、ＣＤ１１ｂαサブユニットのアミノ酸１４４位から３２０位からなるポリペプチドに選択的に結合する抗体。
- モノクローナル抗体である、請求項２９記載の抗体。
- （ａ）アミノ酸３１５位のバリンおよびアミノ酸３２０位のアラニンがシステインに置換されている、ＣＤ１１ｂαサブユニットのアミノ酸１４４位から３２０位を含むポリペプチドに、被験化合物を接触させる段階；ならびに
（ｂ）被験化合物がポリペプチドに結合するか否かを決定する段階
を含む、被験化合物が炎症障害を治療する候補化合物であるか否かを決定する方法であって、ポリペプチドに結合する化合物が、炎症障害を治療する候補化合物である方法。 - ３３２位のイソロイシンがイソロイシン以外のアミノ酸で置換されている、変種ＣＤ１１ｂαサブユニットをコードする、単離された核酸分子。
- ３３２位のイソロイシンがイソロイシン以外のアミノ酸で置換されている、変種ＣＤ１１ｂαサブユニットポリペプチド。
- ３３２位のイソロイシンがイソロイシン以外のアミノ酸によって置換されているＣＤ１１ｂαサブユニットのアミノ酸１４４位から３３２位を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
- ３３２位のイソロイシンがグリシンおよびアラニンから選択されるアミノ酸によって置換されている、ＣＤ１１ｂαサブユニットのアミノ酸１４４位から３３２位を含むポリペプチド。
- ３３３位のイソロイシンがイソロイシン以外のアミノ酸で置換されている、変種ＣＤ１１ｃαサブユニットをコードする、単離された核酸分子。
- ３３３位のイソロイシンがイソロイシン以外のアミノ酸で置換されている、変種ＣＤ１１ｃαサブユニットポリペプチド。
- ＣＤ１１ｃαサブユニットのアミノ酸１４４位から３３２位からなるポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
- ３３２位のイソロイシンがイソロイシン以外のアミノ酸によって置換されている、ＣＤ１１ｃαサブユニットのアミノ酸１４４位から３３３位を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
- ３３２位のイソロイシンがイソロイシン以外のアミノ酸で置換されている、変種ＣＤ１１ｄαサブユニットをコードする、単離された核酸分子。
- ３３２位のイソロイシンがイソロイシン以外のアミノ酸で置換されている、変種ＣＤ１１ｄαサブユニット。
- ＣＤ１１ｄαサブユニットのアミノ酸１４４位から３３１位からなるポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
- ３３２位のイソロイシンがイソロイシン以外のアミノ酸によって置換されている、ＣＤ１１ｄαサブユニットのアミノ酸１４４位から３３２位を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
- ３３１位のイソロイシンがイソロイシン以外のアミノ酸で置換されている、変種ＣＤ４９ａαサブユニットをコードする、単離された核酸分子。
- ３３１位のイソロイシンがイソロイシン以外のアミノ酸で置換されている、変種ＣＤ４９ａαサブユニットポリペプチド。
- ＣＤ４９ａαサブユニットのアミノ酸１４４位から３３０位からなるポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
- アミノ酸３３１位のイソロイシンがイソロイシン以外のアミノ酸によって置換されている、変種ＣＤ４９ａαサブユニットのアミノ酸１４４位から３３２位を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
- ３６１位のイソロイシンがイソロイシン以外のアミノ酸で置換されている、変種ＣＤ４９ｂαサブユニットをコードする、単離された核酸分子。
- ３６１位のイソロイシンがイソロイシン以外のアミノ酸で置換されている、変種ＣＤ４９ｂαサブユニットポリペプチド。
- ＣＤ４９ｂαサブユニットのアミノ酸１４４位から３６０位からなるポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
- ３６１位のイソロイシンがイソロイシン以外のアミノ酸によって置換されている、ＣＤ４９ｂαサブユニットのアミノ酸１４４位から３６１位を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
- ２４９位のイソロイシンがイソロイシン以外のアミノ酸で置換されている、変種α１０αサブユニットをコードする、単離された核酸分子。
- ２４９位のイソロイシンがイソロイシン以外のアミノ酸によって置換されている、変種α１０αサブユニットポリペプチド。
- α１０αサブユニットのアミノ酸５７位から２４８位からなるポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
- アミノ酸２４９位のイソロイシンがイソロイシン以外のアミノ酸によって置換されている、α１０αサブユニットのアミノ酸５７位から２４９位を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
- アミノ酸３４９位のイソロイシンがイソロイシン以外のアミノ酸で置換されている、変種α１１αサブユニットをコードする、単離された核酸分子。
- アミノ酸３４９位のイソロイシンがイソロイシン以外のアミノ酸で置換されている変種α１１αサブユニットポリペプチド。
- α１１αサブユニットのアミノ酸１５９位から３４８位からなるポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
- アミノ酸３４９位のイソロイシンがイソロイシン以外のアミノ酸によって置換されている、変種α１１αサブユニットのアミノ酸１５９位から３４９位を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
- アミノ酸３８５位のイソロイシンがイソロイシン以外のアミノ酸で置換されている、変種αＥαサブユニットをコードする、単離された核酸分子。
- アミノ酸３８５位のイソロイシンがイソロイシン以外のアミノ酸で置換されている、変種αＥαサブユニットポリペプチド。
- α１１αサブユニットのアミノ酸１９６位から３８４位からなるポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
- アミノ酸３８５位のイソロイシンがイソロイシン以外のアミノ酸によって置換されている、α１１αサブユニットのアミノ酸１９６位から３８７位を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
- イソロイシン以外のアミノ酸がグリシンおよびアラニンからなる群より選択される、請求項３２、３４、３６、３８、３９、４０、４２、４３、４４、４６、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５６、５８、５９、６０、６２、および６３のいずれか一項記載の、単離された核酸分子。
- イソロイシン以外のアミノ酸がグリシンおよびアラニンからなる群より選択される、請求項３３、３５、３７、４１、４５、４９、５３、５５、５７、および６１のいずれか一項記載のポリペプチド。
- 請求項１５、２４、および２９のいずれか一項記載の抗体を投与する段階を含む、炎症障害を治療する方法。
- 請求項１５、２４、および２９のいずれか一項記載の抗体を投与する段階を含む、虚血−再灌流損傷を治療する方法。
- 請求項１５、２４、および２９のいずれか一項記載の抗体を投与する段階を含む、再狭窄を治療する方法。
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