JP2015517463A - 黄色ブドウ球菌感染および関連状態を処置および予防する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、黄色ブドウ球菌感染を処置および予防する方法、ならびに黄色ブドウ球菌感染の処置および予防のための新規治療法を特定する方法に関する。
黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus(「S.aureus」))は、人口の25%超に片利共生的に定着する細菌である。重要なことに、この生物は、その初期の定着部位を破壊することができ、細菌の播種および疾患をもたらす。黄色ブドウ球菌は、院内感染の主な原因であり、感染性心内膜炎ならびに皮膚および軟組織感染の最も一般的な病原体であり、食中毒の4大原因の1つである。総計で、黄色ブドウ球菌は、米国の病院内で年間120万人超の患者に感染している。ヒトの健康に対する黄色ブドウ球菌の脅威は、黄色ブドウ球菌感染に対する最後の砦と考えられる抗生物質、バンコマイシンに耐性である株を含む、抗生物質耐性株(すなわち、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)株)の出現によってさらに強調される。これらの事実は、この重要な病原体に対する新規の治療法を開発する重要性を強調する。
本発明の第1の態様は、対象における黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置する方法に関する。この方法は、黄色ブドウ球菌感染を有する危険性があるか、または有する対象を選択することと、対象における黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置するのに有効な条件の下で、CD11b阻害剤を選択された対象に投与することと、を含む。
SEQ ID NO:1
SEQ ID NO:2
SEQ ID NO:3
SEQ ID NO:4
細胞培養物
HL60およびHEK293T細胞は、37℃、5%CO2で、別段の記載がない限り、いずれも10%ウシ胎仔血清(FBS、Atlanta Biologicals)、ペニシリン(100U/ml)、およびストレプトマイシン(0.1mg/ml)(Mediatech)を補充したRPMIおよびDMEM中にそれぞれ維持した。HL60細胞は、1.5%ジメチルスルホキシド(DMSO、Sigma Aldrich)で72時間、約2.5×105でPMN−HL60細胞へと分化させた。形質導入されたHL60細胞は2μg/mlピューロマイシン中に維持した。
血液試料を、匿名の健常なドナーからバフィーコートとして得た(New York Blood Center)。New York City Blood Centerは、この研究に関与した全ての参加者から文書によるインフォームドコンセントを得た。PMNは、デキストラン勾配によって単離した。
組換えLukABを黄色ブドウ球菌から共精製するために、LukAをN末端6x−ヒスチジン(His)タグと融合させた構築物を作製した。この構築物は、最初にlukABプロモーター領域およびlukAシグナル配列を黄色ブドウ球菌ニューマンゲノムDNAからPCR増幅することによって、複数のクローニングステップを通じて作製し、6X−Hisタグをコードするヌクレオチドは、lukAシグナル配列(ss)の後に、次のプライマー:
を使用して付加した。増幅された配列を、XmaIおよびBamHIを使用して、pOS1プラスミド(Schneewind et al.,″Sorting of Protein A to the Staphylococcal Cell Wall,″Cell70(2):267−281(1992)、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)にクローニングした。次いで、lukAB遺伝子間領域を有するlukBを、黄色ブドウ球菌ニューマンゲノムDNAから次のプライマー:
を用いてPCR増幅した。この配列を、BamHIおよびPstIを用いてpOS1 PlukAB−sslukA−6Hisベクターにクローニングした。最後に、成熟lukAを、次のプライマー:
を用いてPCR増幅した。この配列を、BamHIおよびXbaIを用いてpOS1 PlukAB−sslukA−6His−lukBベクターにクローニングし、PlukAB−sslukA−6His−lukA−lukBを得た。組換えプラスミドを大腸菌DH5αに形質転換し、形質転換体をアンピシリン耐性によって選択した。陽性クローンを、黄色ブドウ球菌ニューマンΔlukABに形質転換した(Dumont et al.,″Characterization of a New Cytotoxin That Contributes to Staphylococcus aureus Pathogenesis,″Mol.Microbiol.79(3):814−825(2011)、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。
ストレプトアビジンによるプルダウン生成物の検出の場合、PMN−HL60細胞を、EZ−linkスルホ−NHS−LC−ビオチン(Thermo Scientific)と冷PBS中、30分間、4℃で回転させながらインキュベートした。急冷するために、次いで、反応細胞を冷PBS中100mMの冷グリシンで洗浄した。細胞を、EDTAを含まないプロテアーゼ阻害剤カクテル(Thermo Scientific)含有冷TBS中に再懸濁し、1% N−オクチル−β−D−グルコピラノシド(Affimetrix)を用いて30分間、4℃で回転させながら可溶化した。試料を15000rpm、4℃で30分間遠心分離し、可溶化部分を含有する上清を回収した。可溶化部分(約2×106細胞から)を、30分間、4℃で回転させながら、10μg(5μg/100万個の細胞)のHis−LukABとインキュベートするか、またはTBSとモックインキュベートした。試料を、10mMイミダゾールの存在下、50μlのニッケル樹脂と1時間、4℃で回転させながらインキュベートした。樹脂を1XPBS+50mMイミダゾールで洗浄し、タンパク質を1XPBS+500mMイミダゾールで溶出した。試料を4XSDS沸騰緩衝液中で沸騰させ、4〜15% SDS−PAGE勾配(BioRad)で80Vで流した後、ニトロセルロース膜に30Vで1時間転写した。膜をPBS中0.01% tweenで1時間ブロッキングし、次いで、1:1000のストレプトアビジン−Dylight 680(Thermo Scientific)と1時間インキュベートした。膜を乾燥させ、Odyssey赤外線撮像システム(LI−COR Biosciences)を使用して走査した。
細胞を、蛍光コンジュゲート抗体を用いて30分間氷上で染色した後、1XPBS+2%FBS+0.05%アジ化ナトリウム(FACS緩衝液)で洗浄した。非コンジュゲート抗体の場合は、細胞を、一次抗体抗体を用いて30分間氷上で染色した後、FACS緩衝液で洗浄し、蛍光コンジュゲート二次抗体を用いて30分間氷上で染色した後、FACS緩衝液で洗浄した。全てのFACSデータは、FACSDivaソフトウェアを使用し、LSRIIフローサイトメーター(BD Biosciences)で取得した。データは、Flowjoソフトウェア(Treestar)を使用して分析した。
一次ヒト細胞およびヒト細胞系の表面染色に使用される抗体としては、次が挙げられる:抗CD11b−APC(クローンICRF44)、抗CD18−PE/Cy5(クローンTS1/18)、抗CD11a−FITC(クローンHI111)、および抗CD11c−PerCP/Cy5.5(クローンBu15)(Biolegend)。LukABとCD11bとの相互作用をマッピングするための抗体としては、上に列挙されるヒト特異的抗体の非コンジュゲート型ならびにLM2/1(Santa Cruz)およびCBRM1/5(BioLegend)抗CD11bクローンが挙げられる。I欠失CD11bを検出するために、ヤギ抗CD11b(ポリクローナル)を抗ヤギIgG−APC(R&D Systems)とともに使用した。
HEK293T細胞を、製造者の指示に従い、Lipofectamine 2000(Invitrogen)を使用して、全長ヒトCD11b cDNA(OriGene)を含有するpCMV6−XL5プラスミドまたは空ベクターとインキュベートした。トランスフェクション効率は、GFP生成対照ベクターで決定されるように70〜80%の間であり、CD11b表面レベルは、フローサイトメトリーにより48時間後に決定された。この時点で、LukABまたはPVLに対する感受性が、40μg/mlの各毒素またはPBSを2時間、37℃、5% CO2で細胞に添加することによって決定された。次いで、細胞を洗浄し、α−CD11b−APC(クローンICRF44)で染色した。CD11b+細胞の枯渇は、フローサイトメトリーによって測定し、PBS処置されたCD11b+細胞のパーセントを100%に正規化した。
ヒトCD11bからのIドメインの欠失は、オーバーラップPCRによって達成され、Iドメインの5′セグメント上流およびIドメインの3′セグメント下流が、ヒトCD11b cDNA(OriGene)を含有するpCMV6−XL5ベクターから増幅された。5′UTRを含まないがKozak配列を含むCD11bの5′セグメントの増幅の場合、次のプライマー:
を使用した。CD11bの3′セグメントの増幅の場合、次のプライマー:
を使用した。2つのセグメントを、次のプライマー:
を使用して、オーバーラップPCRによって連結した。野生型(WT)ヒトCD11bも、この最後のプライマーセットでOriGeneプラスミドから増幅させた。増幅された配列を、XbaIおよびNotIを使用してpLenti−CMV−GFP−Puro(Addgene)にクローニングし、pLenti−CMV−hCD11b−puroおよびpLenti−CMV−I欠失hCD11b−puro構築物を得た。組換えプラスミドを大腸菌RecA−5α(New England BioLabs)に形質転換し、形質転換体を、アンピシリン耐性によって選択した。
レンチウイルスのshRNA発現ベクターのストックを、前述の通り(Unutmaz et al.,″Cytokine Signals are Sufficient for HIV−1 Infection of Resting Human T Lymphocytes,″J.Exp.Med.189(11):1735−1746(1999)、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)、HEK293T細胞に次のプラスミド:pMDG gag−pol、pRSV−Rev、pVSV−G Env、およびSIGMA MISSION TRC 1.5ライブラリーから購入したpLKO.1CD11bまたはCD18 shRNA構築物をリン酸カルシウムコトランスフェクションすることによって、生成した。次のshRNA配列:
をCD11bに対して使用し、
をCD18に対して使用した。上清を48時間後に回収し、遠心分離して濾過し、細胞残渣を除去し、前述の通りJurkat細胞上で力価を測定した(Unutmaz et al.,″Cytokine Signals are Sufficient for HIV−1 Infection of Resting Human T Lymphocytes,″J.Exp.Med.189(11):1735−1746(1999)、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。HL60細胞を、それぞれのウイルスまたは空ベクター対照ウイルスで72時間形質導入した後、2μg/mlのピューロマイシンで選択し、これは約95〜99%の形質導入されていない細胞を殺滅させることが決定された。生存細胞を増殖させ、ノックダウンをフローサイトメトリーによって確認した。
マウスPECを、加熱殺菌された黄色ブドウ球菌を用いて前述の通り誘発した(Alonzo et al.,″CCR5 is a Receptor for Staphylococcus aureus Leukotoxin ED,″Nature 493(7430):51−55(2013)、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。
組換えN末端フルオレセイン標識LukABを作製するために、黄色ブドウ球菌ニューマンゲノムDNAからのLukAの成熟タンパク質コード配列をPCR増幅し、次のプライマー:
を使用して、システインをシグナル配列の後のN末端に付加した。増幅された配列を、BamH1およびXbalを使用して、上記の通りPlukAB−sslukA−6His−lukBにクローニングした。組換えプラスミドを大腸菌DH5αに形質転換し、形質転換体を、アンピシリン耐性によって選択した。陽性クローンを、黄色ブドウ球菌ニューマンΔlukABに形質転換した(Dumont et al.,″Characterization of a New Cytotoxin That Contributes to Staphylococcus aureus Pathogenesis,″Mol.Microbiol.79(3):814−825(2011)、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。タンパク質を上記の通り黄色ブドウ球菌から精製し、20倍モル過剰のAlexa Fluor−488 C5マレイミド(Invitrogen)で終夜、4℃で攪拌しながら標識化した。10%グリセロール含有TBS中で10kDa分子量カットオフ透析カセットを用いた透析によって過剰な色素を除去した。標識タンパク質の活性をサイトメトリーアッセイによって確認した。
C末端3XFlagタグおよびN末端6X−Hisタグを有する組換えヒトおよびマウスCD11b Iドメインを作製するために、ヒトおよびマウスIドメインをpCMV6−XL5およびpCMV−EntryヒトおよびマウスCD11b cDNA構築物(OriGene)からそれぞれ増幅させた。C末端6X−グリシンリンカーに続いて3X−Flagタグを有するヒトIドメインの増幅の場合、次のプライマーを使用した:
。C末端6X−グリシンリンカーに続いて3X−Flagタグを有するマウスIドメインの増幅の場合、次のプライマーを使用した:
。ベクターがコードする6X−Hisタグが、IドメインのN末端に存在するように、増幅された配列を、NdeIおよびXhoIを用いてpET15bベクター(Novagen)にクローニングした。組換えプラスミドを大腸菌T7 LysY lacQに形質転換し、形質転換体を、アンピシリン耐性によって選択した。
5〜0.156μgの精製された組換えヒトおよびマウスCD11b Iドメインを、ドットブロット真空(BioRad)を使用してPVDF膜に吸収させた。膜を1X TBS中2%BSAで1時間ブロッキングし、次いで、TBS+2% BSA中5μg/mlの精製されたFITC−LukABと1時間インキュベートした。競合アッセイの場合、10倍過剰(50μg/ml)の非標識精製LukABまたはPVLも膜とインキュベートした。FITC−LukABの結合は、Odyssey赤外線撮像システムを使用して検出し、AlphaImagerソフトウェアを使用して、デンシトメトリーによって定量化した。
表面プラズモン共鳴(SPR)は、前述の通りBiacore T100システム(GE)を使用して実行した(Huergo et al.,″The Campylobacter Jejuni Dps Protein Binds DNA in the Presence of Iron or Hydrogen Peroxide,″J.Bacteriol.(2013)、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。簡単に言うと、組換えMAC−1(R&D Systems)または組換えIドメイン(マウスおよびヒト)を、NHS捕捉キットを使用して、シリーズSセンサーチップCM5(GE)のフローセル2〜4の上に固定化し、フローセル1をブランク固定化として実行した。LukABおよびその変異体を、マルチサイクルカイネティクスを使用して、0.625〜25ug/mLの範囲の濃度で流し、各相互作用に対し少なくとも3回の実験を行った。シングルサイクルカイネティクスを利用し、マルチサイクルカイネティクスの完了前に濃度を最適化した。全てのSPR実験の流動緩衝液は、pH6.8の1xPBSであった。
細胞を前述の通り中毒化した(Dumont et al.,″Characterization of a New Cytotoxin That Contributes to Staphylococcus aureus Pathogenesis,″Mol.Microbiol.79(3):814−825(2011)、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。簡単に言うと、1ウェル当たり1×105個の細胞を、1〜2時間、37℃、5% CO2で、表示された濃度の精製組換えLukABで中毒化した。細胞膜損傷、毒素孔形成、または細胞代謝を、SYTOXグリーン(Invitrogen)、臭化エチジウム(MP biomedicals)、またはCellTiter(Promega)でそれぞれ評価した。抗インテグリン抗体を用いた実験の場合、抗体を中毒化の30分前に室温で添加し、抗体は中毒化の間存在した。
これらの感染は、ΔlukAB、lukABで染色体的に補完されたΔlukAB(ΔlukAB::lukAB)、または野生型(WT)USA300クローン型LAC株を用いて前述の通り行った。簡単に言うと、細胞外黄色ブドウ球菌によるPMNまたはPMN−HL60の殺滅を決定するために、正規化されたUSA300を、1ウェル当たり1×105個の細胞と、感染多重度(MOI)100、50、10、または1で、37℃、5% CO2で1〜2時間インキュベートした。抗インテグリン抗体を用いた実験の場合、抗体を感染の30分前に室温で添加し、抗体は感染の間存在した。膜損傷は、SYTOXグリーンを使用して評価した。
PMNを、構成的にGFPを発現するようにpOS1−PsarA−sod RBS−sgfpで形質転換されたオプソニン化LAC WT、ΔlukAB、およびΔlukAB::lukAB株に感染させた。
データは、別段の指示がない限り、一元配置分散分析およびターキーの多重比較事後試験(GraphPad Prism 第5.0版、GraphPad Software)を使用して分析した。本明細書に提示されるデータは、別段の指示がない限り、同様の結果をもたらした少なくとも3つの独立した実験のうちの1つに由来する。
ヒト多形核細胞を、同質遺伝子型の野生型およびlukAB変異体(ΔlukAB)メチシリン感受性黄色ブドウ球菌(MSSA)およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)株から単離された分泌タンパク質に曝露した。野生型黄色ブドウ球菌株からの分泌タンパク質へのPMNの曝露は、CellTiterアッセイによって調べられる強力な細胞死をもたらした(図1A、黒色バー)。対照的に、lukAB変異体株からの分泌タンパク質へのPMNの曝露は、細胞死を著しく低減させた(図1A、灰色バー)。ΔlukAB株によりもたらされた細胞毒性活性の欠失は、図1Aに示されるように(白色バー)、lukABを発現するプラスミドで株を形質転換することによって回復した(ΔlukAB/pLukAB)。これらのデータは、LukABが、ヒト好中球に対するMSSAおよびMRSA株両方の細胞毒性特性に関与することを示す。
LukABと相互作用する宿主タンパク質を特定するために、LukABに対し極めて敏感であるHL60骨髄細胞系から分化された短命の好中球様細胞であるPMN−HL60細胞を用いて、プルダウンアッセイを行った(Dumont et al.,″Characterization of a New Cytotoxin That Contributes to Staphylococcus aureus Pathogenesis,″Mol.Microbiol.79(3):814−825(2011)、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。溶解物をHisタグ付きLukABとインキュベートし、ニッケルカラムを使用して毒素−宿主タンパク質複合体を単離した。PMN−HL60細胞上の表面タンパク質を、LukABとのインキュベーション前にビオチン化し、宿主タンパク質が、蛍光コンジュゲートストレプトアビジンを使用して可視化され得るようにする(図4A)。この技術を用いることによって、多数の宿主タンパク質がLukABと会合することが観察された(図4A)。ビオチン化なしでヒト血液から単離された一次ヒトPMNを用いてプルダウンを繰り返し、LukABによるプルダウン中に富む細胞因子の識別および量を、質量分析によって決定した。最も豊富なLukAB相互作用細胞表面タンパク質は、CD18およびCD11bであり(表1)、これらはそれぞれ、インテグリンαM/β2、CR3、またはMac−1として知られ本明細書ではMac−1と呼ばれるインテグリン複合体のαおよびβ成分である。LukEDまたはPVLではなく、LukABとCD11bとの会合は、CD11b特異的抗体を用いた免疫ブロットによって確認した(図4B)。LukABとMac−1との特異的および直接相互作用は、プルダウンが精製された組換え毒素および精製された受容体を用いて行われたときに確認された。総タンパク質染色は、LukEDまたはPVLではなくLukABが、それぞれ約150kDaおよび95kDaである、精製されたMac−1複合体のCD11bおよびCD18サブユニットの両方をプルダウンすることができることを明らかにした(図4C)。免疫ブロットは、他の毒素ではなく、LukABによるプルダウンにおけるCD11bの存在をさらに検証した(図4D)。
LukABに対する細胞の感受性とMac−1との関連を提供するために、HL60細胞を、非標的化shRNA(NT shRNA)またはCD18 shRNAを含有するウイルスで形質導入した。これらの細胞のLukABへの感受性を強化するために、安定的に形質導入されたHL60細胞系をPMN−HL60に分化させ(図5A)、CD18およびCD11bの細胞表面レベルに対するshRNAの効果をフローサイトメトリーによって確認した(図5B)。NT shRNA細胞と比較して、CD18 shRNA細胞は、CD18を顕著に枯渇した(図5B)。CD18は、全てのインテグリンαサブユニットの安定性および表面局在化に必要であるため(Weber et al.,″Characterization of Lymphocyte Function−Associated Antigen 1(LFA−1)−Deficient T Cell Lines:The AlphaL and Beta2 Subunits are Interdependent for Cell Surface Expression,″J.Immunol.158(1):273−279(1997)、Springer et al.,″Inherited Deficiency of the Mac−1,LFA−1,p150,95 Glycoprotein Family and Its Molecular Basis,″J.Exp.Med.160(6):1901−1918(1984)、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる)、CD11bもCD18 shRNA細胞において枯渇した(図5B)。したがって、CD18を標的化することによって、Mac−1枯渇細胞系を作製した。精製されたLukABを用いたCD18 shRNA細胞の中毒化は、Mac−1がLukAB孔の形成に必要であることを明らかにした(図5C)。対照的に、PVLは、Mac−1非依存的に孔を形成した。これは、LukABおよびPVLが異なる細胞決定因子を利用してそれらの細胞毒性を作用させることを示す(図5C)。
LukAB細胞毒性が、CD11b特異的抗体でブロックされ得るかどうかを調べた。LukABで中毒化する前に、一次PMNを、CD11bを標的化する3つの異なる抗体、ならびにCD18、CD11a、およびCD11cに対する抗体で前処置した。全ての3つのCD11b抗体およびCD18抗体は、ある程度のLukAB毒性のブロッキングを示すが、LM2/1 CD11b抗体のみが、未処置の細胞またはアイソタイプ対照と比較したときに、LukAB活性を著しく阻害した(図7A〜7B)。
精製されたLukABは、ヒトおよびサルPMNに対して高度に細胞毒性であり、ウサギPMNに対して中度に毒性であり、マウスPMNに対して低度に毒性であることが示された(図3)(Malachowa et al.,″Staphylococcus aureus Leukotoxin GH Promotes Inflammation,″J.Infect.Dis.206(8):1185−1193(2012)、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。これらの所見は、LukABが、血液精製されたPMNを種特異的に標的化することを示唆する。LukEDに対して高度に感受性であるマウス腹腔滲出細胞(PEC)は、LukABに対し耐性である(図8A)。PECは、主に動員されたPMN(Ly6G+/CD11b+)、ならびに単球およびマクロファージ(Ly6G−/CD11b+)からなり、それら全てが高レベルの表面CD11bを有する(図8B)。
黄色ブドウ球菌感染におけるCD11bの役割を確認するために、NTまたはCD11b shRNA PMN−HL60細胞を、CA−MRSA USA300株LACまたはLukABを欠失する同質遺伝子型変異体(ΔlukAB)に感染させた。WT USA300は、LukAB依存的にNT PMN−HL60細胞を殺滅した(図9A)。対照的に、CD11b表面レベルが、shRNA(CD11b)によってこれらの細胞で低減されるとき、WT USA300は、もはや細胞損傷を引き起こさず、代わりにlukAB変異体株に類似する(図9A)。
貪食後のLukAB媒介性細胞損傷が、PMN内からのUSA300の早期脱出および続くUSA300の増殖を促進することが近年確認された。CD11bがLukABの細胞内細胞毒性活性に寄与するかどうかを決定するために、NTおよびCD11b shRNA PMN−HL60細胞をオプソニン化USA300に感染させ、同期させて貪食を促進した。重要なことに、CD11bの枯渇は、USA300の貪食に影響しなかった(図10A〜10B)。これらの条件下で、CD11bのノックダウンにより、WT USA300によって引き起こされる細胞損傷が消失した(図11A)。
この研究は、細胞を特異的に標的化および殺滅するためにブドウ球菌ロイコトキシンLukABによって利用される細胞分子としての、Mac−1インテグリンのCD11bの特定について説明する。この結論は、LukABが、Mac−1複合体(特にCD11bのIドメイン)と直接相互作用し、ノックダウンおよび機能獲得分析によって証明されるように、CD11bが、細胞をLukABに対して感受性にするのに必要かつ十分であるという所見によって支持される。
Claims (38)
- 対象における黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置する方法であって、
黄色ブドウ球菌感染を有するか、または有する危険性のある対象を選択することと、
前記対象における黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置するのに有効な条件の下で、CD11b阻害剤を前記選択された対象に投与することと、を含む、方法。 - 前記黄色ブドウ球菌感染が、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)感染またはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌(MSSA)感染である、請求項1に記載の方法。
- 前記CD11b阻害剤が、タンパク質またはペプチド阻害剤を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記CD11b阻害剤が、組換え好中球阻害因子(rNIF)である、請求項3に記載の方法。
- 前記CD11b阻害剤が、LukAB受容体結合ドメインを含む組換え可溶性タンパク質またはペプチドである、請求項3に記載の方法。
- 前記組換え可溶性タンパク質またはペプチドが、SEQ ID NO:2の残基147〜337に対応するアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の方法。
- 前記CD11b阻害剤が、CD11b特異的抗体である、請求項1に記載の方法。
- 前記CD11b特異的抗体が、CD11bのIドメインに結合する、請求項7に記載の方法。
- 前記CD11b阻害剤が、小分子阻害剤である、請求項1に記載の方法。
- 前記CD11b阻害剤が、2−[4−(3,4−ジヒドロ−2H−キノリン−1−イル)−ブタ−1,3−ジエニル]−1−チルナフト[1,2−d]チアゾール−1−イウム;クロリド、1−エチル−2−/3−/1−エチルベンゾチアゾリン−2−イリジエン/プロペニル/−チアゾリウム,ヨージド、およびそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記選択された対象に、前記CD11b阻害剤と併せて、抗感染剤、抗生物質、および抗菌剤からなる群から選択される薬剤を投与することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 黄色ブドウ球菌感染から生じる状態が、処置または予防され、前記状態が、皮膚創傷および感染、組織膿瘍、毛包炎、骨髄炎、肺炎、熱傷様皮膚症候群、敗血症、化膿性関節炎、心筋炎、心内膜炎、ならびに毒素性ショック症候群からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記投与が、経口的に、吸入によって、鼻腔内滴下によって、局所的に、経皮的に、非経口的に、皮下に、静脈内注射、動脈内注射、筋肉内注射、胸膜内に、腹腔内に、または粘膜への適用によって行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記投与を繰り返すことをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記対象が、乳幼児、若年者、または成人である、請求項1に記載の方法。
- 前記対象が、免疫無防備状態の乳幼児、若年者、または成人である、請求項1に記載の方法。
- 前記黄色ブドウ球菌感染および/または前記黄色ブドウ球菌感染から生じる状態が予防される、請求項1に記載の方法。
- 前記黄色ブドウ球菌感染および/または前記黄色ブドウ球菌感染から生じる状態が処置される、請求項1に記載の方法。
- ゲノムが安定的に組み込まれた発現構築物を含む、トランスジェニック非ヒト動物であって、前記発現構築物が、ヒトCD11bをコードするポリヌクレオチド配列を含む、トランスジェニック非ヒト動物。
- 前記発現構築物が、ヒトCD11bをコードする前記ポリヌクレオチド配列に機能的に連結された白血球特異的プロモーターをさらに含む、請求項19に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記動物が、齧歯類である、請求項19に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記動物が、マウスである、請求項19に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置するのに適した候補化合物を特定する方法であって、
候補化合物のコレクションを提供することと、
請求項19に記載のトランスジェニック非ヒト動物を、LukAB媒介性白血球死を誘導することができる作用物質に曝露することと、
前記コレクションからの1つ以上の候補化合物を、前記トランスジェニック動物に投与することと、
前記1つ以上の候補化合物が投与された前記トランスジェニック動物におけるLukAB媒介性白血球死のレベルを測定することと、
前記1つ以上の候補化合物が投与された前記トランスジェニック動物における前記LukAB媒介性白血球死のレベルを、前記1つ以上の候補化合物が投与されなかったトランスジェニック動物におけるLukAB媒介性白血球死の対照レベルと比較することと、
前記比較に基づき、前記対照レベルと比較して前記トランスジェニック動物における前記LukAB媒介性白血球死のレベルを低減する前記コレクションの候補化合物を、黄色ブドウ球菌および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置するのに適した化合物として特定することと、を含む、方法。 - 前記作用物質が、黄色ブドウ球菌である、請求項23に記載の方法。
- 前記作用物質が、単離された黄色ブドウ球菌LukABタンパク質を含む、請求項23に記載の方法。
- 前記作用物質が、組換えにより生成されたLukABタンパク質を含む、請求項23に記載の方法。
- 前記投与が、前記曝露の前に行われる、請求項23に記載の方法。
- 前記投与が、前記曝露の後に行われる、請求項23に記載の方法。
- 黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置するのに適した候補化合物を特定する方法であって、
候補化合物のコレクションを提供することと、
請求項19に記載のトランスジェニック非ヒト動物を黄色ブドウ球菌に曝露することと、
前記コレクションからの1つ以上の候補化合物を、前記トランスジェニック動物に投与することと、
前記1つ以上の候補化合物が投与された前記トランスジェニック動物における黄色ブドウ球菌感染レベルを測定することと、
前記1つ以上の候補化合物が投与された前記トランスジェニック動物における前記黄色ブドウ球菌感染レベルを、前記1つ以上の候補化合物が投与されていないトランスジェニック動物における対照黄色ブドウ球菌感染レベルと比較することと、
前記比較に基づき、前記対照黄色ブドウ球菌感染レベルと比較して前記トランスジェニック動物における黄色ブドウ球菌感染レベルを低減する候補化合物を、黄色ブドウ球菌および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置するのに適した化合物として特定することと、を含む、方法。 - 前記投与が、前記曝露の前に行われる、請求項29に記載の方法。
- 前記投与が、前記曝露の後に行われる、請求項29に記載の方法。
- 黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置することができる化合物を特定する方法であって、
候補化合物のコレクションを提供することと、
ヒトCD11bを発現する細胞の集団を提供することと、
前記細胞の集団をLukAB媒介性細胞毒性を誘導することができる作用物質で処置することと、
前記処置された細胞の集団を、前記候補化合物のコレクションからの1つ以上の候補化合物と接触させることと、
前記1つ以上の候補化合物の存在下および非存在下で、前記処置された細胞の集団におけるLukAB媒介性細胞毒性レベルを測定することと、
前記1つ以上の候補化合物の存在下と非存在下とで、前記測定されたLukAB媒介性細胞毒性レベルを比較することと、
前記比較に基づき、候補化合物を特定することであって、前記1つ以上の候補化合物の非存在下と比較して、前記1つ以上の候補化合物の存在下での前記LukAB媒介性細胞毒性レベルの減少により、黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置することができる1つ以上の化合物が特定される、ことと、を含む、方法。 - 細胞毒性の標識マーカーを提供することと、
前記ヒトCD11bを発現する細胞の集団を、前記処置中に前記細胞毒性の標識マーカーに曝露することと、
前記細胞毒性の標識マーカーを検出することであって、前記細胞集団におけるLukAB媒介性細胞毒性レベルの前記測定が、前記検出に基づいている、ことと、をさらに含む、請求項32に記載の方法。 - 前記細胞毒性の標識マーカーが、細胞生死判別色素、細胞不透過性色素、および/または細胞溶解のマーカーを含む、請求項33に記載の方法。
- 前記ヒトCD11bを発現する細胞が、白血球である、請求項32に記載の方法。
- 前記ヒトCD11bを発現する細胞が、ヒトCD11bおよび/またはCD11b/CD18を発現するように操作されたヒトまたは非ヒト有核細胞である、請求項32に記載の方法。
- 黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置することができる候補化合物を特定する方法であって、
候補化合物のコレクションを提供することと、
LukAB結合ドメインを含む単離されたCD11b受容体またはそのフラグメントを提供することと、
前記単離されたCD11b受容体またはそのフラグメントを、標識LukA、LukB、および/または標識LukABタンパク質を含む作用物質で処置することと、
前記処置された、単離されたCD11b受容体またはそのフラグメントを、前記コレクションからの1つ以上の候補化合物と接触させることと、
1つ以上の候補化合物の存在下および非存在下での、前記単離されたCD11b受容体またはそのフラグメントへの前記標識LukA、LukB、および/または標識LukABの結合レベルを測定することと、
前記1つ以上の候補化合物の存在下と非存在下とで、前記単離されたCD11b受容体またはそのフラグメントへの前記LukA、LukB、および/またはLukABの結合レベルを比較することと、
前記比較に基づいて、黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置することができる1つ以上の候補化合物を特定することと、を含む、方法。 - 前記1つ以上の候補化合物の非存在下と比較して、前記1つ以上の候補化合物の存在下での前記単離されたCD11b受容体またはそのフラグメントへのLukA、LukB、および/またはLukAB結合の減少により、前記1つ以上の候補化合物が、黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置することができるとして特定される、請求項37に記載の方法。
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