JP2004520270A - ヒストン中のメチル化されたリジンに特異的な抗体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、メチルリジンに特異的なヒストンの抗体の生成に関する。特に、Ｈ３ リジン４メチル化特異的抗体（Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３）は、リジン４でメチル化されたヒストンＨ３に結合する。ヒストンＨ３のリジン４（Ｋ４）のメチル化は、クロマチンの転写的に活性な領域に関連している。第二の抗体であるＨ３ リジン９メチル化特異的抗体（Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３）は、リジン９でメチル化されたヒストンＨ３に特異的に結合する。ヒストンＨ３のリジン９（Ｋ９）のメチル化は、遺伝子のサイレンシングに関連している。これらの抗体は、ヘテロクロマチンおよびユークロマチンの領域の同定ならびに診断的手段およびスクリーニング手段としての利用に有用である。
Description
【０００１】
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下で、２００１年７月３日出願の米国仮特許出願番号第６０／３０２，７４７号および２０００年８月２５日出願の米国仮特許出願番号第６０／２２７，７６７号（これらの開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）の優先権を主張する。
【０００２】
（米国政府の権利）
本発明は、国立衛生研究所により賞与された助成金番号ＲＯ１ ＧＭ４０９２２およびＲＯ１ ＧＭ５３５１２の下で、米国政府の支持により行われた。米国政府は本発明の特定の権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、ヒストンタンパク質の翻訳後修飾により生成されたヒストンエピトープに結合する抗体、このような抗体を含む組成物、および診断手段およびスクリーニング手段としてのこのような組成物の使用に関する。
【０００４】
（発明の背景）
真核生物において、ＤＮＡは、ヒストンタンパク質と複合体化され、クロマチンの反復サブユニットであるヌクレオソームを形成する。このＤＮＡのパッケージングは、ＤＮＡをテンプレートにするプロセス（例えば、転写または複製）のために、タンパク質がＤＮＡへのアクセスを求めることに厳重な制限を課している。ヒストンアミノ末端の翻訳後修飾が、真核生物細胞ゲノムのクロマチン構造の決定および細胞内遺伝子の発現の調節において重要な役割を果たしていることがますます明らかになってきた。
【０００５】
ヒストンアミノ末端の翻訳後修飾は、クロマチンの構造および機能の制御において中心的な役割を果たすと長い間考えられてきた。ヒストンの多くの共有結合修飾が証明されており、これには、ヒストンのアミノ末端「テール」ドメインに生じるアセチル化、リン酸化、メチル化、ユビキチン化、およびＡＤＰリボシル化が挙げられる。修飾の型におけるこのような多様性およびこれらの修飾を生じる残基の顕著な特異性は、未知のままの複雑な階層の順序（ｏｒｄｅｒ）および組み合わせの機能を示唆する。ヒストンアミノ末端に生じる公知の共有結合修飾のうちアセチル化は、おそらく最も研究され、そして理解されている。最近の研究は、クロマチンにおける標的プロモーターへのそれらの補充に応答して、ヒストンにおいてそれぞれ特異的にリジン残基をアセチル化または脱アセチル化する、予め特徴付けられたコアクチベーターおよびコサプレッサーを同定している（Ｂｅｒｇｅｒ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．１１，３３６−３４１を参照のこと）。これらの研究は、クロマチンの再構築が、ヌクレオソームテンプレートからの転写の調節において基本的な役割を果たしている有力な証拠を提供する。
【０００６】
高等真核生物の染色体は、ユークロマチンおよびヘテロクロマチン（これらは、基礎をなすＤＮＡ配列の凝縮の程度および転写活性のレベルにより識別される）の領域からなると歴史的に考えられてきた。構成的なヘテロクロマチンの特定領域はセントロメアのような特徴的な構造においてかまたはその周囲において見出され、そして遺伝子学的に不活性な反復配列の大部分から構成される。対照的に、同様な初期のＤＮＡ配列を有する他の領域は、クロマチンのいずれかの型の特徴を示し得、これは、ヒストンおよびクロマチン関連タンパク質によるＤＮＡのパッケージングのような後成的因子が、それらの遺伝子座でヘテロクロマチン状態を決定することを示唆している。
【０００７】
特定の翻訳後修飾を保有するヒストンを特異的に認識する抗体の使用によって、出願人らは、「ヒストンコード」を解明している。特に、ヒストンタンパク質およびその関連する共有結合修飾が、クロマチン構造を変更し得るメカニズムに寄与することの証拠が明らかになっており、それにより、転写的な「オン−オフ」状態における遺伝的な相違、または特定の高次構造を規定することによる染色体の安定な伝搬を導く。
【０００８】
ヒストンメチル化は、よく理解されていないヒストンに影響を与える翻訳後修飾の１つである。初期の研究は、Ｈ３およびＨ４が、メチル化よって修飾される主要なヒストンであることを示唆し、そして大量のヒストンを用いる配列決定の研究は、いくつかのリジン（例えば、Ｈ３の９および２７ならびにＨ４の２０）が、種特異的な相違が存在するようではあるけれども、しばしばメチル化の好ましい部位であることを示唆する。興味深いことに、各々の修飾されたリジンは、モノメチル化、ジメチル化、またはトリメチル化される能力を有し得、この翻訳後の「標識」に対する別のレベルのバリエーションをさらに加える。本発明は、特異的リジンでメチル化されるヒストンＨ３およびＨ４に特異的である抗体に関する。より詳細には、本発明の１つの局面は、ヒストンＨ３のリジン４および９に関する。これら２つのリジン残基は、インビボにおいてメチル化されることが見出され、そしてメチル化された形態はそれぞれユークロマチンおよびヘテロクロマチンに関連する。
【０００９】
（定義）
本発明の明細書および請求項において、以下の用語は下に記載される定義に従って使用される。
【００１０】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸」とは、ＲＮＡおよび一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡならびにｃＤＮＡを含む。さらに、用語「核酸」、「ＤＮＡ］、「ＲＮＡ］および類似の用語はまた、核酸アナログ（すなわち、リン酸ジエステル骨格以外を有するアナログ）が挙げられる。例えば、いわゆる「ペプチド核酸」（当該分野に公知であり、骨格にリン酸ジエステル結合のかわりにペプチド結合を有する）は、本発明の範囲内と考えられる。
【００１１】
用語「ペプチド」は、３以上のアミノ酸配列を有し、ここで、このアミノ酸は天然に存在するアミノ酸または合成（天然には存在しない）アミノ酸である。ペプチド模倣物としては、１つ以上の以下の修飾を有するペプチドが挙げられる：
１．１つ以上のペプチジル（ｐｅｐｔｉｄｙｌ）−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−−連結（結合）が以下のような非ペプチジル連結によって置換されているペプチド：−−ＣＨ２−カルバメート連結（−−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−−），ホスホネート結合、−ＣＨ２−スルホンアミド（−ＣＨ２−−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ−）連結、尿素（−−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−−）連結、−−ＣＨ２−二級アミン連結、またはアルキル化ペプチジル連結（−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−−）、ここで、ＲＣ１〜Ｃ４アルキルである；
２．Ｎ−末端が以下に誘導されるペプチド：−−ＮＲＲ１基、−−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ基、−−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ基、−−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ基、ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ基、ここで、ＲおよびＲ１は、水素であるか、またはＣｌ〜Ｃ４アルキルであり、ただし、ＲおよびＲｌは両方とも水素ではない；
３．Ｃ末端が以下に誘導されるペプチド：−−Ｃ（Ｏ）Ｒ２、ここで、Ｒ２は、Ｃｌ〜Ｃ４アルコキシおよび−−ＮＲ３Ｒ４からなる群より選択され、ここで、Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素およびＣ１〜Ｃ４アルキルからなる群より選択される。
【００１２】
ペプチドにおいて天然に存在するアミノ酸残基は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨されるように、以下のように省略される：フェニルアラニンはＰｈｅまたはＦであり；ロイシンはＬｅｕまたはＬであり；イソロイシンはＩｌｅまたはＩであり；メチオニンはＭｅｔまたはＭであり；ノルロイシンはＮｌｅであり；バリンはＶａｔまたはＶであり；セリンはＳｅｒまたはＳであり；プロリンはＰｒｏまたはＰであり；スレオニンはＴｈｒまたはＴであり；アラニンはＡｌａまたはＡであり；チロシンはＴｙｒまたはＹであり；ヒスチジンはＨｉｓまたはＨであり；グルタミンはＧｌｎまたはＱであり；アスパラギンはＡｓｎまたはＮであり；リジンはＬｙｓまたはＫであり；アスパラギン酸はＡｓｐまたはＤであり；グルタミン酸はＧｌｕまたはＥであり；システインはＣｙｓまたはＣであり；トリプトファンはＴｒｐまたはＷであり；アルギニンはＡｒｇまたはＲであり；グリシンはＧｌｙまたはＧであり、そしてＸは、任意のアミノ酸である。他の天然に存在するアミノ酸としては、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリジンといったようなものなどが挙げられる。
【００１３】
本明細書中で使用される場合、用語「保存的アミノ酸置換」は、以下の５つの群のうち１つ以内の交換として本明細書中で規定される：
Ｉ．小さな脂肪族の非極性またはわずかに極性な残基：
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
ＩＩ．負に荷電した極性残基およびそのアミド：
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
ＩＩＩ．正に荷電した極性残基：
Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
ＩＶ．大きな脂肪族の非極性残基：
Ｍｅｔ Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ
Ｖ．大きな脂肪族残基：
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、用語「精製された」および類似の用語は、ネイティブかまたは自然環境における分子または化合物に関連する典型的な混入物を実質的に含んでいない形態における分子または化合物の単離をいう。
【００１５】
「作動可能に連結（される）」とは、化合物がそれらの通常の機能を実施するために構成されるような並列をいう。例えば、制御配列またはコード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、コード配列の発現を行う能力がある。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、用語「相補的（な）」または「相補性」とは、塩基対合則に関連するポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチド配列）を参照して使用される。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」にとって相補的な配列は、配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」である。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、用語「ハイブリダイゼーション」とは、相補的な核酸の対を参照して使用される。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強さ（すなわち、核酸間の結合の強さ）は、核酸間の相補性の程度、関連するストリンジェンシーの条件、形成されるハイブリッドの長さ、および核酸内でのＧ：Ｃ比率のような要素により影響を受ける。
【００１８】
「治療剤」、「薬剤」または「薬物」とは、患者における疾病、苦痛、疾患または傷害の処置（予防、診断、軽減、または治癒を含む）において使用され得る任意の治療剤または予防剤をいう。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、用語「処置する（こと）」とは、特異的な障害または状態に関連する症状を軽減させること、および／あるいは前記の症状を予防するかまたは取り除くことを含む。例えば、癌の処置としては、癌細胞の増殖および／もしくは分裂を予防するか、または遅らせること、ならびに癌細胞を死滅させることが挙げられる。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、用語「薬学的受容可能なキャリア」とは、標準的な薬学的キャリア（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、水およびエマルジョン（例えば、油／水または水／油のエマルジョン）、ならびに種々の型の湿潤剤）のいずれかを含む。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｈ３リジン４の抗原性フラグメント」とは、ヒストン３のアミノ末端の天然ペプチドフラグメント（配列番号１、配列番号２、および配列番号３のペプチドフラグメントを含む）およびそれらのフラグメントの合成等価物の両方を含む。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体あるいはそれらの結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント）をいう。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体またはＭｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体の用語「生物学的に活性なフラグメント」とは、それぞれ配列番号４または配列番号５のペプチドに特異的に結合する能力のある、それぞれの全長抗体の、天然部分または合成部分を含む。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「非経口」とは、皮下的投与、静脈内投与または筋内投与を含む。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、文字Ｋ（太文字の書体）
【００２６】
【化１２】
は、アミノ酸配列に関連して使用される場合、リジンのアミノ酸がメチル化されていることを表している。
【００２７】
（本発明の要旨）
本発明は、ヒストンＨ３ペプチドおよびＨ４ペプチドのアミノ末端の特異的修飾に結合する抗体に関する。より詳細には、本発明はメチルリジン特異的ヒストン抗体の生成に関する。これらの抗体は、特異的にメチル化され、そしてヒトの生態および疾患に関連し得るヒストンＨ３およびＨ４のリジン残基を認識する。これらの抗体を含む組成物は、診断手段およびスクリーニング手段として使用される。
【００２８】
（発明の詳細な説明）
ヒストンメチル化は、ヒストンに影響する不十分にしか理解されていない翻訳後修飾である。この修飾は、ヒストンのアミノ末端における選択されたリジン残基において生じる。ヒストンをメチル化する酵素が、遺伝子活性化および抑制の両方に関与していることが、現在明らかになっている。本発明は、メチルリジン特異的ヒストン抗体の産生に関する。これらの抗体は、特異的にメチル化されたヒストンＨ３およびＨ４におけるリジン残基を認識し、そしてヒトの生物学および疾患に関連し得る。
【００２９】
本発明は、コアヒストンタンパク質Ｈ３およびＨ４の可撓性のＮ末端テール上で生じる翻訳後修飾に関する。より詳細には、本発明は、メチル化リジン残基に関する。本出願人らは、Ｈ３のアミノ末端の最初の１５アミノ酸（配列番号７）およびＨ４のアミノ末端の最初の１５アミノ酸（配列番号８）内のリジン残基のメチル化が、転写の調節において重要な役割を果たしていることを発見した。たとえば、ヒストンＨ３上のリジン４（Ｋ４）のメチル化を、クロマチンの転写的に活性な領域に関連付け、一方、ヒストンＨ３上のリジン９（Ｋ９）のメチル化を、遺伝子スプライシングに関連付けた。従って、本発明の１つの局面に従って、ヒストンＨ３上のリジン４（Ｋ４）およびリジン９（Ｋ９）のメチル化は、それぞれユークロマチンおよびヘテロクロマチンのマーカーとして役立ち、そしてこれらの修飾されたタンパク質を認識する抗体は、重要な診断ツールとしての用途を有する。
【００３０】
本発明の１つの局面は、Ｈ３のアミノ末端に特異的な抗体およびＨ４のアミノ末端に特異的な抗体を産生するために使用される抗原に関する。１つの実施形態において、この抗原は、リジンがメチル化されたＨ３またはＨ４のアミノ末端の精製された抗原性フラグメントであり、
【００３１】
【化１３】
またはそれらの合成等価物からなる群より選択され、ここで、太字のＫは、メチル化されたリジン残基を示す。１つの実施形態において、この抗原は、２０アミノ酸以下のＨ３アミノ末端フラグメント、ならびに配列
【００３２】
【化１４】
およびこれらのアミノ酸配列の誘導体を含み、ここで、このアミノ酸配列は、１つ以上のアミノ酸置換を含む。１つの好ましい実施形態において、この抗原は、
【００３３】
【化１５】
またはペプチド配列のいずれかの末端に付加されたネイティブでないさらなるアミノ酸を含むそれらの誘導体である。
【００３４】
代替的な実施形態において、精製された抗原は、適切なキャリア（例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニン）に結合したポリペプチドを含む。１つの好ましい実施形態において、この抗原は、
【００３５】
【化１６】
およびこのアミノ酸配列の誘導体からなる群より選択される配列を含むＨ３ペプチドフラグメント、およびこのペプチドに結合されたキャリアタンパク質からなり、ここで、このアミノ酸配列は、１つ以上の保存されたアミノ酸置換を含む。例えば、この抗原は、配列
【００３６】
【化１７】
を有するペプチドを含み得、ここで、太字のＫは、メチル化リジン残基を示し、そして下線を付したＧＣは、天然のヒストン配列に付加された人工アミノ酸をいう。さらに、この抗原は、必要に応じて、キャリアタンパク質に結合され得る。
【００３７】
上記の抗原に加えて、本発明はまた、リジン残基がメチル化されたＨ３またはＨ４タンパク質のペプチドフラグメントに特異的に結合する、抗体に関する。好ましくは、この抗体は、Ｈ３ヒストンおよびＨ４ヒストンのアミノ末端の最初の２０アミノ酸残基に存在する１つ以上のメチル化されたリジン残基を認識する。より詳細には、本発明は、ペプチド
【００３８】
【化１８】
に特異的に結合する抗体に関し、ここで、太字のＫは、メチル化リジン残基を示し、そして下線を引かれたＧＣは、その抗体の産生を補助するように天然のヒストン配列に付加された人工アミノ酸を示す。１つの実施形態において、この抗体は、
【００３９】
【化１９】
、および１つ以上の保存的アミノ酸置換によって配列番号４、配列番号５、または配列番号６と異なるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸を含むペプチドに特異的である。１つの好ましい実施形態において、この抗体は、ペプチド
【００４０】
【化２０】
に特異的に結合する。
【００４１】
リジン４がメチル化されたＨ３ペプチド（すなわち、配列番号４のペプチド）に特異的に結合する抗体は、Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３と称され、そしてリジン９がメチル化されたＨ３ペプチド（すなわち、配列番号５または配列番号６のペプチド）に特異的に結合する抗体は、Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３と称される。これらの２つの抗体は、交差反応せず、そしてそのメチル化されていないペプチド配列に結合しない。本発明はまた、メチル化されていないヒストンペプチドに結合する抗体を包含する。１つの実施形態において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。
【００４２】
本発明の抗体および抗体フラグメントは、組成物を形成するようにキャリアまたは希釈剤と組み合わされ得る。１つの実施形態において、このキャリアは、薬学的に受容可能なキャリアである。このようなキャリアおよび希釈剤は、界面活性剤および他の薬学的および生理学的に受容可能なキャリア（アジュバント、賦形剤または安定剤を含む）を添加してかまたは添加せずに、水および油のような滅菌液体を含む。例示的な油は、石油起源、動物起源、植物起源、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、または鉱物油）である。一般に、水、生理食塩水、水性デキストロース、および関連糖溶液、ならびにプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのようなグリコールが、特に、注射可能な溶液のために、好ましい液体キャリアである。Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体またはＭｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体、またはそれらの生理活性フラグメントと、キャリアまたは希釈剤とを含む組成物は、ユークロマチンに対してヘテロクロマチンを検出する方法と組み合わせて、使用され得る。
【００４３】
本発明の抗体を産生するために使用される１つの方法は、配列
【００４４】
【化２１】
を含む抗原を、その抗原に特異的な抗体の産生を引き起こすために実験動物（代表的には、ウサギ）に投与する工程を包含する。抗体産生を引き起こすための抗原投与の用量およびレジメンならびに抗体の精製のための方法は、当業者に周知である。代表的には、このような抗体は、免疫前血清を獲得するために最初に出血させたニュージーランド白ウサギに目的の抗原を皮下投与することによって惹起され得る。この抗原は、６つの異なる部位において１つの部位当り１００μｌの総容量で注射され得る。各注射物質は、合成界面活性剤アジュバントプルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオールを含むか、またはＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後のタンパク質またはポリペプチドを含む粉砕したアクリルアミドゲルを含む。
【００４５】
次いで、ウサギを最初の注射の２週間後に出血させ、そして６週毎に３回、同じ抗原で定期的にブーストする。次いで、血清サンプルを、各ブーストの１０日後に収集する。次いで、ポリクローナル抗体を、その抗体を捕捉する対応する抗原を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって血清から回収する。最終的に、ウサギを、ペントバルビタール１５０ｍｇ／ＫｇのＩＶで安楽死させる。ポリクローナル抗体を惹起するためのこの手順および他の手順は、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗら編、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）において開示され、これは、本明細書中に参考として援用される。抗体の特異性は、酵素結合免疫吸着アッセイもしくは免疫ブロッティング、または当業者に公知の同様の方法によって決定され得る。
【００４６】
本発明はまた、それぞれの抗原
【００４７】
【化２２】
およびこれらのメチル化されていない対応ペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を包含する。モノクローナル抗体産生は、当業者に周知の技術を使用して行なわれ得る。基本的には、このプロセスは、インビボまたはインビトロのいずれかで目的の抗原で以前に免疫された哺乳動物（例えば、マウス）の脾臓から免疫細胞（リンパ球）を最初に獲得する工程を包含する。次いで、この抗体分泌リンパ球は、骨髄腫細胞または形質転換された細胞（これらの細胞は、細胞培養中に無限に複製し得る）と融合され、それにより、不死の免疫グロブリン分泌細胞株を生成し得る。得られた融合細胞（すなわち、ハイブリドーマ）は、培養され、そして得られたコロニーは、所望のモノクローナル抗体の産生についてスクリーニングされる。このような抗体を産生するコロニーがクローニングされ、そして大量の抗体を産生するためにインビボまたはインビトロのいずれかで増殖される。本発明の１つの実施形態は、本発明のメチル−リジンペプチドを結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株に関する。このような細胞を融合する理論的基礎および実際的な方法論の説明は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に示され、これは、本明細書中に参考として援用される。
【００４８】
抗体全体に加えて、抗体のフラグメントが、特定の抗原について結合特異性を保持し得る。抗体フラグメントは、タンパク質分解、または組換えＤＮＡ技術を使用する合成を含むがこれらに限定されない、いくつかの方法によって産生され得る。このような実施形態の例は、Ｆａｂフラグメントを産生するためのパパインによる抗体の選択的タンパク質分解であるか、またはＦ（ａｂ’）２フラグメントを産生するためのペプシンによる抗体の選択的タンパク質分解である。これらの抗体フラグメントは、Ｊ．Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、９８〜１１８頁（Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８３）（これは、本明細書中に参考として援用される）において記載されるような、従来の手順によって作製され得る。抗体全体の特異的結合を保持する本発明の抗体の他のフラグメントは、当業者に公知の他の手段によって産生され得る。
【００４９】
１つの実施形態において、抗体は標識されている。本発明は、いかなる特定の検出系または標識に限定されることを意図しない。抗体は、蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）、放射性同位体、またはビオチンもしくはジゴキシゲニンのような非同位体標識試薬で標識され得；ビオチンを含む抗体は、蛍光色素のような任意の所望の標識に結合体化されたアビジンのような「検出試薬」を使用して検出され得る。１つの実施形態において、本発明のヒストン特異的抗体は、二次抗体の使用を介して検出され、ここで、この二次抗体は、標識されており、一次（ヒストン特異的）抗体に特異的である。あるいは、ヒストン特異的抗体は、放射性同位体、またはＦＩＴＣもしくはローダミンのような蛍光色素で直接標識され得；このような場合において、二次検出試薬は、標識されたプローブの検出のために必要ではないかもしれない。
【００５０】
本発明の１つの実施形態に従って、Ｈ３ヒストンおよびＨ４ヒストンにおけるメチル化リジン残基の存在を検出するための方法が提供される。この方法は、ヒストンタンパク質を、標識された抗体と接触させる工程を包含し、ここで、この抗体は、リジン４でメチル化されたＨ３またはリジン９でメチル化されたＨ３のみに特異的に結合する。
【００５１】
１つの実施形態に従って、本発明の抗体は、診断画像化における使用のために標識される。本発明に従う診断画像化に有用な標識の例は、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、９９ｍＴｃ、３２Ｐ、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、および１８８Ｒｈのような放射性標識、フルオロセインおよびローダミンのような蛍光標識、核磁気共鳴活性標識、電子高密度物質および放射線不透過性物質、ポジトロン放出断層撮影（「ＰＥＴ」）スキャナーによって検出可能なポジトロン放出同位体、ルシフェリンのような化学発光物質（ｃｈｅｍｉｌｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）、およびペルオキシダーゼまたはホスファターゼのような酵素学的マーカーである。短距離放射線エミッタ（例えば、短距離検出プローブ（例えば、経直腸的プローブ）によって検出可能な同位体）もまた、使用され得る。これらの同位体および経直腸的検出プローブは、組み合わせて使用される場合、前立腺の窩（ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｆｏｓｓａ）の再発および骨盤結節性疾患（ｐｅｌｖｉｃ ｎｏｄａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）を検出する際に特に有用である。本発明の抗体は、当該分野で公知の技術を使用してこのような試薬で標識され得る。抗体の放射性標識に関連する技術については、例えば、ＷｅｎｓｅｌおよびＭｅａｒｅｓ，Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３）（これは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。Ｄ．Ｃｏｌｃｈｅｒら、「Ｕｓｅ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｉｎ Ａｔｈｙｍｉｃ Ｍｉｃｅ」Ｍｅｔｈ．ＥｎｚｖｍＱＬ，１２１：８０２−８１６（１９８６）（これは、本明細書中に参考として援用される）もまた参照のこと。１つの好ましい実施形態に従って、その抗体は、当該分野で公知の標準的部分を使用して蛍光団または発色団で標識される。
【００５２】
出願人らは、リジン４および９（Ｋ４およびＫ９）におけるヒストンＨ３のメチル化が、それぞれ、修飾されたヒストンに近接する遺伝子の発現の活性化および不活化に関連することを発見した。ヒストンＨ３は、Ｋ９においてメチル化される場合、ヘテロクロマチンタンパク質ＨＰ１について好ましい結合部位であり、次いで、ＨＰ１は、Ｋ９メチル化を担う酵素Ｓｕｖ３９ｈを補充し得、不活化シグナルが広げられ得る機構を作製する。Ｋ９のメチル化はまた、その部位でのアセチル化を妨げ、抑制にさらに寄与する。Ｋ９における反応とは対照的に、ヒストンＨ３ Ｋ４におけるメチル化は、転写活性に相関する。従って、本発明の１つの実施形態に従って、Ｋ４メチル化ヒストンＨ３に特異的な抗体は、クロマチンの転写的に活性な領域を検出するために使用され得、そしてＫ９メチル化ヒストンＨ３に特異的な抗体は、クロマチンの転写的に不活性領域を検出するために使用され得る。実際、染色体のインサイチュ染色によって、Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体およびＭｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体によって生成される染色パターンが、互いの鏡像を生成することが明らかにされる。
【００５３】
Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体およびＭｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体は、診断剤および治療剤として、ヒトにおける使用のための可能性を有するので、本発明の１つの実施形態は、Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体およびＭｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体のヒト化バージョンに関する。抗体のヒト化バージョンは、治療適用のために必要である。なぜなら、非ヒト種由来の抗体は、ヒト免疫系によって外来物質として認識され得、そして中和され得、これらは、あまり有用ではない。ヒト化抗体は、ヒト部分および非ヒト部分を含む免疫グロブリン分子である。より具体的には、ヒト化抗体の抗原結合領域（可変領域）は、非ヒト供給源（例えば、マウス）に由来し、そしてヒト化抗体の定常領域は、ヒト供給源に由来する。ヒト化抗体は、非ヒト抗体分子の抗原結合特異性、およびヒト抗体分子によって付与されるエフェクター機能を有する。代表的には、ヒト化抗体の作製は、組換えＤＮＡ技術の使用を含む。
【００５４】
本発明の抗体は、細胞からユークロマチンまたはヘテロクロマチンを単離する手段を提供するために、不溶性の支持体に結合され得る。この支持体は、微粒子形態または固体形態で存在し得、そしてこれらには、プレート、試験管、ビーズ、球、フィルターまたは膜が含まれ得るが、これらに限定されない。抗体を不溶性支持体に固定するための方法は、当業者に公知である。１つの実施形態において、本発明の抗体は、アフィニティークロマトグラフィーにおける使用に適した不溶性支持体に固定される。
【００５５】
Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体およびＭｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体は、境界エレメントによっていくらか設定される、大規模またはドメイン感受性クロマチン標識である。詳細には、Ｌｓｙ４においてメチル化されたＨ３を含むヒストンに関連するクロマチンは、「オン」ドメイン、または転写活性についてコンピテントである少なくとも１つのドメインを表す。あるいは、Ｌｓｙ９においてメチル化されたＨ３を含むヒストンに関連するクロマチンは、「オフ」ドメインを示し、このドメインは、転写活性についてコンピテントではない。このパターンは、多様な範囲の種にわたって保存されている。これらの抗体を用いる動物ブロットにより、「単純な」生物（出芽酵母）およびテトラヒメナ由来のＨ３ヒストンのほとんどが、メチル化Ｌｙｓ４（オン）を含み、これに対して、著しく対照的には、「複雑な」生物に存在するＨ３ヒストンのほとんどが、メチル化Ｌｙｓ９（オフ）を有することが示唆される（図３を参照のこと）。このことは、酵母およびテトラヒメナにおけるゲノムＤＮＡのほとんどが、発現される（オン）が、ヒト、マウスなどにおけるＤＮＡのほとんどは、オフであるという知見と一致する。従って、より複雑な真核生物における「デフォルト」または基底状態はオフであることが、十分であり得る。Ｌｙｓ４メチル標識の使用を介するオンクロマチンの同定の仕方を知ることは、より「当りがいい」クロマチンに対する導入遺伝子のより優れた標的化のためのストラテジーを開発する際に貴重であると証明され得る。
【００５６】
クロマチン免疫沈降データによって、上の「オン／オフ」標識系モデルが支持される。詳細には、公開されたＳ．ｐｏｍｂｅクロマチンＩＰデータ（Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｎａｋａｙａｍａら、２００１）およびヒトにおける不活性Ｘ染色体上の作業（実施例２を参照のこと）は、このモデルを支持する。さらに、「不活性」Ｘ染色体上にＬｙｓ４ Ｈ３メチル化の「ホットスポット」が存在し、そしていくつかの場合において、腫瘍抑制遺伝子が、この染色体領域にマッピングされている。この遺伝子におけるヘテロ接合性の喪失は、有意な数の進行した場合の卵巣癌と相関する。従って、本発明の抗体は、癌を検出するため、そして治療ストラテジーを決定するための診断剤としてもまた使用され得る。１つの実施形態に従って、疾患状態に関連するクロマチン変更を検出するための方法が提供される。用語「疾患状態」は、先天性欠損を含む生きている動物または植物の正常な状態の機能障害に関連する任意の状態、癌のような病理学的状態、ならびに環境因子および病原体（細菌、ウイルスなど）に対する応答を包含することが意図される。この方法は、正常組織および罹患組織の両方からクロマチンを単離する工程、Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体またはＭｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体のいずれかと、このクロマチンの２つのプールを接触させる工程、および正常組織から単離されたクロマチンの染色パターンを罹患組織のそれと比較する工程を包含する。さらに、クロマチン免疫沈降を使用して、固有の腫瘍抑制遺伝子は、本発明の抗体を使用するディファレンシャルスクリーニングによって単離され得る。
【００５７】
本発明の１つの実施形態に従って、Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体およびＭｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体を使用して、ヘテロクロマチン領域およびユークロマチン領域を同定し、そしてクロマチンの転写的に活性な領域および不活性な領域を検出する。より詳細には、抗体は、所定の疾患状態に関連するクロマチン構造における変化を検出するために使用され得る。従って、抗体は、発現パターンにおける変更（すなわち、優性なネイティブなパターンに比較した、ヘテロクロマチンパターン対ユークロマチンパターンにおける差異）に関連するクロマチン構造の変更を検出するための診断剤として使用され得る。クロマチンの特定の領域についてのクロマチン構造における変更は、特定の疾患状態の診断因子であり得る。例えば、ヘテロクロマチンへのゲノムのユークロマチン領域の通常の転換は、癌または前癌の状態を示す腫瘍抑制遺伝子の抑制を示し得る。同様に、ユークロマチンへのヘテロクロマチンの領域の転換は、宿主細胞／生物の対して有害な影響を与える遺伝子の不適切な発現または過剰発現と関連し得る。
【００５８】
本発明はまた、罹患組織において発現パターンが変更された核酸領域を単離するための広範囲のディファレンシャルスクリーニング技術を使用する方法に関する。例えば、クロマチンは、罹患組織から単離され得、そして罹患状態に関連するクロマチン構造における任意の差異（すなわち、ヘテロクロマチン対ユークロマチンにおける変化）が存在するか否かを決定するために、健全組織から単離されたクロマチンと比較され得る。クロマチン構造におけるこのような差異は、疾患において直接的または間接的な役割を果たす遺伝子の抑制または過剰発現を示し得る。抗メチル（Ｌｙｓ９）Ｈ３抗体および抗メチル（Ｌｙｓ４）Ｈ３抗体は、クロマチン構造におけるこのような変化を検出し、そして罹患状態に関連する遺伝子を同定するのを助けるために使用され得る。このような遺伝子の同定は、疾患を処置するためのより効果的な治療を設計する際に補助となる。
【００５９】
１つの実施形態において、特定の疾患に関連するクロマチン構造における変更を検出するための方法は、修飾特異的ヒストン抗体を使用するクロマチン免疫沈降アッセイを包含する。このプロセスは、クロマチン環境によって管理される広範なＤＮＡ鋳型プロセスの分析を可能にする。より詳細には、この方法は、罹患組織および健全組織の両方からクロマチンを単離する工程、ＤＮＡをフラグメント化する工程（好ましくは超音波処理によって）、および
【００６０】
【化２３】
のアミノ酸配列に特異的に結合する抗体を使用してクロマチンを免疫沈降させる工程（ここで、太字のＫは、メチル化リジン残基を示す）、ならびに健全組織から免疫沈降したクロマチン（および関連したＤＮＡ配列）を罹患した組織と比較する工程を包含する。この免疫沈降したクロマチンの２つのプールの比較は、罹患した組織と健全組織との間の差異の同定を可能にする。
【００６１】
１つの実施形態において、この免疫沈降したクロマチンの２つのプールの比較は、この免疫沈降したクロマチンの２つのプールに関連した核酸配列を単離する工程、および得られた核酸配列の２つのプールを比較する工程を包含する。この核酸配列の２つのプールの比較は、ＰＣＲ、ゲル電気泳動、核酸配列決定、および核酸ハイブリダイゼーション分析を含む、標準的な分子技術のいずれかを使用して行なわれ得る。次いで、この核酸配列の２つのプールの１つのみに存在するこれらの核酸配列は、回収される。これらの核酸配列は、正常な組織または罹患した組織のいずれかに関連する発現された／抑制された遺伝子を示す。１つの実施形態において、クロマチンを免疫沈降するために使用される抗体は、Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体およびＭｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体からなる群より選択される。
【００６２】
クロマチン免疫沈降（クロマチンＩＰ）アッセイにおけるメチルＬｙｓ４／Ｌｙｓ９ヒストンＨ３抗体の使用は、ヒトゲノム（および同様に他のゲノム）の後成的な「オン／オフ」状態に対応するゲノムＤＮＡを濃縮する１つの方法である。クロマチン免疫沈降されたＤＮＡを、（チップ上での）現在のゲノムマイクロアレイ技術と組み合わせることによって、「ヒストンコード」を介するこれらのオン／オフ状態に関してヒト（または他の）ゲノムの任意の部分を調査する可能性を有する。例えば、Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体を使用して免疫沈降したＤＮＡは、固体表面または「チップ」に固定され得、そして転写についてコンピテントである所定の細胞の全ての核酸配列を示し得る。同様に、Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体を使用して免疫沈降したＤＮＡは、固体表面または「チップ」に固定され得、そして転写についてコンピテントでない所定の細胞の全ての核酸配列を示し得る。標的細胞からｍＲＮＡを収穫し、そしてｃＤＮＡを調製し、標的核酸を標識し、次いで、標的ＤＮＡを固定されたＤＮＡとハイブリダイズさせることによって、遺伝子の異常な発現が明らかにされる。
【００６３】
この情報を知ることは、種々のヒト癌における重要な腫瘍抑制タンパク質または発癌性タンパク質のオン／オフ状態を決定する際に貴重であると証明され得る。この後成的標識化が、どのようにゲノムＤＮＡに対応するかを知ることはまた、しばしば、ほとんどのトランスジェニックＤＮＡが「悪い」（Ｌｙｓ９）クロマチン環境に侵入しそしてサイレンシングされることが見出される場合に、トランスジェニック動物および植物を作製する能力を誘導する。従って、ＤＮＡを、動物および植物のトランスジェニック作業のために「良好な」（Ｌｙｓ４）クロマチン環境により良く「誘導する」方法を知ることについての意味は、高い。ヒトにおいて、このことは、遺伝子治療組織に対しても同様に影響を与える。
【００６４】
１つの実施形態において、クロマチンの免疫沈降は、マイクロアレイの使用を介してゲノムの広範なレベルで活性な遺伝子の位置をマッピングするために使用される。例えば、１つの好ましい実施形態において、免疫沈降されたクロマチンの２つのプール（すなわち、罹患組織由来の免疫沈降したクロマチン対健全組織由来の免疫沈降したクロマチン）を比較する方法は、当業者に公知の標準技術を使用する、遺伝子チップ、ＤＮＡマイクロアレイ、またはプロテオミクスチップの使用を包含する。例えば、ＷＯ０１／１６８６０、ＷＯ０１／１６８６０、ＷＯ０１／０５９３５、ＷＯ００／７９３２６、ＷＯ００／７３５０４、ＷＯ００／７１７４６およびＷＯ００／５３８１１（これらの開示は、本明細書中に明確に援用される）において記載されるようなシステムのいずれかは、本発明における使用に適している。好ましくは、このチップは、既知の化合物（例えば、既知のＤＮＡ配列）の順序付けられたアレイを含み、その結果、チップの特定の位置における免疫沈降したクロマチンの相互作用が、その免疫沈降したクロマチンに関連したＤＮＡ配列を同定し、そしてその単離を可能にする。
【００６５】
この技術に対して鍵となることは、種々の修飾に対して特異的な抗体を使用することである。なぜなら、それらの抗体は、ヒストンコードに関連するからである。このことをヒトゲノムおよび他のゲノムに適用することが、エピゲノミクスの基盤を据える。本発明は、Ｌｙｓ４／Ｌｙｓ９ ｍｅｔｈｙｌ Ｈ３抗体を各々ＯＮ／ＯＦＦ抗体として使用することを詳述してきたが、この概念は、より一般的には、「ヒストンコード」に関して開発される任意のすべての抗体に適用される。例えば、Ｌｙｓ９ ｍｅｔｈｙｌ抗体対Ｓｅｒ１０ ｐｈｏｓ Ｈ３抗体はまた、分化対増殖を調節する「ｍｅｔｈｙｌ／ｐｈｏｓ」スイッチでもあり得る。本発明はまた、Ｈ３ヒストンのアミノ末端の他のメチル化領域およびＨ４ヒストンのアミノ末端の他のメチル化領域（Ｈ３のリジン２７およびリジン３６、ならびにＨ４のリジン２０を含む）に関する抗体も包含する。これらの抗体を生成するために使用されるペプチドが、以下に列挙される：
【００６６】
【化２４】
ここで、太字のＫは、メチル化されたリジン残基であり、そして下線を付したＧＣは、この抗体の生成を補助するためにＨ３配列に付加された人工アミノ酸を指す。
【００６７】
本発明の抗体は、標準的な分子生物学技術（例えば、ウェスタンブロット分析、免疫蛍光、および免疫沈降）において使用され得る。上記のように、リジン４においてメチル化したＨ３の存在は、転写的に活性な核に関連する。従って、このＨ３抗体は、遺伝子調節の理解において有用であり得る。さらに、このＭｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体を細胞中にマイクロインジェクションすることにより、特定の遺伝子の活性化が妨害され得ることが、理解される。
【００６８】
本発明の１つの実施形態において、ユークロマチンおよびヘテロクロマチンを検出するためのキットが、提供される。このキットは、以下：
【００６９】
【化２５】
からなる群より選択されるリジンメチル化修飾ペプチドに特異的に結合する抗体を含む。より具体的には、このキットは、以下のペプチド：
【００７０】
【化２６】
に結合する抗体を含み、ここで、太字のＫは、メチル化リジン残基を示す。１つの実施形態において、これらの抗体は、不溶性支持体に付着され、その支持体は、モノリシック固体であるか、または特定の形態であるかのいずれかである。１つの好ましい実施形態において、これらの抗体は、モノクローナル抗体であり、そしてさらなる実施形態において、これらの抗体は、標識されている。この目的のために、本発明の抗体は、種々の容器（例えば、バイアル、チューブ、マイクロタイターウェルプレート、ボトルなど）中にパッケージングされ得る。他の試薬が、別の容器中に含まれ得、そしてこのキットとともに提供され得る。他の試薬は、例えば、陽性コントロールサンプル、陰性コントロールサンプル、緩衝液、細胞培養培地などである。
【００７１】
本発明の別の実施形態において、サンプルがメチラーゼ活性を有するか否かを決定するためのアッセイにおける使用のためのキットが、提供される。このキットは、ペプチドと抗体とを含み、そのペプチドは、ＡＲＴＫＱＴＡＲＧＣ（配列番号４）、ＱＴＡＲＫＳＴＧＶＣＧ（配列番号５）、ＡＲＴＫＱＴＡＲ（配列番号１）、ＱＴＡＲＳＴＧＶ（配列番号２）およびＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＶ（配列番号９）からなる群より選択され、そしてその抗体は、ＡＲＴＫＱＴＡＲＧＣ（配列番号４）、ＱＴＡＲＫＳＴＧＶＣＧ（配列番号５）、ＡＲＴＫＱＴＡＲ（配列番号１）、ＱＴＡＲＳＴＧＶ（配列番号２）およびＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＶ（配列番号９）からなる群より選択されるリジンメチル化修飾ペプチドに特異的に結合する。１つの実施形態において、それらの抗体は、不溶性支持体に付着されており、その支持体は、モノリシック固体であるか、または特定の形態であるかのいずれかである。別の実施形態において、このキットは、非メチル化ペプチドに特異的に結合する抗体をさらに備えており、この非メチル化ペプチドは、ＡＲＴＫＱＴＡＲＧＣ（配列番号４）、ＱＴＡＲＫＳＴＧＶＣＧ（配列番号５）、ＡＲＴＫＱＴＡＲ（配列番号１）、ＱＴＡＲＳＴＧＶ（配列番号２）およびＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＶ（配列番号９）からなる群より選択される。このような抗体は、陰性コントロールとして役立つ。
【００７２】
１つの実施形態において、サンプルのメチラーゼ活性を検出するための方法は、メチラーゼ活性を有すると疑われるサンプルを、所定の長さの時間の間、ペプチドと接触させる工程を包含し、このペプチドは、ＡＲＴＫＱＴＡＲＧＣ（配列番号４）、ＱＴＡＲＫＳＴＧＶＣＧ（配列番号５）、ＡＲＴＫＱＴＡＲ（配列番号１）、ＱＴＡＲＳＴＧＶ（配列番号２）およびＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＶ（配列番号９）からなる群より選択される。その基質に結合するメチル化特異的抗体（すなわち、Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３またはＭｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３）の量は、その基質が所定の時間の間メチル化された程度の直接相関であり、従ってそのサンプルのメチラーゼ活性を示す。このアッセイはまた、メチラーゼの潜在的インヒビターについてスクリーニングするために使用され得る。例えば、１つの実施形態において、アルギニンメチル転移活性のインヒビターについてスクリーニングする方法は、サンプルを提供する工程（そのサンプルは、メチラーゼと、そのメチラーゼによりメチル化される基質と、を含む）、そのサンプルにそのメチラーゼの潜在的インヒビターを添加する工程、およびそのメチル化基質には特異的に結合するが非メチル化基質には特異的には結合しない抗体と、そのサンプルとを接触させる工程、を包含する。１つの実施形態において、その抗体は、以下のペプチド
【００７３】
【化２７】
に特異的である。そのペプチドに結合した抗体の量を定量することは、そのサンプル中のメチラーゼのレベル活性の直接相関である。１つの好ましい実施形態において、検出されるべきメチラーゼ活性は、ＳｕＶａｒ３−９（Ｌｙｓ９について）またはＳｅｔ１（Ｌｙｓ４について）である。
【００７４】
出芽酵母中に存在する非必須遺伝子のすべて（約４，８００個）について「ノックアウト」株が入手可能である。本発明の抗体は、非常に高い程度の特異性を有するので、酵母の全細胞溶解物中の主要な１つまたは２つのバンドのみを検出し、それによりこれらのノックアウト株のすべてを観察するためのロボット利用型スクリーニング方法の開発が可能になる。Ｌｙｓ４メチルＨ３を使用することは、そのオン酵素およびオフ酵素を含む「調節因子」の上流経路全体を導くはずである（ただし、その遺伝子産物が非必須である場合）。
【００７５】
「旧式」ブロットにおける上記のアプローチを使用して、Ｓｅｔ１が、酵母におけるＬｙｓ４ Ｈ３メチル標識を担う酵素であり、かつまたヒトにおけるＬｙｓ４ ＨＭＴアーゼのうちの１つであることが、見出された。驚くべきことに、酵母全細胞溶解物を探索するため読み出し表示としてこのメチルＬｙｓ４ Ｈ３抗体を使用して、Ｌｙｓ４メチル化が、ヌクレオソームの反対側にある保存リジンにおけるＨ２Ｂユビキチン結合によって調節されることが、発見された。これは、「トランス−テール」効果の最初の例であり、この効果は、一方のテールにおける１つのヒストン修飾が、それ程近くない別のテールにおける別の修飾をもたらすことを意味する。ヒトおよびマウスにおいて、ユビキチンをタンパク質に付加する酵素は、ヒトＲａｄ６（ＨＲ６）であり、そしてＨＲ６は、２つのアイソフォーム（ＨＲ６ＡおよびＨＲ６Ｂ）になる。マウスノックアウトＨＲ６Ｂ−／−は、既知ではないが精子形成の間にクロマチン欠損をもたらして精子の死をもたらすようである経路において、雄性不稔性である。従って、ＨＲ６Ｂが、Ｈ２Ｂに対するユビキチン付加を担うこと、従って、Ｌｙｓ４ Ｈ３メチル抗体が、雄性不妊症についての診断剤であることが可能であることが、理解される。さらに、Ｌｙｓ９メチル化を欠損し、Ｘ染色体不活性化に影響し得、かつ雌性不妊症をもたらす、可能性が存在する。従って、本発明の１つの実施形態により、Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体およびＭｅｔｈｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体が、雄性不妊症欠損および雌性不妊症欠損についてスクリーニングするための診断剤として使用される。
【００７６】
現在のモデルは、Ｌｙｓ９メチル化が、少なくともいくつかの場合、ＳｕＶａｒ３−９によって触媒されることを、示唆する。このＬｙｓ９メチル標識は、クロモドメイン（クロマチンの「ベルクロ」パッチとして作用する、短いタンパク質モジュール）によって読み取られるようである。ヘテロクロマチンタンパク質ＨＰ１のクロモドメインが、最もよく示されている。興味深いことに、ＨＰ１からのクロモドメインは、Ｌｙｓ９メチルＨ３ペプチドにはよく結合するが、Ｌｙｓ４ペプチドまたは非修飾ペプチドには、それよりかなり弱くしか結合しない。ＳｕＶａｒ３−９自体（触媒性ＨＭＴアーゼ）もまたクロモドメイン（メチル化ヒストンペプチドについての部位特異性がいまだ試験されていないモジュール）を有することもまた、興味深い。
【００７７】
Ｈ３におけるＬｙｓ４メチル標識は、おそらく、ＨＰ１のクロモドメインとは異なるクロモドメインによって読み取られるようである。１つの実施形態において、本発明の独自に修飾されたペプチド（
【００７８】
【化２８】
を含む）は、Ｌｙｓ４ Ｈ３ペプチドに結合するポリペプチドを探索するための親和性試薬として使用される。いくつかの魅力的候補としては、２つのヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）であるＥｓａ１およびＣＤＹが挙げられ、これらは両方とも、クロモドメインを有する。興味深いことに、ＣＤＹは、雄性Ｙ染色体上にコードされる、精巣特異的ＨＡＴであり、そして体性ヒストンは、プロタミンによる置換をもたらす反応の間に、過剰アセチル化されることが周知である。
【００７９】
それは、精子形成の間に、以下の一連の協調的反応が生じることであり得る：
１．Ｈ２Ｂユビキチン結合が生じる（ＨＲ６Ｂによって触媒される）
２．クロマチンが開く
３．ヒトＳｅｔ１または別のＬｙｓ４ ＨＭＴアーゼによって触媒されるＬｙｓ４メチル化
４．ＨＡＴ ＣＤＹが、そのクロモドメインを介してＬｙｓ４メチル化標識に結合する
５．ヒストン過剰アセチル化が生じ、ＣＤＹにより触媒される
６．体性ヒストンが、その後、変遷タンパク質により置換され、その後プロタミンにより置換される。
【００８０】
上記の工程のうちのいずれかにおける欠損は、精子死亡および雄性不妊症をもたらし得る。
【００８１】
これらの工程のうちの３つが、以下のクロマチン修飾酵素：
ｉ）ＨＲ６Ｂ（Ｅ２ユビキチン結合酵素）
ｉｉ）Ｓｅｔ１（能力のあるＬｙｓ４ ＨＭＴアーゼ）
ｉｉｉ）ＣＤＹ（雄性特異的ＨＡＴ）
を必要とすることに留意すること。
【００８２】
ユビキチン結合Ｈ２Ｂに対する抗体およびユビキチン結合Ｈ２Ａに対する抗体、Ｌｙｓ４メチルＨ３に対する抗体およびＣＤＹ触媒化アセチル化の部位に対する抗体はすべて、雄性不妊症のスクリーニングにおいて、診断的に有用である可能性がある。
【００８３】
（実施例１）
（Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体およびＭｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体の調製）
Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体およびＭｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体を生成するために、リジン４の周囲のヒストンＨ３のアミノ酸配列（配列番号４；
【００８４】
【化２９】
またはリジン９の周囲のヒストンＨ３のアミノ酸配列（配列番号５；
【００８５】
【化３０】
）に対応する短いポリペプチドをまず化学合成した。ここで、太字のＫは、メチル化リジン残基であり、そして下線を付したＧＣは、この抗体の生成を補助するようにＨ３配列に付加された人工アミノ酸を示す。その後、このポリペプチドを、カチオン化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合し、そしてこの結合ペプチドをウサギに注射した。この手順に対する１つの重要な局面は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にペプチドを結合する標準技術が、高品質のメチルリジン４（Ｈ３）特異的抗血清を生成する際には効果がないと示された事実である。従って、この特定のカチオン化ＢＳＡの使用は、今や、メチルリジン特異的抗体を生成する際の特異な「方法」とみなされる。
【００８６】
ウサギ血清を、免疫後に規則正しい間隔で収集し、そしてＭｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体およびＭｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体がその血清中に存在することを、標準的酵素結合免疫吸着アッセイによって示した。これらの抗体は、ウェスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、および免疫沈降アッセイにおける使用のために、適切である。
【００８７】
（実施例２）
（ヘテロクロマチンアセンブリのエピゲノム制御における、ヒストンＨ３リジン９メチル化の役割）
高次クロマチン構造のアセンブリを、ヒストンテールの共有結合修飾と関連付けた。インビボでの証拠が、ヒストンＨ３のリジン９（Ｈ３ Ｌｙｓ９）が、融合酵母におけるヘテロクロマチン結合領域にてＣｌｒ４タンパク質によって優先的にメチル化されることを、示す。Ｃｌｒ４の保存クロモドメインおよびＳＥＴドメインの両方が、インビボでのＨ３ Ｌｙｓ９メチル化に必要である。
【００８８】
その高次クロマチン構造の組織化を、ヒストンテールの翻訳後修飾（アセチル化、リン酸化、およびメチル化を含む）と関連付けた。共有結合ヒストン修飾の個別の組み合わせ（「ヒストンコード」ともいう）が、下流のクロマチン修飾タンパク質を動員するための、ヒストンテール上の「標識（ｍａｒｋ）」を提供することが、示唆された。このことは、いくつかの転写活性化補助因子の保存ブロモドメインがヒストンテール上のアセチル化リジン残基に特異的に結合することを示す、最近の研究によって最もよく示される。同じヒストンテールまたは異なるヒストンテール内の複数の共有結合修飾の確立および維持を担う機構は、完全には理解されていない。
【００８９】
ヒストンテールの修飾もまた、ヘテロクロマチンのアセンブリに関連付けた。ヒストンＨ３およびヒストンＨ４は、酵母、ハエ、および哺乳動物ほどに多様な生物におけるヘテロクロマチン性染色体領域において、ほとんど低アセチル化されている。融合酵母において、ヒストンの低アセチル化は、サイレント接合型領域およびセントロメア（高等真核生物におけるヘテロクロマチン領域と多くの類似点を共有する染色体ドメイン）と関連している。内部（ｉｍｒ）反復および外部（ｏｔｒ）反復により囲まれる独特の配列の中心コアを含むセントロメア領域は、サイレントクロマチン構造へとアセンブルされる。同様に、接合型（ｍａｔ２／３）領域の大きな１５ｋｂ染色体ドメイン（ｍａｔ２遺伝子座およびｍａｔ３遺伝子座、ならびにそれらの間の区間（Ｋ領域として公知）を含む）が、サイレントエピゲノム状態において維持される。これらの領域のサイレント化に影響するトランス作用性因子の中で、Ｃｌｒ３およびＣｌｒ６が、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）のファミリーに属する。Ｓｗｉ６タンパク質およびＣｌｒ４タンパク質は、クロモドメイン（ＨＰ１タンパク質およびＰｏｌｙｃｏｍｂタンパク質において最初に同定された進化的に保存されたモチーフ）を含む。最近、Ｃｌｒ４およびその哺乳動物対応物ＳＵＶ３９Ｈ１の両方が、インビトロで内在性ヒストンＨ３特異的メチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴアーゼ）活性を有することが示された（Ｓ．Ｒｅａら、Ｎａｔｕｒｅ ４０６、５９３（２０００））。しかし、ヒストンが、インビボでこれらのメチルトランスフェラーゼの生理学的標的であるか否かは、わからない。
【００９０】
以前の知見と一致して、組換えＣｌｒ４（ｒＣｌｒ４）は、ヒストンＨ３に対して排他的にＨＭＴａｓｅ活性を有することが見出された。ｒＣｌｒ４によってメチル化されたＨ３の特定の残基を同定するために、Ｈ３のＮＨ２末端由来の合成ペプチドを、インビトロＨＭＴａｓｅアッセイにおける基質として使用した。詳細には、５ｍｇのＨｅＬａコアヒストンまたはニワトリコアヒストンを、２５ｍｌのＨＭＴａｓｅ緩衝液［１０％グリセロール中、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８．０）、１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド、０．５ｍＭ ジチオトレイトール］中、０．５５ｍＣｉのＳ−アデノシル−Ｌ−［メチル−３Ｈ］メチオニン（３Ｈ−ＡｄｏＭｅｔ；７２Ｃｉ／ｍｍｏｌ；１ｍＭ ｐｎａｌ）および２ｍｇの組換えＣｌｒ４野生型タンパク質または変異体タンパク質と共に、３０℃にて１時間インキュベートした。ＳＤＳローディング緩衝液を各サンプルの半分に添加し、そして煮沸して、その後、１５％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）ゲル上で分離した。得られたヒストンのバンドを、クーマシー染色およびフルオログラフィーによって可視化した。ペプチド分析のために、ＣＯＯＨ末端システインを含む、ヒトヒストンＨ３のＮＨ２末端由来の各ペプチド５ｍｇを使用した。半分のサンプルを、Ｗｈａｔｍａｎ Ｐ−８１濾紙にスポットし、５０ｍＭ ＮａＨＣＯ２（ｐＨ ９．０）中で１０分間、４回洗浄し、その後、液体シンチレーション計数を行った（Ｂ．Ｄ．Ｓｔｒａｈｌ、Ｒ．Ｏｈｂａ、Ｒ．Ｇ．Ｃｏｏｋ、Ｃ．Ｄ．Ａｌｌｉｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６、１４９６７（１９９９））。Ｃｌｒ４は、Ｈ３ １−２０非修飾ペプチドを優先的にメチル化したが、Ｈ３ １９−３５非修飾ペプチドをメチル化せず、これは、Ｃｌｒ４ ＨＭＴａｓｅの標的残基がＨ３の最初の２０アミノ酸に存在することを示す。
【００９１】
この標的残基を決定するために、異なるアミノ酸に対して共有結合修飾を含む、合成Ｈ３ １−２０ペプチドセットを開発した。これらのペプチドを基質として用いた場合、Ｌｙｓ９に対するアセチル修飾またはメチル修飾のみが、ｒＣｌｒ４のＨＭＴａｓｅ活性を効果的にブロックし、これは、Ｃｌｒ４が、その哺乳動物ホモログＳＵＶ３９Ｈ１と同様に、Ｈ３のＬｙｓ９を選択的にメチル化することを示す。さらに、ＳＵＶ３９Ｈ１と同様に、ｒＣｌｒ４のＨＭＴａｓｅ活性は、セリン１０のリン酸化によって阻害された。これらの結果は、Ｓｕ（ｖａｒ）３−９タンパク質ファミリーの酵素的特徴が、分裂酵母からヒトへと進化的に保存されていることを実証する。近年の研究は、保存されたＳＥＴドメインおよび２つの隣接システインリッチ領域が、インビトロでのＳＵＶ３９Ｈ１のＨＭＴａｓｅ活性に必要とされることを実証した。これらの保存されたドメイン、クロモ領域、ＳＥＴ領域およびシステインリッチ領域がＣｌｒ４のＨＭＴａｓｅ活性にもまた重要であるか否かを決定するために、変異体Ｃｌｒ４タンパク質を、ＨＭＴａｓｅ活性について試験した。クロモドメインにおける変異［Ｔｒｐ３１からＧｌｙ（Ｗ３１Ｇ）およびＴｒｐ４１からＧｌｙ（Ｗ４１Ｇ）］は、Ｃｌｒ４のＨＭＴａｓｅ活性に対してほとんど効果を有さないが、ＳＥＴドメインにおける変異［Ｇｌｙ３２８からＳｅｒ（Ｇ３７８Ｓ）］および両方のシステインリッチ領域における変異［Ａｒｇ３２０からＨｉｓ（Ｒ３２０Ｈ）およびＧｌｙ４８６からＡｓｐ（Ｇ４８６Ｄ）］は、Ｃｌｒ４のＨＭＴａｓｅ活性を大いに減少し、これは、これらの３つの領域が、インビトロでのＣｌｒ４のＨＭＴａｓｅ活性に重要であることを示す。
【００９２】
Ｈ３ Ｌｙｓ９メチル化とサイレンシングとの間の仮定の相関性を試験するために、Ｈ３ Ｌｙｓ９−メチル特異的抗体を開発した。酵素連結イムノソルベントアッセイにおいて、Ｈ３ Ｌｙｓ９−メチル抗体は、広範な抗体希釈度でＨ３ １−２０ Ｌｙｓ９−メチルペプチドを特異的に認識した。さらに、Ｈ３ Ｌｙｓ９−メチル抗体は、ＨｅＬａコアヒストン陽性コントロールと比較して、組換えヒストンＨ３（ｒＨ３）単独を検出しなかったが、ｒＣｌｒ４によって選択的にメチル化されたｒＨ３を検出し、これは、この抗体の特異性をさらに実証する（Ｎａｋａｙａｍａら（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９２、１１０−１１３頁（この開示は本明細書中に援用される）を参照のこと）。
【００９３】
この抗体をクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）実験（Ｎａｋａｙａｍａら（２０００）Ｃｅｌｌ、１０１、３０７）において使用して、Ｈ３ Ｌｙｓ９−メチル修飾が、サイレンシングされた染色体領域に特異的に局在化されることが発見された。Ｈ３ Ｌｙｓ９のメチル化およびＳｗｉ６は、サイレンシングされたｍａｔ２／３染色体ドメイン内に挿入されたマーカー遺伝子（Ｋｉｎｔ２：：ｕｒａ４ １）で、その内因性の位置にあるコントロールｕｒａ４ＤＳ／Ｅ遺伝子座と比較して、優先的に富化された。同様に、Ｈ３ Ｌｙｓ９のメチル化はまた、ｃｅｎ１の非常に抑制された最も内側の反復内（ｉｍｒ１Ｒ：：ｕｒａ４ １）および外側の反復内（ｏｔｒ１Ｒ：：ｕｒａ４ １）に挿入されたｕｒａ４ １マーカーで優先的に富化されたが、弱く抑制された中心コア（ｃｎｔ１：：ｕｒａ４ １）では富化されなかった。さらに、Ｈ３ Ｌｙｓ９のメチル化は、これらの領域でＳｗｉ６の存在と同時に生じた（Ｐａｒｔｒｉｄｇｅら（２０００）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１４、７８３）。これらの知見は、Ｈ３ Ｌｙｓ９−メチル修飾およびＳｗｉ６がサイレントな染色体領域に優先的に局在されること、および、Ｓｗｉ６の局在がＨ３ Ｌｙｓ９のメチル化に機能的に依存することを示唆する。
【００９４】
野生型細胞におけるＫｉｎｔ２：：ｕｒａ４ １およびｏｔｒ１Ｒ：：ｕｒａ４ １の両方での比較的高いレベルのＳｗｉ６およびＨ３ Ｌｙｓ９メチル化と比較して、Ｓｗｉ６およびＨ３ Ｌｙｓ９メチル化は、ｃｌｒ４Ｄ株において両方の遺伝子座に存在しなかった。この結果は、Ｈ３ Ｌｙｓ９がＣｌｒ４ ＨＭＴａｓｅ活性の生理学的標的であること、および、Ｃｌｒ４がｍａｔおよびｃｅｎ遺伝子座での排他的なインビボＨ３ Ｌｙｓ９−特異的ＨＭＴａｓｅであるようであることを、示唆する。ＳＥＴドメインのみがＣｌｒ４ ＨＭＴａｓｅ活性に必要とされることを示すインビトロ結果と比較して、クロモドメインおよびＳＥＴドメインの両方が、インビボでのＨ３ Ｌｙｓ９のメチル化およびＳｗｉ６の局在化に必要される。まとめると、これらの結果は、クロモドメインが、おそらく、ｍａｔ２／３領域およびセントロメアへＣｌｒ４を標的化するために必要とされ、一方、Ｃｌｒ４のＳＥＴドメインおよび関連するシステインリッチ領域が、触媒部位を構成することを示す。異なるｃｌｒ４変異体バックグラウンドにおけるｍａｔおよびｃｅｎでのＳｗｉ６レベルは、Ｈ３ Ｌｙｓ９メチル化のレベルと直接的に相関し、これは、サイレントな染色体ドメインでのＳｗｉ６の局在化が、Ｈ３ Ｌｙｓ９のメチル化に機能的に依存することをさらに示唆する。
【００９５】
インビボ分析の重要性は、インビトロでＨＭＴａｓｅ活性を減少するＣｌｒ４におけるいくつかの変異が、インビボでＨ３ Ｌｙｓ９メチル化およびＳｗｉ６の局在化を実質的に減少しないという観察によって、さらに強調された。さらに、Ｃｌｒ４のＳＥＴドメインおよびＮＨ２末端システインリッチ領域における変異（Ｇ３７８ＳおよびＲ３２０Ｈ）は、ｍａｔ遺伝子座でのＨ３ Ｌｙｓ９メチル化およびＳｗｉ６の局在化を大いに減少するが；これらの変異は、ｃｅｎ１では中程度またはわずかな効果しか有さない。これらの変異はまた、接合型サイレンシングと比較して、セントロメアサイレンシングに対して弱い効果を有する。これらの結果は、インビトロで組換えモノマータンパク質によって示された酵素的欠損が、インビボでのマルチサブユニットの複合体の状態で機能することによって「レスキュー」され得るという概念と一致する。さらに、ｍａｔ２／３領域およびセントロメアの機能的構成が異なり得、そしてさらなる因子が、セントロメアでのＣｌｒ４活性の促進を補助し得る。
【００９６】
ｃｌｒ３ ＨＤＡＣ（これは、Ｈ３ Ｌｙｓ１４を特異的に脱アセチル化する）における変異は、ｍａｔおよびｃｅｎでのサイレンシングに影響する（Ｓ．Ｉ．Ｓ．Ｇｒｅｗａｌ、Ｍ．Ｊ．Ｂｏｎａｄｕｃｅ、Ａ．Ｊ．Ｓ．Ｋｌａｒ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５０、５６３（１９９８））。ＣｈＩＰ分析は、Ｈ３ Ｌｙｓ１４のＨＤＡＣ活性において部分的に欠損性のｃｌｒ３−７３５変異体が、そのＨＤＡＣ活性の明らかな減少と同時に、ｏｔｒ１：：ｕｒａ４＋でのＨ３ Ｌｙｓ９メチル化およびＳｗｉ６局在化における中程度の減少を示すことを実証した。この結果は、Ｈ３ Ｌｙｓ１４のアセチル化が、インビボでＣｌｒ４のＨＭＴａｓｅ活性を阻害することを示唆する。Ｃｌｒ３とＣｌｒ４との間の機能的相互作用をさらに調査するために、ｃｌｒ３−７３５およびｃｌｒ４Ｒ３２０Ｈ変異を含む二重変異体株を作製した。このｃｌｒ４変異は、ｏｔｒ１Ｒ：：ｕｒａ４＋でのＨ３ Ｌｙｓ９メチル化に対する最小の効果を有する。この二重変異体のＣｈＩＰ分析は、Ｈ３ Ｌｙｓ９のメチル化およびＳｗｉ６の局在化が、その単一の変異体と比較して、ほとんど消失されることを実証した。これらの知見は、Ｃｌｒ３が、Ｃｌｒ４と相乗的に作用し、Ｓｗｉ６をヘテロクロマチンドメインに効果的に局在化させることを示す。言い換えると、Ｃｌｒ３によるＨ３ Ｌｙｓ１４の脱アセチル化は、Ｃｌｒ４によるＨ３ Ｌｙｓ９のメチル化およびＳｗｉ６の局在化に、間接的（Ｃｌｒ４活性を変化させることによって）にかまたは直接的にかのいずれかで、あるいはその両方で必要とされる。これらのデータはまた、Ｌｙｓ９に隣接する残基、および潜在的にはそれらの修飾状態が、適切なＨ３ Ｌｙｓ９−メチル標識の確立に重要な役割を果たすという理論を支持する。以前の研究は、ｒｉｋ１＋が、サイレンシングおよびサイレントな遺伝子座でのＳｗｉ６の局在化に影響することを示した。コンピューター分析は、Ｒｉｋ１が、ＷＤ−４０反復タンパク質内に代表的に見出され、かつタンパク質：タンパク質相互作用に関与することが理論付けられているｂ−プロペラドメインを含むことを明らかにした。ｒｉｋ１における変異は、野生型と比較して、ｍａｔおよびｃｅｎの両方でＨ３ Ｌｙｓ９のメチル化およびＳｗｉ６の局在化を完全に消失させた。
【００９７】
ＷＤ−４０タンパク質は、クロマチン再構成およびヒストン代謝の多くの局面（例えば、クロマチンアセンブリおよびヒストンのアセチル化または脱アセチル化）に関与する。従って、Ｒｉｋ１のｂ−プロペラドメインは、Ｃｌｒ４と複合体を形成して、そのＨＭＴａｓｅ活性をヘテロクロマチン領域に動員し得、そして他のトランス作用性因子（例えば、Ｓｗｉ６およびヒストンデアセチラーゼ）の結合において役割を果たし得る。
【００９８】
Ｈ３ Ｌｙｓ９のＣｌｒ４依存性メチル化に対する、Ｓｗｉ６の可能な役割もまた試験した。Ｓｗｉ６タンパク質レベルが大いに減少された、ｓｗｉ６−１１５（Ｗ２６９Ｒ）変異を保持する株を使用した。予測されたとおり、ｍａｔおよびｃｅｎの両方でのＳｗｉ６局在化は、ＣｈＩＰ分析によって実証されるように、消失された。このｓｗｉ６−１１５変異は、野生型株と比較した場合、Ｈ３ Ｌｙｓ９のメチル化において検出可能な変化を全く生じなかった。これらのデータは、Ｓｗｉ６が、Ｃｌｒ４機能に不必要であることを示し、そしてＳｗｉ６がＣｌｒ４のＨ３ Ｌｙｓ９メチル化の下流で作用することを示唆する。まとめると、上記の結果は、Ｈ３ ＮＨ２−末端テールの共有結合修飾について、サイレンシングされたクロマチン状態の確立を導く事象の時系列を規定する。ＨＤＡＣおよびＨＭＴａｓｅは、協同的に作用して「ヒストンコード」を確立し、次いで、このヒストンコードが、Ｓｗｉ６によって認識される。より詳細には、ＨＤＡＣ（Ｃｌｒ６および／またはＨｄａ１）が、Ｈ３ Ｌｙｓ９を脱アセチル化し、Ｃｌｒ３が、Ｃｌｒ４／Ｒｉｋ１ ＨＭＴａｓｅ複合体によるＨ３ Ｌｙｓ９メチル化の前に、Ｈ３ Ｌｙｓ１４を脱アセチル化する。次いで、Ｈ３ Ｌｙｓ９−メチル修飾へのＳｗｉ６結合は、ヘテロクロマチンアセンブリの自己増幅を生じる。Ｓｗｉ６のヘテロクロマチン結合ドメインは、そのクロモドメインにマッピングされたので、このタンパク質モチーフは、Ｈ３ Ｌｙｓ９−メチル修飾を認識するよう進化したという可能性が最も高い。
【００９９】
Ｓｗｉ６が、細胞周期を通してｍａｔ２／３領域に会合されたままであり、その領域でＳｗｉ６が、後成性の細胞記憶の重要な決定基として作用し、このことが、サイレンシングされた状態の遺伝を促進することが、最近示された。Ｓｗｉ６のマウスホモログであるＭ３１は、Ｓｕ（ｖａｒ）３−９に会合するので、Ｃｌｒ４とＳｗｉ６との間の類似の相互作用が予測される。Ｃｌｒ４のＨＭＴａｓｅ酵素活性の密接な関係、その後の、そのクロモドメインを介するＨ３におけるＬｙｓ９メチル「標識」へのＳｗｉ６の動員および結合は、後成的遺伝の経路を示唆する。Ｃｌｒ４のクロモドメインがＨ３ Ｌｙｓ９−メチル標識を認識する程度は未知であるが、その標識は、Ｃｌｒ４がその後のメチル化事象を行う場合の、クロマチンに結合する手段をその酵素に提供する。高等真核生物におけるＣｌｒ４／ＳＵＶ３９Ｈ１タンパク質およびＳｗｉ６／ＨＰ１タンパク質の保存およびＨ３ Ｌｙｓ９−メチル修飾の存在に基づいて、類似の機構が、分裂酵母からヒトにわたる生物における高次のクロマチンアセンブリを担い得る。ハエおよび哺乳動物におけるＰｏｌｙｃｏｍｂ群のタンパク質による転写抑制と分裂酵母におけるサイレンシングとの間の類似点を考慮すると、ヒストンの脱アセチル化と組み合わせたヒストンのメチル化が、ホメオ遺伝子発現の調節を導く経路においてＰｏｌｙｃｏｍｂを局在化するのを補助し得るという可能性がある。
【０１００】
（実施例３）
（ヒストンＨ３のメチル化の差示的部位は、ヒトＸ染色体上の活性な遺伝子および不活性な遺伝子を標識する）
高等真核生物における染色体は、ユークロマチンおよびヘテロクロマチンの領域からなると歴史的に考えられており、これらは、凝縮の程度およびその根底にあるＤＮＡ配列の転写活性のレベルによって区別される。構成ヘテロクロマチンの特定の領域は、セントロメアのような特殊化された構造またはその付近に見出され、そしてほとんど、遺伝的に不活性な反復配列からなる。対照的に、同じ一次ＤＮＡ配列を有する他の領域は、いずれかの型のクロマチンの特徴を示し得、これは、後成的な要因（例えば、ヒストンおよびクロマチン関連タンパク質によるＤＮＡのパッケージング）が、これらの遺伝子座でのヘテロクロマチン状態を指示することを示唆する。
【０１０１】
後成的サイレンシングの最も劇的な例の１つは、哺乳動物の雌性細胞に見られるＸ染色体不活性化である。このプロセスは、Ｘ連鎖遺伝子の遺伝子量補償を可能にし、それによって、雌性細胞におけるＸ染色体の２つのコピーの一方が、胚発生中にランダムに不活性化される。現在の証拠は、Ｘ不活性化が、非コードＸＩＳＴ転写物の上方調節および不活性化されるべき染色体とのそのシスでの会合によって開始されることを示唆する。ＸＩＳＴ ＲＮＡによるそのコーティング後、不活性なＸ染色体は、遅い複製時点、間期細胞における凝縮された外見（バークロマチン体）、ハウスキーピング遺伝子のＣｐＧ島のＤＮＡメチル化、および低アセチル化ヒストンから構成されそしてＨ２Ａ改変体ＭａｃｒｏＨ２Ａについて富化されている修飾されたヌクレオソームとの会合のような、ヘテロクロマチン特徴を獲得する。Ｘ不活性化の発生におけるこれらの特性の正確な役割は、依然明らかではないが、一旦、不活性な状態が確立されると、これらの後成的特徴は、相乗的に作用して、成体ソーマにおいて多くの細胞分裂を介して不活性Ｘの顕著な安定性を維持するようである。
【０１０２】
近年、いくつかの刊行物により、ヒストンＨ３のメチル化が、マウスおよびＳ．ｐｏｍｂｅにおけるヘテロクロマチンのアセンブリに重要であることが示された（Ｌａｃｈｎｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ４１０，１１６（２００１）；Ｂａｎｎｉｓｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ４１０，１２０（２００１）およびＮａｋａｙａｍａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２，１１０（２００１））。マウスＨＰ１（およびＳ．ｐｏｍｂｅにおけるＳｗｉ６）のクロモドメイン（ｃｈｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ）は、リジン９でメチル化されたＨ３に結合し得、そしてこの部位でのＨ３のメチル化は、ヘテロクロマチンのアセンブリに関与する因子を選び出して補充すると考えられる。さらに、リジン９でのＨ３のアセチル化およびメチル化は、インビボにおいて、競合事象であり得る（Ｃｈｅｕｎｇら，Ｃｅｌｌ １０３，２６３（２０００））。Ｈ３が不活性なＸ染色体上では低アセチル化状態にあり、そしてＨ３のリジン９でのメチル化がヘテロクロマチンのアセンブリに重要であると仮定して、Ｌｙｓ９メチル化Ｈ３の富化について不活性なＸを調べた。
【０１０３】
Ｌｙｓ９メチル化Ｈ３に特異的な抗体を使用して、間接免疫蛍光法により、正常なリンパ芽球細胞株（ＨＨ）からの雌性ヒト中期染色体を試験した。特に、正常なヒト雌性リンパ芽球細胞株（ＨＨ）および５つのＸ染色体を含む雌性リンパ芽球細胞株（６０６１Ｂ）を増殖させ、収集し、そしてＣｙｔｏｓｐｉｎでの３回の遠心分離で顕微鏡スライド上に集めた。修飾されたヒストンを、本質的に他で詳細に記載された（ＣｏｓｔａｎｚｉおよびＪ．Ｒ．Ｐｅｈｒｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３９３，５９９（１９９８））ようにして、間接免疫蛍光法により検出した。簡潔には、細胞を、Ｌｙｓ９メチルＨ３またはアセチルＨ４の一次抗血清の段階希釈物と共に、加湿チャンバー内において３７℃で１時間インキュベートし、そしてＫＣＭ（１２０ｍＭ ＫＣｌ，２０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＣＬ（ｐＨ８．０），０．５Ｍ ＥＤＴＡ，０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ）中において洗浄した。次いで、この細胞を、Ｃｙ３と結合体化されアフィニティー精製されたロバ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）（ＫＣＭ中において１：４０に希釈）と共に、室温にて３０分間インキュベートした。細胞を、再度ＫＣＭで洗浄し、そして室温にて１０分間にわたり４％ホルムアルデヒド中で固定した。滅菌水中で洗浄した後、染色体を、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で対比染色し、抗退色剤（ａｎｔｉｆａｄｅ）（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）中にマウントし、そしてＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｈｏｔ蛍光顕微鏡で観察した。
【０１０４】
Ｌｙｓ９メチル化Ｈ３に特異的な抗体を使用する間接免疫蛍光法によって、大半の染色体はＬｙｓ９メチル化Ｈ３のいくつかの領域を有するが、各中期スプレッド（ｓｐｒｅａｄ）における１つの染色体は一貫して、より強くかつ均一に染色されることが明らかにされた（図１Ａ、白色矢印）。Ｌｙｓ９メチル化Ｈ３を富化した染色体が、不活性なＸ染色体であるか否かを調べるために、５つのＸ染色体を含む細胞株由来の中期スプレッドもまた染色した。これらの細胞において、５つのＸ染色体のうちの４つは、不活性であることが既知である。そして実際、同じサイズの４つの染色体は、Ｌｙｓ９メチルＨ３抗体による濃厚な染色を示す。まとめると、これらのデータにより、不活性なＸにおけるＨ３分子は大部分が低アセチル化状態であるが、そのＨ３分子はリジン９で高度にメチル化されていることが示唆される。
【０１０５】
ヒストンＨ３のＮ末端は、複数の部位で翻訳後修飾される。そしてＨ３のリジン４は、証明された別のメチル化部位である。しかし、リジン９とは対照的に、リジン４のメチル化は、活性な転写と相関した。不活性なＸ染色体におけるこれらの２つのＨ３メチル化部位をさらに比較するため、Ｌｙｓ４メチル化Ｈ３に特異的な抗体を用いて、中期染色体を染色した。雌性細胞株ＨＨおよび６０６１Ｂ由来の中期染色体を、Ｌｙｓ４メチルＨ３抗血清と共にインキュベートし、そしてその染色パターンを、先に記載した間接免疫蛍光法によって分析した。顕著なことに、この抗体は、１スプレッドあたり一つの染色体を除いて、中期スプレッドのすべての染色体を強度に染色する（図１Ｂ）。この独特の染色体は、Ｈ３リジン４メチル化のいくつかの「ホットスポット」を除いて、ほぼ全く染色されない。５Ｘ細胞株の中期スプレッドの染色は、これらの染色体のうちの４つが、Ｌｙｓ４メチルＨ３抗体を使用すると過少染色（ｕｎｄｅｒｓｔａｉｎ）であること示す。このことは、低Ｈ３ Ｌｙｓ４メチル化染色体が、不活性なＸ染色体であることを示唆している。
【０１０６】
不活性なＸ染色体に関するより精密な試験によって、Ｌｙｓ４メチルＨ３抗体で強い染色を示す、この染色体のいくつかの異なる領域が存在することが示されている。１つの領域は、ｐ腕の遠位末端の偽常染色体領域に位置付けられるようであり、別の領域は、ｑ腕のＸｑ２５−２６付近に位置付けられる。そして、かすかな染色が、Ｘｐ１１周辺で時折観察される。Ｘｑ２５−２６を除いて、不活性なＸにおけるＬｙｓ４メチルＨ３染色の他の領域は、不活性化を回避することが公知の複数の遺伝子の位置に対応する（Ｃａｒｒｅｌら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６，１４４４０（１９９９））。従って、これらのデータは、Ｈ３のＬｙｓ４メチル化が、活性な遺伝子発現と関連付けられるという考えと一致する。
【０１０７】
Ｌｙｓ４メチルＨ３抗体によるＸｑ２５−２６領域の強い染色は、当惑させる。なぜなら、この領域は、Ｘの不活性化を回避するいかなる既知の遺伝子をも含まないからである。しかし、Ｘｑ２５−２６．１でのヘテロ接合性の損失は、進行したヒト卵巣癌腫と関連付けられるということは興味深い（Ｃｈｏｉら，Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ２０，２３４（１９９７）を参照のこと）。不活性なＸ染色体上のこの領域でのＬｙｓ４メチル化Ｈ３の富化に関するさらなる研究、およびＨ３のＬｙｓ４／Ｌｙｓ９のメチル化が、この位置での推定癌抑制遺伝子の発現レベルと相関するか否かを決定することによって、ヒストンＨ３のメチル化と遺伝子発現との間の関係に関するさらなる情報が提供される。
【０１０８】
Ｌｙｓ４メチルＨ３抗体による不活性なＸ染色体の過少染色は、Ｈ４の過剰アセチル化形態に対する抗体でのこの染色体の染色パターンと類似するが、同一ではない。この研究において、不活性なＸ染色体のｐ腕のテロメア領域におけるいくらかの染色が、過剰アセチル化Ｈ４に対する抗体を用いて観察されたが、Ｘｐ１１およびＸｑ２５−２６の領域では観察されなかった。対照的に、以前に公表された結果は、不活性なＸ染色体上の３つの領域（Ｘｐｔｅｒ−２２．２、Ｘｐ１１．３−１１．２およびＸｑ２２）が、過剰アセチル化Ｈ４に対する抗体で染色されたこと、しかしこれが、酪酸ナトリウムで処理されたヒト細胞中においてのみ観察されたことを示した。現在、過剰アセチル化Ｈ４の抗体によって染色される領域と、Ｌｙｓ４メチルＨ３の抗体によって染色される領域との間の正確な関係は明確に規定されていない。にもかかわらず、これらのデータは、不活性なＸ染色体が、過剰アセチル化コアヒストンおよびＬｙｓ４メチル化Ｈ３を欠くが、Ｌｙｓ９でメチル化されたＨ３を富化していることを示唆する。まとめると、ヒストン修飾のこれらの組み合わせは、不活性なＸの転写的なサイレンシングを媒介する一連の協調的反応の一部であり得る。
【０１０９】
Ｈ３ Ｌｙｓ９メチル化と不活性なＸ染色体との間の関係をさらに確立するために、免疫蛍光法と蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）との組み合わせによって、ヒト雌性ＩＭＲ９０間期細胞を試験した。特に、ＩＭＲ９０（ＡＴＣＣ）細胞を、カバーガラス上で２４〜４８時間増殖させ、次いで、４％ホルムアルデヒド中において１５分間室温で固定した；次いで、この細胞を、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むＰＢＳ中において４分間氷上で透過化し、ＰＢＳ中で洗浄し、次いで、２×ＳＳＣ中で洗浄し、次いで、ＲＮＡ ＦＩＳＨを行った。核の構造を保存するために、細胞を持続的に水和し続けた。ＲＮＡ ＦＩＳＨハイブリダイゼーションおよび洗浄を、本質的に他で記載された（Ｌａｃｈｎｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ４１０，１１６（２００１））ようにして実施した。簡潔には、細胞を、合計４．５ｋｂの配列にわたる４つのエキソン由来ＤＮＡフラグメントのプールを含むＸＩＳＴプローブでハイブリダイズし、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ＲｅｄまたはＧｒｅｅｎ ｄＵＴＰ（Ｖｙｓｉｓ，Ｄｏｗｎｅｒ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）でのニックトランスレーションにより標識した。３７℃での一晩のハイブリダイゼーション後、ＲＮＡ ＦＩＳＨについての標準的な洗浄（すなわち、５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ中で３回、および２×ＳＳＣ中で３回）を実施した。次いで、細胞を、ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ中で洗浄し、次いで、免疫蛍光法を実施した。一次抗体を室温で１時間インキュベートし、細胞をＰＢＳ中において４回洗浄し、次いで、二次抗体（Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ結合体化ヤギ抗ウサギ抗体）を室温で１時間適用し、次いで、ＰＢＳ中で４回洗浄した。核を、ＤＡＰＩで対比染色した。画像を、Ｏｒｃａ ２ ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）とＩｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎソフトウェア（ＩＰＬａｂ）とを備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ ２蛍光顕微鏡を使用して得た。
【０１１０】
ＸＩＳＴ転写物が、中期ではなく間期の不活性なＸ染色体に特異的に位置付けられること、およびＸｉｓｔ転写物の位置は、ＦＩＳＨ分析によって検出され得ることは、十分に確証されている。Ｌｙｓ９メチルＨ３抗体は、ＤＡＰＩ濃密領域との共存によって示されるようなヘテロクロマチン濃密領域を優先的に染色する。この濃縮された領域はまた、ＸＩＳＴ ＲＮＡシグナルと共存する。このことは、Ｌｙｓ９メチル化Ｈ３を富化した染色体が、実際に、不活性なＸであることを示す。中期染色体の結果と一致して、Ｌｙｓ４メチルＨ３抗体でのヒト間期細胞の染色は、不活性なＸに対応する領域（ＤＡＰＩ濃密染色およびＸｉｓｔ ＲＮＡの位置に基づく）が、Ｌｙｓ４メチルＨ３の染色を欠くことを示している。興味深いことに、Ｌｙｓ４メチルＨ３を富化した異なるドットが、いくつかの細胞について、ネガティブ染色領域内で観察される。Ｌｙｓ４メチルＨ３染色のこの位置付けられた領域が、中期染色体で観察される強く染色される領域に対応するのか否かは、現在知られていない。間期細胞および中期細胞におけるＬｙｓ９メチルＨ３染色およびＬｙｓ４メチルＨ３染色を並べた比較によって、さらに、これらの２つの抗体のそれぞれの染色パターンが、ほぼ相反的な画像であることが示された。これらの結果は、Ｈ３のリジン４およびリジン９でのメチル化が、それぞれ、転写的に活性な領域および不活性な領域についての「相反マーカー」であり、従って、不活性なＸ染色体は、リジン４では低アセチル化状態であるが、リジン９では過剰メチル化状態であるという結論へと導いた。
【０１１１】
生ずる１つの予測は、Ｌｙｓ４メチルＨ３抗体およびＬｙｓ９メチルＨ３抗体が、それぞれ、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）によって、Ｘ染色体上の活性なＦＦ４３遺伝子および不活性な遺伝子について富化するということである。不活性なＸ染色体において、ＸＩＳＴ遺伝子は転写的に活性であるが、ＰＧＫ１遺伝子はサイレントである。逆に、活性なＸ染色体において、ＸＩＳＴ遺伝子はサイレントであるが、ＰＧＫ１遺伝子は活性に転写される。上記の仮説を調べるために、ＣｈＩＰアッセイにおいて、単一の活性なヒトＸ染色体または不活性なヒトＸ染色体のいずれかを含む２つのＣＨＯ体細胞ハイブリッド細胞株を使用して、活性なＸ染色体または不活性なＸ染色体上に存在する遺伝子と関連付けられるヒストン修飾を試験した。これらの２つの細胞株由来のクロマチンを、Ｌｙｓ９メチル化Ｈ３、Ｌｙｓ４メチル化Ｈ３またはＬｙｓ９／１４アセチル化Ｈ３に対する抗体を用いて免疫沈降した。そして免疫沈降したＤＮＡを、ヒトＸｉｓｔ遺伝子およびＰＧＫ１遺伝子のプロモーター領域に対して特異的なプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。
【０１１２】
特に、クロマチン免疫沈降アッセイを、Ｃｈｅｕｎｇら，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ５，９０５（２０００）に記載されるように実施した。この場合、ホルムアルデヒドで固定されたクロマチンを、活性なヒトＸ染色体または不活性なヒトＸ染色体のいずれかを含むＣＨＯ体細胞ハイブリッドから収集した。明細書に示される抗体を用いた免疫沈降反応１回あたり、約３×１０６細胞に値する超音波処理クロマチンを使用した。広範な洗浄、逆架橋化（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ）、ＲＮａｓｅＡおよびプロテインキナーゼＫでの消化の後に、免疫沈降されたＤＮＡを、ヒトＸＩＳＴ遺伝子およびＰＧＫ１遺伝子のプロモーター領域に特異的なプライマー（プライマー配列およびＰＣＲ条件は、ＧｉｌｂｅｒｔおよびＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６，１３８２５（１９９９）に由来した）を使用するＰＣＲによって分析し、そしてポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。
【０１１３】
以前に公表された報告と一致して、アセチル化Ｈ３抗体は、不活性なＸ染色体からはＸＩＳＴ ＤＮＡのみを免疫沈降し、そして活性な染色体からはＰＧＫ１ ＤＮＡのみを免疫沈降した。これらの結果と類似して、Ｌｙｓ４メチルＨ３抗体は、ＸＩＳＴを活性に発現する細胞から（不活性なＸ染色体を含む細胞から）はＸＩＳＴ ＤＮＡを優先的に免疫沈降し、そして活性なＸ染色体を含む細胞からはＰＧＫ１ ＤＮＡを優先的に免疫沈降した。従って、アセチル化Ｈ３およびＬｙｓ４メチル化Ｈ３の両方は、活性なＸ染色体および不活性なＸ染色体の両方において、活性に転写されている遺伝子座で富化される。Ｌｙｓ９メチルＨ３抗体を使用する免疫沈降は、Ｌｙｓ４メチルＨ３抗体およびＬｙｓ４アセチルＨ３抗体を用いて得られる免疫沈降に対して相反的な結果を示した。この場合、ＸＩＳＴ ＤＮＡは、活性なＸ染色体を含む細胞からのみ免疫沈降されたが、ＰＧＫ１ ＤＮＡは、不活性なＸ染色体からのみ免疫沈降された。
【０１１４】
まとめて考えると、このクロマチン免疫沈降データは、Ｌｙｓ４またはＬｙｓ９でメチル化されたＨ３が、染色体の状況（活性なＸ 対 不活性なＸ）とは無関係に、活性な遺伝子および不活性な遺伝子と相反的に関連付けられることを示す。さらに、免疫蛍光での結果と組み合わせると、これらのデータは、Ｈ３における２つの異なるメチル化部位がそれぞれ、活性なクロマチンおよび不活性なクロマチンの標識領域であり得ることを示唆している。
【０１１５】
不活性なＸ染色体は、遺伝子発現の後成的な調節および転写サイレンシングを伴う特殊化されたヌクレオソーム構造の連結について、十分に研究された範例である。始めに言及したように、不活性なＸ染色体全体は、過剰アセチル化されたヒストンが大きく欠けているようであり、そしてコアヒストン改変体であるＭａｃｒｏＨ２Ａは、不活性Ｘ染色体において富化されていることが見出されている。興味深いことに、上記の修飾単独では、いずれもこの型の後成的な調節と関連する安定性を説明することができない。しかし、ヒストンメチル化が、Ｘ不活性化におけるその機能であるより「安定な」後成的クロマチン標識、そして可能性のある細胞性「記憶」マーカーがなおも探索されるべきことに関して、近年記載されている。
【０１１６】
より最近、ヒストンＨ３のリジン９におけるメチル化が、ヘテロクロマチンアセンブリに関して重要な修飾であることが規定され、そして本明細書中に示されるように、この修飾はまた、不活性Ｘ染色体の任意のヘテロクロマチンにおいて富化されている。対照的に、Ｈ３のリジン４におけるメチル化は、不活性Ｘ染色体において相補的に欠けていて、このことは、これらの２つの異なる部位におけるＨ３のメチル化が相反的であり得ること、およびリジン４においてメチル化されたＨ３分子は、転写的に活性な遺伝子と優先的に関連し、一方、その逆がリジン９においてメチル化されたＨ３について真であることを示唆する。これらの知見は、ヒストンアミノ末端テイル上の特定の部位における特定の修飾が異なる特徴を与え得、そして異なる細胞性機能を実行し得るという概念を支持する強力な証拠を提供する。
【０１１７】
クロマチン結合因子を補充するように機能するリジン９においてメチル化されたＨ３についての優先度を示してきたが、この修飾がＸ染色体の不活性化にどのように関与し得るかについては、未だ明らかではない。同様に、リジン４においてメチル化されたＨ３は、転写促進因子を補充するためか、または転写抑制因子の結合をブロックするために機能し得る；しかし、これらの可能性についての直接的な証拠は、いずれもまた欠けている。現在のＣｈＩＰアッセイは、Ｘ連結遺伝子のプロモーターを調べるのみであるが、これらそれぞれ２つの部位においてメチル化されたＨ３は染色体ドメインを区別するゲノムワイドな標識であるであることが予想される。真核生物ゲノムの活性領域および不活性領域は、対照クロマチン構造（ユークロマチン 対 ヘテロクロマチン）を適用するだけでなく、異なる核内ドメインを占有することもまた示されている。従って、リジン４またはリジン９におけるＨ３のメチル化は、転写許容環境 対 転写制限環境に関連する染色体領域の空間的な分布を規定し得る。
【０１１８】
同様に興味をそそることは、メチル化反応を担う酵素の問題である。これまでの研究により、ｈＳｕＶａｒ３−９がＨ３ リジン９特異的なヒストンメチルトランスフェラーゼであることが示されているが、ＳｕＶａｒ３−９ノックアウト胚由来の線維芽細胞は、不活性Ｘ染色体においてメチル化されたリジン９の富化を保持している。
【０１１９】
（実施例４）
（プラダー−ウィリー刻印づけ中心におけるヒストンＨ３ Ｌｙｓ９メチル化およびヒストンＨ３ Ｌｙｓ４メチル化の親特異的相補パターン）
刻印付け遺伝子座位は、父系対立遺伝子と比較して、発生のいくつかの段階または発生の全段階においていくつかの組織または全組織で母系の差次的発現を示す。刻印付け遺伝子座位の母系対立遺伝子と父系対立遺伝子との間の機能的な差異は、これらの座位を含む領域において母系染色体と父系染色体との間の構造的な差異を反映するに相違ない。これらの構造的な差異の確立のための最も簡単なモデルは、染色体ドメインが卵形成および精子形成の間に差次的に標識され、そしてこれらの生殖体刻印付け標識が体細胞における受精後も維持されるということを保持する。しかし、生殖体刻印付け標識が、受精後の差次的な遺伝子発現の原因となる刻印付け標識と同一であることを想定する論理に基づいた理由は存在しない。生殖体標識が体細胞標識と同じでない場合、生殖体標識を読み取り、そしてその情報を用いて体細胞刻印付け標識を強いるための機構が存在するはずである。
【０１２０】
哺乳動物における刻印付け標識の同一性は、広範囲な推測および実験分析の対象である。興味をそそる候補の刻印付け標識は、ＣｐＧジヌクレオチド中の５−メチルシトシンである。多くの刻印付け座位が、刻印付け領域の親起源特異的ＤＮＡメチル化を示し、そしてこれらの親特異的ＤＮＡメチル化標識のうちのいくつかは、配偶子形成の間に確立され、そして体細胞において維持される。メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを複製するための機構が存在する：メンテナンスＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）は半分メチル化されたＤＮＡ（一方の鎖でのみメチル化されたＤＮＡ）を認識し、そして相補鎖上のシトシン残基にメチル基を添加する。刻印付けとしてのシトシンメチル化の支持に頻繁に引用される実験は、ＤＮＭＴ１−／−胚（これは、胚発生の初期に消滅する）が、いくつかの刻印付け座位の二対立遺伝子（ｂｉａｌｌｅｌｉｃ）発現（その正常な一対立遺伝子発現は、不活性対立遺伝子のシトシンメチル化と関連する）を示すことの観察である。
【０１２１】
豊富なデータが刻印付けとしてのシトシンメチル化と一致するが、さらなる分子刻印付けまたは代替的な分子刻印付けについてのいくつかの証拠の路線が存在する。第１に、マウスＭａｓｈ２、ヒトＣＤＫＮ１Ｃ、およびヒトＵＢＥ３Ａを含む多数の刻印付け遺伝子は、親特異的ＤＮＡメチル化の領域を示していない。第２に、いくつかの遺伝子は、差次的にメチル化される領域の保存を示さない刻印付けの進化的な保存を示し、このことは、差次的なシトシンメチル化が一次刻印付けの二次的な結果であり得ることを示唆する。第３に、Ｍａｓｈ２刻印付けは、ＤＮＭＴ１−／−マウス胚において乱されていない。最後に、プラダー−ウィリー症候群（ＰＷＳ）刻印付け中心（ＩＣ）中の刻印付けＳＮＲＰＮ遺伝子のプロモーター領域は、マウスおよびヒトの体組織において差次的なシトシンメチル化を示し、そしてこの領域は、マウス卵母細胞において重度にメチル化されるが、マウス精子においてはメチル化されていない；しかし、Ｅ１−Ｍａａｒｒｉら（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．２７，３４１（２００１））は最近、この領域が、ヒト卵母細胞において全くメチル化されておらず（ヒト精子も同様）、ゆえに、差次的なシトシンメチル化は受精後に生じるに違いないということを示している。
【０１２２】
これらのデータは、少なくともいくつかの刻印付け遺伝子およびいくつかの刻印付け領域において、受精後に差次的な遺伝子発現を導く、生殖体から遺伝した母系対立遺伝子と父系対立遺伝子との間の構造的な差異が、シトシンメチル化以外の何かであるに違いないという結論を導く。原則として、この構造的な差異は、シトシンメチル化以外のＤＮＡの遺伝性共有結合的修飾、体細胞分裂を介して生殖体由来の母系染色体または父系染色体のいずれかと安定に結合したままのＤＮＡ結合タンパク質、または親特異的様式で遺伝されるＤＮＡ結合タンパク質の共有結合的修飾であり得る。
【０１２３】
ヒストン修飾（特に、アセチル化）は、これまでに、おそらく他の転写因子への接近性を増大させるようにクロマチン構造を変化させることによって、多数の転写調節タンパク質の効果を媒介することが示されている。アセチル化ヒストン（これは、極めて不安定である）と異なり、ヒストンに結合したメチル基は、非常に低レベルの代謝回転を示し、このことが、ヒストンメチル化を刻印付けのような後成的プロセスにおける良好な候補修飾としている。従って、近年Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａおよび分裂酵母中の安定なサイレンス（ｓｉｌｅｎｃｅｄ）クロマチン領域の形成と関連付けられているヒストン修飾（ヒストンＨ３のＬｙｓ９でのメチル化）は、ヒストンＨ３のＬｙｓ４でのメチル化（これは、テトラヒメナにおける転写活性と相関付けられている）と共に調べられている。
【０１２４】
ヒト染色体１５ｑ１１−ｑ１３中のプラダー−ウィリー症候群（ＰＷＳ）／アンジェルマン症候群（ＡＳ）領域は、約２Ｍｂの領域内に少なくとも１０個の刻印付け遺伝子を含む（Ｎｉｃｈｏｌｌｓら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１４、１９４（１９９８））；これらの遺伝子のうち８個は、父系染色体から排他的に発現され、そしてこれらの遺伝子のうち活性な父系対立遺伝子の欠損は、ＰＷＳ（これは、乳児低血圧、軽度の発達遅延、および後期発生型の摂食亢進および肥満によって特徴付けられる）を引き起こす。この領域における１つの遺伝子（ＵＢＥ３Ａ）の活性な母系対立遺伝子の欠損は、ＡＳ（これは、いくつかの精神遅滞、言語障害（ｌａｃｋ ｏｆ ｓｐｅｅｃｈ）、発作およびすぐに挑発される笑いによって特徴付けられる）を引き起こす。この領域は、２つの相互排除的な後成的状態（父系状態および母系状態）のいずれかで存在し得る。父系状態の確立は、ＳＮＲＰＮプロモーターをシスで含むＰＷＳ刻印付け中心（ＰＷＳ−ＩＣ）と称されるＤＮＡセグメントを必要とし；母系状態の確立は、ＡＳ−ＩＣと称されるＰＷＳ−ＩＣの動原体の、約３０ｋｂのＤＮＡセグメントを必要とする。この領域の後成的状態を確立する際のＰＷＳ−ＩＣおよびＡＳ−ＩＣの機能は、知られていない。
【０１２５】
コントロール（ＰＷＳ個体（欠失または刻印付けの欠損を介して１５ｑ１１−ｑ１３の父系コピーを欠いている）およびＡＳ個体（１５ｑ１１−ｑ１３の母系コピーを欠いている）の刺激リンパ球から調製したクロマチンを、Ｌｙｓ９でメチル化されたＨ３またはＬｙｓ４でメチル化されたＨ３のいずれかに対して特異的な抗体を用いて免疫沈降した。免疫沈降から収集したＤＮＡを、ＳＮＲＰＮプロモーターを含むＰＷＳ−ＩＣ中の配列およびこの領域中の他の配列についてＰＣＲによってアッセイした。ＰＷＳ刻印付け中心（ＰＷＳクロマチン中に存在する）の母系コピーを、抗メチルＬｙｓ９ Ｈ３抗体によって免疫沈降し、一方で、（ＡＳクロマチン中に存在する）父系コピー上のこの配列の沈降が劇的に低下した。この結果は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａおよび分裂酵母の両方におけるサイレンスヘテロクロマチンの維持がＬｙｓ９ ヒストンＨ３メチルトランスフェラーゼの機能を必要とするという観察と十分に相関する。母系特異的Ｈ３ Ｌｙｓ９メチル化領域は、ＳＮＲＰＮプロモーターから５’側に０．６ｋｂおよび３’側に０．５ｋｂ延びる。逆に、ＰＷＳ−ＩＣの父系コピーを、抗メチルＬｙｓ４ Ｈ３抗体によって免疫沈降した。この配列は、母系コピーに対して沈降しなかった。この修飾と活性クロマチンの関係についての以前の報告は、これらの知見と一致する。
【０１２６】
メチルＬｙｓ９ Ｈ３の親特異的差次的結合は、父系で発現されるＺＮＦ１２７、ＮＤＮ、ＭＡＧＥＬ２、ＩＰＷならびに組織特異的な母系発現を示すＵＢＥ３ＡおよびＡＴＰ１０Ｃを含む１５ｑ１１−ｑ１３中の他の刻印付け遺伝子のプロモーターで検出されなかった。メチルＬｙｓ９ Ｈ３はまた、ＡＳ−ＩＣと結合しなかった。しかし、メチルＬｙｓ４ Ｈ３が、父系活性遺伝子であるＮＤＮの父系対立遺伝子のプロモーター領域と特異的に結合することが見出された。リンパ球クロマチンにおける親特異的Ｌｙｓ４メチル化は、ＺＮＦ１２７、ＭＡＧＥＬ２、ＩＰＷ、ＵＢＥ３Ａ、またはＡＴＰ１０Ｃについて検出されなかった。
【０１２７】
記載された各修飾（シトシンメチル化、ヒストンＨ３およびＨ４のアセチル化、ヒストンＨ３ Ｌｙｓ４メチル化、およびヒストンＨ３ Ｌｙｓ９メチル化）は、異なる分布パターンおよび親特異性を示す。ＳＮＲＰＮプロモーターと重複するＰＷＳ−ＩＣは、最も広範囲な修飾パターン（母系対立遺伝子上のシトシンメチル化およびＨ３ Ｌｙｓ９メチル化、ならびに父系対立遺伝子上のヒストンＨ３およびＨ４のアセチル化、およびヒストンＨ３ Ｌｙｓ４メチル化）を示す。父系ＳＮＲＰＮプロモーター領域はまた、母系染色体上に存在しない非常に顕著なヌクレア−ゼ過剰感作性部位の部位である。差次的なシトシンメチル化を示すＮＤＮのプロモーター領域は、差次的なヒストンアセチル化も差次的なＨ３ Ｌｙｓ９メチル化もいずれも示さない。
【０１２８】
ヒトＰＷＳ刻印付け中心が卵母細胞においてシトシンメチル化を欠くことは明らかである；従って、この修飾は、ＡＳ／ＰＷＳ領域に対する生殖体刻印付けであり得ない。ＰＷＳ刻印付け中心の親特異的ヒストン修飾（Ｈ３アセチル化およびＨ４アセチル化、ならびにＨ３ Ｌｙｓ４メチル化）の間でもまた、精子がヒストンを欠くので生殖体刻印付けがなされ得ず、従って、父系生殖体刻印付けはヒストン修飾であり得ない。しかし、メチルＬｙｓ９ Ｈ３は、配偶子形成の間にＰＷＳ刻印付け中心においてヒストンに対して強いられ得る潜在的な候補刻印付け標識である。母系ヒストン修飾刻印付けは、ヒストンがクロマチンから取り出され、プロタミンによって置換される場合、精子形成の間にプログラムされた抹消を引き起こす特徴的な特性を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａおよび図１Ｂは、Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体（図１Ａ）またはＭｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体（図１Ｂ）のいずれかを用いて染色した正常雌性細胞株（ＨＨ）由来のヒト中期染色体の免疫蛍光検査法のパターンを示す。Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体またはＭｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体の局在は、Ｃｙ３結合二次抗体（ｒｅｄ）を用いて検出した。一方の優先的に染色される染色体と他方の染色体（大きな矢印で示す）との比較を示す２つの抗体を用いて、各々の免疫蛍光検査法のパターンを得た。図１Ｂに示されるように、不活性なＸ染色体の小さな領域のみが、Ｌｙｓ４メチルＨ３染色について増強される。
【図２】
図２は、体細胞ハイブリッド細胞株のＣＨＩＰ分析を示す。不活性（Ｘ不活性）または活性（Ｘ活性）ヒトＸ染色体を含む体性のハイブリッドＣＨＯ細胞由来のクロマチンは、以下の抗体を用いて免疫沈降される：
レーン１＝抗体なし（コントロールレーン）；レーン２＝Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３；
レーン３＝Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３；レーン４＝Ｌｙｓ９／１４−アセチル化Ｈ３；
レーン５＝ＤＮＡなし（コントロール）；レーン６＝ゲノムＤＮＡ。
免疫沈降されたＤＮＡ中のＸｉｓｔおよびＰＧＫ１プロモーターＤＮＡ配列の存在は、ＰＣＲによってアッセイした。ＰＣＲ産物を、１５％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、デジタルカメラによってイメージ化し、そしてそのイメージを臭化エチジウムで染色したバンドの視覚化を促進するために電子的に反転させた。不活性なＸ染色体を含む細胞から示されるように、Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体およびＬｙｓ９／１４アセチルＨ３抗体は、活性Ｘｉｓｔ遺伝子を優先的に免疫沈降させる。ところが、Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体は、不活性ＰＧＫ１遺伝子を優先的に免疫沈降させる。活性Ｘ染色体を含む細胞は、全く逆の免疫沈降パターンが観察された。
【図３】
図３は、単純な生物対複雑な生物との間のＨ３メチル化の免疫ブロット分析を示す。種々の供給源から単離したヒストン（各々の種からコアヒストンの総計５ｕｇ）は、１μｇの組換えＸｅｎｏｐｕｓ Ｈ３と一緒に、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離され、ＰＶＤＦ膜支持体に転写され、そしてＭｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体またはＭｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体のいずれかを用いてプローブした。レーン１〜５は、組換えＸｅｎｏｐｕｓ Ｈ３、出芽酵母、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ、トリおよびヒト細胞株２９３Ｔのそれぞれから単離されたヒストンを示す。同一のサンプルを平行して分析し、ヒストンのローディングをモニターするためにクマシー染色によって試験した。
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下で、２００１年７月３日出願の米国仮特許出願番号第６０／３０２，７４７号および２０００年８月２５日出願の米国仮特許出願番号第６０／２２７，７６７号（これらの開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）の優先権を主張する。
【０００２】
（米国政府の権利）
本発明は、国立衛生研究所により賞与された助成金番号ＲＯ１ ＧＭ４０９２２およびＲＯ１ ＧＭ５３５１２の下で、米国政府の支持により行われた。米国政府は本発明の特定の権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、ヒストンタンパク質の翻訳後修飾により生成されたヒストンエピトープに結合する抗体、このような抗体を含む組成物、および診断手段およびスクリーニング手段としてのこのような組成物の使用に関する。
【０００４】
（発明の背景）
真核生物において、ＤＮＡは、ヒストンタンパク質と複合体化され、クロマチンの反復サブユニットであるヌクレオソームを形成する。このＤＮＡのパッケージングは、ＤＮＡをテンプレートにするプロセス（例えば、転写または複製）のために、タンパク質がＤＮＡへのアクセスを求めることに厳重な制限を課している。ヒストンアミノ末端の翻訳後修飾が、真核生物細胞ゲノムのクロマチン構造の決定および細胞内遺伝子の発現の調節において重要な役割を果たしていることがますます明らかになってきた。
【０００５】
ヒストンアミノ末端の翻訳後修飾は、クロマチンの構造および機能の制御において中心的な役割を果たすと長い間考えられてきた。ヒストンの多くの共有結合修飾が証明されており、これには、ヒストンのアミノ末端「テール」ドメインに生じるアセチル化、リン酸化、メチル化、ユビキチン化、およびＡＤＰリボシル化が挙げられる。修飾の型におけるこのような多様性およびこれらの修飾を生じる残基の顕著な特異性は、未知のままの複雑な階層の順序（ｏｒｄｅｒ）および組み合わせの機能を示唆する。ヒストンアミノ末端に生じる公知の共有結合修飾のうちアセチル化は、おそらく最も研究され、そして理解されている。最近の研究は、クロマチンにおける標的プロモーターへのそれらの補充に応答して、ヒストンにおいてそれぞれ特異的にリジン残基をアセチル化または脱アセチル化する、予め特徴付けられたコアクチベーターおよびコサプレッサーを同定している（Ｂｅｒｇｅｒ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．１１，３３６−３４１を参照のこと）。これらの研究は、クロマチンの再構築が、ヌクレオソームテンプレートからの転写の調節において基本的な役割を果たしている有力な証拠を提供する。
【０００６】
高等真核生物の染色体は、ユークロマチンおよびヘテロクロマチン（これらは、基礎をなすＤＮＡ配列の凝縮の程度および転写活性のレベルにより識別される）の領域からなると歴史的に考えられてきた。構成的なヘテロクロマチンの特定領域はセントロメアのような特徴的な構造においてかまたはその周囲において見出され、そして遺伝子学的に不活性な反復配列の大部分から構成される。対照的に、同様な初期のＤＮＡ配列を有する他の領域は、クロマチンのいずれかの型の特徴を示し得、これは、ヒストンおよびクロマチン関連タンパク質によるＤＮＡのパッケージングのような後成的因子が、それらの遺伝子座でヘテロクロマチン状態を決定することを示唆している。
【０００７】
特定の翻訳後修飾を保有するヒストンを特異的に認識する抗体の使用によって、出願人らは、「ヒストンコード」を解明している。特に、ヒストンタンパク質およびその関連する共有結合修飾が、クロマチン構造を変更し得るメカニズムに寄与することの証拠が明らかになっており、それにより、転写的な「オン−オフ」状態における遺伝的な相違、または特定の高次構造を規定することによる染色体の安定な伝搬を導く。
【０００８】
ヒストンメチル化は、よく理解されていないヒストンに影響を与える翻訳後修飾の１つである。初期の研究は、Ｈ３およびＨ４が、メチル化よって修飾される主要なヒストンであることを示唆し、そして大量のヒストンを用いる配列決定の研究は、いくつかのリジン（例えば、Ｈ３の９および２７ならびにＨ４の２０）が、種特異的な相違が存在するようではあるけれども、しばしばメチル化の好ましい部位であることを示唆する。興味深いことに、各々の修飾されたリジンは、モノメチル化、ジメチル化、またはトリメチル化される能力を有し得、この翻訳後の「標識」に対する別のレベルのバリエーションをさらに加える。本発明は、特異的リジンでメチル化されるヒストンＨ３およびＨ４に特異的である抗体に関する。より詳細には、本発明の１つの局面は、ヒストンＨ３のリジン４および９に関する。これら２つのリジン残基は、インビボにおいてメチル化されることが見出され、そしてメチル化された形態はそれぞれユークロマチンおよびヘテロクロマチンに関連する。
【０００９】
（定義）
本発明の明細書および請求項において、以下の用語は下に記載される定義に従って使用される。
【００１０】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸」とは、ＲＮＡおよび一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡならびにｃＤＮＡを含む。さらに、用語「核酸」、「ＤＮＡ］、「ＲＮＡ］および類似の用語はまた、核酸アナログ（すなわち、リン酸ジエステル骨格以外を有するアナログ）が挙げられる。例えば、いわゆる「ペプチド核酸」（当該分野に公知であり、骨格にリン酸ジエステル結合のかわりにペプチド結合を有する）は、本発明の範囲内と考えられる。
【００１１】
用語「ペプチド」は、３以上のアミノ酸配列を有し、ここで、このアミノ酸は天然に存在するアミノ酸または合成（天然には存在しない）アミノ酸である。ペプチド模倣物としては、１つ以上の以下の修飾を有するペプチドが挙げられる：
１．１つ以上のペプチジル（ｐｅｐｔｉｄｙｌ）−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−−連結（結合）が以下のような非ペプチジル連結によって置換されているペプチド：−−ＣＨ２−カルバメート連結（−−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−−），ホスホネート結合、−ＣＨ２−スルホンアミド（−ＣＨ２−−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ−）連結、尿素（−−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−−）連結、−−ＣＨ２−二級アミン連結、またはアルキル化ペプチジル連結（−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−−）、ここで、ＲＣ１〜Ｃ４アルキルである；
２．Ｎ−末端が以下に誘導されるペプチド：−−ＮＲＲ１基、−−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ基、−−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ基、−−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ基、ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ基、ここで、ＲおよびＲ１は、水素であるか、またはＣｌ〜Ｃ４アルキルであり、ただし、ＲおよびＲｌは両方とも水素ではない；
３．Ｃ末端が以下に誘導されるペプチド：−−Ｃ（Ｏ）Ｒ２、ここで、Ｒ２は、Ｃｌ〜Ｃ４アルコキシおよび−−ＮＲ３Ｒ４からなる群より選択され、ここで、Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素およびＣ１〜Ｃ４アルキルからなる群より選択される。
【００１２】
ペプチドにおいて天然に存在するアミノ酸残基は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨されるように、以下のように省略される：フェニルアラニンはＰｈｅまたはＦであり；ロイシンはＬｅｕまたはＬであり；イソロイシンはＩｌｅまたはＩであり；メチオニンはＭｅｔまたはＭであり；ノルロイシンはＮｌｅであり；バリンはＶａｔまたはＶであり；セリンはＳｅｒまたはＳであり；プロリンはＰｒｏまたはＰであり；スレオニンはＴｈｒまたはＴであり；アラニンはＡｌａまたはＡであり；チロシンはＴｙｒまたはＹであり；ヒスチジンはＨｉｓまたはＨであり；グルタミンはＧｌｎまたはＱであり；アスパラギンはＡｓｎまたはＮであり；リジンはＬｙｓまたはＫであり；アスパラギン酸はＡｓｐまたはＤであり；グルタミン酸はＧｌｕまたはＥであり；システインはＣｙｓまたはＣであり；トリプトファンはＴｒｐまたはＷであり；アルギニンはＡｒｇまたはＲであり；グリシンはＧｌｙまたはＧであり、そしてＸは、任意のアミノ酸である。他の天然に存在するアミノ酸としては、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリジンといったようなものなどが挙げられる。
【００１３】
本明細書中で使用される場合、用語「保存的アミノ酸置換」は、以下の５つの群のうち１つ以内の交換として本明細書中で規定される：
Ｉ．小さな脂肪族の非極性またはわずかに極性な残基：
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
ＩＩ．負に荷電した極性残基およびそのアミド：
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
ＩＩＩ．正に荷電した極性残基：
Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
ＩＶ．大きな脂肪族の非極性残基：
Ｍｅｔ Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ
Ｖ．大きな脂肪族残基：
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、用語「精製された」および類似の用語は、ネイティブかまたは自然環境における分子または化合物に関連する典型的な混入物を実質的に含んでいない形態における分子または化合物の単離をいう。
【００１５】
「作動可能に連結（される）」とは、化合物がそれらの通常の機能を実施するために構成されるような並列をいう。例えば、制御配列またはコード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、コード配列の発現を行う能力がある。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、用語「相補的（な）」または「相補性」とは、塩基対合則に関連するポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチド配列）を参照して使用される。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」にとって相補的な配列は、配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」である。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、用語「ハイブリダイゼーション」とは、相補的な核酸の対を参照して使用される。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強さ（すなわち、核酸間の結合の強さ）は、核酸間の相補性の程度、関連するストリンジェンシーの条件、形成されるハイブリッドの長さ、および核酸内でのＧ：Ｃ比率のような要素により影響を受ける。
【００１８】
「治療剤」、「薬剤」または「薬物」とは、患者における疾病、苦痛、疾患または傷害の処置（予防、診断、軽減、または治癒を含む）において使用され得る任意の治療剤または予防剤をいう。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、用語「処置する（こと）」とは、特異的な障害または状態に関連する症状を軽減させること、および／あるいは前記の症状を予防するかまたは取り除くことを含む。例えば、癌の処置としては、癌細胞の増殖および／もしくは分裂を予防するか、または遅らせること、ならびに癌細胞を死滅させることが挙げられる。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、用語「薬学的受容可能なキャリア」とは、標準的な薬学的キャリア（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、水およびエマルジョン（例えば、油／水または水／油のエマルジョン）、ならびに種々の型の湿潤剤）のいずれかを含む。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｈ３リジン４の抗原性フラグメント」とは、ヒストン３のアミノ末端の天然ペプチドフラグメント（配列番号１、配列番号２、および配列番号３のペプチドフラグメントを含む）およびそれらのフラグメントの合成等価物の両方を含む。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体あるいはそれらの結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント）をいう。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体またはＭｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体の用語「生物学的に活性なフラグメント」とは、それぞれ配列番号４または配列番号５のペプチドに特異的に結合する能力のある、それぞれの全長抗体の、天然部分または合成部分を含む。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「非経口」とは、皮下的投与、静脈内投与または筋内投与を含む。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、文字Ｋ（太文字の書体）
【００２６】
【化１２】
【００２７】
（本発明の要旨）
本発明は、ヒストンＨ３ペプチドおよびＨ４ペプチドのアミノ末端の特異的修飾に結合する抗体に関する。より詳細には、本発明はメチルリジン特異的ヒストン抗体の生成に関する。これらの抗体は、特異的にメチル化され、そしてヒトの生態および疾患に関連し得るヒストンＨ３およびＨ４のリジン残基を認識する。これらの抗体を含む組成物は、診断手段およびスクリーニング手段として使用される。
【００２８】
（発明の詳細な説明）
ヒストンメチル化は、ヒストンに影響する不十分にしか理解されていない翻訳後修飾である。この修飾は、ヒストンのアミノ末端における選択されたリジン残基において生じる。ヒストンをメチル化する酵素が、遺伝子活性化および抑制の両方に関与していることが、現在明らかになっている。本発明は、メチルリジン特異的ヒストン抗体の産生に関する。これらの抗体は、特異的にメチル化されたヒストンＨ３およびＨ４におけるリジン残基を認識し、そしてヒトの生物学および疾患に関連し得る。
【００２９】
本発明は、コアヒストンタンパク質Ｈ３およびＨ４の可撓性のＮ末端テール上で生じる翻訳後修飾に関する。より詳細には、本発明は、メチル化リジン残基に関する。本出願人らは、Ｈ３のアミノ末端の最初の１５アミノ酸（配列番号７）およびＨ４のアミノ末端の最初の１５アミノ酸（配列番号８）内のリジン残基のメチル化が、転写の調節において重要な役割を果たしていることを発見した。たとえば、ヒストンＨ３上のリジン４（Ｋ４）のメチル化を、クロマチンの転写的に活性な領域に関連付け、一方、ヒストンＨ３上のリジン９（Ｋ９）のメチル化を、遺伝子スプライシングに関連付けた。従って、本発明の１つの局面に従って、ヒストンＨ３上のリジン４（Ｋ４）およびリジン９（Ｋ９）のメチル化は、それぞれユークロマチンおよびヘテロクロマチンのマーカーとして役立ち、そしてこれらの修飾されたタンパク質を認識する抗体は、重要な診断ツールとしての用途を有する。
【００３０】
本発明の１つの局面は、Ｈ３のアミノ末端に特異的な抗体およびＨ４のアミノ末端に特異的な抗体を産生するために使用される抗原に関する。１つの実施形態において、この抗原は、リジンがメチル化されたＨ３またはＨ４のアミノ末端の精製された抗原性フラグメントであり、
【００３１】
【化１３】
【００３２】
【化１４】
【００３３】
【化１５】
【００３４】
代替的な実施形態において、精製された抗原は、適切なキャリア（例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニン）に結合したポリペプチドを含む。１つの好ましい実施形態において、この抗原は、
【００３５】
【化１６】
【００３６】
【化１７】
【００３７】
上記の抗原に加えて、本発明はまた、リジン残基がメチル化されたＨ３またはＨ４タンパク質のペプチドフラグメントに特異的に結合する、抗体に関する。好ましくは、この抗体は、Ｈ３ヒストンおよびＨ４ヒストンのアミノ末端の最初の２０アミノ酸残基に存在する１つ以上のメチル化されたリジン残基を認識する。より詳細には、本発明は、ペプチド
【００３８】
【化１８】
【００３９】
【化１９】
【００４０】
【化２０】
【００４１】
リジン４がメチル化されたＨ３ペプチド（すなわち、配列番号４のペプチド）に特異的に結合する抗体は、Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３と称され、そしてリジン９がメチル化されたＨ３ペプチド（すなわち、配列番号５または配列番号６のペプチド）に特異的に結合する抗体は、Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３と称される。これらの２つの抗体は、交差反応せず、そしてそのメチル化されていないペプチド配列に結合しない。本発明はまた、メチル化されていないヒストンペプチドに結合する抗体を包含する。１つの実施形態において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。
【００４２】
本発明の抗体および抗体フラグメントは、組成物を形成するようにキャリアまたは希釈剤と組み合わされ得る。１つの実施形態において、このキャリアは、薬学的に受容可能なキャリアである。このようなキャリアおよび希釈剤は、界面活性剤および他の薬学的および生理学的に受容可能なキャリア（アジュバント、賦形剤または安定剤を含む）を添加してかまたは添加せずに、水および油のような滅菌液体を含む。例示的な油は、石油起源、動物起源、植物起源、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、または鉱物油）である。一般に、水、生理食塩水、水性デキストロース、および関連糖溶液、ならびにプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのようなグリコールが、特に、注射可能な溶液のために、好ましい液体キャリアである。Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体またはＭｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体、またはそれらの生理活性フラグメントと、キャリアまたは希釈剤とを含む組成物は、ユークロマチンに対してヘテロクロマチンを検出する方法と組み合わせて、使用され得る。
【００４３】
本発明の抗体を産生するために使用される１つの方法は、配列
【００４４】
【化２１】
【００４５】
次いで、ウサギを最初の注射の２週間後に出血させ、そして６週毎に３回、同じ抗原で定期的にブーストする。次いで、血清サンプルを、各ブーストの１０日後に収集する。次いで、ポリクローナル抗体を、その抗体を捕捉する対応する抗原を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって血清から回収する。最終的に、ウサギを、ペントバルビタール１５０ｍｇ／ＫｇのＩＶで安楽死させる。ポリクローナル抗体を惹起するためのこの手順および他の手順は、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗら編、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）において開示され、これは、本明細書中に参考として援用される。抗体の特異性は、酵素結合免疫吸着アッセイもしくは免疫ブロッティング、または当業者に公知の同様の方法によって決定され得る。
【００４６】
本発明はまた、それぞれの抗原
【００４７】
【化２２】
【００４８】
抗体全体に加えて、抗体のフラグメントが、特定の抗原について結合特異性を保持し得る。抗体フラグメントは、タンパク質分解、または組換えＤＮＡ技術を使用する合成を含むがこれらに限定されない、いくつかの方法によって産生され得る。このような実施形態の例は、Ｆａｂフラグメントを産生するためのパパインによる抗体の選択的タンパク質分解であるか、またはＦ（ａｂ’）２フラグメントを産生するためのペプシンによる抗体の選択的タンパク質分解である。これらの抗体フラグメントは、Ｊ．Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、９８〜１１８頁（Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８３）（これは、本明細書中に参考として援用される）において記載されるような、従来の手順によって作製され得る。抗体全体の特異的結合を保持する本発明の抗体の他のフラグメントは、当業者に公知の他の手段によって産生され得る。
【００４９】
１つの実施形態において、抗体は標識されている。本発明は、いかなる特定の検出系または標識に限定されることを意図しない。抗体は、蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）、放射性同位体、またはビオチンもしくはジゴキシゲニンのような非同位体標識試薬で標識され得；ビオチンを含む抗体は、蛍光色素のような任意の所望の標識に結合体化されたアビジンのような「検出試薬」を使用して検出され得る。１つの実施形態において、本発明のヒストン特異的抗体は、二次抗体の使用を介して検出され、ここで、この二次抗体は、標識されており、一次（ヒストン特異的）抗体に特異的である。あるいは、ヒストン特異的抗体は、放射性同位体、またはＦＩＴＣもしくはローダミンのような蛍光色素で直接標識され得；このような場合において、二次検出試薬は、標識されたプローブの検出のために必要ではないかもしれない。
【００５０】
本発明の１つの実施形態に従って、Ｈ３ヒストンおよびＨ４ヒストンにおけるメチル化リジン残基の存在を検出するための方法が提供される。この方法は、ヒストンタンパク質を、標識された抗体と接触させる工程を包含し、ここで、この抗体は、リジン４でメチル化されたＨ３またはリジン９でメチル化されたＨ３のみに特異的に結合する。
【００５１】
１つの実施形態に従って、本発明の抗体は、診断画像化における使用のために標識される。本発明に従う診断画像化に有用な標識の例は、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、９９ｍＴｃ、３２Ｐ、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、および１８８Ｒｈのような放射性標識、フルオロセインおよびローダミンのような蛍光標識、核磁気共鳴活性標識、電子高密度物質および放射線不透過性物質、ポジトロン放出断層撮影（「ＰＥＴ」）スキャナーによって検出可能なポジトロン放出同位体、ルシフェリンのような化学発光物質（ｃｈｅｍｉｌｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）、およびペルオキシダーゼまたはホスファターゼのような酵素学的マーカーである。短距離放射線エミッタ（例えば、短距離検出プローブ（例えば、経直腸的プローブ）によって検出可能な同位体）もまた、使用され得る。これらの同位体および経直腸的検出プローブは、組み合わせて使用される場合、前立腺の窩（ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｆｏｓｓａ）の再発および骨盤結節性疾患（ｐｅｌｖｉｃ ｎｏｄａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）を検出する際に特に有用である。本発明の抗体は、当該分野で公知の技術を使用してこのような試薬で標識され得る。抗体の放射性標識に関連する技術については、例えば、ＷｅｎｓｅｌおよびＭｅａｒｅｓ，Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３）（これは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。Ｄ．Ｃｏｌｃｈｅｒら、「Ｕｓｅ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｉｎ Ａｔｈｙｍｉｃ Ｍｉｃｅ」Ｍｅｔｈ．ＥｎｚｖｍＱＬ，１２１：８０２−８１６（１９８６）（これは、本明細書中に参考として援用される）もまた参照のこと。１つの好ましい実施形態に従って、その抗体は、当該分野で公知の標準的部分を使用して蛍光団または発色団で標識される。
【００５２】
出願人らは、リジン４および９（Ｋ４およびＫ９）におけるヒストンＨ３のメチル化が、それぞれ、修飾されたヒストンに近接する遺伝子の発現の活性化および不活化に関連することを発見した。ヒストンＨ３は、Ｋ９においてメチル化される場合、ヘテロクロマチンタンパク質ＨＰ１について好ましい結合部位であり、次いで、ＨＰ１は、Ｋ９メチル化を担う酵素Ｓｕｖ３９ｈを補充し得、不活化シグナルが広げられ得る機構を作製する。Ｋ９のメチル化はまた、その部位でのアセチル化を妨げ、抑制にさらに寄与する。Ｋ９における反応とは対照的に、ヒストンＨ３ Ｋ４におけるメチル化は、転写活性に相関する。従って、本発明の１つの実施形態に従って、Ｋ４メチル化ヒストンＨ３に特異的な抗体は、クロマチンの転写的に活性な領域を検出するために使用され得、そしてＫ９メチル化ヒストンＨ３に特異的な抗体は、クロマチンの転写的に不活性領域を検出するために使用され得る。実際、染色体のインサイチュ染色によって、Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体およびＭｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体によって生成される染色パターンが、互いの鏡像を生成することが明らかにされる。
【００５３】
Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体およびＭｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体は、診断剤および治療剤として、ヒトにおける使用のための可能性を有するので、本発明の１つの実施形態は、Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体およびＭｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体のヒト化バージョンに関する。抗体のヒト化バージョンは、治療適用のために必要である。なぜなら、非ヒト種由来の抗体は、ヒト免疫系によって外来物質として認識され得、そして中和され得、これらは、あまり有用ではない。ヒト化抗体は、ヒト部分および非ヒト部分を含む免疫グロブリン分子である。より具体的には、ヒト化抗体の抗原結合領域（可変領域）は、非ヒト供給源（例えば、マウス）に由来し、そしてヒト化抗体の定常領域は、ヒト供給源に由来する。ヒト化抗体は、非ヒト抗体分子の抗原結合特異性、およびヒト抗体分子によって付与されるエフェクター機能を有する。代表的には、ヒト化抗体の作製は、組換えＤＮＡ技術の使用を含む。
【００５４】
本発明の抗体は、細胞からユークロマチンまたはヘテロクロマチンを単離する手段を提供するために、不溶性の支持体に結合され得る。この支持体は、微粒子形態または固体形態で存在し得、そしてこれらには、プレート、試験管、ビーズ、球、フィルターまたは膜が含まれ得るが、これらに限定されない。抗体を不溶性支持体に固定するための方法は、当業者に公知である。１つの実施形態において、本発明の抗体は、アフィニティークロマトグラフィーにおける使用に適した不溶性支持体に固定される。
【００５５】
Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体およびＭｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体は、境界エレメントによっていくらか設定される、大規模またはドメイン感受性クロマチン標識である。詳細には、Ｌｓｙ４においてメチル化されたＨ３を含むヒストンに関連するクロマチンは、「オン」ドメイン、または転写活性についてコンピテントである少なくとも１つのドメインを表す。あるいは、Ｌｓｙ９においてメチル化されたＨ３を含むヒストンに関連するクロマチンは、「オフ」ドメインを示し、このドメインは、転写活性についてコンピテントではない。このパターンは、多様な範囲の種にわたって保存されている。これらの抗体を用いる動物ブロットにより、「単純な」生物（出芽酵母）およびテトラヒメナ由来のＨ３ヒストンのほとんどが、メチル化Ｌｙｓ４（オン）を含み、これに対して、著しく対照的には、「複雑な」生物に存在するＨ３ヒストンのほとんどが、メチル化Ｌｙｓ９（オフ）を有することが示唆される（図３を参照のこと）。このことは、酵母およびテトラヒメナにおけるゲノムＤＮＡのほとんどが、発現される（オン）が、ヒト、マウスなどにおけるＤＮＡのほとんどは、オフであるという知見と一致する。従って、より複雑な真核生物における「デフォルト」または基底状態はオフであることが、十分であり得る。Ｌｙｓ４メチル標識の使用を介するオンクロマチンの同定の仕方を知ることは、より「当りがいい」クロマチンに対する導入遺伝子のより優れた標的化のためのストラテジーを開発する際に貴重であると証明され得る。
【００５６】
クロマチン免疫沈降データによって、上の「オン／オフ」標識系モデルが支持される。詳細には、公開されたＳ．ｐｏｍｂｅクロマチンＩＰデータ（Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｎａｋａｙａｍａら、２００１）およびヒトにおける不活性Ｘ染色体上の作業（実施例２を参照のこと）は、このモデルを支持する。さらに、「不活性」Ｘ染色体上にＬｙｓ４ Ｈ３メチル化の「ホットスポット」が存在し、そしていくつかの場合において、腫瘍抑制遺伝子が、この染色体領域にマッピングされている。この遺伝子におけるヘテロ接合性の喪失は、有意な数の進行した場合の卵巣癌と相関する。従って、本発明の抗体は、癌を検出するため、そして治療ストラテジーを決定するための診断剤としてもまた使用され得る。１つの実施形態に従って、疾患状態に関連するクロマチン変更を検出するための方法が提供される。用語「疾患状態」は、先天性欠損を含む生きている動物または植物の正常な状態の機能障害に関連する任意の状態、癌のような病理学的状態、ならびに環境因子および病原体（細菌、ウイルスなど）に対する応答を包含することが意図される。この方法は、正常組織および罹患組織の両方からクロマチンを単離する工程、Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体またはＭｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体のいずれかと、このクロマチンの２つのプールを接触させる工程、および正常組織から単離されたクロマチンの染色パターンを罹患組織のそれと比較する工程を包含する。さらに、クロマチン免疫沈降を使用して、固有の腫瘍抑制遺伝子は、本発明の抗体を使用するディファレンシャルスクリーニングによって単離され得る。
【００５７】
本発明の１つの実施形態に従って、Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体およびＭｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体を使用して、ヘテロクロマチン領域およびユークロマチン領域を同定し、そしてクロマチンの転写的に活性な領域および不活性な領域を検出する。より詳細には、抗体は、所定の疾患状態に関連するクロマチン構造における変化を検出するために使用され得る。従って、抗体は、発現パターンにおける変更（すなわち、優性なネイティブなパターンに比較した、ヘテロクロマチンパターン対ユークロマチンパターンにおける差異）に関連するクロマチン構造の変更を検出するための診断剤として使用され得る。クロマチンの特定の領域についてのクロマチン構造における変更は、特定の疾患状態の診断因子であり得る。例えば、ヘテロクロマチンへのゲノムのユークロマチン領域の通常の転換は、癌または前癌の状態を示す腫瘍抑制遺伝子の抑制を示し得る。同様に、ユークロマチンへのヘテロクロマチンの領域の転換は、宿主細胞／生物の対して有害な影響を与える遺伝子の不適切な発現または過剰発現と関連し得る。
【００５８】
本発明はまた、罹患組織において発現パターンが変更された核酸領域を単離するための広範囲のディファレンシャルスクリーニング技術を使用する方法に関する。例えば、クロマチンは、罹患組織から単離され得、そして罹患状態に関連するクロマチン構造における任意の差異（すなわち、ヘテロクロマチン対ユークロマチンにおける変化）が存在するか否かを決定するために、健全組織から単離されたクロマチンと比較され得る。クロマチン構造におけるこのような差異は、疾患において直接的または間接的な役割を果たす遺伝子の抑制または過剰発現を示し得る。抗メチル（Ｌｙｓ９）Ｈ３抗体および抗メチル（Ｌｙｓ４）Ｈ３抗体は、クロマチン構造におけるこのような変化を検出し、そして罹患状態に関連する遺伝子を同定するのを助けるために使用され得る。このような遺伝子の同定は、疾患を処置するためのより効果的な治療を設計する際に補助となる。
【００５９】
１つの実施形態において、特定の疾患に関連するクロマチン構造における変更を検出するための方法は、修飾特異的ヒストン抗体を使用するクロマチン免疫沈降アッセイを包含する。このプロセスは、クロマチン環境によって管理される広範なＤＮＡ鋳型プロセスの分析を可能にする。より詳細には、この方法は、罹患組織および健全組織の両方からクロマチンを単離する工程、ＤＮＡをフラグメント化する工程（好ましくは超音波処理によって）、および
【００６０】
【化２３】
【００６１】
１つの実施形態において、この免疫沈降したクロマチンの２つのプールの比較は、この免疫沈降したクロマチンの２つのプールに関連した核酸配列を単離する工程、および得られた核酸配列の２つのプールを比較する工程を包含する。この核酸配列の２つのプールの比較は、ＰＣＲ、ゲル電気泳動、核酸配列決定、および核酸ハイブリダイゼーション分析を含む、標準的な分子技術のいずれかを使用して行なわれ得る。次いで、この核酸配列の２つのプールの１つのみに存在するこれらの核酸配列は、回収される。これらの核酸配列は、正常な組織または罹患した組織のいずれかに関連する発現された／抑制された遺伝子を示す。１つの実施形態において、クロマチンを免疫沈降するために使用される抗体は、Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体およびＭｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体からなる群より選択される。
【００６２】
クロマチン免疫沈降（クロマチンＩＰ）アッセイにおけるメチルＬｙｓ４／Ｌｙｓ９ヒストンＨ３抗体の使用は、ヒトゲノム（および同様に他のゲノム）の後成的な「オン／オフ」状態に対応するゲノムＤＮＡを濃縮する１つの方法である。クロマチン免疫沈降されたＤＮＡを、（チップ上での）現在のゲノムマイクロアレイ技術と組み合わせることによって、「ヒストンコード」を介するこれらのオン／オフ状態に関してヒト（または他の）ゲノムの任意の部分を調査する可能性を有する。例えば、Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体を使用して免疫沈降したＤＮＡは、固体表面または「チップ」に固定され得、そして転写についてコンピテントである所定の細胞の全ての核酸配列を示し得る。同様に、Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体を使用して免疫沈降したＤＮＡは、固体表面または「チップ」に固定され得、そして転写についてコンピテントでない所定の細胞の全ての核酸配列を示し得る。標的細胞からｍＲＮＡを収穫し、そしてｃＤＮＡを調製し、標的核酸を標識し、次いで、標的ＤＮＡを固定されたＤＮＡとハイブリダイズさせることによって、遺伝子の異常な発現が明らかにされる。
【００６３】
この情報を知ることは、種々のヒト癌における重要な腫瘍抑制タンパク質または発癌性タンパク質のオン／オフ状態を決定する際に貴重であると証明され得る。この後成的標識化が、どのようにゲノムＤＮＡに対応するかを知ることはまた、しばしば、ほとんどのトランスジェニックＤＮＡが「悪い」（Ｌｙｓ９）クロマチン環境に侵入しそしてサイレンシングされることが見出される場合に、トランスジェニック動物および植物を作製する能力を誘導する。従って、ＤＮＡを、動物および植物のトランスジェニック作業のために「良好な」（Ｌｙｓ４）クロマチン環境により良く「誘導する」方法を知ることについての意味は、高い。ヒトにおいて、このことは、遺伝子治療組織に対しても同様に影響を与える。
【００６４】
１つの実施形態において、クロマチンの免疫沈降は、マイクロアレイの使用を介してゲノムの広範なレベルで活性な遺伝子の位置をマッピングするために使用される。例えば、１つの好ましい実施形態において、免疫沈降されたクロマチンの２つのプール（すなわち、罹患組織由来の免疫沈降したクロマチン対健全組織由来の免疫沈降したクロマチン）を比較する方法は、当業者に公知の標準技術を使用する、遺伝子チップ、ＤＮＡマイクロアレイ、またはプロテオミクスチップの使用を包含する。例えば、ＷＯ０１／１６８６０、ＷＯ０１／１６８６０、ＷＯ０１／０５９３５、ＷＯ００／７９３２６、ＷＯ００／７３５０４、ＷＯ００／７１７４６およびＷＯ００／５３８１１（これらの開示は、本明細書中に明確に援用される）において記載されるようなシステムのいずれかは、本発明における使用に適している。好ましくは、このチップは、既知の化合物（例えば、既知のＤＮＡ配列）の順序付けられたアレイを含み、その結果、チップの特定の位置における免疫沈降したクロマチンの相互作用が、その免疫沈降したクロマチンに関連したＤＮＡ配列を同定し、そしてその単離を可能にする。
【００６５】
この技術に対して鍵となることは、種々の修飾に対して特異的な抗体を使用することである。なぜなら、それらの抗体は、ヒストンコードに関連するからである。このことをヒトゲノムおよび他のゲノムに適用することが、エピゲノミクスの基盤を据える。本発明は、Ｌｙｓ４／Ｌｙｓ９ ｍｅｔｈｙｌ Ｈ３抗体を各々ＯＮ／ＯＦＦ抗体として使用することを詳述してきたが、この概念は、より一般的には、「ヒストンコード」に関して開発される任意のすべての抗体に適用される。例えば、Ｌｙｓ９ ｍｅｔｈｙｌ抗体対Ｓｅｒ１０ ｐｈｏｓ Ｈ３抗体はまた、分化対増殖を調節する「ｍｅｔｈｙｌ／ｐｈｏｓ」スイッチでもあり得る。本発明はまた、Ｈ３ヒストンのアミノ末端の他のメチル化領域およびＨ４ヒストンのアミノ末端の他のメチル化領域（Ｈ３のリジン２７およびリジン３６、ならびにＨ４のリジン２０を含む）に関する抗体も包含する。これらの抗体を生成するために使用されるペプチドが、以下に列挙される：
【００６６】
【化２４】
【００６７】
本発明の抗体は、標準的な分子生物学技術（例えば、ウェスタンブロット分析、免疫蛍光、および免疫沈降）において使用され得る。上記のように、リジン４においてメチル化したＨ３の存在は、転写的に活性な核に関連する。従って、このＨ３抗体は、遺伝子調節の理解において有用であり得る。さらに、このＭｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体を細胞中にマイクロインジェクションすることにより、特定の遺伝子の活性化が妨害され得ることが、理解される。
【００６８】
本発明の１つの実施形態において、ユークロマチンおよびヘテロクロマチンを検出するためのキットが、提供される。このキットは、以下：
【００６９】
【化２５】
【００７０】
【化２６】
【００７１】
本発明の別の実施形態において、サンプルがメチラーゼ活性を有するか否かを決定するためのアッセイにおける使用のためのキットが、提供される。このキットは、ペプチドと抗体とを含み、そのペプチドは、ＡＲＴＫＱＴＡＲＧＣ（配列番号４）、ＱＴＡＲＫＳＴＧＶＣＧ（配列番号５）、ＡＲＴＫＱＴＡＲ（配列番号１）、ＱＴＡＲＳＴＧＶ（配列番号２）およびＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＶ（配列番号９）からなる群より選択され、そしてその抗体は、ＡＲＴＫＱＴＡＲＧＣ（配列番号４）、ＱＴＡＲＫＳＴＧＶＣＧ（配列番号５）、ＡＲＴＫＱＴＡＲ（配列番号１）、ＱＴＡＲＳＴＧＶ（配列番号２）およびＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＶ（配列番号９）からなる群より選択されるリジンメチル化修飾ペプチドに特異的に結合する。１つの実施形態において、それらの抗体は、不溶性支持体に付着されており、その支持体は、モノリシック固体であるか、または特定の形態であるかのいずれかである。別の実施形態において、このキットは、非メチル化ペプチドに特異的に結合する抗体をさらに備えており、この非メチル化ペプチドは、ＡＲＴＫＱＴＡＲＧＣ（配列番号４）、ＱＴＡＲＫＳＴＧＶＣＧ（配列番号５）、ＡＲＴＫＱＴＡＲ（配列番号１）、ＱＴＡＲＳＴＧＶ（配列番号２）およびＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＶ（配列番号９）からなる群より選択される。このような抗体は、陰性コントロールとして役立つ。
【００７２】
１つの実施形態において、サンプルのメチラーゼ活性を検出するための方法は、メチラーゼ活性を有すると疑われるサンプルを、所定の長さの時間の間、ペプチドと接触させる工程を包含し、このペプチドは、ＡＲＴＫＱＴＡＲＧＣ（配列番号４）、ＱＴＡＲＫＳＴＧＶＣＧ（配列番号５）、ＡＲＴＫＱＴＡＲ（配列番号１）、ＱＴＡＲＳＴＧＶ（配列番号２）およびＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＶ（配列番号９）からなる群より選択される。その基質に結合するメチル化特異的抗体（すなわち、Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３またはＭｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３）の量は、その基質が所定の時間の間メチル化された程度の直接相関であり、従ってそのサンプルのメチラーゼ活性を示す。このアッセイはまた、メチラーゼの潜在的インヒビターについてスクリーニングするために使用され得る。例えば、１つの実施形態において、アルギニンメチル転移活性のインヒビターについてスクリーニングする方法は、サンプルを提供する工程（そのサンプルは、メチラーゼと、そのメチラーゼによりメチル化される基質と、を含む）、そのサンプルにそのメチラーゼの潜在的インヒビターを添加する工程、およびそのメチル化基質には特異的に結合するが非メチル化基質には特異的には結合しない抗体と、そのサンプルとを接触させる工程、を包含する。１つの実施形態において、その抗体は、以下のペプチド
【００７３】
【化２７】
【００７４】
出芽酵母中に存在する非必須遺伝子のすべて（約４，８００個）について「ノックアウト」株が入手可能である。本発明の抗体は、非常に高い程度の特異性を有するので、酵母の全細胞溶解物中の主要な１つまたは２つのバンドのみを検出し、それによりこれらのノックアウト株のすべてを観察するためのロボット利用型スクリーニング方法の開発が可能になる。Ｌｙｓ４メチルＨ３を使用することは、そのオン酵素およびオフ酵素を含む「調節因子」の上流経路全体を導くはずである（ただし、その遺伝子産物が非必須である場合）。
【００７５】
「旧式」ブロットにおける上記のアプローチを使用して、Ｓｅｔ１が、酵母におけるＬｙｓ４ Ｈ３メチル標識を担う酵素であり、かつまたヒトにおけるＬｙｓ４ ＨＭＴアーゼのうちの１つであることが、見出された。驚くべきことに、酵母全細胞溶解物を探索するため読み出し表示としてこのメチルＬｙｓ４ Ｈ３抗体を使用して、Ｌｙｓ４メチル化が、ヌクレオソームの反対側にある保存リジンにおけるＨ２Ｂユビキチン結合によって調節されることが、発見された。これは、「トランス−テール」効果の最初の例であり、この効果は、一方のテールにおける１つのヒストン修飾が、それ程近くない別のテールにおける別の修飾をもたらすことを意味する。ヒトおよびマウスにおいて、ユビキチンをタンパク質に付加する酵素は、ヒトＲａｄ６（ＨＲ６）であり、そしてＨＲ６は、２つのアイソフォーム（ＨＲ６ＡおよびＨＲ６Ｂ）になる。マウスノックアウトＨＲ６Ｂ−／−は、既知ではないが精子形成の間にクロマチン欠損をもたらして精子の死をもたらすようである経路において、雄性不稔性である。従って、ＨＲ６Ｂが、Ｈ２Ｂに対するユビキチン付加を担うこと、従って、Ｌｙｓ４ Ｈ３メチル抗体が、雄性不妊症についての診断剤であることが可能であることが、理解される。さらに、Ｌｙｓ９メチル化を欠損し、Ｘ染色体不活性化に影響し得、かつ雌性不妊症をもたらす、可能性が存在する。従って、本発明の１つの実施形態により、Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体およびＭｅｔｈｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体が、雄性不妊症欠損および雌性不妊症欠損についてスクリーニングするための診断剤として使用される。
【００７６】
現在のモデルは、Ｌｙｓ９メチル化が、少なくともいくつかの場合、ＳｕＶａｒ３−９によって触媒されることを、示唆する。このＬｙｓ９メチル標識は、クロモドメイン（クロマチンの「ベルクロ」パッチとして作用する、短いタンパク質モジュール）によって読み取られるようである。ヘテロクロマチンタンパク質ＨＰ１のクロモドメインが、最もよく示されている。興味深いことに、ＨＰ１からのクロモドメインは、Ｌｙｓ９メチルＨ３ペプチドにはよく結合するが、Ｌｙｓ４ペプチドまたは非修飾ペプチドには、それよりかなり弱くしか結合しない。ＳｕＶａｒ３−９自体（触媒性ＨＭＴアーゼ）もまたクロモドメイン（メチル化ヒストンペプチドについての部位特異性がいまだ試験されていないモジュール）を有することもまた、興味深い。
【００７７】
Ｈ３におけるＬｙｓ４メチル標識は、おそらく、ＨＰ１のクロモドメインとは異なるクロモドメインによって読み取られるようである。１つの実施形態において、本発明の独自に修飾されたペプチド（
【００７８】
【化２８】
【００７９】
それは、精子形成の間に、以下の一連の協調的反応が生じることであり得る：
１．Ｈ２Ｂユビキチン結合が生じる（ＨＲ６Ｂによって触媒される）
２．クロマチンが開く
３．ヒトＳｅｔ１または別のＬｙｓ４ ＨＭＴアーゼによって触媒されるＬｙｓ４メチル化
４．ＨＡＴ ＣＤＹが、そのクロモドメインを介してＬｙｓ４メチル化標識に結合する
５．ヒストン過剰アセチル化が生じ、ＣＤＹにより触媒される
６．体性ヒストンが、その後、変遷タンパク質により置換され、その後プロタミンにより置換される。
【００８０】
上記の工程のうちのいずれかにおける欠損は、精子死亡および雄性不妊症をもたらし得る。
【００８１】
これらの工程のうちの３つが、以下のクロマチン修飾酵素：
ｉ）ＨＲ６Ｂ（Ｅ２ユビキチン結合酵素）
ｉｉ）Ｓｅｔ１（能力のあるＬｙｓ４ ＨＭＴアーゼ）
ｉｉｉ）ＣＤＹ（雄性特異的ＨＡＴ）
を必要とすることに留意すること。
【００８２】
ユビキチン結合Ｈ２Ｂに対する抗体およびユビキチン結合Ｈ２Ａに対する抗体、Ｌｙｓ４メチルＨ３に対する抗体およびＣＤＹ触媒化アセチル化の部位に対する抗体はすべて、雄性不妊症のスクリーニングにおいて、診断的に有用である可能性がある。
【００８３】
（実施例１）
（Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体およびＭｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体の調製）
Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体およびＭｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体を生成するために、リジン４の周囲のヒストンＨ３のアミノ酸配列（配列番号４；
【００８４】
【化２９】
【００８５】
【化３０】
【００８６】
ウサギ血清を、免疫後に規則正しい間隔で収集し、そしてＭｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体およびＭｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体がその血清中に存在することを、標準的酵素結合免疫吸着アッセイによって示した。これらの抗体は、ウェスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、および免疫沈降アッセイにおける使用のために、適切である。
【００８７】
（実施例２）
（ヘテロクロマチンアセンブリのエピゲノム制御における、ヒストンＨ３リジン９メチル化の役割）
高次クロマチン構造のアセンブリを、ヒストンテールの共有結合修飾と関連付けた。インビボでの証拠が、ヒストンＨ３のリジン９（Ｈ３ Ｌｙｓ９）が、融合酵母におけるヘテロクロマチン結合領域にてＣｌｒ４タンパク質によって優先的にメチル化されることを、示す。Ｃｌｒ４の保存クロモドメインおよびＳＥＴドメインの両方が、インビボでのＨ３ Ｌｙｓ９メチル化に必要である。
【００８８】
その高次クロマチン構造の組織化を、ヒストンテールの翻訳後修飾（アセチル化、リン酸化、およびメチル化を含む）と関連付けた。共有結合ヒストン修飾の個別の組み合わせ（「ヒストンコード」ともいう）が、下流のクロマチン修飾タンパク質を動員するための、ヒストンテール上の「標識（ｍａｒｋ）」を提供することが、示唆された。このことは、いくつかの転写活性化補助因子の保存ブロモドメインがヒストンテール上のアセチル化リジン残基に特異的に結合することを示す、最近の研究によって最もよく示される。同じヒストンテールまたは異なるヒストンテール内の複数の共有結合修飾の確立および維持を担う機構は、完全には理解されていない。
【００８９】
ヒストンテールの修飾もまた、ヘテロクロマチンのアセンブリに関連付けた。ヒストンＨ３およびヒストンＨ４は、酵母、ハエ、および哺乳動物ほどに多様な生物におけるヘテロクロマチン性染色体領域において、ほとんど低アセチル化されている。融合酵母において、ヒストンの低アセチル化は、サイレント接合型領域およびセントロメア（高等真核生物におけるヘテロクロマチン領域と多くの類似点を共有する染色体ドメイン）と関連している。内部（ｉｍｒ）反復および外部（ｏｔｒ）反復により囲まれる独特の配列の中心コアを含むセントロメア領域は、サイレントクロマチン構造へとアセンブルされる。同様に、接合型（ｍａｔ２／３）領域の大きな１５ｋｂ染色体ドメイン（ｍａｔ２遺伝子座およびｍａｔ３遺伝子座、ならびにそれらの間の区間（Ｋ領域として公知）を含む）が、サイレントエピゲノム状態において維持される。これらの領域のサイレント化に影響するトランス作用性因子の中で、Ｃｌｒ３およびＣｌｒ６が、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）のファミリーに属する。Ｓｗｉ６タンパク質およびＣｌｒ４タンパク質は、クロモドメイン（ＨＰ１タンパク質およびＰｏｌｙｃｏｍｂタンパク質において最初に同定された進化的に保存されたモチーフ）を含む。最近、Ｃｌｒ４およびその哺乳動物対応物ＳＵＶ３９Ｈ１の両方が、インビトロで内在性ヒストンＨ３特異的メチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴアーゼ）活性を有することが示された（Ｓ．Ｒｅａら、Ｎａｔｕｒｅ ４０６、５９３（２０００））。しかし、ヒストンが、インビボでこれらのメチルトランスフェラーゼの生理学的標的であるか否かは、わからない。
【００９０】
以前の知見と一致して、組換えＣｌｒ４（ｒＣｌｒ４）は、ヒストンＨ３に対して排他的にＨＭＴａｓｅ活性を有することが見出された。ｒＣｌｒ４によってメチル化されたＨ３の特定の残基を同定するために、Ｈ３のＮＨ２末端由来の合成ペプチドを、インビトロＨＭＴａｓｅアッセイにおける基質として使用した。詳細には、５ｍｇのＨｅＬａコアヒストンまたはニワトリコアヒストンを、２５ｍｌのＨＭＴａｓｅ緩衝液［１０％グリセロール中、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８．０）、１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド、０．５ｍＭ ジチオトレイトール］中、０．５５ｍＣｉのＳ−アデノシル−Ｌ−［メチル−３Ｈ］メチオニン（３Ｈ−ＡｄｏＭｅｔ；７２Ｃｉ／ｍｍｏｌ；１ｍＭ ｐｎａｌ）および２ｍｇの組換えＣｌｒ４野生型タンパク質または変異体タンパク質と共に、３０℃にて１時間インキュベートした。ＳＤＳローディング緩衝液を各サンプルの半分に添加し、そして煮沸して、その後、１５％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）ゲル上で分離した。得られたヒストンのバンドを、クーマシー染色およびフルオログラフィーによって可視化した。ペプチド分析のために、ＣＯＯＨ末端システインを含む、ヒトヒストンＨ３のＮＨ２末端由来の各ペプチド５ｍｇを使用した。半分のサンプルを、Ｗｈａｔｍａｎ Ｐ−８１濾紙にスポットし、５０ｍＭ ＮａＨＣＯ２（ｐＨ ９．０）中で１０分間、４回洗浄し、その後、液体シンチレーション計数を行った（Ｂ．Ｄ．Ｓｔｒａｈｌ、Ｒ．Ｏｈｂａ、Ｒ．Ｇ．Ｃｏｏｋ、Ｃ．Ｄ．Ａｌｌｉｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６、１４９６７（１９９９））。Ｃｌｒ４は、Ｈ３ １−２０非修飾ペプチドを優先的にメチル化したが、Ｈ３ １９−３５非修飾ペプチドをメチル化せず、これは、Ｃｌｒ４ ＨＭＴａｓｅの標的残基がＨ３の最初の２０アミノ酸に存在することを示す。
【００９１】
この標的残基を決定するために、異なるアミノ酸に対して共有結合修飾を含む、合成Ｈ３ １−２０ペプチドセットを開発した。これらのペプチドを基質として用いた場合、Ｌｙｓ９に対するアセチル修飾またはメチル修飾のみが、ｒＣｌｒ４のＨＭＴａｓｅ活性を効果的にブロックし、これは、Ｃｌｒ４が、その哺乳動物ホモログＳＵＶ３９Ｈ１と同様に、Ｈ３のＬｙｓ９を選択的にメチル化することを示す。さらに、ＳＵＶ３９Ｈ１と同様に、ｒＣｌｒ４のＨＭＴａｓｅ活性は、セリン１０のリン酸化によって阻害された。これらの結果は、Ｓｕ（ｖａｒ）３−９タンパク質ファミリーの酵素的特徴が、分裂酵母からヒトへと進化的に保存されていることを実証する。近年の研究は、保存されたＳＥＴドメインおよび２つの隣接システインリッチ領域が、インビトロでのＳＵＶ３９Ｈ１のＨＭＴａｓｅ活性に必要とされることを実証した。これらの保存されたドメイン、クロモ領域、ＳＥＴ領域およびシステインリッチ領域がＣｌｒ４のＨＭＴａｓｅ活性にもまた重要であるか否かを決定するために、変異体Ｃｌｒ４タンパク質を、ＨＭＴａｓｅ活性について試験した。クロモドメインにおける変異［Ｔｒｐ３１からＧｌｙ（Ｗ３１Ｇ）およびＴｒｐ４１からＧｌｙ（Ｗ４１Ｇ）］は、Ｃｌｒ４のＨＭＴａｓｅ活性に対してほとんど効果を有さないが、ＳＥＴドメインにおける変異［Ｇｌｙ３２８からＳｅｒ（Ｇ３７８Ｓ）］および両方のシステインリッチ領域における変異［Ａｒｇ３２０からＨｉｓ（Ｒ３２０Ｈ）およびＧｌｙ４８６からＡｓｐ（Ｇ４８６Ｄ）］は、Ｃｌｒ４のＨＭＴａｓｅ活性を大いに減少し、これは、これらの３つの領域が、インビトロでのＣｌｒ４のＨＭＴａｓｅ活性に重要であることを示す。
【００９２】
Ｈ３ Ｌｙｓ９メチル化とサイレンシングとの間の仮定の相関性を試験するために、Ｈ３ Ｌｙｓ９−メチル特異的抗体を開発した。酵素連結イムノソルベントアッセイにおいて、Ｈ３ Ｌｙｓ９−メチル抗体は、広範な抗体希釈度でＨ３ １−２０ Ｌｙｓ９−メチルペプチドを特異的に認識した。さらに、Ｈ３ Ｌｙｓ９−メチル抗体は、ＨｅＬａコアヒストン陽性コントロールと比較して、組換えヒストンＨ３（ｒＨ３）単独を検出しなかったが、ｒＣｌｒ４によって選択的にメチル化されたｒＨ３を検出し、これは、この抗体の特異性をさらに実証する（Ｎａｋａｙａｍａら（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９２、１１０−１１３頁（この開示は本明細書中に援用される）を参照のこと）。
【００９３】
この抗体をクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）実験（Ｎａｋａｙａｍａら（２０００）Ｃｅｌｌ、１０１、３０７）において使用して、Ｈ３ Ｌｙｓ９−メチル修飾が、サイレンシングされた染色体領域に特異的に局在化されることが発見された。Ｈ３ Ｌｙｓ９のメチル化およびＳｗｉ６は、サイレンシングされたｍａｔ２／３染色体ドメイン内に挿入されたマーカー遺伝子（Ｋｉｎｔ２：：ｕｒａ４ １）で、その内因性の位置にあるコントロールｕｒａ４ＤＳ／Ｅ遺伝子座と比較して、優先的に富化された。同様に、Ｈ３ Ｌｙｓ９のメチル化はまた、ｃｅｎ１の非常に抑制された最も内側の反復内（ｉｍｒ１Ｒ：：ｕｒａ４ １）および外側の反復内（ｏｔｒ１Ｒ：：ｕｒａ４ １）に挿入されたｕｒａ４ １マーカーで優先的に富化されたが、弱く抑制された中心コア（ｃｎｔ１：：ｕｒａ４ １）では富化されなかった。さらに、Ｈ３ Ｌｙｓ９のメチル化は、これらの領域でＳｗｉ６の存在と同時に生じた（Ｐａｒｔｒｉｄｇｅら（２０００）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１４、７８３）。これらの知見は、Ｈ３ Ｌｙｓ９−メチル修飾およびＳｗｉ６がサイレントな染色体領域に優先的に局在されること、および、Ｓｗｉ６の局在がＨ３ Ｌｙｓ９のメチル化に機能的に依存することを示唆する。
【００９４】
野生型細胞におけるＫｉｎｔ２：：ｕｒａ４ １およびｏｔｒ１Ｒ：：ｕｒａ４ １の両方での比較的高いレベルのＳｗｉ６およびＨ３ Ｌｙｓ９メチル化と比較して、Ｓｗｉ６およびＨ３ Ｌｙｓ９メチル化は、ｃｌｒ４Ｄ株において両方の遺伝子座に存在しなかった。この結果は、Ｈ３ Ｌｙｓ９がＣｌｒ４ ＨＭＴａｓｅ活性の生理学的標的であること、および、Ｃｌｒ４がｍａｔおよびｃｅｎ遺伝子座での排他的なインビボＨ３ Ｌｙｓ９−特異的ＨＭＴａｓｅであるようであることを、示唆する。ＳＥＴドメインのみがＣｌｒ４ ＨＭＴａｓｅ活性に必要とされることを示すインビトロ結果と比較して、クロモドメインおよびＳＥＴドメインの両方が、インビボでのＨ３ Ｌｙｓ９のメチル化およびＳｗｉ６の局在化に必要される。まとめると、これらの結果は、クロモドメインが、おそらく、ｍａｔ２／３領域およびセントロメアへＣｌｒ４を標的化するために必要とされ、一方、Ｃｌｒ４のＳＥＴドメインおよび関連するシステインリッチ領域が、触媒部位を構成することを示す。異なるｃｌｒ４変異体バックグラウンドにおけるｍａｔおよびｃｅｎでのＳｗｉ６レベルは、Ｈ３ Ｌｙｓ９メチル化のレベルと直接的に相関し、これは、サイレントな染色体ドメインでのＳｗｉ６の局在化が、Ｈ３ Ｌｙｓ９のメチル化に機能的に依存することをさらに示唆する。
【００９５】
インビボ分析の重要性は、インビトロでＨＭＴａｓｅ活性を減少するＣｌｒ４におけるいくつかの変異が、インビボでＨ３ Ｌｙｓ９メチル化およびＳｗｉ６の局在化を実質的に減少しないという観察によって、さらに強調された。さらに、Ｃｌｒ４のＳＥＴドメインおよびＮＨ２末端システインリッチ領域における変異（Ｇ３７８ＳおよびＲ３２０Ｈ）は、ｍａｔ遺伝子座でのＨ３ Ｌｙｓ９メチル化およびＳｗｉ６の局在化を大いに減少するが；これらの変異は、ｃｅｎ１では中程度またはわずかな効果しか有さない。これらの変異はまた、接合型サイレンシングと比較して、セントロメアサイレンシングに対して弱い効果を有する。これらの結果は、インビトロで組換えモノマータンパク質によって示された酵素的欠損が、インビボでのマルチサブユニットの複合体の状態で機能することによって「レスキュー」され得るという概念と一致する。さらに、ｍａｔ２／３領域およびセントロメアの機能的構成が異なり得、そしてさらなる因子が、セントロメアでのＣｌｒ４活性の促進を補助し得る。
【００９６】
ｃｌｒ３ ＨＤＡＣ（これは、Ｈ３ Ｌｙｓ１４を特異的に脱アセチル化する）における変異は、ｍａｔおよびｃｅｎでのサイレンシングに影響する（Ｓ．Ｉ．Ｓ．Ｇｒｅｗａｌ、Ｍ．Ｊ．Ｂｏｎａｄｕｃｅ、Ａ．Ｊ．Ｓ．Ｋｌａｒ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５０、５６３（１９９８））。ＣｈＩＰ分析は、Ｈ３ Ｌｙｓ１４のＨＤＡＣ活性において部分的に欠損性のｃｌｒ３−７３５変異体が、そのＨＤＡＣ活性の明らかな減少と同時に、ｏｔｒ１：：ｕｒａ４＋でのＨ３ Ｌｙｓ９メチル化およびＳｗｉ６局在化における中程度の減少を示すことを実証した。この結果は、Ｈ３ Ｌｙｓ１４のアセチル化が、インビボでＣｌｒ４のＨＭＴａｓｅ活性を阻害することを示唆する。Ｃｌｒ３とＣｌｒ４との間の機能的相互作用をさらに調査するために、ｃｌｒ３−７３５およびｃｌｒ４Ｒ３２０Ｈ変異を含む二重変異体株を作製した。このｃｌｒ４変異は、ｏｔｒ１Ｒ：：ｕｒａ４＋でのＨ３ Ｌｙｓ９メチル化に対する最小の効果を有する。この二重変異体のＣｈＩＰ分析は、Ｈ３ Ｌｙｓ９のメチル化およびＳｗｉ６の局在化が、その単一の変異体と比較して、ほとんど消失されることを実証した。これらの知見は、Ｃｌｒ３が、Ｃｌｒ４と相乗的に作用し、Ｓｗｉ６をヘテロクロマチンドメインに効果的に局在化させることを示す。言い換えると、Ｃｌｒ３によるＨ３ Ｌｙｓ１４の脱アセチル化は、Ｃｌｒ４によるＨ３ Ｌｙｓ９のメチル化およびＳｗｉ６の局在化に、間接的（Ｃｌｒ４活性を変化させることによって）にかまたは直接的にかのいずれかで、あるいはその両方で必要とされる。これらのデータはまた、Ｌｙｓ９に隣接する残基、および潜在的にはそれらの修飾状態が、適切なＨ３ Ｌｙｓ９−メチル標識の確立に重要な役割を果たすという理論を支持する。以前の研究は、ｒｉｋ１＋が、サイレンシングおよびサイレントな遺伝子座でのＳｗｉ６の局在化に影響することを示した。コンピューター分析は、Ｒｉｋ１が、ＷＤ−４０反復タンパク質内に代表的に見出され、かつタンパク質：タンパク質相互作用に関与することが理論付けられているｂ−プロペラドメインを含むことを明らかにした。ｒｉｋ１における変異は、野生型と比較して、ｍａｔおよびｃｅｎの両方でＨ３ Ｌｙｓ９のメチル化およびＳｗｉ６の局在化を完全に消失させた。
【００９７】
ＷＤ−４０タンパク質は、クロマチン再構成およびヒストン代謝の多くの局面（例えば、クロマチンアセンブリおよびヒストンのアセチル化または脱アセチル化）に関与する。従って、Ｒｉｋ１のｂ−プロペラドメインは、Ｃｌｒ４と複合体を形成して、そのＨＭＴａｓｅ活性をヘテロクロマチン領域に動員し得、そして他のトランス作用性因子（例えば、Ｓｗｉ６およびヒストンデアセチラーゼ）の結合において役割を果たし得る。
【００９８】
Ｈ３ Ｌｙｓ９のＣｌｒ４依存性メチル化に対する、Ｓｗｉ６の可能な役割もまた試験した。Ｓｗｉ６タンパク質レベルが大いに減少された、ｓｗｉ６−１１５（Ｗ２６９Ｒ）変異を保持する株を使用した。予測されたとおり、ｍａｔおよびｃｅｎの両方でのＳｗｉ６局在化は、ＣｈＩＰ分析によって実証されるように、消失された。このｓｗｉ６−１１５変異は、野生型株と比較した場合、Ｈ３ Ｌｙｓ９のメチル化において検出可能な変化を全く生じなかった。これらのデータは、Ｓｗｉ６が、Ｃｌｒ４機能に不必要であることを示し、そしてＳｗｉ６がＣｌｒ４のＨ３ Ｌｙｓ９メチル化の下流で作用することを示唆する。まとめると、上記の結果は、Ｈ３ ＮＨ２−末端テールの共有結合修飾について、サイレンシングされたクロマチン状態の確立を導く事象の時系列を規定する。ＨＤＡＣおよびＨＭＴａｓｅは、協同的に作用して「ヒストンコード」を確立し、次いで、このヒストンコードが、Ｓｗｉ６によって認識される。より詳細には、ＨＤＡＣ（Ｃｌｒ６および／またはＨｄａ１）が、Ｈ３ Ｌｙｓ９を脱アセチル化し、Ｃｌｒ３が、Ｃｌｒ４／Ｒｉｋ１ ＨＭＴａｓｅ複合体によるＨ３ Ｌｙｓ９メチル化の前に、Ｈ３ Ｌｙｓ１４を脱アセチル化する。次いで、Ｈ３ Ｌｙｓ９−メチル修飾へのＳｗｉ６結合は、ヘテロクロマチンアセンブリの自己増幅を生じる。Ｓｗｉ６のヘテロクロマチン結合ドメインは、そのクロモドメインにマッピングされたので、このタンパク質モチーフは、Ｈ３ Ｌｙｓ９−メチル修飾を認識するよう進化したという可能性が最も高い。
【００９９】
Ｓｗｉ６が、細胞周期を通してｍａｔ２／３領域に会合されたままであり、その領域でＳｗｉ６が、後成性の細胞記憶の重要な決定基として作用し、このことが、サイレンシングされた状態の遺伝を促進することが、最近示された。Ｓｗｉ６のマウスホモログであるＭ３１は、Ｓｕ（ｖａｒ）３−９に会合するので、Ｃｌｒ４とＳｗｉ６との間の類似の相互作用が予測される。Ｃｌｒ４のＨＭＴａｓｅ酵素活性の密接な関係、その後の、そのクロモドメインを介するＨ３におけるＬｙｓ９メチル「標識」へのＳｗｉ６の動員および結合は、後成的遺伝の経路を示唆する。Ｃｌｒ４のクロモドメインがＨ３ Ｌｙｓ９−メチル標識を認識する程度は未知であるが、その標識は、Ｃｌｒ４がその後のメチル化事象を行う場合の、クロマチンに結合する手段をその酵素に提供する。高等真核生物におけるＣｌｒ４／ＳＵＶ３９Ｈ１タンパク質およびＳｗｉ６／ＨＰ１タンパク質の保存およびＨ３ Ｌｙｓ９−メチル修飾の存在に基づいて、類似の機構が、分裂酵母からヒトにわたる生物における高次のクロマチンアセンブリを担い得る。ハエおよび哺乳動物におけるＰｏｌｙｃｏｍｂ群のタンパク質による転写抑制と分裂酵母におけるサイレンシングとの間の類似点を考慮すると、ヒストンの脱アセチル化と組み合わせたヒストンのメチル化が、ホメオ遺伝子発現の調節を導く経路においてＰｏｌｙｃｏｍｂを局在化するのを補助し得るという可能性がある。
【０１００】
（実施例３）
（ヒストンＨ３のメチル化の差示的部位は、ヒトＸ染色体上の活性な遺伝子および不活性な遺伝子を標識する）
高等真核生物における染色体は、ユークロマチンおよびヘテロクロマチンの領域からなると歴史的に考えられており、これらは、凝縮の程度およびその根底にあるＤＮＡ配列の転写活性のレベルによって区別される。構成ヘテロクロマチンの特定の領域は、セントロメアのような特殊化された構造またはその付近に見出され、そしてほとんど、遺伝的に不活性な反復配列からなる。対照的に、同じ一次ＤＮＡ配列を有する他の領域は、いずれかの型のクロマチンの特徴を示し得、これは、後成的な要因（例えば、ヒストンおよびクロマチン関連タンパク質によるＤＮＡのパッケージング）が、これらの遺伝子座でのヘテロクロマチン状態を指示することを示唆する。
【０１０１】
後成的サイレンシングの最も劇的な例の１つは、哺乳動物の雌性細胞に見られるＸ染色体不活性化である。このプロセスは、Ｘ連鎖遺伝子の遺伝子量補償を可能にし、それによって、雌性細胞におけるＸ染色体の２つのコピーの一方が、胚発生中にランダムに不活性化される。現在の証拠は、Ｘ不活性化が、非コードＸＩＳＴ転写物の上方調節および不活性化されるべき染色体とのそのシスでの会合によって開始されることを示唆する。ＸＩＳＴ ＲＮＡによるそのコーティング後、不活性なＸ染色体は、遅い複製時点、間期細胞における凝縮された外見（バークロマチン体）、ハウスキーピング遺伝子のＣｐＧ島のＤＮＡメチル化、および低アセチル化ヒストンから構成されそしてＨ２Ａ改変体ＭａｃｒｏＨ２Ａについて富化されている修飾されたヌクレオソームとの会合のような、ヘテロクロマチン特徴を獲得する。Ｘ不活性化の発生におけるこれらの特性の正確な役割は、依然明らかではないが、一旦、不活性な状態が確立されると、これらの後成的特徴は、相乗的に作用して、成体ソーマにおいて多くの細胞分裂を介して不活性Ｘの顕著な安定性を維持するようである。
【０１０２】
近年、いくつかの刊行物により、ヒストンＨ３のメチル化が、マウスおよびＳ．ｐｏｍｂｅにおけるヘテロクロマチンのアセンブリに重要であることが示された（Ｌａｃｈｎｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ４１０，１１６（２００１）；Ｂａｎｎｉｓｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ４１０，１２０（２００１）およびＮａｋａｙａｍａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２，１１０（２００１））。マウスＨＰ１（およびＳ．ｐｏｍｂｅにおけるＳｗｉ６）のクロモドメイン（ｃｈｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ）は、リジン９でメチル化されたＨ３に結合し得、そしてこの部位でのＨ３のメチル化は、ヘテロクロマチンのアセンブリに関与する因子を選び出して補充すると考えられる。さらに、リジン９でのＨ３のアセチル化およびメチル化は、インビボにおいて、競合事象であり得る（Ｃｈｅｕｎｇら，Ｃｅｌｌ １０３，２６３（２０００））。Ｈ３が不活性なＸ染色体上では低アセチル化状態にあり、そしてＨ３のリジン９でのメチル化がヘテロクロマチンのアセンブリに重要であると仮定して、Ｌｙｓ９メチル化Ｈ３の富化について不活性なＸを調べた。
【０１０３】
Ｌｙｓ９メチル化Ｈ３に特異的な抗体を使用して、間接免疫蛍光法により、正常なリンパ芽球細胞株（ＨＨ）からの雌性ヒト中期染色体を試験した。特に、正常なヒト雌性リンパ芽球細胞株（ＨＨ）および５つのＸ染色体を含む雌性リンパ芽球細胞株（６０６１Ｂ）を増殖させ、収集し、そしてＣｙｔｏｓｐｉｎでの３回の遠心分離で顕微鏡スライド上に集めた。修飾されたヒストンを、本質的に他で詳細に記載された（ＣｏｓｔａｎｚｉおよびＪ．Ｒ．Ｐｅｈｒｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３９３，５９９（１９９８））ようにして、間接免疫蛍光法により検出した。簡潔には、細胞を、Ｌｙｓ９メチルＨ３またはアセチルＨ４の一次抗血清の段階希釈物と共に、加湿チャンバー内において３７℃で１時間インキュベートし、そしてＫＣＭ（１２０ｍＭ ＫＣｌ，２０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＣＬ（ｐＨ８．０），０．５Ｍ ＥＤＴＡ，０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ）中において洗浄した。次いで、この細胞を、Ｃｙ３と結合体化されアフィニティー精製されたロバ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）（ＫＣＭ中において１：４０に希釈）と共に、室温にて３０分間インキュベートした。細胞を、再度ＫＣＭで洗浄し、そして室温にて１０分間にわたり４％ホルムアルデヒド中で固定した。滅菌水中で洗浄した後、染色体を、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で対比染色し、抗退色剤（ａｎｔｉｆａｄｅ）（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）中にマウントし、そしてＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｈｏｔ蛍光顕微鏡で観察した。
【０１０４】
Ｌｙｓ９メチル化Ｈ３に特異的な抗体を使用する間接免疫蛍光法によって、大半の染色体はＬｙｓ９メチル化Ｈ３のいくつかの領域を有するが、各中期スプレッド（ｓｐｒｅａｄ）における１つの染色体は一貫して、より強くかつ均一に染色されることが明らかにされた（図１Ａ、白色矢印）。Ｌｙｓ９メチル化Ｈ３を富化した染色体が、不活性なＸ染色体であるか否かを調べるために、５つのＸ染色体を含む細胞株由来の中期スプレッドもまた染色した。これらの細胞において、５つのＸ染色体のうちの４つは、不活性であることが既知である。そして実際、同じサイズの４つの染色体は、Ｌｙｓ９メチルＨ３抗体による濃厚な染色を示す。まとめると、これらのデータにより、不活性なＸにおけるＨ３分子は大部分が低アセチル化状態であるが、そのＨ３分子はリジン９で高度にメチル化されていることが示唆される。
【０１０５】
ヒストンＨ３のＮ末端は、複数の部位で翻訳後修飾される。そしてＨ３のリジン４は、証明された別のメチル化部位である。しかし、リジン９とは対照的に、リジン４のメチル化は、活性な転写と相関した。不活性なＸ染色体におけるこれらの２つのＨ３メチル化部位をさらに比較するため、Ｌｙｓ４メチル化Ｈ３に特異的な抗体を用いて、中期染色体を染色した。雌性細胞株ＨＨおよび６０６１Ｂ由来の中期染色体を、Ｌｙｓ４メチルＨ３抗血清と共にインキュベートし、そしてその染色パターンを、先に記載した間接免疫蛍光法によって分析した。顕著なことに、この抗体は、１スプレッドあたり一つの染色体を除いて、中期スプレッドのすべての染色体を強度に染色する（図１Ｂ）。この独特の染色体は、Ｈ３リジン４メチル化のいくつかの「ホットスポット」を除いて、ほぼ全く染色されない。５Ｘ細胞株の中期スプレッドの染色は、これらの染色体のうちの４つが、Ｌｙｓ４メチルＨ３抗体を使用すると過少染色（ｕｎｄｅｒｓｔａｉｎ）であること示す。このことは、低Ｈ３ Ｌｙｓ４メチル化染色体が、不活性なＸ染色体であることを示唆している。
【０１０６】
不活性なＸ染色体に関するより精密な試験によって、Ｌｙｓ４メチルＨ３抗体で強い染色を示す、この染色体のいくつかの異なる領域が存在することが示されている。１つの領域は、ｐ腕の遠位末端の偽常染色体領域に位置付けられるようであり、別の領域は、ｑ腕のＸｑ２５−２６付近に位置付けられる。そして、かすかな染色が、Ｘｐ１１周辺で時折観察される。Ｘｑ２５−２６を除いて、不活性なＸにおけるＬｙｓ４メチルＨ３染色の他の領域は、不活性化を回避することが公知の複数の遺伝子の位置に対応する（Ｃａｒｒｅｌら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６，１４４４０（１９９９））。従って、これらのデータは、Ｈ３のＬｙｓ４メチル化が、活性な遺伝子発現と関連付けられるという考えと一致する。
【０１０７】
Ｌｙｓ４メチルＨ３抗体によるＸｑ２５−２６領域の強い染色は、当惑させる。なぜなら、この領域は、Ｘの不活性化を回避するいかなる既知の遺伝子をも含まないからである。しかし、Ｘｑ２５−２６．１でのヘテロ接合性の損失は、進行したヒト卵巣癌腫と関連付けられるということは興味深い（Ｃｈｏｉら，Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ２０，２３４（１９９７）を参照のこと）。不活性なＸ染色体上のこの領域でのＬｙｓ４メチル化Ｈ３の富化に関するさらなる研究、およびＨ３のＬｙｓ４／Ｌｙｓ９のメチル化が、この位置での推定癌抑制遺伝子の発現レベルと相関するか否かを決定することによって、ヒストンＨ３のメチル化と遺伝子発現との間の関係に関するさらなる情報が提供される。
【０１０８】
Ｌｙｓ４メチルＨ３抗体による不活性なＸ染色体の過少染色は、Ｈ４の過剰アセチル化形態に対する抗体でのこの染色体の染色パターンと類似するが、同一ではない。この研究において、不活性なＸ染色体のｐ腕のテロメア領域におけるいくらかの染色が、過剰アセチル化Ｈ４に対する抗体を用いて観察されたが、Ｘｐ１１およびＸｑ２５−２６の領域では観察されなかった。対照的に、以前に公表された結果は、不活性なＸ染色体上の３つの領域（Ｘｐｔｅｒ−２２．２、Ｘｐ１１．３−１１．２およびＸｑ２２）が、過剰アセチル化Ｈ４に対する抗体で染色されたこと、しかしこれが、酪酸ナトリウムで処理されたヒト細胞中においてのみ観察されたことを示した。現在、過剰アセチル化Ｈ４の抗体によって染色される領域と、Ｌｙｓ４メチルＨ３の抗体によって染色される領域との間の正確な関係は明確に規定されていない。にもかかわらず、これらのデータは、不活性なＸ染色体が、過剰アセチル化コアヒストンおよびＬｙｓ４メチル化Ｈ３を欠くが、Ｌｙｓ９でメチル化されたＨ３を富化していることを示唆する。まとめると、ヒストン修飾のこれらの組み合わせは、不活性なＸの転写的なサイレンシングを媒介する一連の協調的反応の一部であり得る。
【０１０９】
Ｈ３ Ｌｙｓ９メチル化と不活性なＸ染色体との間の関係をさらに確立するために、免疫蛍光法と蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）との組み合わせによって、ヒト雌性ＩＭＲ９０間期細胞を試験した。特に、ＩＭＲ９０（ＡＴＣＣ）細胞を、カバーガラス上で２４〜４８時間増殖させ、次いで、４％ホルムアルデヒド中において１５分間室温で固定した；次いで、この細胞を、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むＰＢＳ中において４分間氷上で透過化し、ＰＢＳ中で洗浄し、次いで、２×ＳＳＣ中で洗浄し、次いで、ＲＮＡ ＦＩＳＨを行った。核の構造を保存するために、細胞を持続的に水和し続けた。ＲＮＡ ＦＩＳＨハイブリダイゼーションおよび洗浄を、本質的に他で記載された（Ｌａｃｈｎｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ４１０，１１６（２００１））ようにして実施した。簡潔には、細胞を、合計４．５ｋｂの配列にわたる４つのエキソン由来ＤＮＡフラグメントのプールを含むＸＩＳＴプローブでハイブリダイズし、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ＲｅｄまたはＧｒｅｅｎ ｄＵＴＰ（Ｖｙｓｉｓ，Ｄｏｗｎｅｒ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）でのニックトランスレーションにより標識した。３７℃での一晩のハイブリダイゼーション後、ＲＮＡ ＦＩＳＨについての標準的な洗浄（すなわち、５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ中で３回、および２×ＳＳＣ中で３回）を実施した。次いで、細胞を、ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ中で洗浄し、次いで、免疫蛍光法を実施した。一次抗体を室温で１時間インキュベートし、細胞をＰＢＳ中において４回洗浄し、次いで、二次抗体（Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ結合体化ヤギ抗ウサギ抗体）を室温で１時間適用し、次いで、ＰＢＳ中で４回洗浄した。核を、ＤＡＰＩで対比染色した。画像を、Ｏｒｃａ ２ ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）とＩｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎソフトウェア（ＩＰＬａｂ）とを備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ ２蛍光顕微鏡を使用して得た。
【０１１０】
ＸＩＳＴ転写物が、中期ではなく間期の不活性なＸ染色体に特異的に位置付けられること、およびＸｉｓｔ転写物の位置は、ＦＩＳＨ分析によって検出され得ることは、十分に確証されている。Ｌｙｓ９メチルＨ３抗体は、ＤＡＰＩ濃密領域との共存によって示されるようなヘテロクロマチン濃密領域を優先的に染色する。この濃縮された領域はまた、ＸＩＳＴ ＲＮＡシグナルと共存する。このことは、Ｌｙｓ９メチル化Ｈ３を富化した染色体が、実際に、不活性なＸであることを示す。中期染色体の結果と一致して、Ｌｙｓ４メチルＨ３抗体でのヒト間期細胞の染色は、不活性なＸに対応する領域（ＤＡＰＩ濃密染色およびＸｉｓｔ ＲＮＡの位置に基づく）が、Ｌｙｓ４メチルＨ３の染色を欠くことを示している。興味深いことに、Ｌｙｓ４メチルＨ３を富化した異なるドットが、いくつかの細胞について、ネガティブ染色領域内で観察される。Ｌｙｓ４メチルＨ３染色のこの位置付けられた領域が、中期染色体で観察される強く染色される領域に対応するのか否かは、現在知られていない。間期細胞および中期細胞におけるＬｙｓ９メチルＨ３染色およびＬｙｓ４メチルＨ３染色を並べた比較によって、さらに、これらの２つの抗体のそれぞれの染色パターンが、ほぼ相反的な画像であることが示された。これらの結果は、Ｈ３のリジン４およびリジン９でのメチル化が、それぞれ、転写的に活性な領域および不活性な領域についての「相反マーカー」であり、従って、不活性なＸ染色体は、リジン４では低アセチル化状態であるが、リジン９では過剰メチル化状態であるという結論へと導いた。
【０１１１】
生ずる１つの予測は、Ｌｙｓ４メチルＨ３抗体およびＬｙｓ９メチルＨ３抗体が、それぞれ、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）によって、Ｘ染色体上の活性なＦＦ４３遺伝子および不活性な遺伝子について富化するということである。不活性なＸ染色体において、ＸＩＳＴ遺伝子は転写的に活性であるが、ＰＧＫ１遺伝子はサイレントである。逆に、活性なＸ染色体において、ＸＩＳＴ遺伝子はサイレントであるが、ＰＧＫ１遺伝子は活性に転写される。上記の仮説を調べるために、ＣｈＩＰアッセイにおいて、単一の活性なヒトＸ染色体または不活性なヒトＸ染色体のいずれかを含む２つのＣＨＯ体細胞ハイブリッド細胞株を使用して、活性なＸ染色体または不活性なＸ染色体上に存在する遺伝子と関連付けられるヒストン修飾を試験した。これらの２つの細胞株由来のクロマチンを、Ｌｙｓ９メチル化Ｈ３、Ｌｙｓ４メチル化Ｈ３またはＬｙｓ９／１４アセチル化Ｈ３に対する抗体を用いて免疫沈降した。そして免疫沈降したＤＮＡを、ヒトＸｉｓｔ遺伝子およびＰＧＫ１遺伝子のプロモーター領域に対して特異的なプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。
【０１１２】
特に、クロマチン免疫沈降アッセイを、Ｃｈｅｕｎｇら，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ５，９０５（２０００）に記載されるように実施した。この場合、ホルムアルデヒドで固定されたクロマチンを、活性なヒトＸ染色体または不活性なヒトＸ染色体のいずれかを含むＣＨＯ体細胞ハイブリッドから収集した。明細書に示される抗体を用いた免疫沈降反応１回あたり、約３×１０６細胞に値する超音波処理クロマチンを使用した。広範な洗浄、逆架橋化（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ）、ＲＮａｓｅＡおよびプロテインキナーゼＫでの消化の後に、免疫沈降されたＤＮＡを、ヒトＸＩＳＴ遺伝子およびＰＧＫ１遺伝子のプロモーター領域に特異的なプライマー（プライマー配列およびＰＣＲ条件は、ＧｉｌｂｅｒｔおよびＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６，１３８２５（１９９９）に由来した）を使用するＰＣＲによって分析し、そしてポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。
【０１１３】
以前に公表された報告と一致して、アセチル化Ｈ３抗体は、不活性なＸ染色体からはＸＩＳＴ ＤＮＡのみを免疫沈降し、そして活性な染色体からはＰＧＫ１ ＤＮＡのみを免疫沈降した。これらの結果と類似して、Ｌｙｓ４メチルＨ３抗体は、ＸＩＳＴを活性に発現する細胞から（不活性なＸ染色体を含む細胞から）はＸＩＳＴ ＤＮＡを優先的に免疫沈降し、そして活性なＸ染色体を含む細胞からはＰＧＫ１ ＤＮＡを優先的に免疫沈降した。従って、アセチル化Ｈ３およびＬｙｓ４メチル化Ｈ３の両方は、活性なＸ染色体および不活性なＸ染色体の両方において、活性に転写されている遺伝子座で富化される。Ｌｙｓ９メチルＨ３抗体を使用する免疫沈降は、Ｌｙｓ４メチルＨ３抗体およびＬｙｓ４アセチルＨ３抗体を用いて得られる免疫沈降に対して相反的な結果を示した。この場合、ＸＩＳＴ ＤＮＡは、活性なＸ染色体を含む細胞からのみ免疫沈降されたが、ＰＧＫ１ ＤＮＡは、不活性なＸ染色体からのみ免疫沈降された。
【０１１４】
まとめて考えると、このクロマチン免疫沈降データは、Ｌｙｓ４またはＬｙｓ９でメチル化されたＨ３が、染色体の状況（活性なＸ 対 不活性なＸ）とは無関係に、活性な遺伝子および不活性な遺伝子と相反的に関連付けられることを示す。さらに、免疫蛍光での結果と組み合わせると、これらのデータは、Ｈ３における２つの異なるメチル化部位がそれぞれ、活性なクロマチンおよび不活性なクロマチンの標識領域であり得ることを示唆している。
【０１１５】
不活性なＸ染色体は、遺伝子発現の後成的な調節および転写サイレンシングを伴う特殊化されたヌクレオソーム構造の連結について、十分に研究された範例である。始めに言及したように、不活性なＸ染色体全体は、過剰アセチル化されたヒストンが大きく欠けているようであり、そしてコアヒストン改変体であるＭａｃｒｏＨ２Ａは、不活性Ｘ染色体において富化されていることが見出されている。興味深いことに、上記の修飾単独では、いずれもこの型の後成的な調節と関連する安定性を説明することができない。しかし、ヒストンメチル化が、Ｘ不活性化におけるその機能であるより「安定な」後成的クロマチン標識、そして可能性のある細胞性「記憶」マーカーがなおも探索されるべきことに関して、近年記載されている。
【０１１６】
より最近、ヒストンＨ３のリジン９におけるメチル化が、ヘテロクロマチンアセンブリに関して重要な修飾であることが規定され、そして本明細書中に示されるように、この修飾はまた、不活性Ｘ染色体の任意のヘテロクロマチンにおいて富化されている。対照的に、Ｈ３のリジン４におけるメチル化は、不活性Ｘ染色体において相補的に欠けていて、このことは、これらの２つの異なる部位におけるＨ３のメチル化が相反的であり得ること、およびリジン４においてメチル化されたＨ３分子は、転写的に活性な遺伝子と優先的に関連し、一方、その逆がリジン９においてメチル化されたＨ３について真であることを示唆する。これらの知見は、ヒストンアミノ末端テイル上の特定の部位における特定の修飾が異なる特徴を与え得、そして異なる細胞性機能を実行し得るという概念を支持する強力な証拠を提供する。
【０１１７】
クロマチン結合因子を補充するように機能するリジン９においてメチル化されたＨ３についての優先度を示してきたが、この修飾がＸ染色体の不活性化にどのように関与し得るかについては、未だ明らかではない。同様に、リジン４においてメチル化されたＨ３は、転写促進因子を補充するためか、または転写抑制因子の結合をブロックするために機能し得る；しかし、これらの可能性についての直接的な証拠は、いずれもまた欠けている。現在のＣｈＩＰアッセイは、Ｘ連結遺伝子のプロモーターを調べるのみであるが、これらそれぞれ２つの部位においてメチル化されたＨ３は染色体ドメインを区別するゲノムワイドな標識であるであることが予想される。真核生物ゲノムの活性領域および不活性領域は、対照クロマチン構造（ユークロマチン 対 ヘテロクロマチン）を適用するだけでなく、異なる核内ドメインを占有することもまた示されている。従って、リジン４またはリジン９におけるＨ３のメチル化は、転写許容環境 対 転写制限環境に関連する染色体領域の空間的な分布を規定し得る。
【０１１８】
同様に興味をそそることは、メチル化反応を担う酵素の問題である。これまでの研究により、ｈＳｕＶａｒ３−９がＨ３ リジン９特異的なヒストンメチルトランスフェラーゼであることが示されているが、ＳｕＶａｒ３−９ノックアウト胚由来の線維芽細胞は、不活性Ｘ染色体においてメチル化されたリジン９の富化を保持している。
【０１１９】
（実施例４）
（プラダー−ウィリー刻印づけ中心におけるヒストンＨ３ Ｌｙｓ９メチル化およびヒストンＨ３ Ｌｙｓ４メチル化の親特異的相補パターン）
刻印付け遺伝子座位は、父系対立遺伝子と比較して、発生のいくつかの段階または発生の全段階においていくつかの組織または全組織で母系の差次的発現を示す。刻印付け遺伝子座位の母系対立遺伝子と父系対立遺伝子との間の機能的な差異は、これらの座位を含む領域において母系染色体と父系染色体との間の構造的な差異を反映するに相違ない。これらの構造的な差異の確立のための最も簡単なモデルは、染色体ドメインが卵形成および精子形成の間に差次的に標識され、そしてこれらの生殖体刻印付け標識が体細胞における受精後も維持されるということを保持する。しかし、生殖体刻印付け標識が、受精後の差次的な遺伝子発現の原因となる刻印付け標識と同一であることを想定する論理に基づいた理由は存在しない。生殖体標識が体細胞標識と同じでない場合、生殖体標識を読み取り、そしてその情報を用いて体細胞刻印付け標識を強いるための機構が存在するはずである。
【０１２０】
哺乳動物における刻印付け標識の同一性は、広範囲な推測および実験分析の対象である。興味をそそる候補の刻印付け標識は、ＣｐＧジヌクレオチド中の５−メチルシトシンである。多くの刻印付け座位が、刻印付け領域の親起源特異的ＤＮＡメチル化を示し、そしてこれらの親特異的ＤＮＡメチル化標識のうちのいくつかは、配偶子形成の間に確立され、そして体細胞において維持される。メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを複製するための機構が存在する：メンテナンスＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）は半分メチル化されたＤＮＡ（一方の鎖でのみメチル化されたＤＮＡ）を認識し、そして相補鎖上のシトシン残基にメチル基を添加する。刻印付けとしてのシトシンメチル化の支持に頻繁に引用される実験は、ＤＮＭＴ１−／−胚（これは、胚発生の初期に消滅する）が、いくつかの刻印付け座位の二対立遺伝子（ｂｉａｌｌｅｌｉｃ）発現（その正常な一対立遺伝子発現は、不活性対立遺伝子のシトシンメチル化と関連する）を示すことの観察である。
【０１２１】
豊富なデータが刻印付けとしてのシトシンメチル化と一致するが、さらなる分子刻印付けまたは代替的な分子刻印付けについてのいくつかの証拠の路線が存在する。第１に、マウスＭａｓｈ２、ヒトＣＤＫＮ１Ｃ、およびヒトＵＢＥ３Ａを含む多数の刻印付け遺伝子は、親特異的ＤＮＡメチル化の領域を示していない。第２に、いくつかの遺伝子は、差次的にメチル化される領域の保存を示さない刻印付けの進化的な保存を示し、このことは、差次的なシトシンメチル化が一次刻印付けの二次的な結果であり得ることを示唆する。第３に、Ｍａｓｈ２刻印付けは、ＤＮＭＴ１−／−マウス胚において乱されていない。最後に、プラダー−ウィリー症候群（ＰＷＳ）刻印付け中心（ＩＣ）中の刻印付けＳＮＲＰＮ遺伝子のプロモーター領域は、マウスおよびヒトの体組織において差次的なシトシンメチル化を示し、そしてこの領域は、マウス卵母細胞において重度にメチル化されるが、マウス精子においてはメチル化されていない；しかし、Ｅ１−Ｍａａｒｒｉら（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．２７，３４１（２００１））は最近、この領域が、ヒト卵母細胞において全くメチル化されておらず（ヒト精子も同様）、ゆえに、差次的なシトシンメチル化は受精後に生じるに違いないということを示している。
【０１２２】
これらのデータは、少なくともいくつかの刻印付け遺伝子およびいくつかの刻印付け領域において、受精後に差次的な遺伝子発現を導く、生殖体から遺伝した母系対立遺伝子と父系対立遺伝子との間の構造的な差異が、シトシンメチル化以外の何かであるに違いないという結論を導く。原則として、この構造的な差異は、シトシンメチル化以外のＤＮＡの遺伝性共有結合的修飾、体細胞分裂を介して生殖体由来の母系染色体または父系染色体のいずれかと安定に結合したままのＤＮＡ結合タンパク質、または親特異的様式で遺伝されるＤＮＡ結合タンパク質の共有結合的修飾であり得る。
【０１２３】
ヒストン修飾（特に、アセチル化）は、これまでに、おそらく他の転写因子への接近性を増大させるようにクロマチン構造を変化させることによって、多数の転写調節タンパク質の効果を媒介することが示されている。アセチル化ヒストン（これは、極めて不安定である）と異なり、ヒストンに結合したメチル基は、非常に低レベルの代謝回転を示し、このことが、ヒストンメチル化を刻印付けのような後成的プロセスにおける良好な候補修飾としている。従って、近年Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａおよび分裂酵母中の安定なサイレンス（ｓｉｌｅｎｃｅｄ）クロマチン領域の形成と関連付けられているヒストン修飾（ヒストンＨ３のＬｙｓ９でのメチル化）は、ヒストンＨ３のＬｙｓ４でのメチル化（これは、テトラヒメナにおける転写活性と相関付けられている）と共に調べられている。
【０１２４】
ヒト染色体１５ｑ１１−ｑ１３中のプラダー−ウィリー症候群（ＰＷＳ）／アンジェルマン症候群（ＡＳ）領域は、約２Ｍｂの領域内に少なくとも１０個の刻印付け遺伝子を含む（Ｎｉｃｈｏｌｌｓら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１４、１９４（１９９８））；これらの遺伝子のうち８個は、父系染色体から排他的に発現され、そしてこれらの遺伝子のうち活性な父系対立遺伝子の欠損は、ＰＷＳ（これは、乳児低血圧、軽度の発達遅延、および後期発生型の摂食亢進および肥満によって特徴付けられる）を引き起こす。この領域における１つの遺伝子（ＵＢＥ３Ａ）の活性な母系対立遺伝子の欠損は、ＡＳ（これは、いくつかの精神遅滞、言語障害（ｌａｃｋ ｏｆ ｓｐｅｅｃｈ）、発作およびすぐに挑発される笑いによって特徴付けられる）を引き起こす。この領域は、２つの相互排除的な後成的状態（父系状態および母系状態）のいずれかで存在し得る。父系状態の確立は、ＳＮＲＰＮプロモーターをシスで含むＰＷＳ刻印付け中心（ＰＷＳ−ＩＣ）と称されるＤＮＡセグメントを必要とし；母系状態の確立は、ＡＳ−ＩＣと称されるＰＷＳ−ＩＣの動原体の、約３０ｋｂのＤＮＡセグメントを必要とする。この領域の後成的状態を確立する際のＰＷＳ−ＩＣおよびＡＳ−ＩＣの機能は、知られていない。
【０１２５】
コントロール（ＰＷＳ個体（欠失または刻印付けの欠損を介して１５ｑ１１−ｑ１３の父系コピーを欠いている）およびＡＳ個体（１５ｑ１１−ｑ１３の母系コピーを欠いている）の刺激リンパ球から調製したクロマチンを、Ｌｙｓ９でメチル化されたＨ３またはＬｙｓ４でメチル化されたＨ３のいずれかに対して特異的な抗体を用いて免疫沈降した。免疫沈降から収集したＤＮＡを、ＳＮＲＰＮプロモーターを含むＰＷＳ−ＩＣ中の配列およびこの領域中の他の配列についてＰＣＲによってアッセイした。ＰＷＳ刻印付け中心（ＰＷＳクロマチン中に存在する）の母系コピーを、抗メチルＬｙｓ９ Ｈ３抗体によって免疫沈降し、一方で、（ＡＳクロマチン中に存在する）父系コピー上のこの配列の沈降が劇的に低下した。この結果は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａおよび分裂酵母の両方におけるサイレンスヘテロクロマチンの維持がＬｙｓ９ ヒストンＨ３メチルトランスフェラーゼの機能を必要とするという観察と十分に相関する。母系特異的Ｈ３ Ｌｙｓ９メチル化領域は、ＳＮＲＰＮプロモーターから５’側に０．６ｋｂおよび３’側に０．５ｋｂ延びる。逆に、ＰＷＳ−ＩＣの父系コピーを、抗メチルＬｙｓ４ Ｈ３抗体によって免疫沈降した。この配列は、母系コピーに対して沈降しなかった。この修飾と活性クロマチンの関係についての以前の報告は、これらの知見と一致する。
【０１２６】
メチルＬｙｓ９ Ｈ３の親特異的差次的結合は、父系で発現されるＺＮＦ１２７、ＮＤＮ、ＭＡＧＥＬ２、ＩＰＷならびに組織特異的な母系発現を示すＵＢＥ３ＡおよびＡＴＰ１０Ｃを含む１５ｑ１１−ｑ１３中の他の刻印付け遺伝子のプロモーターで検出されなかった。メチルＬｙｓ９ Ｈ３はまた、ＡＳ−ＩＣと結合しなかった。しかし、メチルＬｙｓ４ Ｈ３が、父系活性遺伝子であるＮＤＮの父系対立遺伝子のプロモーター領域と特異的に結合することが見出された。リンパ球クロマチンにおける親特異的Ｌｙｓ４メチル化は、ＺＮＦ１２７、ＭＡＧＥＬ２、ＩＰＷ、ＵＢＥ３Ａ、またはＡＴＰ１０Ｃについて検出されなかった。
【０１２７】
記載された各修飾（シトシンメチル化、ヒストンＨ３およびＨ４のアセチル化、ヒストンＨ３ Ｌｙｓ４メチル化、およびヒストンＨ３ Ｌｙｓ９メチル化）は、異なる分布パターンおよび親特異性を示す。ＳＮＲＰＮプロモーターと重複するＰＷＳ−ＩＣは、最も広範囲な修飾パターン（母系対立遺伝子上のシトシンメチル化およびＨ３ Ｌｙｓ９メチル化、ならびに父系対立遺伝子上のヒストンＨ３およびＨ４のアセチル化、およびヒストンＨ３ Ｌｙｓ４メチル化）を示す。父系ＳＮＲＰＮプロモーター領域はまた、母系染色体上に存在しない非常に顕著なヌクレア−ゼ過剰感作性部位の部位である。差次的なシトシンメチル化を示すＮＤＮのプロモーター領域は、差次的なヒストンアセチル化も差次的なＨ３ Ｌｙｓ９メチル化もいずれも示さない。
【０１２８】
ヒトＰＷＳ刻印付け中心が卵母細胞においてシトシンメチル化を欠くことは明らかである；従って、この修飾は、ＡＳ／ＰＷＳ領域に対する生殖体刻印付けであり得ない。ＰＷＳ刻印付け中心の親特異的ヒストン修飾（Ｈ３アセチル化およびＨ４アセチル化、ならびにＨ３ Ｌｙｓ４メチル化）の間でもまた、精子がヒストンを欠くので生殖体刻印付けがなされ得ず、従って、父系生殖体刻印付けはヒストン修飾であり得ない。しかし、メチルＬｙｓ９ Ｈ３は、配偶子形成の間にＰＷＳ刻印付け中心においてヒストンに対して強いられ得る潜在的な候補刻印付け標識である。母系ヒストン修飾刻印付けは、ヒストンがクロマチンから取り出され、プロタミンによって置換される場合、精子形成の間にプログラムされた抹消を引き起こす特徴的な特性を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａおよび図１Ｂは、Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体（図１Ａ）またはＭｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体（図１Ｂ）のいずれかを用いて染色した正常雌性細胞株（ＨＨ）由来のヒト中期染色体の免疫蛍光検査法のパターンを示す。Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体またはＭｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体の局在は、Ｃｙ３結合二次抗体（ｒｅｄ）を用いて検出した。一方の優先的に染色される染色体と他方の染色体（大きな矢印で示す）との比較を示す２つの抗体を用いて、各々の免疫蛍光検査法のパターンを得た。図１Ｂに示されるように、不活性なＸ染色体の小さな領域のみが、Ｌｙｓ４メチルＨ３染色について増強される。
【図２】
図２は、体細胞ハイブリッド細胞株のＣＨＩＰ分析を示す。不活性（Ｘ不活性）または活性（Ｘ活性）ヒトＸ染色体を含む体性のハイブリッドＣＨＯ細胞由来のクロマチンは、以下の抗体を用いて免疫沈降される：
レーン１＝抗体なし（コントロールレーン）；レーン２＝Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３；
レーン３＝Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３；レーン４＝Ｌｙｓ９／１４−アセチル化Ｈ３；
レーン５＝ＤＮＡなし（コントロール）；レーン６＝ゲノムＤＮＡ。
免疫沈降されたＤＮＡ中のＸｉｓｔおよびＰＧＫ１プロモーターＤＮＡ配列の存在は、ＰＣＲによってアッセイした。ＰＣＲ産物を、１５％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、デジタルカメラによってイメージ化し、そしてそのイメージを臭化エチジウムで染色したバンドの視覚化を促進するために電子的に反転させた。不活性なＸ染色体を含む細胞から示されるように、Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体およびＬｙｓ９／１４アセチルＨ３抗体は、活性Ｘｉｓｔ遺伝子を優先的に免疫沈降させる。ところが、Ｍｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体は、不活性ＰＧＫ１遺伝子を優先的に免疫沈降させる。活性Ｘ染色体を含む細胞は、全く逆の免疫沈降パターンが観察された。
【図３】
図３は、単純な生物対複雑な生物との間のＨ３メチル化の免疫ブロット分析を示す。種々の供給源から単離したヒストン（各々の種からコアヒストンの総計５ｕｇ）は、１μｇの組換えＸｅｎｏｐｕｓ Ｈ３と一緒に、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離され、ＰＶＤＦ膜支持体に転写され、そしてＭｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３抗体またはＭｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３抗体のいずれかを用いてプローブした。レーン１〜５は、組換えＸｅｎｏｐｕｓ Ｈ３、出芽酵母、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ、トリおよびヒト細胞株２９３Ｔのそれぞれから単離されたヒストンを示す。同一のサンプルを平行して分析し、ヒストンのローディングをモニターするためにクマシー染色によって試験した。
Claims (25)
- Ｈ３のアミノ末端の最初の１５アミノ酸の抗原性フラグメントを含む精製されたペプチドであって、該抗原性フラグメントは以下：
- 前記ペプチドが、
- 以下：
- 前記ペプチドが、
- 前記抗体が、前記配列
- 前記抗体が、前記配列
- 前記抗体が、前記配列
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項３に記載の抗体。
- 前記抗体が標識されている、請求項３に記載の抗体。
- 請求項２に記載の抗原性フラグメントに対する結合特異性を保持する、請求項４に記載の抗体のフラグメント。
- 請求項４に記載の抗体および希釈剤または薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
- 転写的に活性なクロマチンを検出する方法であって、該方法が、以下の工程：
該クロマチンと抗体とを接触させる工程、ここで、該抗体はＨ３ヒストン中のメチル化されたリジン４残基にのみ特異的に結合し；
結合しない抗体および非特異的に結合する抗体を、サンプルから取り除く工程；ならびに
該サンプルに結合した抗体を検出する工程、
を包含する、方法。 - 請求項１２に記載の方法であって、前記検出する工程が、前記抗体と標識された二次抗体とを接触させる工程を包含し、ここで、該二次抗体が抗免疫グロブリン抗体である、方法。
- 転写的に不活性なクロマチンを検出する方法であって、該方法が、以下の工程：
該クロマチンと抗体とを接触させる工程、ここで、該抗体はＨ３ヒストン中のメチル化されたリジン９残基にのみ特異的に結合し；
結合しない抗体および非特異的に結合する抗体を、サンプルから取り除く工程；ならびに
該サンプルに結合した抗体を検出する工程、
を包含する、方法。 - 請求項１４に記載の方法であって、前記検出する工程が、前記抗体と標識された二次抗体とを接触させる工程を包含し、ここで、該二次抗体が抗免疫グロブリン抗体である、方法。
- ユークロマチンおよびヘテロクロマチンを検出するためのキットであって、該キットが、
- 請求項１６に記載のキットであって、前記抗体が、
- 請求項１６に記載のキットであって、
- メチルリジン４（ヒストン）特異的血清を生成する方法であって、該方法が、以下の工程：
該標的のメチル化されたリジンに隣接するヒストンアミノ酸配列を含む短いポリペプチドを化学的に合成する工程；
該ポリペプチドとカチオン化されたウシ血清アルブミンとを結合体化させる工程；および
結合体化させたペプチドをウサギまたはマウスに注射する工程、
を包含する、方法。 - メチル化されたＨ３ヒストンの存在を検出する方法であって、該方法が、ヒストンタンパク質と抗体とを接触させる工程を包含し、ここで、該抗体がリジン４またはリジン９でメチル化されているＨ３に特異的に結合する、方法。
- 疾患状態に関連するクロマチンの変化を検出する方法であって、該方法が、以下の工程：
クロマチンの第一のプールおよび第二のプールを作製するために、正常組織および病変組織の両方からクロマチンを単離する工程；
該クロマチンの第一のプールおよび第二のプールとＭｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３およびＭｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３からなる群から選択される抗体とを接触させる工程；ならびに
正常組織から単離されたクロマチンに結合した抗体の染色パターンと病変組織から単離されたクロマチンに結合した抗体の染色パターンとを比較する工程、を包含する、方法。 - 前記クロマチンが中期染色体を含む、請求項２１に記載の方法。
- 疾患状態に関連する核酸配列を同定する方法であって、該方法が、以下の工程：
クロマチンの第一のプールおよび第二のプールを作製するために、正常組織および病変組織の両方からクロマチンを単離する工程；
断片化したクロマチンをＭｅｔｈｙｌ（Ｋ４）Ｈ３およびＭｅｔｈｙｌ（Ｋ９）Ｈ３からなる群から選択される抗体を用いて免疫沈降させる工程；
該免疫沈降された断片化したクロマチンからＤＮＡを単離する工程；ならびに
該クロマチンの第一のプールから単離したＤＮＡと該クロマチンの第二のプールから単離したＤＮＡとを比較する工程、
を包含する、方法。 - 前記免疫沈降させる工程の前に、前記単離したクロマチンを断片化する工程をさらに包含する、請求項２３に記載の方法。
- 請求項２４に記載の方法であって、前記ＤＮＡを比較する工程が以下の工程：
前記クロマチンの第一のプールから単離したＤＮＡを、第一の固体表面に固定化する工程；
前記クロマチンの第二のプールから回収したＤＮＡを、第二の固体表面に固定化する工程；
該第一および第二の固体表面を同一の標識された核酸配列を用いて探索する工程；ならびに
該クロマチンの第一のプールから単離された固定化されたＤＮＡのみに結合する配列を同定する工程、
を包含する、方法。
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