JP2004518752A

JP2004518752A - 強化された細胞内輸送のためのポリヌクレオチド配合物

Info

Publication number: JP2004518752A
Application number: JP2002567355A
Authority: JP
Inventors: ブリュノー・ピタール
Original assignee: アベンティス・パスツール; アベンティス・ファーマ・ソシエテ・アノニム
Priority date: 2001-02-19
Filing date: 2002-02-19
Publication date: 2004-06-24
Also published as: US20040132676A1; WO2002067990A1; EP1363670A1; EP1232758A1; CA2438696A1

Abstract

本発明は、ポリヌクレオチドと、少なくとも２％（重量／容積）、好ましくは２〜１０％の式（Ｉ）ＯＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ａ（ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２Ｏ）_ｂ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｃＨ［式中、ａ、ｂおよびｃは、ポリオキシプロピレン部分の分子量が１４５０〜２０５０であり、ポリオキシエチレン部分がコポリマーの７５〜８５％（重量：重量）を構成するような値である］の非イオン性コポリマーとを含む医薬組成物に関する。当該組成物は、好ましくはカチオン脂質またはリン酸ナトリウムを含まない。当該コポリマーは、真核細胞への前記ポリヌクレオチドの輸送、または、真核細胞における前記ポリヌクレオチドの発現を改善することが意図されている。式（Ｉ）に相当するコポリマーの代表的な例はＦ６８である。本発明に係る組成物は、特に、遺伝子治療、ワクチン接種および免疫療法分野で有用である。

Description

【０００１】
本発明は、ポリヌクレオチドを真核細胞に輸送する方法、および、免疫化などの様々な治療分野におけるその使用に関する。
【０００２】
１９８０年代の終わりまでに、インビボでの遺伝情報の輸送は、遺伝物質がリポソームにカプセル化されているか、または、ウイルスベクターに統合されているかのいずれかの場合にのみ検出可能であることが一般的に認識されていた。その後、検出手段が改善されるにつれ、「裸のＤＮＡ」の発現が実際に起こり得ることが示された。これは、等張水溶液中のＤＮＡを用いて、単なる注射器を用いて筋肉内または皮内に注射することによって示された（Ｗｏｌｆｆｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４７：１４６５）。しかしながら、この発見は、大量のＤＮＡが必要であるというそれ自体の制限を有していることがすぐに明らかにもなった。これは、例えば遺伝子治療または免疫化の分野における、いわゆる「ＤＮＡ技術」の開発を妨げ得る実際に深刻な欠点であった。そこで、逆戻りして、細胞および／または核へのトランスフェクションの効率を高めることを目的として、ＤＮＡを様々な化学薬品と配合する試みが提案された。
【０００３】
先の１０年で、全領域の生産物がこの効果に関して試験された。最もよく知られた化合物としては、ＰＬＧＡ微粒子、カチオン脂質、例えばＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−２，２−（ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、リポポリアミンおよびポリリシンタイプのカチオン性ポリマーが挙げられる。これらの化合物は、ポリヌクレオチドに結合することができ、それらのトランスフェクションを促進すると考えられるが、それらのうちいずれも、完全に満足のいく結果は長期で得られなかった。実際に、配合ポリヌクレオチドの有効性は、全体的に、非配合ポリヌクレオチドの有効性とせいぜい同程度であった。
【０００４】
またあいにく、これら複合体のいくつかは、安定性を欠いていることもある。それゆえに、カチオン性のトランスフェクト剤（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇａｇｅｎｔ）／ポリヌクレオチド複合体を安定化する非イオン界面活性剤のような第二の化合物を加えることが提案されている（ＷＯ９８／３４６４８）。この界面活性剤は、特に、ポリオキシアルキレン、例えばＢＡＳＦ社販売のＰｌｕｒｏｎｉｃｓ^（Ｒ）Ｆ６８が挙げられ、これはまたＬｕｔｒｏｌの名前でも知られている。
【０００５】
現在、Ｆ６８のような化合物はまた、安定化目的に必要とされる量よりわずかに多い十分な量で加えられる場合、いかなるカチオン性分子が存在しなくてもトランスフェクションレベルに直接作用させることができる、ということが見出されている。
【０００６】
この理由のために、本発明は、ポリヌクレオチドと、少なくとも２％（重量／容積）の式（Ｉ）ＯＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ａ（ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２Ｏ）_ｂ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｃＨ［式中、ａ、ｂおよびｃは、ポリオキシプロピレン部分の分子量が１４５０〜２０５０であり、ポリオキシエチレン部分がコポリマーの７５〜８５％（重量：重量）を構成するような値である］の非イオン性コポリマーとを含む医薬組成物に関する。
【０００７】
他の実施形態において、本発明はまた、活性な治療物質としてポリヌクレオチドを含む薬剤を製造するための、式（Ｉ）ＯＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ａ（ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２Ｏ）_ｂ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｃＨ［式中、ａ、ｂおよびｃは、ポリオキシプロピレン部分の分子量が１４５０〜２０５０であり、ポリオキシエチレン部分がコポリマーの７５〜８５％（重量：重量）を構成するような値である］の非イオン性コポリマーの使用に関し、当該使用は、前記薬剤を必要とする個体の細胞への前記ポリヌクレオチドの輸送、および／または、前記薬剤を必要とする個体の細胞における前記ポリヌクレオチドの発現を改善するためであり、前記コポリマーは、少なくとも２％（重量：容積）の濃度で前記ポリヌクレオチドに加えられる。
【０００８】
また、本発明は、ポリヌクレオチドを真核細胞に輸送する方法に関し、当該方法は、細胞と、少なくとも２％（重量：容積）の式（Ｉ）ＯＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ａ（ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２Ｏ）_ｂ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｃＨ［式中、ａ、ｂおよびｃは、ポリオキシプロピレン部分の分子量が１４５０〜２０５０であり、ポリオキシエチレン部分がコポリマーの７５〜８５％（重量：重量）を構成するような値である］の非イオン性コポリマーを配合したポリヌクレオチドとを接触させることを含む。
【０００９】
典型的には、本発明は、（ｉ）本発明に係る組成物を哺乳動物またはその他いかなる動物に投与することを含む、インビボでポリヌクレオチドを輸送する方法；または、（ｉｉ）哺乳動物細胞（またはその他いかなる動物に由来する細胞）と、本発明に係る組成物とを接触させることを含む、インビトロまたはエクスビボでポリヌクレオチドを輸送する方法で有り得る。エクスビボでの輸送方法に関して、哺乳動物細胞を予め生物から採取し、それらがポリヌクレオチドを取り込んだら、該生物中にさらに再移植することができる。
【００１０】
有利には、本発明に係る組成物は、カチオン脂質およびリン酸ナトリウムを含まない。必要に応じて、本発明に係る組成物はまた、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび塩化マグネシウムからなる群より選択される化合物を、好ましくは等張または高張な量で含み得る。
【００１１】
本発明の使用に関して、上記の記載に相当する非イオン性コポリマーは、典型的には、ＢＡＳＦ社販売のＰｌｕｒｏｎｉｃ^（Ｒ）Ｆ６８である。その平均分子量は８４００と推定され、親水性ポリオキシエチレン成分は、総重量の約８０％を示す。この製品は２０℃で固形である。室温で、水溶液中、式（Ｉ）のコポリマーは、かなり広い濃度範囲（例えば１〜１５％）で球形のミセルを形成する。室温では、例えば１〜１５％の式（Ｉ）のコポリマーを含む水溶液は、液状である。より高い温度では、液状の溶液はゲルに変化し、続いてペーストになる。より詳細な情報は、ＡｌｅｘａｎｄｒｉｄｉｓＰ．，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＣｏｌｌｏｉｄ＆ＩｎｔｅｒｆａｃｅＳｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２：４７８で見出すことができ、これは、参照により本発明に組み込まれる。
【００１２】
有利には、本発明に係る医薬組成物は、２〜１５％、好ましくは２〜１０％、最も好ましくは約５％の式（Ｉ）のコポリマーを含む。
【００１３】
本発明における使用に関して、上記ポリヌクレオチドは、ポリデオキシリボヌクレオチドまたはポリリボヌクレオチドのいずれでもよい。それらの起源は問題ではなく、天然または人工；ゲノムＤＮＡまたは相補ＤＮＡ；トランスファーＲＮＡまたはリボゾームＲＮＡが挙げられる。それらは、特に、動物、ヒト、植物、細菌またはウイルス起源であり得る。
【００１４】
治療薬としてのそれらの機能は、特に、宿主細胞における遺伝子発現またはｍＲＮＡ転写を制御することによりアンチセンス分子として作用することであり得る。また、それは、所定のポリペプチド、例えばタンパク質を真核細胞で発現させることができるポリヌクレオチドであり得る。
【００１５】
特定の実施形態によれば、上記ポリヌクレオチドは、宿主細胞による発現に関し、治療的に重要なタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを動作可能なようにコードし、これは受容生物の機能障害を克服するのに有用である。それゆえに、本発明に係る組成物はインビボまたはエクスビボの遺伝子治療に有用である。
【００１６】
また、上記ポリヌクレオチドは、ヒトまたは動物においてそれに対する免疫反応を生じさせることが可能なポリペプチドを動作可能なようにコードすることができ、特に該ポリペプチドは、病原体（感染因子）または腫瘍状態（腫瘍関連抗原）に特異的である。
【００１７】
それゆえに、この特定の実施形態によれば、本発明は、特に、感染症、例えばウイルスまたは細菌の感染症、もしくはガンを治療または予防するための、ワクチンの調製、または、ヒトまたは動物に適用される免疫療法治療をもたらす。
【００１８】
この後者の実施形態における使用に関して、上記ポリヌクレオチドはＤＮＡが有利であり、好ましくはベクターの形態、すなわちプラスミドベクターの形態である。安全性の理由で、このようなベクターは非感染性であり、宿主生物中で複製されない。加えてこのようなベクターは、宿主生物のゲノムに統合する能力を実質的に欠いている。治療的ポリペプチドまたは抗原性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、宿主生物中でのその発現に必要な要素の制御下に置かれる。この目的のために、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーターを用いることが一般的な方法である。
【００１９】
上述したように、本発明に係る医薬組成物は、インビボまたはエクスビボの遺伝子治療目的に用いることができる。この理由に関して、その他の観点に従い、本発明はまた、遺伝子の欠乏または欠失により誘導された疾患を治療する方法に関し、当該方法は：
疾患を治すことが可能な遺伝子を含むポリヌクレオチドと、少なくとも２％（重量／容積）の式（Ｉ）の非イオン性コポリマーとを含む組成物を、このような治療を必要とする患者に投与すること；または、
このような治療を必要とする患者から適切な細胞を収集すること、これらの細胞と、（ａ）疾患を治すことが可能な遺伝子をコードするポリヌクレオチドと、（ｂ）少なくとも２％（重量／容積）の式（Ｉ）の非イオン性コポリマーとを含む組成物とを、細胞がトランスフェクトされるように接触させること、および、トランスフェクトされた細胞を患者に再移植することを含む。
【００２０】
遺伝子治療に有用な組成物は、治療的な遺伝子、すなわち治療効果を示すポリペプチドをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む。このタンパク質産物は、標的細胞に関して同種（すなわち、標的細胞が病的な状態を示さない場合、標的細胞で通常発現される産物）であり得る。この場合、本発明に係る組成物の投与の後に続くポリペプチドの発現は、例えば、不十分な発現、または、不活性もしくは弱い活性のタンパク質の発現を克服することを可能にする。また、治療的な遺伝子は、高められた安定性、改変された活性等を有する細胞性ポリペプチドの変異型をコードしてもよい。また、該ポリペプチドは、標的細胞に関して異種でもよく、例えば、不十分な活性または異常な活性を補足したり、導入したり、または、改変したりできる。
【００２１】
この観点において、本発明はまた、遺伝的障害を治療するための薬剤の製造における、遺伝子欠失を修正することが可能なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、非イオン性コポリマー（特に式（Ｉ）または（ＩＩ）のコポリマー）との、上述の組み合わせ使用に関する。
【００２２】
インビボでの治療上の処置において、本発明に係る組成物は、いかなる特定の除外なしに、治療に最も適切な経路で投与することができ、一般的に、局所、皮膚、経口的、直腸、膣、非経口的、鼻腔内、筋肉内、皮下、眼内、皮内等に投与することができる。
【００２３】
また、本発明に係る組成物は、免疫化（例えばワクチン接種）および免疫療法の分野においても有用であり得る。この場合、当該組成物は、抗原性産物をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含み、当該抗原性産物は、本質的にはタンパク質（タンパク質、ポリペプチド、ペプチド等；包括的にポリペプチドと称される）であり、例えば、いかなる病原体もしくは感染因子（例えば病原性ウイルスまたは細菌）により自然状態下で発現されるポリペプチド、または、腫瘍状態または腫瘍条件で特徴的に異常発現する哺乳動物のポリペプチド（腫瘍関連抗原）であり得る。従ってこれは、感染因子特異的ポリペプチドまたはガン特異的ポリペプチドと称される。
【００２４】
ヒトを免疫にするための本発明に係る組成物の使用は、式（Ｉ）の非イオン性コポリマーが、非配合ポリヌクレオチドで観察された抗原に対する抗体反応に比べて、該反応を顕著に高めることができるため、特に有利である。実際に、裸のＤＮＡまたは既知のＤＮＡ配合物を用いた免疫化は、一般的に細胞性免疫反応を高めるが、その一方で体液性反応はわずかしか誘導されない。驚くべきことに、本発明の組成物は、良好な抗体反応を誘導するのに有用であることが見出された。
【００２５】
適切なレベルでの抗体反応の誘導を促進することは、式（Ｉ）のコポリマーの特別な特性ではない。様々なタイプの非イオン性コポリマー（非イオン性ポリオールまたは誘導体）も、同じ効果を生じさせることができる。この目的のために、ポリマー内のポリオキシアルキレンは、特にアルキレン基を有するポリオキシアルキレンが可能であり、当該アルキレン基の長さまたはコンフォメーションは異なっていても同一でもよく、特に、ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンのブロックコポリマー、例えばＰａｓｃｈａｌｉｓＰ．（上記）で説明されたブロックコポリマー、例えばポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）およびポロキサミン（ｐｏｌｏｘａｍｉｎｅ）が挙げられ、特に、式（ＩＩ）ＯＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ａ（ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２Ｏ）_ｂ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｃＨ［式中、ａ、ｂおよびｃは、ポリオキシプロピレン部分の分子量が１０００〜４０００であり、ポリオキシエチレン部分がコポリマーの１０〜８５％（重量：重量）を構成するような値である］に相当するブロックコポリマーが挙げられる。
【００２６】
この観点において、本発明はまた、感染症またはガンを治療または予防するための薬剤の製造における、病原菌またはガンに特異的なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、非イオン性コポリマー、特に式（Ｉ）または（ＩＩ）の非イオン性コポリマーとの、上述の組み合わせ使用に関する。この医薬組成物または免疫化組成物は、特に、感染症またはガンを治療または予防することを目的とした免疫反応、特に体液性免疫反応を誘導するのに必要とされる。
【００２７】
免疫化および免疫療法の分野で有用な本発明の組成物は、これらの分野で一般的に用いられるいかなる経路、特に、粘膜経路、例えば経口的経路、胃内経路および鼻腔内経路、または、非経口的経路、例えば筋肉内経路、皮内経路、表皮内経路および皮下経路で投与され得る。有利には、ガンを治療するのに有用な組成物は、腫瘍部位または組織のできる限り近くに投与される。当該組成物が充実性腫瘍を治療することを目的とする場合、その投与は、腫瘍のまさにその部位に、特に直接注射により実行することができる。
【００２８】
一般的に、投与されるポリヌクレオチドの量は、例えば治療または予防される疾患、ポリヌクレオチドそのものの特徴、例えばアンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡ、プラスミドベクターのプロモーターの強度、遺伝子により発現された産物の生物活性のような多数の要素、本組成物が対象とする個体または動物（すなわち哺乳動物）の身体的な状態（体重、年齢等）、投与方法、および、配合物のタイプに依存する。一般的に、治療または予防的観点において成人に投与され得る有効な用量は、約１０μｇ〜約５ｍｇ、好ましくは約１００μｇ〜約５ｍｇ、最も特に好ましくは約２５０μｇ〜約３ｍｇである。投与は、１回の用量で行ってもよいし、または、間を置いて繰り返し行ってもよい。
【００２９】
本発明の組成物は、遺伝子治療、ワクチンまたは免疫療法分野での使用における規制に従って、従来どおりに製造することができる。特に、組成物は薬学的に受容されるビヒクルを含み、固体（例えば凍結乾燥形態）でも、または液状でもよい。必要に応じて、当該固形は投与用の液体媒体中で再構成されてもよい。
次の図を参照して本発明を以下で説明する。
【００３０】
実験
材料および方法
動物
メスのＢａｌｂ／ＣマウスをＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＬｅｓＯｎｃｉｎｓ，Ｆｒａｎｃｅ）から購入し、スイス、Ｃ５７Ｂ１／６およびウィスターラットをＪａｎｖｉｅｒＥｌｅｖａｇｅ（ＬｅＧｅｎｅｓｔＳｔＩｓｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。マウスをよびラットを８週齢、４００〜４５０ｇでそれぞれ用いて、ＦｒｅｎｃｈＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈｆｏｒａｎｉｍａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎのガイドラインに従って収容し、世話をした。
【００３１】
プラスミド
プラスミドｐＣＭＶ−ｌｕｃ（Ｆｅｒｒａｒｉｅｔａｌ，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．（１９９７）４：１１００）、ｐＣＭＶβ−ｇａｌ（クロンテック社製）ｐＣＭＶ−ＧＦＰ（クロンテック社製）およびｐＭ−１０６８は、それぞれルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、および、ＨＩＶＧａｇ／Ｐｏｌ／Ｎｅｆ融合タンパク質をコードする合成遺伝子を含み、それらはそれぞれヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子（ＣＭＶＩＥ１）プロモーターの制御下である。ＨＩＶキメラは、ヒトにおけるＴ細胞エピトープ免疫優性（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ）であることが知られているＰｏｌおよびＮｅｆタンパク質のペプチドに融合した全長コドン最適化ｇａｇ遺伝子で構成される（Ｄｅｍｌｅｔａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２００１）７５（２２）：１０９９１）。同ＰｏｌおよびＮｅｆエピトープは、ＡＬＶＡＣ−ＨＩＶｖＣＰ１４５６により発現される（Ｊｉｎｅｔａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２００２）７６（５）：２２０６）。
プラスミドｐＣＭＶ−ＳｅＡＰ（またはＶＲ−ＳｅＡＰとも称される）およびｐＣＭＶ−ＨＡ（ＶＲ−ＨＡ）を、基幹をＶｉｃａｌ由来とするＶＲ１０１２を用いて構築した（Ｈａｒｔｉｋｋａｅｔａｌ，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．（１９９６）７（１０）：１２０５）。それらは、それぞれ、ＣＭＶＩＥ１プロモーターとウシ成長ホルモンポリＡシグナルとの制御下に、分泌されたアルカリホスファターゼ（ＳｅＡＰ）とインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子とを含む。
プラスミドは、ＥｎｄｏＦｒｅｅプラスミド精製カラム（キアゲン社、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて組換え大腸菌から精製された。０．８％アガロースゲル電気泳動実験によれば、プラスミドが本質的にスーパーコイルであるであることが示された。
【００３２】
Ｌｕｔｒｏｌを用いたプラスミドＤＮＡの調製
Ｌｕｔｒｏｌ（またはＦ６８とも称される）、ポリ（エチレンオキシド）_７５−ポリ（プロピレンオキシド）_３０−ポリ（エチレンオキシド）_７５ブロックコポリマーは、ＢＡＳＦ社からの贈与品である。ストック溶液を水中２０％（ｗ／ｖ）で調製し、４℃で保存した。Ｌｕｔｒｏｌ／プラスミドＤＮＡ配合物は、等量の１０％Ｌｕｔｒｏｌ（２×Ｆ６８）と、３００ｍＭのＮａＣｌ（１．８％ＮａＣｌ）、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液中の２×プラスミドＤＮＡ溶液とを混合することによって調製され、５０μｌ溶液（１５０ｍＭのＮａＣｌ（０．９％）中に５％（ｗ／ｖ）Ｌｕｔｒｏｌを含む）当たり必要な最終濃度のＤＮＡが得られた。１５０ｍＭのＮａＣｌ中の裸のＤＮＡ溶液もコントロールとして用いた。
【００３３】
筋肉注射
４００μｌのエトミデート（Ｈｙｐｎｏｍｉｄａｔｅ２ｍｇ／ｍｌ、Ｊａｎｓｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ，Ｉｓｓｙ−ｌｅｓ−Ｍｏｕｌｉｎｅａｕｘ，Ｆｒａｎｃｅ）、または、ケタミン（Ｉｍａｌｇｅｎ５００、Ｍｅｒｉａｌ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）とキシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ２％、ＢａｙｅｒＰｕｔｅａｕｘ，Ｆｒａｎｃｅ）との混合物を腹膜内注射することにより、マウスを麻酔した。前脛骨筋（ｔｉｂｉａｌｃｒａｎｉａｌｍｕｓｃｌｅ）の上の皮膚の毛を剃り、動物に５０μｌの裸のＤＮＡまたは配合ＤＮＡを注射した。ＤＮＡ免疫化のために、Ｂａｌｂ／Ｃマウスの筋肉内に３週の間隔で２回注射した。ＺｏｌｅｔｉｌＮＤ（Ｖｉｒｂａｃ，Ｃａｒｒｏｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を３０ｍｇ／ｋｇ腹膜内注射することにより、ラットを麻酔した。５００μｇの裸のＤＮＡまたは配合ＤＮＡを含む５００μｌをラットの前脛骨筋に注射した。
【００３４】
アルカリホスファターゼ活性の測定
ＳｅＡＰは、クロンテック社製のキット（ＧｒｅａｔＥｓｃａｐｅＫ−２０４１−１）を用いて分析された。簡単に言えば、１５μｌの血清を９６−ウェルプレートのウェルごとに分配し、４５μｌの１×希釈緩衝液を加える。内因性のアルカリホスファターゼを不活性化するためにプレートを６５℃で３０分間インキュベートし、続いて４℃に冷却し、室温で放置する。続いてウェル当たり６０μｌの試験緩衝液を加え、プレートを室温で５分間インキュベートする。ウェル内容物を黒い９６−ウェルプレート（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒ，Ｄｙｎａｔｅｃｈ）に移送する。続いて、２０倍に希釈したＣＳＰＤ（３−（４−メトキシ−スピロ（ｌ，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３，３．１．１^３．７］デカン）−４−イル）フェニルリン酸二ナトリウム）を６０μｌ加え、次に室温で２０分間インキュベートする。Ｖｉｃｔｏｒ−１４２０ルミノメーター（Ｗａｌｌａｃ）を用いて、アルカリホスファターゼ活性を反映した化学発光シグナルを測定する。
上記キットに添付の組換えＳｅＡＰ（０．１ｍｇ／ｍｌ）を用いた標準範囲（１０^−７〜１０^−１の希釈、すなわち０．０１〜１０，０００ｐｇ／μｌ）のＳｅＡＰが含まれる。この標準範囲の回帰線により、光量単位（ＲＬＵ）を用いてＳｅＡＰ発現をｐｇ／ｍｌに変換することができる。
【００３５】
ルシフェラーゼ活性の測定
特に指定のない限り、前脛骨筋へのＤＮＡ注射の７日後にマウスを屠殺した。それぞれの注射された筋肉を取り除き、液体窒素中で冷凍し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ，ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加した１ｍｌのレポーターリシス緩衝液（プロメガ社、Ｃｈａｒｂｏｎｎｉｅｒｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）中でホモジナイズした。１０００ｒｐｍで４分間の遠心分離の後、１０μｌの上清のルシフェラーゼ活性をＶｉｃｔｏｒ２（パーキンエルマー社、ＬｅｓＵｌｌｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）で測定した。１００μｌのルシフェラーゼ基質（プロメガ社、Ｃｈａｒｂｏｎｎｉｅｒｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を添加後５秒間、光の放射を測定した。精製ルシフェラーゼ（シグマ社）を用いて注射されていないマウスの前脛骨筋で調製された標準曲線が、各マイクロプレートに対して含まれる。結果を筋肉当たりのルシフェラーゼ（ｐｇ）＋／−ＳＥＭで示した。
【００３６】
組織学的分析
ｐＣＭＶ−βｇａｌプラスミドＤＮＡ／Ｌｕｔｒｏｌ複合体を筋肉注射した後７日目に、前脛骨筋を４％の新しいパラホルムアルデヒド中で２０分間固定し、ＰＢＳ（２ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．０１％デオキシコール酸ナトリウム、０．４％ＮＰ４０を含む、ｐＨ７．４）で３０分間３回洗浄した。続いて、１ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ）を含むＸ−ｇａｌ溶液（ＰＢＳ中、２ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．０１％デオキシコール酸ナトリウム、０．４％ＮＰ４０、５ｍＭフェリシアン化カリウム、５ｍＭフェロシアン化カリウム、ｐＨ７．４）中で、筋肉を３７℃で一晩インキュベートした。最後に組織をパラフィンに埋め込み、４μｍ切片にカットした。２００μｍごとに１つの切片をマウントし、Ｋｅｒｎｅｃｈｔｒｏｔ溶液で対比染色した。
【００３７】
抗体反応の測定
体液性反応は、Ｈａｅｎｓｌｅｒｅｔａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９８）１７（７−８）：６２８で説明されたＥＬＩＳＡ分析により研究され、ここで不活性化インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４または組換えＨＩＶＰ２４（Ｇａｇタンパク質）がコーティング抗原として用いられる。
免疫化前と、２回目のＤＮＡ配合物注射の１４日後とに、血清サンプルを麻酔したマウスから回収した。インフルエンザウイルスとＰ２４とに特異的な抗体（トータルＩｇＧおよび／またはＩｇＧサブクラス）をＥＬＩＳＡで測定した。全体の不活性化インフルエンザウイルス（Ａ／ＰＲ／８／３４）および組換えＰ２４を用いて、ウェルを被覆した。血清サンプルを１／１００〜１／２０４８００に希釈した。ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ，Ｍｏｎｔｌｕｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を１／３００００に希釈した。プレートを分光光度計（ＶｍａｘＰｌａｔｅｒｅａｄｅｒ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ，ＢｉｏＴｉｍｅ，Ｓｔ−Ｇｒｅｇｏｉｒｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を４９０〜６５０ｎｍで用いて読み取った。実験データからブランクの平均値を引いた。抗インフルエンザウイルスおよび抗Ｐ２４のタイターは、各ＥＬＩＳＡプレートに含まれる標準Ａ／ＰＲ／８／３４およびＰ２４−特異的マウス血清の４−パラメーターの回帰曲線からそれぞれ計算された。標準のタイターは、１０の独立した実験から式：ＯＤ（４９０〜６５０ｎｍ）×１０／１／希釈に従って予め決定されていた。免疫化後のその特異的なタイターが免疫前のタイターの平均より少なくとも０．５ｌｏｇ_１０高い場合に、抗血清が陽性であるとみなした。
【００３８】
ＥＬＩＳＰＯＴ
ニトロセルロースで裏張りされたマイクロタイタープレート（９６−ウェルマルチスクリーンＭＡプレート、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｔＱｕｅｎｔｉｎＦａｌｌａｖｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）を、一次抗γ−ＩＦＮ抗体（＃１８１８１ＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＰｏｎｔｄｅＣｌａｉｘ，Ｆｒａｎｃｅ）（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で１０μｇ／ｍｌ）で室温で１時間被覆した。プレートをＲＰＭＩ培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣｅｒｇｙＰｏｎｔｏｉｓｅ，Ｆｒａｎｃｅ）で１時間ブロックし、ＰＢＳで洗浄した。２回目の免疫化後１２日目に回収された脾細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および抗生物質を含むＲＰＭＩ培地中に再懸濁した（ＨＡＤＮＡ免疫化マウスからの脾細胞は２×１０^６個の細胞／ｍｌの濃度で、または、ＨＩＶＤＮＡ免疫化マウスからの脾細胞は４×１０^６個の細胞／ｍｌの濃度で）。マウスＩＬ−２（ベーリンガー社製）を加え、最終濃度を２０Ｕ／ｍｌにした。１００μｌの細胞懸濁液を抗サイトカイン被覆プレートに３連で分配した。Ｈ−２Ｋｄ分子で制限されたＡ／ＰＲ／８／３４ＨＡ２細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープ（ＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬ）、または、Ａ／ＰＲ／８／３４核タンパク質ＣＴＬエピトープ（ＴＹＱＲＴＲＡＬＶＴＧ、ネガティブコントロール）に相当するペプチドを、最終容積２００μｌ中、最終濃度２０μｇ／ｍｌで、ＨＡＤＮＡ免疫化マウスからの脾細胞に加えた。Ｈ−２Ｋｄ分子で制限されたｇａｇ細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープ（ＡＭＱＭＬＫＥＴＩ）、または、Ａ／ＰＲ／８／３４核タンパク質ＣＴＬエピトープ（ＴＹＱＲＴＲＡＬＶＴＧ、ネガティブコントロール）に相当するペプチドを、最終容積２００μｌ中、最終濃度２０μｇ／ｍｌで、ＨＩＶＤＮＡ免疫化マウスからの脾細胞に加えた。プレートを、３７℃の加湿した５％ＣＯ_２インキュベーターで１８時間インキュベートした。続いて、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄し、ビオチン化抗γ−ＩＦＮ抗体（＃１８１１２ＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｆｒａｎｃｅ）１μｇ／ｍｌで、室温で２時間被覆した。続いて、プレートをＰＢＳＴｗｅｅｎで洗浄し、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（＃７１００−０５ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｌｉｎｉｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｏｎｔｒｏｕｇｅ，Ｆｒａｎｃｅ）で処理した。プレートを室温で１時間インキュベートし、充分に洗浄した。最後の洗浄の後、３−アミノ−９−エチルカルバゾールペルオキシド基質の溶液を加えることにより、γ−ＩＦＮ分泌細胞を可視化した。スポットをイメージアナライザー（ＭｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｅｖｒｙ，Ｆｒａｎｃｅ）で計数し、値を手動計数により確認した。３連ウェルのスポット数を平均することにより、γ−ＩＦＮ生産細胞の頻度を計算した。非抗原ウェル（γ−ＩＦＮスポットが１０個未満）からのスポット平均値を引いた。
【００３９】
結果
Ｌｕｔｒｏｌ／ＤＮＡ配合物のトランスフェクション活性
５％Ｆ６８の存在または非存在下でのインビボでのトランスフェクションの後、ＳｅＡＰまたはルシフェラーゼをコードする遺伝子の発現レベルを研究した。
図１に示されるように、血清サンプルで測定されたＳｅＡＰ活性は、５％Ｆ６８の存在によりＳｅＡＰ発現レベルが約１１倍に高められたことを示す。
図２に示されるように、トランスフェクトされたマウス前脛骨筋で測定されたルシフェラーゼ活性は、裸のＤＮＡよりＬｕｔｒｏｌ／ＤＮＡ配合物のほうが、ルシフェラーゼ発現を高めることにおいてより活性であることを示す。ルシフェラーゼ発現の時間経過は（図２Ａ）、ルシフェラーゼが、ＤＮＡまたはＬｕｔｒｏｌ／ＤＮＡ配合物の筋肉注射後６時間にすでに合成されたことを示す。ルシフェラーゼ発現は次第に増加し、３日目でプラトーに達する。７日目で、ルシフェラーゼ活性のわずかな減少が検出される。これらの４つの時点で、ルシフェラーゼ活性は、裸のＤＮＡよりＬｕｔｒｏｌ／ＤＮＡ配合物を用いたほうが大きい（６時間で２．５倍〜７日目で１１倍）。ルシフェラーゼ発現は、マウス前脛骨筋に注射されたプラスミドＤＮＡ量の作用により直線的に増加し、例えば５０μｇの裸のＤＮＡは、５μｇの裸のＤＮＡ活性より９倍大きいルシフェラーゼ活性を発生させる（図２Ｂ）。その反対に、前脛骨筋に注入されたＬｕｔｒｏｌ／ＤＮＡ配合物では、注射したプラスミド量に直接比例したルシフェラーゼ発現は生じず、なぜなら５０μｇの５％Ｌｕｔｒｏｌ配合ＤＮＡは、５μｇの配合したＤＮＡより６０倍大きいルシフェラーゼ発現を生じさせるためである。裸のＤＮＡまたは５％Ｌｕｔｒｏｌ配合ＤＮＡをＢａｌｂ／Ｃ、スイスおよびＣ５７Ｂ１／６マウスの前脛骨筋に注入することによるルシフェラーゼ発現の研究により（図２Ｃ）、マウス系に関係なく、５％Ｌｕｔｒｏｌの存在により遺伝子発現が改善されることが示される。
【００４０】
レポーター遺伝子発現のインビボでの生体内分布
裸のＤＮＡ（図３Ａ）またはＬｕｔｒｏｌ／ＤＮＡ配合物（図３Ｂ、ＣおよびＤ）を筋肉注射した後７日目のマウス前脛骨筋の、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を用いた組織学的分析によれば、Ｌｕｔｒｏｌ／ＤＮＡの関係が、β−ガラクトシダーゼ酵素を発現する筋線維の数を増加させることを示す。β−ガラクトシダーゼ発現筋原線維の数は、裸のＤＮＡまたは２および５％Ｌｕｔｒｏｌ配合ＤＮＡを注射された各マウス組織断面で計数された。陽性の線維の数は、裸のＤＮＡを筋肉注射されたもので得られた数より、２および５％Ｌｕｔｒｏｌ配合ＤＮＡの方が、それぞれ４および１０倍高い（図３Ｆ）。組織断面の検査によれば、輸送遺伝子発現のレベルは筋原線維と他で可変的であり、Ｌｕｔｒｏｌ／ＤＮＡ配合物でトランスフェクトされた筋原線維は、平均して、裸のＤＮＡでトランスフェクトされた筋原線維より高いレベルでβ−ガラクトシダーゼを発現することが示される。前脛骨に近い筋肉におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の分析によれば、導入遺伝子発現は注射された筋肉に限られることが示される。Ｌｕｔｒｏｌが導入遺伝子を発現する筋原線維の数を強化するという観測結果を補強するために、β−ガラクトシダーゼの代わりに緑色蛍光タンパク質を用いてこの方法を繰り返した。組織断面によれば、プラスミドＤＮＡを混合した５％Ｌｕｔｒｏｌが、ＧＦＰを発現する筋原線維の数の増加をもたらすことが再度示される（図３ＦおよびＧ）。
【００４１】
他の動物種における我々の遺伝子デリバリーシステムを確認するために、ラットの前脛骨筋に、裸のｐＣＭＶβ−ｇａｌプラスミドＤＮＡまたはＬｕｔｒｏｌ／ＤＮＡ配合物を注射した。Ｌｕｔｒｏｌ／ＤＮＡ配合物を注射されたラットからの前脛骨筋の顕微鏡検査によれば（図４Ｂ）、裸のＤＮＡを受容した筋肉（図４Ａ）と比べて、トランスフェクトされた線維のパーセンテージの顕著な増加が示される。代表的なラットの前脛骨筋断面の光学顕微鏡写真において、可変的な青色の強度が観察され、β−ガラクトシダーゼ発現レベルが筋原線維と他で異なることが示される。より高い倍率のこれらの組織断面によれば、筋内膜および毛細血管における細胞の近辺でβ−ガラクトシダーゼ酵素も見出されたことが示される（図４Ｄ）。
【００４２】
Ｌｕｔｒｏｌ存在下でのＤＮＡ免疫化
ＤＮＡ免疫原性に対するＬｕｔｒｏｌの影響を評価するために、ＣＭＶプロモーターの制御下でインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）のＨＡタンパク質をコードするプラスミドを、マウス前脛骨筋に注射し、５週間後に血清のタイターをＥＬＩＳＡで測定した（図５Ａ）。
１μｇの裸のＨＡプラスミドの注射では、試験された６匹のマウスにおいて低い特異的なＩｇＧ抗体のタイターしか得られず、セロコンバージョンは観察されない。それに対して、１０μｇのＤＮＡを含むＬｕｔｒｏｌ／ＤＮＡ配合物を筋肉注射することにより、６匹の動物中４匹においてセロコンバージョンを伴い、抗ＨＡタイターの規模が１１０倍増加する。１０μｇ用量に関して、Ｌｕｔｒｏｌ／ＤＮＡ配合物は、陽性の抗血清の幾何平均タイターが９倍（４．５２〜３．５８ｌｏｇ_１０）に増加し、全てのマウスがセロコンバージョンを起こす。Ｌｕｔｒｏｌ配合プラスミドＤＮＡ（５０μｇ）での免疫化では、抗体タイターまたはセロコンバージョンを起こしたマウスの数のいずれも改善されない。以前の実験では、５０μｇのプラスミドＤＮＡの筋肉注射により、特異的な抗ＩＧｇタイターがプラトーレベルに達し、セロコンバージョンのパーセンテージが１００％に達することが示された（データ示さず）。
【００４３】
プラスミドＤＮＡ免疫化のその他のモデルを用いて、Ｌｕｔｒｏｌ／ＤＮＡ配合物が実際に免疫反応を強化できるかどうかを決定することを確かめた。ＨＩＶｇａｇ、ｐｏｌおよびｎｅｆタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡを用いた（ｐＭ−１０６８）。食塩水中のプラスミドＤＮＡまたは５％Ｌｕｔｒｏｌ配合のプラスミドＤＮＡの様々な濃度を筋肉注射することによりＢａｌｂ／Ｃマウスを免疫化し、抗ｐ２４抗体タイター測定のために５週間後に血清を回収した。図５Ｂによれば、食塩水中のプラスミドＤＮＡまたは５％Ｌｕｔｒｏｌ配合プラスミドＤＮＡいずれかを１および３μｇを注射したマウスでは、特異的なＩｇＧ抗体は非常に低いことが示される。１０、３０および１００μｇの裸のプラスミドＤＮＡを用いれば、それぞれ６匹マウスのうち３匹、６匹マウスのうち６匹、および６匹マウスのうち６匹において、セロコンバージョンを伴い、より高い反応が得られる。１０、３０および１００μｇのプラスミドＤＮＡを含むＬｕｔｒｏｌ／ＤＮＡ配合物の筋肉注射により、それぞれ、裸のＤＮＡに対して１００、１０および４倍の平均抗体タイターの増加が生じる。１０μｇ用量に関しては、５％Ｌｕｔｒｏｌの存在により、セロコンバージョンを起こした動物の数が、６匹のうち３匹から、６匹のうち６匹に増加する。
要するに、これら２種の免疫化モデルを用いた結果により、Ｌｕｔｒｏｌが、ＤＮＡ免疫化により誘導される体液性反応を顕著に強化するのに有用であることが確認できる。
【００４４】
Ｌｕｔｒｏｌ／ＤＮＡ配合物の筋肉注射後の細胞性応答
プラスミドｐＣＭＶ−ＨＡおよびｐＭ−１０６８の追加免疫注射の後それぞれ２および３週間目に、ＤＮＡ免疫化で誘導された細胞性応答に関するＬｕｔｒｏｌの効果を研究し、脾臓細胞を回収し、ＣＴＬエピトープを含むペプチドでの刺激でγ−ＩＦＮを生産するＨＡまたはｐ２４に特異的なＴ細胞存在に関して、ＥＬＩＳＰＯＴで試験した。図６ＡおよびＢによれば、前脛骨へ注射されたＤＮＡの量が、明らかにスポット数に依存していることが示された。平均の応答は、５％Ｌｕｔｒｏｌの存在下でより高いが、その差は統計的に有意ではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】
裸のプラスミドＶＲ−ＳｅＡＰ（１）または５％Ｌｕｔｒｏｌ配合プラスミドＶＲ−ＳｅＡＰ（２）のいずれか（１０μｇ）を筋肉注射したＢａｌｂ／Ｃマウスで生産された分泌アルカリホスファターゼ（ＳｅＡＰ）の発現を示す。６匹のマウスからなる２つの群を構成した。容量１００μｌ未満の１０μｇのプラスミドを、各マウスの各前脛骨筋へ続けて２回（各５０μｌ）注射することにより投与した。７日後、血液サンプルを回収し、血清をＳｅＡＰ活性に関して試験した。
【図２】
図２Ａは、裸のプラスミドｐＣＭＶ−ｌｕｃ（黒四角）または５％Ｌｕｔｒｏｌ配合プラスミドｐＣＭＶ−ｌｕｃ（白丸）のいずれかを筋肉注射することによって生じたルシフェラーゼ発現の時間経過を示す。各群において６個の前脛骨筋が含まれる。スイスマウスの各前脛骨筋に裸のＤＮＡ（コントロール群）または配合ＤＮＡいずれかを１５μｇ含む食塩水（５０μｌ）を注射した。６時間〜７日後、ルシフェラーゼ活性を測定するために、筋肉を回収し、リシス緩衝液の存在下でホモジナイズした。その結果を、合成されたルシフェラーゼ量の平均として筋肉当たりのルシフェラーゼ（ｐｇ）で示す。ＳＥＭは、標準誤差である。
図２Ｂは、ルシフェラーゼ発現が注射されたＤＮＡの量に依存することを示す。６個の前脛骨筋からなる２つの群を構成した。スイスマウスの各前脛骨筋に、裸のｐＣＭＶ−ｌｕｃ（コントロール群）または５％Ｌｕｔｒｏｌ配合ｐＣＭＶ−ｌｕｃのいずれかを５、２５または５０μｇ含む配合物（５０μｌ）を注射した。７日後にルシフェラーゼ活性を測定した。その結果を、筋肉当たりのルシフェラーゼの量（ｐｇ）として示す。
図２Ｃは、容積５０μｌ未満の裸のプラスミドｐＣＭＶ−ｌｕｃ（白バー）または５％Ｌｕｔｒｏｌ配合プラスミドｐＣＭＶ−ｌｕｃ（黒バー）のいずれか１５μｇの筋肉注射により生じたルシフェラーゼ発現に関するマウス系の影響を示す。様々な系、すなわちＢａｌｂ／Ｃ、スイスおよびＣ５７Ｂ１／６からの６個の前脛骨筋の群を構成した。７日後、ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果を、筋肉当たりの生産されたルシフェラーゼ（ｐｇ）の平均として示す。
【図３】
図３Ａ〜Ｄは、容積５０μｌ未満の裸のｐＣＭＶβ−ｇａｌ（３Ａ）または５％Ｌｕｔｒｏｌ配合ｐＣＭＶβ−ｇａｌ（３Ｂ、ＣおよびＤ）のいずれか５０μｇをスイスマウスの前脛骨筋に注射した後７日で可視化した、β−ガラクトシダーゼ発現の生体内分布を示す。
図３Ｅは、容積５０μｌ未満の裸のｐＣＭＶβ−ｇａｌ（白バー）または２もしくは５％Ｌｕｔｒｏｌ配合ｐＣＭＶβ−ｇａｌ（黒バー）のいずれか５０μｇを注射した後に得られた青色の筋原線維平均数を示す。最も高いトランスフェクションレベルを示した組織断面を用いて青色の細胞数を数えた。データは、各群における平均＋／−ＳＥＭ（ｎ＝６）として示される。
図３Ｆおよび３Ｇは、裸のプラスミドＤＮＡｐＣＭＶ−ＧＦＰ（３Ｆ）または５％Ｌｕｔｒｏｌ配合プラスミドＤＮＡｐＣＭＶ−ＧＦＰ（３Ｇ）のいずれかを注射した後７日後の、前脛骨筋の組織断面を表す。
【図４】
図４Ａ〜Ｄは、容積５００μｌ未満の裸のｐＣＭＶβ−ｇａｌ（４Ａおよび４Ｃ）または５％Ｌｕｔｒｏｌ配合ｐＣＭＶβ−ｇａｌ（４Ｂおよび４Ｄ）のいずれか５００μｇを筋肉注射した後の、ラットの前脛骨筋におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の組織学的分析を示す。図４Ｃおよび４Ｄは、それぞれ４Ａ〜４Ｂの拡大像を表す。
【図５】
図５Ａおよび５Ｂは、裸の（白バー）または５％Ｌｕｔｒｏｌと配合された（黒バー）いずれかの様々な量のプラスミドｐＣＭＶ−ＨＡ（１、１０および５０μｇ、容積５０μｌ未満）およびｐＭ−１０６８（１、３、１０、３０および１００μｇ、容積５０μｌ未満）をＢａｌｂ／Ｃマウスの筋肉内に注射することにより生じた、Ａ／ＰＲ／８／３４インフルエンザ系（５Ａ）またはＨＩＶｐ２４（５Ｂ）に対するＩｇＧ抗体反応をそれぞれ示す。６匹のマウス群を構成した。０日目および２１日目にマウスに用量を投与した。２回目の注射から２週間後に血清サンプルを回収し、抗Ａ／ＰＲ／８／３４（５Ａ）および抗ｐ２４（５Ｂ）トータルＩｇＧに関してＥＬＩＳＡでアッセイした。結果を平均の抗体タイターとしてプロットし、ここでエラーバーはＳＥＭを示す。
【図６】
図６Ａおよび６Ｂは、裸の（白バー）または５％Ｌｕｔｒｏｌと配合された（黒バー）いずれかの、様々な量のプラスミドｐＣＭＶ−ＨＡ（１、１０および５０μｇ、容積５０μｌ未満）およびｐＭ−１０６８（１、３、１０、３０および１００μｇ、容積５０μｌ未満）をＢａｌｂ／Ｃマウスの筋肉内に注射することにより生じた、Ａ／ＰＲ／８／３４インフルエンザ株（６Ａ）またはＨＩＶｐ２４（６Ｂ）に対するγ−ＩＦＮ生産細胞の免疫をそれぞれ示す。６匹のマウス群を構成した。０日目および２１日目にマウスに用量を投与した。２回目の（追加免疫）注射から１２日後に脾臓細胞を回収し、ＥＬＩＳＰＯＴによりγ−ＩＦＮ生産細胞をアッセイした。各バーは、１０^６個の細胞当たりのγ−ＩＦＮを分泌する細胞の数の平均＋／−ＳＥＭを示す。

Claims

ポリヌクレオチドと、少なくとも２％（重量／容積）の式（Ｉ）ＯＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ａ（ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２Ｏ）_ｂ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｃＨ［式中、ａ、ｂおよびｃは、ポリオキシプロピレン部分の分子量が１４５０〜２０５０であり、ポリオキシエチレン部分がコポリマーの７５〜８５％（重量：重量）を構成するような値である］の非イオン性コポリマーとを含む医薬組成物。
カチオン脂質を含まない、請求項１に記載の組成物。
リン酸ナトリウムを含まない、請求項１または２に記載の組成物。
ポリヌクレオチドと、２〜１０％（重量／容積）の式（Ｉ）の非イオン性コポリマーとを含む、請求項３に記載の組成物。
ポリヌクレオチドと、約５％（重量／容積）の式（Ｉ）の非イオン性コポリマーとを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび塩化マグネシウムからなる群より選択される化合物を、等張または高張な量でさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
非イオン性コポリマーがＰｌｕｒｏｎｉｃｓ^（Ｒ）Ｆ６８である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
ポリヌクレオチドがアンチセンスポリヌクレオチドである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
ポリヌクレオチドは、所定のポリペプチドを真核細胞で発現することができる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
ポリヌクレオチドは、病原体または腫瘍状態に特異的なポリペプチドを発現することができる、請求項９に記載の組成物。
ポリヌクレオチドは遺伝子欠失を修正することができる、請求項９に記載の組成物。
ポリヌクレオチドはＤＮＡである、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
活性な治療薬としてポリヌクレオチドを含む薬剤の製造における、式（Ｉ）ＯＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ａ（ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２Ｏ）_ｂ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｃＨ［式中、ａ、ｂおよびｃは、ポリオキシプロピレン部分の分子量が１４５０〜２０５０であり、ポリオキシエチレン部分がコポリマーの７５〜８５％（重量：重量）を構成するような値である］の非イオン性コポリマーの使用であって、このような薬剤を必要とする患者の細胞への上記ポリヌクレオチドの輸送、および／または、このような薬剤を必要とする患者の細胞での上記ポリヌクレオチドの発現を改善するために、上記コポリマーは、少なくとも２％（重量：容積）の濃度で上記ポリヌクレオチドに加えられる、上記の使用。
コポリマーは、２〜１０％の濃度でヌクレオチドに加えられる、請求項１３に記載の使用。
コポリマーは、約５％の濃度で前記ヌクレオチドに加えられる、請求項１４に記載の使用。
薬剤は、カチオン脂質またはリン酸ナトリウムを含まない、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の使用。
薬剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび塩化マグネシウムからなる群より選択される化合物を、等張または高張な量でさらに含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の使用。
コポリマーがＰｌｕｒｏｎｉｃｓ^（Ｒ）Ｆ６８である、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の使用。
ポリヌクレオチドが請求項８〜１２のいずれか一項で定義された、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の使用。
活性な治療薬として、病原体または腫瘍状態に対する免疫反応を誘導するために病原体または腫瘍状態に特異的なポリペプチドを真核細胞で発現することが可能なポリヌクレオチドを含む薬剤の製造における、式（Ｉ）ＯＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ａ（ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２Ｏ）_ｂ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｃＨ［式中、ａ、ｂおよびｃは、ポリオキシプロピレン部分の分子量が１４５０〜２０５０であり、ポリオキシエチレン部分がコポリマーの７５〜８５％（重量：重量）を構成するような値である］の非イオン性コポリマーの使用であって、上記コポリマーは、少なくとも２％（重量：容積）の濃度で上記ポリヌクレオチドに加えられる、上記の使用。
免疫反応が特に体液性である、請求項２０に記載の使用。
免疫反応は、病原体により誘発される腫瘍状態または感染症を防ぐ、請求項２０または２１に記載の使用。
免疫反応は、病原体により誘発される腫瘍状態または感染症に対して治療作用を有する、請求項２０または２１に記載の使用。
活性な治療薬として、遺伝的障害を治療するために遺伝子欠失を修正することができるポリペプチドを真核細胞において動作可能なようにコードするポリヌクレオチドを含む薬剤の製造における、式（Ｉ）ＯＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ａ（ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２Ｏ）_ｂ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｃＨ［式中、ａ、ｂおよびｃは、ポリオキシプロピレン部分の分子量が１４５０〜２０５０であり、ポリオキシエチレン部分がコポリマーの７５〜８５％（重量：重量）を構成するような値である］の非イオン性コポリマーの使用であって、上記コポリマーは、少なくとも２％（重量：容積）の濃度で上記ポリヌクレオチドに加えられる、上記の使用。
ポリヌクレオチドを真核細胞に輸送する方法であって、上記細胞と上記ポリヌクレオチドとを接触させることを含み、上記ポリヌクレオチドは、少なくとも２％（重量：容積）の式（Ｉ）ＯＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ａ（ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２Ｏ）_ｂ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｃＨ［式中、ａ、ｂおよびｃは、ポリオキシプロピレン部分の分子量が１４５０〜２０５０であり、ポリオキシエチレン部分がコポリマーの７５〜８５％（重量：重量）を構成するような値である］の非イオン性コポリマーと共に配合される、上記の方法。
ポリヌクレオチドが請求項２〜６のいずれか一項で定義されたように配合される、請求項２５に記載の方法。
コポリマーがＰｌｕｒｏｎｉｃｓ^（Ｒ）Ｆ６８である、請求項２５または２６に記載の方法。
ポリヌクレオチドが請求項８〜１２のいずれか一項で定義された、請求項２５、２６または２７に記載の方法。