JP2004508423A - ホスファチジルセリンを保有するアポトーシス擬態体及び医療用治療におけるその使用 - Google Patents

Abstract

三次元構造を有し、サイズと形がアポトーシス細胞及びアポトーシス小体に類似し、ホスファチジルセリン（ＰＳ）分子をその表面に有する合成及び半合成体を患者に投与して、患者の免疫系を改変し、その結果、不適当なサイトカインの発現と関連する疾患又は内皮機能不全の症状を軽減及び／又は進行を遅らせる。合成及び半合成体は、患者において、アポトーシス様のメカニズムの引き金を引くものと考えられる。投与単位当たり５００から５００，０００，０００の量のホスファチジルセリン（ＰＳ）保有体を使用する。ＰＳ保有体はリポソームとすることができる。

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生化学活性を有する合成及び半合成組成物、及び哺乳類患者の種々の疾患の治療及び／又は予防におけるその使用に関する。特に、患者の体内に導入した後に細胞アポトーシスのプロセスを擬態して、有益な効果を得ることができる合成及び半合成体の調製及び使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
下記の文献が引用される。
【０００３】
【参考文献】

【０００４】
体内の細胞死の２つのメカニズム、ネクロシスとアポトーシスが知られている。アポトーシスは、プログラムされた細胞死のプロセスであり、Ｋｅｒｒら、（１９９２）により記載されており、それにより、連続的な細胞分裂と分化が起こるように、体内の種々の器官システムと組織の安定状態のレベルが保持されている。アポトーシスを受ける細胞は、しばしば、細胞容量の著しい減少、細胞骨格の修飾などの、特有の形態変化を示し、顕著な膜泡状突起、クロマチンの濃縮、ＤＮＡのオリゴヌクレオゾーム断片への分解をもたらす。これらの形態変化の後に、アポトーシス細胞は、破れて、アポトーシス小体として知られる、数多くの小さな断片となり、これは本質的に、インタクトなオルガネラ、クロマチンなどを含む膜結合体からなる。アポトーシス細胞とアポトーシス小体は、通常、迅速に、マクロファージ、樹状突起細胞の食作用により体から除去され、その後、それらを溶解し、それらの潜在的な前炎症性細胞内容物を放出させることができる。
【０００５】
アポトーシス細胞及び／又はアポトーシス小体を摂取したマクロファージ（例えば、食作用）は、前炎症性サイトカイン生産を阻害するようであり（Ｆａｄｏｋら、１９９８）、こうして患者の免疫系におけるＴｈ−１応答を下方制御することができる。そのような下方制御は、アポトーシス細胞又は小体の接種の後に、又はアポトーシスが促進されやすい細胞接種の後に達成することもできる。
【０００６】
アポトーシスの間に、ホスファチジルセリンは、細胞膜上の外部に露出し（Ｆａｄｏｋら（１９９２））、この露出したホスファチジルセリンは、特異的なレセプターに結合して、哺乳類におけるアポトーシス細胞の取り込みとクリアランスを媒介する（Ｆａｄｏｋら、（２０００））。細胞上のホスファチジルセリンの表面発現は、アポトーシス細胞の同定の認識された方法である。
【０００７】
Ｍｏｎａｓｔｒａら（１９９３）は、ウシ皮質由来のリン脂質ホスファチジルセリン（ＰＳ）（ＢＣ−ＰＳ）の投与が、ＳＪＬ／Ｊマウスにおいて養子移植された実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）に対する効果を有するかもしれないことを記載している。しかしながら、３０ｍｇ／ｋｇという非常に多量のＢＣ−ＰＳ投与が、毎日腹膜内に注射された。ヒトに与えられたリポソームの等価の投与（平均個体当たり２ｇを超える）は、毒性の可能性があり、高価で、したがって非実用的であり、好ましくない。そのような量は、とにかく薬剤としては活性であり、免疫系改変剤としては作用が強すぎるであろう。
【０００８】
ＰＳの経口投与が、空間記憶を改善するために、５０ｍｇ／日の量で動物モデルにおいて（Ｚａｎｏｔｔｉら、１９８９）、またアルツハイマー病を治療するために３００ｍｇ／日の量でヒトにおいて（Ｄｅｌｗａｉｄｅら，１９８６）用いられ、プラセボと比較して、ＰＳ処理患者において、統計的に著しい改善がみられた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するための手段】
本発明は、ＰＳ保有体が多くの疾患の治療に用いることができるという驚くべき発見に関するものである。
【００１０】
特に、非毒性でＴ細胞機能媒介疾患を治療するのに有効な量のＰＳ保有体を、哺乳類の患者へ投与することを含むＴ細胞機能媒介疾患を治療するための方法であって、Ｔ細胞機能媒介疾患の進行が阻害される及び／又は減少するものである方法に関する。
【００１１】
さらに、非毒性で炎症性疾患を治療する有効量のＰＳ保有体を、哺乳類の患者へ投与することを含む炎症性疾患の治療方法であって、炎症性疾患の進行が阻害される及び／又は減少する方法に関する。
【００１２】
さらに、本発明の別の態様は、非毒性で内皮機能疾患を治療する有効量のＰＳ保有体を、哺乳類の患者へ投与することを含む内皮機能疾患の治療方法であって、内皮機能疾患の進行が阻害される及び／又は減少するものである方法である。
【００１３】
別の実施態様は、非毒性で、不適当なサイトカイン発現を治療するのに有効な量のＰＳ保有体を、哺乳類の患者へ投与することを含み、疾患の進行が阻害される及び／又は減少するものである、不適当なサイトカイン発現を特徴とする免疫系疾患の治療方法である。
【００１４】
本発明は、また、哺乳類に投与されるために製薬上許容される生体適合性合成又は半合成体と、製薬上許容されるキャリアを含み、その合成又は半合成体の少なくとも一部が、哺乳類アポトーシス小体に相当する配置とサイズを有し、その合成又は半合成体の表面は、修飾されて一以上のホスファチジルセリンレセプターに対する複数のリガンドを含み、哺乳類患者に投与されるときその体は抗原提示細胞上のホスファチジルセリンレセプターへ結合することが可能である、製薬組成物にも関する。生体適合性の合成体はリポソームでもよい。
【００１５】
本発明の別の態様は、製薬上のキャリアと、哺乳類に投与されるための非リポソーム合成体を含み、非リポソーム生体適合性合成体が、哺乳類アポトーシス小体に相当する配置とサイズを有し、その体の表面は、修飾されて一以上のホスファチジルセリンレセプターに対する複数のリガンドを含み、哺乳類患者に投与されるときその生体適合性合成体は抗原提示細胞上のホスファチジルセリンレセプターへ結合することが可能である、製薬組成物に関する。生体適合性非リポソーム合成体は、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルデンプン、及びアガロースなどの多糖類、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリスチレン、及び広範囲の他の天然、半合成、及び合成物質から選択することができる。
【００１６】
他の実施態様では、本発明は、凍結乾燥されたＰＳ保有体、及び凍結乾燥されたＰＳ保有体と製薬上許容されるキャリアを含むパーツのキットに関する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明によれば、インビボのアポトーシス細胞及び／又はアポトーシス小体を擬態する特性を有し、患者の免疫系の細胞により取り込まれて、インビボで前炎症性サイトカインの阻害及び／又は抗炎症性サイトカインの増進などの有益な効果を伴う、合成及び半合成体が、患者に投与される。これらの合成及び半合成体は、形及び寸法が、哺乳類細胞に類似した範囲から、哺乳類細胞のアポトーシスにより産生されるアポトーシス小体にほぼ類似した範囲である三次元体であり（典型的には、球状、円柱状、長球面及び偏球面を含む回転楕円状、ジグザク状、腎臓形状で、直径が約５０ナノメーターから約５００ミクロンであるがこれに制限されない）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）分子をその表面に有している。そのような体を以下「ＰＳ保有体」と称する。
【００１８】
「合成又は半合成ＰＳ保有体」なる用語は、ＰＳと、５０％までのリポソームの非ＰＳ成分を含むリポソームを意味する。「非リポソーム合成体」なる用語はリポソームでないＰＳ保有体を意味する。
【００１９】
上述の如く、細胞の膜上に露出されたＰＳは、マクロファージによるアポトーシスリンパ球のクリアランスにおいて、鍵となる役割を果たすことが知られている。ＰＳに対するレセプターは、マクロファージ上に存在する。「ホスファチジルセリンレセプター」又は「ＰＳレセプター」は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のレセプター、例えばマクロファージであり、その活性は、モノマー又はオリゴマーの溶解性のホスファチジルセリンにより阻害される。ＰＳレセプターは、樹状細胞などの他のＡＰＣ上に存在することもできることを意図している。ＰＳがＰＳレセプターのリガンドであることは理解されている。
【００２０】
本発明によれば、適当な手段により患者に投与した後、おそらくマクロファージ及び／又は樹状細胞又は他の抗原提示細胞の飲み込みにより、又は他の相互作用により、他のＰＳ保有体は、患者の免疫系と相互作用して、サイトカイン反応に関して、アポトーシス細胞／小体がマクロファージにより食作用を受けるときに得られるものと実質的に同様の効果を与える。
【００２１】
本発明において、ＰＳ保有体は、ワクチンといくらか類似した方法で、患者の免疫系の改変剤として作用することも重要である。したがって、それらは、接種部位で、ＰＳ保有体の適合な免疫応答を開始するのに十分な局所的濃度を提供する量と投与方法により用いられる。免疫系改変物質に適当なＰＳ保有体の量は、一般的に、受容動物の体のサイズに直接比例せず、したがって、薬剤投薬量と明確に区別することができ、患者の血流と組織において治療レベルの活性物質を提供するように設計される。薬剤投薬量は、したがって、非常に大きい。
【００２２】
患者は哺乳類でもよく、ヒト、及びウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコなどの家畜を含むがこれにより限定されないことが意図される。
【００２３】
ＰＳ保有体は、表面のＰＳ分子を有する。リン脂質として、ＰＳは、膜の単一成分として、又はその主要又は微量成分として、他のリン脂質及び／又は膜形成物質とともにリポソームの膜を形成することができる。リポソーム、又は液体ビシクルは、ミクロン又はサブミクロンの範囲の密封された嚢であり、その壁は、適当な両親媒性物質の層からなる。それらは、通常水性媒体を含む。ＰＳ保有体は、リポソーム構造に限定されない。
【００２４】
リン脂質は、両親媒性分子（すなわち両親媒性物質）であり、これは、水に不溶性の炭化水素鎖に結合した極性水溶性基を有する分子を含む化合物を意味する。マトリックスの層として機能する両親媒性物質は、規定された極性及び無極性領域を有する。両親媒性物質は、ＰＳ、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルコリン、コレステロール、カルジオリピン、セラミド及びスフィンゴミエリンなどの自然発生の脂質を、単独使用又は互いの混合物として、含むことができる。それらは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエステル及びサッカロースジエステルなどの合成化合物でもよい。
【００２５】
本発明は、ＰＳ保有体として、膜成分としてＰＳを有するリポソームだけでなく、その外表面分子上にホスホセリンのモノマー又はオリゴマー（ホスファチジルセリンと区別される）を非ＰＳ膜成分を、例えば、リポソーム表面の化学的改変により結合されて、ＰＳを患者の受容免疫系の成分とのさらなる相互作用に利用可能にしている有するリポソームも使用を意図している。ホスホセリンをその分子の表面上に含むために、それらはＰＳ保有体の定期の範囲内に含まれる。
【００２６】
本発明に用いられる好ましいＰＳ保有体は、５０−１００重量％のホスファチジルセリン（ＰＳ）と、残余のホスファチジルコリン（ＰＣ）又は他の生物的に許容されるリン脂質（類）から構成されるリポソームである。より好ましいのは、６５−９５重量％、さらに好ましくは７０−８０重量％の範囲のＰＳにより構成されるリポソームであり、現在の実験結果に基づけば、最も好ましい実施態様は、ＰＳが７５重量％であり、残りがＰＣなどの他のリン脂質である。それらは、周知の方法により、原料としてリン脂質の適当な量の混合物から調製される。
【００２７】
適当なサイズのリポソームを調製する方法は、当業者に知られており、本発明の一部を構成するものではない。種々の教科書と文献を参照することができ、例えば、Ｙｅｃｈｅｚｋｅｌ Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ及びＤａａｎ Ｊ． Ａ． Ｃｈｒｏｍｅｌｉｎｅによる総説、及びそこに引用されている文献、例えば、Ｎｅｗ， Ｒ．Ｃ．（１９９０）及びＮａｓｓａｎｄｅｒ，Ｕ．Ｋ．ら（１９９０）を参照することができる。
【００２８】
本発明の好ましい実施態様のＰＳリポソームの直径は、約５０ナノメーターから約１０００ナノメーターであり、より好ましくは約５０ナノメーターから約５００ナノメーターである。そのような好ましい直径は、哺乳類のアポトーシス小体の直径に相当するであろう。
【００２９】
リポソームの種々の代替物は、本発明においてＰＳ保有体として使用することができる。これらは、通常製薬業で用いられるような、天然又は合成の生体適合性物質、例えばポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリスチレンなどや、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシエチルセルロース、アガロースなどの多糖類の、粒子、顆粒、ミクロスフェア、又はビーズを含む。そのような適当な物質で、ＰＳに結合して誘導体化されたもの、アガロースの場合、結合されたＰＳを有しているものは、市販されており、例えば、Ｐｏｌｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．４００ Ｖａｌｌｅｙ Ｒｏａｄ， Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ， ＰＡ １８９７６又はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓより市販されている。ビーズは、固体又は中空状でよく、又は生体適合性物質で充填されていてもよい。それらは、必要なら、それらの表面にＰＳ分子を有するように改変されている。
【００３０】
ＰＳ保有体の患者への投与は、患者の免疫系の活性成分に作用可能に接触させる適当な手段なら、いかなる手段を用いてもよい。
【００３１】
ＰＳ保有体は、生理滅菌食塩水、滅菌水、パイロジェンフリーの水、等張食塩水、及びリン酸緩衝液溶液などの製薬上許容されるキャリアに、製薬処方物で用いられる他の非毒性適合性物質とともに懸濁することができる。好ましくはＰＳ保有体は、生理的に食塩水などの生体適合性液体中の懸濁液に構成され、免疫系に導入する適当な経路、例えば、動脈内、静脈内、又は最も好ましくは筋肉内又は皮下で、患者に投与される。
【００３２】
ＰＳ保有体は、凍結乾燥され、後に、投与のために再懸濁することが意図される。本発明は、また、凍結乾燥されたＰＳ保有体と、生理滅菌食塩水、滅菌水、パイロジェンフリーの水、等張食塩水、リン酸緩衝液溶液などの製薬上許容されるキャリア、並びに製薬処方物に用いられる他の非毒性適合性物質を含むパーツのキットにも関する。
【００３３】
患者へＰＳ保有体を投与する好ましい方法は、１週間から数ヶ月にわたって、毎日、１週間に数回、毎週又は毎月、患者へ接種する１クールである。投与の頻度と長さは、患者によって、処置される病状、重篤度によって、及び処置が予防、治療又は治癒を意図したものかによって、変わる可能性がある。その設計と最適化は、治療する医師の十分な技術範囲である。
【００３４】
投与されるＰＳ保有体の量は、治療が意図される哺乳類の疾患の性質によって、患者の同一性と特徴によって変わるであろう。ＰＳ体の有効量が、患者に毒性でなく、免疫系を圧倒するほど多くないことは重要である。ＰＳ保有体の懸濁液の動脈内、静脈内、皮下、又は筋肉内投与を用いるとき、各投与について、一般的に、全血液の相当容量に通常みられる白血球の数、又はそこから生じ得るアポトーシス小体の数の１０％−１０００％に相当する量のＰＳ保有体を含む約０．１−５０ｍｌの液体を投与することが好ましい。一般的に、ヒトの患者への送達当たり投与されるＰＳ保有体の数は、約５００から約５００，０００，０００（＜５０ｎｇ脂質）、より好ましくは約１０，０００から約１０，０００，０００、最も好ましくは約２００，０００から約２，０００，０００の範囲である。
【００３５】
本発明の方法において、ＰＳ保有体が免疫改変剤として、ワクチンの性質で、作用するので、各投与について接種部位に投与されるそのような体の数は、患者の体重の単位当たりのＰＳ保有体の数又は重量に比べて、より重要な量である。同じ理由により、小さな動物で使用されるために有効な量又は数のＰＳ保有体は、体重比ベースでより大きな哺乳類の有効量を直接意味するものではない。
【００３６】
本発明の範囲が、実施の態様の特定の理論により制限されることを意図するものではないが、以下は、本発明を実施する手段のよりよい理解のために、仮の説明として提供される。患者の免疫系の抗原提示細胞、特にマクロファージや樹状細胞を含む専門の抗原提示細胞（ＡＰＣ）が、それらがアポトーシス細胞、アポトーシスソ油体を取り込むのと同様にして、ＰＳ保有体を取り込むと仮定する。ＰＳ保有体を取り込むと、ＡＰＣは、Ｔｈ細胞集団で変化を促進する抗炎症反応を誘導し、Ｔｈ２細胞及び／又は他の制御／抗炎症性細胞集団（Ｔｒ１細胞）の量を増加し、Ｔｈ１細胞を減少させる。Ｔｈ２細胞と他の制御細胞は、インターロイキン−１０などの抗炎症性サイトカインを分泌し、炎症を減少させる。
【００３７】
本発明は、Ｔ細胞機能、炎症、内皮機能不全、及び不適当なサイトカイン発現を含む、広範囲の哺乳類疾患の予防及び／又は治療における使用を示す。疾患を有する、又は疾患が疑われる患者が、治療のために選択され得る。「治療」は、症状の軽減を意味し、例えば特定の疾患の重篤度の軽減又は症状の数の軽減、又は症状のさらなる進行の制限を含むが、これらに限定されない。
【００３８】
Ｔ細胞機能（Ｔ細胞媒介）疾患に関して、これらは自己免疫疾患でもよく、例えば、糖尿病、強皮症、乾癬、慢性関節リウマチを含むがこれらに限定されない。
【００３９】
本発明は、炎症性アレルギー反応、臓器及び細胞移植反応疾患、炎症反応を生じる細菌感染での使用を意図している。酸化的ストレス及び／又は虚血性再灌流障害、毒物摂取、毒性の化学品にさらされること、放射ダメージ、空中浮遊又は水中浮遊刺激物質にさらされることなどに対する予防における使用、炎症にダメージをあたえることも意図している。腎臓、肝臓、心臓などの内部臓器の炎症性、アレルギー性、Ｔ細胞媒介疾患も示される。
【００４０】
本発明によって示される不適当なサイトカイン発現を含む疾患に関して、これらは神経変性疾患を含む。神経変性疾患は、ダウン症候群、アルツハイマー病及びパーキンソン病を含み、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）を含むある種のサイトカインのレベルの増加に関連している（Ｇｒｉｆｆｉｎ ＷＳＴら（１９８９）；Ｍｏｇｉ Ｍ．ら（１９９６）参照）。ＩＬ−１βが海馬において長期的増強を阻害することも示されている（Ｍｕｒｒａｙ，Ｃ．Ａ．ら（１９９８））。海馬での長期的増強は、シナプス形成性の形態であり、一般的に、記憶と学習のための適当なモデルであると考慮されている（Ｂｌｉｓｓ，Ｔ．Ｖ．Ｐ．ら（１９９３））。かくして、脳内での不適当なサイトカイン発現は、現在、神経変性疾患の発展と進行に関与すると考えられている。
【００４１】
かくして、本発明は、ダウン症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、老人性痴呆症、うつ病、多発性硬化症、ハンチントン病、末梢神経障害、脊髄病、神経障害性関節病、慢性炎症性脱髄性疾患、単神経障害、多発性神経障害、対称性遠位性感覚神経障害、神経筋接合部障害、筋無力症及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの神経障害を含む、広範囲の哺乳類の神経変性と他の神経性疾患の治療と予防について、示されている。
【００４２】
本発明は、内皮機能不全を含む疾患に関して、広範囲のそのような哺乳類疾患の治療及び予防について示されており、心臓血管病、例えばアテローム硬化症、末梢動脈又は動脈閉塞性疾患、うっ血性心不全、脳血管疾患（発作）、心筋梗塞、アンギナ、高血圧症など、血管痙攣性疾患、例えば、レーノー病、心臓シンドロームＸ、片頭痛など、虚血から生じる損傷（虚血性損傷又は虚血性再灌流損傷）を含むが、それらに限定されない。要するに、実質的に、不適当な機能の内皮から生じるあらゆる疾患であり得る。
【００４３】
【実施例】
実施例１−５
これらの実施例は、種々のサイズと組成の、種々の濃度での、ネズミ接触過敏症（ＣＨＳ）モデル、Ｔｈ１媒介炎症反応の技術的に承認されたモデルでの耳膨張における、種々のホスファチジルセリン含有リポソームの接種の効果を示す。これらの実験について、６−８週齢で体重が２２−２５ｇの雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた。
【００４４】
実施例１
ＰＳリポソーム
１００±２０ナノメーターのサイズの、ホスファチジルセリン（ＰＳ）含有リポソームを上述のごとく調製した。これはホスファチジルセリン含有量は１００％であった（完全にＰＳからなる）。１ｍｌ当たり４．８×１０^１４リポソームを含むリポソームのストック懸濁液を、ＰＢＳで希釈して、１ｍｌ当たり６×１０^６粒子を含む接種懸濁液を得、各動物に、この懸濁液を５０μｌ（３×１０^５のリポソームを含む）接種した。
【００４５】
プロトコール
リポソームを受け取った試験群Ａは２５匹の動物からなる。対照群は２４匹の動物からなる。下記の実験を行なった。
【００４６】
【表１】

【００４７】
１−６日目に、Ａ群のマウスに、１００％ＰＳから調製されたリポソームを接種した。リポソームは、筋肉内（ＩＭ）接種で５０μｌの容量で、すなわち、接種当たり、３００，０００リポソーム、試験期間全体にわたる投与合計量１，８００，００リポソームを接種した。対照群のマウスは、リポソームを受けていないが、後述の如くＡ群と同様に感作し、負荷を課し、試験した。
【００４８】
感作
１日目に、当日リポソーム接種を受けた後に、５ｍｇ／ｍｌのペントバルビタールナトリウムの０．２ｍｌの腹膜内（ＩＰ）接種を用いてマウスを麻痺させた。マウスの腹部の皮膚に７０％ＥＴＯＨをスプレーした。刃を用いて、その腹部から直径約１インチの毛を除いた。露出した領域に、ピペットチップを用いて、４：１のアセトン：オリーブオイル中の２５μｌの０．５％の２，４−ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）を塗布した。
【００４９】
負荷
６日目に、当日リポソーム接種をした後、以下のようにして、マウスにＤＮＦＢの負荷を課した。１０μｌの０．２％ＤＮＦＢを右の耳の背表面に、ピペットチップで塗布し、１０μｌのビヒクルをピペットチップで左の耳に塗布した。
【００５０】
結果
７日目に、負荷の２４時間後、各動物を、ハロタンで麻痺させ、耳の厚み（ミクロンで）を、Ｐｅａｃｏｃｋバネ負荷ミクロメーターを用いて測定した。耳の膨張の増加をＣＨＳ反応の尺度として用いる。データは、（処理された右耳の厚み）−（ビシクル処理された左耳の厚み）の差異として表される。２つの実験群の間の差異の有意性を、両側スチュ−デントｔテストにより検定する。ｐ＜０．０５の値は有意と考えられる。結果を下記に示し、添付の図１にもグラフで、ミクロンでの耳膨張を棒グラフで示す。
【００５１】
【表２】

【００５２】
実施例２
サイズが１００±２０ナノメーターで、異なる量のホスファチジルセリン（すなわち９０％、７５％、５０％）と残余のホスファチジルコリン（ＰＣ）を含むのリポソームを、各リン脂質を適当な相対量で混合した出発混合物から上述のごとく調製した。４つの異なる動物群を用いて、群当たり５匹のマウスに、下記の実験を行なった。
【００５３】
【表３】

【００５４】
接種の量と手順、感作の手順、付加の手順及び結果の測定はすべて実施例１に記載したものと同様にした。結果を下記の表２に示し、図２にグラフで示す。リポソーム中、約７５重量％のＰＳ濃度が、明らかに最適であることを示す。
【００５５】
【表４】

【００５６】
実施例３
再び、上述のＣＨＳネズミモデルを用いて、サイズが１００±２０ナノメーターで、７５％のＰＳと２５％のＰＣを含むリポソームを、異なる投薬量、すなわち各５０μｌ接種中のリポソームを異なる数とした以外は、同じプロトコールに従って、マウスの群に接種した。動物の各群についてｍｌ当たりのリポソームの数と、同じテストと測定手順を用いて得られる結果は下記の通りであった。
【００５７】
Ｅ群−１０^１０（１０匹の動物）
平均の正味耳膨張１１．１０；ＳＤ２．５６；ＳＥ０．８１；
対照の％　８６；　減少の％　１４；
対照に対するｐ　０．０５２
Ｆ群−１０^８（１５匹の動物）
平均の正味耳膨張８．９３；ＳＤ２．４９；ＳＥ０．６４；
対照の％　６８；　減少の％　３２；
対照に対するｐ　＜０．０００１
Ｇ群−１０^７（５匹の動物）
平均の正味耳膨張６．２０；ＳＤ１．９２；ＳＥ０．８６；
対照の％　４８；　減少の％　５２；
対照に対するｐ　＜０．０００１
Ｈ群−１０^６（１５匹の動物）
平均の正味耳膨張５．１３；ＳＤ２．１７；ＳＥ０．５６；
対照の％　４０；　減少の％　６０；
対照に対するｐ　＜０．０００１
Ｊ群−１０^５（５匹の動物）
平均の正味耳膨張７．６０；ＳＤ１．５２；ＳＥ０．６８；
対照の％　５９；　減少の％　４１；
対照に対するｐ　＜０．０００１
Ｋ群−１０^４（１０匹の動物）
平均の正味耳膨張１０．０；ＳＤ１．０５；ＳＥ０．３３；
対照の％　７８；　減少の％　２２；
対照に対するｐ　０．０００１２８
【００５８】
これらの結果を図３においてグラフで示す。
【００５９】
実施例４
種々のサイズの１００％ＰＳのリポソームを調製し、実施例１に記載したプロトコールに従って、マウスの群に接種した。接種の容量、接種当たりのリポソームの数、手順及び測定は、実施例１に記載したように行なった。
得られた結果は下記の通りであった。
【００６０】
【表５】

【００６１】
これらの結果を添付の図４にグラフで示す。リポソームは、かなり均一なサイズであり、平均サイズの範囲は±２０ｎｍである。
【００６２】
実施例５
表面にホスファチジルセリンＰＳを保有するように誘導体化されたアガロースビーズを、実施例１に記載したネズミ接触過敏症モデルにおいて、リポソームに代えて用いた。アガロースビーズは、平均粒子サイズが４５−１６５ミクロンで一般的に球形のサイズであるという特徴を有していた（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， カタログ番号Ｐ３５７８）。対照として、ＰＳを含有しない同様のアガロースビーズを用いた（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， カタログ番号Ａ９０４５）。誘導体化と非誘導体化の両方のビーズは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から市販されている。
【００６３】
アガロースビーズは、ＰＢＳに懸濁し、実施例１に記載された手順とプロトコールにしたがって、各接種について、５０μｌ中３００，０００ビーズの投薬量で動物に接種した。耳膨張の測定は、上述の如く行なった。実験群と、対象群の各々において５匹の動物を用いた。
【００６４】
非誘導体化アガロースを受けた動物は、７．８μｍの実験結果として耳の厚みの平均の正味変化を示した（ＳＤ２．１７、ＳＥＭ０．９７）が、ＰＳ誘導体化ビーズを受けた動物について相当する数は、４．００（ＳＤ２．９２，ＳＥＭ１．３０，ｐ対アガロース０．０４７５０９）であり、そのリポソーム形態と同様に、本発明による、固体ビーズに結合したときのＰＳの有意な活性を示している。結果は図５にグラフで示す。
【００６５】
実施例６
脳の海馬は、アルツハイマー病などの認識機能不全に伴う変性条件で特に傷つき易い脳の領域として同定されている。認識機能の基礎にある細胞及び分子のメカニズムを研究するために、長期増強（ＬＴＰ）動物モデルを用いる。ＬＴＰは、学習と記憶についての生物的物質として提案されている、海馬形成でおこすシナプス形成性の形態である（Ｂｌｉｓｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３６１；３１−３９（１９９０））。インビボでラットのＬＴＰの電気生理学的記録と、その後の、記録の後に採集した海馬組織における生化学的変化の分析は、ＬＴＰの基礎にある細胞のできごとが、老化、ストレス、アルツハイマー病及び細菌感染などの神経炎症に関連する状態においてどのように変化し得るかの調査を可能にするモデルを提供する。
【００６６】
グラム陰性細菌の細胞壁の成分であるリポ多糖（ＬＰＳ）の全身投与は、ＩＬ−１βなどの前炎症性サイトカインの増加を誘導することにより、免疫系の活性化を引き起こす。ＬＰＳとＩＬ−１βにより誘導される神経欠損の一例は、海馬における長期増強（ＬＴＰ）の欠損である。ＬＴＰを示すものは、集団の興奮性シナプス後電位（ｅｐｓｐ）平均勾配である。強直性刺激で、ｅｐｓｐ勾配（％）は、急に増加し、シナプス活性の増加を示すが、ＬＰＳで誘導されたＬＴＰの阻害は、この上昇を減少させ、及び／又はｅｐｓｐ勾配をより速くベースラインに戻し、増加されたシナプス活性が短命であることを示す。したがって、強直性刺激の後、間隔をおいて測定したｅｐｓｐ勾配（％）は、脳の海馬の炎症と同様に、炎症性刺激の後に、記憶とその損失を反映するために用いることができる。
【００６７】
プロトコール
ＬＴＰ：雄のウィスラーラット（ｃ．３００ｇ）の６つの群に、キャリアのみの食塩水又はＰＳ体（すなわち、食塩水キャリア中に１００％ＰＳ、サイズ１００±２０ナノメーター）を有する食塩水を筋肉内に接種した。１５０μｌの食塩水中の９×１０^５のリポソームを、ラットに−１４日目、−１３日目、−１日目に接種した。
【００６８】
０日目に、ラットをウレタン（１．５ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）で麻痺させ、ＬＰＳ（リポ多糖）（１００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）又は対照として食塩水を接種した。３時間後に、双極刺激電極と単極記録電極を、貫通路と、歯状回の背側の細胞体に各々、据え付けた。０．０３３Ｈｚ試験ショックを与え、ＬＰＳを誘導するための強直刺激の前１０分間と後４５分間、反応を記録した（３０秒の感覚で、２００ｍｓ、２５０Ｈｚ送達された刺激の３トレーン）。
【００６９】
ラットを断頭で殺し、海馬、強直化及び非強直化歯状回、皮質及び内側嗅皮質を氷上に切り離し、スライス状に切り刻み、１ｍｌ中の、１０％ＤＭＳＯ含有クレブス溶液で凍結した。
【００７０】
ＬＰＳで誘導化されたＬＴＰの阻害をブロックすることの有効性を、組織からの神経伝達物質放出の電気生理学的記録から評価した。強直前１０分間と後４０分間のｅｐｓｐ勾配（％）を追跡した。ＰＳリポソームでの前処置のクールとＬＰＳの接種の処置を受けた動物からの組織は、強直性刺激の４０から４５分後に５％未満のｅｐｓｐ勾配（％）の減少を示したが、ＰＳリポソーム前処理のクールなしで同様に接種した動物からの組織は、同じ期間で約２５％の減少を示した。これは明らかに、ＰＳリポソームでの上述の前処理が、神経保護効果を発揮していることを示している。このことを、強直性刺激から４０−４５分後に、ＬＳＰ接種、前処理動物組織（右手側）、ＬＰＳ接種で前処理無しの動物組織（左手側）のｅｐｓｐ（％）の棒グラフで図６に示す。＊＊は、各食塩水対照からの有意な差異を示す。＋＋は、ＬＰＳ接種で前処理なしの対照からの有意な差異を示す。
【００７１】
さらに、海馬におけるＩＬ−１β濃度を、周知の酵素免疫測定法で測定した。結果を、ＰＳリポソームで前処理されていない対照組織について（左手側）及び、上記の前処理を受けた組織について（右手側）、ｐｇ／ｍｇでのＩＬ−１βの棒グラフを図７に示す。影のついた棒は、ＬＰＳ接種を与えられた動物の組織、クリアな棒はそのような接種を受けていない組織からの結果を示す。前状態化されていない処理は、ＬＰＳ接種から通常おこる炎症性サイトカインＩＬ−１βの上方制御を有効に阻害することが明白である。
【００７２】
同様にして、海馬における反応性酸素種（ＲＯＳ）形成を調べた。ＲＯＳは、海馬から調製されたシナプトソームで、ＤＣＦＨ−ＤＡの酸化された蛍光産物であるＤＣＦを測定することにより評価した。ＲＯＳは、神経細胞を破壊することが知られている。これらの結果を、同様に図８に示すが、やはり、本発明の方法の神経保護効果を示している。
【００７３】
さらに、海馬における抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の濃度を測定した。ＩＬ−１０濃度は、酵素免疫測定法により測定し、対照からのパーセント差異として表した。これらの結果を図７と８と同様にして、図９に示す。それらは、本発明の前処理を受けていない動物からの組織において、ＬＰＳ接種が、食塩水接種と比べて、約３０％のＩＬ−１０含有量の減少をおこす（左側の棒）ことを示している。これに対して、上述のＰＳリポソームでの前処理のクールを受けた動物からの組織では、食塩水接種に比べてＬＰＳ接種はＩＬ−１０含有量の約４５％の増加を起こす（右側の棒）。
【００７４】
ＩＬ−１０とＩＬ−１β含有量についてのこれらの結果は、本発明の前処理の後の、海馬における有意な抗炎症効果を示す。
【００７５】
要するに、結果は、ＰＳ保有体が、ＬＰＳで誘導されるＬＴＰ阻害と神経炎症をブロックするために有効であることを示す。
【００７６】
上記で引用したすべての文献、特許、特許出願は、その全部がここに参照として取り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ネズミ接触過敏症（ＣＨＳ）モデルを用いた、対照と処理マウスの正味の耳膨張（ミクロン）を示す。
【図２】図２は、ＣＨＳモデルを用いて、リポソーム中のＰＳの量を変化させたＰＳリポソームて処理した処理マウスと、対照マウスにおける、正味耳膨張を示す。
【図３】図３は、ＣＨＳモデルを用いて、種々の数のリポソームで処理した処理マウスと、対照マウスにおける、正味耳膨張を示す。
【図４】図４は、ＣＨＳモデルを用いて、種々のサイズのＰＳ含有リポソームで処理した処理マウスと、対照マウスにおける、正味耳膨張を示す。
【図５】図５は、ＣＨＳモデルにおいて、その表面にＰＳを保有するように誘導体化されたアガロースビーズが投与された処理マウスと、対照マウスにおける、正味耳膨張を示す。
【図６】図６は、長期増強（ＬＴＰ）動物モデルを用いた、対照と処理ラットでの興奮性シナプス後電位（ｅｐｓｐ）勾配（％）を示す棒グラフである。
【図７】図７は、対照ラットと処理ラットの海馬におけるＩＬ−１βの濃度を示す。
【図８】図８は、対照ラットと処理ラットの海馬における反応性酸素種（ＲＯＳ）形成を示す。
【図９】図９は、対照ラットと処理ラットの海馬におけるＩＬ−１０の濃度を示す。

Claims (41)

1. 患者の免疫系を改変し、その結果、不適当なサイトカインの発現と関連する疾患又は内皮機能不全の症状を軽減及び／又は進行を遅らせるために、患者へ投与する医薬の調製における、投与単位当たり５００から５００，０００，０００の量のホスファチジルセリン（ＰＳ）保有体の使用。
2. ＰＳ保有体の量が、投与単位当たり、１０，０００から１０，０００，０００である請求項１記載の使用。
3. 投与のための前記ＰＳ保有体が、投与単位当たり０．１−５０ｍＬの容量で、生物に許容される流体に懸濁されている請求項１又は２記載の使用。
4. 前記ＰＳ保有体がリポソームである請求項１乃至３のいずれか一項記載の使用。
5. 前記リポソームが、約５０ナノメーター乃至約５００ミクロンの範囲の大きさの直径を有する請求項４記載の使用。
6. 前記リポソームが、約５０ナノメーター乃至約１０００ナノメーターの範囲の大きさを有する請求項４記載の使用。
7. 前記リポソームが５０乃至１００重量％の範囲のホスファチジルセリンと、残余のホスファチジルコリンから構成される請求項４乃至６のいずれか一項記載の使用。
8. 前記リポソームが、６５乃至９０重量％のＰＳを含む請求項４乃至７のいずれか一項記載の使用。
9. 前記保有体が、生体適合性粒子、顆粒、ミクロスフェア、又はビーズであり、そこに結合されたホスファチジルセリン表面を有する請求項１乃至３のいずれか一項記載の使用。
10. 前記保有体が、そこに結合されたＰＳ表面を有するアガロースビーズであり、５０ナノメーター乃至５００ミクロンのサイズを有する、請求項８記載の使用。
11. 前記疾患が、神経変性疾患である請求項１乃至１０のいずれか一項記載の使用。
12. 前記疾患が、Ｔ細胞媒介疾患である請求項１乃至１０のいずれか一項記載の使用。
13. 前記疾患が、内皮機能疾患である請求項１乃至１０のいずれか一項記載の使用。
14. 非毒性で、Ｔ細胞機能媒介疾患を治療するのに有効な量のＰＳ保有体を、哺乳類の患者へ投与することを含み、Ｔ細胞機能媒介疾患の進行が阻害される及び／又は疾患の症状が減少するものである、Ｔ細胞機能媒介疾患を治療するための方法。
15. 非毒性で、炎症性疾患を治療するのに有効な量のＰＳ保有体を、哺乳類の患者へ投与することを含み、炎症性疾患の進行が阻害される及び／又は疾患の症状が減少するものである、炎症性疾患の治療方法。
16. 非毒性で、内皮機能疾患を治療するのに有効な量のＰＳ保有体を、哺乳類の患者へ投与することを含み、内皮機能疾患の進行が阻害される及び／又は疾患の症状が減少するものである、内皮機能疾患の治療方法。
17. 非毒性で、不適当なサイトカイン発現を治療するのに有効な量のＰＳ保有体を、哺乳類の患者へ投与することを含み、疾患の進行が阻害される及び／又は減少するものである、不適当なサイトカイン発現を特徴とする免疫系疾患の治療方法。
18. 投与されるＰＳ保有体の量が３０ｍｇ／ｋｇ未満である請求項１４、１５、１６又は１７記載の方法。
19. 投与されるＰＳ保有体の量が、約５００乃至約５００，０００，０００体である請求項１８記載の方法。
20. 投与されるＰＳ保有体の量が、約１０，０００乃至約１０，０００，０００体である請求項１９記載の方法。
21. 投与されるＰＳ保有体の量が、約２００，０００乃至約２，０００，０００体である請求項２０記載の方法。
22. ＰＳ保有体が、約６５％を超えるＰＳを含む請求項１４、１５、１６又は１７記載の方法。
23. ＰＳ保有体が、約６５％乃至約９０％のＰＳを含む請求項１４、１５、１６又は１７記載の方法。
24. ＰＳ保有体が、約７０％乃至約８０％のＰＳを含む請求項１４、１５、１６又は１７記載の方法。
25. ＰＳ保有体が、約７５％のＰＳを含む請求項１４、１５、１６又は１７記載の方法。
26. 哺乳類患者に投与されるために製薬上許容される生体適合性合成又は半合成体と、製薬上許容されるキャリアを含む製薬組成物であって、その合成又は半合成体の少なくとも一部が、哺乳類アポトーシス小体に相当する配置とサイズを有し、その合成又は半合成体の表面は、修飾されて一以上のホスファチジルセリンレセプターに対する複数のリガンドを含み、その合成又は半合成体は、哺乳類患者に投与されると、抗原提示細胞上のホスファチジルセリンレセプターへ結合することが可能である、製薬組成物。
27. 前記製薬上許容される合成又は半合成体がリポソームである、請求項２６記載の製薬組成物。
28. 単位投与剤型を含む請求項２６記載の製薬組成物。
29. 製薬上のキャリアと、哺乳類患者に投与されるための生体適合性非リポソーム合成体を含む製薬組成物であって、非リポソーム生体適合性合成体が、哺乳類アポトーシス小体に相当する配置とサイズを有し、その製薬上許容される合成体の表面は、修飾されて一以上のホスファチジルセリンレセプターに対する複数のリガンドを含み、その生体適合性合成体は、哺乳類患者に投与されると、抗原提示細胞上のホスファチジルセリンレセプターへ結合することが可能である、製薬組成物。
30. 前記生体適合性非リポソーム合成体が、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、ポリビニルピロリドン、多糖類、ポリスチレン及びアガロースから選ばれる、請求項２９記載の製薬組成物。
31. 単位投与剤型を含む請求項２９記載の製薬組成物。
32. 前記の有効量のＰＳ保有体を患者に投与することを含む、哺乳類患者における疾患の症状を軽減する方法。
33. 前記疾患が、Ｔ細胞媒介疾患、炎症性疾患、内皮機能不全疾患又は不適当なサイトカイン発現疾患である請求項３２記載の方法。
34. 前記投与が、生体適合性液中のＰＳ保有体の懸濁液として、動脈内、静脈内、筋肉内、皮下で行なわれる、請求項３２又は３３記載の方法。
35. 哺乳類患者における症状を軽減する医薬の調製における、前記ＰＳ保有体の使用。
36. 哺乳類患者における症状の軽減における、前記ＰＳ保有体の使用。
37. 哺乳類細胞に類似した範囲から、哺乳類細胞のアポトーシスにより産生されるアポトーシス小体に類似した範囲の形及び寸法を有し、その表面上にホスファチジルセリン分子を有する三次元合成及び半合成体。
38. 膜外表面に結合されたホスファチジルセリン分子を有するリポソームの形態の、請求項３７記載の合成及び半合成体。
39. 凍結乾燥されたＰＳ保有体。
40. 請求項３９記載の凍結乾燥されたＰＳ保有体と製薬上許容されるキャリアを含むパーツのキット。
41. 前記製薬上許容されるキャリアが、生理滅菌食塩水、滅菌水、パイロジェンフリーの水、等張食塩水、リン酸緩衝液溶液から選ばれる請求項４０記載のキット。

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