JP2004508023A - 核酸合成の感度および特異性を増強するための化合物および方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、カチオン性およびポリカチオン性組成物ならびに核酸分子の合成を増強する方法に関する。好ましい局面では、本発明は、核酸合成、配列決定、または増幅の阻害または調節に関する。特に、本発明は、このような合成の増強用の二本鎖および／または一本鎖核酸分子および／または一本鎖／二本鎖核酸複合体（例えば、プライマー／鋳型複合体、二本鎖鋳型、一本鎖鋳型、または一本鎖プライマー）に親和性を有するカチオン性およびポリカチオン性の分子、化合物、ならびに組成物を開示する。本発明のカチオン性およびポリカチオン性の分子、化合物、ならびに組成物は、周囲温度で非特異的核酸合成を阻害することができる。したがって、好ましい局面では、本発明は、核酸分子の「ホットスタート」合成に関する。したがって、本発明は、低温（例えば、反応の設定時）での非特異的核酸合成を防止する。本発明はまた、１つまたはそれ以上の本発明のカチオン性およびポリカチオン性の分子、化合物、ならびに組成物を含む核酸分子の合成、増幅、逆転写、または配列決定用のキットに関する。本発明はまた、本発明の方法を行うために調製した組成物およびこのような方法の後または間に作製された組成物に関する。本発明はまた、一般に、種々の核酸分子の分解の阻害または防止に有用な組成物に関する。

Description

【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、例えば周囲温度で起こり得る非特異的核酸合成の減少による核酸合成の選択性および特異性を増大させる方法に関する。本発明はまた、本発明の方法を行うための組成物に関する。本発明の方法および組成物を、核酸配列決定、増幅反応、核酸合成、およびｃＤＮＡ合成に使用することができる。
【０００２】
本発明はまた、例えば、１つまたはそれ以上の二本鎖核酸分子および／または一本鎖核酸分子および／または二本鎖／一本鎖複合体との結合または複合体形成によって核酸合成、配列決定、増幅、およびｃＤＮＡ合成を阻害または防止することができるリガンド（特にカチオン性およびポリカチオン性の分子、化合物、ならびに組成物）に関する。したがって、本発明は、このような反応で使用される核酸基質（例えば、プライマー、鋳型およびプライマー／鋳型複合体）との結合または相互作用によって核酸合成、配列決定、増幅、およびｃＤＮＡ合成反応を阻害または防止することができる。
【０００３】
本発明はまた、核酸合成中の核酸分子または核酸合成のための調製物の分解を阻害または防止することができるリガンド（特にカチオン性およびポリカチオン性の分子、化合物、ならびに組成物）に関する。リガンドは、核酸、好ましくは一本鎖分子または一本鎖含有分子と結合または相互作用することができる。このような相互作用は、好ましくは、ヌクレアーゼ、特にエキソヌクレアーゼ、具体的には一本鎖特異的エキソヌクレアーゼによる核酸分子の分解を防止または阻害する。本発明はまた、本発明のカチオン性およびポリカチオン性の分子、化合物、ならびにカチオン性組成物を含むキットに関する。
【０００４】
関連技術
ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型の全部または一部に相補的なＤＮＡ分子の形成を触媒する。プライマーの一本鎖ＤＮＡ鋳型とのハイブリッド形成の際、ポリメラーゼは５’から３’方向でのＤＮＡ合成を触媒し、続いてヌクレオチドを成長鎖の３’−水酸基に付加する。したがって、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）またはヌクレオチドおよびプライマーの存在下では、一本鎖ＤＮＡ鋳型の全部または一部に相補的な新規のＤＮＡ分子を合成することができる。
【０００５】
中温性および好熱性ＤＮＡポリメラーゼの両方を使用して、核酸形成を触媒する。ＰＣＲまたはサイクル配列決定では、あまりストリンジェントではない温度（例えば、周囲温度）での間違ってアニーリングされたプライマーの伸長に起因する非特異的ＤＮＡ増幅レベルが減少するために中温性よりもむしろ熱安定性ポリメラーゼが好ましい。しかし、いくつかのプライマー配列および一定の実験条件下で、有意な非特異的核酸産物合成量により、熱安定性ポリメラーゼの感度が低下し、各プライマーセットの伸長至適化が必要となる。さらに、周囲温度で高レベルの活性を有するポリメラーゼ（例えば、サーマトガ・ニアポリタナ（Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）由来のＤＮＡポリメラーゼ）を使用する場合、これはさらに問題となる。
【０００６】
生物、組織、または細胞の構造および生理学の実験では、しばしばその遺伝子含量を決定することが望ましい。生物の遺伝子フレームワークは、生物の体細胞および生殖細胞中に含まれるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中のヌクレオチド塩基の二本鎖配列にコードされる。特定のＤＮＡまたは遺伝子セグメントの遺伝子含有量は、遺伝子にコードされるタンパク質の産生時のみに発現する。タンパク質産生のために、ＤＮＡ二重らせんの１つの鎖（「コード」鎖）の相補コピーがポリメラーゼ酵素によって産生され、リボ核酸（ＲＮＡ）の特異的配列が得られる。この特定のＲＮＡ型は、タンパク質産生についてのＤＮＡからの遺伝子メッセージを含むので、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と呼ばれている。
【０００７】
所与の細胞、組織、または生物内で、それぞれ個別かつ特異的なタンパク質をコードする多数のｍＲＮＡ種が存在する。この事実は、組織または細胞中の遺伝子発現研究に興味を持つ研究者に強力なツールを提供する。ｍＲＮＡ分子を単離でき、種々の分子生物学的技術によってさらに操作し、それにより細胞、組織、または生物の完全な機能的遺伝子含量を解明可能である。
【０００８】
一般的な遺伝子発現研究アプローチは、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローンの産生である。この技術では、生物由来のｍＲＮＡ分子を生物の細胞または組織の抽出物から単離する。この単離は、しばしばチミジン（Ｔ）のオリゴマーが複合体形成したセルロースまたはアガロースなどのクロマトグラフィーマトリックスを使用する。ほとんどの真核生物ｍＲＮＡ分子上の３’末端は連続したアデノシン（Ａ）塩基を含み、ＡはＴに結合するので、ｍＲＮＡ分子を組織または細胞抽出物中の他の分子および基質から容易に精製することができる。これらの精製ｍＲＮＡ分子から、逆転写酵素（ＲＴ）またはＲＴ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用してｃＤＮＡコピーを作製することができ、一本鎖ｃＤＮＡ分子を生成させる。次いで、一本鎖ｃＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼの作用によってもとのｍＲＮＡ（および生物のゲノムに含まれるこのｍＲＮＡをコードするもとの二本鎖ＤＮＡ配列）の完全な二本鎖ＤＮＡコピー（すなわち、二本鎖ｃＤＮＡ）に変換することができる。次いで、タンパク質特異的二本鎖ｃＤＮＡをベクターに挿入することができ、その後、宿主細菌、酵母、動物、または植物細胞に導入される（形質転換またはトランスフェクションと呼ばれるプロセス）。次いで、宿主細胞を培地中で増殖させ、目的の遺伝子または目的の遺伝子の一部を含む（多くの場合、発現する）宿主細胞集団が得られる。
【０００９】
ｍＲＮＡの単離からベクター（例えば、プラスミド、ウイルスベクター、コスミドなど）へのｃＤＮＡの挿入、単離遺伝子または遺伝子部分を含む宿主細胞集団の成長までのこの完全なプロセスを、「ｃＤＮＡクローニング」という。ｃＤＮＡセットが供給源となる細胞、組織、または生物中に存在する機能的遺伝情報を含む遺伝子または遺伝子の一部の「集団」を示すので、多数の異なるｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製する場合、得られたｃＤＮＡセットを「ｃＤＮＡライブラリー」と呼ぶ。
【００１０】
ｃＤＮＡ分子の合成は、ｍＲＮＡ分子の３’末端または３’末端付近から開始され、５’から３’方向に進行し、成長鎖にヌクレオチドが連続的に付加される。オリゴ（ｄＴ）プライマーを使用したポリＡテールの３’末端でのｃＤＮＡ合成のプライミングは、ｍＲＮＡの３’メッセージを産生されたｃＤＮＡ分子中に示すことを確実にする。ｃＤＮＡ合成中に選択性および特異性を増大させる能力により、より代表的なｃＤＮＡライブラリーが得られ、これは、全長ｃＤＮＡ分子（例えば、全長遺伝子）を有するｃＤＮＡライブラリーの可能性を増大させることができる。このような進歩が、目的の全長遺伝子発見の可能性を非常に高めると思われる。
【００１１】
したがって、ポリメラーゼおよび逆転写酵素の核酸分子を合成する能力を改良する方法が必要である。このような進歩が、核酸合成、配列決定、増幅、およびｃＤＮＡ合成の改良すると思われる。
【００１２】
発明の概要
本発明は、上記の要求を満たす。本発明は、所定の条件下（好ましくは周囲温度）での核酸合成および／または分解の阻害、減少、実質的減少、または消失のための方法を提供する。好ましい局面では、本発明は、反応設定中、好ましくは核酸合成の至適反応条件が達成される前の核酸合成および分解（特に、鋳型およびプライマー分解）を防止または阻害する。したがって、本発明により、核酸合成中に使用されるかその間に存在するポリメラーゼおよび／またはヌクレアーゼを阻害可能である。最適下限条件または反応設定中のＤＮＡポリメラーゼ活性のこのような阻害により、非特異的核酸合成が防止または減少する。一旦反応設定が完了して、至適条件に達すると、核酸合成を開始することができる。さらに、本発明は、核酸合成基質および産物の分解を防止するので、合成開始後に、より有効に核酸合成を行うことができる。
【００１３】
より詳細には、本発明は、任意の核酸分子（一本鎖または二本鎖核酸または二本鎖／一本鎖複合体を含む核酸分子を含む二本鎖など）に結合するか相互作用する任意の１つまたはそれ以上のリガンド（特にカチオン性もしくはポリカチオン性の分子、化合物、または組成物）の導入による核酸合成の調節に関する。このような二本鎖核酸分子は一本鎖領域（好ましくは一方または両方の末端）を含むか、相補核酸鎖と対合した塩基ではない配列またはヌクレオチドを含むか、完全に二本鎖であり得る。したがって、このようなカチオン性もしくはポリカチオン性の分子、化合物、または組成物は、このような二本鎖核酸分子（例えば、プライマー／鋳型複合体または二本鎖鋳型などの二本鎖基質）と結合するか相互作用することができ、活性ポリメラーゼまたは逆転写酵素の核酸合成基質（プライマー／鋳型複合体など）との結合または相互作用の防止により核酸合成を妨害する。
【００１４】
別の局面では、本発明は、核酸、特に二本鎖、一本鎖、または一本鎖含有核酸に結合する任意の１つまたはそれ以上のリガンド（特にカチオン性およびポリカチオン性の分子、化合物、ならびに組成物）の導入による核酸合成の調節に関する。したがって、このようなカチオン性もしくはポリカチオン性の分子、化合物、または組成物は、核酸分子（例えば、一本鎖プライマーまたは一本鎖鋳型または二本鎖分子などの核酸合成基質）に結合するか相互作用し、例えば、核酸合成基質（合成反応でポリメラーゼまたは逆転写酵素によって使用されるプライマー／鋳型複合体を形成するための鋳型とプライマーなど）の結合、相互作用、またはハイブリッド形成の防止によって核酸合成を妨害する。
【００１５】
さらに、本発明のリガンド（特にカチオン性およびポリカチオン性の分子、化合物、ならびに組成物）の核酸分子（特に、一本鎖核酸（例えば、プライマーおよび鋳型などの一本鎖基質））との相互作用により、存在し得るヌクレアーゼ（エキソヌクレアーゼなど）によるこのような分子の分解を防止する。したがって、本発明のカチオン性およびポリカチオン性の分子、化合物、ならびに組成物は、核酸合成、増幅、および配列決定反応において使用される基質の分解を防止するが、このような反応によって産生された産物の分解も防止する。例えば、核酸合成、増幅、および配列決定反応において使用される多数のポリメラーゼは、一本鎖核酸基質または産物を分解することができるエキソヌクレアーゼ活性（例えば、ＤＮＡポリメラーゼの３’から５’、および５’→３’エキソヌクレアーゼ活性）を有し、核酸合成反応効率に悪影響を及ぼす。さらに、合成、増幅、および配列決定で使用される反応混合物は、反応混合物中の核酸基質または産物を分解し得る添加したヌクレアーゼ（特定の目的または機能のために反応混合物に添加することができる）または夾雑ヌクレアーゼ（例えば、ＲＮアーゼ、ＤＮアーゼ、およびエキソヌクレアーゼ、特に、一本鎖エキソヌクレアーゼ）を含み得る。本発明のカチオン性およびポリカチオン性の分子、化合物、または組成物を含めることにより、核酸合成、増幅、または配列決定の前、間、または後の核酸分子または基質の分解を防止または阻害可能である。
【００１６】
したがって、本発明は核酸分子と結合（好ましくは非カチオン性結合による）または相互作用し、好ましくはリガンド／核酸複合体を形成するリガンドに関する。本発明の核酸リガンド（「阻害リガンド」または「核酸リガンド」と呼ぶことができる）は、任意の核酸分子（二本鎖核酸分子および／または一本鎖核酸分子および／または一本鎖／二本鎖核酸複合体（好ましくは、核酸構造が凝縮されている）など）と結合または相互作用するように電荷プロフィールを有する任意の分子または化合物（化学的化合物またはポリマーを含む）であり得る。好ましいリガンドには、天然および合成の化合物、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、脂質、リポタンパク質などが含まれる。一般に、本発明のリガンドには、任意のカチオン性もしくはポリカチオン性の分子、化合物、または組成物が含まれる。天然のカチオン性分子には、ヒストン、プロタミン、スペルミン、スペルミジン、および可動性の高い基を有するタンパク質が含まれる（Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ、１９８８、９５０、２２１〜２２８；Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９、２４３、３７５〜３７８；Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ、１９９１、８８、４２５５〜４２５９）。合成カチオン性分子には、有機分子またはポリマー（ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブレン、ポリリジン、ポリヒスチジン、カチオン性ポリペプチド、カチオン性コアを有する高分子など）（概要については、Ｃｏｔｔｅｎ，ＭおよびＷａｇｎｅｒ，Ｅ、１９９３、Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４、７０５〜７１０；Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．、４、３７２〜３７９を参照のこと）、両親媒性凝集物（Ｂｅｈｒ，Ｊ．Ｐ．、１９９４、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．、５、３８２〜３８９）、ポリアミドアミンカスケードポリマーまたはデンドリマー、リポポリアミン、およびポリエチレンイミン（Ｂｏｕｓｓｉｆら、１９９５、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ、９２、７２９７〜７３０１）が含まれる。ゴールドマン（Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｃ．Ｋ．）ら、１９９７（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１５、４６２〜４６６）に記載のグルコース骨格を有する非脂質、非ペプチドポリカチオン性ポリマー、合成ポリアミノポリマーもまた含まれる。他の組成物には、カチオン性脂質またはカチオン性リポソーム製剤（「トランスフェクタム（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ）（商標）」（Ｐｒｏｍｅｇａ）、「ドータップ（ＤＯＴＡＰ）（商標）」（Ｒｏｃｈｅ）、「ヒュージーン（ＦＵＧＥＮＥ６）（商標）」（Ｒｏｃｈｅ）、「エックストリームジーン（Ｘ−ｔｒｅｍｅ　ＧＥＮＥ）Ｑ２（商標）」（Ｒｏｃｈｅ）、「ジーンジェイマー（ＧｅｎｅＪａｍｍｅｒ）（商標）」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、「ジーンポーター（ＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒ）（商標）」（Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）、「イフェクテン（Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ）（商標）」（Ｑｕｉａｇｅｎ）、「スーパーフェクト（Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ）（商標）」（Ｑｕｉａｇｅｎ）、「リポフェクチン（登録商標）」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、「リポフェクトエース（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ）（商標）」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、「リポフェクタミン（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ）（商標）」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、「リポフェクタミン　２０００（商標）」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、「セルフェクチン（ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ）（登録商標）」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、および「ディーエムリー（ＤＭＲＩＥ）−Ｃ（商標）」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ））、米国特許第４，８１２，４４９号、同第４，８９１，３５５号、同第５，１７１，６７８号、同第５，１８６，９２３号、同第５，２０８，０３６号、同第５，２６４，６１８号、同第５，２７７，８９７号、同第５，２７９，８３３号、同第５，２８３，１８５号、同第５，３３４，７６１号、同第４，８９７，３５５号、同第５，４５９，１２７号、同第５，５４５，４１２号、同第５，６５０，０９６号、同第５，６６７，７７４号、同第５，６７４，９０８号、同第５，７０５，３８５号、同第５，７１９，１３１号、同第５，７３６，３９２号、同第５，７４４，３３５号、同第５，７８３，５６５号、同第５，８３０，４３０号、同第５，８４０，７１０号、同第５，８５４，２２４号、同第５，８６９，６０６号、同第５，９０６，９２２号、同第５，９３５，９３６号、同第５，９４８，９２５号、同第５，９４８，７６７号、国際公開公報第９７／４２８１９号、国際公開公報第９８／０２１９０号、国際公開公報第９８／１７３７３号、国際公開公報第９８／１９７０９号、国際公開公報第９９／２９７１２号、国際公開公報第９８／４０４９９号、国際公開公報第９８／４０５０２号、国際公開公報第９８／４２８１９号、欧州特許第０３９４１１１号、同第０８４６６８０号、および仏国特許第１，５６７，２１４号に記載のその他の物質が含まれる。米国特許第５，８６１，３９７号は、両親媒性カチオン性脂質を記載しており、米国特許第５，６７０，３４７号は核酸と相互作用する合成ポリペプチドを記載している。一般に、ＤＮＡ凝縮剤およびトランスフェクション剤もまた、本発明により使用される。１つの局面では、本発明のリガンドは核酸分子ではなく、および／または核酸分子と結合することができる酵素ではない。
【００１７】
別の好ましい局面では、本発明のリガンド（例えば、カチオン性またはポリカチオン性分子、化合物）および組成物は、一定の条件下で１つまたはそれ以上の核酸分子（特に、１つまたはそれ以上の核酸合成基質）と結合（好ましくは、非共有結合による）または複合体を形成することができ、条件が変わると核酸から解離する。条件には、混合物の種々の温度、イオン強度、およびｐＨが含まれる。したがって、カチオン性またはポリカチオン性の分子、化合物、および組成物を、好ましくは、基質（例えば、プライマー／鋳型複合体、二本鎖分子および／またはプライマーおよび一本鎖鋳型などの一本鎖分子）と結合または相互作用する反応混合物に導入し、それにより特定の反応条件下でポリメラーゼまたは逆転写酵素活性を有する１つまたはそれ以上の酵素の存在下で核酸合成を阻害する。本発明のカチオン性またはポリカチオン性の分子、化合物、および組成物はまた、反応混合物の合成産物および／または基質と相互作用または結合する能力を有し、それにより反応混合物中に存在し得るヌクレアーゼで産物または基質の分解が防止されて、核酸合成産物が増加する。
【００１８】
したがって、好ましい局面では、本発明の１つまたはそれ以上のカチオン性またはポリカチオン性の分子、化合物、および組成物は、１つまたはそれ以上の核酸基質と結合することができ、一定条件下でこのような基質（例えば、一本鎖鋳型および一本鎖プライマー）で合成を防止することができる。このような合成は、例えば、核酸の活性ポリメラーゼ／逆転写酵素との相互作用の防止および／または核酸分子の相互作用（プライマー／鋳型複合体を形成するためのハイブリッド形成など）の防止によって防止される。このようなカチオン性またはポリカチオン性の分子、化合物、および組成物はまた、このような分子と結合して好ましくはヌクレアーゼ作用に接近不可能であるため反応における核酸分子の分解を防止する。したがって、このようなカチオン性またはポリカチオン性の分子、化合物、および組成物を、好ましくは、このような核酸分子と競合的に結合または相互作用する反応混合物に導入して、それによりポリメラーゼおよび／またはヌクレアーゼ活性を有する１つまたはそれ以上の酵素の存在下で核酸合成および／または核酸分解を阻害する。
【００１９】
本発明のリガンド（例えば、カチオン性またはポリカチオン性の分子、化合物、および組成物）による核酸合成または相互作用／結合の阻害を、好ましくは、消失または減少させて、反応条件が変化した場合（例えば、温度が上昇した場合）に核酸合成を進行させることができる。好ましい局面では、条件変化によりカチオン性またはポリカチオン性分子の二本鎖核酸基質および／または一本鎖核酸基質および／または一本鎖／二本鎖複合体と相互作用する能力に影響を与え、基質の放出し（例えば、基質からのカチオン性／ポリカチオン性分子の解離）および／またはポリメラーゼ／逆転写酵素活性を有する酵素の基質として利用可能な核酸分子を作製し、それにより核酸合成を進行可能なカチオン性またはポリカチオン性分子を変性または不活化させる。
【００２０】
従って、本発明は、（ａ）１つまたはそれ以上の核酸鋳型（ｃＤＮＡ分子などのＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子でもよい）と１つまたはそれ以上の二本鎖および／または一本鎖核酸基質および／または一本鎖／二本鎖／二本鎖複合体（例えば、鋳型、鋳型／プライマー複合体および／またはプライマーなどの核酸合成基質）と結合または相互作用することができる本発明の１つまたはそれ以上のプライマーおよび１つまたはそれ以上のリガンド（例えば、カチオン性またはポリカチオン性の分子、化合物、および組成物）とを混合する工程と、（ｂ）この混合物を前記鋳型の全部または一部に相補的な１つまたはそれ以上の第１の核酸分子の合成に十分な条件下で核酸ポリメラーゼ活性および／またはヌクレアーゼ活性（例えば、ＤＮＡポリメラーゼおよび／または逆転写酵素および／またはエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼなどのヌクレアーゼ）を有する１つまたはそれ以上の酵素の存在下でインキュベートする工程とを含む、１つまたはそれ以上の核酸の合成法に関する。このような混合を、好ましくは、核酸合成を防止し、および／または本発明のリガンド（例えば、カチオン性またはポリカチオン性の分子、化合物、および組成物）の１つまたはそれ以上の核酸合成基質への結合を可能にする条件下で行う。好ましい局面では、合成条件は、核酸からリガンドを解離するか本発明のリガンドを変性させて前記リガンドの核酸合成基質への結合を阻害、減少、実質的に減少、または消失するのに十分である。本発明の１つの態様では、一旦このような会合のためのインキュベーション条件が再確立されると、カチオン性／ポリカチオン性の分子または化合物（すなわち、脂質またはリポソーム製剤）は、核酸結合能力を復元または回復することができる。このようなインキュベーション条件は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドおよび１つまたはそれ以上の核酸合成緩衝液の使用を含み得る。したがって、本発明の好ましいリガンド（例えば、カチオン性／ポリカチオン性の分子または化合物）は、使用条件に依存して核酸分子に可逆的に会合／解離する。したがって、反応中にさらなるカチオン性／ポリカチオン性化合物を添加することなくインキュベーション条件の変化によっていくつかの合成サイクルが起こり得る。例えば、増幅中（例えば、ＰＣＲ）での異なる条件での反応サイクルにより、カチオン性／ポリカチオン性分子が不活化されないので、一旦このような相互作用が可能な条件に達すると、このような分子は核酸合成基質および合成産物と結合または会合することができる。好ましくは、本発明のカチオン性／ポリカチオン性分子の解離および／またはカチオン性／ポリカチオン性分子の核酸合成基質への結合の阻害に十分な温度であるが、ポリメラーゼおよび／または逆転写酵素または核酸合成反応で存在し且つ必要な他の酵素の不活化に不十分な温度でインキュベーション条件が達成される。本発明のこのような方法は、選択的に１つまたはそれ以上のさらなる工程（第１の核酸分子の全部または一部に相補的な１つまたはそれ以上の第２の核酸分子の作製に十分な条件下で合成された第１の核酸分子をインキュベートするなどの工程）を含み得る。このようなさらなる工程を、上記の本発明のリガンド（例えば、カチオン性／ポリカチオン性分子）の存在下で行うこともできる。本発明はまた、この方法で合成された核酸分子に関する。
【００２１】
本発明の方法を使用して、合成核酸分子を、リガンド／核酸混合物または複合体（例えば、核酸／カチオン性またはポリカチオン性複合体）が有利な他のアッセイ法または手順（宿主または宿主細胞への核酸の導入など）または核酸／カチオン性またはポリカチオン性化合物がアッセイ法の最終目的に劇的に影響を与えないアッセイ法または手順で直接使用することができる。したがって、より詳細には、本発明は、（ａ）本発明のリガンド（特に、カチオン性またはポリカチオン性分子またはトランスフェクション剤）の存在下で１つまたはそれ以上の核酸分子を合成する工程と、（ｂ）本発明の該リガンドの存在下で１つまたはそれ以上の宿主または宿主細胞に合成した核酸分子を導入する工程とを含む、１つまたはそれ以上の宿主または宿主細胞への核酸分子の導入に関する。
【００２２】
より具体的には、本発明は、（ａ）該第１のプライマーが該ＤＮＡ分子の第１の鎖の３’末端または３’末端付近の配列に相補的であり、前記第２のプライマーが前記ＤＮＡ分子の第２の鎖の３’末端または３’末端付近の配列に相補的である、第１および第２のプライマーおよび１つまたはそれ以上の本発明のリガンド（例えば、カチオン性またはポリカチオン性の分子、化合物、および組成物）（例えば、二本鎖核酸および／または一本鎖核酸および／または一本鎖／二本鎖複合体に親和性を有する分子）を混合する工程と、（ｂ）該第１のプライマーを該第１の鎖に、該第２のプライマーを該第２の鎖にハイブリッド形成させる工程と、（ｃ）該第１の鎖の全部または一部に相補的な第３のＤＮＡ分子および前記第２の鎖の全部または一部に相補的な第４のＤＮＡ分子が合成されるような条件下で混合物をインキュベートする工程と、（ｄ）前記第１および第３の鎖および該第２および第４の鎖を変性する工程と、（ｅ）工程（ａ）から（ｃ）または（ｄ）を１回以上繰り返す工程とを含む、ＤＮＡ分子の増幅法に関する。このような混合を、好ましくは、核酸合成を妨げ、および／または本発明のカチオン性もしくはポリカチオン性の分子、化合物、または組成物を１つまたはそれ以上の核酸合成基質に結合させる条件下で行う。好ましい局面では、合成条件は、本発明のカチオン性もしくはポリカチオン性の分子、化合物、または組成物を解離もしくは変性、または減少させて、カチオン性もしくはポリカチオン性の分子、化合物、または組成物の核酸合成基質への結合を阻害、減少、実質的に減少、または消失するのに十分である。好ましくは、インキュベーション条件は本発明のカチオン性もしくはポリカチオン性の分子、化合物、または組成物の解離および／または核酸合成基質に対するカチオン性もしくはポリカチオン性の分子、化合物、または組成物の核酸合成基質への結合の防止に十分な温度であるが、ポリメラーゼおよび／または逆転写酵素もしくは核酸合成反応で存在し且つ必要な酵素の変性または不活化に不十分な温度でインキュベーション条件が達成される。このようなインキュベーション条件には、１つまたはそれ以上のポリメラーゼ、１つまたはそれ以上のヌクレオチド、および／または１つまたはそれ以上の緩衝塩の存在下でのインキュベーションを含み得る。本発明はまた、これらの方法によって増幅された核酸分子に関する。本発明の方法によって作製されたこのような増幅核酸分子を、さらに操作または処理することもできる（１つまたはそれ以上の宿主または宿主細胞への増幅核酸分子の導入を含む）。したがって、本発明は、特に、（ａ）１つまたはそれ以上の本発明のリガンド（例えば、カチオン性もしくはポリカチオン性の分子、化合物、または組成物）の存在下で１つまたはそれ以上の核酸分子を増幅させる工程と、（ｂ）前記増幅核酸分子を少なくとも１つの前記リガンドの存在下で１つまたはそれ以上の宿主または宿主細胞に導入する工程とを含む、１つまたはそれ以上の宿主または宿主細胞への核酸分子の導入に関する。
【００２３】
本発明はまた、（ａ）配列決定すべき核酸分子を１つまたはそれ以上のプライマー、１つまたはそれ以上の本発明のリガンド（カチオン性もしくはポリカチオン性の分子、化合物、または組成物）、１つまたはそれ以上のヌクレオチド、および１つまたはそれ以上の終止剤と混合して混合物を形成する工程と、（ｂ）混合物を配列決定すべき分子の全部または一部に相補的な分子集団の合成に十分な条件下でインキュベートする工程と、（ｃ）集団を分離して配列決定すべき分子の全部または一部のヌクレオチド配列を決定する工程を含む、核酸分子の配列決定法に関する。さらに詳細には、本発明は、（ａ）本発明のカチオン性もしくはポリカチオン性の分子、化合物、または組成物（二本鎖核酸および／または一本鎖核酸および／または一本鎖／二本鎖複合体に親和性を有する）、１つまたはそれ以上のヌクレオチド、および１つまたはそれ以上の終止剤を混合する工程と、（ｂ）第１の核酸分子にプライマーをハイブリッド形成する工程と、（ｃ）該合成分子の長さが前記第１の分子よりも短く、該合成分析が３’末端にターミネーターヌクレオチドを含む、該第１の核酸分子に相補的な核酸分子の無作為な集団の合成に十分な条件下で工程（ｂ）の混合物をインキュベートする工程と、（ｄ）該第１の核酸分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部を配列決定することができるように該合成分子をサイズで分離する工程とを含む、核酸分子の配列決定法に関する。このような混合を、好ましくは、核酸合成を阻害し、および／または本発明のカチオン性もしくはポリカチオン性の分子、化合物、または組成物を１つまたはそれ以上の核酸合成基質に結合する条件下で行う。好ましい局面では、合成条件および／またはハイブリッド形成条件は、本発明のカチオン性もしくはポリカチオン性の分子、化合物、または組成物を解離または変性させて、カチオン性もしくはポリカチオン性の分子、化合物、または組成物の核酸合成基質への結合を阻害、減少、実質的に減少、または消失するのに十分である。好ましくはインキュベーション条件は、本発明のカチオン性／ポリカチオン性分子の解離または減少および／またはカチオン性／ポリカチオン性分子の核酸合成基質への結合の防止に十分な温度であるが、ポリメラーゼおよび／または逆転写酵素または核酸合成反応で存在し且つ必要な他の酵素の不活化に不十分な温度でインキュベーション条件が達成される。このようなターミネーターヌクレオチドには、ｄｄＮＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、もしくはｄｄＣＴＰ、またはその修飾誘導体が含まれる。このようなインキュベーション条件には、１つまたはそれ以上のポリメラーゼおよび／または緩衝塩の存在下でのインキュベーションを含み得る。
【００２４】
本発明はまた、一般に、核酸合成反応における核酸分子分解の防止または阻害法に関する。好ましくは、このような方法を、核酸合成、ｃＤＮＡ合成、増幅、または配列決定中に行う。特に、本方法は、（ａ）１つまたはそれ以上の本発明のリガンド（例えば、カチオン性／ポリカチオン性分子）を得る工程と、（ｂ）１つまたはそれ以上のヌクレアーゼ活性を有するヌクレアーゼによる前記核酸分子の分解の防止または阻害に十分な条件下で該本発明のリガンドを１つまたはそれ以上の核酸分子に接触させる工程とを含み得る。本発明のカチオン性／ポリカチオン性分子は核酸分子に親和性を有するので、核酸分子と結合または相互作用することができる。したがって、本発明のカチオン性／ポリカチオン性分子は、核酸分子と結合することができ、したがって、ヌクレアーゼとこのような核酸分子との相互作用または結合を防止することができる。好ましい局面では、本発明の核酸分子保護法を、インビトロ反応、特に標準的な分子生物学的技術（核酸合成、増幅、配列決定、およびｃＤＮＡ合成など）で使用する反応中に行う。本発明の分解保護法は、本発明のカチオン性／ポリカチオン性分子を解離する工程、および／または特定の条件下（例えば、温度上昇、ｐＨの変化、または反応混合物のイオン強度の変化）で本発明のカチオン性／ポリカチオン性分子の核酸分子への結合を妨げる工程とをさらに含み得る。
【００２５】
本発明はまた、本発明のリガンド（例えば、カチオン性／ポリカチオン性分子）および本発明のリガンドを含む組成物ならびに本発明の方法によって産生された核酸分子、核酸分子を含むベクター（発現ベクターであり得る）、ならびにこれらの核酸分子またはベクターを含む宿主細胞に関する。本発明で使用されるリガンド（例えば、カチオン性／ポリカチオン性の分子、化合物、または組成物）を、既知の技術（例えば、米国特許第４，８１２，４４９号、同第５，１７１，６７８号、同第５，１８６，９２３号、同第５，２７７，８９７号、同第５，２０８，０３６号、同第５，２０８，０３６号、同第５，２６４，６１８号、同第５，２７９，８３３号、同第５，３３４，７６１号、同第４，８９７，３５５号、同第５，４５９，１２７号、同第５，６５０，０９６号、同第５，７４４，３３５号、同第５，８５４，２２４号、同第５，８６９，６０６号、同第５，９０６，９２２号、同第５，６７４，９０８号、および国際公開公報第９８／１９７０９号に記載の方法）によって産生することができる。米国特許第５，８６１，３９７号は、両親媒性カチオン性脂質の産生を記載しており、米国特許第５，６７０，３４７号は核酸と相互作用する合成ポリペプチドを記載している。
【００２６】
本発明はまた、１つまたはそれ以上の本発明のリガンド（例えば、カチオン性およびポリカチオン性の分子、化合物、または組成物）を含む１つまたはそれ以上の容器を含む、核酸分子の合成、配列決定、および増幅用のキットに関する。本発明のこれらのキットは、選択的に、１つまたはそれ以上のヌクレオチド、１つまたはそれ以上の鋳型、１つまたはそれ以上のポリメラーゼ（例えば、好熱性または中温性ＤＮＡポリメラーゼ）、および／または逆転写酵素、１つまたはそれ以上の適切な緩衝液、１つまたはそれ以上のプライマー、１つまたはそれ以上の終止剤（１つまたはそれ以上のジデオキシヌクレオチドなど）、および本発明の方法を実施するための説明書からなる群より選択される１つまたはそれ以上のさらなる成分を含み得る。本発明はまた、本発明に係る核酸分子の変性の一般的な防止または阻害法で使用するキットに関する。このようなキットは、１つまたはそれ以上の本発明のリガンド（例えば、カチオン性もしくはポリカチオン性の分子、化合物、または組成物）を含む１つまたはそれ以上の容器を含み得る。これらのキットは、選択的に、１つまたはそれ以上のヌクレオチド、１つまたはそれ以上の鋳型、１つまたはそれ以上のポリメラーゼ（例えば、好熱性または中温性ＤＮＡポリメラーゼ）、および／または逆転写酵素、１つまたはそれ以上のヌクレアーゼ、１つまたはそれ以上の適切な緩衝液、１つまたはそれ以上のプライマー、１つまたはそれ以上の終止剤、および本発明の方法の実行のための装置からなる群より選択される１つまたはそれ以上のさらなる成分を含み得る。
【００２７】
本発明はまた、核酸分子の合成、配列決定、および増幅用の組成物およびこのような合成、配列決定、および増幅反応の実施用に作製された組成物に関する。本発明はまた、本発明の合成、配列決定、および増幅反応の実施中または実施後に作製される組成物に関する。本発明のこのような組成物は、１つまたはそれ以上の本発明のリガンド（例えば、阻害カチオン性／ポリカチオン性分子）を含むことができ、１つまたはそれ以上のヌクレオチド、１つまたはそれ以上のプライマー、１つまたはそれ以上の鋳型、１つまたはそれ以上の逆転写酵素、１つまたはそれ以上のＤＮＡポリメラーゼ、１つまたはそれ以上の緩衝液、１つまたはそれ以上の緩衝液の塩、１つまたはそれ以上の本発明の方法によって作製された合成核酸分子からなる群より選択される１つまたはそれ以上の成分をさらに含むことができる。本発明はまた、核酸分子分解の阻害または防止の方法で使用するための組成物およびこのような方法の実施のために作製された組成物に関する。本発明はまた、核酸分子の分解に対するこのような保護法の実施中または実施後に作製される組成物に関する。本発明のこのような組成物は、１つまたはそれ以上の本発明のリガンド（例えば、阻害カチオン性／ポリカチオン性分子）を含むことができ、１つまたはそれ以上のヌクレオチド、１つまたはそれ以上のプライマー、１つまたはそれ以上の鋳型、１つまたはそれ以上の逆転写酵素、１つまたはそれ以上のポリメラーゼ（ＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素）、１つまたはそれ以上の緩衝液、１つまたはそれ以上の緩衝液の塩、および１つまたはそれ以上の核酸分子からなる群より選択される１つまたはそれ以上の成分をさらに含むことができる。
【００２８】
本発明の他の好ましい態様は、以下の図面および本発明の説明および特許請求の範囲に照らして、当業者に明白であると思われる。
【００２９】
発明の詳細な説明
定義
以下の説明では、組換えＤＮＡ技術で使用されている多数の用語を広く使用する。このような用語が与えられる範囲を含む明細書および特許請求の範囲についての明白で一貫した理解のために、以下の定義を提供する。
【００３０】
プライマー
本明細書中で使用される「プライマー」は、核酸分子の増幅または重合中にヌクレオチド単量体の共有結合によって伸長される一本鎖オリゴヌクレオチドまたはＤＮＡをいう。
【００３１】
鋳型
本明細書中で使用される、「鋳型」という用語は、増幅、合成、または配列決定すべき二本鎖または一本鎖核酸分子（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）をいう。二本鎖分子の場合、第１および第２の鎖の形成のためのその鎖の変性を、好ましくは、これらの分子を増幅、合成、または配列決定するか、二本鎖分子を鋳型として直接使用する前に行う。一本鎖鋳型については、鋳型の一部に相補的なプライマーを適切な条件下でハイブリッド形成し、その後１つまたはそれ以上のポリメラーゼは前記鋳型の全部または一部に相補的な核酸分子を合成することができる。または、二本鎖鋳型については、１つまたはそれ以上のプロモーター（例えば、ＳＰ６、Ｔ７、またはＴ３プロモーター）を、１つまたはそれ以上のポリメラーゼと組み合わせて使用して、鋳型の全部または一部に相補的な核酸分子を作製することができる。本発明によって新規に合成した分子の長さは元の鋳型と同じでも短くてもよい。
【００３２】
組み込み
本明細書中で使用される、「組み込み」という用語は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ分子またはプライマーの一部となることを意味する。
【００３３】
増幅
本明細書中で使用される、「増幅」とは、ポリメラーゼを使用したヌクレオチド配列のコピー数の任意のインビトロでの増加法をいう。核酸増幅により、ヌクレオチドがＤＮＡおよび／またはＲＮＡ分子またはプライマーに組み込まれ、それにより鋳型の全部または一部に相補的な新規の分子が形成される。形成された核酸分子およびその鋳型を鋳型として使用して、さらなる核酸分子を合成することができる。本明細書中で使用される、１つの増幅反応は、多数の複製ラウンドからなり得る。ＤＮＡ増幅反応には、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が含まれる。１つのＰＣＲ反応は、５から１００「サイクル」のＤＮＡ分子の変性および合成からなり得る。
【００３４】
ヌクレオチド
本明細書中で使用される、「ヌクレオチド」とは、塩基−糖−リン酸の組み合わせをいう。ヌクレオチドは、核酸配列（ＤＮＡおよびＲＮＡ）の単量体単位である。「ヌクレオチド」という用語には、リボヌクレオシド三リン酸（ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＧ、ＧＴＰ）およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、またはその誘導体が含まれる。このような誘導体には、例えば、［αＳ］ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰおよび７−デアザ−ｄＡＴＰ、２’−Ｏ−メチル修飾誘導体、ビオチン化ヌクレオチド、およびこれらを含む核酸分子にヌクレアーゼ耐性を付与するヌクレオチド誘導体が含まれる。本明細書中で使用される、「ヌクレオチド」という用語はまた、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）およびその誘導体をいう。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の例には、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、およびｄｄＴＴＰが含まれるが、これらに限定されない。本発明によれば、「ヌクレオチド」を、非標識であっても既知の技術によって検出可能なように標識してもよい。検出可能な標識には、例えば、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、および酵素標識が含まれる。
【００３５】
オリゴヌクレオチド
「オリゴヌクレオチド」とは、ホスホジエステルもしくはホスホチオエートまたは１つのヌクレオチドのデオキシリボースもしくはリボースの３’と、隣接するヌクレオチドのデオキシリボースもしくはリボースの５’との間のアミド結合によって連結されたヌクレオチドの共有結合配列を含む合成または天然分子をいう。
【００３６】
ハイブリッド形成
「ハイブリッド形成」および「ハイブリッド形成する」という用語は、二本鎖分子を得るための２つの相補的一本鎖核酸分子（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）の塩基対合をいう。本明細書中で使用される、２つの核酸分子をハイブリッド形成させることができるが、塩基対合は完全に相補的ではない。したがって、当技術分野で既知の適切な条件を使用した場合、ミスマッチ塩基は２つの核酸分子のハイブリッド形成を防止しない。
【００３７】
単位
本明細書中で使用される、「単位」という用語は、酵素活性をいう。例えば、ＤＮＡポリメラーゼをいう場合、１単位の活性は、標準的なＤＮＡ合成開始条件下で３０分間に１０ｎｍｏｌのｄＮＴＰを酸不溶性物質（すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を取り込む酵素の量である。
【００３８】
ベクター
宿主細胞中で自己複製することができ、ベクターの不可欠な生物学的機能を喪失することなく決定可能な様式でＤＮＡ配列を切断することができる１つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位によって特徴付けられ、ＤＮＡをスプライシングして複製およびクローニングを行うことができる、プラスミド、ファージミド、コスミド、またはファージＤＮＡまたは他のＤＮＡ分子。クローニングベクターは、クローニングベクターで形質転換された細胞の同定に使用する適切なマーカーをさらに含み得る。例えば、マーカーは、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を示す。
【００３９】
発現ベクター
クローニングベクターに類似しているが宿主への形質転換後にクローニングした遺伝子の発現を増強することができるベクター。クローンニングされた遺伝子は、通常、プロモーター配列などの一定の調節配列の調節下（すなわち、作動可能に連結されている）に置かれる。
【００４０】
組換え宿主
発現ベクター、クローニングベクター、または任意のＤＮＡ分子中に所望のクローンニングされた遺伝子を含む任意の原核もしくは真核の生物または細胞。「組換え宿主」という用語はまた、宿主染色体またはゲノム上に所望の遺伝子を含むように遺伝子操作されている宿主細胞を含むことを意味する。
【００４１】
宿主
複製可能な発現ベクター、クローニングベクター、または任意のＤＮＡ分子のレシピエントである任意の原核もしくは真核の生物または細胞。ＤＮＡ分子は、構造遺伝子、プロモーターおよび／または複製起点を含み得るが、これらに限定されない。
【００４２】
プロモーター
一般に、開始コドンに隣接して存在する遺伝子の５’領域として記載されるＤＮＡ配列。プロモーター領域では、隣接遺伝子の転写が開始される。
【００４３】
遺伝子
ポリペプチドまたはタンパク質の発現に必要な情報を含むＤＮＡ配列。これには、プロモーターおよび構造遺伝子ならびにタンパク質発現に関連する他の配列が含まれる。
【００４４】
構造遺伝子
伝令ＲＮＡに転写され、その後特定のポリペプチドに特徴的なアミノ酸配列に翻訳されるＤＮＡ配列。
【００４５】
作動可能に連結された
本明細書中で使用されるように、構造遺伝子によってコードされるポリペプチド発現の開始を調節するようにプロモーターが配置されることを意味する。
【００４６】
発現
発現は、遺伝子がポリペプチドを産生する過程である。これには、遺伝子の伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写およびこのようなｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳が含まれる。
【００４７】
実質的に純粋な
本明細書中で使用される、「実質的に純粋な」とは、所望の精製タンパク質またはポリペプチドが、天然には所望のタンパク質またはポリペプチドに会合している細胞夾雑物を本質的に含まないことを意味する。夾雑細胞化合物には、ホスファターゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、望ましくないＤＮＡポリメラーゼ酵素を含み得るが、これらに限定されない。
【００４８】
熱安定性
本明細書中で使用される、「熱安定性」とは、熱による不活化に耐性を示すポリペプチドまたは酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、および逆転写酵素）をいう。例として、ＤＮＡポリメラーゼは、５’から３’方向でのプライマーの伸長によって一本鎖ＤＮＡ鋳型に相補的なＤＮＡ分子の形成を合成する。中温性ＤＮＡポリメラーゼのこの活性を、熱処理で不活化することができる。例えば、Ｔ５　ＤＮＡポリメラーゼ活性は、９０℃で３０分間の酵素の曝露によって完全に不活化される。本明細書中で使用される、「熱安定性ポリメラーゼ活性」とは、中温性ポリメラーゼよりも高い熱不活化耐性を示す。しかし、熱安定性ポリメラーゼは、熱不活化に完全に耐性を示す酵素をいうことを意味しないので、熱処理によりいくらかのポリメラーゼ活性は減少し得る。熱安定性ポリメラーゼはまた、中温性ポリメラーゼよりも至適温度が高い。
【００４９】
３’→５’エキソヌクレアーゼ活性
「３’→５’エキソヌクレアーゼ活性」とは、当技術分野で既知の酵素活性である。この活性は、しばしばＤＮＡポリメラーゼに関連し、ＤＮＡ複製「校正」または修正機構に関連すると考えられている。
【００５０】
「３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が実質的に減少したポリメラーゼ」は、本明細書中では（１）対応する非変異野生型酵素の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の約１０％またはそれ以下、好ましくは約１％またはそれ以下の変異または改変ポリメラーゼまたは（２）約１単位／ｍｇタンパク質未満、または好ましくは約０．１単位／ｍｇタンパク質またはそれ以下の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼのいずれかと定義する。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の活性単位を、「ＢＲＬ　１９８９カタログおよび参照ガイド」のｐ５に記載のように末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）によって［^３Ｈ］ｄＴＴＰで標識したλＤＮＡの３’末端のＨｈａＩ断片を用いてアッセイしたところ、３７℃で６０分間に１０ｎｍｏｌの基質を溶解する活性の量と定義する。タンパク質を、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）、Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７２：２４８、１９７６の方法によって測定する。比較手段として、ｐＴＴＱ１９−Ｔ５−２によってコードされる天然の野生型Ｔ５−ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡＰ）またはＴ５−ＤＮＡＰの比活性は約１０単位／ｍｇタンパク質である一方で、ｐＴＴＱ１９−Ｔ５−２（エキソ）（米国特許第５，２７０，１７９号）によってコードされるＤＮＡポリメラーゼの比活性は約０．０００１単位／ｍｇタンパク質（すなわち、非改変酵素の比活性の約０．００１％（１０５倍の減少））である。
【００５１】
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性
「５’→３’エキソヌクレアーゼ活性」もまた、当技術分野で既知の酵素活性である。この活性は、しばしば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰｏｌＩおよびＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼに関連する。
【００５２】
「５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に減少したポリメラーゼ」とは、本明細書中では（１）対応する非変異野生型酵素の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の約１０％またはそれ以下、好ましくは約１％またはそれ以下の変異または改変ポリメラーゼまたは（２）約１単位／ｍｇタンパク質、または好ましくは約０．１単位／ｍｇタンパク質またはそれ以下の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼのいずれかと定義する。
【００５３】
３’→５’および５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のどちらも、配列決定ゲルで観察することができる。活性な５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、成長プライマーの５’末端からのヌクレオチドの除去による配列決定ゲルに非特異的ラダーが得られる。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を、配列決定ゲル中の放射性標識プライマーの分解後に測定することができる。したがって、例えば、野生型と変異または改変ポリメラーゼとの比較によるこれらの活性の相対量を、日常的な実験だけで同定することができる。
【００５４】
本明細書中で使用される組換えＤＮＡ技術および分子生物学および細胞生物学分野で使用される他の用語は、一般に当技術分野における業者に理解されている。
【００５５】
リガンド
本発明のリガンドには、二本鎖核酸（すなわち、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡ、ＰＮＡ／ＤＮＡ、ＰＮＡ／ＲＮＡ、ＬＮＡ／ＤＮＡ、またはＬＮＡ／ＲＮＡ）および／または一本鎖核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、またはＬＮＡまたはその組み合わせ）および／または一本鎖／二本鎖核酸複合体または他のオリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート結合、３’−Ｏ−メチルリボース塩基などを有する）に親和性を有する種々の化合物／分子（天然および合成を含む）が含まれる。したがって、本発明のリガンドを、本発明によって任意の天然または誘導体または合成核酸分子と共に使用することができる。多数の合成、天然、誘導体核酸分子が当技術分野で既知であり、日常的に合成、増幅、および配列決定反応における基質として使用されている。このような核酸分子は、修飾基、検出可能な標識、誘導体化ヌクレオチド、結合の改変、塩基修飾、糖の修飾などを含み得る。本発明によれば、このような天然、合成、および誘導合成、増幅、および配列決定用基質を、本発明のリガンド（カチオン性／ポリカチオン性化合物）と組み合わせて使用することができる。このようなリガンドには、このような核酸分子と結合するか親和性を有する任意のタンパク質、糖、ステロイド、または脂質を含み得るかこれらに由来し得る。このようなリガンドの例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：天然化合物（ヒストン、プロタミン、スペルミン、スペルミジン、および可動性の高い基を有するタンパク質など）、合成カチオン性化合物（ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブレン、ポリリジン、ポリヒスチジン、ポリペプチド、ポリアミドアミンカスケードポリマーもしくはデンドリマー、リポポリアミン、およびポリエチレンイミンなど）、およびカチオン性脂質またはカチオン性リポソーム製剤（「トランスフェクタム（商標）」（Ｐｒｏｍｅｇａ）、「ドータップ（商標）」（Ｒｏｃｈｅ）、「ヒュージーン６（商標）」（Ｒｏｃｈｅ）、「エックストリームジーン　Ｑ２（商標）」（Ｒｏｃｈｅ）、「ジーンジェイマー（商標）」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、「ジーンポーター（商標）」（Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）、「イフェクテン（商標）」（Ｑｕｉａｇｅｎ）、「スーパーフェクト（商標）」（Ｑｕｉａｇｅｎ）、「リポフェクチン（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ）（商標）」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、「リポフェクトエース（商標）」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、「リポフェクタミン（商標）」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、「リポフェクタミン　２０００（商標）」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、「セルフェクチン（商標）」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、「ディーエムリー−Ｃ（商標）」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）など）、核酸がペプチドの結合によりスプライシングされないように核酸と相互作用する正電荷を持つ天然および合成ペプチド、カチオン性界面活性剤、および以下の特許に記載の他のカチオン性化合物：米国特許第４，８１２，４４９号、同第５，１７１，６７８号、同第５，１８６，９２３号、同第５，２７７，８９７号、同第５，２０８，０３６号、同第５，２０８，０３６号、同第５，２６４，６１８号、同第５，２７９，８３３号、同第５，３３４，７６１号、同第４，８９７，３５５号、同第５，４５９，１２７号、同第５，６５０，０９６号、同第５，７４４，３３５号、同第５，８５４，２２４号、同第５，６７０，３４７号、同第５，８６９，６０６号、同第５，９０６，９２２号、同第５，６７４，９０８号、国際公開公報第９８／１９７０９号、同第５，８６１，３９７号、米国特許第５，６７０，３４７号、国際公開公報第９３／１９７６８号、国際公開公報第００／２７７９５号、国際公開公報第９７／４２８１９号、欧州特許第０８４６６８０号、米国特許第５，８３０，４３０号、国際公開公報第９８／４０５０２号、国際公開公報第９８／４０４９９号、国際公開公報第９８／０２１９０号、および国際公開公報第９９／２９７１２号。
【００５６】
本発明により使用することができるカチオン性化合物は、式Ｉ：
【化１】

（式中、Ｒ^１およびＲ^２は独立して、Ｈ、Ｃ_１−１０アルキル、好ましくはＣ_１−６アルキル、より好ましくはＣ_１−３アルキルであり、ＹおよびＺは独立して、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−、ＣＨ＝ＣＨＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨＣＨ_２−、−ＣＨ＝ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ−、および−ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨ−からなる群より選択されるメンバーであり、ｎおよびｑは独立して、３〜１０、好ましくは３〜７の整数であり、ｍおよびｐは独立して、２〜１２、好ましくは４〜９の整数であり、但し、ｎ＋ｍとｑ＋ｐとの合計が１０〜１７の整数であり、Ｘは陰イオンである）の化合物である。Ｘは、１価または２価の陰イオンであり得る。式Ｉの好ましい化合物には、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリドおよびＮ−ステアリル−Ｎ−オレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリドが含まれる。米国特許第５，７５３，６１３号を参照のこと。
【００５７】
本発明により使用することができる別のカチオン性化合物群には、式ＩＩ：
【化２】

（式中、Ｒ_１は飽和または不飽和のＣ_{１０−１００}の直鎖または分岐炭化水素鎖であり、
Ｒ^２は、電子対、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、Ｒ_５−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒ_６、Ｒ_５−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｒ_６、アルキルアミノアルキル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、およびアリール（全てを選択的に置換することができる）からなる群より選択され、
Ｒ_３およびＲ_４は独立して、互いに水素、Ｃ_{１−１００}アルキル、好ましくはＣ_６−２２アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、Ｒ_５−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒ_６、Ｒ_５−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｒ_６、アルキルアミノアルキル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、およびアリール（全てを選択的に置換することができる）からなる群より選択され、Ｒ_５およびＲ_６は独立して、アルキレン、アルケニレン、またはアルキニレンである）のカチオン性脂質が含まれる。Ｒ_２が電気対ではなく、選択的に１つまたはそれ以上の脂質凝集複合体を形成するための少なくとも１つの中性脂質である場合、Ａは薬学的に許容可能な陰イオンである。米国特許第５，２７９，８３３号を参照のこと。
【００５８】
好ましい局面では、Ｒ_１は飽和または不飽和のＣ_{１０−３０}の直鎖または分岐炭化水素鎖である。別の好ましい局面では、式ＩＩ中のＲ_３およびＲ_４は、Ｃ_１−３アルキルであり、Ｒ_１およびＲ_２の一方は不飽和Ｃ_{１６−２０}アルキルであり、Ｒ_１およびＲ_２の他方は不飽和または飽和Ｃ_{１６−２０}アルキルのどちらでもない。好ましくは、Ｒ_１は飽和または不飽和のＣ_{１０−３０}の直鎖または分岐炭化水素鎖である。好ましくは、Ｒ_１は飽和または不飽和のＣ_{１２−２４}の直鎖炭化水素鎖である。Ｒ_２、Ｒ_３、およびＲ_４は独立して、水素、Ｃ_１−２０アルキル、Ｃ_２−２０アルキル、Ｃ_４−２０ヘテロアルキル、Ｃ_４−２０ヘテロアルケニル、Ｃ_４−２０ヘテロアルキニル、Ｃ_６−１２アリール（Ｃ_１−２０）アルキル、およびＣ_６−１２アリール（その全てを選択的に置換することができる）からなる群より選択される。より好ましくは、Ｒ_１は飽和または不飽和のＣ_{１４−２０}の直鎖または分岐炭化水素鎖であり、Ｒ_２は、水素、Ｃ_６−１８アルキル、Ｃ_６−１８アルケニル、Ｃ_６−１８アルキニル、Ｃ_６−１８ヘテロアルキル、Ｃ_６−１８へテロアルケニル、Ｃ_６−１８へテロアルキニル、フェニル（Ｃ_６−１８）アルキル、およびフェニルからなる群より選択され、Ｒ_３およびＲ４は独立して、水素、Ｃ_１−５アルキル、Ｃ_２−６アルケニル、Ｃ_２−６アルキニル、Ｃ_２−５ヘテロアルキル、Ｃ_２−５へテロアルケニル、Ｃ_２−５へテロアルキニル、フェニル（Ｃ_１−５）アルキル、特にベンジルおよびフェニル（その全てを選択的に置換することができる）からなる群より選択される。式ＩＩのカチオン性脂質の別の有用な群は、Ｒ_１およびＲ_２が共にＣ_{１０−２０}飽和アルキル基であるものである。
【００５９】
別の好ましい局面では、カチオン性脂質は、式ＩＩＩ：
【化３】

を有する。
【００６０】
Ａは任意の融和性陰イオンである。Ｒ_１およびＲ_２は、上記の式ＩＩで定義されている。これらの陰イオンは有機であるか無機である得る。Ａは好ましくは、Ｂｒ⁻、Ｃｌ⁻、Ｆ⁻、Ｉ⁻であるハロゲンであり、またはＡは、硫酸塩、亜硝酸塩、もしくは硝酸塩である。好ましい化合物には、臭化セチルジメチルエチルアンモニウムおよび臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）が含まれる。
【００６１】
別の好ましい局面では、カチオン性化合物は、式ＩＶ：
【化４】

（式中、Ｒ^１およびＲ^２は独立して、６〜２４個の炭素原子のアルキル、アルケニル、またはアルキニル基であり、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、独立して、水素、１〜８個の炭素原子のアルキル、６〜１１個の炭素原子のアリルまたはアラルキルであり、または、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５のうち２つまたは３つは、正電荷の窒素原子と組み合わせて、５〜８原子の環状構造を形成し、正電荷の窒素原子に加えて、構造中の原子は炭素原子であり、１つの酸素原子、窒素原子、または硫黄原子を含むことができ、ｎは１〜８であり、Ｘは陰イオンである）またはその鏡像異性体を有する。式ＩＶの好ましい化合物は、Ｎ−（２，３−ジ（９−（Ｚ）−オクタデセニルオキシ））−プロプ−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）である。米国特許第５，５５０，２８９号を参照のこと。
【００６２】
式Ｖ：
【化５】

（式中、Ｒ_ａ基、Ｒ_ｂ基、Ｒ_ｃ基、およびＲ_ｄ基は独立して、Ｃ_１２、Ｃ_１３、Ｃ_１４、Ｃ_１５、Ｃ_１６、Ｃ_１７、Ｃ_１８、Ｃ_１９、Ｃ_２０、Ｃ_２１、またはＣ_２２の直鎖アルキルまたはアルケニル基である）を有する脂質もまた本発明の実施に有用である。好ましい態様では、より長い脂質（Ｃ_１８−Ｃ_２２）を使用する。好ましい式Ｖの化合物には、テトラメチルテトラパルミチルスペルミン（ＴＭＴＰＳ）、テトラメチルテトララウリルスペルミン（ＴＭＴＬＳ）、テトラメチルテトラミリスチルスペルミン（ＴＭＴＭＳ）、テトラメチルテトラステリルスペルミン（ＴＭＴＳＳ）およびテトラメチルテトラオレオイルスペルミン（ＴＭＴＯＳ）が含まれる。国際公開公報第９８／４０４９９号を参照のこと。
【００６３】
別の態様では、カチオン性脂質は、式ＶＩ：
【化６】

（式中、ＲおよびＲ_１はそれぞれ独立して１１個から２９個の炭素原子を含む直鎖、脂肪族炭化水素基であり、Ｘは、１価または多価の陰イオンである）を有する窒素含有イミダゾリニウム由来のカチオン性脂質である。選択的に、ＲおよびＲ_１をカルボキシル基に置換して、双極性化合物を得ることができる。式ＶＩの好ましい化合物は、１−（２−（オレオイルオキシ）エチル）−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムである。米国特許第５，８３０，８７８号を参照のこと。
【００６４】
別の好ましい態様では、カチオン性化合物には、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミドスペルミン（ＤＰＰＥＳ）が含まれる。両方の化合物では、陰イオンは、ベア（Ｊ．Ｂｅｈｒ）ら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ、８６、６９８２〜６９８６、１９８９に記載のトリフルオロ酢酸または他の陰イオンであり得る。
【００６５】
別の好ましい態様では、本発明により使用することができるカチオン性化合物には、（１−｛（３−アミノプロピル）−［４−（３−アミノプロピルアミノ）−ブチル］−カルバモイル｝−２−フェニルエチル）カルバミン酸１７−（１，５−ジメチルヘキシ）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ｛ａ｝フェナントレン−３−イルエステル；［１−｛（３−アミノ−プロピル）−［４−（３−アミノ−プロピルアミノ）ブチル］カルバモイル｝−２−（４−ヒドロキシフェニル）−エチル］カルバミン酸１７−（１，５−ジメチルヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ｛ａ｝フェナントレン−３−イルエステル；｛５−アミノ−５−［（４−アミノブチル）−（３−アミノ−プロピル）カルバモイル］ペンチル｝カルバミン酸１７−（１，５−ジメチルヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［α］フェナントレン−３−イルエステル；（５−アミノ−５｛（３−アミノ−プロピル）−［４−（３−アミノプロピル−アミノブチル］カルバモイル｝−ペンチル）カルバミン酸１７−（１，５−ジメチルヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［α］フェナントレン−３−イルエステル；および（５−アミノ−１−｛３−アミノプロピル）−［４−（３−アミノプロピルアミノ）ブチル］カルバモイル｝ペンチル）−　カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［α］フェナントレン−３−イルエステルが含まれる。米国特許第５，９４８，９２５号を参照のこと。
【００６６】
別の好ましい態様では、本発明により使用することができるカチオン性化合物には、以下が含まれる：コレステリル−３β−カルボキシル−アミドエチレントリメチルアンモニウムヨージド、１−ジメチルアミノ−３−トリメチル−アンモニオ−ＤＬ−２−プロピル−コレステリルカルボン酸ヨージド、コレステリル−３β−カルボキシアミドエチレンアミン、コレステリル−３β−オキシスクシンアミドエチレントリメチルアンモニウムヨージド、１−ジメチルアミノ−３−トリメチルアンモニオ−ＤＬ−２−プロピル−コレステリル−３β−オキシコハク酸ヨージド、２−［（２−トリメチルアンモニオ）−エチルメチルアミノ］エチル−コレステリル−３β−オキシコハク酸ヨージド、３β［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール、および３β−［Ｎ−（ポリエチレンイミン）−カルバモイル］コレステロール。米国特許第５，２８３，１８５号を参照のこと。
【００６７】
別の好ましい態様では、本発明により使用することができるカチオン性化合物には、以下が含まれる：スペルミンコレステロールカルバメート、Ｎ^４−スペルミンコレステロールカルバメート、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルリジンアミド、リジン３−Ｎ−ジヒドロコレステリルカルバメート、およびＮ^１Ｎ^１−ジオクタデシル−１，２，６−トリアミノヘキサン。米国特許第５，６５０，０９６号を参照のこと。
【００６８】
別の好ましい態様では、カチオン性化合物は、式ＶＩＩ：
【化７】

（式中、Ｒ_１およびＲ_４は同一であっても異なっていてもよく、選択的に少なくとも１つのエーテルの酸素原子が割り込まれたアルキル鎖を有するアルキル、アリール、アリールアルキル、またはシクロアルキルであり、
Ｒ_２およびＲ_３は同一であっても異なっていてもよく、Ｒ_１、Ｒ_４、またはＨであり、
Ｎ_１、Ｎ_２、Ｎ_３、およびＮ_４は生理学的ｐＨでプロトン化することができる窒素原子であり、
Ａ、Ｂ、およびＣは同一であっても異なっていてもよく、ポリアミンが、
（ｉ）ヒトまたは非ヒト動物へのポリアミンの投与の際に標的細胞によって取り込むことができ、ポリアミンのヒトまたは非ヒト動物への投与の際に細胞内または細胞表面上に存在する受容体の少なくとも１つのポリアミン部位に結合することができ、
（ｉｉ）標的細胞による取り込みの際、正電荷窒素原子と生物学的対陰イオンとの間の静電的相互作用を介して競合的に結合するように窒素原子の間の距離が有効に維持される架橋基であり、
細胞中の生物学的対陰イオンへの結合の際、ポリアミンは細胞内ポリアミンと生物学的に異なる様式で機能し、さらに、少なくとも１つの前記架橋基Ａ、Ｂ、およびＣは窒素原子のいずれかに対してαではない少なくとも１つの−ＣＨ（ＯＨ）−基を含む）を有するポリアミンまたはその可能な立体異性体またはその薬学的に許容可能な酸との塩である。好ましい式ＶＩＩの化合物には、ジエチルノルスペルミン（ＤＥＮＳＰＭ）、ＭＥＮＳＰＭ、ＤＥＮＳＰＭ、ＤＩＰＮＳＰＭ、ＤＭＳＰＭ、ＭＥＳＰＭ、ＤＥＳＰＭ、ＤＰＳＰＭ、ＦＤＥＳＰＭ、ＤＭＨＳＰＭ、ＭＥＨＳＰＭ、ＤＥＨＳＰＭ、ＤＩＰＨＳＰＭ、ＥＴＢＨＳＰＭ、ＤＴＢＨＳＰＭ、ＤＥ（３，４，４）、ＤＥ（４，５，４）、ＰＩＰ（３，４，３）、ＰＹＲ（３，３，３）、ＰＩＰ（４，４，４）、ＰＹＲ（４，４，４）、ＰＩＰ（５，４，５）、ＢＡＨＳＰＭ、ＣＨＸ（４，４，４）−トランス、およびＣＨＸ（３，４，３）−トランスが含まれる。米国特許第５，９６２，５３３号を参照のこと。
【００６９】
本発明は、さらに、式ＶＩＩＩ：
【化８】

（式中、ｘ、ｙ、およびｚは独立して、０〜１００までの整数であり、
各Ｘ_１は独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ_５−、−Ｃ（＝Ｘ_２）−、−Ｃ（＝Ｘ_２）−Ｎ（Ｒ_５）−、−Ｎ（Ｒ_５）−Ｃ（＝Ｘ_２）−、−Ｃ（＝Ｘ_２）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｘ_２）−または−Ｘ_２−（Ｒ_５Ｘ_２）Ｐ（＝Ｘ_２）−Ｘ_２−であり、
各Ｘ_２は独立して、ＯまたはＳであり、
各Ｙ_１は独立して、リン酸残基、Ｎ（Ｒ_６）_ａ−、Ｓ（Ｒ_６）_ａ−、Ｐ（Ｒ_６）_ａ−、または−ＣＯ_２Ｒ_６（式中、ａは１〜３の整数である）であり、
各Ｙ_２は独立して、−Ｎ（Ｒ_６）_ｂ−、Ｓ（Ｒ_６）_ｂ−、またはＰ（Ｒ_６）_ｂ−（式中、ｂは０〜２の整数である）であり、
各Ｙ_３は独立して、リン酸残基、Ｎ（Ｒ_６）_ａ−、Ｓ（Ｒ_６）_ａ−、Ｐ（Ｒ_６）_ａ−、または−ＣＯ_２Ｒ_６（式中、ａは１〜３の整数である）であり、
各Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、およびＲ_４は独立して、２個から約２０個の炭素のアルキレンであり、
各Ｒ_５は独立して、水素または１個から約１０個の炭素のアルキルであり、
各Ｒ_６は独立して、−［Ｒ_７−Ｘ_３］_ｃ−Ｒ_８または−Ｒ_９−［Ｘ_４−Ｒ_１０］_ｄ−Ｑであり、
各ｃおよびｄは独立して、０〜約１００の整数であり、
Ｑは独立して、リン酸残基、−Ｎ（Ｒ_１１）_ｑ−、Ｓ（Ｒ_１１）_ｑ−、Ｐ（Ｒ_１１）_ｑ−、または−ＣＯ_２Ｒ_１１（式中、ａは１〜３の整数である）であり、
各Ｘ_３およびＸ_４は独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ_５−、−Ｃ（＝Ｘ_２）−、−Ｃ（＝Ｘ_２）−Ｎ（Ｒ_５）−、−Ｎ（Ｒ_５）−Ｃ（＝Ｘ_２）−、−Ｃ（＝Ｘ_２）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｘ_２）−または−Ｘ_２−（Ｒ_５Ｘ_２）Ｐ（＝Ｘ_２）−Ｘ_２−であり、
各Ｒ_７は独立して、２個から約２０個の炭素のアルキレンであり、
各Ｒ_８は独立して、水素または１個から約６０個の炭素のアルキルであり、
各Ｒ_９およびＲ_１０は独立して、２個から約２０個の炭素のアルキレンであり、
各Ｒ_１１は独立して、−［Ｒ_７−Ｘ_３］ｃ−Ｒ_８または−Ｒ_９−［Ｘ_４−Ｒ_１０］_ｄ−Ｗであり、
各Ｗは独立して、リン酸残基、−Ｎ（Ｒ_１２）_ｗ−、Ｓ（Ｒ_１２）_ｗ−、Ｐ（Ｒ_１２）_ｗ−、または−ＣＯ_２Ｒ_１２（式中、ｗは１〜３の整数である）であり、
Ｒ_１２は−［Ｒ_７−Ｘ_３］_ｃ−Ｒ_８であり、但し、式（Ｉ）の化合物は、少なくとも２つの第四級の塩を含む）のカチオン性脂質化合物の使用を意図する。好ましい式ＶＩＩＩの化合物には、Ｎ，Ｎ’−ビス（ドデシルアミノカルボニルメチレン）−Ｎ，Ｎ’−ビス−（β−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムエチルアミノカルボニルメチレン）−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−エチレンジアミンテトラヨージド（ＥＤＴＡ−ＬＡ−ＴＭＡテトラヨージド）；Ｎ，Ｎ’−ビス（ドデシルアミノカルボニルメチレン）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸（ＥＤＴＡ−ＬＡ）；Ｎ，Ｎ’’−ビス（ヘキサデシルアミノカルボニルメチレン）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリス（β−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウムエチルアミノカルボキシメチレン）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリ−メチルジエチレントリアミンヘキサヨージド（ＤＴＰＡ−ＨＡ−ＴＭＥヘキサヨージド）；Ｎ，Ｎ’−ビス（ドデシルアミノカルボニルメチレン）−Ｎ，Ｎ’−ビス（β−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムエチルアミノカルボニルメチレン）−Ｎ，Ｎ’−ジメチルシクロヘキシレン−１，４−ジアミンテトラヨージド（ＣＤＴＡ−ＬＡ−ＴＭＡテトラヨージド）；１，１，７，７，−テトラ（β−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラ−メチルアンモニウムエチルアミノカルボニルメチレン）−４−ヘキサデシルアミノカルボニルメチレン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリメチル−１，４，７−トリアザヘプタンヘプタヨージド（ＤＴＰＡ−ＭＨＡ−ＴＴＭＡヘプタヨージド）；Ｎ，Ｎ’−ビス（ドデシルオキシカルボニルメチレン）−Ｎ，Ｎ’−ビス（β−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムエチルアミノカルボニルメチレン）エチレンジアミンジヨージド；Ｎ，Ｎ，Ｎ’’，Ｎ’’−テトラ（β−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムエチルアミノカルボニルメチレン）−Ｎ’−（１，２−ジオレオイルグリセロ−３−ホスホエタノールアミノカルボニルメチレン）ジエチレントリアミンテトラヨージド；Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデシルアミノカルボニルメチレン−Ｎ，Ｎ’−ビス（トリメチルアンモニウムエチルアミノカルボニルメチレン）−エチレンジアミンジヨージド；Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデシルオキシカルボニルメチレン）−Ｎ−（β−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムエチルアミノカルボニルメチレン）−Ｎ−メチル−Ｎ’−（カルボキシメチレン）エチレンジアミンジヨージド；およびＮ，Ｎ’−ビス（ヘキサデシルアミノカルボニルメチレン）−Ｎ，Ｎ’−ビス（β−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムエチルアミノカルボニルメチレン）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミンテトラヨージドが含まれる。米国特許第５，８３０，４３０号を参照のこと。
【００７０】
本発明はまた、式ＩＸ：
【化９】

（式中、Ｒ_１およびＲ_２は、個別または共にＣ_１−２３アルキルまたは
アルキルまたはアルケニルであり、ｑは１〜６であり、
【化１０】

Ｚ_１およびＺ_２は、個別または共にＨまたは非分岐アルキルＣ_１−６であり、
Ｘ_１は−（ＣＨ_２）_ｎＢｒ、Ｃｌ、Ｆ、またはＩ（ｎ＝０−６）であるか、
Ｘ_２は−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２（ｎ＝０−６）であるか、
Ｘ_３は−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｍＮＨ_２（ｍ＝２−６）であるか、
Ｘ_４は−ＮＨ−（ＣＨ_２）_３ＮＨ−（ＣＨ_２）_４−ＮＨ_２であるか、
Ｘ_５は−ＮＨ−（ＣＨ_２）_３−ＮＨ（ＣＨ_２）_４−ＮＨ（ＣＨ_２）_３−ＮＨ_２であり、
Ｘ_６は、
【化１１】

であり、
Ｘ_７は、
【化１２】

であり、
Ｘ_８は、
【化１３】

であり、
ｐは２〜５であり、ＹはＨまたはアミド基またはアルキルアミノ基に結合した他の基であり、
Ｘ_９は、ポリアミン（例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリブレン、ヒストン、またはプロタミンであるか、
Ｘ_１０は、レポーター分子（例えば、
【化１４】

ビオチン、葉酸、またはＰＰＤ）であるか、
Ｘ_１１は、多糖類または置換多糖類であるか、
Ｘ_１２はタンパク質であるか、
Ｘ_１３は抗体であるか、
Ｘ_１４は、アミンまたはハロゲン化反応基であるか、
Ｘ_１５は、−（ＣＨ_２）_ｒ−ＳＨ（式中、ｒは０〜６である）であるか、
Ｘ_１６は、−（ＣＨ_２）_ｓ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ_２）_ｔ−ＮＨ_２（ｓは０〜６であり、ｔは２〜６である）である）のカチオン性化合物の使用を意図する。国際公開公報第９４／２７４３５号を参照のこと。
【００７１】
複合体は、少なくとも１つの中性脂質をさらに含み得る。使用することができる中性脂質の例には、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ホスファチジン酸、およびコレステロールが含まれる。好ましくは、中性脂質は、ジアシルホスファチジルコリン（ジオレイホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、パルミトイルオレイルホスファチジルコリンなど）、レシチンおよびリゾレシチン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、およびコレステロールからなる群より選択される。より好ましくは、中性脂質は、アシル基中に１０個から２４個の炭素原子を有するジアシルホスファチジルエタノールアミンである。より好ましくは、アシル基は、ラウロイル、ミリストイル、ヘプタデカノイル、パルミトイル、ステアロイル、またはオレイルである。特に、中性脂質は、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレイルホスファチジルエタノールアミン、ジヘプタデカノイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、β−リノレイル−γ−パルミトイルホスファチジルエタノールアミン、およびβ−オレイル−γ−パルミトイルホスファチジルエタノールアミン、特に、ジオレイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。
【００７２】
カチオン性脂質と中性脂質との比は、使用した特定のカチオン性脂質に依存して広範に変化し得る。例えば、比は、約１：１０から約１０：１、好ましくは約１：７から約７：１、より好ましくは約１：５から約５：１、より好ましくは約２．５：１から約１：２．５であり得る。
【００７３】
有用なアルキル基には、直鎖および分岐Ｃ_１−１８アルキル基、好ましくは、Ｃ_１−１０アルキル基、より好ましくはＣ_１−５アルキル基が含まれる。典型的なＣ_１−１８アルキル基には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、３−ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、デシル基、ドデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基、およびオクタデシル基が含まれる。
【００７４】
有用なアルケニル基は、Ｃ_２〜１８アルケニル基、好ましくはＣ_２〜１０アルケニル基、より好ましくはＣ_２〜６アルケニル基である。典型的なＣ_２〜１８アルケニル基には、エテニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、ｓｅｃ−ブテニル、ヘキセニル、オクテニル、デセニル、ドデセニル、テトラデセニル（特に、９−テトラデセニル）、ヘキサデセニル（特に９−ヘキサデセニル）、およびオクタデセニル（特に、９−オクタデセニル基）が含まれる。
【００７５】
有用なアルキル基は、Ｃ_２〜１８アルキニル基、好ましくはＣ_２〜１０アルキニル基、より好ましくはＣ_２〜６アルキニル基である。典型的なＣ_２〜１８アルキニル基には、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基、２−ブチニル基、ヘキシニル基、オクチニル基、デシニル基、ドデシニル基、テトラデシニル基、ヘキサデシニル基、およびオクタデシニル基が含まれる。
【００７６】
典型的なヘテロアルキル基には、ＯまたはＳで置換された１つまたはそれ以上のＣＨ_２基を有する上記のＣ_１〜１８アルキル基のいずれかが含まれる。
【００７７】
典型的なヘテロアルケニル基には、ＯまたはＳで置換された１つまたはそれ以上のＣＨ_２基を有する上記のＣ_２〜１８アルケニル基のいずれかが含まれる。
【００７８】
典型的にヘテロアルキニル基には、ＯまたはＳで置換された１つまたはそれ以上のＣＨ_２基を有する上記のＣ_２〜１８アルキニル基のいずれかが含まれる。
【００７９】
典型的に、アルキルアミノアルキル基は、Ｒ_７−ＮＨ−Ｒ_８（Ｒ_７およびＲ_８は上記定義のアルキレン基である）である。
【００８０】
有用なアリール基は、Ｃ_６〜１４アリール、特にＣ_６〜１０アリールである。典型的なＣ_６〜１４アリール基には、フェニル、ナフチル、フェナントリル、アントラシル、インデニル、アズレニル、ビフェニル、ビフェニルエニル、およびフルオレニル基が含まれる。
【００８１】
有用なアリールアルキル基には、上記Ｃ_６〜１４アリール基のいずれかで置換されたＣ_１〜１８アルキル基のいずれかが含まれる。有用な価には、ベンジル、フェネチル、およびナフチルメチルが含まれる。
【００８２】
有用なアリールアルケニル基には、上記Ｃ_６〜１４アリール基のいずれかで置換されたＣ_２〜１８アルケニル基のいずれかが含まれる。
【００８３】
有用なアリールアルキニル基には、上記Ｃ_６〜１４アリール基のいずれかで置換されたＣ_２〜１８アルキニル基のいずれかが含まれる。有用な基には、フェニルエチニルおよびフェニルプロピニルが含まれる。
【００８４】
有用なハロ基またはハロゲン基には、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素が含まれる。
【００８５】
有用なハロアルキル基には、１つまたはそれ以上のフッ素、塩素、臭素、またはヨウ素で置換されたＣ_１〜１０アルキル基（例えば、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチル、１，１−ジフルオロエチル、およびトリクロロメチル基）が含まれる。
【００８６】
有用なヒドロキシアルキル基には、水酸基で置換されたＣ_１〜１０アルキル基（例えば、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル、およびヒドロキシブチル基）が含まれる。
【００８７】
有用なアルコキシ基には、上記Ｃ_１〜１０アルキル基の１つを置換する酸素が含まれる。
【００８８】
有用なアルキルチオ基には、上記Ｃ_１〜１０アルキル基の１つで置換する硫黄が含まれる。
【００８９】
有用なアシルアミノ基は、任意のアシル基、特に、アミノ窒素に結合したＣ_{２ 〜６}アルカノイルまたはＣ_６〜１０アリール（Ｃ_２〜６）アルカノイル（例えば、アセトアミド、プロピオンアミド、ブタノイルアミド、ヘンタノイルアミド、ヘキサノイルアミド、およびベンゾイル）である。
【００９０】
有用なアシルオキシ基は、オキシ（−Ｏ−）基に結合した任意のＣ_１〜６アシル（アルカノイル）（例えば、アセトキシ、プロピオノイルオキシ、ブタノイルオキシ、ペンタノイルオキシ、ヘキサノイルオキシなど）である。
【００９１】
有用なアルキルアミノおよびジアルキルアミノ基は、−ＮＨＲ_９およびＮＲ_９Ｒ_１０（式中、Ｒ_９およびＲ_１０はＣ_１〜１０アルキル基である）である。
【００９２】
アミノカルボニル基は、−（ＣＯ）ＮＨ_２である。
【００９３】
有用なアルキルチオール基には、−ＳＨ基で置換された上記のＣ_１〜１０アルキル基のいずれかが含まれる。
【００９４】
カルボキシ基は、−ＣＯＯＨである。
【００９５】
ウレイド基は、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ_２である。
【００９６】
アミノ基は、−ＮＨ_２である。
【００９７】
Ｒ基に対する選択的な置換基には、上記のハロゲン、ハロ（Ｃ_１〜６）アルキル、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_２〜６アルケニル、Ｃ_２〜６アルキニル、ヒドロキシ（Ｃ_１〜６）アルキル、アミノ（Ｃ_１〜６）アルキル、カルボキシ（Ｃ_１〜６）アルキル、アルコキシ（Ｃ_１〜６）アルキル、ニトロ、アミノ、ウレイド、アシルアミノ、ヒドロキシ、チオール、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシ、アミノカルボニル、およびＣ_１〜６アルキルチオール基が含まれる。好ましい選択的置換基には、ヒドロキシ（Ｃ_１〜６）アルキル、アミノ（Ｃ_１〜６）アルキル、ヒドロキシ、カルボキシ、ニトロ、Ｃ_１〜６アルキル、アルコキシ、チオール、およびアミノが含まれる。
【００９８】
認識されるように、他のリガンド（天然、非天然、修飾など）を選択して本発明で使用することができる。このような選択を、二本鎖および／または一本鎖および／または一本鎖／二本鎖核酸複合体核酸結合研究および／または核酸合成阻害アッセイ法によって行うことができる。好ましいリガンドは、ポリカチオン性であり、好ましくは、一定条件下で望ましくない酵素活性の阻害に十分に安定な核酸と複合体を形成する。好ましくは、複合体は、ポリメラーゼおよび／またはヌクレアーゼ活性を阻害する。１つの局面では、核酸と複合体を形成し、且つトランスフェクションが可能なトランスフェクション剤を、本発明に従って使用することができる。本発明で使用されるカチオン性またはポリカチオン性化合物／分子／組成物を、既知の技術で合成するか、購入することができる。
【００９９】
本発明のリガンド（例えば、カチオン性化合物／分子／組成物）を、好ましくは、合成、配列決定、または増幅反応において、ポリメラーゼまたは逆転写酵素の存在下でこのような合成、配列決定、または増幅の防止または阻害に十分な最終濃度で使用する。本発明のリガンドとポリメラーゼまたは逆転写酵素との比は、使用するポリメラーゼまたは逆転写酵素およびリガンドによって変化し得る。合成、配列決定、または増幅反応についてのリガンド（例えば、カチオン性化合物／分子／組成物）：ポリメラーゼ／逆転写酵素比は、約０．００１から１，０００，０００：１；約０．０１から１００，０００：１；約０．１から１０，０００：１；約１から１，０００：１；約１から５０：１；約１から１０：１；約１から５：１；または約１から２：１の範囲であり得る。勿論、本発明での使用に適切なこのような適切なリガンド：ポリメラーゼ／逆転写酵素比は、当技術分野の業者に明らかであるか、日常的実験のみで同定される。
【０１００】
核酸合成法
本発明のリガンド（特に、カチオン性化合物／分子／組成物）を、核酸合成法で使用することができる。特に、本発明のリガンドは、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの増幅反応において非特異的核酸合成を減少させることが発見された。したがって、本発明のカチオン性化合物／分子／組成物を、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）およびＲＮＡなどの核酸分子の合成を必要とする任意の方法で使用することができる。本発明のリガンド（例えば、カチオン性化合物／分子／組成物）を有利に使用し得る方法には、リガンドが解離するか変性または不活化する温度より低い温度で反応を設定し、その後核酸からリガンド（例えば、カチオン性化合物／分子／組成物）を解離するかリガンドを変性または不活化して核酸合成または増幅が起こる温度に上昇する（または他の反応条件を変化させる）ことによって反応を開始する核酸合成法、核酸増幅法（「ホットスタート」合成または増幅を含む）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０１】
本発明の局面による核酸合成法は、１つまたはそれ以上の工程を含み得る。例えば、本発明は、（ａ）１つまたはそれ以上の核酸鋳型を１つまたはそれ以上のプライマーおよび上記の本発明のリガンド（例えば、ポリカチオン性またはカチオン性の化合物／分子／組成物）およびポリメラーゼ活性または逆転写酵素活性を有する１つまたはそれ以上の酵素と混合して混合物を形成する工程と、（ｂ）混合物を核酸合成の阻害に十分な条件下でインキュベートする工程と、（ｃ）混合物を鋳型の全部または一部に相補的な１つまたはそれ以上の第１の核酸分子の作製に十分な条件下でインキュベートする工程とを含む、１つまたはそれ以上の核酸分子の合成法を提供する。本発明の局面によれば、核酸鋳型は、１つのｃＤＮＡ分子もしくはライブラリーなどのＤＮＡ分子、１つのｍＲＮＡ分子（もしくはｍＲＮＡ分子集団）などのＲＮＡ分子、またはその任意の他の誘導体であり得る。ｐＨ、温度、イオン強度、およびインキュベーション時間などの合成に十分な条件を、当業者によって至適化され得る。
【０１０２】
さらに、本発明で使用されるポリメラーゼ活性を有する酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、および逆転写酵素）を、例えば、インビトロゲンコーポレーション、ライフテクノロジーディビジョン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）（Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）、ニューイングランドバイオラボズ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）（Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、またはベーリンガーマンハイムバイオケミカルズ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ）から購入することができる。本発明で使用される逆転写酵素活性を有する酵素を、例えば、インビトロゲンコーポレーション、ライフテクノロジーディビジョン（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）、シグマ（Ｓｉｇｍａ）（Ｓａｉｎｔ　Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）またはベーリンガーマンハイムバイオケミカルズ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ）から購入することができる。または、ポリメラーゼまたは逆転写酵素を、当業者に既知の天然タンパク質の標準的単離および精製法に従って、天然のウイルスまたは細菌供給源から単離することができる（例えば、Ｈｏｕｔｓ，Ｇ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２９：５１７、１９７９を参照のこと）。さらに、このようなポリメラーゼ／逆転写酵素を、当業者に既知の組換えＤＮＡ技術によって調製することができる（例えば、Ｋｏｔｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、１６：２６５、１９８８；Ｓｏｌｔｉｓ，Ｄ．Ａ．およびＳｋａｌｋａ，Ａ．Ｍ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：３３７２から３３７６、１９８８を参照のこと）。ポリメラーゼ活性および逆転写酵素活性を有する酵素の例には、以下を含むＤＮＡポリメラーゼを含み得るが、これらに限定されない：サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモトガ・ネオポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａ）（Ｔｎｅ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ）（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモトガ・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（ＴｌｉまたはＶＥＮＴ（商標））ＤＮＡポリメラーゼ、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、ディープベント（ＤＥＥＰＶＥＮＴ）（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、、ピロコッカス・ウーシィ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｗｏｏｓｉｉ）（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、ピロコッカス属ＫＯＤ２（ＫＯＤ）ＤＮＡポリメラーゼ、バチルス・ステロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、バチルス・カルドフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｂｃａ）ＤＮＡポリメラーゼ、サルフォロバス・アシッドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ　ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）（Ｓａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモプラズマ・アシッドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）（Ｔａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｆｌａｖｕｓ）（Ｔｆｌ／Ｔｕｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・ラバー（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｒｕｂｅｒ）（Ｔｒｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・ブロキアナス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）（ＤＹＮＡＺＹＭＥ（商標））ＤＮＡポリメラーゼ、メタノバクテリウム・サーモオートフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）（Ｍｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、マイコバクテリアＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｔｂ、Ｍｌｅｐ）、大腸菌ｐｏｌＩＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７　ＤＮＡポリメラーゼ、および一般にｐｏｌＩ、ｐｏｌＩＩＩ、ファミリーＡ、ファミリーＢ、およびファミリーＣ型ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにその変異体、変異型、および誘導体。ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ３、Ｔ５、およびＳＰ６ならびにその変異体、変異型、および誘導体）もまた、本発明に従って使用することができる。ＤＮＡ親和性が増大する変異は、ポーレスキー（Ｐｏｌｅｓｋｙ）ら、１９９０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５、１４５７９〜１４５９１に記載されている。上記のポリペプチドを所望の目的のために変更することは当業者の範囲内である。
【０１０３】
本発明で使用した核酸ポリメラーゼは、中温性または好熱性であってよく、好ましくは好熱性である。好ましい中温性ＤＮＡポリメラーゼには、大腸菌、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、Ｄ．ラディドオランス（Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）、Ｃ．アウランティカス（Ｃ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、発疹チフスリケッチア（Ｒ．ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、梅毒トレポネーマシスティス（Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）属、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、乳酸菌（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ライ菌（Ｍ．ｌｅｒａｅ）、Ｍ．スメグマティス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、バクテリオファージＬ５、ｐｈｉ−Ｃ３１、Ｔ７、Ｔ３、Ｔ５、ＳＰ０１、ＳＰ０２、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＩＰ−１由来のミトコンドリア、および真核生物線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）およびキロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）などの生物から単離することができるＤＮＡポリメラーゼ（およびその各クレノウ断片）のＰｏｌＩファミリー（Ａｓｔａｔｋｅ，Ｍ．ら、１９９８、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７８、１４７〜１６５）、ならびに任意の供給源、およびその変異体、誘導体、または変異型について単離されたファミリーＡ、ファミリーＢ、ファミリーＣ、およびｐｏｌＩＩＩ型ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。本発明および本発明の組成物で使用することができる好ましい熱安定性ＤＮＡポリメラーゼには、Ｔａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｐｆｕ、Ｔｆｌ、Ｔｔｈ、ストッフェル（Ｓｔｏｆｆｅｌ）断片、ベント（ＶＥＮＴ）（商標）およびディープベント（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレオチド活性の減少、実質的に減少、または活性を示さないように好ましく改変された変異体、変異型、および誘導体が含まれる（米国特許第５，４３６，１４９号、同第４，８８９，８１８号、同第４，９６５，１８８号、同第５，０７９，３５２号、同第５，６１４，３６５号、同第５，３７４，５５３号、同第５，２７０，１７９号、同第５，０４７，３４２号、同第５，５１２，４６２号、国際公開公報第９２／０６１８８号、国際公開公報第９２／０６２００号、国際公開公報第９６／１０６４０号、バーンズ（Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．）、Ｇｅｎｅ、１１２：２９〜３５、１９９２、ローヤー（Ｌａｗｙｅｒ，Ｆ．Ｃ．）ら、ＰＣＲ　Ｍｅｔｈ．Ａｐｐｌ．、２：２７５〜２８７、１９９３、フレイマン（Ｆｌａｍａｎ，Ｊ．−Ｍ．）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、２２（１５）：３２５９〜３２６０、１９９４）。
【０１０４】
本発明で使用される逆転写酵素には、逆転写活性を有する任意の酵素が含まれる。このような酵素には、以下が含まれるが、これらに限定されない：レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、Ｂ型肝炎逆転写酵素、カリフラワーモザイクウイルス逆転写酵素、細菌逆転写酵素、ＴｔＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：４８７〜４９１、１９８８、米国特許第４，８８９，８１８号、および同第４，９６５，１８８号）、Ｔｎｅ　ＤＮＡポリメラーゼ（国際公開公報第９６／１０６４０号および国際公開公報第９７／０９４５１号）、Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，３７４，５５３号）、およびその変異体、変異型、または誘導体（例えば、国際公開公報第９７／０９４５１号および国際公開公報第９８／４７９１２号を参照のこと）。本発明で使用される好ましい酵素には、ＲＮアーゼＨ活性が減少、実質的に減少、または消失したものが含まれる。「ＲＮアーゼＨ活性が実質的に減少する」とは、酵素活性が対応する野生型またはＲＮアーゼＨ＋酵素（野生型モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）、トリ骨髄芽細胞症ウイルス（ＡＭＶ）、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）逆転写酵素など）のＲＮアーゼ活性の約２０％未満、より好ましくは約１５％、１０％、または５％未満、最も好ましくは約２％未満であることを意味する。任意の酵素のＲＮアーゼＨ活性を、例えば、米国特許第５，２４４，７９７号、コートウィックズ（Ｋｏｔｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｌ．）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、１６：２６５、１９８８、およびゲラード（Ｇｅｒａｒｄ，Ｇ．Ｆ．）ら、ＦＯＣＵＳ、１４（５）：９１、１９９２（その開示の全てが本明細書中で参照として組み入れられる）に記載の種々のアッセイ法によって決定することができる。本発明での使用に特に好ましいポリペプチドには、以下が含まれるが、これらに限定されない：Ｍ−ＭＬＶ　Ｈ⁻逆転写酵素、ＲＳＶ　Ｈ⁻逆転写酵素、ＡＭＶ　Ｈ⁻逆転写酵素、ＲＡＶ（ラウス関連ウイルス）Ｈ⁻逆転写酵素、ＭＡＶ（骨髄芽細胞症関連ウイルス）Ｈ⁻逆転写酵素、およびＨＩＶ　Ｈ⁻逆転写酵素（米国特許第５，２４４，７９７号および国際公開公報第９８／４７９１２号を参照のこと）。しかし、リボ核酸分子からＤＮＡ分子を産生することができる（すなわち、逆転写酵素活性を有する）任意の酵素を、本発明の組成物、方法、およびキットで同様に使用することができると当業者に理解される。
【０１０５】
本発明によれば、インプットもしくは鋳型核酸分子またはライブラリーを、種々の細胞、組織、器官、または生物などの天然供給源から得た核酸分子集団から調製することができる。核酸分子供給源として使用することができる細胞は、原核生物（エッシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）属、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）属、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）属、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、およびストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属を含む細菌細胞）または真核生物（真菌（特に、酵母）、植物、原生動物、および他の寄生虫、および動物（昆虫（特に、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）属細胞）線虫（特に、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓ）細胞）、および哺乳動物（特に、ヒト細胞）を含む）であり得る。
【０１０６】
一旦出発細胞、組織、器官、または他の試料が得られると、核酸分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡまたはポリＡ＋ＲＮＡ）分子など）を、当技術分野で既知の方法によってこれらから単離するか、ｃＤＮＡ分子またはライブラリーを調製することができる（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら、Ｃｅｌｌ、１５：６８７〜７０１、１９７８、Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．およびＢｅｒｇ，Ｐ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．、２：１６１〜１７０、１９８２、Ｇｕｂｌｅｒ，Ｕ．およびＨｏｆｆｍａｎ，Ｂ．Ｊ．、Ｇｅｎｅ、２５：２６３〜２６９、１９８３を参照のこと）。
【０１０７】
本発明の好ましい局面の実施では、第１の核酸分子を、上記のようにして得た核酸鋳型（好ましくは、ｍＲＮＡ分子またはポリＡ＋ＲＮＡ分子などのＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である）を１つまたはそれ以上の本発明の上記リガンド（または種々のその組み合わせ）と混合して混合物を形成させることによって合成することができる。核酸鋳型の全部または一部に相補的な第１の核酸分子の合成を、好ましくは、反応温度の上昇および本発明のリガンド（例えば、カチオン性の化合物／分子／組成物）変性または不活化の後に行い、それにより核酸合成基質（例えば、二本鎖プライマー／鋳型ハイブリッドおよび一本鎖プライマー、および鋳型）が遊離し、逆転写が優先され（ＲＮＡ鋳型の場合）、および／またはインプットまたは鋳型核酸分子が重合される。このような合成を、好ましくは、ヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）またはその誘導体）の存在下で行う。
【０１０８】
勿論、このリガンド（例えば、カチオン性化合物／分子／組成物）を有利に使用し得る核酸合成の他の技術は、当業者に容易に明らかであると思われる。
【０１０９】
増幅および配列決定法
本発明の他の局面では、リガンド（例えば、カチオン性化合物／分子／組成物）を、核酸分子の増幅法または配列決定法で使用することができる。本発明の局面に係る核酸増幅法は、一工程（例えば、一工程ＲＴ−ＰＣＲ）または二工程（例えば、二工程ＲＴ−ＰＣＲ）逆転写酵素増幅反応として当技術分野で一般的に既知の方法における逆転写活性を有する１つまたはそれ以上のポリペプチドの使用をさらに含み得る。長い核酸分子（すなわち、約３Ｋｂから５Ｋｂ長を超える）の増幅のために、国際公開公報第９８／０６７３６号および国際公開公報第９５／１６０２８号に記載のようにＤＮＡポリメラーゼを組み合わせて使用することができる。
【０１１０】
本発明のこの局面に係る増幅法は、１つまたはそれ以上の工程を含み得る。例えば、本発明は、（ａ）核酸鋳型を１つまたはそれ以上の本発明のリガンド（例えば、カチオン性化合物／分子／組成物）（または本明細書中に記載の種々のリガンドの組み合わせ）と混合して、混合物を形成する工程と、（ｂ）ポリメラーゼ活性を有する酵素による鋳型の全部または一部に相補的な核酸分子の増幅可能な十分な条件下で前記混合物をインキュベートする工程を含む、核酸分子の増幅法を提供する。好ましい局面では、合成を優先させる条件により、核酸からリガンド（例えば、カチオン性化合物／分子／組成物）が解離されるか、本発明のリガンド（例えば、カチオン性化合物／分子／組成物）を変性または不活化させる。本発明はまた、このような方法によって増幅した核酸分子を提供する。
【０１１１】
核酸分子または断片の一般的な増幅法および分析法は、当業者に既知である（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号、イニス（Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．）ら編、「ＰＣＲプロトコール：方法および適用ガイド（ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１９９０、グリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．）およびグリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．）編、「ＰＣＲ法：技術革新（ＰＣＲ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）」、Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ、ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ、１９９４を参照のこと）。例えば、本発明に従って使用することができる増幅法には、ＰＣＲ（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号）、鎖置換増幅（ＳＤＡ：米国特許第５，４５５，１６６号、欧州特許第０ ６８４ ３１５号）、および核酸配列を用いた増幅（ＮＡＳＢＡ：米国特許第５，４０９，８１８号、欧州特許第０ ３２９ ８２２号）が含まれる。
【０１１２】
典型的には、これらの増幅法は、（ａ）核酸試料を１つまたはそれ以上の本発明のリガンド（例えば、カチオン性化合物／分子／組成物）、１つまたはそれ以上のプライマー配列の存在下で核酸ポリメラーゼ活性を有する１つまたは複数ポリペプチドと接触させる工程と、（ｂ）好ましくはＰＣＲまたは等価の自動化増幅技術によって前記核酸試料を増幅して増幅核酸断片を回収する工程と、（ｃ）選択的に、サイズ、好ましくはゲル電気泳動によって増幅した核酸断片を分離し、例えば、臭化エチジウムなどの核酸結合色素でのゲル染色によって核酸断片を存在を分析する工程とを含む。
【０１１３】
本発明の方法による増幅および合成後、増幅または合成した核酸断片を、さらなる用途または特徴付けのために単離することができる。この工程を、通常、サイズおよび／または任意の物理的または生化学的手段（ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、クロマトグラフィー（サイズ、親和性、および免疫クロマトグラフィーを含む）、密度勾配遠心分離法、および免疫吸着法を含む）に係る増幅または合成核酸断片の分離によって行う。多数の核酸断片の感度の高い分離のための迅速且つ再現性の高い手段であり、いくつかの核酸試料の断片を直接同時に比較可能であるため、ゲル電気泳動による核酸断片の分離が特に好ましい。別の好ましい態様では、本発明の方法によって増幅または合成されたこれらの断片または任意の核酸断片単離および特徴付のためにこのアプローチを拡大することができる。したがって、本発明はまた、本発明の増幅または合成法によって産生された単離核酸分子に関する。
【０１１４】
本態様では、電気的溶出または物理的切り出しなどの標準的技術によって同定のために使用したゲル（上記を参照のこと）から１つまたはそれ以上の増幅または合成核酸断片を取り出す。次いで、単離した固有の核酸断片を、種々の原核生物（細菌）または真核生物（酵母、植物、またはヒトおよび他の哺乳動物を含む動物細胞）のトランスフェクションまたは形質転換に適切な標準的ベクター（発現ベクターを含む）に挿入することができる。または、本発明の方法によって産生された核酸分子を、例えば、下記の方法および当技術分野で標準的な他の方法（例えば、ＤＮＡ配列決定法に関する米国特許第４，９６２，０２２号および同第５，４９８，５２３号を参照のこと）による配列決定（すなわち、核酸断片のヌクレオチド配列の決定）によってさらに特徴付けることができる。
【０１１５】
本発明に係る核酸配列決定法は、１つまたはそれ以上の工程を含み得る。例えば、本発明は、（ａ）配列決定すべき核酸分子を、１つまたはそれ以上のプライマー、１つまたはそれ以上の本発明の上記リガンド（例えば、カチオン性化合物／分子／組成物）（またはその種々の組み合わせ）、１つまたはそれ以上のヌクレオチド、１つまたはそれ以上の終止剤（ジデオキシヌクレオチドなど）、および１つまたはそれ以上のポリメラーゼ活性および／またはエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素と混合して混合物を形成する工程と、（ｂ）前記混合物を配列決定すべき分子の全部または一部に相補的な分子集団の合成に十分な条件下でインキュベートする工程と、（ｃ）前記集団を分離して配列決定すべき分子の全部または一部のヌクレオチド配列を決定する工程とを含む、核酸分子の配列決定法を提供する。
【０１１６】
本発明で使用することができる核酸配列決定技術には、ジデオキシ配列決定法（米国特許第４，９６２，０２２号および同第５，４９８，５２３号など）が含まれる。
【０１１７】
宿主または宿主細胞の形質転換／トランスフェクション
本発明はまた、１つまたはそれ以上の宿主または宿主細胞への核酸分子の導入法を提供する。本発明のリガンド（例えば、カチオン性またはポリカチオン性化合物／分子／組成物）を、トランスフェクション／形質転換剤またはＤＮＡ凝縮剤として使用することができ、本発明はまた、１つまたはそれ以上の宿主細胞への核酸分子の導入を容易にする。したがって、リガンド（例えば、カチオン性化合物／分子／組成物）の存在下で本発明にしたがって合成または増幅させた核酸分子を、トランスフェクション／トランスフェクション剤を個別に添加することなく宿主細胞への直接導入に使用することができるが、核酸分子の導入を容易にするために本発明にしたがって他の薬剤を添加することができる。したがって、本発明は、（ａ）１つまたはそれ以上の本発明のリガンド（例えば、カチオン性またはポリカチオン性化合物／分子／組成物）（または本明細書中に記載の種々のリガンドの組み合わせ）の存在下で１つまたはそれ以上の核酸分子を合成または増幅する工程と、（ｂ）該合成または増幅核酸分子を少なくとも１つの該リガンドの存在下で１つまたはそれ以上の宿主または宿主細胞中でインキュベートする工程とを含む、宿主または宿主細胞中に１つまたはそれ以上の核酸分子を導入する方法に関する。
【０１１８】
宿主または宿主細胞への核酸分子の導入を、当技術分野で既知の標準的手順および技術によって行うことができる。使用した宿主または細胞の型およびリガンドの型（例えば、カチオン性またはポリカチオン性化合物／分子／組成物）に依存して、当業者に認識されている異なる手順を使用することができる。本発明によれば、原核生物（大腸菌、枯草菌、肺炎球菌などを含むグラム陰性菌およびグラム陽性菌など）または真核生物（酵母、植物、またはヒトまたは他の哺乳動物を含む動物）宿主または宿主細胞を、本発明に従って核酸分子でトランスフェクトまたは形質転換することができる。エレクトロポレーション、化学的コンピテント細胞の形質転換、トランスフェクションなどを含む種々の技術を、本発明に従って使用することができる。
【０１１９】
キット
本発明はまた、核酸分子の合成、増幅、または配列決定用のキットを提供する。本発明の局面に係るキットは、１つまたはそれ以上の本発明のリガンド（特に、カチオン性化合物／分子／組成物）を含み得る１つまたはそれ以上の容器（バイアル、チューブ、アンプル、ボトルなど）を含み得る。
【０１２０】
本発明のキットは、１つまたはそれ以上の以下の構成要素を含み得る：（ｉ）１つまたはそれ以上のリガンド（特に、本発明のカチオン性組成物）、（ｉｉ）１つまたはそれ以上のポリメラーゼおよび／または逆転写酵素、（ｉｉｉ）１つまたはそれ以上の適切な緩衝液、（ｉｖ）１つまたはそれ以上のヌクレオチド、（ｖ）１つまたはそれ以上のプライマー、（ｖｉ）１つまたはそれ以上の鋳型、（ｖｉｉ）１つまたはそれ以上の宿主または宿主細胞（核酸分子導入能力のある細胞であり得る）、および（ｖｉｉｉ）本発明の方法を実施するための説明書。
【０１２１】
組成物
本発明はまた、本発明の合成、増幅、または配列決定の実施、本発明のヌクレアーゼ保護法の実施、および本発明に係る宿主または宿主細胞への核酸分子の導入のために調製した組成物に関する。さらに、本発明は、本発明のこのような方法をの実施中または実施後に作製された組成物に関する。好ましい局面では、本発明の組成物は、１つまたはそれ以上の本発明のリガンド（特に、カチオン性化合物／分子／組成物）を含む。このような組成物は、さらに、（ｉ）１つまたはそれ以上のポリメラーゼおよび／または逆転写酵素、（ｉｉ）１つまたはそれ以上の適切な緩衝液、（ｉｉｉ）１つまたはそれ以上のヌクレオチド、（ｉｖ）１つまたはそれ以上の鋳型、（ｖ）１つまたはそれ以上のプライマー、（ｖｉ）１つまたはそれ以上の鋳型／プライマー複合体、（ｖｉｉ）本発明の合成法、増幅法、または配列決定法によって作製された１つまたはそれ以上の核酸分子、および（ｖｉｉｉ）１つまたはそれ以上の宿主または宿主細胞からなる群より選択される１つまたはそれ以上の成分を含むことができる。
【０１２２】
本発明はまた、１つまたはそれ以上の核酸分子と結合または複合体形成している本発明のリガンド（例えば、カチオン性化合物／分子／組成物）を含む組成物ならびにこのような組成物中で見出されたかまたは本発明の方法の間に作製されたリガンド／核酸分子複合体に関する。
【０１２３】
本明細書中に記載の方法および適用に対する他の適切な修正形態および適応形態が自明であり、本発明の範囲またはその任意の態様から逸脱することなくこれらを得ることができることが当業者に明白であると思われる。本発明の詳細に説明してきたが、本発明は以下の実施例を参照してより明白に理解されるが、この実施例は、例示のみを目的とし、本発明の制限を意図しない。
【０１２４】
実施例１
Ｔｎｅ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄ７３７Ａ；５’→３’エンドヌクレアーゼ欠損）のポリメラーゼ活性を、カチオン性組成物リポフェクタミン（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄより入手）の存在下または非存在下で、周囲温度、３７℃、および７２℃にて測定した。ポリメラーゼアッセイ法で使用したＤＮＡ基質は、３４／６０ｍｅｒのプライマー／鋳型であった。プライマー鎖の５’末端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して３２Ｐで標識した。ｄＮＴＰおよびＭｇＣｌ_２の存在下でのＤＮＡ基質へＴｎｅ　ＤＮＡポリメラーゼの添加によって重合反応を開始した。ＤＮＡの反応濃度は約１０ｎＭであり、４つのｄＮＴＰはそれぞれ２００μＭであり、ＭｇＣｌ_２は１．５ｍＭであった。リポフェクタミン（商標）を、ＤＮＡ−ｄＮＴＰ−Ｍｇ^２＋溶液に添加し、混合物を周囲温度で約５分間インキュベートし、ＤＮＡ−カチオン性組成物複合体を形成させ、その後Ｔｎｅポリメラーゼでの反応を開始した。対照反応には（図１、パネル１を参照のこと）、リポフェクタミン（商標）を添加しなかった。Ｔｎｅ　ＤＮＡポリメラーゼ濃度は、約７０ｎＭであり、リポフェクタミン（商標）濃度を、０ｍＭから４０ｍＭに変化させた。Ｔｎｅの添加から４分後に反応を停止させた。
【０１２５】
Ｔｎｅ　ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性は、周囲温度の１０ｍＭリポフェクタミン（商標）の存在下で有意に阻害されたが、３７℃および７２℃では反応は影響を受けなかった。酵素活性の阻害は、本発明者らの実験条件下ではリポフェクタミン（商標）の濃度に依存する。しかし、リポフェクタミン（商標）濃度は増加するので、重合反応は３７℃および７２℃でされも有意に阻害される（図１、パネルＩＩＩおよびＩＶを参照のこと）。
【０１２６】
実施例２
Ｔｎｅ　ＤＮＡポリメラーゼ（５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損）の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を、一本鎖３４ｍｅｒＤＮＡ基質を使用して測定した。エキソヌクレアーゼ指示ＤＮＡ消化を、リポフェクタミン（商標）の存在下および非存在下で、周囲温度、３７℃、および７２℃にて測定した。オリゴヌクレオチド基質の５’末端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して^３２Ｐで標識した。リポフェクタミン（商標）およびＭｇＣｌ_２の存在下での３４ｍｅｒオリゴヌクレオチド基質溶液へのＴｎｅ　ＤＮＡポリメラーゼの添加によって、エキソヌクレアーゼ反応を開始した。ＤＮＡ溶液にリポフェクタミン（商標）を添加し、混合物を周囲温度で約５分間インキュベートして、ＤＮＡ−カチオン性組成物複合体を形成し、その後Ｔｎｅポリメラーゼでのエキソヌクレアーゼ指示ｓｓＤＮＡ消化を開始した。対照反応では、リポフェクタミン（商標）は存在しなかった（図２、パネルＩ参照）。各反応では、ＤＮＡ基質の反応濃度は約１０ｎＭであり、ＭｇＣｌ_２は約３ｍＭであった。Ｔｎｅ　ＤＮＡポリメラーゼ濃度は約７０ｎＭであり、リポフェクタミン（商標）濃度は、０ｍＭから６０ｍＭであった。
【０１２７】
Ｔｎｅ　ＤＮＡポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性は、周囲温度での本発明者らの実験条件下でのリポフェクタミン（商標）の存在下で有意に阻害された。３７℃および７２℃では、リポフェクタミン（商標）は、６０ｍＭのリポフェクタミン（商標）濃度でさえもＴｎｅのエキソヌクレアーゼ活性のあまり有効な阻害剤ではなかった（図２、パネルＶを参照のこと）。上記の結果により、リポフェクタミン（商標）は、有意に異なる親和性でｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡ基質に結合／保護することが示唆される。
【０１２８】
本明細書中に列挙した全ての刊行物、特許、および特許出願は、本発明が属する技術分野の当業者のレベルを示し、各個別の刊行物、特許、または特許出願は詳細に且つ個別に参照として組み入れられると意味されるような程度で本明細書中で参照として組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＮＡポリメラーゼによって触媒されたＤＮＡ重合反応のリポフェクタミン（商標）による阻害を示す。本明細書中に報告した全測定で使用したＤＮＡポリメラーゼは、Ａｓｐ１３７Ａｌａ置換の挿入により５’−３’エキソ活性が欠損している（米国特許第５，９４８，６１４号を参照のこと）。ＰはＤＮＡプライマー（３４ｍｅｒ）の位置を示し、Ｆ．Ｌ．は完全に伸長した産物である（６０ｍｅｒ）。レーンＱは、オリゴヌクレオチド基質の対照レーンである。パネルＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶは、種々の濃度のリポフェクタミン（商標）でのＴｎｅによって触媒されたポリメラーゼ反応を示す。パネルＩは、リポフェクタミン（商標）の非存在下での反応を示す。パネルＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶは、１０ｍＭ、２０ｍＭ、および４０ｍＭのリポフェクタミン（商標）の存在下での反応を示す。各反応条件について、ＤＮＡ基質およびＴｎｅ　ＤＮＡポリメラーゼ濃度を、それぞれ約１０ｍＭおよび７０ｎＭに保持した。ポリメラーゼ反応を、ａ、ｂ、およびｃのサブパネルに示すように、各々、周囲温度、３７℃、および７２℃で測定した。各条件では、Ｔｎｅ添加による重合の開始から４分後に反応を停止させた。
【図２】周囲温度でのリポフェクタミン（商標）を使用したＴｎｅ　ＤＮＡポリメラーゼによって触媒された５’−３’エキソヌクレアーゼ反応の阻害を示す。Ｐは３４ｍｅｒのＤＮＡ基質の位置を示す。レーンＱは、オリゴヌクレオチド基質の対照レーンである。パネルＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、およびＶは、種々の濃度のリポフェクタミン（商標）でのＴｎｅ　ＤＮＡポリメラーゼによって触媒された３’−５’エキソヌクレアーゼ反応を示す。パネルＩは、リポフェクタミン（商標）の非存在下での反応を示す。パネルＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、およびＶは、１０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭ、および６０ｍＭのリポフェクタミン（商標）の存在下での反応を示す。各反応条件について、ＤＮＡ基質およびＴｎｅ　ＤＮＡポリメラーゼ濃度を、それぞれ約１０ｎＭおよび７０ｎＭに保持した。３４ｍｅｒ基質のエキソヌクレアーゼ消化を、ａ、ｂ、およびｃのサブパネルに示すように、各々、周囲温度、３７℃、および７２℃で測定した。各条件では、Ｔｎｅ添加による反応の開始から２０分後に消化を停止させた。

Claims (55)

1. １つまたはそれ以上の核酸分子に結合するか親和性を有することができる１つまたはそれ以上のカチオン性またはポリカチオン性分子および／または化合物を含む、核酸合成阻害用組成物。
2. 分子または化合物が、ヒストン、プロタミン、スペルミン、スペルミジン、および可動性の高い基を有するタンパク質からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
3. 分子または化合物が、合成もしくは天然の分子または化合物である、請求項１に記載の組成物。
4. 合成分子または合成化合物が、ポリマー、両親媒性凝集物、カチオン性脂質、およびカチオン性リポソーム製剤からなる群より選択される、請求項３に記載の組成物。
5. ポリマーが、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブレン、ポリヒスチジン、カチオン性ポリペプチド、およびポリリジンからなる群より選択される、請求項４に記載の組成物。
6. ポリマーがポリリジンである、請求項１に記載の組成物。
7. 両親媒性凝集物が、ポリアミドアミンカスケードポリマー、リポポリアミン、およびポリエチレンイミンからなる群より選択される、請求項４に記載の組成物。
8. カチオン性脂質またはカチオン性リポソーム製剤が、「トランスフェクタム（商標）」、「ドータップ（商標）」、「ヒュージーン６（商標）」、「エックストリームジーンＱ２（商標）」、「ジーンジェイマー（商標）」、「ジーンポーター（商標）」、「イフェクテン（商標）」、「スーパーフェクト（商標）」、「リポフェクチン（商標）」、「リポフェクトエース（商標）」、「リポフェクタミン（商標）」、「リポフェクタミン　２０００（商標）」、「セルフェクチン（商標）」、および「ディーエムリー−Ｃ（商標）」からなる群より選択される、請求項４に記載の組成物。
9. カチオン性脂質またはリポソーム製剤は、「リポフェクタミン（商標）」である、請求項８に記載の組成物。
10. 分子または化合物が熱不安定性である、請求項１に記載の組成物。
11. 分子または化合物の結合または親和性が、核酸合成条件下で阻害されるか、減少するか、実質的に減少するか、または消失する、請求項１に記載の組成物。
12. 分子または化合物が、核酸合成条件下で解離するか、変性するか、不活化する、請求項１に記載の組成物。
13. 分子または化合物がポリペプチド由来である、請求項１に記載の組成物。
14. 核酸ポリメラーゼ活性を有する１つまたはそれ以上の酵素をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
15. 酵素が好熱性である、請求項１４に記載の組成物。
16. 高熱性酵素が核酸合成条件下でポリメラーゼ活性を維持している、請求項１５に記載の組成物。
17. 核酸ポリメラーゼ活性を有する酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、および逆転写酵素からなる群より選択される、請求項１５に記載の組成物。
18. ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｐｆｕ、ベント（商標）、ディープベント（商標）、ＫＯＤ、およびＴｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにその変異体、変異型、および誘導体からなる群より選択される、請求項１７に記載の組成物。
19. 逆転写酵素が、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＲＡＶ逆転写酵素、ＭＡＶ逆転写酵素、およびＨＩＶ逆転写酵素、ならびにその変異体、変異型、および誘導体からなる群より選択される、請求項１７に記載の組成物。
20. 逆転写酵素のＲＮアーゼＨ活性が実質的に減少する、請求項１７に記載の組成物。
21. 少なくとも１つの核酸鋳型と１つまたはそれ以上の請求項１に記載の分子または化合物を混合して混合物を形成する工程と、
    混合物を鋳型の全部または一部に相補的に第１の核酸分子の合成に十分な条件下でインキュベートする工程を含む、核酸分子の合成法。
22. 混合を、核酸合成の防止および／または分子または化合物の１つまたはそれ以上の核酸合成基質への結合を可能にする条件下で行う、請求項２１に記載の方法。
23. 第１の核酸分子の合成を、前記分子または化合物の解離、変性、または不活化および／または前記分子または化合物の１つまたはそれ以上の核酸合成基質への結合の阻害、減少、実質的な減少、または消失に十分な条件下で行う、請求項２１に記載の方法。
24. 合成を、１つまたはそれ以上のヌクレオチド、ポリメラーゼ活性を有する１つまたはそれ以上のポリペプチド、および１つまたはそれ以上のプライマーからなる群より選択される少なくとも１つの成分の存在下で行う、請求項２１に記載の方法。
25. 混合物が、二本鎖核酸鋳型／プライマー複合体、一本鎖鋳型、および一本鎖プライマーからなる群より選択される１つまたはそれ以上の核酸分子を含む、請求項２１に記載の方法。
26. 核酸分子を第１の核酸分子の全部または一部に相補的な第２の核酸分子の作製に十分な条件下でインキュベートする工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
27. 請求項２１に記載の方法によって作製された、核酸分子。
28. 少なくとも１つの核酸鋳型と少なくとも１つの請求項１に記載の１つまたはそれ以上の分子とを混合する工程と、
    混合物を鋳型の全部または一部に相補的な核酸分子の増幅に十分な条件でインキュベートする工程とを含む、核酸分子の増幅法。
29. 混合を、核酸増幅を防止するおよび／または分子または化合物の１つまたはそれ以上の核酸増幅基質への結合を可能にする条件下で行う、請求項２８に記載の方法。
30. 増幅を、分子もしくは化合物の解離、不活化、または変性および／または前記分子もしくは化合物の１つまたはそれ以上の核酸合成基質への結合の阻害、減少、実質的な減少、または消失に十分な条件下で行う、請求項２８に記載の方法。
31. 増幅を、１つまたはそれ以上のヌクレオチド、ポリメラーゼ活性を有する１つまたはそれ以上のポリペプチド、および１つまたはそれ以上のプライマーからなる群より選択される少なくとも１つの成分の存在下で行う、請求項２８に記載の方法。
32. 混合物が、二本鎖核酸鋳型／プライマー複合体、一本鎖鋳型、および一本鎖プライマーからなる群より選択される１つまたはそれ以上の核酸分子を含む、請求項２８に記載の方法。
33. 請求項２８に記載の方法によって増幅された、核酸分子。
34. 少なくとも１つの配列決定すべき核酸分子と１つまたはそれ以上の請求項１に記載の分子と、１つまたはそれ以上の終止剤とを混合する工程と、
    混合物を配列決定すべき分子の全部または一部に相補的な分子集団の合成に十分な条件下でインキュベートする工程と、
    集団を分離して前記配列決定すべき分子の全部または一部のヌクレオチド配列を決定する工程とを含む、核酸分子の配列決定法。
35. 混合を、核酸合成の防止および／または分子または化合物の１つまたはそれ以上の核酸合成基質への結合に十分な条件下で行う、請求項３４に記載の方法。
36. 配列決定すべき分子の全部または一部に相補的な分子集団の合成を、分子または化合物の解離、変性、または不活化および／または前記分子または化合物の１つまたはそれ以上の核酸合成基質への結合の阻害、減少、実質的な減少、または消失に十分な条件下で行う、請求項３４に記載の方法。
37. 合成を、１つまたはそれ以上のヌクレオチド、ポリメラーゼ活性を有する１つまたはそれ以上のポリペプチド、および１つまたはそれ以上のプライマーからなる群より選択される少なくとも１つの成分の存在下で行う、請求項３４に記載の方法。
38. 混合物が、配列決定すべき二本鎖分子／プライマー複合体、配列決定すべき一本鎖分子、および一本鎖プライマーからなる群より選択される１つまたはそれ以上の核酸分子を含む、請求項３４に記載の方法。
39. １つまたはそれ以上の請求項１に記載の分子または化合物を含む、核酸分子合成用のキット。
40. １つまたはそれ以上のヌクレオチド、１つまたはそれ以上のＤＮＡポリメラーゼ、１つまたはそれ以上の逆転写酵素、１つまたはそれ以上の適切な緩衝液、１つまたはそれ以上のプライマー、および１つまたはそれ以上の終止剤からなる群より選択される１つまたはそれ以上の成分をさらに含む、請求項３９に記載のキット。
41. 核酸に高い親和性を示す１つまたはそれ以上のカチオン性もしくはポリカチオン性の分子または化合物を含む、阻害組成物。
42. 少なくとも１つの核酸鋳型と、１つまたはそれ以上の請求項１に記載の分子または化合物を核酸合成の防止または阻害に十分な条件下で混合する工程と、
    混合物を鋳型の全部または一部に相補的な核酸分子の合成に十分なカチオン性分子または化合物の解離、変性、または不活化に十分な条件下でインキュベートする工程とを含む、核酸分子の合成法。
43. （ａ）１つまたはそれ以上のヌクレオチド、１つまたはそれ以上の請求項１に記載の分子または化合物、および少なくとも１つのターミネーターヌクレオチドを使用して、核酸合成の防止または阻害に十分な条件下で配列決定すべき第１のＤＮＡ分子を得る工程と、
    （ｂ）合成ＤＮＡ分子の長さが第１のＤＮＡ分子よりも短く、前記合成ＤＮＡ分子が５’末端にターミネーターヌクレオチドを含む、工程（ａ）の混合物を前記第１のＤＮＡ分子に相補的なＤＮＡ分子の無作為な集団の合成に十分な分子または化合物の解離または不活化または変性に十分な条件下でインキュベートする工程と、
    （ｃ）第１のＤＮＡ分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部を決定することができるように該合成ＤＮＡ分子をサイズで分離する工程とを含む、ＤＮＡ分子の配列決定法。
44. （ａ）第１および第２のプライマーを得る工程であって、分子または化合物が核酸合成を予防または阻害するような条件下で、第１のプライマーがＤＮＡ分子の第１の鎖の３’末端または３’末端付近に相補的であり、第２のプライマーが、該ＤＮＡ分子および１つまたはそれ以上の請求項１に記載の分子または化合物の第２の鎖の３’末端または３’末端付近の配列に相補的であり、
    （ｂ）第１の鎖に相補的な第３のＤＮＡ分子および第２の鎖に相補的な第４のＤＮＡ分子の合成に十分な分子または化合物の解離、不活化、または変性に十分な条件下でインキュベートする工程と、
    （ｃ）該第１および第３の鎖ならびに第２および第４の鎖を変性する工程と、
    工程（ａ）から（ｂ）または（ｃ）を１回またはそれ以上繰り返す工程とを含む、二本鎖ＤＮＡ分子の増幅法。
45. １つまたはそれ以上のｍＲＮＡ鋳型と１つまたはそれ以上の請求項１に記載の分子または化合物とを混合する工程と、
    混合物を鋳型の全部または一部に相補的なｃＤＮＡ分子の合成に十分な条件下でインキュベートする工程とを含む、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡの調製法。
46. 少なくとも１つの核酸鋳型と１つまたはそれ以上の請求項１に記載の分子または化合物を核酸増幅の防止または阻害に十分な条件下で混合する工程と、
    混合物を鋳型の全部または一部に相補的な核酸分子の増幅に十分な分子または化合物の解離、変性、または不活化に十分な条件下でインキュベートする工程とを含む、核酸分子の増幅法。
47. １つまたはそれ以上の核酸リガンドを得る工程と、
    ヌクレアーゼ活性を有する１つまたはそれ以上のヌクレアーゼによる核酸分子の分解の防止または阻害に十分な条件下でリガンドを１つまたはそれ以上の核酸分子に接触させる工程とを含む、核酸分解を防止または阻害する方法。
48. リガンドがポリカチオン性もしくはカチオン性の分子または化合物である、請求項４７に記載の方法。
49. １つまたはそれ以上のカチオン性もしくはポリカチオン性の分子または化合物を含む、核酸合成を阻害するための組成物。
50. 分子または化合物が１つまたはそれ以上の核酸分子に結合するか親和性を有する、請求項４９に記載の組成物。
51. １つまたはそれ以上のヌクレオチド、１つまたはそれ以上の核酸鋳型、１つまたはそれ以上のプライマー、および１つまたはそれ以上の核酸ポリメラーゼ活性を有する酵素からなる群より選択される少なくとも１つの成分をさらに含む、請求項４９に記載の組成物。
52. 少なくとも１つの核酸鋳型と１つまたはそれ以上のカチオン性もしくはポリカチオン性の分子または化合物とを混合する工程と、混合物を鋳型の全部または一部に相補的な核酸分子の合成の阻害または防止に十分な条件下でインキュベートする工程とを含む、核酸合成を阻害または予防する方法。
53. 混合物が、１つまたはそれ以上のヌクレオチド、１つまたはそれ以上の核酸鋳型、１つまたはそれ以上のプライマー、および１つまたはそれ以上の核酸ポリメラーゼ活性を有する酵素からなる群より選択される少なくとも１つの成分をさらに含む、請求項５２に記載の組成物。
54. １つまたはそれ以上の核酸リガンドの存在下で１つまたはそれ以上の核酸分子を合成または増幅する工程と、
    リガンドの存在下で１つまたはそれ以上の宿主または宿主細胞中に合成または増幅した核酸分子を導入する工程とを含む、宿主または宿主細胞中の１つまたはそれ以上の核酸分子の導入法。
55. 少なくとも１つのリガンドがカチオン性もしくはポリカチオン性の化合物または分子である、請求項５４に記載の方法。

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