JP6522496B2 - L−核酸の酵素性合成 - Google Patents
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Description
好ましくはポリメラーゼ活性提示部分は、配列番号1に記載のアミノ酸配列、配列番号2に記載のアミノ酸配列、配列番号3に記載のアミノ酸配列および配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列からなる、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼXまたはその変異体である。
好ましくはポリメラーゼ活性提示部分は、配列番号15に記載のアミノ酸配列、配列番号16に記載のアミノ酸配列、配列番号17に記載のアミノ酸配列、配列番号18に記載のアミノ酸配列、配列番号19に記載のアミノ酸配列、配列番号20に記載のアミノ酸配列、配列番号21に記載のアミノ酸配列および配列番号22に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列からなる、Dpo4ポリメラーゼまたはその変異体である。
好ましくはポリメラーゼ活性提示部分は、配列番号1に記載のアミノ酸配列、配列番号2に記載のアミノ酸配列、配列番号3に記載のアミノ酸配列および配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列からなる、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼXまたはその変異体である。
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好ましくはポリメラーゼ活性提示部分は、配列番号1に記載のアミノ酸配列、配列番号2に記載のアミノ酸配列、配列番号3に記載のアミノ酸配列および配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列からなる、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼXまたはその変異体である。
好ましくはポリメラーゼ活性提示部分は、配列番号15に記載のアミノ酸配列、配列番号16に記載のアミノ酸配列、配列番号17に記載のアミノ酸配列、配列番号18に記載のアミノ酸配列、配列番号19に記載のアミノ酸配列、配列番号20に記載のアミノ酸配列、配列番号21に記載のアミノ酸配列および配列番号22に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列からなる、Dpo4ポリメラーゼまたはその変異体である。
(a)L−核酸分子の不均一集団を作製し;
(b)段階(a)のL−核酸分子の不均一集団を標的分子と接触させ;
(c)標的分子が結合しないL−核酸分子を分離し;
(d)標的分子が結合するL−核酸分子を増幅させること
を含み、
増幅の段階が、第三の、第四の、第五の、第六のおよび第七の態様の何れかの実施形態によるタンパク質を使用し、
このタンパク質が、アミノ酸がD−アミノ酸であるアミノ酸配列からなる、
標的分子結合L−核酸分子の同定のための方法によって、第十の態様の第一の実施形態でもある第十の態様においても解決される。
(e)標的分子が結合するL−核酸分子の配列決定を行い;
(f)核酸分子、段階(e)で配列決定したL−核酸分子のヌクレオチド配列と同一であるヌクレオチド配列を合成する、段階をさらに含む。
(da)増幅された核酸分子を標的分子と接触させる段階
が導入され、
ここで、段階(b)および場合によっては段階(c)および/または(d)が段階(e)の前に行われ、段階(da)、(b)、(c)および場合によっては(d)は、この順序で1回または数回行われる。
a)第三の、第四の、第五の、第六のおよび第七の態様の何れかの実施形態によるタンパク質の2以上の断片が化学的に合成され、それによって断片がそれらの全体としてタンパク質のアミノ酸配列を形成し、好ましくはこの断片が固相ペプチド合成により合成され、
b)段階a)の断片が、セグメント縮合、ネイティブ化学ライゲーション、酵素性ライゲーションまたはそれらの組み合わせによって互いに対して連結され、
このタンパク質が、アミノ酸がD−アミノ酸であるアミノ酸配列からなる、
方法によって、第十一の態様の第一の実施形態でもある第十一の態様においても解決される。
この第一のD−ペプチドまたは第一のD−タンパク質が、そのN−末端で保護基によって保護され、そのC−末端で4−グアニジノフェニルエステル基によって保護され、
この第二のD−ペプチドまたは第二のD−タンパク質が、自由N−末端および、そのC−末端でチオアルキルエステルまたはチオアリールエステル基を含む、
方法によって、第十二の態様の第一の実施形態でもある第十二の態様においても解決される。
a)ポリメラーゼがN−末端で短縮される場合、アミノ酸の位置は、ポリメラーゼのC−末端に対するその位置により、およびそのアミノ酸の周囲のアミノ酸に対して決定され、
b)ポリメラーゼがC−末端で短縮される場合、アミノ酸の位置は、ポリメラーゼのN−末端に対するその位置により、およびそのアミノ酸の周囲のアミノ酸に対して決定され、
b)ポリメラーゼがN−末端およびC−末端で短縮される場合、アミノ酸の位置は、そのアミノ酸の周囲のアミノ酸に対するその位置によって決定されるようになる。
断片縮合は、ペプチドのアミノ酸のその鎖が化学基で完全に保護されているペプチドを使用し、そのペプチドは溶液中でカップリングされる。
実施例で使用される場合の略語
ACN アセトニトリル(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Deutschland)
DCM ジクロロメタン(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Deutschland)
DIPEA N,N−ジイソプロピルアミン(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Deutschland)
EDT(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Deutschland)
Fmoc 9−フルオレニル−メトキシカルボニル−
HATU (2−(7−アザ−1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)(CreoSalus,Louisville KY,USA)
HFIP 1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロホスフェート(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Deutschland)
HPLC 高速液体クロマトグラフィー(高圧液体クロマトグラフィーと呼ばれることもある。)
MeIm メチルイミダゾール(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Deutschland)
MeOHメタノール(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Deutschland)
MSNT 1−(メシチレン−2−スルホニル)−3−ニトロ−1,2,4−トリアゾール(Merck KGaA,Darmstadt,Germany)
NMP N−メチル−ピロリドン(Iris Biotech GmbH,Marktredwitz,Deutschland)
PyBOP (ベンゾトリアゾール−1−イルオキシ)トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(Merck KGAA,DARMSTADT,GERMANY)
SDS ドデシル硫酸ナトリウム(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Deutschland)
TBTU O−(ベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(Merck KGaA,Darmstadt,Germany)
tBu (tert.−ブチル−)
TFA トリフルオロ酢酸(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Deutschland)
TFE 1,1,1−トリフルオロエタノール(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Deutschland)
THF(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Deutschland)
TIS(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Deutschland)
TLC 薄層クロマトグラフィー
Tris トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Deutschland)
UPLC 超高速液体クロマトグラフィー
アフリカブタ熱ウイルス(略称ASFV)からのポリメラーゼXは、1997年にOliverosらにより記載され、特徴が調べられた。ポリメラーゼXの野生型遺伝子は、開始コドンおよび終止コドンを含む、僅か525塩基対のオープンリーディングフレーム(略称ORF)を有する(Oliverosら、1997)。コードされるタンパク質の長さは僅か174アミノ酸である。この例は、どのようにポリメラーゼXならびにそれらの変異体がE.コリ(E.coli)で発現され、His6−Tagを用いて精製されたかを説明する。
ASFVのコドン使用はE.コリ(E.coli)と異なるので、ポリメラーゼXに対するE.コリ(E.coli)−コドン最適化合成遺伝子をGeneArt AG(Regensburg,Germany)から購入した。本合成遺伝子配列は、pCR4−Blunt−TOPOベクター(元の会社:Invitrogen,Karlsruhe,Germany)中で提供された。開始コドンおよび2つの終止コドンを含むコドン最適化オープンリーディングフレームは、次の配列:ATGCTGACCCTGATTCAGGGCAAAAAAATCGTGAACCATCTGCGTAGCCGTCTGGCCTTTGAATATAACGGCCAGCTGATTAAAATTCTGAGCAAAAACATTGTGGCGGTGGGCAGCCTGCGTCGTGAAGAAAAAATGCTGAACGATGTGGATCTGCTGATTATTGTGCCGGAAAAAAAACTGCTGAAACATGTGCTGCCGAACATTCGTATTAAAGGCCTGAGCTTTAGCGTGAAAGTGTGCGGCGAACGTAAATGCGTGCTGTTTATCGAATGGGAAAAAAAAACCTACCAGCTGGACCTGTTTACCGCGCTGGCCGAAGAAAAACCGTATGCGATCTTTCATTTTACCGGTCCGGTGAGCTATCTGATTCGTATTCGTGCGGCGCTGAAAAAAAAAAACTACAAACTGAACCAGTATGGCCTGTTTAAAAACCAGACCCTGGTGCCGCTGAAAATTACCACCGAAAAAGAACTGATTAAAGAACTGGGCTTTACCTATCGCATTCCGAAAAAACGCCTGTAATAAを有した。
発現コンストラクトpMJ14を用いてE.コリ(E.coli)で全−L−ポリメラーゼXを発現させた。pMJ130、pMJ356、pMJ357またはpMJ412から全−L−ポリメラーゼXの変異体を発現させた。発現のために、コンピーテントE.コリ(E.coli)株の「BL−21(DE3)pLysS’」(Novagen/VWR、Dresden,Germany)において適切な発現コンストラクトを形質転換し、抗生物質アンピシリンを用いて維持した。600nmでの光学密度がおよそ0.6に到達するまで、2YT培地中で培養物を37℃で増殖させた。次いで、0.4mMの最終濃度まで、イソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド(略称IPTG)を添加することによって、タンパク質発現を誘導した。30℃で発現を4時間行った。遠心によって細胞を回収し、−80℃で保存するか、またはすぐに処理した。
「溶解および結合(lyse and bind)緩衝液」(50mM Na−リン酸、pH7.5、500mM NaCl、40mMイミダゾール)中、新鮮または凍結E.コリ(E.coli)細胞を氷上で再懸濁し、「フレンチプレス」(G.Heinemann,Schwabisch Gmund,Germany)細胞破壊装置を用いて溶解させた。「Ni−NTA Superflow」材料(Qiagen、Hilden,Germany)を用いて4℃で精製を行った。溶出緩衝液(50mM Na−リン酸、pH7.5、500mM NaCl、200mMイミダゾール)を用いて、段階溶出を行った。SDS−PAGE(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)を用いて分画を分析し、プールし、必要に応じて「Q Sepharose fast flow」材料(GE healthcare,Freiburg,Germany)を用いて「AKTA purifier」システム上で陰イオン−イオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製した。MALDI質量分析によってタンパク質同一性を確認し、的確な分画をプールし、濃縮し、再緩衝化した。25mM Na−リン酸、pH7.5、250mM NaCl、50%グリセロールからなる緩衝液中で精製タンパク質を−20℃で保存した。ウシ血清アルブミン(略称BSA)標準物質を用いてBCA−タンパク質アッセイ(Pierce/Perbio Science,Bonn,Germany)によってタンパク質濃度を評価した。
オリゴヌクレオチドにより形成される様々なタイプの基質複合体を用いて、全−L−ポリメラーゼXおよび全−L−ポリメラーゼXの変異体(実施例1参照)に対する活性アッセイを行ったが、この基質およびオリゴヌクレオチドはD−DNA−ヌクレオチドからなる。
Sekizakiら(Sekizakiら、1996)と同様に、tert−ブチルオキシカルボニル−保護4−グアニジノフェノールを合成した。これに従い、40mmole N,N’−Bis−(tert−ブチルオキシカルボニル)−S−メチルイソチオウレア(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Deutschland)および60mmole 4−アミノフェノール(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Deutschland)を500mL丸底フラスコ中、250mL THF中で溶解させた。この後、溶液にアルゴンを10分間吹き付け、CaCl2チューブで密封しながら120時間撹拌し続けた。
1mmole Z−D−Leu−OH(Bachem,Bubendorf,Switzerland)、0.9eq.TBTUおよび0.9eq.HO−Gp(Boc)2を10mL DMF中で溶解させた。2eq.DIPEAの添加後、溶液を2時間撹拌した。溶媒を蒸発させた後、DCMを用いて粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーで精製した。Z−D−Leu−OGp(Boc)2の純粋な分画を合わせ、溶媒を蒸発させた。
Barlosら(Barlosら、1989)により記載のように、0.10mmole TentaGel−R−Tritylレジン(Rapp Polymere,Tubingen,Deutschland)をFmoc−D−Ser(tBu)−OH(Bachem,Bubendorf,Switzerland)とともに載せた。したがって、0.10mmolレジンを0.6mmole塩化チオニルとともに、30分間、2回温置し、その後DCMで洗浄した。この後、6mL DCM中で、0.6mmole Fmoc−D−Ser(tBu)−OH、2.4mmol DIPEとともに90分間レジンを温置した。その後、DCM中の10%MeOH(v/v)、10%DIPEA(v/v)の溶液を用いて、レジンを10分間、3回ブロッキング処理し、DCMで洗浄した。FASTmocプロトコールとともにABI433(Applied Biosystems,Foster City,USA)を用いて、自動化合成を行った。NMP中9eq.HATUおよび20eq.DIPEAを用いて10eq.アミノ酸を活性化した。カップリング時間は45分間であり、NMP中20%(v/v)ピペリジン(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Deutschland)を用いてFmoc−脱保護化を7分間、3回行った。
6mL NMP中で45分間にわたり、5eq.アミノ酸、eq.4.9eq.HATUおよび10eq.DIPEAを用いて、Fmoc−D−Ala−OHを0.10mmole TentaGel−R−NH2レジン(Rapp Polymere,Tubingen,Deutschland)に充填した。その後に、レジンをTHFで洗浄した。80℃で2時間、THF中の4eq.Lawesson試薬と温置することによって、Fmoc−D−Ala−Ψ[CS−NH]−R−TentaGelへの変換を達成した。この後、レジンをNMPで洗浄した。その後、既に記載のとおり(実施例1.3参照)、そのように調製したレジンを自動化ペプチド合成において使用した。この後、Sharmaら(Sharmaら、2011)に従い、DMF中ヨウ化メチルと一晩温置することによって、対応するチオエステルを生成させた。レジンのろ過後、ペプチドチオエステルを含有する溶媒を蒸発させ、氷冷ジエチルエーテルを用いて残渣を沈殿させた。TFA中2.5%EDT、2.5%水、2.5%TISを用いて2時間にわたり、側鎖保護基の切断を行った。TFAの蒸発後、氷冷ジエチルエーテルでペプチドを沈殿させた。ACN/水勾配を用いて、C18カラム(Phenomenex,Aschaffenburg,Germany)上でペプチドチオエステルの逆相HPLC精製を行った。生成物を含有する分画を合わせ、凍結乾燥させた。
DCM中6eq.アミノ酸、6eq.MSNTおよび4.5eq MeImを用いて、0.10mmole TentaGel−R−PHBレジン(Rapp Polymere,Tubingen,Deutschland)にFmoc−D−Leu−OHを充填した。FASTmocプロトコールとともにABI433を用いて自動化合成を行った。NMP中9eq.HATUおよび20eq.DIPEAを用いて10eq.アミノ酸を活性化した。カップリング時間は45分間であり、NMP中20%(v/v)ピペリジンを用いて7分間にわたりFmoc−脱保護化を3回行った。42アミノ酸後、二重カップリング段階を行った。TFA中2.5%EDT、2.5%水、2.5%TISを用いて2時間にわたり、N末端Fmoc−保護化ペプチドの切断を達成した。TFAの蒸発後、氷冷ジエチルエーテルによりペプチドを沈殿させた。C18カラム上でACN/水勾配を用いて、粗製N末端保護化ペプチドの逆相HPLC精製を行った。生成物含有分画を合わせ、凍結乾燥させた。その後、Fmoc−保護化ペプチドを溶解させ、N末端Fmoc−基を切り離すために、DMF中20%ピペリン中で撹拌した。20分後、溶媒を蒸発させ、氷冷ジエチルエーテルを用いて残渣を沈殿させた。その後に、ACN/水勾配とともにC18カラムにより逆相HPLCを用いて、沈殿粗製ペプチドを精製した。生成物含有分画を合わせ、凍結乾燥させた。
2%TritonX100(Sigma Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Germany)を含有するリン酸ナトリウム緩衝液(100mM、pH8.5、100mM NaCl入り)中で、ペプチド1を0.2mMに、ペプチド2を0.6mMに溶解させた。20μMクロストリパイン(Endoprotease Arg−C,Worthington Biochemical Corporation,Lakewood,N.J.,USA)の添加後、反応混合物を37℃で一晩振盪した。沈殿ペプチドを遠心し、H20/ACN/ギ酸 60/40/0.5中で溶解させ、30分内の30%から60%の水中ACNの勾配でRP−18−カラム(Phenomenex,Aschaffenburg,Germany)を用いて、逆相HPLCによって精製した。生成物含有分画を合わせ、凍結乾燥させた。
6Mグアニジウム塩酸塩中で実施例3による乾燥全−DポリメラーゼX変異体V80Aを溶解させ、3,500分子量カットオフの市販の透析装置(Pierce/PerBio,Bonn,Germany)中での段階的な透析によって4℃で再折り畳みを行った。最終緩衝液は、50mMリン酸ナトリウム、500mM塩化ナトリウム、pH7.5であった。プレキャストゲル(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)上で標準的な一連の既知のタンパク質濃度を用いてドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)を行い、続いてSYPRO−RED染色(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)およびBioRad Fxスキャナー機器上での密度バンド分析を行うことによってタンパク質濃度を推定した。
33マー下鎖(lower strand)DNAオリゴヌクレオチドを2本の17マー上鎖(upper strand)DNAオリゴヌクレオチドとアニーリングさせ、その結果、上鎖(upper strand)で1ヌクレオチドギャップを生じさせることによって、基質を作製した。L−立体配置でオリゴヌクレオチドを合成した。アニーリング前に、Gamma−32P−アデノシン−三リン酸(Gamma−32P−ATP)およびT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いた標準的キナーゼ反応によって、32Pにより17マーの上鎖(upper strand)オリゴヌクレオチドMJ_1_58_MDをその5’−末端で放射性標識した。L−オリゴヌクレオチドMJ_1_58_MDのキナーゼ反応を促進するために、オリゴヌクレオチド合成中に、2つのD−立体配置グアノシン塩基を5’末端に付加した。65℃で10分間加熱し、ゆっくりと冷却することによって、10mM Tris−HCl、5mM MgCl2、pH8.0中でアニーリングを行った。NAP−カラム(GE healthcare,Freiburg,Germany)上での精製によって、組み込まれなかったgamma−32P−ATPを除去した。この複合体は、ギャップ内の鋳型位置でA、C、GまたはTの何れかを含有した。基質複合体の仕組みについては、図7参照。
33マー下鎖(lower strand)DNAオリゴヌクレオチドを2つの17マーおよび12−マー上鎖(upper strand)DNAオリゴヌクレオチドとアニーリングさせ、その結果上鎖(upper strand)において6ヌクレオチドのギャップを生じさせることによって、基質を作製した。L−立体配置でオリゴヌクレオチドを合成した。アニーリング前に、Gamma−32P−アデノシン−三リン酸(ATP)およびT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いた標準的なキナーゼ反応によって、17マー上鎖(upper strand)オリゴヌクレオチドMJ_1_58_MD(L−立体配置)をその5’−末端で32Pにより放射性標識した。L−オリゴヌクレオチドMJ_1_58_MDのキナーゼ反応を促進するために、オリゴヌクレオチド合成中に2つのD−立体配置グアノシン塩基を5’末端に付加した。65℃で10分間加熱し、ゆっくりと冷却することによって、10mM Tris−HCl、5mM MgCl2、pH8.0中で、アニーリングを行った。NAP−カラム(GE healthcare,Freiburg,Germany)上での精製によって、組み込まれなかったgamma−32P−ATPを除去した。基質複合体の仕組みについては、図9Aを参照。
アフリカブタ熱ウイルス(略称ASFV)からのポリメラーゼXは、ギャップ修復機能がある非常に離散性の高い酵素として文献(Oliveros,1997)に記載されている。実施例2で示されるように、全−L−ポリメラーゼXおよびそれらの変異体は、ギャップのある基質上でのそれぞれの開始後、非常に僅かなヌクレオチドのみの組み込みを触媒することが示された。ここで、発明者らは、全−L−ポリメラーゼXおよび変異体を用いてより長いDNAを合成することを可能にする方法を開示し、83マー鎖の完全な重合化を示す。
全−L−ポリメラーゼXおよびそれらの変異体の活性を試験するために、プライマー−鋳型複合体を使用した。全−L−ポリメラーゼXの変異体V80GおよびV80Aを試験するためにも同じ複合体を使用した。
活性アッセイにおいて、全−L−ポリメラーゼXまたは全−L−ポリメラーゼXの変異体V80GまたはV80AをD−立体配置プライマー−鋳型複合体と合わせた。典型的な6μLアッセイは、50nM基質複合体、1.3ng/μL以下の全−L−ポリメラーゼXまたは全−L−ポリメラーゼXの変異体V80GもしくはV80A、8μMの各D−dNTPおよび緩衝液(50mM Tris−HCl、10mM MgCl2、4%グリセロール、0.1mg/mLウシ血清アルブミン(BSA)、pH7.5)を含有した。Rovalab(Teltow,Germany)からD−dNTPを購入した。Pol−X試料に対して、温置時間は37℃で30分間であった。陰性対照として、基質を全−L−ポリメラーゼXまたは全−L−ポリメラーゼXの変異体V80GもしくはV80Aなし、およびデスオキシ−ヌクレオチド−三リン酸(D−dNTP)なしでも温置した。製造者により供給されたTaq緩衝液中0.083U/μLの最終濃度でTaqポリメラーゼ(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)を用いて陽性対照を遂行した。Taq試料を60℃で30分間温置した。アッセイ体積全体を試料緩衝液/色素と混合し、変性ゲル上で分離した。ゲルをBioRad Fxホスホイメージャーシステムを用いて読み取った。
開始後の全−L−ポリメラーゼXが僅か1個のヌクレオチドの組み込みを触媒し、次いでDNA基質上に留まりながら停止するという仮定のもと、発明者らは、全−L−ポリメラーゼXが鋳型から解離し、鋳型に再会合できるように、加熱パルス(50℃、2分間)を繰り返し行った。この温度サイクリング手順を繰り返して、発明者らは、全−L−ポリメラーゼXを用いて、83マーの完全な重合化を行うことができた。全−L−ポリメラーゼX試料に対する温度プロファイルを次のように行ったことを除き、一定温度に対して上に記載のように反応および対照を設定した:
5から25サイクルの(20℃で30分間//50℃で2分間)
次いで20℃で30分間の最終段階。
この実施例で開示される方法は、全−D立体配置ポリメラーゼを試験するためにL−立体配置基質を使用する。
活性アッセイにおいて、合成全−DポリメラーゼX変異体V80AをL−立体配置プライマー−鋳型複合体と合わせる。典型的な6μLアッセイは、50nM基質複合体、1.3ng/μL以下の全−DポリメラーゼX変異体、8μMの各L−dNTPおよび緩衝液(50mM Tris−HCl、10mM MgCl2、4%グリセロール、0.1mg/mLウシ血清アルブミン(BSA)、pH7.5)を含有する。L−dNTPをRasayan,Inc.(Encinitas,CA,USA)から購入した。温置時間は37℃で少なくとも30分間である。陰性対照として、基質をまた、ポリメラーゼなし、およびデスオキシ−ヌクレオチド−三リン酸(L−dNTP)なしでも温置する。アッセイ体積全体を試料緩衝液/色素と混合し、変性ゲル上で分離する。ゲルはBioRad Fxホスホイメージャーシステムを用いて読み取る。
実施例5と同様に、全−DポリメラーゼX変異体V80Aによる83マーL−基質の全長全重合化を可能にするために温度サイクリング手順を繰り返す。温度プロファイルを次のように行ったことを除き、一定温度に対して上で記載されるように反応および対照を設定する:
5から25サイクルの(20℃で30分間//50℃で2分間)
次いで20℃で30分間の最終段階。
ポリメラーゼDpo4は元来、スルホロブス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)(略称Sso)(Boudsocq,2001)で発見された。この野生型遺伝子は、開始コドンおよび終止コドンを含む1,059塩基対のオープンリーディングフレーム(略称ORF)を有する。コードされるタンパク質の長さは、352アミノ酸である。この例は、ポリメラーゼDpo4およびポリメラーゼDpo4の変異体がどのようにE.コリ(E.coli)において発現されて、Strep−Tagを用いて精製されたかを説明する。
Ssoのコドン使用はE.コリ(E.coli)とは異なるので、野生型SsoポリメラーゼDpo4に対するE.コリ(E.coli)−コドン最適化合成遺伝子をGeneArt AG(Regensburg,Germany)から購入した。合成遺伝子配列は、pENTRY−IBA10ベクター(元の会社:IBA GmbH,Gottingen,Germany)において提供された。開始コドンを含むが終止コドンを含まないコドン最適化オープンリーディングフレームは、次の配列を有した:ATGATTGTGCTGTTTGTGGATTTTGATTATTTTTATGCCCAGGTGGAAGAAGTTCTGAATCCGAGCCTGAAAGGTAAACCGGTTGTTGTTTGTGTTTTTAGCGGTCGCTTTGAAGATAGCGGTGCAGTTGCAACCGCCAATTATGAAGCCCGTAAATTTGGTGTTAAAGCCGGTATTCCGATTGTTGAAGCCAAAAAAATTCTGCCGAATGCAGTTTATCTGCCGATGCGCAAAGAAGTTTATCAGCAGGTTAGCAGCCGTATTATGAATCTGCTGCGCGAATATAGCGAAAAAATTGAAATTGCCAGCATTGATGAAGCCTATCTGGATATTAGCGATAAAGTGCGCGATTATCGCGAAGCATATAATCTGGGCCTGGAAATTAAAAATAAAATCCTGGAAAAAGAAAAAATTACCGTGACCGTGGGCATTAGCAAAAATAAAGTGTTTGCCAAAATTGCAGCAGATATGGCAAAACCGAATGGCATTAAAGTGATTGATGATGAAGAAGTGAAACGTCTGATTCGCGAACTGGATATTGCAGATGTTCCGGGTATTGGCAATATTACCGCAGAAAAACTGAAAAAACTGGGCATTAATAAACTGGTTGATACCCTGAGCATTGAATTTGATAAACTGAAAGGCATGATTGGTGAAGCGAAAGCCAAATATCTGATTAGCCTGGCACGTGATGAATATAATGAACCGATTCGTACCCGTGTTCGTAAAAGCATTGGTCGTATTGTGACCATGAAACGCAATAGCCGTAATCTGGAAGAAATTAAACCGTACCTGTTTCGTGCAATTGAAGAAAGCTATTATAAACTGGATAAACGCATTCCGAAAGCCATTCATGTTGTTGCAGTTACCGAAGATCTGGATATTGTTAGCCGTGGTCGTACCTTTCCGCATGGTATTAGCAAAGAAACCGCCTATAGCGAAAGCGTTAAACTGCTGCAGAAAATCCTGGAAGAAGATGAACGTAAAATTCGTCGTATTGGTGTGCGCTTTAGCAAATTTATTGAAGCCATTGGCCTGGATAAATTTTTTGATACC。
発現コンストラクトpMJ343を用いて、E.コリ(E.coli)において全−L−ポリメラーゼDpo4を発現させた。pMJ361、pMJ362、pMJ363、pMJ365、pMJ502、pMJ503またはpMJ504から、全−L−ポリメラーゼDpo4の突然変異の変異体を発現させた。発現のために、「Transformation and Storage Solution」(Epicentre/Biozym,Hessisch Oldendorf,Germany)を用いて、E.コリ(E.coli)株「NEB express」(New England Biolabs,Frankfurt am Main,Germany)において適切な発現コンストラクトを形質転換し、抗生物質アンピシリンを用いて維持した。誘導因子として200ng/mLアンヒドロテトラサイクリン(IBA GmbH,Gottingen,Germany)を用いて、培地「EnBase Flo」または「EnPresso」(BioSilta,Oulu,Finland)中で30℃にて48時間、発現を行った。遠心によって細胞を回収し、−80℃で保存するかまたはすぐに処理した。
「緩衝液W」(100mM Tris−HCl、pH8.0、150mM NaCl、1mM EDTA)中で新鮮または凍結E.コリ(E.coli)細胞を氷上で再懸濁し、「フレンチプレス」(G.Heinemann,Schwabisch Gmund,Germany)細胞破壊装置を用いて溶解させた。5mL StrepTrap HPカラム(GE healthcare,Freiburg,Germany)を備えた「AKTA express」システム上で4℃で精製を行った。2.5mMデスチオビオチン(IBA GmbH,Gottingen,Germany)を含む緩衝液Wを用いて段階溶出を行った。SDS−PAGE(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)を用いて分画を分析し、プールし、必要に応じて、「Q HP」カラム(GE healthcare,Freiburg,Germany)を備えた「AKTA精製装置」システム上で陰イオン−イオン交換クロマトグラフィーでさらに精製した。LC−MS質量分析によってタンパク質同一性を確認し、的確な分画をプールし、濃縮し、10,000分子量カットオフ(MWCO)のVivaSpin 15R濃縮装置(VivaSciences/Sartorius Stedim Biotech,Gottingen,Germany)を用いて再緩衝化した。100mM KCl、10mM Tris−HCl pH7.4、0.1mM EDTA、1mM DTT、50%グリセロールからなる緩衝液中で、精製タンパク質を−20℃で保存した。SDS−PAGE上でウシ血清アルブミン(略称BSA)標準物質を用い、SYPRO Red(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)で染色して、ゲル密度測定によって、タンパク質濃度を推定した。
全−LポリメラーゼDpo4の長さは352アミノ酸である。全−LポリメラーゼDpo4を化学的に作製するために、固相ペプチド合成により合成され得るより短い断片から、このような合成全−LポリメラーゼDpo4を組み立てなければならず、このより短い断片は、ネイティブ化学ライゲーションなどのペプチドライゲーション法によってライゲーションしなければならなかった。この例は、合成全−L−ポリメラーゼDpo4を得るためにネイティブ化学ライゲーションによって、Dpo4のライゲーション断片1−154、155−352、155−202および203−352が、E.コリ(E.coli)でどのように発現され、精製され、互いに対してライゲーションされているかを説明する。
実施例7で開示されるように、市販ソースから合成遺伝子コンストラクトとして全−L−ポリメラーゼDpo4に対する遺伝子を得た(GeneArt,Regensburg,Germany)。そのコドン最適化配列に基づいてこの実施例の全ての断片をクローニングした。全−L−ポリメラーゼDpo4変異体A155Cの断片1−154、155−352、155−202および203−352に対する次の発現コンストラクトを作製した:
このコンストラクトは、全−L−ポリメラーゼDpo4変異体A155Cの断片1−154、続いてMxe GyrAインテインを含有し、チオエステルおよびキチン−結合ドメイン(CBD)を生成させるためにこれを使用した。2つのPCR生成物からコンストラクトを組み立てた。全−L−ポリメラーゼDpo4変異体A155Cの断片1−154を増幅するために鋳型としてのpMJ343およびプライマーMJ_1_90_DD(5’−リン酸−AGCGGCTCTTCGATGATTGTGCTGTTTGTGGATTTT−3’)およびMJ_1_91_DD(5’−リン酸−AGCGGCTCTTCGGCATGCAATTTTGGCAAACACTTT−3’)を用いて、PCR生成物1を作製した。Mxe Gyr AインテインおよびCBDを増幅するために鋳型としてのpTWIN1(New England Biolabs,Frankfurt am Main,Germany)およびプライマーMJ_1_72_DD(5’−リン酸−AGCGGCTCTTCGTGCATCACGGGAGAT−3’)およびMJ_1_73_DD(5’−リン酸−AGCGGCTCTTCGCCCTTGAAGCTGCCACAAGGCAGGAACGTT−3’)を用いて、PCR生成物2を作製した。プライマーMJ_1_90_DDおよびMJ_1_91_DDは、Purimex(Grebenstein,Germany)由来であり、一方でプライマーMJ_1_72_DDおよびMJ_1_73_DDは、IBA GmbH(Gottingen,Germany)由来であった。フラッシュゲル系(LONZA,Basel,Switzerland)上で2つのPCR生成物をゲル精製し、StarGate Mutagenesis ENTRYクローニングキット(IBA GmbH,Gottingen,Germany)を用いてpENTRY−IBA20において一緒にクローニングし、その結果、pMJ366が得られた。StarGate Transferクローニングキット(IBA GmbH,Gottingen,Germany)を用いたpASG−IBAwt1(IBA GmbH,Gottingen,Germany)におけるpMJ366からのサブクローニングによって、pMJ370が得られた。コンストラクトpMJ370は、(インテイン切断/チオエステル産生後)154アミノ酸長の次のタンパク質配列とともに、全−L−ポリメラーゼDpo4変異体A155Cの断片1−154−チオエステルをコードする:MIVLFVDFDYFYAQVEEVLNPSLKGKPVVVCVFSGRFEDSGAVATANYEARKFGVKAGIPIVEAKKILPNAVYLPMRKEVYQQVSSRIMNLLREYSEKIEIASIDEAYLDISDKVRDYREAYNLGLEIKNKILEKEKITVTVGISKNKVFAKIA−チオエステル。
このコンストラクトは、「Profinity eXact」タグと、それに続く全−L−ポリメラーゼDpo4変異体A155Cの断片155−352を含有する。「Profinity eXact」タグを精製およびタンパク質分解性切断のために使用した。2つのPCR生成物からコンストラクトを組み立てた。「Profinity eXact」タグを増幅するために鋳型としてのpPAL7(Bio−Rad,Munchen,Germany)およびプライマーMJ_1_99_DD(5’−リン酸−AGCGGCTCTTCGATGGGAGGGAAATCAAACGGGGAA−3’)およびMJ_1_100_DD(5’−リン酸−AGCGGCTCTTCGGCACAAAGCTTTGAAGAGCTTGTC−3’)を用いて、PCR生成物1を作製した。A155C突然変異を含有するdpo4断片155−352を増幅するために鋳型としてのpMJ361およびプライマーMJ_1_96_DD(5’−リン酸−AGCGGCTCTTCGTGCGATATGGCAAAACCGAATGGCATTAAA−3’)およびMJ_1_97_DD(5’−リン酸−AGCGGCTCTTCGCCCTTAGGTATCAAAAAATTTATCCAGG−3’)を用いて、PCR生成物2を作製した。プライマーMJ_1_96_DD、MJ_1_97_DD、MJ_1_99_DDおよびMJ_1_100_DDは全て、Purimex(Grebenstein,Germany)由来であった。フラッシュゲルシステム(LONZA,Basel,Switzerland)上で2つのPCR生成物をゲル精製し、StarGate Mutagenesis ENTRYクローニングキット(IBA GmbH,Gottingen,Germany)を用いてpENTRY−IBA20と一緒にクローニングし、pMJ382が得られた。StarGate Transferクローニングキット(IBA GmbH,Gottingen,Germany)を用いたpASG−IBA5(IBA GmbH,Gottingen,Germany)中のpMJ382からのサブクローニングによって、pMJ384が得られた。コンストラクトpMJ384は、(タンパク質分解性切断後)198アミノ酸長の次のタンパク質配列とともに突然変異A155Cを含有する全−L−ポリメラーゼDpo4の断片155−352をコードする:CDMAKPNGIKVIDDEEVKRLIRELDIADVPGIGNITAEKLKKLGINKLVDTLSIEFDKLKGMIGEAKAKYLISLARDEYNEPIRTRVRKSIGRIVTMKRNSRNLEEIKPYLFRAIEESYYKLDKRIPKAIHVVAVTEDLDIVSRGRTFPHGISKETAYSESVKLLQKILEEDERKIRRIGVRFSKFIEAIGLDKFFDT。
このコンストラクトは、「Profinity eXact」タグとそれに続く、突然変異V203Cを含有するdpo4断片203−352を含有する。「Profinity eXact」タグを精製およびタンパク質分解性切断のために使用した。2つのPCR生成物からコンストラクトを組み立てた。「Profinity eXact」タグを増幅するために鋳型としてのpPAL7(Bio−Rad,Munchen,Germany)およびプライマーMJ_1_99_DD(5’−リン酸−AGCGGCTCTTCGATGGGAGGGAAATCAAACGGGGAA−3’)およびMJ_1_100_DD(5’−リン酸−AGCGGCTCTTCGGCACAAAGCTTTGAAGAGCTTGTC−3’)を用いてPCR生成物1を作製した。V203C突然変異を含有するdpo4断片203−352を増幅するために鋳型としてのpMJ362およびプライマーMJ_1_98_DD(5’−リン酸−AGCGGCTCTTCGTGTGATACCCTGAGCATTGAATTT−3’)およびMJ_1_97_DD(5’−リン酸−AGCGGCTCTTCGCCCTTAGGTATCAAAAAATTTATCCAGG−3’)を用いてPCR生成物2を作製した。プライマーMJ_1_97_DD、MJ_1_98_DD、MJ_1_99_DDおよびMJ_1_100_DDは全てPurimex(Grebenstein,Germany)由来であった。フラッシュゲルシステム(LONZA,Basel,Switzerland)上で2つのPCR生成物をゲル精製し、StarGate Mutagenesis ENTRYクローニングキット(IBA GmbH,Gottingen,Germany)を用いてpENTRY−IBA20中で一緒にクローニングし、その結果、pMJ383が得られた。StarGate Transferクローニングキット(IBA GmbH,Gottingen,Germany)を用いたpASG−IBA5(IBA GmbH,Gottingen,Germany)中のpMJ383からのサブクローニングによって、pMJ385が得られた。コンストラクトpMJ385は、(タンパク質分解性切断後)150アミノ酸長の次のタンパク質配列とともにdpo4断片203−352 V203Cをコードする:CDTLSIEFDKLKGMIGEAKAKYLISLARDEYNEPIRTRVRKSIGRIVTMKRNSRNLEEIKPYLFRAIEESYYKLDKRIPKAIHVVAVTEDLDIVSRGRTFPHGISKETAYSESVKLLQKILEEDERKIRRIGVRFSKFIEAIGLDKFFDT。
このコンストラクトは、dpo4断片155−202とそれに続く、チオエステルを生成させるために使用したMxe GyrAインテインおよびキチン−結合ドメイン(CBD)を含有する。2つのPCR生成物からコンストラクトを組み立てた。dpo4 155−202断片を増幅するために鋳型としてのpMJ343およびプライマーMJ_1_101_DD(5’−リン酸−AGCGGCTCTTCGATGGCAGATATGGCAAAACCGAAT−3’)およびMJ_1_102_DD(5’−リン酸−AGCGGCTCTTCGGCACAGTTTATTAATGCCCAGTTT−3’)を用いてPCR生成物1を構築した。Mxe Gyr AインテインおよびCBDを増幅させるために鋳型としてのpTWIN1(New England Biolabs,Frankfurt am Main,Germany)およびプライマーMJ_1_72_DD(5’−リン酸−AGCGGCTCTTCGTGCATCACGGGAGAT−3’)およびMJ_1_73_DD(5’−リン酸−AGCGGCTCTTCGCCCTTGAAGCTGCCACAAGGCAGGAACGTT−3’)を用いてPCR生成物2を作製した。プライマーMJ_1_101_DDおよびMJ_1_102_DDは、Purimex(Grebenstein,Germany)由来であり、一方、プライマーMJ_1_72_DDおよびMJ_1_73_DDはIBA GmbH(Gottingen,Germany)由来であった。フラッシュゲルシステム(LONZA,Basel,Switzerland)上で2つのPCR生成物をゲル精製し、StarGate Mutagenesis ENTRYクローニングキット(IBA GmbH,Gottingen,Germany)を用いてpENTRY−IBA20中で一緒にクローニングし、その結果、pMJ386が得られた。StarGate Transferクローニングキット(IBA GmbH,Gottingen,Germany)を用いたpASG−IBAwt1(IBA GmbH,Gottingen,Germany)中でのpMJ386からのサブクローニングによって、pMJ388が得られた。コンストラクトpMJ388は、dpo4断片155−202とそれに続く(最初のメチオニンのE.コリ(E.coli)介在切断後およびインテイン切断/チオエステル産生後)48アミノ酸長のタンパク質配列をコードする:ADMAKPNGIKVIDDEEVKRLIRELDIADVPGIGNITAEKLKKLGINKL−チオエステル。
発現のために、「Transformation and Storage Solution」(Epicentre/Biozym,Hessisch Oldendorf,Germany)を用いてE.コリ(E.coli)株「NEB EXPRESS」(New England Biolabs,Frankfurt am Main,Germany)中で適切な発現コンストラクトを形質転換し、抗生物質アンピシリンを用いて維持した。誘導因子として200ng/mLアンヒドロテトラサイクリン(IBA GmbH,Gottingen,Germany)を用いて、一晩、周囲温度で培地「EnBase Flo」または「EnPresso」(BioSilta,Oulu,Finland)中で発現を行った。遠心によって細胞を回収し、−80℃で保存するかまたはすぐに処理した。
「カラム緩衝液」(20mM HEPES、pH8.5、500mM NaCl)中で新鮮または凍結E.コリ(E.coli)細胞を氷上で再懸濁し、「フレンチプレス」(G.Heinemann,Schwabisch Gmund,Germany)細胞破壊装置を用いて溶解させた。キチン結合ビーズを含有するカラム(New Englands Biolabs,Frankfurt am Main,Germany)を備えた「AKTA express」システム(GE healthcare,Freiburg,Germany)」上で4℃で精製を行った。細胞溶解液を適用し、ベースラインまでカラム緩衝液で洗浄した後、インテイン介在性タンパク質切断およびチオエステル形成を誘導するために、カラム緩衝液中の50mM 2−メルカプトエタンスルホネート(略称MESNA)とともにカラムを4℃で20時間温置した。チオエステルを担う切断タンパク質をカラム緩衝液でカラムから洗い流し、濃縮し、5mM Bis−Tris、pH6.5、250mM NaClからなる緩衝液中でBioGel P60媒体材料(BioRad,Munchen,Germany)を用いてゲルろ過に供した。SDS−PAGE上でウシ血清アルブミン(BSA)標準物質を用い、SYPRO Red(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)で染色して、ゲル密度測定によってタンパク質濃度を推定した。LC−MS質量分析によって、タンパク質の正体およびチオエステルの存在を確認した。
次のとおり、pMJ384からの全−L−ポリメラーゼDpo4変異体A155Cの断片155−352の精製を行った:「緩衝液W」(100mM Tris−HCl、pH8.0、150mM NaCl、1mM EDTA)中で新鮮または凍結E.コリ(E.coli)細胞を氷上で再懸濁し、「フレンチプレス」(G.Heinemann,Schwabisch Gmund,Germany)細胞破壊装置を用いて溶解させた。5mL StrepTrap HPカラム(GE healthcare,Freiburg,Germany)を備えた「AKTA express」システム上で4℃で精製を行った。2.5mMデスチオビオチン(IBA GmbH,Gottingen,Germany)を含む緩衝液Wを用いて段階溶出を行った。HiPrep26/10脱塩カラム(GE healthcare,Freiburg,Germany)を用いた「Profinity eXact溶出緩衝液」(0.1M Na−リン酸、pH7.2、0.1M NaF)中での緩衝液交換に、溶出タンパク質を供し、次いでゆっくりとProfinity eXactカラムに注入した。試料を濃縮し、1mMの最終濃度になるまでTris(2−カルボキシエチル)ホスフィン)(TCEP)を供給し、5mM Bis−Tris、pH6.5、250mM NaClからなる緩衝液で展開されるHiLoad 16/60 Superdex 75調製グレードカラム(GE healthcare,Freiburg,Germany)を用いてゲルろ過に適用した。タンパク質を濃縮し、−80℃で保存した。SDS−PAGE上でウシ血清アルブミン(BSA)標準物質を用い、SYPRO Red(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)で染色して、ゲル密度測定によってタンパク質濃度を推定した。LC−MS質量分析によってタンパク質同一性を確認した。
次のとおりpMJ385からのdpo4断片203−352 V203Cの精製を行った:封入体を調製し、「i−FOLDタンパク質再折り畳み系」マニュアル(Novagen/Merck−Millipore,Darmstadt,Germany)に記載のとおり変性させた。Sephadex G−25微細物質(GE healthcare,Freiburg,Germany)を用いて、可溶化タンパク質を「緩衝液W」(100mM Tris−HCl、pH8.0、150mM NaCl、1mM EDTA)への緩衝液交換に供し、StrepTrap HPカラム(GE healthcare,Freiburg,Germany)を備えた「AKTA express」システム上で4℃で精製した。2.5mMデスチオビオチン(IBA GmbH,Gottingen,Germany)を含む緩衝液Wで段階溶出を行った。0.1Mの最終濃度まで溶出タンパク質溶液にNaFを供給し、1mMの最終濃度になるようにTris(2−カルボキシエチル)ホスフィン)(TCEP)を供給し、次いでProfinity eXactカラム中にゆっくりと注入した。脱イオン化水でフロースルーを1:3希釈し、HClを用いてpHを7.2に調整した。「緩衝液A」(50mM Na−リン酸、pH7.2、1mM 2−メルカプトエタノール)中で平衡化したHiTrap SP HPカラム(GE healthcare,Freiburg,Germany)を用いて陽イオン交換−クロマトグラフィーによって試料をさらに精製した。17%、25%および100%の「緩衝液B」(50mM Na−リン酸、pH7.2、1M NaCl、1mM 2−メルカプトエタノール)を用いて段階溶出を行った。分画をプールし、濃縮し、脱イオン化水中で展開させるHiLoad 16/60 Superdex 75調製グレードカラム(GE healthcare,Freiburg,Germany)を用いてゲルろ過に適用した。液体窒素中でタンパク質を瞬間凍結し、凍結乾燥させた。SDS−PAGE上でのウシ血清アルブミン(BSA)標準物質を用い、SYPRO Red(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)で染色して、ゲル密度測定によってタンパク質濃度を推定した。LC−MS質量分析によってタンパク質同一性を確認した。
2%Triton X100、1%チオフェノールおよび5mM TRIS(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩を含有するTRIS−緩衝液(pH8.6)中で全−L−ポリメラーゼDpo4変異体A155Cの断片1−154−チオエステルおよび155−352を50μMで溶解させた。反応混合物を室温により72時間振盪した。その後、ライゲーションの成功をSDS−PAGE(図11A)およびLC−ESI−質量分析(RP18−カラム、20分間の0.1%TFA 5−95%での水中0.1%TFAによるACN勾配、図11B)により分析した。41kDa前後でレーンにおいて明確なバンドが見出され、このことから、全長ポリメラーゼが示された。理論分子量(Mtheor=40223Da)は、ESI−MSにより示される場合の、実測分子量(Mobs=40265Da)と一致する。
2%SDS、1%チオフェノールおよび5mMトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩を含有するTRIS−緩衝液(pH8.6)中で、全−L−ポリメラーゼDpo4の断片155−202−チオエステルおよび203−352 V203Cを0.2Mで溶解させた。室温によって反応混合物を72時間振盪した。SDS−PAGE(図20A)およびLC−ESI−質量分析(RP18−カラム、20分間の0.1%TFA 5−95%での水中0.1%TFAによるACN勾配、図20B)によって、ライゲーションの成功の分析を行った。レーン7で21.5kDa前後で明確なバンドが見出され、これによりライゲーション生成物が示された。理論分子量(Mtheor=22749Da)は、ESI−MSによって示される場合の、実測分子量(Mobs=22769Da)と一致する。
この実施例は、全−L−ポリメラーゼDpo4および実施例7による全−L−ポリメラーゼDpo4の変異体に対する、および実施例8による合成全−L−ポリメラーゼDpo4に対するPCR活性試験を記載する。
PCR反応のための鋳型は、83マー1本鎖D−DNAオリゴヌクレオチド(MJ_1_1_DD)であり、これにより第一の温度サイクルにおいて逆の鎖が生成する。その後、両鎖を指数関数的増幅のための鋳型とする。D−立体配置で、NOXXONにおいて、鋳型DNAオリゴヌクレオチドおよびDNAプライマーを合成する。
15μLPCR反応は、各0.2mMの4種類のD−dNTP、10nM 83マーssDNA(MJ_1_1_DD)鋳型、1μMのフォワードおよびリバースプライマー、1x ThermoPol緩衝液(Invitrogen、20mMトリス−HCl、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1%Triton X−100、pH8.8@25℃)および少なくとも0.67ng/μLの全−L−ポリメラーゼDpo4または全−L−ポリメラーゼDpo4の変異体または合成全−L−ポリメラーゼDpo4を含有した。フォワードプライマーはDE4.40T7であり、リバースプライマーはDE4.40Rであり、102塩基対長のPCR生成物が得られる。Rovalab(Teltow,Germany)からD−dNTPを購入した。全−L−ポリメラーゼDpo4または全−L−ポリメラーゼDpo4の変異体または合成全−L−ポリメラーゼDpo4を省くことによって陰性対照を遂行した。市販の全−L−dpo4(New England Biolabs,Frankfurt am Main,Germany)を用いて陽性対照を遂行した。
全−L−ポリメラーゼDpo4、全−L−ポリメラーゼDpo4の変異体A155C、V203C、C31S、A155C/V203C、S85C、S86C、S96Cおよび合成全−L−ポリメラーゼDpo4を試験した。試験したポリメラーゼは全て、PCR反応において鋳型鎖を増幅することができた。図12Aは、全−L−ポリメラーゼDpo4の変異体A155C、V203C、C31S、A155C/V203Cを用いて行ったPCR反応の分析を示し、これら全てが、DNA標準物質ラダーと比較した場合に約100bpの範囲となるバンドを示した。予想されたPCR生成物サイズは102塩基対であった。このバンドはポリメラーゼがない陰性対照では現れない。またこの102bpバンドは、83マー鋳型より高く移動する。図12Bは、組み換え全−L−ポリメラーゼdpo4を用い、断片のライゲーションにより作製された合成全−L−ポリメラーゼdpo4を使用して行ったPCR反応の分析を示す。ゲルは、DNA標準物質ラダーと比較した場合に約100bpの範囲となるバンドを示した。予想されたPCR生成物サイズは102塩基対であった。ポリメラーゼがない陰性対照においてこのバンドは非常に弱い。図12Bからのレーン2および3を比較した場合に見ることができるように、組み換え全−L−ポリメラーゼdpo4および合成全−L−ポリメラーゼdpo4は、同一の活性を示す。
本実施例中では、全−DポリメラーゼDpo変異体A155C/V203Cの合成を記載する。全−DポリメラーゼDpo変異体A155C/V203Cのアミノ酸配列は、Ac−MIVLFVDFDYFYAQVEEVLNPSLKGKPVVVCVFSGRFEDSGAVATANYEARKFGVKAGIPIVEAKKILPNAVYLPMRKEVYQQVSSRIMNLLREYSEKIEIASIDEAYLDISDKVRDYREAYNLGLEIKNKILEKEKITVTVGISKNKVFAKIACDMAKPNGIKVIDDEEVKRLIRELDIADVPGIGNITAEKLKKLGINKLCDTLSIEFDKLKGMIGEAKAKYLISLARDEYNEPIRTRVRKSIGRIVTMKRNSRNLEEIKPYLFRAIEESYYKLDKRIPKAIHVVAVTEDLDIVSRGRTFPHGISKETAYSESVKLLQKILEEDERKIRRIGVRFSKFIEAIGLDKFFDT−OHである。
1mmole Z−D−Met−OH、0.9eq.TBTUおよび0.9mmol HO−Gp(Boc)2を10mL DMF中で溶解させた。2eq.DIPEAの添加後、溶液を2時間撹拌した。溶媒を蒸発させた後、DCMを用いてフラッシュクロマトグラフィーにより粗生成物を精製した。Z−D−Met−OGp(Boc)2の純粋な分画を合わせ、溶媒を蒸発させた。
6mL NMP中で45分間、5eq.アミノ酸、eq.4.9eq.HATUおよび10eq DIPEAを用いて、Fmoc−脱保護後に、Fmoc−D−Thr(tBu)−OHを0.1mmole Fmoc−Sieber rink アミドNovaSynTGレジンに充填した。
Barlosら(Barlosら、1989)により記載されるように、0.10mmole TentaGel−R−TritylレジンにFmoc−D−Gly−OHを充填した。したがって、0.6mmoleの塩化チオニルとともに0.10mmolレジンを30分間、2回温置し、その後にDCMで洗浄した。この後、6mLDCM中の0.6mmole Fmoc−Gly−OH、2.4mmol DIPEAとともにレジンを90分間温置した。その後、DCM中10%MeOH(v/v)、10%DIPEA(v/v)の溶液を用いて、レジンを10分間、3回ブロッキング処理し、DCMで洗浄した。FASTmocプロトコールによりABI433を用いて自動化合成を行った。NMP中9eq.HATUおよび20eq.DIPEAを用いて10eq.アミノ酸を活性化した。カップリング時間は45分間であり、NMP中20%(v/v)ピペリジンを用いてFmoc−脱保護化を7分間、3回行った。39アミノ酸のカップリング後、二重カップリングを行った。
Barlosら(Barlosら、1989)に記載のように、Fmoc−D−Leu−OHを0.10mmole TentaGel−R−Tritylレジンに充填した。したがって、0.6mmole塩化チオニルとともに0.10mmolレジンを30分間、2回温置し、その後にDCMで洗浄した。この後、6mL DCM中の0.6mmole Fmoc−D−Leu−OH、2.4mmol DIPEAとともにレジンを90分間温置した。その後、DCM中10%MeOH(v/v)、10%DIPEA(v/v)の溶液を用いて、レジンを10分間、3回ブロッキング処理し、DCMで洗浄した。FASTmocプロトコールによりABI433を用いて自動化合成を行った。NMP中9eq.HATUおよび20eq.DIPEAを用いて、10eq.アミノ酸を活性化した。カップリング時間は45分間であり、NMP中20%(v/v)ピペリジンを用いてFmoc−脱保護化を7分間、3回行った。
6mL NMP中で、45分間、5eq.アミノ酸、eq.4.9eq.HATUおよび10eq.DIPEAを用いて、0.10mmole TentaGel−R−NH2レジンにFmoc−D−Ala−OHを充填した。その後に、レジンをTHFで洗浄した。2時間にわたり、80℃でTHF中4eq.Lawesson試薬との温置によって、Fmoc−D−Ala−Ψ[CS−NH]−R−TentaGelへの変換を達成した。この後、レジンをNMPで洗浄した。その後に、このように調製したレジンを既に記載のように自動化ペプチド合成において使用した(ABI433、FASTmocプロトコール、NMP中9eq.HATUおよび20eq.DIPEAを用いて10eq.アミノ酸を活性化し;カップリング時間は45分間であり、NMP中20%(v/v)ピペリジンによって7分間、Fmoc−脱保護化を3回行った。)。44カップリングアミノ酸の後、二重カップリング段階を行った。
0.10mmole TentaGel−R−Tritylレジンに、Barlosら(Barlosら、1989)に記載のようにFmoc−D−Pro−OHを充填した。したがって、0.6mmole塩化チオニルとともに30分間、2回、0.10mmolレジンを温置し、その後に、DCMで洗浄した。この後、6mL DCM中0.6mmole Fmoc−D−Pro−OH、2.4mmol DIPEAとともに、レジンを90分間温置した。その後、DCM中10%MeOH(v/v)、10%DIPEA(v/v)の溶液を用いて、レジンを10分間、3回ブロッキング処理し、DCMで洗浄した。FASTmocプロトコールによってABI433を用いて自動化合成を行った。NMP中9eq.HATUおよび20eq.DIPEAを用いて10eq.アミノ酸を活性化した。カップリング時間は45分間であり、NMP中20%(v/v)ピペリジンによって、7分間、3回、Fmoc−脱保護化を行った。46アミノ酸のカップリング後、二重カップリングを行った。DMF中10%(v/v)無水酢酸および10%(v/v)DIPEAを用いてN−末端のアセチル化を10分間、3回行った。
ペプチド7とのペプチド6のプロテアーゼ−触媒ライゲーションによる、全−D−ペプチド、Ac−MIVLFVDFDYFYAQVEEVLNPSLKGKPVVVCVFSGRFEDSGAVATANYEARKFGVKAGIPIVEAKKILPNAVYLPMRKEVYQQVSSRIMNLLREYSEKIEIASIDEAYLDISDKVRDYREAYNLGLEIKNKILEKEKITVTVGISKNKVFAKIA−SMe(8)の合成
4M尿素を含有するリン酸ナトリウム緩衝液(100mM、pH8.5、100mM NaCl入り)中で、ペプチド6を0.2mMに溶解させ、ペプチド7を0.6mMに溶解させた。20μMクロストリパイン(エンドプロテアーゼArg−C、Worthington Biochemical Corporation,Lakewood,N.J.,USA)の添加後、反応混合物を37℃で一晩振盪した。沈殿ペプチドを遠心し、H20/ギ酸 80/20中で溶解させ、30分内で5%から95%の水中ACN勾配でRP−18−カラム(Phenomenex,Aschaffenburg,Germany)を用い、逆相HPLCによって精製する。最終ペプチドをSDS−PAGE(図19A)およびESI−質量分析(図19B)により分析した。レーン1で14,4kDaと21.5kDaとの間でバンドが見られ、ライゲーション生成物が示された。ライゲーション生成物の理論分子量(Mtheor=17476Da)は、ESI−MSにより示されるように実測分子量(Mobs=17486Da)と一致する。
2%Triton X100、1%チオフェノールおよび5mMトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩を含有するトリス−緩衝液(pH8.6)中で、ペプチド5および8の両方を0.2Mに溶解させる。反応混合物を室温により72時間振盪する。その後、逆相HPLCにより混合物を精製し、SDS−PAGE、逆相UPLCおよびESI−質量分析により分析する。ライゲーション生成物の正確な質量が分かる。
この実施例は、実施例10による全−DポリメラーゼDpo4変異体A155C/V203Cに対するPCR活性試験を記載する。
驚くべきことに、合成全−DポリメラーゼDpo4変異体A155C/V203Cは、余分な再折り畳みを行うことなく活性であり、したがって、さらなる再折り畳み手順なく使用される。プレキャストゲル(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)上でのドデシル硫酸ナトリウム(略称SDS)ポリアクリルアミドゲル電気泳動(略称PAGE)により、標準的な一連の既知のタンパク質濃度を用い、その後SYPRO−RED染色(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)およびBioRad Fxスキャナー機器上での密度バンド分析を行うことによって、タンパク質濃度を推定する。
PCR反応に対する鋳型は、83マー1本鎖L−DNAオリゴヌクレオチド(MJ_1_105_LD)であり、そこから、第一の温度サイクルにおいて逆鎖が生成される。その後、両鎖を指数関数的増幅に対する鋳型とする。NOXXONにおいてL−立体配置で鋳型DNAオリゴヌクレオチドおよびDNAプライマーを合成する。
15μLPCR反応は、各0.2mMの4種類のL−dNTP、10nM 83マーssDNA(MJ_1_105_LD)鋳型、1μMのフォワードおよびリバースプライマー、1x ThermoPol緩衝液(Invitrogen、20mMトリス−HCl、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1%Triton X−100、pH8.8@25℃)および少なくとも0.67ng/μLの全−DポリメラーゼDpo4変異体A155C/V203Cを含有する。フォワードプライマーは、MJ_oligo_187_LDであり、102bpのPCR生成物が得られ、これは83マー鋳型とは区別されるものである。リバースプライマーは、MJ_oligo_189_LDである。L−dNTPは、Rasayan,Inc.(Encinitas,CA,USA)によるカスタム合成として購入する。
全−DポリメラーゼDpo4変異体A155C/V203CおよびL−DNA基質およびL−ヌクレオチドを用いたPCR反応によって、DNA標準物質ラダーと比較した場合に約100bpの範囲となるバンドが得られる。このバンドは、ポリメラーゼがない陰性対照では出現しない。また、この102bpバンドは、83マー鋳型より高く移動する。全−DポリメラーゼDpo4変異体A155C/V203CはL−DNA増幅の出現に依存するので、温度増幅過程での合成全−DポリメラーゼDpo4変異体A155C/V203Cの活性が確認される。
標準的な環外アミン保護基とともに(DamhaおよびOgilvie、1993)2’TBDMS DNAホスホラミダイト化学を用いて、ABI394合成装置(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)による固相合成によって、L−DNA核酸またはD−DNA核酸を作製した。DNA合成のために、D−およびL−立体配置のdA(N−Bz)−、dC(N−Ac)−、dG(N−ibu)−およびdTを適用した。ChemGenes,Wilmington,MAから全ホスホルアミダイトを購入した。合成および脱保護後、ゲル電気泳動によってL−DNA核酸またはD−DNA核酸を精製した。
次のような、本明細書中で引用する書類の完全な文献データは、別段の断りがない場合、それによってその参考文献の開示が参照により本明細書中に組み込まれる。
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Claims (37)
- 第一のL−核酸の3’末端に1以上のL−ヌクレオチドを付加するための方法であって、ポリメラーゼ活性提示部分を含むタンパク質の存在下で1以上のL−ヌクレオチドを第一のL−核酸と反応させる段階を含み、前記ポリメラーゼ活性が前記第一のL−核酸の3’末端に1以上のL−ヌクレオチドを付加することができ、前記ポリメラーゼ活性提示部分はアミノ酸配列からなり、前記アミノ酸配列のアミノ酸はD−アミノ酸である、方法。
- 前記ポリメラーゼ活性が温度安定性のポリメラーゼ活性である、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼ活性提示部分のアミノ酸配列が少なくとも300個のアミノ酸を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼ活性提示部分が、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼX、サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)ポリメラーゼXコアドメイン、ラットポリメラーゼβ、真核生物ポリメラーゼβ、クレノウ断片、クレノウエキソポリメラーゼ、T4DNAポリメラーゼ、Phi29DNAポリメラーゼ、T7DNAポリメラーゼ、SP6ポリメラーゼ、DNAポリメラーゼI、およびポリメラーゼλ、並びにそれらのそれぞれおよび何れかの変異体の群から選択され、前記変異体が、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼX、サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)ポリメラーゼXコアドメイン、ラットポリメラーゼβ、真核生物ポリメラーゼβ、クレノウ断片、クレノウエキソポリメラーゼ、T4DNAポリメラーゼ、Phi29DNAポリメラーゼ、T7DNAポリメラーゼ、SP6ポリメラーゼ、DNAポリメラーゼI、およびポリメラーゼλの群から選択されるそれぞれのポリメラーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼ活性提示部分が、配列番号1に記載のアミノ酸配列、配列番号2に記載のアミノ酸配列、配列番号3に記載のアミノ酸配列および配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼXまたはその変異体である、請求項4に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼ活性提示部分が、ポリメラーゼDPO4、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)DNAポリメラーゼ、パイロコッカス属(Pyrococcus sp.)DNAポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)DNAポリメラーゼ、スルホロブス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)DNAポリメラーゼ、サーモコッカス・ゴルゴナリウス(Thermococcus gorgonarius)DNAポリメラーゼ、KODポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、Tthポリメラーゼ、Pwoポリメラーゼ、Sacポリメラーゼ、Bstポリメラーゼ、Pocポリメラーゼ、Pabポリメラーゼ、Mthポリメラーゼ、Phoポリメラーゼ、ES4ポリメラーゼ、Tbrポリメラーゼ、Tflポリメラーゼ、Truポリメラーゼ、Tacポリメラーゼ、Tneポリメラーゼ、Tmaポリメラーゼ、Tihポリメラーゼ、Tfiポリメラーゼ、およびStoffel断片、並びにそれらの変異体の群から選択され、前記変異体が、ポリメラーゼDPO4、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)DNAポリメラーゼ、パイロコッカス属(Pyrococcus sp.)DNAポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)DNAポリメラーゼ、スルホロブス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)DNAポリメラーゼ、サーモコッカス・ゴルゴナリウス(Thermococcus gorgonarius)DNAポリメラーゼ、KODポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、Tthポリメラーゼ、Pwoポリメラーゼ、Sacポリメラーゼ、Bstポリメラーゼ、Pocポリメラーゼ、Pabポリメラーゼ、Mthポリメラーゼ、Phoポリメラーゼ、ES4ポリメラーゼ、Tbrポリメラーゼ、Tflポリメラーゼ、Truポリメラーゼ、Tacポリメラーゼ、Tneポリメラーゼ、Tmaポリメラーゼ、Tihポリメラーゼ、Tfiポリメラーゼ、およびStoffel断片の群から選択されるそれぞれのポリメラーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1から3の何れか1項に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼ活性提示部分が、配列番号15に記載のアミノ酸配列、配列番号16に記載のアミノ酸配列、配列番号17に記載のアミノ酸配列、配列番号18に記載のアミノ酸配列、配列番号19に記載のアミノ酸配列、配列番号20に記載のアミノ酸配列、配列番号21に記載のアミノ酸配列および配列番号22に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、Dpo4ポリメラーゼまたはその変異体である、請求項6に記載の方法。
- 前記反応が、第二のL−核酸をさらに含み、前記第一のL−核酸の1つの分子が、前記第二のL−核酸の1つの分子とハイブリッド形成する、請求項1から7の何れか1項に記載の方法。
- L−ヌクレオチドおよびポリメラーゼ活性提示部分を含むタンパク質の存在下で標的L−核酸を増幅するための方法であって、前記ポリメラーゼ活性が前記標的L−核酸を増幅させることができ、前記ポリメラーゼ活性提示部分はアミノ酸配列からなり、前記アミノ酸配列のアミノ酸はD−アミノ酸である、方法。
- 前記ポリメラーゼ活性が温度安定性のポリメラーゼ活性である、請求項9に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼ活性提示部分のアミノ酸配列が少なくとも300個のアミノ酸を含む、請求項9または10に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼ活性提示部分が、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼX、サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)ポリメラーゼXコアドメイン、ラットポリメラーゼβ、真核生物ポリメラーゼβ、クレノウ断片、クレノウエキソポリメラーゼ、T4DNAポリメラーゼ、Phi29DNAポリメラーゼ、T7DNAポリメラーゼ、SP6ポリメラーゼ、DNAポリメラーゼI、およびポリメラーゼλ、並びにそれらのそれぞれおよび何れかの変異体の群から選択され、前記変異体が、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼX、サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)ポリメラーゼXコアドメイン、ラットポリメラーゼβ、真核生物ポリメラーゼβ、クレノウ断片、クレノウエキソポリメラーゼ、T4DNAポリメラーゼ、Phi29DNAポリメラーゼ、T7DNAポリメラーゼ、SP6ポリメラーゼ、DNAポリメラーゼI、およびポリメラーゼλの群から選択されるそれぞれのポリメラーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼ活性提示部分が、配列番号1に記載のアミノ酸配列、配列番号2に記載のアミノ酸配列、配列番号3に記載のアミノ酸配列および配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼXまたはその変異体である、請求項12に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼ活性提示部分が、ポリメラーゼDPO4、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)DNAポリメラーゼ、パイロコッカス属(Pyrococcus sp.)DNAポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)DNAポリメラーゼ、スルホロブス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)DNAポリメラーゼ、サーモコッカス・ゴルゴナリウス(Thermococcus gorgonarius)DNAポリメラーゼ、KODポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、Tthポリメラーゼ、Pwoポリメラーゼ、Sacポリメラーゼ、Bstポリメラーゼ、Pocポリメラーゼ、Pabポリメラーゼ、Mthポリメラーゼ、Phoポリメラーゼ、ES4ポリメラーゼ、Tbrポリメラーゼ、Tflポリメラーゼ、Truポリメラーゼ、Tacポリメラーゼ、Tneポリメラーゼ、Tmaポリメラーゼ、Tihポリメラーゼ、Tfiポリメラーゼ、およびStoffel断片、並びにそれらの変異体の群から選択され、前記変異体が、ポリメラーゼDPO4、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)DNAポリメラーゼ、パイロコッカス属(Pyrococcus sp.)DNAポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)DNAポリメラーゼ、スルホロブス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)DNAポリメラーゼ、サーモコッカス・ゴルゴナリウス(Thermococcus gorgonarius)DNAポリメラーゼ、KODポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、Tthポリメラーゼ、Pwoポリメラーゼ、Sacポリメラーゼ、Bstポリメラーゼ、Pocポリメラーゼ、Pabポリメラーゼ、Mthポリメラーゼ、Phoポリメラーゼ、ES4ポリメラーゼ、Tbrポリメラーゼ、Tflポリメラーゼ、Truポリメラーゼ、Tacポリメラーゼ、Tneポリメラーゼ、Tmaポリメラーゼ、Tihポリメラーゼ、Tfiポリメラーゼ、およびStoffel断片の群から選択されるそれぞれのポリメラーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項9から11の何れか1項に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼ活性提示部分が、配列番号15に記載のアミノ酸配列、配列番号16に記載のアミノ酸配列、配列番号17に記載のアミノ酸配列、配列番号18に記載のアミノ酸配列、配列番号19に記載のアミノ酸配列、配列番号20に記載のアミノ酸配列、配列番号21に記載のアミノ酸配列および配列番号22に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、Dpo4ポリメラーゼまたはその変異体である、請求項14に記載の方法。
- 少なくとも1つのプライマーを利用し、前記少なくとも1つのプライマーが、L−ヌクレオチドからなる、請求項9から14の何れか1項に記載の方法。
- ポリメラーゼ活性提示部分を含むタンパク質であって、前記ポリメラーゼ活性提示部分が、アミノ酸がD−アミノ酸であるアミノ酸配列からなり、前記ポリメラーゼ活性が第一のL−核酸の3’末端に1以上のL−ヌクレオチドを付加することができる、タンパク質。
- 前記ポリメラーゼ活性が温度安定性のポリメラーゼ活性である、請求項17に記載のタンパク質。
- 前記ポリメラーゼ活性提示部分のアミノ酸配列が少なくとも300個のアミノ酸を含む、請求項17または18に記載のタンパク質。
- 前記ポリメラーゼ活性提示部分が、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼX、サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)ポリメラーゼXコアドメイン、ラットポリメラーゼβ、真核生物ポリメラーゼβ、クレノウ断片、クレノウエキソポリメラーゼ、T4DNAポリメラーゼ、Phi29DNAポリメラーゼ、T7DNAポリメラーゼ、SP6ポリメラーゼ、DNAポリメラーゼI、およびポリメラーゼλ、並びにそれらのそれぞれおよび何れかの変異体の群から選択され、前記変異体が、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼX、サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)ポリメラーゼXコアドメイン、ラットポリメラーゼβ、真核生物ポリメラーゼβ、クレノウ断片、クレノウエキソポリメラーゼ、T4DNAポリメラーゼ、Phi29DNAポリメラーゼ、T7DNAポリメラーゼ、SP6ポリメラーゼ、DNAポリメラーゼI、およびポリメラーゼλの群から選択されるそれぞれのポリメラーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項17に記載のタンパク質。
- 前記ポリメラーゼ活性提示部分が、配列番号1に記載のアミノ酸配列、配列番号2に記載のアミノ酸配列、配列番号3に記載のアミノ酸配列および配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼXまたはその変異体である、請求項20に記載のタンパク質。
- 前記ポリメラーゼ活性提示部分が、ポリメラーゼDPO4、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)DNAポリメラーゼ、パイロコッカス属(Pyrococcus sp.)DNAポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)DNAポリメラーゼ、スルホロブス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)DNAポリメラーゼ、サーモコッカス・ゴルゴナリウス(Thermococcus gorgonarius)DNAポリメラーゼ、KODポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、Tthポリメラーゼ、Pwoポリメラーゼ、Sacポリメラーゼ、Bstポリメラーゼ、Pocポリメラーゼ、Pabポリメラーゼ、Mthポリメラーゼ、Phoポリメラーゼ、ES4ポリメラーゼ、Tbrポリメラーゼ、Tflポリメラーゼ、Truポリメラーゼ、Tacポリメラーゼ、Tneポリメラーゼ、Tmaポリメラーゼ、Tihポリメラーゼ、Tfiポリメラーゼ、AmpliTaq、およびStoffel断片、並びにそれらの変異体の群から選択され、前記変異体が、ポリメラーゼDPO4、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)DNAポリメラーゼ、パイロコッカス属(Pyrococcus sp.)DNAポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)DNAポリメラーゼ、スルホロブス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)DNAポリメラーゼ、サーモコッカス・ゴルゴナリウス(Thermococcus gorgonarius)DNAポリメラーゼ、KODポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、Tthポリメラーゼ、Pwoポリメラーゼ、Sacポリメラーゼ、Bstポリメラーゼ、Pocポリメラーゼ、Pabポリメラーゼ、Mthポリメラーゼ、Phoポリメラーゼ、ES4ポリメラーゼ、Tbrポリメラーゼ、Tflポリメラーゼ、Truポリメラーゼ、Tacポリメラーゼ、Tneポリメラーゼ、Tmaポリメラーゼ、Tihポリメラーゼ、Tfiポリメラーゼ、AmpliTaq、およびStoffel断片の群から選択されるそれぞれのポリメラーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項17から19の何れか1項に記載のタンパク質。
- 前記ポリメラーゼ活性提示部分が、配列番号15に記載のアミノ酸配列、配列番号16に記載のアミノ酸配列、配列番号17に記載のアミノ酸配列、配列番号18に記載のアミノ酸配列、配列番号19に記載のアミノ酸配列、配列番号20に記載のアミノ酸配列、配列番号21に記載のアミノ酸配列および配列番号22に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、Dpo4ポリメラーゼまたはその変異体である、請求項22に記載のタンパク質。
- 配列番号15に記載のアミノ酸配列を含むポリメラーゼであって、前記アミノ酸配列のアミノ酸がD−アミノ酸である、ポリメラーゼ。
- 配列番号1に記載のアミノ酸配列を含むポリメラーゼであって、前記アミノ酸配列のアミノ酸がD−アミノ酸である、ポリメラーゼ。
- 野生型ポリメラーゼのポリメラーゼ変異体であって、前記野生型ポリメラーゼが配列番号15に記載のアミノ酸配列からなり、前記ポリメラーゼ変異体が、ポリメラーゼ活性を有し、前記ポリメラーゼ変異体がL−核酸の3’末端に1以上のL−ヌクレオチドを付加することができ、前記ポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列のアミノ酸は、D−アミノ酸であり、前記変異体が、配列番号15に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、野生型ポリメラーゼのポリメラーゼ変異体。
- 前記ポリメラーゼ活性が、温度安定性のポリメラーゼ活性である、請求項26に記載のポリメラーゼ変異体。
- 前記ポリメラーゼ変異体がアミノ酸配列を含み、前記ポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列が、少なくとも1つのアミノ酸位置で野生型ポリメラーゼのアミノ酸配列とは異なる、請求項26または27に記載のポリメラーゼ変異体。
- 野生型ポリメラーゼのポリメラーゼ変異体であって、前記野生型ポリメラーゼが、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなり、前記ポリメラーゼ変異体がポリメラーゼ活性を有し、前記ポリメラーゼ変異体がL−核酸の3’末端に1以上のL−ヌクレオチドを付加することができ、前記ポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列のアミノ酸は、D−アミノ酸であり、前記変異体が、配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、野生型ポリメラーゼのポリメラーゼ変異体。
- 前記ポリメラーゼ変異体がアミノ酸配列を含み、前記ポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列が、少なくとも1つのアミノ酸位置で野生型ポリメラーゼのアミノ酸配列とは異なる、請求項29に記載のポリメラーゼ変異体。
- L−核酸の3’末端に対して1以上のL−ヌクレオチドを付加するための方法における、ポリメラーゼ活性提示部分を含むタンパク質の使用であって、前記タンパク質がアミノ酸配列からなり、かつ前記アミノ酸配列のアミノ酸がD−アミノ酸である、タンパク質の使用。
- L−ヌクレオチドの存在下で標的L−核酸を増幅するための方法における、ポリメラーゼ活性提示部分を含むタンパク質の使用であって、前記タンパク質がアミノ酸配列からなり、かつ前記アミノ酸配列のアミノ酸がD−アミノ酸である、タンパク質の使用。
- 標的L−核酸を増幅するための方法がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項32に記載の使用。
- 前記タンパク質が、請求項17から30の何れか1項に記載のタンパク質である、請求項31から33の何れか1項に記載の使用。
- 標的分子結合L−核酸分子の同定のための方法であって、次の段階:
(a)L−核酸分子の不均一集団を作製すること;
(b)段階(a)の前記L−核酸分子の不均一集団を前記標的分子と接触させること;
(c)前記標的分子が結合しないL−核酸分子を分離すること;
(d)前記標的分子が結合するL−核酸分子を増幅させること
を含み、前記増幅段階が請求項17から30の何れか1項に記載のタンパク質を使用する、方法。 - 請求項17から30の何れかに記載のタンパク質を作製するための方法であって、
a)請求項17から30の何れかに記載のタンパク質の2以上の断片が化学的に合成され、それによって、前記断片が全体として前記タンパク質のアミノ酸配列を形成し、
b)段階a)の断片が、セグメント縮合、ネイティブ化学ライゲーション、酵素性ライゲーションまたはそれらの組み合わせにより互いに対して連結され、
前記タンパク質が、アミノ酸がD−アミノ酸であるアミノ酸配列からなる、方法。 - 前記断片が固相ペプチド合成によって合成される、請求項36に記載の方法。
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