JP2004352681A - がん細胞増殖抑制剤及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】甘しょ焼酎蒸留粕に麹菌又は麹菌抽出物を作用させ、圧搾ろ過し、得られた液体部分を必要があれば中空糸膜でろ過して精製する。
また、麹菌又は麹菌抽出物を甘しょ焼酎蒸留粕に添加しただけではろ過が困難な場合は、麹菌又は麹菌抽出物を添加するとき、さらにセルラーゼ系酵素を添加する。
【選択図】 図5
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、甘しょ焼酎蒸留粕から得られた生理活性物質であるがん細胞増殖抑制剤及びその製造方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
本格乙類焼酎の消費の増加が続くなかで、製品量の約2倍量発生する焼酎蒸留粕は、常圧蒸留でBOD約60000ppm、減圧蒸留でBOD約100000ppmと高濃度の汚染物質が含まれ、その処理が問題となっている。
【0003】
焼酎蒸留粕の処理として海洋投棄が規制されている現在、農地還元や肥料化、飼料化などが検討され、一部で実施されている。農地還元では悪臭の発生や地下水の汚染が心配され、肥料化については処理効率が必ずしも十分期待できないという問題があった(例えば、特許文献1参照。)。
また、飼料化に際しては、処理施設や処理経費からみてコスト高が懸念される。(例えば、特許文献2参照。)
【0004】
ところで焼酎蒸留粕中には、食物繊維類、非発酵性糖類、蛋白質、脂肪等のほか、麹菌・酵母等の菌体、有機酸、ミネラル分、ビタミン類及びポリフェノール等が含まれており、これらの中には生理活性を示す物質の存在が期待される。
【0005】
また、乙類焼酎蒸留粕のなかで甘しょ焼酎蒸留粕は著しく固液分離が困難なため、その処理が難しかったが、甘しょ焼酎蒸留粕にセルラーゼ系酵素と麹を作用させることで固液分離を容易にする方法が開発された(例えば、特許文献3参照。)。
上記の方法で固液分離された液体部分に特に生理活性物質が存在することが鋭意研究の結果明らかとなり、本発明がなされることとなった。
【0006】
【特許文献1】
特開平10−287485号公報
【特許文献2】
特許第2976072号公報
【特許文献3】
特願2002−225623号明細書
【0007】
【発明が解決しようとする課題】
従来、処理が困難とされていた甘しょ焼酎蒸留粕から生理活性物質であるがん細胞増殖抑制剤を得ることを本発明の目的とする。
【0008】
【課題を解決するための手段】
本発明は、甘しょ焼酎蒸留粕に麹菌又は麹菌の抽出物を作用させた後、固液分離を行って分離された液体からなることを特徴とする生理活性物質であるがん細胞増殖抑制剤である。
【0009】
甘しょ焼酎蒸留粕の固液分離を容易に実施するため、必要な場合はセルラーゼ酵素及び麹菌又は麹菌抽出物を添加するが、固液分離が比較的容易な場合はセルラーゼ系酵素の添加は省略できる。麹菌又は麹菌の抽出物を添加することは、単に固液分離を容易にするだけでなく、甘しょ焼酎蒸留粕中の生理活性物質の増加をもたらす効果が認められたためである。
【0010】
本発明において用いられる麹菌は、通常焼酎製造に用いられる白麹菌又は黒麹菌が適当である。これらの麹菌はクエン酸生成能力が高く、雑菌汚染に対する抵抗性が大きいからである。
【0011】
【発明の実施の形態】
本発明の生理活性物質であるがん細胞増殖抑制剤は、甘しょ焼酎蒸留粕に麹菌又は麹菌の抽出物を作用させ、甘しょ焼酎蒸留粕に含まれる生理活性物質を増加させることで得られるものである。生理活性物質の含有量の変化をDPPHラジカル消去能で検討した。その結果を図1に示した。
【0012】
ラジカル消去能は安定ラジカルであるDPPHを用いて測定した。活性はIC50(DPPHの吸光度を50%減少させるに必要な試料の量)でトロロックス換算により示した。
【0013】
ラジカル消去能の測定:
(1)サンプル75μl採取
(2)0.1M MES溶液(pH6.0):添加,0.1M MES溶液は0.2M MES溶液(pH6.0):100% EtOH=1:1混合して調製する。
(3)75μlDPPH溶液 添加
3.94mgDPPHを50%EtOH25mlに溶解
(4)撹拌(2分間)
(5)OD520測定
【0014】
ポリフェノール含量の測定:フォーリン・チオカルトウ法により測定した。
【0015】
サツマイモもろみ酢(甘しょ焼酎蒸留粕を酵素と20%麹を添加して処理したもの)と、その原料である焼酎粕液(甘しょ焼酎蒸留粕を酵素処理した液)を前記の方法でラジカル消去能を測定し、その結果を図1に示した。
焼酎粕液及びもろみ酢のラジカル消去能(IC50)はそれぞれ3.9,4.3でもろみ酢が焼酎粕液より明らかに高い値を示した。
【0016】
サツマイモもろみ酢と前記焼酎粕液のポリフェノール含量の測定結果を図2に示した。焼酎粕液は約77mg(クロロゲン酸相当/100ml)でもろみ酢は約134mg(クロロゲン酸相当/100ml)であり、焼酎粕液に麹を添加して処理することにより、ポリフェノール含量が約1.7倍ほど増加することを示している。
【0017】
甘しょ焼酎蒸留粕を麹菌又は麹菌の抽出物で処理することで生理活性物質の含量が増加する可能性が前記ラジカル消去能やポリフェノール含量の測定で十分推測されたので、サツマイモもろみ酢のがん細胞増殖抑制機能を解析することとし、がん細胞増殖の測定を行った。
【0018】
サツマイモもろみ酢によるがん細胞の増殖抑制効果は、ヒト急性前骨髄性白血病がん細胞(HL−60)を用いてMTTアッセイで検討した。また、対照細胞群としてマウス正常皮膚由来細胞(JB6)を用いた。MTT(3−C4,5−dimethylthiazol−2yl)−diphenyltetrazoliumbromide)は帯黄色の化合物で、生細胞のミトコンドリアの呼吸鎖に作用し、存在する酵素によってテトラゾリウム環が開裂し、青色のフオルマザンを生成する。この生成量は細胞数とほぼ比例関係にあり、フオルマザンは酸性イソプロパノールにより分解し、呈色するので、その比色値を測定し、比較することによって細胞増殖の指標とすることができる。その測定ステップとして、まず細胞を96−ウエルプレートに分注し、24時間培養した。その後、各種濃度のサツマイモもろみ酢を添加し、さらに48時間培養した。サツマイモもろみ酢無添加の細胞をコントロールとした。また、もろみ酢のバックグランドを除去するため、培地のみの96−ウエルプレートに同量のもろみ酢を添加した。細胞増の測定はCamichaelらの方法に従って行った。
【0019】
急性前骨髄性白血病がん細胞(HL−60)の増殖抑制効果は次の細胞生存率(%)=「(実験区の吸光度−サンプルの吸光度)/コントロールの吸光度」×100で表した。その結果を図3に示した。
【0020】
図3によると、HL−60細胞に各種濃度のサツマイモもろみ酢を添加し、48時間培養後の測定結果は、0.25,0.5,0.75および1.00mg/mlの添加ではHL−60の生存率は無添加のコントロール(100%)に対して、それぞれ96.0%,69.5%,30.6%及び19.6%となった。これらの結果、サツマイモもろみ酢には、がん細胞増殖を抑制する成分が存在することがわかった。
【0021】
同様の方法でサツマイモもろみ酢を正常皮膚細胞(JB6)に添加し、48時間培養後、細胞生存率を測定した。その結果を図4に示す。0.25,0.5,0.75及び1.00mg/mlの添加ではJB6細胞の生存率は、無添加のコントロール(100%)に対して、それぞれ97.7%,87.4%,85.1%及び72.2%であった。これらの結果は、サツマイモもろみ酢は正常細胞の増殖にはほとんど影響を与えないことがわかった。
【0022】
抗がん能実験:抗がん能は、マウスにマウスの腹水がん細胞(サルコーマ180)を皮下投与し、同時にサツマイモもろみ酢を経口投与してサルコーマ180による腫瘍組織重量の増殖抑制効果で検討した。また、上記の実験に用いたマウス脾臓中のナチュラルキラー(NK)細胞活性を測定し、生体防御能の亢進と腫瘍組織の増殖抑制との関連を検討した。
【0023】
マウスの腹水がん細胞180の準備:腹水がん細胞サルマーユ180をマウス(Balb/c,雄、5週令)の腹腔に注入し、約2〜3週間飼育すると、注入されたサルコーマは増殖を開始し、多量の腹水が溜まってくる。かなり溜まった時点で腹水を抜き取る。この中に多量のサルコーマ細胞が存在する。得られた腹水は多量の血液を含むので、低調緩衝液中で赤血球を除去し、さらにサルコーマ細胞密度を計測する。
【0024】
サルコーマ180の皮下投与:マウス(Balb/c,雄、6週令)にサルコーマ180(5×106/マウス)を腰部に皮下投与する。その後、サツマイモもろみ酢5%を含む精製飼料で20日間飼育し、腫瘍重量を測定した。
また、脾臓をとり、NKを含む脾臓細胞を集め、NK活性測定試料とした。
【0025】
脾臓ナチュラルキラー(NK)細胞活性の測定:
(1)脾細胞の調製:Balb/cマウスの実験飼料投与期間終了の翌日に頚椎脱臼し、脾臓を採取する。ハンクス液を入れたディッシュ中で周囲結合組織を除く。はさみで細切し、RPMI1640培地を加えながらスチールメッシュを通し、細胞の浮遊液を得る。さらに細かいメッシュを通し組織片を除く。細胞浮遊液を遠沈(150×g,5分)して細胞を集め、2mlの0.144M NH4Cl−0.017M Tris−HCl(pH7.2)を加えてピペッティングし、赤血球を溶血させる。1500rpm,2分遠心分離し、リンパ球を集める。RPMI1640培地を10ml加えて洗浄、遠心分離してリンパ球を集める。前記培地を5ml加え、細胞数を測定する。
【0026】
得られた脾細胞をRPMI1640培地で5×106/mlとし、6cmディッシュに4mlずつ分注し、37℃,5%炭酸ガスで3時間培養する。培養後、細胞浮遊液を回収し、さらにRPMI1640培地(37℃)で軽くピペッティングし、浮遊細胞を回収する。これを遠心分離(150×g,5分)し、得た細胞をNK細胞を含む非接着性脾リンパ球とした。
【0027】
培地の調製:RPMI1640培地(ニッスイ製薬)
使用説明書にもとづいて作製した培地に、L−グルタミン0.3mg/ml,ペニシリン100U/ml,ストレプトマイシン100mg/mlを加え、10%NaHCO3でpH7.4に調整した。
【0028】
(2)YAC−1細胞(リンパ腫細胞、ターゲット細胞)の調製
NK細胞(エフェクター細胞)のターゲットとなるYAC−1細胞(ターゲット細胞)をRPMI1640培地で培養し、細胞数を1×105/mlに調整する。YAC−1は対数増殖期にあるものを使用した。
凍結したYAC−1を融解し、6cmディッシュに加え、3日後のYAC−1を試験に用いた。
【0029】
(3)NK活性の測定
NK活性の測定は、障害を受けた細胞の放出するLactate dehydrogenase(LDH)をマーカーとする細胞障害性ELISAアッセイシステム(Cytotox96,Promega)による。
【0030】
96穴プレート(岩城硝子)にエフェクター細胞として脾細胞100μl分注する。これにRPMI1640培地に浮遊させたターゲット細胞であるYAC−1(リンパ腫細胞)1×105/ml,100μlずつ分注し、37℃,5%炭酸ガスインキュベーターで4時間培養する。この時のエフェクター細胞とターゲット細胞の細胞数の比を100:1,50:1,30:1,20:1,10:1,5:1に調整する。マイクロプレート用の遠心機で遠沈(250×g,4分)し、細胞を沈殿させ、各上清50μlを別のプレートに取り、基質混合液を50μlずつ添加し、遮光し、室温静置する。30分後、反応停止液、50μlを加え、直ちにELISAリーダーで492nmの吸光度を測定することによりLDH放出量を算出する。以上の操作は全て無菌的に行った。
【0031】
前項0024記載の方法でサツマイモもろみ酢の抗がん能を腫瘍重量の測定によって行った。その結果を図5に示す。
すなわち、マウスにがん細胞を皮下投与し、同時にサツマイモもろみ酢を経口投与して20日間飼育し、解体し、腫瘍重量を測定した。コントロールとして通常の餌だけを与えた区分と腫瘍重量の比較を行った。サツマイモもろみ酢を与えた区分の腫瘍重量がコントロールに比べて低い結果が得られた。これによりサツマイモもろみ酢に抗がん能を持つ成分が含まれており、腫瘍の増殖抑制が示唆された。
【0032】
ヒトは腫瘍細胞(がん細胞)が3千〜数千個・日も生じるといわれている。この異常細胞が生き残るとがん組織化する確率が高いといわれている。この異常細胞を早期に見つけて処理しているのがナチュラルキラー細胞と言われるものであり、このナチュラルキラー細胞活性が高く維持されていると、異常細胞の消去が早期に行われ、がん組織化が未然防止されることになる。マイクロプレートでサツマイモもろみ酢を添加した区分とコントロール区分を比較した結果、もろみ酢を添加した区分のNK活性が亢進した結果を図6に示した。
【0033】
図6に示した結果は、前項0029,0030に記載した方法で測定したものである。NK活性は次式により算出した。
(実験LDH放出量−自然放出量)/(最大放出量−自然放出量)×100%
自然放出量:ターゲット細胞からエフェクタ細胞の作用なしに放出されるLDH量。
最大放出量:ターゲット細胞中に存在する全LDH量。
【0034】
【実施例1】
甘しょ焼酎蒸留粕からがん細胞増殖抑制剤として使用することができるサツマイモもろみ酢は、次の方法で製造する。ただし、この実施例は単に本発明の説明のため、具体的な態様を説明するものであり、本願の開示する発明の範囲を限定するものではない。
甘しょ焼酎蒸留粕(20kg)にセルラーゼ系酵素(甘しょ焼酎蒸留粕に対し0.1重量%:トリコデルマ ビリデ由来のセルラーゼ,商品名セルロシンT2,阪急バイオインダストリー社製造)と米麹4kgを添加し、約30〜40℃で少なくとも6時間撹拌しながら可溶化処理を行い、繊維質を分解して、ろ過性を向上させる。
【0035】
次に、圧搾ろ過機(東洋商会製)を使用して2kg/cm2荷重で固液分離した。得られた液体部分はポリスルホン製の中空糸膜で2時間ろ過後、殺菌して、サツマイモもろみ酢とした。
【0036】
【実施例2】
本発明における麹菌の抽出物は下記の方法で製造した。
すなわち、麹4gに酢酸緩衝液(86mM NaCl+0.1M酢酸緩衝液(pH5.0))20mlを加え、20℃で3時間、シェーカーで撹拌・抽出し、上清を0.45μmフィルターでろ過して調製した。
【0037】
【発明の効果】
以上、説明したように本発明によれば、甘しょを原料とする焼酎製造において副成する焼酎蒸留粕に麹菌又は麹菌抽出物を作用させた後、固液分離して得られた液体成分がDPPHラジカル消去能を有するとともにがん細胞増殖抑制作用を有することが明らかとされたため、甘しょ焼酎蒸留粕の有効利用の途が開かれることとなった。
【図面の簡単な説明】
【図1】DPPHラジカル消去能を示す図である。
【図2】ポリフェノール含量を示す図である。
【図3】もろみ酢のヒト急性前骨髄性白血病細胞(HL−60)の増殖抑制効果を示す図である。
【図4】もろみ酢のマウス正常皮膚由来細胞(JB6)の増殖への影響を示す図である。
【図5】もろみ酢の抗がん能試験の結果を示す図である。
【図6】もろみ酢のNK亢進作用(NK:YAC−1=10:1)の結果を示す図である。
Claims (2)
- 甘しょ焼酎蒸留粕に麹菌又は麹菌の抽出物を作用させた後、固液分離を行って分離された液体からなることを特徴とするがん細胞増殖抑制剤。
- 甘しょ焼酎蒸留粕に麹菌又は麹菌の抽出物を作用させた後、固液分離を行って液体を分離することを特徴とするがん細胞増殖抑制剤の製造方法。
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JP2003154436A JP2004352681A (ja) | 2003-05-30 | 2003-05-30 | がん細胞増殖抑制剤及びその製造方法 |
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2003
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