JP2004340931A

JP2004340931A - バイオポリマーアレイの製造のための品質管理方法

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Publication number: JP2004340931A
Application number: JP2004078550A
Authority: JP
Inventors: Ralf Mauritz; マウリッツラルフ; Dieter Heindl; ディーター　ハインドル
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2003-03-19
Filing date: 2004-03-18
Publication date: 2004-12-02
Anticipated expiration: 2024-03-18
Also published as: CA2461405A1; US20040235022A1; JP4069089B2

Abstract

【課題】非破壊的であり、いったん最終脱保護または検出が行なわれたら、さらなる工程を必要とせず、脱保護の割合の評価ならびに後の使用に自由に利用し得るバイオポリマーの品質の評価を可能にする方法を提供すること。
【解決手段】（ａ）検出可能な保護基を含むモノマーまたはオリゴマー建築ブロックからアレイ上に複数の種々のバイオポリマー種を合成する工程；（ｂ）合成後に該アレイ上の検出可能な保護基の測定を任意に実施する工程；（ｃ）該検出可能な保護基を切断除去する工程；および（ｄ）脱保護の効力を測定するために切断後に該アレイ上の検出可能な保護基の測定を実施する工程；を含む、バイオポリマーアレイを製造するための品質管理方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、検出可能な保護基の使用を含む、バイオポリマーアレイの製造のための品質管理方法に関する。

固相上での核酸およびペプチドの合成は、ここ２０年間で確立された方法である。核酸合成のもっとも普及した方法は、ホスホルアミダイト法（例えば、非特許文献１参照）であり、この方法では、3'または5'方向に個々のヌクレオチド建築ブロックの反復縮合によりオリゴヌクレオチド鎖が構築される。３つの反応性ヌクレオチド基：リボース糖5'ヒドロキシル基、核酸塩基アデニン、グアニンおよびシトシン（チミンは保護基を必要としない）のアミノ保護基、ならびにヌクレオチド3'リン酸残基のリン酸保護基を保護するため、種々のオーソゴナル(orthogonal)保護基が使用されている。これらの保護基は、次いで、合成中または合成後のいずれかにおいて種々の条件下で切断される。4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル（DMT）基は5'ヒドロキシルの標準、2-シアノエチル基はリン酸残基の標準、および種々のアシル基は核酸塩基のアミノ官能基の標準となっている（例えば、非特許文献２および非特許文献３参照）。DMT基は、次のホスホルアミダイトが結合し得るヒドロキシル基を生成するために合成中に切断される。他の示した保護基は、任意の副反応または副生成物を防ぐため、合成の終了まで残存する。合成の終了時、完全なオリゴヌクレオチドは、主に、塩基により完全に脱保護され、それにより、2-シアノエチルおよびアシル保護基が切断される。

バイオチップの製造には本質的に２つの手段：オリゴヌクレオチドプローブのオフチップ合成およびオンチップ合成がある。オフチップ合成では、オリゴヌクレオチドを、上述の標準試薬を用いて市販の合成機で作製し、次いでチップ上に固定する。オンチップ合成では、オリゴヌクレオチドを、上述の標準試薬を用いてチップ上に直接作製する。前者の場合、オリゴヌクレオチドの品質は、HPLCまたは質量分光分析などの解析方法により解析することができ、必要であれば、精製により向上させることができる。後者の場合のオンチップ合成は、限られた品質管理しか許容されず、精製は不可能である。品質管理は、通常、次いで検出および定量され得るオリゴヌクレオチドの末端における（主に蛍光性）着色物質の共有結合によってのみ可能である。

文献において、オリゴヌクレオチドの脱保護度を測定するための方法の記載はほとんどない。第１の方法は、モノクローナル抗体でのオリゴヌクレオチド上の核酸塩基および5'-ヒドロキシル保護基の検出を含む（例えば、非特許文献４参照）。他の参考文献には、切断可能な蛍光性保護基の使用が記載されている。しかしながら、これらは、5'-ヒドロキシル基またはリン酸残基の保護基については言及しているが、核酸塩基アミノ基のものについては言及していない。これに関して、DNA合成アレイの合成効率を調べるのに使用される5'-ヒドロキシル基の蛍光性の光不安定性保護基が記載されている（例えば、特許文献１参照）ことに注意されたい。基本的に蛍光性特性を有する核酸塩基保護基について記載している（例えば、非特許文献５参照）。しかしながら、この基は、他の目的のため、特にβ-脱離反応プロセスを用いることによる脱保護特性の改良のために開発されている。
米国特許第6,238,862号B1明細書 BeaucageおよびCaruthers、「Tetrahedron Lett.」、1981年、第22巻、p.1859-1862 BuechiおよびKhorana、「J. Mol. Biol.」、1972年、第72巻、p.251-258 Souveaux、「Protocol for Oligonucleotide Conjugates」、S. Agrawal編「Method in Molecular Biology」、Humana Press Inc., Totowa, N.J.、1994年、第26巻、第1章 Fuら、「Analytical Biochemistry」、2002年、第306巻、第1号、p.135-143 WagnerおよびPfleiderer、「Helv. Chim. Act.」、1990年、第80巻、p.200-212

概して、オンチップ合成では正確な品質管理は行い得ない。現在、オリゴヌクレオチドの末端に色素を結合させることのみが、固相オリゴヌクレオチドの品質および合成の品質の間接的な指標を与える。しかしながら、これは、合成の終了時の脱保護の割合、すなわち全ての2-シアノエチル保護基およびアシル保護基が切断されたかどうかの指標をなんら提供するものではない。標準的な条件下では、核酸塩基アシル保護基が常に定量的に切断され得るわけではなく、したがって、アミノ基の一部が保護されたままとなることが知られている。しかしながら、アミノ基の完全な脱保護はチップの最適は適用に必須である。アミノ官能保護基のすべてが切断されるはずはないが、ワトソン-クリックまたはフーグスティーン型塩基対の形成が阻害されるため、続くハイブリダイゼーションは決定的に障害され得る。

したがって、本発明の目的は、非破壊的であり、いったん最終脱保護または検出が行なわれたら、さらなる工程を必要とせず、脱保護の割合の評価ならびに後の使用に自由に利用し得るバイオポリマーの品質の評価を可能にする方法を提供することである。

すなわち、本発明は、
（１）（ａ）検出可能な保護基を含むモノマーまたはオリゴマー建築ブロックからアレイ上に複数の種々のバイオポリマー種を合成する工程；
（ｂ）合成後に該アレイ上の検出可能な保護基の測定を任意に実施する工程；
（ｃ）該検出可能な保護基を切断除去する工程；および
（ｄ）脱保護の効力を測定するために切断後に該アレイ上の検出可能な保護基の測定を実施する工程；
を含む、バイオポリマーアレイを製造するための品質管理方法、

（２）検出可能な保護基が蛍光性の検出可能な保護基から選択される前記（１）記載の方法、

（３）蛍光性の検出可能な保護基がピレン、ダンシル、スチルベン、ローダミンまたはクマリン部分を含む基から選択される前記（２）記載の方法、

（４）検出可能な保護基が放射性の検出可能な保護基である前記（１）記載の方法、

（５）放射性の検出可能な保護基が¹⁴C、³²Pまたは³Hドープ部分を含む基から選択される前記（４）記載の方法、

（６）検出可能な保護基が電気化学的に検出可能な保護基から選択される前記（１）記載の方法、

（７）電気化学的に検出可能な保護基がフェロセンまたはフェノチアジン部分を含む基から選択される前記（６）記載の方法、

（８）検出可能な保護基がUV-またはIR-検出可能な保護基から選択される前記（１）記載の方法、

（９）UV-またはIR-検出可能な保護基が芳香族ニトロ部分、ヒドロキシル部分、チオール、チオエーテルもしくはチオフェノール部分、ニトリル部分、イソシアネートもしくはハロ部分を含む基から選択される前記（８）記載の方法、

（１０）検出可能な保護基がバイオアフィン検出可能な保護基から選択される前記（１）記載の方法、

（１１）バイオアフィン検出可能な保護基がビオチン、ジゴキシンまたはジゴキシゲニン部分を含む基から選択される前記（１０）記載の方法、

（１２）バイオポリマー種が核酸、核酸アナログ、ペプチドおよびペプチドアナログから選択される前記（１）〜（１１）いずれか記載の方法、

（１３）バイオポリマー種が核酸および核酸アナログから選択され、検出可能な保護基が核酸塩基に結合される前記（１２）記載の方法、

（１４）検出可能な保護基が核酸塩基のアミノ基に結合される前記（１３）記載の方法、

（１５）バイオポリマー合成のための建築ブロックが、一般構造式(I)または(II)：

（式中、R¹はヒドロキシ保護基であり、
R²は-H、-(C₁〜C₁₀)-アルコキシ、-(C₂〜C₁₀)-アルケニルオキシ、-(C₂〜C₁₀)-アルキニルオキシ、-ハロゲン、-アジド、-NHR7、-SR7または-OR7（式中、R7は保護基またはレポーター基である）であり、
R³はリン酸塩、H-ホスホン酸塩または保護基を含み得る他のリン酸塩アナログ基であり、
Bは核酸塩基または核酸塩基アナログであり、
nは0または1であり、
Lは検出可能な保護基である）
を有するヌクレオチド建築ブロックである、前記（１２）〜（１４）いずれか記載の方法、

（１６）R¹が任意に置換されたトリフェニルメチル基（例えば、4,4'-ジメトキシトリフェニルメチルまたは4-モノメトキシトリフェニルメチル）、ピキシル基、光切断可能基（例えば、p-ニトロフェニルプロポキシカルボニル（NPPOC）または(α-メチル)-6-ニトロピペロニルオキシカルボニル（MeNPOC））、および置換シリル保護基（例えば、tert-ブチルジメチルシリル（TBDMS）またはtert-ブチルジフェニルシリル（TBDPS））から選択される、前記（１５）記載の方法、

（１７）R³が亜リン酸アミド基である前記（１５）または（１６）記載の方法、

（１８）R³が基-P(R⁶)-NR⁴R⁵であり、式中、R⁴およびR⁵は独立して-H、-(C₁〜C₁₀)-アルキル、-(C₂〜C₁₀)-アルケニル、-(C₆〜C₂₂)-アリールからなる群より選択されるか、またはNと一緒になってNR⁴R⁵は5〜6員の複素環式環を形成し得、R⁶は-(C₂〜C₆)-アルケニルオキシ、-(C₂〜C₆)-アルケニル、-(C₁〜C₆)-アルキル、-(C₁〜C₆)-アルコキシからなる群より選択され、各基は-ハロ、p-ニトロアリールオキシおよび-シアノから選択される１つまたは数個の置換基を含み得るか、またはR⁶は-Hである、前記（１２）記載の方法、

（１９）R⁶が2-シアノエチルオキシ基である前記（１８）記載の方法、

（２０）Lが、n=1の場合、構造-C(O)-R、またはn=0の場合、=CH-NR⁸Rを有し、式中、Rは保護基の残基であり、R⁸はHおよび-(C₁〜C₃)-アルキルから選択される、前記（１５）〜（１９）いずれか記載の方法、

（２１）Bがアデニン、グアニン、シトシン、そのアザおよび／またはデアザアナログ、ならびにさらなるアミノ基を含有するアナログから選択される前記（１５）〜（２０）いずれか記載の方法、

（２２）一般構造式(I)または(II)：

（式中、R¹はヒドロキシ保護基であり、
R²は-H、-(C₁〜C₁₀)-アルコキシ、-(C₂〜C₁₀)-アルケニルオキシ、-(C₂〜C₁₀)-アルキニルオキシ、-ハロゲン、-アジド、-NHR⁷、-SR⁷または-OR⁷（式中、R⁷は保護基またはレポーター基である）であり、
R³はリン酸塩、H-ホスホン酸塩または保護基を含み得る他のリン酸塩アナログ基であり、
Bは核酸塩基または核酸塩基アナログであり、
nは0または1であり、
Lは検出可能な保護基である）
を有する核酸合成建築ブロック、

（２３）核酸アレイの生成のための前記（２２）記載の建築ブロックの使用、

（２４）前記（２２）記載の核酸合成建築ブロックを少なくとも１つ含んでなる核酸アレイの合成用の試薬キット、ならびに

（２５）それぞれ異なる検出保護基を保有する前記（２２）の核酸合成建築ブロックを少なくとも２つ含んでなる前記（２４）記載の試薬キット、
に関する。

これらの単純な工程は、合成されたバイオポリマーの品質管理を可能にする。主要点は、バイオポリマー脱保護の完全性の品質管理である。重要な利点は、この方法論が非破壊的であり、いったん最終脱保護または検出が行なわれたら、さらなる工程を必要としないことである。成果は、脱保護の割合の評価ならびに後の使用に自由に利用し得るバイオポリマーの品質の評価である。

したがって、本発明は、
(a) 検出可能な保護基を含有するモノマー建築ブロックまたはオリゴマー建築ブロックから複数の異なるバイオポリマー種をアレイ上に合成する工程；
(b) 合成後、任意にアレイ上の検出可能な保護基の測定を行なう工程；
(c) 該検出可能な保護基を切断する工程、および
(d) 脱保護の効率を調べるため、切断後、アレイ上の該検出可能な保護基の測定を行なう工程
を含む、バイオポリマーアレイを製造するための品質管理方法に関する。

一般に、本発明は、バイオポリマーアレイの製造における、検出可能な保護基の使用に関する。本明細書において使用される用語「バイオポリマー」は、特に、DNAもしくはRNAなどの核酸またはペプチド核酸(PNA)もしくはロック(locked)核酸(LNA)などの核酸アナログまたはその組み合わせに関する。しかしながら、該用語はまた、ペプチドおよびペプチドアナログならびに炭水化物などの他のバイオポリマーまたはその任意の組み合わせに関する。好ましくは、バイオポリマー種は、検出可能な保護基が核酸塩基、特に核酸塩基のアミノ基に結合している核酸および核酸アナログから選択される。

本明細書で使用される用語「アレイ」は、固体支持体、例えば、平面または非平面固体支持体に関する。固体支持体は、シリコン、金属、シリカ、ガラスなどの金属酸化物またはプラスチックまたはその任意の組み合わせなどの材料から選択される表面を有し得る。好ましくは、アレイはチップである。

本発明の方法は、モノマー建築ブロックまたはオリゴマー建築ブロックから複数の異なるバイオポリマー種をアレイ上に合成する工程を含む。例えば、核酸は、当該技術分野で公知のホスホアミダイト建築ブロックまたはホスホネート建築ブロックから合成され得る。合成は、空間的に指向される合成、例えば、担体の異なる位置における異なるバイオポリマー種の合成である。空間的に指向されるバイオポリマー合成方法としては、光指向性合成、マイクロリソグラフィー、インクジェットによる塗布、ピンプリンティング、特定の位置へのマイクロチャンネル蒸着および物理的バリアによる金属イオン封鎖が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、これらの方法は、通常、保護基を除去することにより、担体上に活性部位を作製し、該活性部位に、モノマー建築ブロックまたはオリゴマー建築ブロック（これら自身は、建築ブロックのさらなる結合が所望される場合、任意に、保護された活性部位を有する）を結合させることを含む。

好ましい態様では、バイオポリマー種の合成は、検出可能な保護基が、合成が終結するまでバイオポリマー種上に残留するような様式で行なわれる。合成は、標準的なプロトコルを用いて行なわれ得ることに注意されたい。

合成が終結した後、アレイ上の検出可能な保護基の第１測定を行ない得る。この手段により、アレイ上のバイオポリマーの定性的および／または定量的測定が可能である。第１測定工程は、好ましくは、検出可能な保護基の定性的および／または定量的測定が、アレイ上の異なる位置で別個に行なわれる空間的分離測定工程である。空間的に指向される検出手順のための技術は、アレイ上の複数の位置での平行測定を可能にする空間的分離検出器、例えば、顕微鏡またはCCD画像形成システムなどの検出器マトリックスの使用を含み得る。

任意の第１測定後、検出可能な保護基を切断する。切断は、それぞれの検出基の性質に応じて公知のプロトコルにより、例えば、照射などの光化学的方法、または酸もしくは塩基処理などの化学的方法により行なわれ得る。これに関して、検出可能な保護基は、好ましくは、バイオポリマー合成手順の間は切断されないように選択されることに注意されたい。

検出可能な保護基の切断後、保護効率を調べるため、検出可能な保護基の測定をアレイ上で行なう。この測定は、定性的および／または定量的であり得る。第１測定を行なう場合、切断前と切断後の保護基の量の差は、脱保護されたバイオポリマーの量を示し、したがって、脱保護の割合を示す。脱保護後に保護基がそれ以上検出されなくなったら、脱保護は定量され、それ以外の場合、脱保護の反復が必要であり得る。

本発明の第１態様において、検出可能な保護基は、蛍光性基、例えばピレン、ダンシル(dansyl)、スチルベン、ローダンミンおよび／またはクマリン部分を含む基から選択される。蛍光性基の重要な特徴は、オリゴヌクレオチド合成の間は安定であるということである。例えば、蛍光性部分は、アシル、例えば、tert-ブチルフェノキシアセチル保護基または別のアミノ保護基と組み合わされてもよい。

さらなる態様において、検出可能な保護基は、放射能により検出可能な保護基から選択され得る。例えば、放射能により検出可能な基は、適当な保護基、例えばアミノ保護基と組み合わされてもよい¹⁴C、³²Pおよび³Hドープ部分を含有する基から選択される。

またさらなる態様において、検出可能な保護基は、電気化学的に検出可能な保護基、例えば、フェロセンおよび／またはフェノチアジン部分を含有する基から選択され得る。これらの部分は、適当な保護基、例えばアミノ保護基と組み合わされてもよい。かかる保護基の測定は、電気化学的方法、例えば、ボルタンメトリーにより行なわれ得る。

本発明のなおさらなる態様では、検出可能な保護基は、UVまたはIR検出可能な保護基から、例えば、芳香族ニトロ部分、水酸基部分、チオール、チオエーテルもしくはチオフェノール部分、ニトリル部分、イソシアネート部分および／またはハロ部分から選ばれうる。UVおよびIR検出可能な保護基は、好ましくは、アレイ上で合成された生体高分子種から独立して検出可能である。

なおさらなる態様では、検出可能な保護基は、バイオアフィン検出可能な保護基から選ばれる。バイオアフィン検出可能な保護基は、結合対のそれぞれの他のパートナーとのその特異的相互作用により検出されうるバイオアフィン結合対のパートナーから選択された部分を含む。バイオアフィン検出可能な保護基の特定の例は、ビオチン、ジゴキシンまたはジゴキシゲニン部分を含む保護基である。ビオチンは、ストレプトアビジンもしくはアビジンとのまたは抗ビオチン-抗体とのそのバイオアフィン相互作用により検出されうる。ジゴキシンまたはジゴキシゲニンは、それぞれの抗体との特異的な相互作用により検出されうる。

本発明の特に好ましい態様では、バイオポリマー合成のための建築ブロックは、一般式ＩまたはII：

（式中、R¹はヒドロキシ保護基であり、
R²は、-H、-(C₁〜C₁₀)-アルコキシ、-(C₂〜C₁₀)-アルケニルオキシ、-(C₂〜C₁₀)-アルキニルオキシ、ハロゲン、-アジド、-NHR⁷、-SR⁷またはOR⁷であり、ここでR⁷は保護基またはレポーター基であり、
R³は、ホスフェート、H-ホスホネートまたは保護基を含みうる他のホスフェートアナログ基であり、
Bは核酸塩基または核酸塩基アナログであり、
nは0または1であり、
Lは、n=1の場合、例えば、構造-C(O)-Rの検出可能な保護基であり、またはn=0である場合、＝CH-NR⁸Rであり、ここでRはレポーター基の残基であり、R⁸は、-(C₁〜C₃)-アルキルからなる群より選ばれる）
を有するヌクレオチド建築ブロックである。

化合物（I）または（II）において、5'または3'ヒドロキシ保護基R¹は、好ましくは任意に置換されたトリフェニルメチル基、例えば、4,4'-ジメトキシトリフェニルメチルまたは4-モノメトキシトリフェニルメチル、ピクシル基、光切断可能基、例えば、p-ニトロフェニルプロポキシカルボニル（NPPOC）または（α-メチル）-6-ニトロピペロニルオキシカルボニル（MeNPOC）、および置換シリル保護基、例えば、tert-ブチルジメチルシリル（TBDMS）またはtert-ブチルジフェニルシリル（TBDPS）から選ばれる。

基R³は、保護基、好ましくはホスフィトアミド基、より好ましくは基-P(R⁶)NR4R5、を含みうるホスフェートまたはホスフェートアナログ基であり、ここでR⁴およびR⁵は、-H、-(C₁〜C₁₀)-アルキル、-(C₂〜C₁₀)-アルケニル、-(C₆-C₂₂)-アリールからなる群より独立して選ばれ、またはNR⁴R⁵は、Nと共に5〜6-員複素環式環を形成し得、
R⁶は、-(C₂〜C₆)-アルケニルオキシ、-(C₂〜C₆)アルケニル、-(C₁〜C₆)-アルキル、または-(C₁〜C₆)-アルコキシであり、
ここで、各基は、-ハロ、p-ニトロアリールオキシおよび-シアノから選ばれる１つまたはいくつかの置換基を含みうるか、またはR⁶は-Hであり、
R⁶は最も好ましくは2-シアノエチルオキシ基である。

Bは、少なくとも１つのアミノ基、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、または対応する核酸塩基アナログを有する核酸塩基または核酸塩基アナログである。核酸塩基または核酸塩基アナログは、好ましくは、核酸分子への取り込み後に相補的な核酸塩基とともに水素架橋形成しうる。適切な核酸塩基アナログは、複素環が、Simons（Advanced 2001 Chemistry Texts, Nucleoside Mimetics, Gordon and Breach Science Publishers, Amsterdam 2001, Chapter 4）に記載されるような天然の核酸塩基とは異なる少なくとも１つのアミノ基を含む単環式および二環式複素環、例えば、プリンまたはピリミジン環のCH-部分が窒素で置換されている天然に存在する核酸塩基のアザアナログ（8-アザ-アデノシン等）または環のＮ原子がCH基により置換されている天然に存在する核酸塩基のデアザアナログ（7-デアザ-グアノシン等）またはアザおよびデアザ置換の組み合わせ（8-アザ-7-デアザ-グアノシン等）である。さらに好ましい核酸塩基アナログは、C-ヌクレオシド、例えば、プリン塩基のN9原子またはピリミジン塩基のN1原子がそれぞれ、ホルマイシンおよびシュードイソシチジン等の炭素原子（sp²配置の）により置換されているデアザ核酸塩基である。さらに、適切な核酸塩基アナログは、さらなるアミノ基、例えば、2-アミノアデノシンを保有しうる。さらに、核酸塩基または核酸塩基アナログは置換され得、ここで置換基、例えば、C₁〜C₃アルキルまたはアルコキシ、C₂〜C₃アルケニルまたはアルケニルオキシ、C₂〜C₃アルキニルまたはアルキニルオキシおよび／またはハロ置換基は、相補性塩基への水素架橋の形成と好ましくは適合する。置換基の好ましい位置は、ピリミジン塩基のC5、プリン塩基のC8およびデアザプリン塩基のC7である。

さらに、本発明は、上記のような一般式ＩまたはIIを有する核酸合成建築ブロックに関する。

建築ブロックは核酸アレイの製造に適切である。

さらに、本発明は、上記のような少なくとも１つの核酸合成建築ブロックを含む核酸アレイの合成のための試薬キットに関する。例えば、試薬キットは、各々異なる検出可能な保護基を保有する少なくとも２つの異なる核酸合成建築ブロックを含みうる。異なる検出可能な保護基は、好ましくは、互いに独立して検出可能である。例えば、試薬キットは、少なくとも２つの異なる独立して検出可能な蛍光保護基、または検出可能な保護基の種々の態様の組み合わせ、例えば、蛍光およびバイオアフィン検出可能な保護基または種々の保護基の他の組み合わせを含みうる。

さらに、本発明は、以下の図面および実施例により、より詳細に説明される。

スチルベン標識核酸合成建築ブロックの合成
4-ヒドロキシスチルベンから出発し、所望のスチルベン標識建築ブロックを、図５のスキームに従って以下の工程Ａ）〜Ｆ）で合成した。

Ａ）(4-スチリル-フェノキシ)-酢酸エチルエステル（ａ）の合成。
550mgの水素化ナトリウム（パラフィンオイル中の60％懸濁物）を２ｇトランス4ヒドロキシスチルベンの70ml乾燥ジオキサン溶液に添加した。室温で１時間の撹拌後、1.2mlのヨード酢酸エチルエステルを添加した。混合物を１時間還流し、次いで室温に冷却した。濾過後、溶媒をロータリーエバポレーターを用いて除去し、残渣を、溶出液としてヘキサン／酢酸エチルエステル2:1を用いるシリカゲルにおけるカラムクロマトグラフィーにより精製した。
収量：1.0g。

Ｂ）(4-スチリル-フェノキシ)-酢酸（ｂ）の合成。
20mlの10MolのNaOHを１ｇ（4-スチリル-フェノキシ）酢酸エチルエステル（ａ）の60mlジオキサン溶液に20分間内に添加した。５時間の撹拌後、10MolのHClでpHをpH２に調整した。混合物を酢酸エチルエステルで抽出した。有機層を分離し、水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を蒸発させた。乾燥剤として塩化カルシウムを用いて、残渣を減圧下で５日間乾燥させた。
収量：0.81g。

Ｃ）N6(4-スチリル-フェノキシ)-アセチル-4.2(-)-3',5'-O-(1,1,3,3-テトライソプロピル-1,3-ジシロキサンジイル)アデノシン（ｃ）。
0.81ｇの(4-スチリル-フェノキシ)-酢酸（ｂ）を15mlのジオキサンおよび３mlの塩化メチレンの混合物に溶解させた。4〜8℃で2.6mlの塩化オキサリルを添加した後、混合物を室温で４時間撹拌した。ロータリーエバポレーターを用いることにより溶媒を除去した。残渣を10mlの塩化メチレンに溶解させた。溶液を、1.35ｇの4.2(-)-3',5'-O-(1,1,3,3-テトライソプロピル1,3-ジシロキサンジイル)アデノシンの30ml塩化メチレン溶液および３mlピリジン溶液に室温で滴下した。次いで混合物を一晩撹拌した。ロータリーエバポレーターを用いることにより溶媒を除去し、残渣を、トルエン／酢酸エチルエステル／メタノール4:1:1を用いるシリカゲルにおけるカラムクロマトグラフィーにより精製した。
収量：1.5g。

Ｄ）N6(4-スチリル-フェノキシ)-アセチルアデノシン（ｄ）の合成。
1.5ｇのN6(4-スチリル-フェノキシ)-アセチル-4.2(-)-3'-,5'-O-(1,1,3,3-テトライソプロピル-1,3-ジシロキサンジイル)アデノシン（ｃ）を90mlの1MテトラブチルアンモニウムフルオライドTHF溶液に溶解させ、一晩撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターを使用することにより除去し、残渣を酢酸エチルエステル／メタノール2:1を用いるシリカゲルにおけるカラムクロマトグラフィーにより精製した。
収量：0.56g。

Ｅ）5'-(p,p'-ジメトキシトリチル)-N6(4-スチリル-フェノキシ)-アセチルアデノシン（ｅ）の合成
0.46gの塩化ジメトキシトリチルを含有する10mlの乾燥ピリジン溶液を、室温にて1時間以内に0.56gのN6(4-スチリル-フェノキシ)-アセチルアデノシン（ｄ）を含有する10mlの乾燥ピリジン溶液に滴下した。一晩撹拌後、ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を蒸発させた。残渣を300mlの酢酸エチルエステルに溶解し、100mlの水で洗浄した。有機相を分離し、硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた。濾過後、溶媒をロータリーエバポレーターを使用して除去した。

シリカゲル上のカラムクロマトグラフィーにより精製を実施した。従って、粗生成物を0.1％のトリエチルアミンを含有する塩化メチレン／メタノール10：1混合物に溶解した。溶液を、シリカゲル60（0.063〜0.200mm）で充填したI=40cm/d=6.9cmのカラムに適用した。生成物を0.1％のトリエチルアミンを含有する塩化メチレン／メタノール10：1混合物で溶出させた。TLC(シリカゲル)：0.1％のトリエチルアミンを含有する塩化メチレン／メタノール10：1混合物：Rf：0.56。
収量：200mg

Ｆ）5'-(p,p'-ジメトキシトリチル)-N6(4-スチリル-フェノキシ)-アセチルアデノシンの2-シアノエチルホスホルアミダイト（ｆ）の合成
アルゴン下室温にて、0.56μlのNエチルジイソプロピルアミンおよび次いで73μlのクロロ-2-シアノエトキシジイソプロピルアミノホスファンを、200mgの5'-(p,p'-ジメトキシトリチル)-N6(4-スチリル-フェノキシ)-アセチルアデノシン（ｅ）を含有する5mlの塩化メチレン溶液に添加した。溶媒をロータリーエバポレーターを使用して除去した。残渣を50mlの酢酸エチルエステルに溶解し、10mlの5％炭酸水素ナトリウム溶液で２回洗浄した。有機相を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。濾過後、溶媒をロータリーエバポレーターを使用して除去した。

シリカゲル上のカラムクロマトグラフィーにより精製を実施した。従って、粗生成物を塩化メチレン／アセトン／トリエチルアミン45：5：0.5混合物に溶解した。溶液を、シリカゲル60（0.063〜0.200mm）で充填したI=32cm/d=4.5cmのカラムに適用した。生成物を0.1％のトリエチルアミンを含有する酢酸エチルエステル／ヘキサン1：1混合物で溶出させた。TLC(シリカゲル、塩化メチレン／アセトン／トリエチルアミン45：5：0.5)：Rf：0.70。

NMR(^d6-DMSO) ¹H(300MHz): 10.97 s[1H], 8.64 s[1H], 8.56 s[1H],6.78-7.5 m[24H], 6.50 s broad [1H], 5.20 s[2H], 4.82 s, broad [1H], 4.16 s, broad [1H], 3.64 s[6H], 3.55 s, broad [2H], 3.64 s, broad [2H], 3.23 s, broad [2H], 3.11 m, broad [1H], 2.73 dt[2H], 2.55 m, broad [1H] 1.22 dd[12H] ³¹P(300MHz): 148.89 d.
収量：120mg。

図１は、蛍光、ピレン-標識シチジン建築ブロックを示す模式図である。ピレン含有核酸塩基保護基は、蛍光特性を示し、それゆえ、光学的解析手順により検出されうる。核酸塩基アミノ官能基がビオチンまたはジゴキシゲニン標識系を有する切断可能アシル基で保護される場合、検出はストレプトアビジンまたは抗ジゴキシゲニンを用いて行われうる。図２は、IR検出可能なニトロ芳香族部分を有するシチジン建築ブロックを示す図である。図３は、電気化学的に検出可能なフェロセン部分を有するシチジン建築ブロックを示す図である。図４は、蛍光検出可能なスチルベン部分を有するアデニン建築ブロックを示す図である。図５は、図４のアデニン建築ブロックの合成のスキームを示す図である。

Claims

（ａ）検出可能な保護基を含むモノマーまたはオリゴマー建築ブロックからアレイ上に複数の種々のバイオポリマー種を合成する工程；
（ｂ）合成後に該アレイ上の検出可能な保護基の測定を任意に実施する工程；
（ｃ）該検出可能な保護基を切断除去する工程；および
（ｄ）脱保護の効力を測定するために切断後に該アレイ上の検出可能な保護基の測定を実施する工程；
を含む、バイオポリマーアレイを製造するための品質管理方法。
バイオポリマー種が核酸、核酸アナログ、ペプチドおよびペプチドアナログから選択される請求項１記載の方法。
バイオポリマー種が核酸および核酸アナログから選択され、検出可能な保護基が核酸塩基に結合される請求項２記載の方法。
検出可能な保護基が核酸塩基のアミノ基に結合される請求項３記載の方法。
バイオポリマー合成のための建築ブロックが、一般構造式(I)または(II)：

式中、R¹はヒドロキシ保護基であり、
R²は-H、-(C₁〜C₁₀)-アルコキシ、-(C₂〜C₁₀)-アルケニルオキシ、-(C₂〜C₁₀)-アルキニルオキシ、-ハロゲン、-アジド、-NHR7、-SR7または-OR7（式中、R7は保護基またはレポーター基である）であり、
R³はリン酸塩、H-ホスホン酸塩または保護基を含み得る他のリン酸塩アナログ基であり、
Bは核酸塩基または核酸塩基アナログであり、
nは0または1であり、
Lは検出可能な保護基である
を有するヌクレオチド建築ブロックである、請求項２〜４いずれか記載の方法。
R¹が任意に置換されたトリフェニルメチル基（例えば、4,4'-ジメトキシトリフェニルメチルまたは4-モノメトキシトリフェニルメチル）、ピキシル基、光切断可能基（例えば、p-ニトロフェニルプロポキシカルボニル（NPPOC）または(α-メチル)-6-ニトロピペロニルオキシカルボニル（MeNPOC））、および置換シリル保護基（例えば、tert-ブチルジメチルシリル（TBDMS）またはtert-ブチルジフェニルシリル（TBDPS））から選択される、請求項５記載の方法。
R³が亜リン酸アミド基である請求項５または６記載の方法。
R³が基-P(R⁶)-NR⁴R⁵であり、式中、R⁴およびR⁵は独立して-H、-(C₁〜C₁₀)-アルキル、-(C₂〜C₁₀)-アルケニル、-(C₆〜C₂₂)-アリールからなる群より選択されるか、またはNと一緒になってNR⁴R⁵は5〜6員の複素環式環を形成し得、R⁶は-(C₂〜C₆)-アルケニルオキシ、-(C₂〜C₆)-アルケニル、-(C₁〜C₆)-アルキル、-(C₁〜C₆)-アルコキシからなる群より選択され、各基は-ハロ、p-ニトロアリールオキシおよび-シアノから選択される１つまたは数個の置換基を含み得るか、またはR⁶は-Hである、請求項２記載の方法。
一般構造式(I)または(II)：

式中、R¹はヒドロキシ保護基であり、
R²は-H、-(C₁〜C₁₀)-アルコキシ、-(C₂〜C₁₀)-アルケニルオキシ、-(C₂〜C₁₀)-アルキニルオキシ、-ハロゲン、-アジド、-NHR⁷、-SR⁷または-OR⁷（式中、R⁷は保護基またはレポーター基である）であり、
R³はリン酸塩、H-ホスホン酸塩または保護基を含み得る他のリン酸塩アナログ基であり、
Bは核酸塩基または核酸塩基アナログであり、
nは0または1であり、
Lは検出可能な保護基である
を有する核酸合成建築ブロック。
核酸アレイの生成のための請求項９記載の建築ブロックの使用。
請求項９記載の核酸合成建築ブロックを少なくとも１つ含んでなる核酸アレイの合成用の試薬キット。