JP2004250407A - アミロイド蓄積性疾患の診断プローブおよび治療用化合物 - Google Patents

Abstract

【課題】アミロイドβ蛋白が蓄積する疾患の画像診断プローブ用化合物、それを含有する組成物、キット、老人斑の染色方法、蛋白βシート構造が病因となる疾患予防、治療用医薬組成物の提供。
【解決手段】画像診断プローブ用の式Ｉ（ａ）またはＩ（ｂ）：

［式中、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３は独立して水素、ハロゲン、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＳＯ_３Ｈ、ＮＨ_２、ＮＯ_２、炭素数１〜４個のアルキル、Ｏ−炭素数１〜４個のアルキルであり、Ｒ_４およびＲ_５は独立して水素または炭素数１〜４個のアルキルであり、Ｘは酸素、イオウまたはＮＲ_６であり、Ｒ_６は水素または炭素数１〜４個のアルキルであり、Ｙは窒素またはＣＲ_７であり、Ｒ_７は水素または炭素数１〜４個のアルキルであり、Ｚは窒素またはＣＲ_８であり、Ｒ_８は水素または炭素数１〜４個のアルキルであり、ｎは０ないし４の整数である］
で示される化合物またはその塩もしくは溶媒和物。
【選択図】 なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アミロイドβ蛋白が蓄積する疾患の画像診断プローブ、詳細には陽電子放出核種により標識されたプローブ、ならびに該プローブを含む画像診断用組成物に関する。さらに本発明は、例えば、脳材料中のアミロイドβ蛋白の検出・染色、例えば、アルツハイマー病患者脳における老人斑の検出・染色、ならびに蛋白のβシート構造が病因または病因の一部となる疾患の予防および／または治療用の医薬組成物にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
アミロイドが蓄積する疾患には、体内の種々の器官や組織への不溶性原線維性蛋白（アミロイド）の沈着を特徴とする種々の疾病があり、アルツハイマー病やダウン症候群等が含まれる。このうち、アルツハイマー病（ＡＤ）は現在最も治療の困難な疾病の１つとされており、正確な早期診断が望まれている。
アルツハイマー病（ＡＤ）は現在最も治療の困難な疾病の１つとされており、正確な早期診断が望まれている疾病である。アルツハイマー病は主として初老期から老年期に起こる進行性の痴呆を特徴とする疾患である。病理学的には大脳の全体的な萎縮、神経細胞の著しい変性と脱落、神経原線維変化と老人斑の出現を特徴とする。アルツハイマー病に代表される痴呆の最大のリスクファクターは加齢であることが知られている。したがって、老齢人口の増加に伴う患者数の増加は、特に、高齢化社会となっている日本、アメリカ、ヨーロッパ諸国において顕著であり、それに対する医療コストはこれらの国の医療システムを危機におとしめている。
なお、我が国においてはアルツハイマー病患者数は約１００万人と推定され、今後人口の高齢化に伴いその患者数は増大することが確実視されている。アルツハイマー病患者にかかわる費用は介護費用を含めると年間患者１人当たり２５０万円を超えると考えられていることから、すでに我が国では２兆５千億円を超える社会経済的コストを払っていることになる。アルツハイマー病において痴呆症状が顕在化する以前ないしはできるだけ早期に治療を加えることは、大きな医療経済的効果をもたらすことはいまや世界の常識となっている。しかし現状ではこれらの段階のアルツハイマー病を正確に診断することは極めて困難である。
【０００３】
現在のアルツハイマー病診断方法は各種あるが、我が国においては長谷川式、ＡＤＡＳ、ＭＭＳＥ等の、アルツハイマー病が疑われる個体の認知機能の低下を定量的に評価する方法が一般的であり、まれに画像診断法（ＭＲＩ、ＣＴ等）が補助的に用いられている。しかしこれらの診断法では病気を確定するには不十分であり、確定診断には生前における脳の生検（バイオプシー）、死後脳の病理組織学的検査が必要である。このように、アルツハイマー病の診断法についても精力的な研究が行われているにもかかわらず、それほどの進歩がみられないでいる。多くの研究の結果、最初の臨床症状が現れるかなり前（長い場合は約４０年前）にはすでにアルツハイマー病特徴的な神経変性が始まっていることが判ってきた。また同病においては患者を取り巻く家族または臨床家が最初の臨床症状に気づいた時には、すでに脳内病理像は取り返しのつかない状態まで進行していることが知られている。上述のような病状の進行特性および患者数の激増を考え合わせると、アルツハイマー病の正確な早期診断の必要性ならびに意義は極めて大きい。
【０００４】
アルツハイマー病の病理組織像は２つの主徴に代表される。すなわち老人斑および神経原線維変化である。前者の主構成成分はβシート構造をとったアミロイドβ（Ａβ）蛋白であり、後者のそれは過剰リン酸化されたアミロイドβ蛋白である。アルツハイマー病の確定診断はこれらの病理学的特徴が患者脳内に出現することをよりどころとしている。
アミロイドβ蛋白はアルツハイマー病を包含するアミロイドが蓄積する疾患に特徴的であり、密接な関連性を有している。したがって、体内、特に脳内でβシート構造をとったアミロイドβ蛋白をマーカーとして検出することが、アミロイドが蓄積する疾患、特にアルツハイマー病の重要な診断方法の１つとなる。アルツハイマー病をはじめとするアミロイドが蓄積する疾患の診断を目的として、体内、特に脳内アミロイドβ蛋白に特異的に結合し、これを染色する物質の検索が従来から行われている。かかる物質としてはコンゴーレッド（非特許文献１参照）およびチオフラビンＳ（非特許文献２参照）、チオフラビンＴ（非特許文献３参照）ならびにクリサミンＧおよびその誘導体（特許文献１および特許文献２参照）等が知られているが、アミロイドβ蛋白に対する結合特異性、血液−脳関門透過性、溶解度、毒性等の面から問題が少なくない。本発明者らは、アミロイドβ蛋白に対して特異性が高く、血液−脳関門透過性、溶解度が大きく、毒性が小さい等の特徴を有する種々の化合物化合物を見出している（特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６および特許文献７参照）。
【０００５】
脳内蛋白がβシート構造をとることによって、その蛋白自身が病因となる疾患が知られている。 アルツハイマー病においてはアミロイドβ蛋白およびタウ蛋白がβシート構造をとることによって、蛋白自身が病因または病因の一部となっていると考えられている。 Ｙａｎｋｎｅｒらはアミロイドβ蛋白にβシート構造をとらせることにより神経細胞毒性を発揮することを初めて報告した（サイエンス、２４５巻、４１７−４２０ページ、１９８９）。その後、多くの追試が行われ、βシート構造をとったアミロイドβ蛋白が、神経細胞毒性を有することが確認された。このようにβシート構造をとったアミロイドβ蛋白、タウ蛋白に神経細胞毒性がみられることから、その細胞毒性を抑制する化合物は蛋白自身がβシート構造をとることによって病因、または病因の一部となる疾患、例えばアルツハイマー病の治療薬になりうることが示唆される。
【０００６】
これまでアルツハイマー病の研究あるいは生検または剖検試料を用いた診断等には、アルツハイマー患者から得た脳試料の切片を調製し、これを染色することが行われてきた。従来の染色剤は主として、コンゴーレッドまたはチオフラビンＳが用いられてきた。これらの染色剤は、上述のごとくアミロイドβ蛋白に対する結合特異性、血液−脳関門透過性、溶解度、毒性等の面から問題が少なくない。
したがって、アルツハイマー病をはじめとするアミロイドβ蛋白が蓄積する疾患の診断のための、アミロイドβ蛋白に対する特異性の高い化合物に対する必要性が高まっている。
【０００７】
【特許文献１】
国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９１８明細書
【特許文献２】
国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／０７８８９明細書
【特許文献３】
特願平第２０００−０８００８２号明細書
【特許文献４】
特願平第２０００−０８００８３号明細書
【特許文献５】
特願平第２００１−０７６０７５号明細書
【特許文献６】
国際特許出願ＰＣＴ／ＪＰ０１／０２２０４明細書
【特許文献７】
国際特許出願ＰＣＴ／ＪＰ０１／０２２０５明細書
【非特許文献１】
パチトラー（Ｐｕｃｈｔｌｅｒ）ら、ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第１０巻、３５頁、１９６２年
【非特許文献２】
パチトラー（Ｐｕｃｈｔｌｅｒ）ら、ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第７７巻、４３１ページ、１９８３年
【非特許文献３】
レバイン（ＬｅＶｉｎｅ）、プロテインサイエンス（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２巻、４０４−４１０ページ、１９９３年
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記事情に鑑み、アミロイドβ蛋白に対する結合特異性、ならびに血液−脳関門透過性が高く、アミロイドβ蛋白が蓄積する疾患の画像診断プローブとして使用できる物質を提供するものである。また本発明は、アミロイドβ蛋白が蓄積する疾患の画像診断プローブとして用いられる標識されたかかる物質、ならびにかかるプローブを含む画像診断用組成物およびキットも提供する。さらに本発明は、脳材料中のアミロイドβ蛋白、例えば、これを主成分とする老人斑の染色方法、ならびに蛋白のβシート構造が病因または病因の一部となる疾患の予防および／または治療用の医薬組成物も提供する。
【０００９】
【課題を解決するための手段および発明の実施の形態】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、式Ｉ（ａ）またはＩ（ｂ）に示す化合物またはその塩もしくは溶媒和物がアミロイドβ蛋白に対して高い結合特異性を有し、さらに血液−脳関門透過性も高いことを見出し、本発明を完成するに至った。特に、本発明化合物はアミロイドβ蛋白を特異的かつ鮮明に染色することから、特にアルツハイマー病、ダウン症候群などの正確な早期診断を可能にするものといえる。また、本発明化合物は血液−脳関門透過性も高いことから、生前における非侵襲性の診断が可能となる。
【００１０】
すなわち、本発明は、
（１）アミロイドβ蛋白が蓄積する疾患の画像診断プローブとして使用される、式Ｉ（ａ）またはＩ（ｂ）：
【化２】

［式中、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３は独立して水素、ハロゲン、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＳＯ_３Ｈ、ＮＨ_２、ＮＯ_２、炭素数１〜４個のアルキル、Ｏ−炭素数１〜４個のアルキルであり、
Ｒ_４およびＲ_５は独立して水素または炭素数１〜４個のアルキルであり、
Ｘは酸素、イオウまたはＮＲ_６であり、Ｒ_６は水素または炭素数１〜４個のアルキルであり、
Ｙは窒素またはＣＲ_７であり、Ｒ_７は水素または炭素数１〜４個のアルキルであり、
Ｚは窒素またはＣＲ_８であり、Ｒ_８は水素または炭素数１〜４個のアルキルであり、
ｎは０ないし４の整数である］
で示される化合物またはその塩もしくは溶媒和物、
（２）ＢＦ−１３７およびＢＦ−１４１からなる群より選択される上記（１）記載の化合物、
（３）標識されている上記（１）または（２）記載の化合物またはその塩もしくは溶媒和物、
（４）標識が放射性核種である上記（３）記載の化合物またはその塩もしくは溶媒和物、
（５）Ｒ_１ないしＲ_８のずれかが放射線放出核種で標識されている上記（４）記載の化合物またはその塩もしくは溶媒和物、
（６）標識がγ線放出核種である上記（４）または（５）記載の化合物またはその塩もしくは溶媒和物、
（７）γ線放出核種が^９９ｍＴｃ、^１１１Ｉｎ、^６７Ｇａ、^２０１Ｔｌ、^１２３Ｉおよび^１３３Ｘｅからなる群より選択されるものである上記（６）記載の化合物またはその塩もしくは溶媒和物、
（８）γ線放出核種が^９９ｍＴｃおよび^１２３Ｉからなる群より選択されるものである上記（７）記載の化合物またはその塩もしくは溶媒和物、
（９）標識が陽電子放出核種である上記（４）または（５）記載の化合物またはその塩もしくは溶媒和物、
（１０）陽電子放出核種が^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏおよび^１８Ｆからなる群より選択される上記（９）記載の化合物またはその塩もしくは溶媒和物、
（１１）陽電子放出核種が^１８Ｆである上記（１０）記載の化合物またはその塩もしくは溶媒和物、
（１２）上記（１）ないし（１１）のいずれかに記載の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物および医薬上許容される担体を含む、アミロイドが蓄積する疾患の画像診断用組成物、
（１３）^９９ｍＴｃまたは^１２３Ｉで標識された上記（８）記載の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を含む上記（１２）記載の組成物、（１４）^１８Ｆで標識された上記（１１）記載の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を含む上記（１２）記載の組成物、
（１５）上記（１）ないし（１１）のいずれかに記載の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を必須の構成成分として含む、アミロイドが蓄積する疾患の画像診断用キット、
（１６）^９９ｍＴｃまたは^１２３Ｉで標識された上記（８）記載の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を必須の構成成分として含む上記（１５）記載のキット、
（１７）^１８Ｆで標識された上記（１１）記載の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を必須の構成成分として含む上記（１５）記載のキット
（１８）上記（１）記載の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を含む脳試料中のアミロイドβ蛋白の染色用組成物、
（１９）上記（１）記載の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を必須の構成成分として含む、脳試料中のアミロイドβ蛋白の染色用キット、
（２０）上記（１）記載の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を用いることを特徴とする脳試料中のアミロイドβ蛋白の染色方法、
（２１）上記（１）記載の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物および医薬上許容される担体を含有する、蛋白のβシート構造が病因または病因の一部となる疾患の予防および／または治療用医薬組成物、および
（２２）疾患がアルツハイマー病である上記（２１）記載の医薬組成物
に関するものである。
【００１１】
本発明のアミロイドβ蛋白が蓄積する疾患の画像診断プローブとして使用される物質は上の一般式Ｉ（ａ）またはＩ（ｂ）で示される化合物またはその塩もしくは溶媒和物である。好ましい本発明化合物はＢＦ−１３７（２−［２−（４−ジメチルアミノフェニル）エテニル］−４，５−ジメチルオキサゾール）およびＢＦ−１４１（２−［２−（４−ジメチルアミノフェニル）エテニル］チオフェン）などである（表１参照）。なお、表１において、チオフラビンＴはβ構造をよく認識する化合物として知られており、参考として掲載した。
【００１２】
【表１】

【００１３】
以下、式Ｉ（ａ）またはＩ（ｂ）の化合物の各置換基について説明する。
本明細書において、「炭素数１〜４個のアルキル」という場合、メチル、エチル、プロピル、ブチル、およびこれらの構造異性体を包含するものとする。
Ｘは酸素（Ｏ）、イオウ（Ｓ）またはＮＲ_６である。
Ｙは窒素（Ｎ）またはＣＲ_７である。
Ｚは窒素（Ｎ）またはＮＲ_８である。
Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３の例としては水素、フッ素、塩素、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＳＯ_３Ｈ、ＮＨ_２、ＮＯ_２、ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ_２またはメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル等が挙げられる。Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３は同じであってもよく、異なっていてもよい。特に好ましいＲ_１、Ｒ_２およびＲ_３は水素である。また、Ｒ_１、Ｒ_２またはＲ_３は標識された基であってもよく、例えば、標識ハロゲンであってもよく、陽電子放出核種であるハロゲン、例えば、^１８Ｆなどが好ましい。
Ｒ_４およびＲ_５の好ましい例としては水素、メチル、エチル等が挙げられる。Ｒ_４またはＲ_５は標識された基であってもよい。Ｒ_４およびＲ_５は同じであってもよく、異なっていてもよい。
Ｒ_６、Ｒ_７およびＲ_８の好ましい例としては水素、メチル、エチル等が挙げられる。Ｒ_６、Ｒ_７またはＲ_８は標識された基であってもよい。Ｒ_６、Ｒ_７またはＲ_８は同じであってもよく、異なっていてもよい。
ｎは独立して０ないし４の整数である。ｎが０以外の場合、Ｒ_１置換基またはＲ_３置換基はそれぞれが結合する環のいずれの位置に存在していてもよい。２個以上のＲ_１置換基および／またはＲ_３置換基が存在する場合、それぞれが同一であってもよく、また異なっていてもよい。
また、化合物中の２つの環の間に二重結合が存在するので、シス、トランス双方の異性体が式Ｉ（ａ）およびＩ（ｂ）の化合物に存在しうる。
【００１４】
式Ｉ（ａ）またはＩ（ｂ）の化合物の塩も本発明に包含される。式Ｉ（ａ）またはＩ（ｂ）の化合物中の窒素原子またはいずれかの官能基とともに塩が形成されてもよい。化合物中にカルボキシル基またはスルホン酸基が存在するような場合、これと金属との間に塩が形成されてもよい。かかる塩の例としては、リチウム、ナトリウム、カリウムのごときアルカリ金属との塩、マグネシウム、カルシウム、バリウムのごときアルカリ土類金属との塩等が挙げられる。式Ｉ（ａ）またはＩ（ｂ）の化合物が水酸基を含む場合、その水素がナトリウム、カリウム等の金属となっている化合物も、本発明に包含される。さらに、式Ｉ（ａ）またはＩ（ｂ）の化合物と金属塩とで形成される錯体（例えば塩化マグネシウム、塩化鉄のごとき金属塩とで形成される錯体）が存在する場合には、これらも本明細書においては式Ｉ（ａ）またはＩ（ｂ）の化合物の塩に含めることとする。本発明化合物を組成物またはキットに使用する場合、医薬上許容される塩であることが好ましい。また、式Ｉ（ａ）またはＩ（ｂ）の化合物の医薬上許容される塩としては、例えば、塩素、臭素、ヨウ素のごときハロゲン化物イオンとの塩、あるいはナトリウム、カリウム、カルシウムのごとき金属との塩がある。かかる塩は本発明に包含される。また、式Ｉ（ａ）またはＩ（ｂ）の化合物の溶媒和物も本発明に包含される。溶媒和物としては、水和物、メタノール和物、エタノール和物、アンモニア和物等が挙げられる。本発明組成物またはキットに使用する場合、やはり医薬上許容されるものが好ましく、医薬上許容される溶媒和物としては、水和物、エタノール和物等が挙げられる。本明細書において、「本発明化合物」または「本発明の化合物」という場合、式Ｉ（ａ）またはＩ（ｂ）の化合物、ならびにその塩および溶媒和物を包含するものとする。
【００１５】
本発明においては、アミロイドβ蛋白が蓄積する疾患における体内のアミロイドβ蛋白にインビボにおいて特異的に結合する式Ｉ（ａ）またはＩ（ｂ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物を、アミロイドβ蛋白が蓄積する疾患の画像診断プローブとして使用する。本発明化合物により老人斑が鮮明に染色される。本明細書における「Ａβが蓄積する疾患」とは、Ａβ蛋白の脳内蓄積を主徴とする疾病をいい、Ａβ蛋白、すなわち老人斑をマーカーとして診断可能な疾病としては、アルツハイマー病、ダウン症候群などがあげられる。
【００１６】
アミロイドβ蛋白が蓄積する疾患の診断においては本発明化合物を標識したものをプローブとして使用するのが一般的である。標識には、蛍光物質、アフィニティー物質、酵素基質、放射性核種等がある。アミロイドβ蛋白が蓄積する疾患の画像診断には通常、放射性核種で標識したプローブを使用する。当該分野においてよく知られた方法により種々の放射性核種で本発明化合物を標識することができる。例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３５Ｓ、^１３１Ｉ等は以前から使用されている放射性核種であり、インビトロでの利用例が多い。画像診断プローブおよびその検出手段に求められる一般的要件としては、インビボで診断できること、患者へのダメージが少ないこと（特に非侵襲的であること）、検出感度が高いこと、半減期が適当な長さであること（標識プローブ調製時間、診断時間が適当であること）等が挙げられる。そこで、最近では、高い検出感度と物質透過性を示すγ線を利用した陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）またはγ線放出核種によるコンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）が用いられるようになってきた。このうち、ＰＥＴは、陽電子放出核種から正反対の方向に放射される２本のγ線を１対の検出器により同時計数法により検出するので、解像力や定量性に優れた情報が得られるので好ましい。ＳＰＥＣＴ用には^９９ｍＴｃ、^１１１Ｉｎ、^６７Ｇａ、^２０１Ｔｌ、^１２３Ｉ、^１３３Ｘｅ等のγ線放出核種で本発明化合物を標識することができる。^９９ｍＴｃおよび^１２３ＩがＳＰＥＣによく用いられている。ＰＥＴ用には^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８Ｆ、^６２Ｃｕ、^６８Ｇａ、^７６Ｂｒ等の陽電子放出核種で本発明化合物を標識することができる。陽電子放出核種のなかでも、半減期が適当であること、標識しやすさ等の点から^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８Ｆが好ましく、^１８Ｆが特に好ましい。陽電子放出核種、γ線放出核種等の放射線放出核種での本発明化合物の標識位置は、式Ｉ（ａ）またはＩ（ｂ）中のいずれの位置であってもよい。あるいは環上の水素が陽電子放出核種、γ線放出核種等の放射線放出核種で置換されていてもよい。式Ｉ（ａ）またはＩ（ｂ）の化合物標識位置はいずれの位置であってもよいが、好ましい標識位置は化合物中のフェニル環上である。かかる標識された式Ｉ（ａ）またはＩ（ｂ）の化合物も本発明に包含される。例えば、本発明化合物を^１８Ｆで標識する場合、側鎖のいずれかが^１８Ｆで標識されていてもよく、あるいは環上の水素が^１８Ｆで置換されていてもよい。例えば、Ｒ_１〜Ｒ_８のいずれかに含まれる水素を^１８Ｆで置換してもよい。
【００１７】
一般的には、これらの核種はサイクロトロンまたはジェネレーターと呼ばれる装置により産生される。当業者は、産生核種に応じた産生方法および装置が選択可能である。そのようにして産生された核種を用いて本発明化合物を標識することができる。
これらの放射性核種で標識された標識化合物の製造方法は当該分野においてよく知られている。代表的な方法としては、化学合成法、同位体交換法および生合成法がある。化学合成法は従来から広く用いられており、放射性の出発物質を用いること以外は通常の化学合成法と本質的に変わらない。この方法により種々の核種が化合物に導入されている。同位体交換法は、簡単な構造の化合物中の^３Ｈ、^３５Ｓ、^１２５Ｉ等を複雑な構造の化合物中に移して、これらの核種で標識された複雑な構造の化合物を得る方法である。生合成法は^１４Ｃ、^３５Ｓ等で標識した化合物を微生物等の細胞に与えてこれらの核種が導入された代謝産物を得る方法である。
標識位置については、通常の合成と同様に合成スキームを目的に応じて設計することにより、所望位置に標識を導入することができる。かかる設計は当業者によく知られている。
また、例えば、比較的半減期の短い^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８Ｆ等の陽電子放出核種を用いる場合、病院等の施設内の設置された（超）小型サイクロトロンから所望核種を得て、上記の方法により所望化合物を所望位置で標識して、即座に診断、検査、治療等に使用することも可能となっている。
これらの当業者に公知の方法により、本発明化合物の所望位置に所望核種を導入して標識することができる。
【００１８】
本発明標識化合物の対象への投与は局所的であってもよく、あるいは全身的であってもよい。投与経路としては、皮内、腹腔内、静脈、動脈、または脊髄液への注射または輸液等があるが、疾病の種類、使用核種、使用化合物、対象の状態、検査部位等の要因により選択できる。本発明プローブを投与して、アミロイドβ蛋白への結合および崩壊のための十分な時間経過後、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ等の手段で検査部位を調べることができる。これらの手段は、疾病の種類、使用核種、使用化合物、対象の状態、検査部位等の要因に応じて適宜選択できる。
放射性核種で標識された本発明化合物の用量は、疾病の種類、使用核種、使用化合物、対象の年齢、身体的状態、性別、疾病の程度、検査部位等により様々である。特に、対象の被曝量については十分に注意する必要がある。例えば、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８Ｆのごとき陽電子放出核種により標識された本発明化合物の放射能量は、通常には、３．７メガベクレルないし３．７ギガベクレル、好ましくは、１８メガベクレルないし７４０メガベクレルの範囲である。
【００１９】
また本発明は、本発明化合物を含む、アミロイドβ蛋白が蓄積する疾患の画像診断用組成物を提供する。本発明組成物は、本発明化合物および医薬上許容される担体を含む。組成物中の本発明化合物は標識されていることが好ましい。上記のごとき標識法は様々であるが、インビボでの画像診断用途には放射性核種（特に^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８Ｆのごとき陽電子放出核種）で標識されていることが望ましい。本発明組成物の形態は、その目的からすれば注射あるいは輸液可能な形態であることが好ましい。したがって、医薬上許容される担体は液体であるものが好ましく、リン酸カリウム緩衝液、生理食塩水、リンゲル液、蒸留水等のごとき水性溶媒、あるいはポリエチレングリコール、植物性油脂、エタノール、グリセリン、ジメチルスルホキサイド、プロピレングリコール等のごとき非水性溶媒があるが、これらに限らない。担体と本発明化合物との配合比率は、適用部位、検出手段等に応じて適宜選択できるが、通常には１０万対１ないし２対１の比率であり、好ましくは１万対１ないし１０対１の比率である。また、本発明組成物はさらに公知の抗菌剤（例えば、抗生剤等）、局所麻酔剤（例えば、塩酸プロカイン、塩酸ジブカイン等）、バッファー（例えば、トリス−塩酸バッファー、ヘペスバッファー等）、浸透圧調節剤（例えば、グルコース、ソルビトール、塩化ナトリウム等）等を含有していてもよい。
【００２０】
さらに本発明は、本発明化合物を必須の構成成分として含む、アミロイドβ蛋白が蓄積する疾患の画像診断用キットを提供する。通常には、キットは、本発明化合物、それを溶解する溶剤、バッファー、浸透圧調節剤、抗菌剤、局所麻酔剤等の各成分を別個に、あるいはいくつかを一緒にしてそれぞれの容器に入れたものをひとまとめにしたものである。本発明化合物は未標識であっても、標識されていてもよい。未標識の場合、上で説明したような通常の方法により、使用前に本発明化合物を標識することができる。また本発明化合物は凍結乾燥粉末等の固形として提供してもよく、あるいは適当な溶媒中に溶解して提供してもよい。溶剤としては上述の本発明組成物に用いる担体と同様のものであってよい。また、バッファー、浸透圧調節剤、抗菌剤、局所麻酔剤等の各成分も上述の本発明組成物に使用するものと同様のものであってよい。容器は種々のものを適宜選択できるが、本発明化合物への標識導入操作に適した形状とすることもでき、化合物の性質に応じて遮光性の材質のものとしてもよく、あるいは患者への投与に便利なようにバイアル、または注射器等の形状とすることもできる。また、キットは診断に必要な器具類、例えば注射器、輸液セット、あるいはＰＥＴ装置に使用する器具類等を適宜含んでいてもよい。通常、キットには説明書を添付する。
【００２１】
さらに、本発明化合物がアミロイドβ蛋白に特異的に結合することから、本発明化合物を未標識のまま、あるいは標識して、インビトロでのアミロイドβ蛋白の検出、定量等に使用することもできる。例えば、顕微鏡標本のアミロイドβ蛋白染色、試料中のアミロイドβ蛋白の比色定量、あるいはシンチレーションカウンターを用いたアミロイドβ蛋白の定量等に本発明化合物を使用してもよい。
【００２２】
先にも述べたように、コンゴーレッドまたはチオフラビンＳ等ではアミロイドβ蛋白および神経原線維変化の両方を染色するのに対し、本発明化合物はアミロイドβ蛋白に特異性が高い。したがって、本発明化合物は、例えば、アミロイドβ蛋白蓄積性疾患の研究あるいは生前または死後における診断等に有用であり、例えば、アルツハイマー病患者脳の老人斑の染色剤として有用と考えられる。本発明化合物を用いた脳切片の染色は通常の方法で行うことができる。
したがって、本発明は、本発明化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を含む脳試料中のアミロイドβ蛋白の染色用組成物、ならびに本発明化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を必須の構成成分として含む、脳試料中のアミロイドβ蛋白の染色用キット関する。さらに、本発明は本発明化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を用いることを特徴とする脳試料中のアミロイドβ蛋白の染色方法にも関する。
【００２３】
さらに上述のごとく、βシート構造をとったアミロイドβ蛋白に神経細胞毒性がみられることが判明している。かくして、本発明化合物は、蛋白自身がβシート構造をとることによって病因、または病因の一部となる疾患、例えばアルツハイマー病の治療薬になりうると考えられる。
したがって、さらに本発明は、本発明化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物および医薬上許容される担体を含有する、蛋白のβシート構造が病因または病因の一部となる疾患、例えば、アルツハイマー病やダウン症候群の予防および／または治療用医薬組成物に関する。
かかる医薬組成物の形態は特に限定されないが、液体処方が好ましく、特に注射用処方が好ましい。かかる注射用処方を脳内に直接注入することもでき、あるいは、実施例３にて示すように本発明化合物は血液／脳関門透過性が高いので、上記医薬組成物を静脈注射または静脈点滴用に処方して投与することもできる。かかる液体処方の調製は当該分野にて公知の方法で行うことができる。溶液の調製は、例えば、本発明化合物を適当な担体、注射用水、生理食塩水、リンゲル液等に溶解し、フィルター等で滅菌し、その後、適当な容器、例えば、バイアルまたはアンプルに充填する。また、溶液を凍結乾燥させ、使用時に適当な担体で再度溶液に復元することも可能である。懸濁液の調製は、例えば、本発明化合物を例えばエチレンオキサイドにさらすことにより滅菌し、次いで、滅菌済み液体担体懸濁することにより行うことができる。
本発明化合物の投与量は、患者の病状、性別、年齢、体重等に左右されるが、一般的には、体重７０ｋｇの成人の場合、１日あたり０．１ｍｇないし１ｇ、好ましくは１ｍｇないし１００ｍｇ、より好ましくは５ｍｇないし５０ｍｇである。一定期間かかる投与量で処置を行い、結果により投与量を増減することができる。
【００２４】
次に本発明化合物のスクリーニング方法について説明する。本発明化合物のなかにはチオフラビンＴ法では蛍光波長がチオフラビンＴと重なるためにスクリーニングが不可能なものがあった。それらの化合物については以下の新規スクリーニングを導入した。
（１）アミロイドβ蛋白（ペプチド研より購入）はリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶解し３７℃で４日間放置した。
（２）同緩衝液に溶解したコンゴーレッド５０μｌを９６穴マイクロプレートに分注した（最終濃度０．１μＭ）。
（３）アミロイドβ蛋白１００μｌずつを添加（最終濃度５μＭ）し、３０分間放置した。
（４）同緩衝液に溶解した被験化合物を１００μｌずつ添加（最終濃度１０マイクロＭ）し、６０分間放置した。
（５）蛍光マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス社製、ｆｍａｘ）を用いて、あらかじめ測定してあった、最適励起および測定波長で測定した。
（６）被験化合物とアミロイドβ蛋白とコンゴーレッド共存下の蛍光度をＡ、被験化合物とコンゴーレッド共存下のそれをＢ、被験化合物とアミロイドβ蛋白共存下のそれをＣ、被験化合物単独のそれをＤとすると被験化合物のβ構造認識度は以下の式で算出した。
被験化合物β構造認識度（％）＝｛（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）｝×１００
（７）このβ構造認識度が大きいほど被験化合物はアミロイドβ蛋白に対する結合特異性が高いといえる。
【００２５】
次に発明化合物のアルツハイマー病患者脳切片上での染色性について説明する。
（１）病理学的にアルツハイマー病と確定診断された患者および正常高齢者の、側頭葉または海馬における脳標本を使用した。標本は共同研究先である福祉村病院から提供を受け、患者遺族から研究目的での使用に対する承諾を得ている（ビーエフ研究所倫理委員会 許可Ｎｏ．ＲＳ−９９−０２）。
（２）パラフィン包埋された脳組織は厚さ６μｍあるいは８μｍで薄切し、スライドグラス上に伸展、乾燥させた。パラフィン脳切片はキシレン１０分×２、１００％エタノールｌ５分×２、９５％エタノールｌ５分×２、流水洗１０分の順で脱パラフィン化した。
（３）本発明化合物による染色の前処理として、リポフスチンによる自己蛍光を除去する処置を行った。はじめに、脱パラフィン化した切片を１０％ホルマリン溶液に６０分間浸漬し、ＰＢＳで５分間洗浄した後、０．２５％ ＫＭｎＯ_４溶液に９０分間浸漬した。ＰＢＳにて２分間×２回洗浄した後、０．１％ Ｋ_２Ｓ_２Ｏ_５／シュウ酸溶液中に約３０秒間浸し、さらにＰＢＳにて２分間×３回洗浄を行った。
（４）５０％エタノールに溶解した１００μＭ本発明化合物溶液を約１５０μｌ滴下し、１０分間反応させた。水道水中に５回つけた後、５０％エタノールに３〜５回つけて速やかに分別を行い、その後ＰＢＳに６０分間浸漬した上、Ｆｌｕｏｒ Ｓａｖｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で封入し、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，Ｅｃｌｉｐｓ Ｅ８００）を用いて鏡検した。画像はデジタルカメラ（Ｐｌａｒｏｉｄ ＰＤＭＣＩＩ）にて撮影した。
【００２６】
免疫染色は以下のように行った。
（１）脱パラフィン後、蒸留水中で２分×２で洗浄を行い、イムノペンにより組織を囲んだ後、蟻酸を約１５０μｌ滴下し、室温で５分間静置した。水道水で５分間洗浄した後、冷ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０に２分間浸漬し、その後、０．０５％トリプシン溶液を約１５０μｌ滴下して、３７℃、１５分間反応させた。
（２）氷浴中、冷ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で５分間×２回洗浄した後、ブロッキング用血清を２滴滴下して、３７℃、３０分間反応させ、余分な水分を除去した後に、アミロイドβ蛋白の特異抗体である６Ｆ／３Ｄ（ＤＡＫＯ社、１：５０希釈）を約１５０μｌ滴下して、３７℃、１時間反応させた。
（３）さらに冷ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で２分間×５回洗浄した後、抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ヤギ、ビオチン結合溶液を２滴滴下して３７℃、１時間反応させ、冷ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で２分間×３回洗浄した上でＡＢＣ溶液（ストレプトアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体溶液）を２滴滴下して、３０分間静置した。再び、冷ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で２分間×３回洗浄した後、ＤＡＢ溶液（２０ｍｌの０．０５ｍｏｌ／ｌトリス塩酸緩衝液にＤＡＢ １０ｍｇを溶解し、使用直前に３％過酸化水素水１００μｌを添加）を約１５０μｌ滴下して、十分な発色を得たのち、蒸留水で１分間洗浄し、反応を停止させ、封入後、鏡検した。
【００２７】
以下に本発明化合物の特性に関する試験方法を説明する。
（Ａ）急性毒性試験
本発明化合物の急性毒性をマウスを用いて静脈内投与で検討した。Ｃｒｊ：ＣＤ１系雄性マウスを一群４匹として使用した（各群の平均体重は３０〜３４ｇであった）。化合物はポリエチレングリコール４００、エチルアルコール、ＤＭＳＯの混合液で溶解後、その後生理的食塩水に希釈して、尾静脈を介して投与し、以後７日まで観察した。
【００２８】
（Ｂ）脳移行試験
脳移行性の測定は下記の手順によった。
（１）マウスに本発明化合物を静脈内投与し、インビボにおける脳移行性を測定した。
（２）マウスは３０〜４０ｇ（７週齢、ｎ＝３）のＳｌｃ：ＩＣＲ（日本ＳＬＣ）を用いた。
（３）被験化合物を塩酸、またはポリエチレングリコール４００、エチルアルコール、ＤＭＳＯの混合液で溶解後、尾静脈より注入し、投与より２分後にエーテル麻酔下で脳の採材をおこなった。
（４）脳（小脳を含む）は採材後−８０℃で保存した。使用時には凍結したまま湿重量を測定し生理食塩水を加え、ホモジナイズを行った。ホモジネートを１０分間遠心し、上清をコンディショニングしたＣ１８固相抽出カートリッジに添加し、メチルアルコールにて溶出を行った。
（５）被験化合物は高速液体クロマトグラフィを用い、吸光（ＵＶ／Ｖｉｓ検出器、Ｗａｔｅｒｓ）および蛍光（ＦＳ−８０２０、東ソー）を検出した。
投与量に対する脳内の被験化合物含有量（％ＩＤ（ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｄｏｓｅ）／ｍｌまたはｇ）を求めた。
【００２９】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を何ら限定するものではない。
実施例１ 本発明化合物はアミロイドβ蛋白を特異的に認識する化合物である
上記のアミロイドβ蛋白を特異的に認識する化合物のスクリーニング方法により、表１に示す化合物が見出された（チオフラビンＴは参考として掲載）。化合物の構造については表１参照。
【００３０】
本発明の化合物のβ構造認識度はチオフラビンＴよりも高い傾向を示した（表１）。
アルツハイマー病患者脳切片におけるＢＦ−１３７（左パネル）とチオフラビンＳ（右パネル、左パネルの隣接切片）との染色性を比較したところ、図１に示すように、ＢＦ−１３７は、主として老人斑（クサビ型矢印）を染色したが、チオフラビンＳは老人斑および神経原線維変化（ないしはリン酸化アミロイドβ蛋白）の両者を染色した。
また、アミロイド特異抗体である６Ｆ／３０の免疫染色との染色性を比較したところ、図２に示すようにＢＦ−１３７は老人斑（クサビ型矢印）および、びまん性老人斑（破線丸印）を染色した。
このように、本発明化合物（ＢＦ−１３７）は、老人斑をより鮮明に染色した。すなわち、本発明化合物は主としてアミロイドβ蛋白を認識するプローブとして使用可能であることがわかった。
【００３１】
実施例２ 急性毒性試験
次に本発明化合物（ＢＦ−１３７およびＢＦ−１４１）について上記（Ａ）記載の方法により行った急性毒性試験の結果を表２に示す。
【表２】

一般にヒトでのＰＥＴ撮影にはポジトロン標識および未標識化合物の総投与量として、１×１０^−１２から１×１０^−５ｍｇ／ｋｇの静脈内投与が用いられ、多くはの場合、１×１０^−１０から１×１０^−７ｍｇ／ｋｇの静脈内投与が用いられる。化合物の静脈内投与時の最大耐量とＰＥＴ撮影時に必要な総化合物量をみてみると、両者の間には少なくとも１００万倍および１０万倍以上の開きがあることから、ＢＦ−１３７はＰＥＴ撮影用プローブとしては極めて安全性の高い化合物と考えられる。
【００３２】
実施例３ 脳移行性
表３にマウスにおける本発明化合物（ＢＦ−１３７）静脈内投与２分後の脳移行を示した。試験方法は上記（Ｂ）に記載したとおりである。中枢神経系を対象としたＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ用化合物の脳移行性は、０．５％ＩＤ／ｇ以上あれば十分と考えられている。その意味で被験化合物は極めての脳移行性の高い化合物である。
【表３】

【００３３】
次に本発明化合物の染色剤としての有用性について述べる。
これまでのアルツハイマー病患者脳切片を染色する染色剤は主として、コンゴレッドまたはチオフラビンＳが用いられてきた。これらの染色剤はアルツハイマー病の２つの病理学的主徴と言われる老人斑および神経原線維変化の両者を染色するのが特徴である。
本発明化合物は、図１に示したように老人斑に対する特異性が高く、老人斑およびリン酸化アミロイドβ蛋白に両者を染色するチオフラビンＳとは特異性が異なっていた。このことより、本発明化合物の１の用途として、アルツハイマー病患者脳切片おける老人斑の選択的染色剤としての使用が考えられる。
【００３４】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明化合物は、アミロイドβ蛋白に対する特異性が高く、血液−脳関門透過性が高く、しかも極めて安全性の高いものである。したがって、例えば、アルツハイマー病患者脳における老人斑の染色剤として有用と考えられる。また、本発明によれば、本発明化合物を含む、アミロイドβ蛋白が蓄積する疾患の画像診断用組成物およびキットが提供される。かかる化合物、組成物、またはキットを用いることにより、疾病の早期における正確な診断が可能となる。さらに本発明によれば、アミロイドβ蛋白の蓄積が病因または病因の一部となる疾患の予防および／または治療用の医薬組成物も提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はアルツハイマー病患者脳切片におけるＢＦ−１３７（左パネル）とチオフラビンＳ（右パネル、左パネルの隣接切片）との染色性の比較を示す。ＢＦ−１３７は、主として老人斑（クサビ型矢印）を染色したが、チオフラビンＳは老人斑および神経原線維変化（ないしはリン酸化アミロイドβ蛋白）の両者を染色した。
【図２】図２はアルツハイマー病患者脳切片におけるＢＦ−１３７（左パネル）とアミロイド特異的抗体である６Ｆ／３Ｄ（右パネル、左パネルの隣接切片）との染色性の比較を示す。ＢＦ−１３７は６Ｆ／３Ｄで染色される老人斑（クサビ型矢印）およびびまん性老人斑（破線丸印）を染色した。

Claims (22)

1. アミロイドβ蛋白が蓄積する疾患の画像診断プローブとして使用される、式Ｉ（ａ）またはＩ（ｂ）：
   

   

   ［式中、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３は独立して水素、ハロゲン、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＳＯ_３Ｈ、ＮＨ_２、ＮＯ_２、炭素数１〜４個のアルキル、Ｏ−炭素数１〜４個のアルキルであり、
   Ｒ_４およびＲ_５は独立して水素または炭素数１〜４個のアルキルであり、
   Ｘは酸素、イオウまたはＮＲ_６であり、Ｒ_６は水素または炭素数１〜４個のアルキルであり、
   Ｙは窒素またはＣＲ_７であり、Ｒ_７は水素または炭素数１〜４個のアルキルであり、
   Ｚは窒素またはＣＲ_８であり、Ｒ_８は水素または炭素数１〜４個のアルキルであり、
   ｎは０ないし４の整数である］
   で示される化合物またはその塩もしくは溶媒和物。
2. ＢＦ−１３７およびＢＦ−１４１からなる群より選択される請求項１記載の化合物。
3. 標識されている請求項１または２記載の化合物またはその塩もしくは溶媒和物。
4. 標識が放射性核種である請求項３記載の化合物またはその塩もしくは溶媒和物。
5. Ｒ_１ないしＲ_８のいずれかが放射線放出核種で標識されている請求項４記載の化合物またはその塩もしくは溶媒和物。
6. 標識がγ線放出核種である請求項４または５記載の化合物またはその塩もしくは溶媒和物。
7. γ線放出核種が^９９ｍＴｃ、^１１１Ｉｎ、^６７Ｇａ、^２０１Ｔｌ、^１２３Ｉおよび^１３３Ｘｅからなる群より選択されるものである請求項６記載の化合物またはその塩もしくは溶媒和物。
8. γ線放出核種が^９９ｍＴｃおよび^１２３Ｉからなる群より選択されるものである請求項７記載の化合物またはその塩もしくは溶媒和物。
9. 標識が陽電子放出核種である請求項４または５記載の化合物またはその塩もしくは溶媒和物。
10. 陽電子放出核種が^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏおよび^１８Ｆからなる群より選択される請求項９記載の化合物またはその塩もしくは溶媒和物。
11. 陽電子放出核種が^１８Ｆである請求項１０記載の化合物またはその塩もしくは溶媒和物。
12. 請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物および医薬上許容される担体を含む、アミロイドが蓄積する疾患の画像診断用組成物。
13. ^９９ｍＴｃまたは^１２３Ｉで標識された請求項８記載の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を含む請求項１２記載の組成物。
14. ^１８Ｆで標識された請求項１１記載の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を含む請求項１２記載の組成物。
15. 請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を必須の構成成分として含む、アミロイドが蓄積する疾患の画像診断用キット。
16. ^９９ｍＴｃまたは^１２３Ｉで標識された請求項８記載の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を必須の構成成分として含む請求項１５記載のキット。
17. ^１８Ｆで標識された請求項１１記載の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を必須の構成成分として含む請求項１５記載のキット。
18. 請求項１の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を含む脳試料中のアミロイドβ蛋白の染色用組成物。
19. 請求項１の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を必須の構成成分として含む、脳試料中のアミロイドβ蛋白の染色用キット。
20. 請求項１の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を用いることを特徴とする脳試料中のアミロイドβ蛋白の染色方法。
21. 請求項１の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物および医薬上許容される担体を含有する、蛋白のβシート構造が病因または病因の一部となる疾患の予防および／または治療用医薬組成物。
22. 疾患がアルツハイマー病である請求項２１記載の医薬組成物。

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