JP2004248668A - アポトーシス誘導剤 - Google Patents

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Abstract

【課題】アポトーシス誘導剤の提供。
【解決手段】ＨＴＲＡ３のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性または遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩を含有してなるアポトーシス誘導剤など。
【選択図】なし

Description

本発明は、アポトーシス誘導剤などに関する。さらに詳しくは、本発明は、ＨＴＲＡ３の酵素活性およびその基質、ＨＴＲＡ３の機能阻害に基づくアポトーシス誘導剤およびそのスクリーニング方法などに関する。また、本発明は、ＨＴＲＡ３の機能促進に基づくアポトーシス抑制剤あるいはタンパク製剤を利用したアポトーシス抑制剤およびそのスクリーニング方法などに関する。
最近の研究の進展によって、癌は複数の遺伝子変異が体細胞に蓄積し、その結果として細胞の増殖制御機能が破綻した病気であることが証明されてきている。またアポトーシス研究の進展に伴い、癌における細胞の異常増殖には、癌細胞のアポトーシス制御遺伝子の異常が関与していることが明らかとなってきた。特に癌遺伝子として発見されたＢｃｌ−２（Science, (228)巻, 1440-1443頁, 1985年）が、アポトーシス抑制を介して癌化に関与していることが示唆されて以来（Nature, (335)巻, 440-442頁, 1988年）、発癌過程におけるアポトーシス抑制の重要性が注目されている。また癌遺伝子・癌抑制遺伝子として同定されてきた遺伝子産物の多くが、アポトーシス制御に関与することが証明されていることや、抗癌剤処理により癌細胞が能動的にアポトーシスシグナルを活性化して死ぬことから、アポトーシスシグナル伝達に関わる因子は、抗癌剤開発・癌治療の際の新たな標的となりうることが示唆されている。
癌の化学療法においては、新しい抗癌剤の開発により延命効果が向上し、治癒に向かうケースも増えてきている。現在までに使用されてきた抗癌剤は、癌細胞が正常細胞よりも増殖・代謝が活発であることを利用したものが多い。例えばＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤は、ＤＮＡ複製の際に切断されたＤＮＡの再結合を阻害することによりアポトーシスを誘導し、抗腫瘍効果を発揮するとされる薬剤であり、これは癌細胞では正常細胞よりも盛んにＤＮＡ複製が起きていることを利用している。ＤＮＡトポイソメラーゼＩを阻害する塩酸イリノテカン（カンプトテシン）や、ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩを阻害するエトポシド・テニポシドは、臨床において固形癌治療に効果を上げている。しかしこれらの抗癌剤は、前述したように正常細胞に対しても少なからず傷害を与え、特に細胞分裂の盛んな骨髄などにしばしば強い副作用が現れる。このため化学療法では腫瘍特異的にアポトーシスを誘導することが要求され、現在様々なアポトーシス誘導型の抗癌剤の開発が進んでいるが、未だこの要求に満足に応える抗癌剤はない。
上述のアポトーシス誘導型の抗癌剤をスクリーニングする上で、その抗癌剤の作用点となるタンパク質の活性を明らかにすることは、スクリーニング方法を考案するために非常に重要である。
一方、癌の進展においてプロテアーゼの重要性は古くから知られている。癌細胞の浸潤・転移プロセスにおいては、基底膜のIV型コラーゲンをはじめとした細胞外マトリックスの分解は必須であり、その分解にマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）が中心的役割を果たすことが知られている。マトリックスメタロプロテアーゼはヒトでは２３種の分子種からなる遺伝子ファミリーを形成しており、例えばその内のＭＴ１−ＭＭＰは基底膜成分のラミニン−５を分解し、その分解産物が細胞運動を亢進することにより、癌細胞の浸潤・転移を促進する可能性が示唆されている（J.Cell Biol., (148)巻, 615-624頁, 2000年）。
またウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターは、血中でプラスミノーゲンに働いてプラスミンを遊離させるプロテアーゼである。最近の研究では、プラスミノーゲンアクチベーターやプラスミンがＭＭＰ活性化の主要な担い手であるとされている（EMBO J., (16)巻, 2319-2332頁, 1997年）。さらにプラスミンは潜在型ＴＧＦβに作用し、活性型ＴＧＦβを遊離することが知られている。活性型ＴＧＦβは血管新生の促進、細胞外マトリックスの蓄積、免疫抑制作用などを引き起こすことから、癌細胞が増殖・浸潤・転移しやすい環境を形成する上で、重要な役割を果たしていると考えられている。
Insulin-like growth factor（ＩＧＦ）はアポトーシス抑制型の増殖因子であることが知られている。例として、ＩＧＦは現在、ＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩの２つの分子が知られているが、このうちＩＧＦ−Ｉの受容体であるＩＧＦ−Ｉ受容体ノックアウトマウスの繊維芽細胞に、ＳＶ４０癌遺伝子を導入しても癌化しないことから、アポトーシス抵抗性の獲得に寄与する重要な因子との報告がある（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (90)巻, 11217-11221頁, 1993年）。また繊維芽細胞中でｃ−Ｍｙｃを過剰発現させてアポトーシスを誘導させた状態で、ＩＧＦを添加すると、このアポトーシス誘導効果が抑制されることが報告された（EMBO.J., (13)巻, 3286-3295頁, 1994年）。
血中にて循環しているＩＧＦは遊離した状態ではなく、IGF-binding protein（ＩＧＦ−ＢＰ）と結合した状態で存在することが知られている。ＩＧＦ−ＢＰの正確な機能は不明であるが、ＩＧＦと複合体を形成することによって、増殖因子としてのＩＧＦの活性を調節していると考えられている。現在ＩＧＦ−ＢＰとして６種のタンパクが同定されているが、これらのＩＧＦ−ＢＰを分解するプロテアーゼとして、ＢＰ−３プロテアーゼ、ＭＭＰ、プラスミン、カテプシン、ＰＳＡなどが同定され、増殖因子としてのＩＧＦの活性を調節している可能性が示唆されている（Endocrine Reviews, (18)巻, 801-831頁, 1997年）。
Serine protease（ＨＴＲＡ３）は、Serine protease ＨＴＲＡ１あるいはＨＴＲＡ２と相同性がある遺伝子として公共の遺伝子データベース〔非特許文献１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ０４００９４）〕に登録されている。しかしＨＴＲＡ３の生理機能、特にSerine protease活性を直接示した報告、あるいはＨＴＲＡ３とアポトーシス、あるいはＨＴＲＡ３と癌との関連を示した報告は現在までにない。
ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ０４００９４
癌細胞に特異的に発現する分子を標的とし、癌細胞のアポトーシス誘導作用、または増殖阻害作用を示す薬剤が切望されている。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、癌組織に発現が顕著に増加する遺伝子（Serine protease ＨＴＲＡ３遺伝子）を見出し、さらに該遺伝子の機能を抑制することにより、アポトーシスが誘導されることを見出した。また、さらに該遺伝子の機能を探索することにより、プロテアーゼ活性を有することを見出した。この知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、アポトーシス抑制活性の新たな実験結果、自己プロセッシングの現象、プロテアーゼ活性の基質を見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
（１）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなるアポトーシス誘導剤；
（２）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩を含有してなるアポトーシス誘導剤；
（３）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド；
（４）配列番号：３、配列番号：２６または配列番号：２８で表される塩基配列を有する前記（３）記載のアンチセンスポリヌクレオチド；
（５）前記（３）記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬；
（６）アポトーシス誘導剤である前記（５）記載の医薬；
（７）癌の予防・治療剤である前記（５）または（６）記載の医薬；
（８）癌が膵臓癌である前記（７）記載の医薬；
（９）前記（３）記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる診断薬；
（１０）癌の診断薬である前記（９）記載の診断薬；
（１１）癌が膵臓癌である前記（１０）記載の診断薬；
（１２）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体；
（１３）前記（１２）記載の抗体を含有してなる医薬；
（１４）アポトーシス誘導剤である前記（１３）記載の医薬；
（１５）癌の予防・治療剤である前記（１３）または（１４）記載の医薬；
（１６）癌が膵臓癌である前記（１５）記載の医薬；
（１７）前記（１２）記載の抗体を含有してなる診断薬；
（１８）癌の診断薬である前記（１７）記載の診断薬；
（１９）癌が膵臓癌である前記（１８）記載の診断薬；
（２０）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有してなる癌の診断薬；
（２１）癌が膵臓癌である前記（２０）記載の診断薬；
（２２）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とするアポトーシス誘導剤のスクリーニング方法；
（２３）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とするアポトーシス誘導剤のスクリーニング用キット；
（２４）前記（２２）記載のスクリーニング方法または前記（２３）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうるアポトーシス誘導剤；
（２５）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とするアポトーシス誘導剤のスクリーニング方法；
（２６）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有することを特徴とするアポトーシス誘導剤のスクリーニング用キット；
（２７）前記（２５）記載のスクリーニング方法または前記（２６）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうるアポトーシス誘導剤；
（２８）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる膵臓癌の予防・治療剤；
（２９）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩を含有してなる膵臓癌の予防・治療剤；
（３０）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする膵臓癌の予防・治療剤のスクリーニング方法；
（３１）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする膵臓癌の予防・治療剤のスクリーニング用キット；
（３２）前記（３０）記載のスクリーニング方法または前記（３１）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる膵臓癌の予防・治療剤；
（３３）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする膵臓癌の予防・治療剤のスクリーニング方法；
（３４）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有することを特徴とする膵臓癌の予防・治療剤のスクリーニング用キット；
（３５）前記（３３）記載のスクリーニング方法または前記（３４）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる膵臓癌の予防・治療剤；
（３６）プロテアーゼ活性を有する、配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質；
（３７）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなるプロテアーゼ阻害剤；
（３８）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩を含有してなるプロテアーゼ阻害剤；
（３９）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなるプロテアーゼ阻害剤；
（４０）配列番号：３、配列番号：２６または配列番号：２８で表される塩基配列からなるアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなるプロテアーゼ阻害剤；
（４１）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなるプロテアーゼ阻害剤；
（４２）アポトーシス誘導剤である前記（３７）ないし（４１）記載の剤または癌（好ましくは膵臓癌）の予防・治療剤である前記（３７）ないし（４１）記載の剤；
（４３）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とするプロテアーゼ阻害剤のスクリーニング方法；
（４４）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とするプロテアーゼ阻害剤のスクリーニング用キット；
（４５）前記（４３）記載のスクリーニング方法または前記（４４）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうるプロテアーゼ阻害剤；
（４６）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とするプロテアーゼ阻害剤のスクリーニング方法；
（４７）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有することを特徴とするプロテアーゼ阻害剤のスクリーニング用キット；
（４８）前記（４６）記載のスクリーニング方法または前記（４７）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうるプロテアーゼ阻害剤；
（４９）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする該タンパク質のプロテアーゼ活性の基質のスクリーニング方法；
（５０）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする該タンパク質のプロテアーゼ活性の基質のスクリーニング用キット；
（５１）前記（４９）記載のスクリーニング方法または前記（５０）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のプロテアーゼ活性の基質；
（５２）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする該タンパク質のプロテアーゼ活性の基質のスクリーニング方法；
（５３）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有することを特徴とする該タンパク質のプロテアーゼ活性の基質のスクリーニング用キット；
（５４）前記（５２）記載のスクリーニング方法または前記（５３）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のプロテアーゼ活性の基質；配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質のプロテアーゼ活性の基質；
（５５）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害することを特徴とするアポトーシス誘導方法；
（５６）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害することを特徴とするプロテアーゼ阻害方法；
（５７）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害することを特徴とする膵臓癌の予防・治療方法；
（５８）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を阻害することを特徴とするアポトーシス誘導方法；
（５９）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を阻害することを特徴とするプロテアーゼ阻害方法；
（６０）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を阻害することを特徴とする膵臓癌の予防・治療方法；
（６１）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とするアポトーシス誘導方法；
（６２）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とするプロテアーゼ阻害方法；
（６３）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする膵臓癌の予防・治療方法；
（６４）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とするアポトーシス誘導方法；
（６５）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とするプロテアーゼ阻害方法；
（６６）配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする膵臓癌の予防・治療方法；
（６７）アポトーシス誘導剤の製造のための配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の使用；
（６８）プロテアーゼ阻害剤の製造のための配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の使用；
（６９）膵臓癌の予防・治療剤の製造のための配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の使用；
（７０）アポトーシス誘導剤の製造のための配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩の使用；
（７１）プロテアーゼ阻害剤の製造のための配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩の使用；
（７２）膵臓癌の予防・治療剤の製造のための配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩の使用；
（７３）配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩；
（７４）配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（７５）ＤＮＡである前記（７４）記載のポリヌクレオチド；などを提供する。
本発明で用いられるタンパク質は、癌細胞に特異的に発現し、癌の診断マーカーであり、したがって、該タンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、該タンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩は、例えば、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍または血液腫瘍などの癌（好ましくは、膵臓癌など）の予防・治療剤として安全に使用することができる。さらに、該タンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、該タンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩は、例えば、アポトーシス誘導（または促進）剤、プロテアーゼ阻害剤などとして安全に使用することもできる。
また、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドや抗体は、本発明で用いられるタンパク質の発現を阻害することができ、例えば大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍または血液腫瘍などの癌（好ましくは、膵臓癌など）の予防・治療剤として、あるいはアポトーシス誘導（または促進）剤、プロテアーゼ阻害剤などとして安全に使用することができる。
本発明で用いられる配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、本発明のタンパク質または本発明で用いられるタンパク質と称することもある）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
配列番号：５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：５で表わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：３０で表わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。
配列番号：５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：３０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、アポトーシス抑制活性やプロテアーゼ活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、アポトーシス抑制活性やプロテアーゼ活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
アポトーシス抑制活性の測定は、自体公知の方法、例えばアポトーシス実行因子カスパーゼ３および７の酵素活性を利用した方法(Methods in Enzymology, (244)巻, 615-31頁, 1994年)またはそれに準じる方法と、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて特異的な遺伝子の機能を阻害する方法またはそれに準じる方法を組み合わせることによって測定することができる。
例えばアポトーシス抑制活性は、カスパーゼ３および７に特異的な基質に蛍光物質を結合させたものと同時に消光物質を結合させたものを利用することで測定できる。すなわち本発明のタンパク質（例、ＨＴＲＡ３）のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＨＴＲＡ３を発現する細胞に導入してＨＴＲＡ３遺伝子の機能を阻害した後、前述の基質と適当な緩衝液中で反応させ、カスパーゼ３および７活性に基づく消光物質ラベルから遊離した蛍光ラベル基質の生成量を、蛍光測定装置等を用いて定量することによって、本発明のタンパク質（例、ＨＴＲＡ３）のアポトーシス抑制活性の程度を測定できる。
プロテアーゼ活性の測定は、自体公知の方法、例えばカゼインの分解を利用した方法などで測定できる。
具体的にはカゼインについて蛍光標識したものを作製し、これに本発明のタンパク質を作用させ、カゼイン分解産物由来の蛍光シグナルの増大を測定することで、プロテアーゼ活性を測定できる（Anal. Biochem, (254)巻, 144-147頁, 1997年）。
また、上記のプロテアーゼ活性測定法を用いて、本発明のタンパク質の酵素活性を阻害し、アポトーシス誘導活性を有する化合物をスクリーニングすることができる。例えば上記反応系に低分子化合物を共存させ、カゼイン分解産物由来の蛍光シグナルの減少を測定することで、低分子化合物による本発明のタンパク質の酵素阻害活性を定量することができる。選択された化合物はアポトーシス誘導剤（本明細書では、アポトーシス誘導活性を有する化合物またはその塩自体を、アポトーシス誘導剤と称することがある。）として、膵臓癌などの癌治療薬に応用できる。
配列番号：３０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、後述の実施例で示すとおり、配列番号：５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の自己消化により生じる産物に相当し、配列番号：３０で表されるアミノ酸配列は新規なアミノ酸配列である。
さらに本発明のタンパク質を用いて、これに結合するタンパク質、あるいは基質となるタンパク質を探索することが可能である。
具体的には本発明のタンパク質の発現ベクターを用いて細胞で一過性発現させ、得られた本発明のタンパク質と結合するタンパク質を免疫沈降法などの方法で探索することが可能である。例えば、ＴＧＦβなどの細胞増殖抑制因子やそのファミリー（例えばＢＭＰ−４，ＧＤＦ−５，Ａｃｔｉｖｉｎ）、ＩＧＦなどの細胞増殖因子などが、本発明のタンパク質と結合するタンパク質として考えられる。
またカゼインを用いたプロテアーゼ活性測定法と同様に、様々なタンパク質を蛍光標識することで、本発明のタンパク質のプロテアーゼ活性の基質となるタンパク質を探索することが可能である。例えば、ラミニン−５などの基底膜成分であるタンパク質、コラーゲンなどの細胞外マトリックス構成成分であるタンパク質、ＩＧＦ−ＢＰなどのＩＧＦ活性調節因子、プラスミノーゲンなどのＴＧＦβ活性調節因子、潜在型ＴＧＦβなどが、本発明のタンパク質のプロテアーゼ活性の基質となるタンパク質として考えられる。
また、本発明で用いられるタンパク質としては、例えば、1)配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、2)配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、3)配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、4)配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または5)それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、とくに限定されない。
本明細書におけるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：５または配列番号：３０で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、本発明で用いられるタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明で用いられるタンパク質には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明で用いられるタンパク質の具体例としては、例えば、配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：３０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などがあげられる。
本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドとしては、前記した本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドであって、好ましくは、前記した本発明で用いられるタンパク質と同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。
具体的には、後述する本発明の抗体を調製する目的には、配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列において、少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。
また、本発明で用いられる部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、本発明で用いられる部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
さらに、本発明で用いられる部分ペプチドには、前記した本発明で用いられるタンパク質と同様に、Ｃ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有しているもの、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明で用いられる部分ペプチドは抗体作成のための抗原としても用いることができる。
本発明で用いられるタンパク質または部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、またはそのアミド体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ， ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分ペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ペプチドとを製造し、これらのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。この粗タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質またはペプチドのアミド体を得ることができる。
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、所望のタンパク質またはペプチドのエステル体を得ることができる。
本発明で用いられる部分ペプチドまたはそれらの塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明で用いられるタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明で用いられる部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の1)〜5)に記載された方法が挙げられる。
1)M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
2)SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
3)泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
4)矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学IV、 205、(1977年)
5)矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明で用いられる部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、前述した本発明で用いられるタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
本発明で用いられるタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：６で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：６で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。また、本発明で用いられるタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：３１で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：３１で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号：３０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：６で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：６で表される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：３１で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：３１で表される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）2nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：６で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。また、配列番号：３０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：３１で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）としては、前述した本発明で用いられる部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：６または配列番号：３１で表される塩基配列を含有するＤＮＡの一部分を有するＤＮＡ、または配列番号：６または配列番号：３１で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、本発明のタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：６または配列番号：３１で表される塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質、部分ペプチド（以下、これらをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）2nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲ、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたタンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウィルス，ワクシニアウィルス，バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、PhoＡ・シグナル配列、OmpＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６０巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology），１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N 細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，マウスＡＴＤＣ５細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６９巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７５巻，１９２９(１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,6, 47-55(1988)などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８ 新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Journal of the American Medical Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のタンパク質を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより測定することができる。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体は、本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以下、抗体の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）に対する抗体は、本発明のタンパク質を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (1975)〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗原）自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行い、該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
本発明で用いられるタンパク質または部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ（以下、アンチセンスポリヌクレオチドの説明においては、これらのＤＮＡを本発明のＤＮＡと略記する場合がある））の塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスポリヌクレオチドとしては、本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）の塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスポリヌクレオチドであってもよいが、アンチセンスＤＮＡが好ましい。
本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、（イ）翻訳阻害を指向したアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、本発明のタンパク質のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドが、（ロ）ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ分解を指向するアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、イントロンを含む本発明のＤＮＡの全塩基配列の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドがそれぞれ好適である。
具体的には、配列番号：６または配列番号：３１で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド、好ましくは例えば、配列番号：６または配列番号：３１で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡの塩基配列に相補な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド（より好ましくは、配列番号：６または配列番号：３１で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡの塩基配列に相補な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド）が挙げられる。アンチセンスポリヌクレオチドとしては、配列番号：３、配列番号：２６または配列番号：２８で表される塩基配列からなるアンチセンスポリヌクレオチドが好ましく用いられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、１０〜４０個程度、好ましくは１５〜３０個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスＤＮＡを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾りん酸残基に置換されていてもよい。また、各ヌクレオチドの糖（デオキシリボース）は、２’−Ｏ−メチル化などの化学修飾糖構造に置換されていてもよいし、塩基部分（ピリミジン、プリン）も化学修飾を受けたものであってもよく、配列番号：６または配列番号：３０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズするものであればいずれのものでもよい。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
本発明に従えば、本発明のタンパク質遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンスポリヌクレオチド（核酸）を、クローン化した、あるいは決定されたタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。かかるポリヌクレオチド（核酸）は、本発明のタンパク質遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいは本発明のタンパク質関連ＲＮＡとの相互作用を介して本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節・制御することができる。本発明のタンパク質関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、および本発明のタンパク質関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外で本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とペプチド（蛋白質）との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド（蛋白質）のアミノ酸を通常指している。タンパク質遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、タンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、「アンチセンス」であるということができる。アンチセンスポリリボヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシリボヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えば J. Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Crooke et al. ed., Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993 などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいは本発明のタンパク質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞に適用できる。
以下に、本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以下、本発明のタンパク質と略記する場合がある）、本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）、本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）、および本発明のＤＮＡのアンチセンスポリヌクレオチド（以下、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドと略記する場合がある）の用途を説明する。
本発明のタンパク質は、癌組織で発現が増加するので、腫瘍マーカーとして利用することが出来る。すなわち、癌組織における早期診断、病巣の進展度の推定のためのマーカーとして有用である。よって、本発明のタンパク質をコードする遺伝子のアンチセンスポリヌクレオチド、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物もしくはその塩または本発明のタンパク質に対する抗体を含有する医薬は、例えば、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍または血液腫瘍などの癌（好ましくは、膵臓癌など）の治療・予防剤、アポトーシス誘導（または促進）剤、プロテアーゼ阻害剤（本明細書では、プロテアーゼ阻害活性を有する化合物またはその塩自体を、プロテアーゼ阻害剤と称することがある。）として使用することができる。
また、本発明のタンパク質の遺伝子は、正常組織での発現が低く、癌組織、特に膵臓癌組織での発現が高いことから、アポトーシス抑制の生理機能の阻害に基づく薬剤を想定した場合、正常組織での薬理作用が低い、すなわち副作用の少ない薬効を示す癌の予防・治療剤の開発が可能になる。
（１）疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のタンパク質は癌組織で発現が増加しており、さらに、本発明のタンパク質の活性を阻害するとプロテアーゼ活性が阻害される。また、本発明のタンパク質の活性を阻害すると癌細胞がアポトーシスを誘導する。従って、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩は、例えば大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍または血液腫瘍などの癌（好ましくは、膵臓癌など）の治療・予防剤として使用することができる。また、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩は、例えば、プロテアーゼ阻害剤、アポトーシス誘導（または促進）剤などとして使用することもできる。また、本発明のタンパク質のプロテアーゼ活性を阻害することにより、慢性関節リュウマチ、変形性関節症、心筋梗塞、動脈硬化症などの治療・予防剤として使用することもでき、本発明のタンパク質のプロテアーゼ活性を阻害することにより、神経変性疾患（アルツハイマー病など）などの治療・予防剤として使用することもできる。
したがって、本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質の活性（例えば、プロテアーゼ活性、アポトーシス抑制活性など）を阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用であり、かつそのスクリーニング方法を提供する。
より具体的には、例えば、（i）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞のアポトーシス抑制活性と、（ii）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物のアポトーシス抑制活性とを比較することを特徴する本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法；（iii）本発明のタンパク質のプロテアーゼ活性と、（iv）本発明のタンパク質と試験化合物の混合物のプロテアーゼ活性とを比較することを特徴する本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法；などが用いられる。
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された宿主（形質転換体）が用いられる。宿主としては、例えば、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のタンパク質を細胞内あるいは細胞外に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。本発明のタンパク質を発現し得る細胞の培養方法は、前記した本発明の形質変換体の培養法と同様である。
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげられる。
例えば、上記（ii）の場合におけるアポトーシス抑制活性を、上記（i）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害させる試験化合物を、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物として選択することができる。
また、例えば、上記（iii）の場合におけるプロテアーゼ活性を、上記（v）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害させる試験化合物を、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物として選択することができる。
本発明のタンパク質の活性を阻害する活性を有する化合物は、本発明のタンパク質の生理活性を抑制するための安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物である。該化合物の塩としては、前記した本発明のペプチドの塩と同様のものが用いられる。
さらに、本発明のタンパク質の遺伝子も、癌組織において発現が増加するので、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩も、例えば乳癌、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍または血液腫瘍などの癌（好ましくは、膵臓癌など）の治療・予防剤として使用することができる。また、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩は、例えば、プロテアーゼ阻害剤、アポトーシス誘導（または促進）剤などとして使用することもできる。
したがって、本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）は、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
スクリーニング方法としては、（v）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合と、（vi）試験化合物の存在下、本発明で用いられるタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合との比較を行うことを特徴とするスクリーニング方法が挙げられる。
上記方法において、（v）と（vi）の場合における、前記遺伝子の発現量（具体的には、本発明のタンパク質量または前記タンパク質をコードするｍＲＮＡ量）を測定して、比較する。
試験化合物および本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、上記と同様のものが挙げられる。
タンパク質量の測定は、公知の方法、例えば、本発明のタンパク質を認識する抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、ウェスタン解析、ＥＬＩＳＡ法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
ｍＲＮＡ量の測定は、公知の方法、例えば、プローブとして配列番号：６、配列番号：３１またはその一部を含有する核酸を用いるノーザンハイブリダイゼーション、あるいはプライマーとして配列番号：６、配列番号：３１またはその一部を含有する核酸を用いるＰＣＲ法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
例えば、上記（v）の場合における遺伝子の発現を、上記（vi）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害させる試験化合物を、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物として選択することができる。
本発明のスクリーニング用キットは、本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、または本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドを産生する能力を有する細胞を含有するものである。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物またはその塩であり、本発明のタンパク質の活性（例、アポトーシス抑制活性など）を阻害する化合物またはその塩、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩である。
該化合物の塩としては、前記した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用いられる。
本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、および本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩はそれぞれ、例えば大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍または血液腫瘍などの癌（好ましくは、膵臓癌など）の治療・予防剤として、またはプロテアーゼ阻害剤、アポトーシス誘導（または促進）剤などとして有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上述の治療・予防剤として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記化合物またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（５０mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記化合物またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記化合物が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記化合物との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、膵臓癌の治療の目的で本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物またはその塩を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物またはその塩の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、膵臓癌の治療の目的で本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物またはその塩を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を癌病変部に注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（２）本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の定量
本発明のタンパク質に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）は、本発明のタンパク質を特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のタンパク質の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明のタンパク質とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法、および
（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法を提供する。
上記（ii）の定量法においては、一方の抗体が本発明のタンパク質のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のタンパク質のＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
また、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称する場合がある）を用いて本発明のタンパク質の定量を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')２ 、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、タンパク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のタンパク質量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のタンパク質のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原(Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明のタンパク質を感度良く定量することができる。
さらには、本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質の濃度を定量することによって、本発明のタンパク質の濃度の増加が検出された場合、例えば大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍または血液腫瘍などの癌である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタンパク質を検出するために使用することができる。また、本発明のタンパク質を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のタンパク質の検出、被検細胞内における本発明のタンパク質の挙動の分析などのために使用することができる。
（３）遺伝子診断薬
本発明のＤＮＡは、例えば、プローブとして使用することにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）における本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断薬として有用である。
本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomics），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより発現増加が検出された場合やＰＣＲ−ＳＳＣＰ法によりＤＮＡの突然変異が検出された場合は、例えば大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍または血液腫瘍などの癌である可能性が高いと診断することができる。
（４）アンチセンスポリヌクレオチドを含有する医薬
本発明のＤＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑制することができる本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、生体内における本発明のタンパク質または本発明のＤＮＡの機能（例、アポトーシス抑制活性など）を抑制することができるので、例えば大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍または血液腫瘍などの癌（好ましくは、膵臓癌など）の治療・予防剤として使用することができる。また、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは例えば、アポトーシス誘導（または促進）剤、プロテアーゼ阻害剤などとして使用することもできる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドを上記の治療・予防剤、誘導（または促進）剤、阻害剤などとして使用する場合、自体公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。
また、例えば、前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。該アンチセンスポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に局所投与することもできる。
さらに、体内動態の改良、半減期の長期化、細胞内取り込み効率の改善を目的に、前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独またはリポゾームなどの担体とともに製剤（注射剤）化し、静脈、皮下等に投与してもよい。
該アンチセンスポリヌクレオチドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、膵臓癌の治療の目的で本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ）においては、一日につき該アンチセンスポリヌクレオチドを約０．１〜１００ｍｇ投与する。
さらに、該アンチセンスポリヌクレオチドは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部を含有する二重鎖ＲＮＡ（本発明のポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡ）、本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部を含有するリボザイムなども、本発明の遺伝子の発現を抑制することができ、生体内における本発明で用いられるタンパク質または本発明で用いられるＤＮＡの機能を抑制することができるので、例えば、例えば大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍または血液腫瘍などの癌（好ましくは、膵臓癌など）の予防・治療剤、アポトーシス誘導（または促進）剤、プロテアーゼ阻害剤などとして使用することができる。
二重鎖ＲＮＡは、公知の方法（例、Nature, 411巻, 494頁, 2001年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
リボザイムは、公知の方法（例、TRENDS in Molecular Medicine, 7巻, 221頁, 2001年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部に公知のリボザイムを連結することによって製造することができる。本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得る本発明のＲＮＡ上の切断部位に近接した部分（ＲＮＡ断片）が挙げられる。
上記の二重鎖ＲＮＡまたはリボザイムを上記予防・治療剤、誘導（または促進）剤、阻害剤として使用する場合、アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。
（５）本発明の抗体を含有する医薬
本発明の抗体は、例えば大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍または血液腫瘍などの癌（好ましくは、膵臓癌など）の予防・治療剤（例、ワクチンなど）として使用することができる。また、本発明の抗体は、例えば、アポトーシス誘導（または促進）剤、プロテアーゼ阻害剤として使用することもできる。
本発明の抗体を含有する上記疾患の治療・予防剤、誘導（または促進）剤、阻害剤は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。好ましくはワクチンとして定法に従って投与することができる。
本発明の抗体は、それ自体を投与しても良いし、または適当な医薬組成物として投与しても良い。投与に用いられる医薬組成物としては、本発明の抗体およびその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであっても良い。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤、ワクチン等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調整できる。注射剤の調整方法としては、例えば、上記本発明の抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（５０mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されても良い。
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。抗体の含有量としては、投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ程度、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ程度、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇ程度の上記抗体が含有されていることが好ましい。
本発明の抗体を含有する上記予防・治療剤、誘導剤、阻害剤の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の膵臓癌の治療・予防のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０.０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０.１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０.１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与（例、血管内注射、皮下注射など）に適する剤形として提供される。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
（６）本発明の「ＨＴＲＡ３の活性阻害作用を有する化合物またはその塩を含有してなるアポトーシス誘導剤」および「ＨＴＲＡ３の発現阻害作用を有する化合物またはその塩を含有してなるアポトーシス誘導剤」；ならびに「ＨＴＲＡ３の活性阻害作用を有する化合物またはその塩を含有してなるプロテアーゼ阻害剤」および「ＨＴＲＡ３の発現阻害作用を有する化合物またはその塩を含有してなるプロテアーゼ阻害剤」について
「ＨＴＲＡ３の活性阻害作用を有する化合物」は、ＨＴＲＡ３の活性阻害作用を有する化合物であればいかなるものでもよく、例えば大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍または血液腫瘍などの癌（好ましくは、膵臓癌など）の予防・治療剤として用いられる。
「ＨＴＲＡ３の発現阻害作用を有する化合物」は、ＨＴＲＡ３の発現阻害作用を有する化合物であればいかなるものでもよく、例えば大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍または血液腫瘍などの癌（好ましくは、膵臓癌など）の予防・治療剤として用いられる。
該予防・治療剤は、上記と同様にして製造される。
（７）ＤＮＡ転移動物
本発明は、外来性の本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（２）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１)記載の動物、
（３）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第（２）記載の動物、および
（４）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統，ＢＤＦ１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のタンパク質を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、1)ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、2)各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ペプチド鎖延長因子1α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネーターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネーターなどが用いられる。
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流 に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のタンパク質の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能亢進症や、本発明のタンパク質が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行うことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質に関連する疾患に対する予防・治療剤、例えば大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍または血液腫瘍などの癌（好ましくは、膵臓癌など）の予防・治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原料として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行うことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正常タンパク質の機能阻害（dominant negative作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質または機能不活性型不応症に対する予防・治療剤、例えば大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍または血液腫瘍などの癌（好ましくは、膵臓癌など）の予防・治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
1)組織培養のための細胞源としての使用、
2)本発明のＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたペプチド組織を分析することによる、本発明のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化するペプチドとの関連性についての解析、
3)ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
4)上記3)記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
5)本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症などを含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のタンパク質産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症を含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明のタンパク質が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
（８）ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第（１）項記載の胚幹細胞、
（３）ネオマイシン耐性である第（１）項記載の胚幹細胞、
（４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）項記載の胚幹細胞、
（５）ゲッ歯動物がマウスである第（４）項記載の胚幹細胞、
（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（９）ゲッ歯動物がマウスである第（８）項記載の非ヒト哺乳動物、および
（１０）第（７）項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしている本発明のタンパク質の活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のタンパク質の発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知 EvansとKaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３.５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１−１００００U/ml）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１−０.５％トリプシン／０.１−５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１−３日毎に行うが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第292巻、154頁、1981年；G. R. Martin プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschman ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のタンパク質の細胞生物学的検討において有用である。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のタンパク質により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のタンパク質の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
（８ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病、例えば癌など（好ましくは、膵臓癌など）に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
例えば大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍または血液腫瘍などの癌（好ましくは、膵臓癌など）に対して治療・予防効果を有する化合物をスクリーニングする場合、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、試験化合物非投与群と癌の発症度合いの違いや癌の治癒度合いの違いを上記組織で経時的に観察する。
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の上記疾患症状が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上改善した場合、該試験化合物を上記の疾患に対して治療・予防効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のタンパク質の欠損や損傷などによって引き起こされる疾患に対して治療・予防効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。本発明のタンパク質の欠損や損傷などによって引き起こされる疾患としては、例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患；狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患；女性の不妊症；などが挙げられる。従って、本発明のタンパク質の活性を促進する化合物またはその塩、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩、本発明のタンパク質自体、本発明のタンパク質の遺伝子などは、例えば、神経細胞、心筋細胞などのアポトーシス抑制作用を示し、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患；狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患；などの疾患の治療・予防剤として使用することができる。また、アポトーシス抑制剤などとして使用することもできる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の膵臓癌患者においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の膵臓癌患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（８ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明のタンパク質の発現する組織で、本発明のタンパク質の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のタンパク質の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のタンパク質欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質の発現の阻害、該タンパク質の機能を阻害することができるので、例えば大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍または血液腫瘍などの癌（好ましくは、膵臓癌など）の予防・治療剤として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の膵臓癌患者においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の膵臓癌患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療剤の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明のタンパク質のプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にそのタンパク質を合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のタンパク質そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
本明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ：グアニン
Ｃ ：シトシン
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ ：グリシン
Ａｌａ ：アラニン
Ｖａｌ ：バリン
Ｌｅｕ ：ロイシン
Ｉｌｅ ：イソロイシン
Ｓｅｒ ：セリン
Ｔｈｒ ：スレオニン
Ｃｙｓ ：システイン
Ｍｅｔ ：メチオニン
Ｇｌｕ ：グルタミン酸
Ａｓｐ ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ ：リジン
Ａｒｇ ：アルギニン
Ｈｉｓ ：ヒスチジン
Ｐｈｅ ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ ：チロシン
Ｔｒｐ ：トリプトファン
Ｐｒｏ ：プロリン
Ａｓｎ ：アスパラギン
Ｇｌｎ ：グルタミン
ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
Ｓｅｃ ：セレノシステイン（selenocysteine）
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｍｅ ：メチル基
Ｅｔ ：エチル基
Ｂｕ ：ブチル基
Ｐｈ ：フェニル基
ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ ：ホルミル
Ｂｚｌ ：ベンジル
Cl2-Bzl ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル
Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ ：ジニトロフェニル
Ｔｒｔ ：トリチル
Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１,２,３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド
ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２〕
実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
実施例２で用いられたアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕
実施例２で用いられたコントロールオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
ＨＴＲＡ３のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６〕
配列番号：５で表されるアミノ酸配列を有するＨＴＲＡ３をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
ＨＴＲＡ３をコードする全長遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕
実施例３で用いられたＨＴＲＡ３をコードする全長遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕
実施例３で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
実施例３で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕
実施例３で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
実施例３で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕
実施例３で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕
実施例３で用いられたＨＴＲＡ３をコードする全長遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕
実施例３で用いられたＨＴＲＡ３をコードする全長遺伝子の一部を含むＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１６〕
実施例３で用いられたＨＴＲＡ３をコードする全長遺伝子の一部を含むＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕
実施例３で用いられたＨＴＲＡ３をコードする全長遺伝子の一部を含むＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１８〕
実施例６で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕
実施例６で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２０〕
実施例６で得られたＨＴＲＡ３Ｓ３０５Ａ変異体発現ベクター6)におけるＨＴＲＡ３Ｓ３０５Ａ変異体をコードするＤＮＡを含む塩基配列を示す。
〔配列番号：２１〕
実施例６で得られたＨＴＲＡ３Ｓ３０５Ａ変異体発現ベクター7)におけるＨＴＲＡ３Ｓ３０５Ａ変異体をコードするＤＮＡを含む塩基配列を示す。
〔配列番号：２２〕
実施例７で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２３〕
実施例７で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２４〕
実施例７で用いられたプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：２５〕
ＨＴＲＡ３Ｓ３０５Ａ変異体（３０５番目のセリン残基がアラニン残基に置換している変異体）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２６〕
実施例９で用いられたアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：２７〕
実施例９で用いられたコントロールオリゴヌクレオチドの塩基配列（配列番号：２６で表される塩基配列のリバース配列）を示す。
〔配列番号：２８〕
実施例９で用いられたアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：２９〕
実施例９で用いられたコントロールオリゴヌクレオチドの塩基配列（配列番号：２８で表される塩基配列のリバース配列）を示す。
〔配列番号：３０〕
実施例１０で得られた、ヒトＨＴＲＡ３の自己消化により生じる３７ｋＤａのタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３１〕
配列番号：３０で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
以下において、実施例により本発明をより具体的にするが、この発明はこれらに限定されるものではない。
ヒト膵臓癌組織におけるＨＴＲＡ３遺伝子発現量の検討
ヒト膵臓癌組織由来のtotal RNA（Direct Clinical Access社）を５例、および膵臓癌組織周辺の正常組織由来のtotal RNA（Direct Clinical Access社）を４例、計９例を鋳型として用い、ＨＴＲＡ３遺伝子の発現量の検討を行った。
まずこれらのtotal RNA 2μgから、TaqMan Gold RT-PCR Kit（Applied Biosystems社）を用いて逆転写反応を行い、cDNA溶液を得た。該反応における反応液の組成と反応条件は添付の標準実験プロトコールに従い、100μlの液量とした。
ＨＴＲＡ３遺伝子発現量の定量は、２個のプライマー、プライマー１（配列番号：１）およびプライマー２（配列番号：２）を用いたPCR法にて行った。該反応における反応液の組成は上記cDNA 0.5μlを鋳型として使用し、HotStarTaq Master Mix（QIAGEN社）10μl量、10μMのプライマー１（配列番号：１）および10μMのプライマー２（配列番号：２）を各0.5μl、および蒸留水を8.5μl加え、20μlの液量とした。PCR反応は、95℃・15分の後、94℃・30秒、60℃・30秒、72℃・30秒のサイクルを30回繰り返し最後に72℃・10分の伸長反応を行った。該反応終了後、PCR産物のアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色にてPCR産物を検出した結果、膵臓癌組織由来のtotal RNA５例からはＨＴＲＡ３遺伝子由来のPCR産物が得られたが、正常組織由来のtotal RNA４例からはPCR産物は検出されなかった。従ってヒト膵臓癌組織においてＨＴＲＡ３遺伝子の発現は、正常組織と比較し顕著に亢進していることが明らかとなった。なお鋳型に用いたtotal RNAの内部標準は、TaqMan Rodent GAPDH Control Reagent VIC Probe（Applied Biosystems社）を用いて定量したＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量とした。ＧＡＰＤＨ遺伝子のPCR反応条件は、ＨＴＲＡ３遺伝子のPCR反応条件と同一の条件で行った結果、９例全てのtotal RNAよりＧＡＰＤＨ遺伝子由来のPCR産物が検出され、正常組織におけるＨＴＲＡ３遺伝子由来のPCR産物の未検出は、RNAの分解に起因するものではないことが証明された。
ＨＴＲＡ３のアポトーシス抑制活性の検討
膵臓癌組織にて、発現が顕著に亢進していたＨＴＲＡ３遺伝子のアポトーシス抑制活性について検討するために、ＨＴＲＡ３アンチセンスオリゴヌクレオチド導入実験を行った。まず、ＨＴＲＡ３全長配列（GenBank:AY040094）に対するアンチセンス（配列番号：３）を設計後、phosphorothioate化オリゴヌクレオチドを合成し、ＨＰＬＣ精製して導入実験に用いた（Amersham Pharmacia Biotech社）。コントロールオリゴヌクレオチドとして配列番号：３で表される塩基配列のリバース配列（配列番号：４）を同様にphosphorothioate化し、ＨＰＬＣ精製して用いた（Amersham Pharmacia Biotech社）。
被験細胞として膵臓癌由来細胞株ＢｘＰＣ−３（Cancer Invest.、4巻、15-23頁、1986年、ATCCより購入）を用いた。１ウェル当たり８０００細胞のＢｘＰＣ−３を、９６ウェル・透明底ブラックプレート（Falcon社）に播種した。３７℃、５％ＣＯ２の条件で２日間培養後、オリゴヌクレオチドを導入した。オリゴヌクレオチド導入にはTfx-50 Reagent （Promega社）を使用し、その標準実験プロトコールに従った。オリゴヌクレオチドを導入し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で２日間培養後、アポトーシス抑制活性について検討した。細胞の有するアポトーシス活性は、カスパーゼ３および７の酵素活性を測定することによって定量した。カスパーゼ３および７の酵素活性は、Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 Assay（Promega社）を用い、１ウェル当たり50μlの基質溶液を使用し、標準の実験プロトコールに従って定量した。
その結果、コントロール（リバース）オリゴヌクレオチド導入細胞（１００％）と比較し、アンチセンスオリゴヌクレオチド導入細胞において、顕著なカスパーゼ３および７の酵素活性の上昇が認められた（１２６％）。すなわちアンチセンスオリゴヌクレオチド導入によって細胞のアポトーシスが誘導され、ＨＴＲＡ３がアポトーシス抑制活性を有することが示された。
以上より、ＨＴＲＡ３は膵臓癌組織にて顕著に発現が亢進しているだけでなく、癌細胞のアポトーシスに関与していることが明らかとなった。
ヒトＨＴＲＡ３発現ベクターの構築
配列番号：８に示す二本鎖ＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社）に挿入したＨＴＲＡ３発現ベクター1)を作製した。オリゴヌクレオチド（配列番号：９および配列番号：１１）をプライマーとして用いてＰＣＲ法により二本鎖ＤＮＡを合成した。該反応における反応液の組成はＭＴＣパネル卵巣ｃＤＮＡ（クロンテック社）０．３μｌ、ＥｘＴａｑ１０×バッファー２．０μｌ、ＥｘＴａｑ０．１μｌ、１０μＭのプライマーを各０．５μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ１．６μｌ、および蒸留水１５μｌを加え液量を２０μｌとした。ＰＣＲ反応は、９８℃・１分の後、９８℃・３０秒、６５℃・３０秒、７２℃・９０秒のサイクルを１０回繰り返してから、９８℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃・９０秒のサイクルを２０回繰り返し、最後に７２℃・７分の伸長反応を行った。該反応後、ＰＣＲ産物を蒸留水で１００倍希釈し、さらにＰＣＲ反応によって目的配列の増幅を行った。該反応における反応液の組成は、ＰＣＲ産物希釈液３μｌを鋳型として使用し、ＥｘＴａｑ１０×バッファー２０μｌ、ＥｘＴａｑ１μｌ、１０μＭのプライマーを各５μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ１６μｌ、および蒸留水１５０μｌを加え液量を２００μｌとした。ＰＣＲ反応は、９８℃・１分の後、９８℃・３０秒、６５℃・３０秒、７２℃・９０秒のサイクルを１０回繰り返してから、９８℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃・９０秒のサイクルを２０回繰り返し、最後に７２℃・７分の伸長反応を行った。該反応終了後、ＰＣＲピューリフィケーションキット（キアゲン社）により精製した。精製したＰＣＲ産物を制限酵素ＸｂａIおよびＫｐｎIにより消化し、この反応液をアガロースゲル電気泳動後、ゲルエキストラクションキット（キアゲン社）により精製した。同様にｐｃＤＮＡ３．１（＋）を制限酵素ＸｂａIおよびＫｐｎIにより消化し、アガロースゲル電気泳動後、ゲルエキストラクションキット（キアゲン社）により精製した。ＰＣＲ産物７５ngとベクター断片６０ngおよびＤＮＡライゲーションキットVer2ソリューションI５μｌ（タカラ社）を混合して16℃で３０分間ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、得られた形質転換株８株を選択した。選択した大腸菌を培養後、ＤＮＡを抽出し、ビッグダイターミネーターサイクルシークエンシングｖｅｒ２（ＡＢＩ社）を用いてシークエンス反応を行い、３７００ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ社）により塩基配列を決定し、配列番号：８（ＯＲＦを全て含有）と一致するクローンを選択した。
次に、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７に示す塩基配列のＤＮＡを、それぞれ配列番号：１４および配列番号：１５をｐ３×ＦＬＡＧ−ＣＭＶ１４に、配列番号：１６をｐ３×ＦＬＡＧ−ＣＭＶ１３に、配列番号：１７をｐ３×ＦＬＡＧ−ＣＭＶ９（シグマ社）にＫｐｎI制限酵素サイトおよびＸｂａI制限酵素サイトで挿入して４種のＦＬＡＧ−標識ＨＴＲＡ３発現ベクター2)、3)、4)、5)を作製した。先に得られた発現ベクター1)を鋳型とし、プライマーとして配列番号：１４にオリゴヌクレオチド（配列番号：９および配列番号：１２）、配列番号：１５に（配列番号：９および配列番号：１３）、配列番号１６に（配列番号：１０および配列番号：１２）、配列番号：１７に（配列番号：１０および配列番号：１１）の組み合わせで用いて、得られた発現ベクター1)を鋳型としてＰＣＲ法により二本鎖ＤＮＡ４種を合成した。該反応における反応液の組成は、４．７ｎｇ／μｌの発現ベクター1)２μｌ、１０×ｐｆｕバッファー５μｌ、ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ０．２５μｌ、１０μＭのプライマー（配列番号：９および配列番号：１２）または（配列番号：９および配列番号：１３）または（配列番号：１０および配列番号：１２）または（配列番号：１０および配列番号：１１）を各１．２５μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ４μｌ、および蒸留水３６．２５μｌを加え液量を５０μｌとした。ＰＣＲ反応は、９８℃・１分の後、９８℃・３０秒、６５℃・３０秒、７２℃・９０秒のサイクルを１０回繰り返してから、９８℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃・９０秒のサイクルを１５回繰り返し、最後に７２℃・７分の伸長反応を行った。合成したＰＣＲ産物をそれぞれアガロースゲル電気泳動後、ゲルエキストラクションキット（キアゲン社）により精製し、制限酵素ＸｂａIおよびＫｐｎIにより消化した。得られた断片をＰＣＲピューリフィケーションキット（キアゲン社）により精製した。同様に発現ベクターｐ３×ＦＬＡＧ−ＣＭＶ９、１３および１４を制限酵素ＸｂａIおよびＫｐｎIにより消化し、アガロースゲル電気泳動後、ゲルエキストラクションキット（キアゲン社）により精製した。ＰＣＲ産物とベクター断片をそれぞれ５０ngおよび３０ng用いてＤＮＡライゲーションキットVer2ソリューションにより16℃で３０分間ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、得られた形質転換株８株を選択した。選択した大腸菌を培養後、ＤＮＡを抽出し、ビッグダイターミネーターサイクルシークエンシングｖｅｒ２（ＡＢＩ社）を用いてシークエンス反応を行い、３７００ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ社）により塩基配列を決定し、配列番号：１４（ＯＲＦを全て含有）、配列番号：１５（Ｃ末端のＰＤＺドメイン欠損）、配列番号：１６（Ｎ末端のシグナル配列欠損）、配列番号：１７（Ｎ末端のシグナル配列欠損）に一致するクローンを選択した。〔ドメイン、シグナル配列に関しては、Biochem. J., (Jan(6))巻, epub ahead of print頁, 2003年参照〕
ヒトＨＴＲＡ３の一過性発現と細胞培養上清の取得
ＣＯＳ−７細胞を血清含有ＤＭＥＭ培地で培養し、遺伝子導入の前日に１０ｃｍディッシュ（ファルコン社）に９×１０５個を播種した。血清不含ＤＭＥＭ培地で洗浄後、１２μｇの発現ベクター2)、3)、4)、5)、空ベクターｐ３×ＦＬＡＧ−ＣＭＶ１４、ｐ３×ＦＬＡＧ−ＣＭＶ１３またはｐ３×ＦＬＡＧ−ＣＭＶ９と３６μｌのＴＲＡＮＳＦＡＳＴ（プロメガ社）を含む６ｍｌの無血清培地を加え、それぞれの発現ベクターと空ベクターにつき１０ｃｍディッシュ２枚づつ遺伝子導入を行った。３７℃，５％ＣＯ2の条件で１時間培養した後、１０％牛血清含有ＤＭＥＭ培地１２ｍｌを加え、さらに１日培養した。ＰＢＳ（―）で洗浄後、血清およびフェノールレッド不含ＤＭＥＭ培地 ８ｍｌに交換し、２日後に培養上清を回収した。培養上清は、２５００ｒｐｍで遠心後、１０ｃｍディッシュ２枚分を合わせて１６ｍｌを用いてＵＦＶ２ＢＧＣ１０（ミリポア社）により限外ろ過を行い、６７０μｌまで濃縮した。
ヒトＨＴＲＡ３によるカゼインの分解
実施例４で得られた濃縮培養上清25μl、75μlのEnzChek Protease Assay Kit green fluorescence Digestion Buffer（モレキュラープローブ社）、100μlの10μg/ml EnzChek Protease Assay Kit green fluorescenceＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識カゼイン基質溶液（モレキュラープローブ社）を混合し、３７℃で４時間反応させた。反応後、血清およびフェノールレッド不含ＤＭＥＭ培地２５μｌ、75μlのEnzChek Protease Assay Kit green fluorescence Digestion Buffer、100μlの10μg/ml EnzChek Protease Assay Kit green fluorescenceＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識カゼイン基質溶液の混合液をバックグラウンドとして励起波長485nmで蛍光波長538nmをフルオロスキャン蛍光プレートリーダー（ラボシステムズ社）により測定した。ＨＴＲＡ３発現ベクター2)、3)、4)、5)をトランスフェクションした培養上清では、対応する空ベクターとして発現ベクター2)と3)に対してはｐ３×ＦＬＡＧ−ＣＭＶ１４、発現ベクター4)に対してはｐ３×ＦＬＡＧ−ＣＭＶ１３、発現ベクター5)に対してはｐ３×ＦＬＡＧ−ＣＭＶ９をトランスフェクションした培養上清と比べて蛍光強度がそれぞれ３．９、３．５、３．３、２．１倍に上昇した。実施例４で得た細胞培養上清に含まれるＨＴＲＡ３がカゼイン分解活性を持つことが明らかになった。
ヒトＨＴＲＡ３Ｓ３０５Ａ変異体発現ベクターの構築
オリゴヌクレオチド（配列番号：１８および配列番号：１９）をプライマーとして用いてＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ(ストラタジーン社)により、配列番号：２０に示す二本鎖ＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社）に、また、配列番号：２１に示す二本鎖ＤＮＡをｐ３×ＦＬＡＧ−ＣＭＶ１４に挿入したＨＴＲＡ３Ｓ３０５Ａ変異体（配列番号：２５）発現ベクター6)（配列番号：２０）、7)（配列番号：２１）を作製した。該反応における反応液の組成は実施例３で得られた発現ベクター1)、2）を１０ ｎｇ、１０×反応バッファー５．０ μｌ、ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １.０ μｌ、２.７ μＭのプライマーを各５μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌおよび蒸留水３３ μｌを加え液量を５１ μｌとした。ＰＣＲ反応は、９５℃・３０秒の後、９５℃・３０秒、５５℃・１分、６８℃・８分のサイクルを１２回繰り返して行った。該反応後、ＰＣＲ反応液に１μｌの制限酵素 ＤｐｎＩにより消化した。消化後、大腸菌ＸＬ−Ｂｌｕｅに形質転換し、選択した大腸菌を培養後、ＤＮＡを抽出し、ビッグダイターミネーターサイクルシークエンシングｖｅｒ２（ＡＢＩ社）を用いてシークエンス反応を行い、３７００ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ社）により塩基配列を決定し、配列番号：２０および配列番号：２１と一致するクローンを選択した。
ＨＴＲＡ３のアンチセンスによるアポトーシス抑制活性の検討−２−
（ＰＡＮＣ−１細胞の追加とｍＲＮＡ減少の確認）
実施例２で述べたＨＴＲＡ３のアポトーシス抑制活性をさらに検証するために、被験細胞として膵臓癌由来細胞株ＰＡＮＣ−１（Int. J. Cancer、15巻、741-747頁、1975年、ATCCより購入）を用いて、同様の実験を行った。ＨＴＲＡ３アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号：３）とコントロールオリゴヌクレオチド（配列番号：４）は実施例２で述べたphosphorothioate化オリゴヌクレオチドを用いた。
１ウェル当たり１００００細胞のＰＡＮＣ−１を、１２ウェルプレート（Falcon社）に播種した。３７℃、５％ＣＯ２の条件で２日間培養後、オリゴヌクレオチドを導入した。オリゴヌクレオチド導入にはTransFast Reagent （Promega社）を使用し、その標準実験プロトコールに従った。オリゴヌクレオチドを導入し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で２日間培養後、アポトーシス抑制活性について検討した。細胞の有するアポトーシス活性は、カスパーゼ３および７の酵素活性を測定することによって定量した。カスパーゼ３および７の酵素活性は、Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 Assay （Promega社）を用い、１ウェル当たり500μlの基質溶液を使用し、標準の実験プロトコールに従って定量した。
その結果、コントロール（リバース）オリゴヌクレオチド導入細胞（１００％）と比較し、アンチセンスオリゴヌクレオチド導入細胞において、顕著なカスパーゼ３および７の酵素活性の上昇が認められた（１３３％）。すなわちアンチセンスオリゴヌクレオチド導入によってＰＡＮＣ−１細胞においてもＢｘＰＣ−３細胞と同様のアポトーシスが誘導され、ＨＴＲＡ３がアポトーシス抑制活性を有することが示された。
さらに同バッチでＨＴＲＡ３遺伝子のｍＲＮＡの減少を測定した。オリゴヌクレオチドを導入した後、３７℃、５％ＣＯ２の条件で６時間培養後、RNeasy Mini Kit (QIAGEN社)を用いてtotal RNA抽出を標準の実験プロトコールに従って行った。total RNAから、TaqMan Gold RT-PCR Kit（Applied Biosystems社）を用いて逆転写反応を行い、cDNA溶液を得た。該反応における反応液の組成と反応条件は添付の標準実験プロトコールに従った。
ＨＴＲＡ３遺伝子の発現量はTaqMan PCR法を用いて定量した。プライマーとして配列番号：２２と配列番号：２３に表したオリゴヌクレオチドを用いた。プローブとして、配列番号：２４に表したＦＡＭ，ＴＡＭＲＡ標識オリゴヌクレオチドを用いた。TaqMan PCRは、TaqMan Universal Mixture (Applied Biosystems社)を用いて、その標準の実験プロトコールに従って行った。各々のプライマーの終濃度は250 nM、プローブの終濃度は100 nMとした。PCR反応は、95℃：15秒と65℃：60秒の40サイクルとした。
さらにＨＴＲＡ３遺伝子発現量の内部標準は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量とした。ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量の定量は、TaqMan GAPDH Control Reagents (Applied Biosystems社)を用いて、その標準の実験プロトコールに従って行った。
ＨＴＲＡ３遺伝子のTaqMan PCRを行い、その発現量をＧＡＰＤＨ遺伝子で補正した結果、コントロール（リバース）オリゴヌクレオチド導入細胞（１００％）と比較し、アンチセンスオリゴヌクレオチド導入細胞において、顕著なＨＴＲＡ３遺伝子のｍＲＮＡの減少が認められた（４９％）。すなわちアンチセンスオリゴヌクレオチド導入によってＨＴＲＡ３遺伝子のｍＲＮＡの減少が示され、細胞のアポトーシス誘導はこのＨＴＲＡ３遺伝子のｍＲＮＡの減少に起因する可能性が示された。
ＨＴＲＡ３の一過性発現によるアポトーシス抑制活性の検討
ＨＴＲＡ３遺伝子のアポトーシス抑制活性について検討するために、ＨＴＲＡ３発現ベクター導入実験を行った。ＨＴＲＡ３発現ベクターは、実施例３で得られた配列番号：１４で表されるＯＲＦを全て含有する発現ベクター2)を用いた。コントロールとして対応する空ベクターであるｐ３×ＦＬＡＧ−ＣＭＶ１４を用いた。さらにアポトーシス抑制活性におけるセリンプロテアーゼ活性の役割を考察するために、配列番号：２０に表されるＨＴＲＡ３遺伝子の発現ベクター6)（タンパク配列として３０５番目のセリン残基がアラニン残基に置換している変異体（配列番号：２５））を用いた。
被験細胞として膵臓癌由来細胞株ＰＡＮＣ−１（Int. J. Cancer、15巻、741-747頁、1975年、ATCCより購入）を用いた。１ウェル当たり１００００細胞のＰＡＮＣ−１を、９６ウェル・透明底ブラックプレート（Falcon社）に播種した。３７℃、５％ＣＯ２の条件で２日間培養後、各々の空ベクター、発現ベクター2)、6)を導入した。導入にはTransfast Reagent （Promega社）を使用し、その標準実験プロトコールに従った。各々の空ベクター、発現ベクターの終濃度は1nMとした。導入して、３７℃、５％ＣＯ２の条件で２日間培養後、アポトーシス抑制活性について検討した。細胞の有するアポトーシス活性は、カスパーゼ３および７の酵素活性を測定することによって定量した。カスパーゼ３および７の酵素活性は、Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 Assay （Promega社）を用い、１ウェル当たり50μlの基質溶液を使用し、標準の実験プロトコールに従って定量した。
その結果、コントロール（空ベクター：ｐ３×ＦＬＡＧ−ＣＭＶ１４）導入細胞（１００％）と比較し、ＨＴＲＡ３発現ベクター2)導入細胞において、顕著なカスパーゼ３および７の酵素活性の抑制が認められた（７５％）。さらに３０５番目のセリン残基をアラニン残基に置換したＨＴＲＡ３の発現ベクター6)導入細胞においてはこの抑制効果は認められなかった（１０２％）。すなわちＨＴＲＡ３のアポトーシス抑制活性について、セリンプロテアーゼ活性が重要であることが示された。
同様の実験を大腸癌由来細胞株ＳＷ４８０（J. Natl. Cancer Inst.、58巻、209-214頁、1977年、ATCCより購入）を用いて行った。１ウェル当たり１００００細胞のＳＷ４８０を、９６ウェル・透明底ブラックプレート（Falcon社）に播種した。３７℃、５％ＣＯ２の条件で２日間培養後、各々の空ベクター、発現ベクター2)、6)を導入した。導入にはTransfast Reagent （Promega社）を使用し、その標準実験プロトコールに従った。各々の空ベクター、発現ベクターの終濃度は1nMとした。導入して、３７℃、５％ＣＯ２の条件で２日間培養後、アポトーシス抑制活性について検討した。細胞の有するアポトーシス活性は、カスパーゼ３および７の酵素活性を測定することによって定量した。カスパーゼ３および７の酵素活性は、Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 Assay （Promega社）を用い、１ウェル当たり50μlの基質溶液を使用し、標準の実験プロトコールに従って定量した。
その結果、コントロール（空ベクター：ｐ３×ＦＬＡＧ−ＣＭＶ１４）導入細胞（１００％）と比較し、ＨＴＲＡ３発現ベクター2)導入細胞において、顕著なカスパーゼ３および７の酵素活性の抑制が認められた（４９％）。さらに３０５番目のセリン残基をアラニン残基に置換したＨＴＲＡ３の発現ベクター6)導入細胞においてはこの抑制効果は認められなかった（１０４％）。すなわちＰＡＮＣ−１細胞における同様のアポトーシス抑制活性がＳＷ４８０細胞についても認められ、またセリンプロテアーゼ活性が重要であることが示された。
ＨＴＲＡ３のアンチセンスによるアポトーシス抑制活性の検討−３−
（アンチセンスオリゴヌクレオチドの追加）
ＨＴＲＡ３遺伝子のアポトーシス抑制活性についてさらに検証するために、実施例２で述べたＨＴＲＡ３アンチセンスオリゴヌクレオチドとは異なる配列のアンチセンスオリゴヌクレオチド導入実験を行った。ＨＴＲＡ３全長配列（GenBank:AY040094）に対するアンチセンス（配列番号：２６および配列番号：２８）を設計後、phosphorothioate化オリゴヌクレオチドを合成し、ＨＰＬＣ精製して導入実験に用いた（Sigma Genosys社）。コントロールオリゴヌクレオチドとして配列番号：２６および配列番号：２８で表される塩基配列のリバース配列（配列番号：２７および配列番号：２９）を同様にphosphorothioate化し、ＨＰＬＣ精製して用いた（Sigma Genosys社）。
被験細胞として膵臓癌由来細胞株ＰＡＮＣ−１（Int. J. Cancer、15巻、741-747頁、1975年、ATCCより購入）を用いた。１ウェル当たり１００００細胞のＰＡＮＣ−１を、９６ウェル・透明底ブラックプレート（Falcon社）に播種した。３７℃、５％ＣＯ２の条件で２日間培養後、オリゴヌクレオチドを導入した。オリゴヌクレオチド導入にはTransfasr Reagent （Promega社）を使用し、その標準実験プロトコールに従った。オリゴヌクレオチドを導入し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で２日間培養後、アポトーシス抑制活性について検討した。細胞の有するアポトーシス活性は、カスパーゼ３および７の酵素活性を測定することによって定量した。カスパーゼ３および７の酵素活性は、Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 Assay（Promega社）を用い、１ウェル当たり50μlの基質溶液を使用し、標準の実験プロトコールに従って定量した。
その結果、コントロール（リバース）オリゴヌクレオチド導入細胞（１００％）と比較し、アンチセンスオリゴヌクレオチド導入細胞において、顕著なカスパーゼ３および７の酵素活性の上昇が認められた（配列番号：２７に対して配列番号：２６の上昇率は１５８％、配列番号：２９に対して配列番号：２８の上昇率は１３７％）。実施例２の結果と併せて、アンチセンスオリゴヌクレオチド導入によって細胞のアポトーシスが誘導され、ＨＴＲＡ３がアポトーシス抑制活性を有することが強く示された。
ヒトＨＴＲＡ３の自己消化により生じる３７ｋＤａタンパク質の取得
ＦＬＡＧ−標識ＨＴＲＡ３発現ベクター2)（配列番号 １４）をＨＥＫ２９３細胞株にトランスフェクションし、７５０ μｇ／ｍｌ Ｇ４１８により選択し、ＦＬＡＧ−標識ＨＴＲＡ３安定発現株を単離した。ＦＬＡＧ−標識ＨＴＲＡ３安定発現株を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで6日間培養後、培養上清４５０ ｍｌを取得した。得られた培養上清を２５００ｒｐｍで１０分間遠心後、１０倍濃度のＴＢＳを加えた。５００ μｌのＦＬＡＧ抗体ビーズ（シグマ社）カラムに上清を添加し、２０ｍｌのＴＢＳでカラム洗浄後、１００μｇ／ｍｌの３×ＦＬＡＧペプチド(シグマ社)５００μｌで５回溶出した（フラクション１−５）。得られたフラクション２を１２ ％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、ＰＶＤＦメンブレン(ミリポア社)に転写した。転写したメンブレンはＭｉｌｌｉ-Ｑで洗浄後、０．１％ ＣＢＢ−Ｒ２５０、４５ ％ ＭｅＯＨ、１０ ％ Ａｃｅｔａｔｅを含む染色液で５分間染色した。染色後、４５％ ＭｅＯＨ、１０ ％ Ａｃｅｔａｔｅで１５分間脱色した。Ｍｉｌｌｉ-Ｑで３回洗浄後、９０ ％ ＭｅＯＨ、７ ％ Ａｃｅｔａｔｅで４０秒間脱色した。乾燥後、メンブレンから３７ｋＤａのバンドを切り抜いてアミノ末端シークエンスに供した。アミノ末端シークエンスは株式会社アプロサイエンスに委託した。その結果、ＳＳＰＲＹの５アミノ酸残基が決定され、ヒトＨＴＲＡ３の自己消化により生じる３７ｋＤａのタンパク質の配列は、配列番号：３０に示す３２０アミノ酸残基の配列と決定された。
ＩＧＦＢＰ−２および５の切断
実施例１０で取得したＦＬＡＧ−標識ＨＴＲＡ３安定発現株をＯＰＴＩ−ＭＥＭ(インビトロジェン社)で３日間培養後、培養上清４００ ｍｌを取得した。得られた培養上清を２０００ ｒｐｍで１０分間遠心後、１０倍濃度のＴＢＳを加えた。５ ｍｌのＦＬＡＧ抗体ビーズ（シグマ社）カラムに上清を添加し、２００ｍｌのＴＢＳでカラム洗浄後、１００ μｇ／ｍｌの３×ＦＬＡＧペプチド(シグマ社)５ ｍｌで４回溶出した（フラクション１−４）。得られたフラクション２および３をＳｌｉｄｅ Ａ Ｌｉｚｅｒ（ピアス社）でＴＢＳに対して３回透析し、１．４ ｍｇ／ｍｌのＦＬＡＧ−標識ＨＴＲＡ３を得た。次に、粗精製したＨＴＲＡ３：０．９４ μｇを１２５ ｎＭ ＩＧＦＢＰ−５（オーストラルバイオロジカルズ社）、２５ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ(ｐＨ ７.４)、２５ ｍＭ ＣＨＥＳ、５０ ｍＭ ＮａＣｌ、０.０２５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１.５ ｍＭ ＤＴＴを含む２０ μlの反応液中において37℃で１４.５ ｈｒ反応させた。また、粗精製ＨＴＲＡ３：１．４ μｇを１２５ ｎＭ ＩＧＦＢＰ−２（オーストラルバイオロジカルズ社）、２５ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ(ｐＨ ７.４)、２５ ｍＭ ＣＨＥＳ、５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１.０２５ ％ Ｔｗｅｅｎ２０、１.５ ｍＭ ＤＴＴを含む２０ μlの反応液中において３７℃で１２ ｈｒ反応させた。反応後、２０ μlの２×ｌａｅｍｍｌｉ バッファー(５% βメルカプトメタノール)を加えて９８℃で５分間処理し、１５−２５ % グラジエントゲル（第一化学薬品）でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＰＶＤＦ膜(アマシャム社)に転写した。転写後ＰＶＤＦ膜はＢｌｏｃｋ Ａｃｅ（大日本製薬株式会社）で1時間ブロッキングを行った後、０.１ ％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含むＴＢＳで３回洗浄（各５分間）し、０．２ μｇ／ｍｌのＩＧＦＢＰ−２抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社）または１ μｇ／ｍｌのＩＧＦＢＰ−５抗体（オーストラルバイオロジカルズ社）と２時間反応させた。その後０.１ ％ Ｔｗｅｅｎ ２０ を含むＴＢＳで３回洗浄（各５分間）し、０.１ ％ Ｔｗｅｅｎ ２０ を含むＴＢＳで１００００倍希釈したＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ標識抗ヤギまたは抗マウスIgG抗体（シグマ社）で1時間反応させた。反応後、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｏｒ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ(プロメガ社)により発色した。その結果、ＨＴＲＡ３によりＩＧＦＢＰ−２のバンドが減少し、３０ ｋＤａの分解産物と思われるバンドが見られた。また、ＨＴＲＡ３によりＩＧＦＢＰ−５のバンドが消失した。以上の結果から、ＨＴＲＡ３によりＩＧＦＢＰ−２およびＩＧＦＢＰ−５が分解されることが示された。

Claims (69)

  1. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなるアポトーシス誘導剤。
  2. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩を含有してなるアポトーシス誘導剤。
  3. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド。
  4. 配列番号：３、配列番号：２６または配列番号：２８で表される塩基配列からなる請求項３記載のアンチセンスポリヌクレオチド。
  5. 請求項３記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
  6. アポトーシス誘導剤である請求項５記載の医薬。
  7. 癌の予防・治療剤である請求項５または６記載の医薬。
  8. 癌が膵臓癌である請求項７記載の医薬。
  9. 請求項３記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる診断薬。
  10. 癌の診断薬である請求項９記載の診断薬。
  11. 癌が膵臓癌である請求項１０記載の診断薬。
  12. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。
  13. 請求項１２記載の抗体を含有してなる医薬。
  14. アポトーシス誘導剤である請求項１３記載の医薬。
  15. 癌の予防・治療剤である請求項１３または１４記載の医薬。
  16. 癌が膵臓癌である請求項１５記載の医薬。
  17. 請求項１２記載の抗体を含有してなる診断薬。
  18. 癌の診断薬である請求項１７記載の診断薬。
  19. 癌が膵臓癌である請求項１８記載の診断薬。
  20. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有してなる癌の診断薬。
  21. 癌が膵臓癌である請求項２０記載の診断薬。
  22. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とするアポトーシス誘導剤のスクリーニング方法。
  23. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とするアポトーシス誘導剤のスクリーニング用キット。
  24. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とするアポトーシス誘導剤のスクリーニング方法。
  25. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有することを特徴とするアポトーシス誘導剤のスクリーニング用キット。
  26. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる膵臓癌の予防・治療剤。
  27. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩を含有してなる膵臓癌の予防・治療剤。
  28. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする膵臓癌の予防・治療剤のスクリーニング方法。
  29. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする膵臓癌の予防・治療剤のスクリーニング用キット。
  30. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする膵臓癌の予防・治療剤のスクリーニング方法。
  31. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有することを特徴とする膵臓癌の予防・治療剤のスクリーニング用キット。
  32. プロテアーゼ活性を有する、配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩。
  33. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなるプロテアーゼ阻害剤。
  34. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩を含有してなるプロテアーゼ阻害剤。
  35. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなるプロテアーゼ阻害剤。
  36. 配列番号：３、配列番号：２６または配列番号：２８で表される塩基配列からなるアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなるプロテアーゼ阻害剤。
  37. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなるプロテアーゼ阻害剤。
  38. アポトーシス誘導剤である請求項３３ないし３７記載の剤。
  39. 癌の予防・治療剤である請求項３３ないし３７記載の剤。
  40. 癌が膵臓癌である請求項３９記載の剤。
  41. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とするプロテアーゼ阻害剤のスクリーニング方法。
  42. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とするプロテアーゼ阻害剤のスクリーニング用キット。
  43. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とするプロテアーゼ阻害剤のスクリーニング方法。
  44. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有することを特徴とするプロテアーゼ阻害剤のスクリーニング用キット。
  45. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする該タンパク質のプロテアーゼ活性の基質のスクリーニング方法。
  46. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする該タンパク質のプロテアーゼ活性の基質のスクリーニング用キット。
  47. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする該タンパク質のプロテアーゼ活性の基質のスクリーニング方法。
  48. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有することを特徴とする該タンパク質のプロテアーゼ活性の基質のスクリーニング用キット。
  49. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害することを特徴とするアポトーシス誘導方法。
  50. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害することを特徴とするプロテアーゼ阻害方法。
  51. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害することを特徴とする膵臓癌の予防・治療方法。
  52. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を阻害することを特徴とするアポトーシス誘導方法。
  53. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を阻害することを特徴とするプロテアーゼ阻害方法。
  54. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を阻害することを特徴とする膵臓癌の予防・治療方法。
  55. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とするアポトーシス誘導方法。
  56. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とするプロテアーゼ阻害方法。
  57. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする膵臓癌の予防・治療方法。
  58. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とするアポトーシス誘導方法。
  59. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とするプロテアーゼ阻害方法。
  60. 配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする膵臓癌の予防・治療方法。
  61. アポトーシス誘導剤の製造のための配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の使用。
  62. プロテアーゼ阻害剤の製造のための配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の使用。
  63. 膵臓癌の予防・治療剤の製造のための配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の使用。
  64. アポトーシス誘導剤の製造のための配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩の使用。
  65. プロテアーゼ阻害剤の製造のための配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩の使用。
  66. 膵臓癌の予防・治療剤の製造のための配列番号：５または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩の使用。
  67. 配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩。
  68. 配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
  69. ＤＮＡである請求項６８記載のポリヌクレオチド。
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