JP2004161777A - 抗原提示の調節 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 抗原提示細胞による抗原提示を増強あるいは阻害するための方法であって、抗原提示細胞をIiの精製されたペプチドと接触させることを含む方法であって、該ペプチドは、カテプシンBならびにカテプシンBおよびDの混合物からなる群から選択されたエンドプロテアーゼによるIiの加水分解によって得られる特定のアミノ酸配列を有する。
【選択図】 なし
Description
このような方法およびこのような方法によって同定される突然変異体は、免疫変調(immunomodulatory)活性について更に試験される小有機化合物などの化合物のクラスを同定するのに有用である。このような方法での最初の工程は、Ii開裂経路の中間体に対して選択的に結合する小有機化合物を同定することである。次に、この方法で同定された化合物を抗原提示細胞と接触させ、そして抗原提示の変化を測定する。
免疫調節タンパク質Iiは、合成時のMHCクラスIIαおよびβ鎖を結合し、おそらく、タンパク質抗原が消化されてMHCクラスII分子に対して結合するペプチドになる同じ細胞内区分において、細胞内プロテアーゼカテプシン(cathepsins)BおよびD(レイズ(Reyes),V.E.他、1991年,J.Immunol.,146:3877〜3880)を含むプロテアーゼによってα,β鎖から開裂され且つ放出されることが実証されている(トーマス(Thomas),L.J.他、1988年,J.Immunol.,140:2670〜2674)。
この方法で同定された突然変異体をそれぞれ、文字「M」(突然変異体として)の後に、突然変異体に存在する特定の突然変異を明記する括弧付きの情報によって示す。例えば、M[R19→A;R20→A]は、19位のアルギニンがアラニンで置き換えられ且つ20位のアルギニンがアラニンで置き換えられている突然変異体Iiを示す。野生型のものとは異なるエンドプロテアーゼ消化パターンを示す具体的に同定された他の突然変異体は、M[R78→A;K80→A;K83→A;K86→T];M[K137→A;K143→A];M[R151→A;K154→A];およびM[L174→V;F175→A]である。
T細胞提示ペプチドとは、MHCクラスII分子の前後関係においてT細胞ハイブリドーマによって認識された独特のエピトープを含むことが実証されているペプチドである。これらは、例えば、プロテアーゼ消化および単離によって、または化学合成によって生じさせることができる。本明細書中で用いられる、T細胞提示ペプチドの相同体とは、アミノ酸置換を有するペプチド、このようなペプチドのフラグメント、またはT細胞提示ペプチドのセグメントに対して構造的相同性を有すると考えられる小さな有機化合物として定義される。このような阻害検定は、インビトロで以下の成分、すなわち、(1)エンドプロテアーゼ消化パターンが野生型のものとは異なる突然変異体Iiと、MHCクラスIIαおよびβ鎖とを含むエンドプロテアーゼで消化された第一の三量体複合体、(2)T細胞提示ペプチド結合の阻害について試験される小さな有機分子および(3)T細胞提示ペプチドを組合わせることによって実施される。このような検定において、T細胞提示ペプチドのエンドプロテアーゼで消化された三量体複合体に対する結合が小さな有機化合物の存在下で阻止される場合、小さな有機化合物は段階的開裂過程の中間体に結合していると結論を下すことができる。ELISA検定などの指示検定は、指示化合物の結合を阻害する化合物を同定するのに用いることができる。このような検定は、T細胞提示ペプチド(またはその相同体)に対する結合親和性について試験される精製分子を固体支持体に対して結合することによって行なわれる。次に、溶液中に存在するT細胞提示ペプチド(またはその相同体)を、結合に適当な条件下において固体支持体に結合された分子と一緒にインキュベートする。このような結合は、T細胞提示ペプチドまたはその相同体に対して結合した指示薬の認識によって確認される。
抗原提示のエンハンサーおよび阻害剤の両方を同定した。例えば、抗原提示を促すペプチドとしては、[Tyr−Ii(78〜92),(YRMKLPKPPKPVSKMR)]があり;そして抗原提示を阻害するペプチドは、[Ii(148〜164),(ENLRHLKNTMETLDWKV)]および[LYELQTKLQTLK]である。セッテ(Sette)ら((1992)Science 258:1801〜1804)が、T細胞提示ペプチドの結合に対する阻害作用を有するIiのペプチドを報告したことは注目される。しかしながら、抗原提示を促すIiペプチドの開示がこれまでに文献で報告されたことはなかった。MHCクラスIIαおよびβ鎖の結合を保持するが、抗原提示の促進に関係した機能を妨げるアミノ酸残基の系統的置換によって抗原提示を阻害する[Tyr−Ii(78〜92),(YRMKLPKPPKPVSKMR)]の相同体を当業者が得ることはできると考えられる。
ペプチド結合の効率を、可溶化されたMHCクラスIIα,β,Ii複合体からのカテプシンBで媒介されたIiの放出の間に試験した。種々の濃度のカテプシンB、pH5.0[A:酵素なし(ペプチドのみ);BカテプシンB(0.1U/ml);C:カテプシンB(0.5U/ml);D:カテプシンB(2.5U/ml)]による室温または37℃で5分間、15分間、30分間または60分間の消化を、結合されたところで引き続き架橋された、N−ヒドロキシスクシンイミドアジドベンゾイル(HSAB)標識され、125I−放射性標識されたインフルエンザウイルスMA(18〜29)ペプチド存在下で行なった。このHLA−DR1で制限されたT細胞提示ペプチドを、DR−1陽性ジェストム(Jesthom)細胞系によって試験した。放射性ヨウ素化ペプチド(100nM)を、種々の時間Iiを開裂したカテプシンBによってジェストム細胞から可溶化されたミクロソーム膜タンパク質に対して加えた。それぞれのインキュベーション後、2mM PMSF、10mM N−エチルマレイミド酸および1mMヨードアセトアミドを含む10mMトリス、pH9.0を用いる1:1希釈によって酵素を失活させた。次いで、ペプチドを、アジド基の紫外線活性化の後にα,β鎖に架橋させた。架橋ペプチドを、MHCクラスIIα,β鎖に対して架橋したペプチドの量の漸進的増加による消化の5分目に検出した。比較しうる時点および温度で、約10倍程度のペプチドが、酵素を伴わないペプチド単独によるよりもカテプシンB 0.05U/mlによって結合した。ペプチド結合は、酵素の量、インキュベーション時間およびインキュベーション温度に比例して増加した。
ペプチド結合は、カテプシンB処理なしでは検出されなかったが、ペプチドがIiタンパク質分解中に存在した場合、はるかに多量のペプチドが結合された。
ペプチド結合は、カテプシンDによるIi開裂の間には促進されなかった。MHCクラスIIα,β,Ii三量体を含む界面活性剤で可溶化されたミクロソーム膜を、種々の量のカテプシンDと一緒に125I−標識HSAB−MA(18〜29)ペプチド(100nM)存在下において30分間インキュベートし、架橋させ、そして上記のように処理した。Iiを開裂したがそのフラグメントのMHCクラスIIα,β鎖からの完全な解離を速やかにもたらさなかったカテプシンDの広範囲の濃度下において(レイズ(Reyes),V.E.他、1991年,J.Immunol.,146:3877〜3880)、放射性ヨウ素化MA(18〜29)ペプチドの促進された結合はみられなかった。
HLA−DR1+ジェストム(Jesthom)ヒトBリンパ芽球細胞のMHCクラスII分子に対する[125I]MA(18〜29)結合特異性を、MA(18〜29)ペプチド、HLA−DR1制限インフルエンザHA(306〜318)、HLA−DP制限デング熱ウイルスNS3(251〜265)およびHLA−B37制限インフルエンザウイルスNP(336〜356)との競合によって検査した。これらのペプチドおよび125I標識HSAB−MA(18〜29)ペプチド(100nM)を、MHCクラスIIα,β,Ii三量体を含む界面活性剤で可溶化されたミクロソーム膜と一緒にカテプシンB 0.5U/mlの存在下で30分間インキュベートし、架橋のために光活性化し、そして抗MHCクラスII抗体との免疫沈降物を上記のように処理した。結合に対する競合は、HLA−DR1制限ペプチド、すなわちヒトMHCクラスII HLA−DR1分子を結合後のTリンパ球によって認識されることが他で示されたペプチドによってのみ見られた。すなわち、MHCクラスII分子に対する[125I]HSAB−MA(18〜29)(10-7M)の結合は、冷HSAB結合MA(18〜29)およびインフルエンザウイルスHA(306〜318)と競合したが、インフルエンザウイルスNP(336〜356)およびデング熱ウイルスNS3(251〜265)とは競合しなかった。
Iiを開裂するのが見られたカテプシンDの最低量は0.1U/mlであった。[35S]メチオニン標識ジェストム細胞から可溶化されたミクロソーム膜タンパク質を、カテプシンD(濃度0、0.01、0.05、0.1、0.5、2.5、10.0U/ml)によってpH5.0で室温において30分間処理した。 インキュベーションの最後に酵素を失活させ、そして抗クラスII mAb,IVA12または抗Ii mAb,VIC−Y1によって免疫沈降物を生成させた。免疫沈降した試料をSDS−PAGEおよびオートラジオクラフィーによって分析した。第二の実験において、Iiを開裂するのが見られたカテプシンDの最低量(0.1U/ml)を、種々の濃度のカテプシンB(0.02〜0.5U/ml)存在下のペプチド結合検定に加えた場合、ペプチド結合の正味量は、オートラジオグラフのデンシトメトリーによって判定したところ、カテプシンD不含で見られるよりも約3倍増加した。この実験に対して、ヨウ素化HSAB−MA(18〜29)ペプチドおよび放射性標識されていないミクロソーム膜を、カテプシンD 0.1U/mlと一緒にまたは不含で、種々の量のカテプシンB(0.02、0.1または0.5U/ml)存在下で10分間または30分間インキュベートした。引き続きの光活性化および抗クラスII mAbによる免疫沈降の後、試料をSDS−PAGEおよびオートラジオクラフィーに付した。
MHCクラスIIα,β鎖抗原結合部位の外来ペプチド負荷は、Iiの開裂および放出と同時の過程であったという仮説を試験するために、Iiの配列中の推定上の開裂部位を、カテプシンDおよびカテプシンBによるIiの段階的開裂および放出について提唱した。カテプシンBおよびカテプシンDは、それぞれの酵素に特有の一連のIiフラグメントと一緒にMHCクラスIIα,β鎖からIiを開裂したので(レィズ(Reyes),V.E.他、1991年,J.Immunol.,146:3877〜3880)、Iiはそれぞれの酵素に特異的な開裂部位を有する。疎水性−陽イオン性部位でのカテプシンB開裂および疎水性−疎水性部位でのカテプシンD開裂を提唱することができる(表1)。
表IIのオリゴヌクレオチドによって構築した突然変異体Ii遺伝子を、HLA-DR1 α及びβ遺伝子と共に、ヒトHLA-DR1 α,β遺伝子(RSV-5(neo)-DRα 120及びRSV.5(gpt)-DRβ 008)をクローニングしラウス肉腫ウイルス(RSV)ロングターミナルリピート(LTR)配列(Long et al.,1991)によってドライブされたRSV.5(neo)プラスミドに組込んだ後で、C0S1細胞にトランスフェクトした。Ii突然変異体を作成するためにIi遺伝子(451-p33-143)(Sekaly et al.,1986)を使用した。突然変異体及び野生型のIi遺伝子をRSV.5(ヒグロマイシン)ベクターにクローニングした。遺伝子及びクローニングベクターはすべてNIHのEric Long博士から寄贈された。RSV.5(neo)DR1α 120をNde1で消化してプラスミドを直鎖化し、RSV.5(gpt)DR1β 008をNde1及びBg1IIで消化してDR1β遺伝子を放出させることによってHLA-DR1 α及びβ遺伝子を1つのプラスミド中に再構築した。直鎖化したRSV.5(neo)DR1α 120プラスミドを仔ウシ腸ホスファターゼによって処理し、精製したDR1β遺伝子フラグメントに結合させた。産物をT4 DNAポリメラーゼによって処理して不整合末端を埋め戻し、再結合させた。
Xu及びStavnezer(1992)のエレクトロポレーションによって遺伝子トランスフェクションを実施した。COS1細胞を24時間増殖させ、トリプシン-EDTA(GIBCO,BRL)によって放出させ、加温した無血清RPMI-1640培地によって2回洗浄し、無血清RPMI-1640培地に6×106細胞/mlで再浮遊させた。PG200 Progenitor IIエレクトロポレーター(Hoefer Scientific Instruments,San Francisco,CA)によって容量1mlあたり250V/1200μFでトランスフェクションを行った。6×106細胞あたり24μgの量で各プラスミドを使用した。トランスフェクション後、細胞を完全RPMI-1640培地中で3×106細胞/8ml/皿の濃度で再度培養した。エレクトロポレーションによってDNAがCOS1細胞に効率的に導入された。免疫蛍光染色によって定量するとトランスフェクションの45時間後に40〜65%のCOS1細胞が細胞表面にHLA-DR1分子を発現していた。
Reyes et al.(1991,J.Immunol,146:3877-3880)に従ってカテプシンB消化を実施した。150μl中に約5×105細胞からの細胞溶解物を、0.1Mのクエン酸ナトリウム(pH2.5)によってpH5.0に調整した。1mMのDTT及び1mMのEDTAの存在下のカテプシンBで溶解液を室温で1時間または別の指定時間処理した。酵素消化またはコントロール消化後、2mMのPMSF、10mMのNEM及び1mMのヨードアセトアミドを含有する10mMのTris(pH9.5)によってサンプルをpH7.4に調整し、MHCクラスIIα,β鎖にまだ結合しているIiフラグメントを分析するために、IVA12抗-MHCクラスIIα,β鎖により免疫沈降物を調製した。MHCクラスIIα,β鎖に結合し及びそれから放出したIiフラグメントを分析するために、30μl容量中で上記と同じ条件下で免疫沈降物を消化し、3×SDSサンプルバッファーを用い100℃に加熱して反応を終結させた(1×SDSサンプルバッファーは、62.5mMのTris-HCl,pH6.8、10%(w/v)のグリセロール、5%の2-メルカプトエタノール及び2.3%のSDSを含有していた)。サンプルを電気泳動ゲルに直接添加した。MHCクラスIIα,β及びIiのトリプルトランスフェクタントを抗MHCクラスII mAb IVA-12で免疫沈降させると、野生型及び突然変異体のすべてのIi鎖がクラスIIα,β鎖と結合し、ほぼ等しい量の三量体的複合体を形成した。しかしながら、これらの複合体をカテプシンBで消化すると、Ii開裂の異なるパターンが判明した(表III)。〔R151K154〕以外の全部の突然変異体においては野生型IiのカテプシンB消化によって生じるフラグメントのいくつかがレベル低下または欠損を示した。野生型Iiの消化によって観察されたIiの主要な野生型形態はp21、p14、p10及びp6であった。野生型Ii消化パターンと対照的に、突然変異体〔L174F175〕は微量のp21を有しており、突然変異体〔R78K80K83K86〕はp14、p10及びp6を産生しなかった。また、突然変異体〔R19R20〕及び〔K137K143〕は、野生型p21バンドの約1/10の弱いp21バンドを有していた(5ユニットのカテプシンBと突然変異体〔R19R20〕及び〔K137K143〕とのパターンと、0.5ユニットのカテプシンBと野生型Iiとのパターンとの比較)。
Reyes et al.(1991)の手順に従ってCD消化を行った。150μl中の約5×105細胞に由来の細胞溶解物を0.1Mのクエン酸ナトリウム(pH2.5)によってpH5.0に調整した。1mMのEDTAの存在下で溶解物をカテプシンD(Sigma)によって室温で1時間または別の指定時間処理した。酵素消化またはコントロール消化後、2mMのPMSF、10mMのNEM及び1mMのヨードアセトアミドを含有する10mMのTris(pH9.5)によってサンプルをpH7.4に調整し、MHCクラスIIα,β鎖にまだ結合したIiフラグメントを分析するために免疫沈降物を調製した。MHCクラスIIα,β鎖に結合し且つそれから放出したIiフラグメントを分析するために、30μl容量中で上記と同じ条件下で免疫沈降物を消化し、3×SDSサンプルバッファーを用いて100℃に加熱することによって反応を終結させた(1×SDSサンプルバッファーは、62.5mMのTris-HCl,pH6.8、10%(w/v)のグリセロール、5%の2-メルカプトエタノール及び2.3%のSDSを含有していた)。サンプルを電気泳動ゲルに直接添加した。
突然変異体〔R19R20〕、〔K137K143〕及び〔L174F175〕からのカテプシンB誘導p21がHLA-DR1α,β鎖から産生されたか、分解されたか、または解離されたかを試験するために、クラスIIα,β三量体をIVA-12 mAbでの免疫沈降によって単離し、次いでこれらをカテプシンBによって消化し、全部の産物をSDS-PAGEによって分析した。免疫沈降物を30μl容量中で実施例8と同じ条件下で消化し、3×SDSのサンプルバッファーを用い100℃に加熱することによって反応を終結させた(1×SDSサンプルバッファーは、62.5mMのTris-HCl,pH6.8、10%(w/v)のグリセロール、5%の2-メルカプトエタノール及び2.3%のSDSを含有していた)。サンプルを電気泳動ゲルに直接添加した。
T細胞に提示されたエピトープが両親媒性ヘリックスとしてコイルを形成し得ることがDeLisi及びBerzofskyによって証明されたので(DeLisi,C.et al.,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:7048-7052)、このようなモチーフのメカニズムに基づくこのようなエピトープの選択理論が試験されてきた(Margalit,H.et al.,1987,J.Immunol.,138:2213-2229; Rothbard,J.B.et al.,1988,EMBO J.,7:93-100; Stille,C.J.et al.,1987,Mol.Immunol.,24:1021-1027; Reyes,V.E.et al.,1988,Mol.Immunol.,25:867-871)。Ii(146-164)中のかかる「完全な」両親媒性ヘリックスは、このヘリックスが代理の抗原であり、MHCクラスIII分子のペプチド結合部位をブロックし得るという仮説を導いた(Elliott,W.L.et al.,1987,J.Immunol.,138:2949-2952; Stille,C.J.et al.,1987,Mol.Immunol.,24:1021-1027)。細い長手方向の疎水性ヘリックスストリップを有するという点でIi(146-164)に構造的に類似した合成ペプチドPH-1.0を設計した。また、長手方向ヘリックスストリップ内部のロイシンからトレオニンへの系統的な置換が脂質ミセルに対するペプチドの螺旋状コイル形成に与える効果を試験するために、PH-1.0の一連の類縁体を設計した(Lu,S.et al.,1991,J.Biol.Chem.,266:10054-10057)。
当業者は、本文中に具体的に記載した本発明の実施態様に対する多数の均等物を定型化した実験方法以外の手段を要せずに認識し確認することができよう。このような均等物は後記の請求の範囲に包含されることが意図されるものである。
Claims (7)
- 抗原提示細胞による抗原提示を増強するための方法であって、抗原提示細胞をIiの精製されたペプチドと接触させることを含む方法。
- Iiのペプチドを、もう一つのエンドプロテアーゼとは独立のカテプシンBならびにカテプシンBおよびDの混合物からなる群から選択されるエンドプロテアーゼによるIiの消化によって製造することができる、請求項1の方法。
- IiペプチドがYRMKLPKPPKPVSKMRである、請求項1の方法。
- 抗原提示細胞による抗原提示を阻害するための方法であって、抗原提示細胞をIiの精製されたペプチドと接触させることを含む方法であり、当該ペプチドが、もう一つのエンドプロテアーゼとは独立のカテプシンBならびにカテプシンBおよびDの混合物からなる群から選択されるエンドプロテアーゼによるIiの消化によって製造することができる方法。
- 抗原提示細胞による抗原提示を阻害するための方法であって、抗原提示細胞をENLRHLKNTMETLDWKV を含むIiのペプチドと接触させることを含む方法。
- 抗原提示細胞による抗原提示を増強するIiの精製されたペプチドであって、もう一つのエンドプロテアーゼとは独立のカテプシンBならびにカテプシンBおよびDの混合物からなる群から選択されるエンドプロテアーゼによるIiの消化によって製造することができるペプチド。
- 抗原提示細胞による抗原提示を阻害するIiの精製されたペプチドであって、もう一つのエンドプロテアーゼとは独立のカテプシンBならびにカテプシンBおよびDの混合物からなる群から選択されるエンドプロテアーゼによるIiの消化によって製造することができるペプチド。
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