JP2004097045A - 培養容器 - Google Patents
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Abstract
【課題】簡易な構成によって、各処理工程における塵埃や細菌等による汚染を低減する。
【解決手段】少なくとも1つの主培養容器2と、培地を封入した少なくとも1つの培地容器3と、前記主培養容器2内の流体を収容可能な少なくとも1つの廃棄培地容器4とを、相互間の流体の流動を制限可能な連結管5,6により、外部に対して密封状態に連結した培養容器1であって、前記主培養容器2の高さが、前記培地容器3および前記廃棄培地容器4より低く形成されている培養容器1を提供する。
【選択図】 図1
【解決手段】少なくとも1つの主培養容器2と、培地を封入した少なくとも1つの培地容器3と、前記主培養容器2内の流体を収容可能な少なくとも1つの廃棄培地容器4とを、相互間の流体の流動を制限可能な連結管5,6により、外部に対して密封状態に連結した培養容器1であって、前記主培養容器2の高さが、前記培地容器3および前記廃棄培地容器4より低く形成されている培養容器1を提供する。
【選択図】 図1
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
この発明は、細胞を培養する培養容器に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
細胞を培養するには、患者から抽出された骨髄液等の体液から培養すべき細胞を抽出する抽出工程、培養すべき細胞に適した培地を調製する培地調製工程、抽出された細胞を適当な培養容器内に培地とともに投入して所定の培養条件下に配する一次培養工程、一次培養された細胞を生体組織補填材と混合してさらに培養する二次培養工程等、複数の工程が順次行われる。
【0003】
従来、この種の細胞の培養は、全体を密封して内部の塵埃量を管理したクリーンベンチにおいて行うことが考えられている(例えば、特許文献1参照。)。
【0004】
【特許文献1】
特公平3−57744号公報(第2頁第3欄等)
【0005】
すなわち、クリーンベンチ内においては、例えば、天井側から床側に向かって流れる空気流が形成されており、各処理工程において塵埃等が生じた場合には、空気流によって塵埃等が床側に流され、床下に配置された集塵機によって回収されることになる。クリーンベンチ内にはロボットアームが配置されていて、各工程間において細胞を移動させることができるようになっている。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このように全ての処理工程を比較的大きなクリーンベンチ内で行う場合には、各工程が行われる空間が連続しているために、一の工程において発生する塵埃が、他の工程に配されている細胞に混入する可能性がある。したがって、複数の細胞を同時に培養する場合には、細胞間の混合が生じたり、添加する物質が汚染されたりしないように最新の注意が必要で、手間やコストがかかっていた。
【0007】
この発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、簡易な構成によって、各処理工程における塵埃や細菌等による汚染を低減することができる培養容器を提供することを目的としている。また、この発明は、使用する培地の量を最小限に抑えて、使用材料の節約、培地交換作業の迅速化を図ることをも目的としている。
【0008】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、この発明は、以下の手段を提供する。
請求項1に係る発明は、少なくとも1つの主培養容器と、培地を封入した少なくとも1つの培地容器と、前記主培養容器内の流体を収容可能な少なくとも1つの廃棄培地容器とを、相互間の流体の流動を制限可能な連結管により、外部に対して密封状態に連結した培養容器であって、前記主培養容器の高さが、前記培地容器および前記廃棄培地容器より低く形成されている培養容器を提供する。
【0009】
この発明によれば、主培養容器内に細胞を封入して、培地容器と主培養容器との間の連結管における流体の流動の制限を解除することにより、培地容器から主培養容器へ培地を流入させる。この状態で上記連結管における流体の流動を再度制限することにより、主培養容器内部が他の容器に対して密封される。これにより、外部に対して密封された主培養容器内において細胞を培養することが可能となる。
【0010】
また、所定時間が経過した後に主培養容器内の培地を交換する必要が生じた場合には、主培養容器と廃棄培地容器との間の連結管の流動制限を解除する。これにより、主培養容器から廃棄培地容器に向けて培地が流動させられ、主培養容器内において不要となった廃棄培地を廃棄培地容器に排出することが可能となる。
【0011】
この場合において、培地容器および廃棄培地容器の高さが主培養容器より高く形成されているので、培養容器全体の設置面積が制限されている場合に、細胞を培養するために比較的広い面積を必要とする主培養容器の底面を広く確保しながら、培地容器および廃棄培地容器の底面積を小さくして、全体の設置面積を低減することが可能となる。
【0012】
請求項2に係る発明は、請求項1に記載の培養容器において、前記主培養容器の内容積が、前記培地容器および前記廃棄培地容器より小さく形成されている培養容器を提供する。
この発明によれば、新たな培地を培地容器から主培養容器へ、多数回にわたり供給し、不要となった培地を主培養容器から廃棄培地容器へ、多数回にわたり排出することが可能となる。したがって、多数回に及ぶ培地交換が可能となる。
【0013】
請求項3に係る発明は、請求項1または請求項2に記載の培養容器において、前記主培養容器の底面が、前記培地容器および前記廃棄培地容器より広く形成されている培養容器を提供する。
この発明によれば、必要最小限の培地を用いて充分な広さの底面を有する主培養容器を達成することが可能となる。
【0014】
【発明の実施の形態】
この発明の実施の形態を説明する前に、生体組織補填体としての骨補填体の製造工程について概略的に説明する。骨補填体を製造するには、図7に示されるように、まず、患者の腸骨等から骨髄液を採取する。採取された骨髄液は遠心分離機にかけられて、旋回されることにより、比重の重い骨髄細胞を抽出される。
【0015】
抽出された骨髄細胞は、予め調製されている培地とともに培養容器内に投入され混合される。培地の一部は取り出されて感染検査に回される。
この後に、混合された骨髄液および培地を所定の温度(例えば、37±0.5℃)、湿度(例えば、100%)およびCO2濃度(例えば5%)等の培養条件に維持することにより所定時間にわたって一定培養条件下で細胞が一次培養される。細胞の培養途中の所定の交換時期には、培養容器内から培地が廃棄される。そして、再度培地を混合されて培養工程が繰り返し継続される。廃棄された培地の一部は感染検査に回される。
【0016】
所定の培養期間が終了すると、培養容器内から培地が廃棄された後に、培養容器内にトリプシンのような蛋白質分解酵素が投入・混合される。これにより、培養容器の底面に付着して成長していた間葉系幹細胞が、主培養容器の底面から剥離される。そして、このように剥離された間葉系幹細胞は、遠心分離機にかけられることにより抽出される。
【0017】
抽出された間葉系幹細胞は、細胞数調整が行われた後に、骨補填材と適当な培地が投入された培養容器内に混合される。実際には、間葉系幹細胞を骨補填材に付着させ、培地内に投入する。そして、上記と同様にして、混合された間葉系幹細胞と培地を所定の温度(例えば、37±0.5℃)、湿度(例えば、100%)およびCO2濃度(例えば5%)等の培養条件に維持することにより、所定時間にわたって一定培養条件下で細胞が二次培養される。
【0018】
二次培養工程においても、一次培養工程と同様にして、定期的に培地の交換が行われ、投入される培地の一部および廃棄される培地の一部がそれぞれ、感染検査に回される。そして、所定の培養期間が経過したところで、出荷用の品質検査と感染検査のための検体抽出が行われ、製造された骨補填体は密封されて製品として提供される。
【0019】
次に、この発明の第1の実施形態に係る培養容器について、図面を参照して、以下に説明する。
本実施形態に係る培養容器1は、上述した培養工程の内、特に、一次培養工程に利用される。
【0020】
本実施形態に係る培養容器1は、図1および図2に示されるように、1つの主培養容器2と、1つの培地容器3と、1つの廃棄培地容器4と、主培養容器2と培地容器3とを連結する第1の連結管5と、主培養容器2と廃棄培地容器4とを連結する第2の連結管6とから構成されている。連結管5,6には、それぞれ図示しない制御装置によって開閉されるバルブ7,8が設けられている。
【0021】
前記主培養容器2は、図2に示されるように、比較的高さの低い薄型の箱状に形成されている。主培養容器2は、内部に平坦な底面2aを備えるとともに、該底面2aに付着して成長する間葉系幹細胞の培養に必要な最小限の培地の深さ(例えば、0.1〜10mm、好ましくは0.3〜5mm、さらに好ましくは0.5〜2mm)を達成できる程度の高さ寸法に形成されている。
一方、培地容器3および廃棄培地容器4は、前記主培養容器2の数分の1程度の底面積を有し、主培養容器2の数倍の高さ寸法を有する箱状に形成されている。培地容器3および廃棄培地容器4の内容積は、主培養容器2の内容積の2倍以上となるように設定されている。
【0022】
培地容器3および廃棄培地容器4は、例えば、伸縮可能の柔軟な材質、例えば塩化ビニルによって構成されている。したがって、培地容器3は、外部から押圧力を加えられることによって、その内容積が収縮させられ、内部の流体を外部に放出することができるようになっている。一方、廃棄培地容器4は、外部から吸引力を加えられることによって、その内容積が膨張させられ、外部の流体を内部に吸引することができるようになっている。
【0023】
また、前記主培養容器2内および培地容器3内には、例えば、MEM(MinimalEssential Medium:最小必須培地)、FBS(Fetal Bovine Serum:ウシ胎児血清)、抗生剤等を所定の配合比率、例えば、84:15:1で調整した培地が封入されている。FBSに代えて、ヒト血清を採用してもよい。抗生剤としては、ペニシリン系抗生物質の他、セフェム系、マクロライド系、テトラサイクリン系、ホスホマイシン系、アミノグリコシド系、ニューキノロン系等任意の抗生物質を採用することができる。
前記廃棄培地容器5には、何も封入されておらず、完全な収縮状態とされている。
【0024】
前記主培養容器2は、例えば、注射針を貫通可能で、かつ、注射針を引き抜いた後には弾性により閉塞される注入部9を備えている。これにより、体液、例えば、骨髄液を採取した注射器の注射針を注入部9に刺すことで、主培養容器2内に骨髄液を投入し、注射針を注入部9から引き抜くことで、主培養容器2内を外部に対して遮断することができるようになっている。
【0025】
このように構成された本実施形態に係る培養装置1の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係る培養装置1を用いて細胞を培養するには、まず、上述したように、骨髄液を採取した注射器の注射針を注入部9に貫通させて主培養容器2内に骨髄液を注入する。
【0026】
そして、主培養容器2の底面2aが略水平になるように平坦な場所に配置した状態で、所定の培養条件、例えば、温度(例えば、37±0.5℃)、湿度(例えば、100%)およびCO2濃度(例えば5%)等の条件下に配することにより、培養を行う。そして、CO2濃度条件は、培地にCO2を溶解させたり、主培養容器2の一部または全部をCO2透過フィルタにより構成したりすることで達成可能である。
【0027】
主培養容器2は、高さの低い薄型の箱状に形成されているので、内部に貯留される培地は細胞の培養のために必要最小限の深さを達成する程度であり、広い底面積の全体に行き渡るように貯留しても、その総量は少なくて済む。したがって、少ない培地内に骨髄液を注入して、培養条件を整えることにより、主培養容器2の底面2aには、骨髄細胞中の間葉系幹細胞が付着して成長する。
【0028】
その後、所定の培地交換時期に達した時点で、図3に示されるように、主培養容器2と廃棄培地容器4とを連結している連結管6のバルブ8を開放し、廃棄培地容器4の周囲を低圧状態にする。これにより、廃棄培地容器4の内容積が膨張させられ、主培養容器2内の培地が廃棄培地容器4内へ吸引される。主培養容器2内の間葉系幹細胞は、底面2aに付着した状態で残る。主培養容器4内の培地が吸引され終えたら、連結管6のバルブ8を閉じるとともに、連結管5のバルブ7を開放する。
【0029】
そして、培地容器3に外部から押圧力を加えることによって、図4に示すように、培地容器3を収縮させ、内部の新たな培地を連結管5を介して主培養容器2へ供給する。
このようにして、主培養容器2内の培地が新たな培地と入れ替えられることになる。
【0030】
培地容器3の内容積は主培養容器2の内容積の2倍以上の大きさに構成されているので、培地容器3内に貯留されている培地は、複数回に小分けして主培養容器2に供給することができる。また、廃棄培地容器4の内容積は主培養容器2の内容積の2倍以上の大きさに構成されているので、主培養容器2から排出される培地を複数回にわたって受け入れることができる。
【0031】
そして、このような培地交換工程を複数回繰り返しつつ培養を継続することにより、主培養容器2の底面2aに間葉系幹細胞が充分に成長する。成長した間葉系幹細胞を収容した主培養容器2は、培養容器1ごと、あるいは、該主培養容器2に連結している全ての連結管5,6を熱により無菌的に密封して切断することにより搬送されることになる。
【0032】
このように、本実施形態に係る培養容器1によれば、培養に必要な培地等を予め封入しておき、一次培養工程の培養期間中を通じて、外部に対して培養容器1の内部を密封状態に遮断することができる。これにより、外部からの塵埃等の混入を防止することができる。また、培地の飛沫が飛散しやすい培地交換作業も、培地容器3および廃棄培地容器4を収縮、膨張させるだけで、内部に封入した状態のまま行うことができる。したがって、外部の他の細胞に対しても混入等の影響を与えることがない。
【0033】
なお、本実施形態における培養容器1は、所定の時期に複数回にわたり培地の交換を行いながら間葉系幹細胞を成長させる一次培養工程に適用可能なものとして説明したが、主培養容器2に、例えば、βリン酸三カルシウム多孔体等の骨補填材を封入しておき、一次培養工程において培養された間葉系幹細胞を投入できるようにしておくことにより、二次培養工程に適用可能に構成してもよい。
【0034】
また、主培養容器2に採血管(図示略)を接続しておき、該採血管によって患者から採取した骨髄液を直接、主培養容器2内に投入することにしてもよい。
連結管5,6に設けたバルブ7,8に代えて、外部から連結管5,6を挟むことにより開閉するピンチバルブ(図示略)を採用することにしてもよい。
また、膨張、収縮可能な培地容器3および/または廃棄培地容器4を、図5に示されるように、蛇腹により構成してもよい。このようにすることで、培地容器3および/または廃棄培地容器4をスムーズに収縮・膨張させることが可能となり、効率的な培地交換が可能となる。
【0035】
また、図6に示されるように、主培養容器2に、バルブ10により開閉可能な他の連結管11を介して、トリプシンのような蛋白質分解酵素を封入した酵素容器12を接続しておくことにしてもよい。これにより、細胞の培養が終了した時点で、酵素容器12からトリプシンを主培養容器2へ供給し、主培養容器2の底面2aに付着している間葉系幹細胞を剥離させ、回収することが可能となる。なお、主培養容器2内において剥離された間葉系幹細胞を主培養容器2内から取り出すための細胞回収管(図示略)を主培養容器2に設けておいてもよい。
【0036】
また、図6の符号13に示されるように、各容器に無菌的チューブ接続用のチューブを設けることにしてもよい。このチューブは、一端を閉塞された塩化ビニル等の材料からなっている。無菌的チューブ接続は、接続しようとする2本のチューブを加熱したカッターにより切断しながらその位置をずらして一致させ、カッターを除去することにより融着させる接続方法である。この方法によれば、例えば、培地容器3、廃棄培地容器4、酵素容器12に他の培地容器、廃棄培地容器、酵素容器(図示略)をそれぞれ接続して、培地、酵素を補給し、あるいは廃棄培地を外部に排出して、さらに培養工程を継続することが可能となる。なお、主培養容器2に無菌的接続用チューブ(図示略)を接続しておくことにより、培養を終了した間葉系幹細胞を外部に無菌的に取り出すことも可能となる。
【0037】
また、培地容器3、酵素容器12のように、主培養容器2へ供給する物質を封入した容器は主培養容器2よりも高い位置に配し、廃棄培地容器4のように主培養容器2から排出される物質を収容する容器は主培養容器2よりも低い位置に配置することにしてもよい。このようにすることで、連結管5,6,11に設けられているバルブ7,8,10の開閉により、重力によって簡易に培地を交換し、あるいは、トリプシンを供給して、細胞を回収することが可能となる。
【0038】
なお、本実施形態においては、酵素容器12を設け、トリプシンにより間葉系幹細胞を剥離することとしたが、これに代えて、主培養容器2の内壁に、所定の温度を境界として疎水性と親水性とが切り替わる温度応答性処理を施すことにしてもよい。
温度応答性処理は、温度応答性高分子ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)を共有結合で固定することにより行われる。温度応答性処理された領域は、32℃を境界温度として、それ以上では、市販の細胞用培養容器と同程度の弱い疎水性を呈するが、温度を境界温度以下に冷却することにより高い親水性を呈するようになる領域となる。したがって、例えば、37℃で培養した後に32℃以下に冷却することにより、主培養容器2内面を高い親水性を呈するように変化させ、非侵襲的に間葉系幹細胞を剥離させることが可能となる。
【0039】
また、上記各実施形態においては、培養する細胞として間葉系幹細胞を例に挙げて説明したが、これに代えて、ES細胞、体性幹細胞、骨細胞、軟骨細胞、神経細胞等の他の体細胞を培養する場合に適用してもよい。
また、主培養容器2に供給する体液としては、骨髄液の他、末梢血、臍帯血でもよい。また、採取した骨髄液を遠心分離して得られた骨髄細胞のみを主培養容器2内に供給することにしてもよい。
また、生体組織補填材として、βリン酸三カルシウムからなる骨補填材の他、他のセラミックスやコラーゲン、ポリ乳酸等任意の生体適合材料を主培養容器2内に封入しておくことにしてもよい。
【0040】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明に係る培養装置によれば、外部に対して密封された主培養容器内において細胞を培養することができるので、外部からの塵埃の混入や、外部への培地や細胞の飛散を防止することができるという効果がある。また、細胞を培養するために比較的広い面積を必要とする主培養容器の底面を広く確保しながら、培地容器および廃棄培地容器の底面積を小さくして、全体の設置面積を低減することができる。
この場合に、培地容器および廃棄培地容器の底面積を小さくしても内容積を大きく確保することができるので、複数回に及ぶ培地交換を可能として、細胞を充分に培養することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】この発明の一実施形態に係る培養容器を示す平面図である。
【図2】図1の培養容器を示す側面図である。
【図3】図1の培養容器を用いた培養工程のうち、培地の排出工程をしめす側面図である。
【図4】図1の培養容器を用いた培養工程のうち、新たな培地の供給工程を示す側面図である。
【図5】この発明の培養容器の第1の変形例を示す平面図である。
【図6】この発明の培養容器の第2の変形例を示す側面図である。
【図7】この発明に係る培養容器が用いられる培養工程を説明する説明図である。
【符号の説明】
1 培養容器
2 主培養容器
3 培地容器
4 廃棄培地容器
【発明の属する技術分野】
この発明は、細胞を培養する培養容器に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
細胞を培養するには、患者から抽出された骨髄液等の体液から培養すべき細胞を抽出する抽出工程、培養すべき細胞に適した培地を調製する培地調製工程、抽出された細胞を適当な培養容器内に培地とともに投入して所定の培養条件下に配する一次培養工程、一次培養された細胞を生体組織補填材と混合してさらに培養する二次培養工程等、複数の工程が順次行われる。
【0003】
従来、この種の細胞の培養は、全体を密封して内部の塵埃量を管理したクリーンベンチにおいて行うことが考えられている(例えば、特許文献1参照。)。
【0004】
【特許文献1】
特公平3−57744号公報(第2頁第3欄等)
【0005】
すなわち、クリーンベンチ内においては、例えば、天井側から床側に向かって流れる空気流が形成されており、各処理工程において塵埃等が生じた場合には、空気流によって塵埃等が床側に流され、床下に配置された集塵機によって回収されることになる。クリーンベンチ内にはロボットアームが配置されていて、各工程間において細胞を移動させることができるようになっている。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このように全ての処理工程を比較的大きなクリーンベンチ内で行う場合には、各工程が行われる空間が連続しているために、一の工程において発生する塵埃が、他の工程に配されている細胞に混入する可能性がある。したがって、複数の細胞を同時に培養する場合には、細胞間の混合が生じたり、添加する物質が汚染されたりしないように最新の注意が必要で、手間やコストがかかっていた。
【0007】
この発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、簡易な構成によって、各処理工程における塵埃や細菌等による汚染を低減することができる培養容器を提供することを目的としている。また、この発明は、使用する培地の量を最小限に抑えて、使用材料の節約、培地交換作業の迅速化を図ることをも目的としている。
【0008】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、この発明は、以下の手段を提供する。
請求項1に係る発明は、少なくとも1つの主培養容器と、培地を封入した少なくとも1つの培地容器と、前記主培養容器内の流体を収容可能な少なくとも1つの廃棄培地容器とを、相互間の流体の流動を制限可能な連結管により、外部に対して密封状態に連結した培養容器であって、前記主培養容器の高さが、前記培地容器および前記廃棄培地容器より低く形成されている培養容器を提供する。
【0009】
この発明によれば、主培養容器内に細胞を封入して、培地容器と主培養容器との間の連結管における流体の流動の制限を解除することにより、培地容器から主培養容器へ培地を流入させる。この状態で上記連結管における流体の流動を再度制限することにより、主培養容器内部が他の容器に対して密封される。これにより、外部に対して密封された主培養容器内において細胞を培養することが可能となる。
【0010】
また、所定時間が経過した後に主培養容器内の培地を交換する必要が生じた場合には、主培養容器と廃棄培地容器との間の連結管の流動制限を解除する。これにより、主培養容器から廃棄培地容器に向けて培地が流動させられ、主培養容器内において不要となった廃棄培地を廃棄培地容器に排出することが可能となる。
【0011】
この場合において、培地容器および廃棄培地容器の高さが主培養容器より高く形成されているので、培養容器全体の設置面積が制限されている場合に、細胞を培養するために比較的広い面積を必要とする主培養容器の底面を広く確保しながら、培地容器および廃棄培地容器の底面積を小さくして、全体の設置面積を低減することが可能となる。
【0012】
請求項2に係る発明は、請求項1に記載の培養容器において、前記主培養容器の内容積が、前記培地容器および前記廃棄培地容器より小さく形成されている培養容器を提供する。
この発明によれば、新たな培地を培地容器から主培養容器へ、多数回にわたり供給し、不要となった培地を主培養容器から廃棄培地容器へ、多数回にわたり排出することが可能となる。したがって、多数回に及ぶ培地交換が可能となる。
【0013】
請求項3に係る発明は、請求項1または請求項2に記載の培養容器において、前記主培養容器の底面が、前記培地容器および前記廃棄培地容器より広く形成されている培養容器を提供する。
この発明によれば、必要最小限の培地を用いて充分な広さの底面を有する主培養容器を達成することが可能となる。
【0014】
【発明の実施の形態】
この発明の実施の形態を説明する前に、生体組織補填体としての骨補填体の製造工程について概略的に説明する。骨補填体を製造するには、図7に示されるように、まず、患者の腸骨等から骨髄液を採取する。採取された骨髄液は遠心分離機にかけられて、旋回されることにより、比重の重い骨髄細胞を抽出される。
【0015】
抽出された骨髄細胞は、予め調製されている培地とともに培養容器内に投入され混合される。培地の一部は取り出されて感染検査に回される。
この後に、混合された骨髄液および培地を所定の温度(例えば、37±0.5℃)、湿度(例えば、100%)およびCO2濃度(例えば5%)等の培養条件に維持することにより所定時間にわたって一定培養条件下で細胞が一次培養される。細胞の培養途中の所定の交換時期には、培養容器内から培地が廃棄される。そして、再度培地を混合されて培養工程が繰り返し継続される。廃棄された培地の一部は感染検査に回される。
【0016】
所定の培養期間が終了すると、培養容器内から培地が廃棄された後に、培養容器内にトリプシンのような蛋白質分解酵素が投入・混合される。これにより、培養容器の底面に付着して成長していた間葉系幹細胞が、主培養容器の底面から剥離される。そして、このように剥離された間葉系幹細胞は、遠心分離機にかけられることにより抽出される。
【0017】
抽出された間葉系幹細胞は、細胞数調整が行われた後に、骨補填材と適当な培地が投入された培養容器内に混合される。実際には、間葉系幹細胞を骨補填材に付着させ、培地内に投入する。そして、上記と同様にして、混合された間葉系幹細胞と培地を所定の温度(例えば、37±0.5℃)、湿度(例えば、100%)およびCO2濃度(例えば5%)等の培養条件に維持することにより、所定時間にわたって一定培養条件下で細胞が二次培養される。
【0018】
二次培養工程においても、一次培養工程と同様にして、定期的に培地の交換が行われ、投入される培地の一部および廃棄される培地の一部がそれぞれ、感染検査に回される。そして、所定の培養期間が経過したところで、出荷用の品質検査と感染検査のための検体抽出が行われ、製造された骨補填体は密封されて製品として提供される。
【0019】
次に、この発明の第1の実施形態に係る培養容器について、図面を参照して、以下に説明する。
本実施形態に係る培養容器1は、上述した培養工程の内、特に、一次培養工程に利用される。
【0020】
本実施形態に係る培養容器1は、図1および図2に示されるように、1つの主培養容器2と、1つの培地容器3と、1つの廃棄培地容器4と、主培養容器2と培地容器3とを連結する第1の連結管5と、主培養容器2と廃棄培地容器4とを連結する第2の連結管6とから構成されている。連結管5,6には、それぞれ図示しない制御装置によって開閉されるバルブ7,8が設けられている。
【0021】
前記主培養容器2は、図2に示されるように、比較的高さの低い薄型の箱状に形成されている。主培養容器2は、内部に平坦な底面2aを備えるとともに、該底面2aに付着して成長する間葉系幹細胞の培養に必要な最小限の培地の深さ(例えば、0.1〜10mm、好ましくは0.3〜5mm、さらに好ましくは0.5〜2mm)を達成できる程度の高さ寸法に形成されている。
一方、培地容器3および廃棄培地容器4は、前記主培養容器2の数分の1程度の底面積を有し、主培養容器2の数倍の高さ寸法を有する箱状に形成されている。培地容器3および廃棄培地容器4の内容積は、主培養容器2の内容積の2倍以上となるように設定されている。
【0022】
培地容器3および廃棄培地容器4は、例えば、伸縮可能の柔軟な材質、例えば塩化ビニルによって構成されている。したがって、培地容器3は、外部から押圧力を加えられることによって、その内容積が収縮させられ、内部の流体を外部に放出することができるようになっている。一方、廃棄培地容器4は、外部から吸引力を加えられることによって、その内容積が膨張させられ、外部の流体を内部に吸引することができるようになっている。
【0023】
また、前記主培養容器2内および培地容器3内には、例えば、MEM(MinimalEssential Medium:最小必須培地)、FBS(Fetal Bovine Serum:ウシ胎児血清)、抗生剤等を所定の配合比率、例えば、84:15:1で調整した培地が封入されている。FBSに代えて、ヒト血清を採用してもよい。抗生剤としては、ペニシリン系抗生物質の他、セフェム系、マクロライド系、テトラサイクリン系、ホスホマイシン系、アミノグリコシド系、ニューキノロン系等任意の抗生物質を採用することができる。
前記廃棄培地容器5には、何も封入されておらず、完全な収縮状態とされている。
【0024】
前記主培養容器2は、例えば、注射針を貫通可能で、かつ、注射針を引き抜いた後には弾性により閉塞される注入部9を備えている。これにより、体液、例えば、骨髄液を採取した注射器の注射針を注入部9に刺すことで、主培養容器2内に骨髄液を投入し、注射針を注入部9から引き抜くことで、主培養容器2内を外部に対して遮断することができるようになっている。
【0025】
このように構成された本実施形態に係る培養装置1の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係る培養装置1を用いて細胞を培養するには、まず、上述したように、骨髄液を採取した注射器の注射針を注入部9に貫通させて主培養容器2内に骨髄液を注入する。
【0026】
そして、主培養容器2の底面2aが略水平になるように平坦な場所に配置した状態で、所定の培養条件、例えば、温度(例えば、37±0.5℃)、湿度(例えば、100%)およびCO2濃度(例えば5%)等の条件下に配することにより、培養を行う。そして、CO2濃度条件は、培地にCO2を溶解させたり、主培養容器2の一部または全部をCO2透過フィルタにより構成したりすることで達成可能である。
【0027】
主培養容器2は、高さの低い薄型の箱状に形成されているので、内部に貯留される培地は細胞の培養のために必要最小限の深さを達成する程度であり、広い底面積の全体に行き渡るように貯留しても、その総量は少なくて済む。したがって、少ない培地内に骨髄液を注入して、培養条件を整えることにより、主培養容器2の底面2aには、骨髄細胞中の間葉系幹細胞が付着して成長する。
【0028】
その後、所定の培地交換時期に達した時点で、図3に示されるように、主培養容器2と廃棄培地容器4とを連結している連結管6のバルブ8を開放し、廃棄培地容器4の周囲を低圧状態にする。これにより、廃棄培地容器4の内容積が膨張させられ、主培養容器2内の培地が廃棄培地容器4内へ吸引される。主培養容器2内の間葉系幹細胞は、底面2aに付着した状態で残る。主培養容器4内の培地が吸引され終えたら、連結管6のバルブ8を閉じるとともに、連結管5のバルブ7を開放する。
【0029】
そして、培地容器3に外部から押圧力を加えることによって、図4に示すように、培地容器3を収縮させ、内部の新たな培地を連結管5を介して主培養容器2へ供給する。
このようにして、主培養容器2内の培地が新たな培地と入れ替えられることになる。
【0030】
培地容器3の内容積は主培養容器2の内容積の2倍以上の大きさに構成されているので、培地容器3内に貯留されている培地は、複数回に小分けして主培養容器2に供給することができる。また、廃棄培地容器4の内容積は主培養容器2の内容積の2倍以上の大きさに構成されているので、主培養容器2から排出される培地を複数回にわたって受け入れることができる。
【0031】
そして、このような培地交換工程を複数回繰り返しつつ培養を継続することにより、主培養容器2の底面2aに間葉系幹細胞が充分に成長する。成長した間葉系幹細胞を収容した主培養容器2は、培養容器1ごと、あるいは、該主培養容器2に連結している全ての連結管5,6を熱により無菌的に密封して切断することにより搬送されることになる。
【0032】
このように、本実施形態に係る培養容器1によれば、培養に必要な培地等を予め封入しておき、一次培養工程の培養期間中を通じて、外部に対して培養容器1の内部を密封状態に遮断することができる。これにより、外部からの塵埃等の混入を防止することができる。また、培地の飛沫が飛散しやすい培地交換作業も、培地容器3および廃棄培地容器4を収縮、膨張させるだけで、内部に封入した状態のまま行うことができる。したがって、外部の他の細胞に対しても混入等の影響を与えることがない。
【0033】
なお、本実施形態における培養容器1は、所定の時期に複数回にわたり培地の交換を行いながら間葉系幹細胞を成長させる一次培養工程に適用可能なものとして説明したが、主培養容器2に、例えば、βリン酸三カルシウム多孔体等の骨補填材を封入しておき、一次培養工程において培養された間葉系幹細胞を投入できるようにしておくことにより、二次培養工程に適用可能に構成してもよい。
【0034】
また、主培養容器2に採血管(図示略)を接続しておき、該採血管によって患者から採取した骨髄液を直接、主培養容器2内に投入することにしてもよい。
連結管5,6に設けたバルブ7,8に代えて、外部から連結管5,6を挟むことにより開閉するピンチバルブ(図示略)を採用することにしてもよい。
また、膨張、収縮可能な培地容器3および/または廃棄培地容器4を、図5に示されるように、蛇腹により構成してもよい。このようにすることで、培地容器3および/または廃棄培地容器4をスムーズに収縮・膨張させることが可能となり、効率的な培地交換が可能となる。
【0035】
また、図6に示されるように、主培養容器2に、バルブ10により開閉可能な他の連結管11を介して、トリプシンのような蛋白質分解酵素を封入した酵素容器12を接続しておくことにしてもよい。これにより、細胞の培養が終了した時点で、酵素容器12からトリプシンを主培養容器2へ供給し、主培養容器2の底面2aに付着している間葉系幹細胞を剥離させ、回収することが可能となる。なお、主培養容器2内において剥離された間葉系幹細胞を主培養容器2内から取り出すための細胞回収管(図示略)を主培養容器2に設けておいてもよい。
【0036】
また、図6の符号13に示されるように、各容器に無菌的チューブ接続用のチューブを設けることにしてもよい。このチューブは、一端を閉塞された塩化ビニル等の材料からなっている。無菌的チューブ接続は、接続しようとする2本のチューブを加熱したカッターにより切断しながらその位置をずらして一致させ、カッターを除去することにより融着させる接続方法である。この方法によれば、例えば、培地容器3、廃棄培地容器4、酵素容器12に他の培地容器、廃棄培地容器、酵素容器(図示略)をそれぞれ接続して、培地、酵素を補給し、あるいは廃棄培地を外部に排出して、さらに培養工程を継続することが可能となる。なお、主培養容器2に無菌的接続用チューブ(図示略)を接続しておくことにより、培養を終了した間葉系幹細胞を外部に無菌的に取り出すことも可能となる。
【0037】
また、培地容器3、酵素容器12のように、主培養容器2へ供給する物質を封入した容器は主培養容器2よりも高い位置に配し、廃棄培地容器4のように主培養容器2から排出される物質を収容する容器は主培養容器2よりも低い位置に配置することにしてもよい。このようにすることで、連結管5,6,11に設けられているバルブ7,8,10の開閉により、重力によって簡易に培地を交換し、あるいは、トリプシンを供給して、細胞を回収することが可能となる。
【0038】
なお、本実施形態においては、酵素容器12を設け、トリプシンにより間葉系幹細胞を剥離することとしたが、これに代えて、主培養容器2の内壁に、所定の温度を境界として疎水性と親水性とが切り替わる温度応答性処理を施すことにしてもよい。
温度応答性処理は、温度応答性高分子ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)を共有結合で固定することにより行われる。温度応答性処理された領域は、32℃を境界温度として、それ以上では、市販の細胞用培養容器と同程度の弱い疎水性を呈するが、温度を境界温度以下に冷却することにより高い親水性を呈するようになる領域となる。したがって、例えば、37℃で培養した後に32℃以下に冷却することにより、主培養容器2内面を高い親水性を呈するように変化させ、非侵襲的に間葉系幹細胞を剥離させることが可能となる。
【0039】
また、上記各実施形態においては、培養する細胞として間葉系幹細胞を例に挙げて説明したが、これに代えて、ES細胞、体性幹細胞、骨細胞、軟骨細胞、神経細胞等の他の体細胞を培養する場合に適用してもよい。
また、主培養容器2に供給する体液としては、骨髄液の他、末梢血、臍帯血でもよい。また、採取した骨髄液を遠心分離して得られた骨髄細胞のみを主培養容器2内に供給することにしてもよい。
また、生体組織補填材として、βリン酸三カルシウムからなる骨補填材の他、他のセラミックスやコラーゲン、ポリ乳酸等任意の生体適合材料を主培養容器2内に封入しておくことにしてもよい。
【0040】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明に係る培養装置によれば、外部に対して密封された主培養容器内において細胞を培養することができるので、外部からの塵埃の混入や、外部への培地や細胞の飛散を防止することができるという効果がある。また、細胞を培養するために比較的広い面積を必要とする主培養容器の底面を広く確保しながら、培地容器および廃棄培地容器の底面積を小さくして、全体の設置面積を低減することができる。
この場合に、培地容器および廃棄培地容器の底面積を小さくしても内容積を大きく確保することができるので、複数回に及ぶ培地交換を可能として、細胞を充分に培養することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】この発明の一実施形態に係る培養容器を示す平面図である。
【図2】図1の培養容器を示す側面図である。
【図3】図1の培養容器を用いた培養工程のうち、培地の排出工程をしめす側面図である。
【図4】図1の培養容器を用いた培養工程のうち、新たな培地の供給工程を示す側面図である。
【図5】この発明の培養容器の第1の変形例を示す平面図である。
【図6】この発明の培養容器の第2の変形例を示す側面図である。
【図7】この発明に係る培養容器が用いられる培養工程を説明する説明図である。
【符号の説明】
1 培養容器
2 主培養容器
3 培地容器
4 廃棄培地容器
Claims (3)
- 少なくとも1つの主培養容器と、培地を封入した少なくとも1つの培地容器と、前記主培養容器内の流体を収容可能な少なくとも1つの廃棄培地容器とを、相互間の流体の流動を制限可能な連結管により、外部に対して密封状態に連結した培養容器であって、
前記主培養容器の高さが、前記培地容器および前記廃棄培地容器より低く形成されている培養容器。 - 前記主培養容器の内容積が、前記培地容器および前記廃棄培地容器より小さく形成されている請求項1に記載の培養容器。
- 前記主培養容器の底面が、前記培地容器および前記廃棄培地容器より広く形成されている請求項1または請求項2に記載の培養容器。
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JP2008043236A (ja) * | 2006-08-11 | 2008-02-28 | Daiwa Can Co Ltd | 飲食物の微生物検査方法 |
JP2008048644A (ja) * | 2006-08-23 | 2008-03-06 | Nikon Corp | 培養器具及び培養装置 |
JPWO2015037468A1 (ja) * | 2013-09-12 | 2017-03-02 | ユニバーサル・バイオ・リサーチ株式会社 | 培養システム、及び培養方法 |
-
2002
- 2002-09-06 JP JP2002261127A patent/JP2004097045A/ja active Pending
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