JP2004083432A

JP2004083432A - エラスターゼ阻害剤

Info

Publication number: JP2004083432A
Application number: JP2002243646A
Authority: JP
Inventors: Tatsuya Ichitsubo; 市坪　達也; Yukie Akagi; 赤木　幸恵
Original assignee: Rohto Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Rohto Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2002-08-23
Filing date: 2002-08-23
Publication date: 2004-03-18

Abstract

【課題】新規なエラスターゼ阻害剤を提供する。
【解決手段】グルコサミン、グルコサミン誘導体またはそれらの塩に、エラスターゼ阻害作用を見出し、新規なエラスターゼ阻害剤として提供できる。本発明のエラスターゼ阻害剤は、皮膚の弾力性や柔軟性の低下を防ぎ、肌のハリを回復又は維持することができ若々しい肌を保つ効果を有する。
【選択図】　　なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グルコサミン、グルコサミン誘導体またはそれらの塩を含有するエラスターゼ阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
エラスチンは、皮膚、血管壁、腱、軟骨などの伸展性に富む結合組織内に存在する弾性繊維状構造蛋白質であり、ペプチド鎖間に独特の架橋構造をもち弾力性と柔軟性を与えている。エラスチンは、エラスターゼにより分解される。エラスターゼは、エラスチンを特異的な基質とするプロテアーゼの一種で、エラスチンの新陳代謝に重要な役割を果たす。通常の生体内ではエラスターゼとエラスターゼ活性調節因子とが協同しあうことによって、エラスターゼ活性が恒常的に保持されている。しかし、エラスターゼ活性が亢進するとエラスチンを過剰に分解してしまうため、組織老化、更には疾患を悪化させる原因となる。
【０００３】
これまでの研究により、ある種の疾患においてエラスターゼ活性の亢進が密接に関与していることがわかっている。そこで、亢進したエラスターゼ活性を抑制するエラスターゼ阻害剤の疾患治療剤としての有用性が、慢性関節リュウマチ、変形性関節症などの関節系疾患（日本薬理学会誌、９９、９３−１０７、１９９２）、全身性炎症反応症候群（医学のあゆみ４月別冊、１０４−１０７、１９９８）、動脈硬化等で報告されている。
【０００４】
皮膚の自然老化や光老化の機序にもエラスターゼ関与している。紫外線曝露された皮膚では多形核白血球を含む炎症性細胞の湿潤、エラスチン繊維の部分的凝集、過剰に亢進されたエラスターゼによりエラスチン繊維の凝集が生じる（Ｊ．　Ｓｏｃ．　Ｃｏｓｍｅｔ．Ｃｈｅｍ．Ｊａｐａｎ、３１（２）、ｐ１９０−２００、１９９７）等、老化とエラスターゼの関連が解明されつつある。そして、エラスターゼ阻害剤を用いた皮膚外用剤に、皮膚の弾力性や柔軟性を取り戻し、ハリを回復及び／又は維持し若々しい肌を保つ抗老化効果、抗シワ効果があることが報告されている。
【０００５】
例えば、特開２０００−３１９１８９号公報、特開平１０−１８２４１４号公報、特許２７６９０８３号公報、特許２７９８５７３号、特許２９６９４５１号、特開平０５−２１３９９１号公報、特開平０７−３１６０５６号公報、特開平１０−２６５３５９号公報、特開２０００−２４７８３０号公報などが知られている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、安全性が高い新規なエラスターゼ阻害剤を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、前記課題を解決するために鋭意検討の結果、グルコサミン、グルコサミン誘導体またはそれらの塩にエラスターゼ阻害作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、グルコサミン、グルコサミンの誘導体またはそれらの薬理学的に許容される塩の中から選ばれる少なくとも１種の化合物を含有するエラスターゼ阻害剤に関する。また、本発明は、グルコサミン、グルコサミン誘導体またはそれらの薬理学的に許容される塩の中から選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分として含有してなるエラスターゼ阻害剤に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明におけるグルコサミン、グルコサミン誘導体またはそれらの薬学的に許容される塩は、動物、植物、微生物菌体、培養液などから精製された天然品であることが好ましいが、公知の方法により化学合成により得た合成品を利用してもよく、市販品を利用してもよい。本発明において、グルコサミン誘導体としては、生体内に適用された後にグルコサミンに変化しうる化合物が好ましく、例えば、Ｎ−アセチルグルコサミンのような誘導体が例示できる。なお、グルコサミン誘導体は本発明の効果を奏するものである限り、特にこれらに限るものではない。
【０００９】
本発明のグルコサミン、またはグルコサミン誘導体の塩としては、薬理学的に（製薬上）又は生理学的に許容される塩が使用できる。薬理学的又は生理学的に許容できる塩としては、例えば、有機酸塩（例えば、乳酸塩、酢酸塩、酪酸、トリフルオロ酢酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、トシル酸塩、パルミチン酸、ステアリン酸など）、無機酸塩（例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩など）などが例示できる。好ましくは、塩酸グルコサミン、硫酸グルコサミンである。特に好ましくは塩酸グルコサミンである。
なお、これらのグルコサミン、その誘導体またはそれらの塩は、単独で又は二種以上組み合わせて使用してもよい。
【００１０】
本発明のエラスターゼ阻害剤において、グルコサミン、グルコサミン誘導体またはその塩の使用量は、グルコサミンの種類、剤型等によっても異なるが、例えばヒトを含む哺乳動物に適用するエラスターゼ阻害剤とする場合、１日使用量が０．０１〜３０００ｍｇ、好ましくは０．１〜２０００ｍｇ、特に好ましくは０．１〜２０００ｍｇを１回または２〜４回に分けて適用することができる。また、研究用試薬のようにヒトを含む哺乳動物に適用しないエラスターゼ阻害剤とする場合には、剤形等にあわせて適宜使用量を設定することができる。
【００１１】
本発明のエラスターゼ阻害剤中への、グルコサミン、グルコサミン誘導体またはその塩の含有量は、グルコサミンの種類、剤型等によっても異なるが、通常０．００１〜７０．０重量％、好ましくは０．０１〜５０重量％、より好ましくは０．０１〜２０重量％、特に好ましくは０．１〜１０重量％の範囲を挙げることができる。
【００１２】
本発明のエラスターゼ阻害剤は、本発明の効果を損なわない量的及び質的範囲内で、グルコサミン、グルコサミン誘導体またはその塩の他に通常使用される溶媒や基剤、各種添加剤（例えば界面活性剤、乳化剤、油分、安定化剤、増粘剤、防腐剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、分散剤、ｐＨ調整剤、保湿剤、紫外線吸収剤、ビタミン類、キレート剤、アミノ酸類、香料等）などを配合することによって、錠剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、硬カプセル剤等の固形製剤の他、シロップ剤、軟カプセル剤等の液剤、軟膏剤、乳剤等の半固形剤などの製剤形態、化粧料であれば、例えばファンデーション、口紅、化粧水、美容液、乳液、クリーム、ローション、オイル、ジェル、パックなどの各種所望の形態に調製することができる。これらは通常用いられる添加物や溶媒等を用いて常法によって製造可能である。
【００１３】
本発明のエラスターゼ阻害剤は、医薬品、医薬部外品、食品、化粧品等の各種分野において利用することができる。具体的には、ヒトをはじめとする哺乳動物においてエラスターゼ亢進に起因する疾患の治療剤、予防剤、またはエラスターゼ亢進に起因する生理状態のための研究試薬等として有用である。具体的には、慢性関節リュウマチ・変形性関節症などの関節疾患治療及び／又は予防剤、紫外線曝露や加齢によるシワやタルミの改善及び／又は予防のための抗老化又は抗シワ用皮膚外用剤、皮膚の弾力性や柔軟性を向上しハリを回復し維持する美肌用化粧料等が挙げられる。
【００１４】
【発明の効果】
グルコサミン、グルコサミン誘導体またはそれらの塩は、エラスターゼ活性の阻害作用を有する。そのため、皮膚老化現象である弾力性や柔軟性の低下を防止し、皮膚のハリを回復又は維持することができ肌の状態を若々しく保つことができる。また、シワやタルミの予防又は改善にも有用である。さらに、関節疾患等の各種疾患の治療などにも効果がある。
【００１５】
【実施例】
以下に本発明を実施例及び試験例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例等に限定されるものではない。なお、下記の各処方において％とは、特に言及しない限り、重量（Ｗ／Ｗ）％を意味するものとする。
【００１６】
実施例１〜４の調製
塩酸グルコサミンを滅菌精製水に濃度０．０４、０．１２、０．４および１．２（ｗ／ｖ）％となるように溶解し、得られた水溶液をそれぞれ実施例１〜４とした。
【００１７】
試験例１　ヒト白血球由来エラスターゼ活性阻害試験
実施例１〜４を用いて、ヒト白血球由来エラスターゼ活性阻害率を試験した。反応用緩衝液は、０．２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）を用いた。エラスターゼ基質溶液は、合成基質であるＮ−サクシニル−アラニル−アラニル−アラニル−ｐ−ニトロアニリド（ＢＡＣＨＥＭ　ＡＧ社製）をＤＭＳＯで５０ｍＭとなるように調製し、使用時に反応緩衝液で５ｍＭに希釈して調製した。エラスターゼ酵素液は、ヒト白血球由来エラスターゼ（Ｅｌａｓｔｉｎ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）をリン酸緩衝液で１０μｇ／ｍｌとなるように調製した。
９６ウエルマイクロプレートの１ウエルに対して、エラスターゼ基質溶液　５０μｌ（反応溶液中での最終濃度１．２５ｍＭ）、エラスターゼ酵素液　１００μｌ（反応溶液中での最終濃度５．０μｇ／ｍｌ）及び実施例１〜４を５０μｌを添加して３７℃で１時間反応させた。対照としては、エラスターゼ基質溶液　５０μｌ（反応溶液中での最終濃度１．２５ｍＭ）、エラスターゼ酵素液　１００μｌ（反応溶液中での最終濃度５．０μｇ／ｍｌ）及び精製水　１００μｌ（比較例１）を添加したものも、同様に３７℃で１時間反応させた。その後、実施例１〜４及び比較例１を添加した反応溶液の吸光度４０５ｎｍを測定した。
エラスターゼ阻害率は、分解生成物であるｐ−ニトロアニリドの吸光度４０５ｎｍをもちいて、以下のように求めた。即ち、実施例１〜４添加反応溶液の１時間後吸光度と比較例１添加反応溶液の１時間後吸光度の差を、比較例１添加反応溶液の１時間経過後吸光度で除してエラスターゼ阻害率（％）とした。結果は表１に示す。
【００１８】
【表１】

【００１９】
表１に示す結果より、塩酸グルコサミンを含有する実施例１〜４において、濃度依存的にヒト白血球由来エラスターゼ活性を阻害することが確認された。
【００２０】
試験例２　ヒト線維芽細胞由来エラスターゼ活性阻害試験
実施例３又は４を用いて、ヒト線維芽細胞由来のエラスターゼ活性阻害率を試験した。ヒト線維芽細胞（クラボウ）を牛胎児血清を１０％含有するダルベッコ最小培地（ＤＭＥＭ）中に播種して、３７℃・５％ＣＯ_２インキュベーター内で培養した。培養用シャーレ（１００ｍｍディッシュ、コーニング）で培養後コンフルエントになった細胞を集め、緩衝液リン酸バッファー６ｍｌに再懸濁し、超音波で破砕して粗酵素液を調製した。こうして得た粗酵素液１００μｌに、ＤＭＳＯで５０ｍＭとなるように調製し、使用時に反応緩衝液（０．２Ｍ　Ｔｒｉｓ−　ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０））で５ｍＭに希釈して調製したエラスターゼ合成基質Ｎ−サクシニル−アラニル−アラニル−アラニル−ｐ−ニトロアニリド（ＢＡＣＨＥＭ　ＡＧ社製）を５０μｌ添加し、さらに実施例３又は４を５０μｌ添加して、３７℃で１時間反応させた。対照として、粗酵素液１００μｌに、ＤＭＳＯで５０ｍＭとなるように調製し、使用時に反応緩衝液（０．２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０））で５ｍＭに希釈して調製したエラスターゼ合成基質Ｎ−サクシニル−アラニル−アラニル−アラニル−ｐ−ニトロアニリド（ＢＡＣＨＥＭ　ＡＧ社製）を５０μｌ及び精製水　５０μｌ（比較例１）を添加したものも、同様に３７℃で１時間反応させた。その後、実施例３又は４及び比較例１を添加した反応溶液の吸光度４０５ｎｍを測定した。
エラスターゼ阻害率は、分解生成物であるｐ−ニトロアニリドの吸光度４０５ｎｍをもちいて、以下のように求めた。即ち、実施例３又は４添加反応溶液の１時間後吸光度と比較例１添加反応溶液の１時間後吸光度の差を、比較例１添加反応溶液の１時間経過後吸光度で除してエラスターゼ阻害率（％）とした。結果は表２に示す。
【００２１】
【表２】

【００２２】
表２に示す結果より、塩酸グルコサミンを含有する実施例３及び４は、濃度依存的に繊維芽細胞由来のエラスターゼ活性を阻害することが確認された。皮膚繊維芽細胞由来のエラスターゼに対して塩酸グルコサミンが高い阻害活性を有していることから、エラスチンの分解を抑制し、皮膚の老化現象である弾力性や柔軟性の低下を防止して、皮膚のハリを回復又は維持できることが示唆された。
【００２３】
試験例３　紫外線照射ヒト線維芽細胞由来エラスターゼ活性阻害試験
実施例３又は４を用いて、紫外線（ＵＶＡ　および　ＵＶＢ）を照射したヒト線維芽細胞由来のエラスターゼ活性阻害率を試験した。ヒト線維芽細胞（クラボウ）を牛胎児血清を１０％含有するダルベッコ最小培地（ＤＭＥＭ）中に播種して、３７℃・５％ＣＯ_２インキュベーター内で培養した。培養用シャーレ（１００ｍｍディッシュ、コーニング）に細胞を播種しサブコンフルエント状態になった時に紫外線ＵＶＡ（４０Ｊ／ｃｍ^２）およびＵＶＢ（４０ｍＪ／ｃｍ^２）を照射した。照射後２４時間３７℃・５％ＣＯ_２インキュベーター内で培養した。２４時間後、細胞を集め、緩衝液リン酸バッファー６ｍｌに再懸濁し、超音波で破砕して粗酵素液を調製した。こうして得た粗酵素液１００μｌに、ＤＭＳＯで５０ｍＭとなるように調製し、使用時に反応緩衝液（０．２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０））で５ｍＭに希釈して調製したエラスターゼ合成基質Ｎ−サクシニル−アラニル−アラニル−アラニル−ｐ−ニトロアニリド（ＢＡＣＨＥＭ　ＡＧ社製）を５０μｌ添加し、さらに実施例３又は４を５０μｌ添加して、３７℃で１時間反応させた。対照として、粗酵素液１００μｌに、ＤＭＳＯで５０ｍＭとなるように調製し、使用時に反応緩衝液（０．２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０））で５ｍＭに希釈して調製したエラスターゼ合成基質Ｎ−サクシニル−アラニル−アラニル−アラニル−ｐ−ニトロアニリド（ＢＡＣＨＥＭ　ＡＧ社製）を５０μｌ及び精製水　５０μｌ（比較例１）を添加したものも、同様に３７℃で１時間反応させた。その後、実施例３又は４及び比較例１を添加した反応溶液の吸光度４０５ｎｍを測定した。
分解生成物であるｐ−ニトロアニリドの吸光度４０５ｎｍをもちいて、エラスターゼ阻害率は、以下のように求めた。即ち、実施例３又は４添加反応溶液の１時間後吸光度と比較例１添加反応溶液の１時間後吸光度の差を、比較例１添加反応溶液の１時間経過後吸光度で除してエラスターゼ阻害率（％）とした。結果は表３示す。
【００２４】
【表３】

【００２５】
表３に示す結果より、塩酸グルコサミンを含有する実施例３及び４は、濃度依存的に紫外線照射された繊維芽細胞由来のエラスターゼ活性をも阻害することが確認された。塩酸グルコサミンのエラスターゼ阻害作用が、光老化による皮膚の老化現象に対して優れた予防及び／又は改善効果を有することが示唆された。
【００２６】
試験例４　へアレスマウスを用いた抗しわ試験
試験例４−１
表４に示す実施例５〜７について、紫外線によるしわ発生に対する予防効果を塩酸グルコサミンの塗布試験により検討した。５週齡雄性へアレスマウスは８匹を１群とした４群に対し、３週間にわたり、第１週目に９０ｍＪ／ｃｍ^２、第２週目に１２０ｍＪ／ｃｍ^２、第３週目に１５０ｍＪ／ｃｍ^２のＵＶＢ紫外線を１週間あたり３回照射した。また紫外線を照射している３週間、各群のヘアレスマウスには、実施例５〜７又は比較例２の試験溶液を５０μｌずつ１日３回背中に塗布した。そして、第１回目の紫外線照射から２４日後に、目視にてしわを７段階にスコア化（表５）し、シワ発生の予防効果を評価した。結果は表４に示す。
試験例４−２
表４に示す実施例８〜１０について、紫外線によるしわ発生に対する予防効果を塩酸グルコサミンの経口投与により検討した。試験例４−１と同様に５週齡雄性へアレスマウスは８匹を１群とした４群に対し、３週間にわたりＵＶＢ紫外線を照射した。また、紫外線を照射している３週間の間、各群のヘアレスマウスには、実施例８〜１０又は比較例２の試験溶液を３００μｌずつ１日３回経口投与し、実施例８では塩酸グルコサミンが５００ｍｇ／ｋｇｗ／ｄａｙ、実施例９では塩酸グルコサミンが１０００ｍｇ／ｋｇｗ／ｄａｙ、実施例１０では塩酸グルコサミンが１５００ｍｇ／ｋｇｗ／ｄａｙとなるように投与した。そして、第１回目の紫外線照射から２４日後に、目視にてしわを７段階にスコア化（表３）し、シワ発生の予防効果を評価した。結果は表５に示す。
【００２７】
【表４】

【００２８】
【表５】

【００２９】
表４に示す結果より、塩酸グルコサミンを含有する実施例は、濃度依存的に紫外線曝露によるシワの予防効果があることが確認された。塩酸グルコサミンは、皮膚のシワの形成を抑制する優れた抗シワ効果があることがわかった。
【００３０】
実施例１１　美容用食品
下記の成分を混合し、打錠して錠剤（１錠５００ｍｇ）を得た。

【００３１】
実施例１２　抗老化用化粧品（乳液）

合計　　　　　　　　　　　　　　１００％
【００３２】
実施例３　抗老化用化粧品（美容液）

Claims

グルコサミン、グルコサミン誘導体またはそれらの薬理学的に許容される塩の中から選ばれる少なくとも一種を含有するエラスターゼ阻害剤。