JP2004045169A - 生体高分子の結晶化条件探査方法及び探査装置 - Google Patents
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Abstract
【課題】生体高分子の結晶化条件の探査方法及び装置、生体高分子結晶の製造方法の提供。
【解決手段】生体高分子の結晶化条件の探査方法。生体高分子含有溶液と半透膜で隔てられた溶液に、溶液の物理化学的性質を変化させる物質を添加して、生体高分子含有溶液の物理化学的性質を変化させ、生体高分子含有溶液の状態をモニターすることで生体高分子の結晶化条件を探査する。溶液と半透膜で隔てられた生体高分子含有溶液の容量を、減少または増大させることで生体高分子含有溶液中の生体高分子濃度を変化させ、生体高分子含有溶液の状態をモニターすることで生体高分子の結晶化条件を探査する。上記法により探査された結晶化条件を用いて、生体高分子の結晶を製造する方法。移動可能な半透膜で隔離された透析結晶化室及び溶液混合室を有する生体高分子の結晶化条件探査装置。透析結晶化室は、室内をモニターするための窓を有し、溶液混合室は、１つ以上の試薬ボトルと試薬ボトルから溶液を供給可能に接続されている
【選択図】図１
【解決手段】生体高分子の結晶化条件の探査方法。生体高分子含有溶液と半透膜で隔てられた溶液に、溶液の物理化学的性質を変化させる物質を添加して、生体高分子含有溶液の物理化学的性質を変化させ、生体高分子含有溶液の状態をモニターすることで生体高分子の結晶化条件を探査する。溶液と半透膜で隔てられた生体高分子含有溶液の容量を、減少または増大させることで生体高分子含有溶液中の生体高分子濃度を変化させ、生体高分子含有溶液の状態をモニターすることで生体高分子の結晶化条件を探査する。上記法により探査された結晶化条件を用いて、生体高分子の結晶を製造する方法。移動可能な半透膜で隔離された透析結晶化室及び溶液混合室を有する生体高分子の結晶化条件探査装置。透析結晶化室は、室内をモニターするための窓を有し、溶液混合室は、１つ以上の試薬ボトルと試薬ボトルから溶液を供給可能に接続されている
【選択図】図１
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体高分子含有溶液からの生体高分子の結晶化条件を探査する方法、探査した条件での生体高分子結晶の製造方法、及び生体高分子の結晶化条件探査装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質のような生体高分子の立体構造は、生体高分子を結晶化し、Ｘ線回折試験に付すことにより解析される。しかし、生体高分子は多様であり、その結晶化は、必ずしも容易ではなく、物によっては結晶化しない場合もある。現在採用されている生体高分子の結晶化方法は、非常に多数の結晶化条件を絨毯爆撃的に試みることにより行われ、多分に偶然性に依存する非合理的過程に基づいている。
【０００３】
生体高分子の結晶化方法の代表例として、蒸発拡散法が最も広く行われている。結晶化条件が未知の生体高分子については、まず、蒸発拡散法により、結晶化条件の当たりを付け、その後、蒸気拡散法、透析法、バッチ法などにより精密な条件検討が行われるのが一般的である。
【０００４】
蒸発拡散法を用いて結晶化条件の当たりを付ける際に、粗マトリックス法と呼ばれる探査方法を利用する。粗マトリックス法では、生体高分子を含有する溶液のｐＨ、温度、緩衝剤、沈殿化剤等のパラメーターが異なる数百種類のサンプル溶液を用意し、溶液を静置して、結晶の析出を待ち、結晶の形成の有無を定期的に観察することで、結晶化条件が探査される。現在、パラメーターを変化させた数十種類のサンプルが一度に調整できるような蒸発拡散法用のキットが市販されている。しかし、このようなキットを複数使用し、数百種類のサンプルを用意するには、相当量の生体高分子サンプルが必要である。さらに、各サンプルの調製自体及び結晶生成の有無の観察は通常は人の手や目で行われており、非常に多数の条件を変化させる場合、作業者の負担は大きい。
【０００５】
そのような状況を改善する目的で、サンプル調製や観察を、ロボットを使用して自動で行う試みもなされている。しかし、依然として、パラメーターの異なる多数の溶液を用意する必要が有り、少量の生体高分子サンプルでは、結晶化条件の探査はできないという問題は解決されていない。また、検索範囲を広げれば、それだけ多量の生体高分子が必要になるという問題もある。さらに、上記方法では、結晶化条件を不連続で探査するので、結晶化条件の発見自体、偶然性に依存しているという問題を内在しており、本質的に結晶化条件を見逃す場合も有り得る。
【０００６】
さらに、蒸気拡散法による結晶化では、生体高分子の初期濃度を少なくとも結晶析出濃度の半分程度まで予め濃縮しておく必要がある。しかし、この濃縮が結晶化を阻害する生体高分子の非特異的会合の原因となることが多い、という問題もある。
生体高分子の結晶化には、生体高分子が単分散状態で溶液に溶解している必要が有り、生体高分子が単分散状態にあるかは、例えば、動的光散乱測定により、非破壊的に迅速に測定可能である。
それにしても、数百種類の生体高分子含有溶液について単分散状態となる条件を決定するのは手間である。
【０００７】
ポストゲノム時代を迎え、多量のタンパク質の構造解析が待たれている。複雑な構造解析のために、高性能のＸ線回折装置の開発も進んでいる。しかし、肝心な生体高分子の結晶化方法が、試行錯誤と偶然性に依存しており、タンパク質の構造解析の律速段階となっている。
【０００８】
そこで本発明の目的は、比較的少量の生体高分子であっても、より確実性高く、かつより簡便に生体高分子の結晶化条件を探査できる方法及び装置を提供することにある。さらに本発明の目的は、上記探査方法により見いだされた結晶化条件において生体高分子の結晶を製造する方法を提供することにある。
【０００９】
本発明は、生体高分子含有溶液からの生体高分子の結晶化条件を探査する方法であって、生体高分子含有溶液と半透膜で隔てられた溶液に、溶液の物理化学的性質を変化させる物質を連続的または断続的に添加して、前記生体高分子含有溶液の物理化学的性質を連続的または断続的に変化させ、その間の、生体高分子含有溶液の状態を、連続的または断続的にモニターすることで、生体高分子の結晶化条件を探査する方法（以下、第１の探査方法という）に関する。
【００１０】
さらに本発明は、生体高分子含有溶液からの生体高分子の結晶化条件を探査する方法であって、溶液と半透膜で隔てられた生体高分子含有溶液の容量を、連続的または断続的に減少または増大させることで生体高分子含有溶液中の生体高分子濃度を変化させ、その間の、生体高分子含有溶液の状態を、連続的または断続的にモニターすることで、生体高分子の結晶化条件を探査する方法（以下、第２の探査方法という）に関する。
【００１１】
第２の探査方法においては、生体高分子含有溶液の容量の変化と並行して、または独立に、生体高分子含有溶液と半透膜で隔てられた溶液に、溶液の物理化学的性質を変化させる物質を連続的または断続的に添加して、前記生体高分子含有溶液の物理化学的性質を連続的または断続的に変化させ、その間の、生体高分子含有溶液の状態を、連続的または断続的にモニターすることができる。
【００１２】
さらには、上記本発明の方法により探査された結晶化条件を用いて、生体高分子の結晶を製造する方法に関する。
【００１３】
加えて本発明は、移動可能な半透膜で隔離された透析結晶化室及び溶液混合室を有し、透析結晶化室は、室内をモニターするための窓を有し、かつ溶液混合室は、１つ以上の試薬ボトルと、試薬ボトルからの溶液が供給可能に接続されていることを特徴とする生体高分子の結晶化条件探査装置に関する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の第１及び第２の探査方法ともに、生体高分子含有溶液から生体高分子が結晶化する条件を探査する方法である。
本発明において、生体高分子としては、水溶性タンパク質、膜タンパク質、核酸、タンパク質−核酸複合体等を挙げることができる。生体高分子の由来は特に制限はないが、例えば、ヒト由来の生体高分子であることができる。
【００１５】
［本発明の探査装置］
以下に、まず、本発明の探査装置について概説する。
図１は、本発明の装置を模式的に表した図である。
図１中、１１は透析結晶化室、１２は半透膜、１３溶液混合室であり、透析結晶化室１１と溶液混合室１３とは上下に移動可能な半透膜１２で隔離されている。透析結晶化室１１と溶液混合室１３は、図示しない恒温槽内に配置され、透析結晶化室１１は、室内をモニターするためのレーザー窓１５及び試料注入口となるインジェクションバルブ１７を有する。透析結晶化室１１は、結晶観察用ＣＣＤカメラ１６が付属されている。溶液混合室１３は、１つ以上の試薬ボトル１４（１４ａ〜１４ｅ）と、例えば、ピエゾ素子を使った排出バルブ１８（１８ａ〜１８ｅ）を介して試薬ボトル１４からの溶液が供給可能に接続されている。さらに、透析結晶化室及び溶液混合室の一方又は両方に、溶液排出口を有する（図１には図示されていない。）半透膜１２はプランジャー３１を介して接続しているステップモーター３２により上下動される。
【００１６】
図３に本発明の装置の一実施態様を示す。
図３の装置は、基本的な構造及び機能は図１の装置と同様である。
（ａ）に半透膜１２が上昇した状態が示され、（ｂ）に半透膜１２が下降した状態が示されている。
Ａ〜Ｅが試薬ボトル１４（１４ａ〜１４ｅ）であり、Ｆが試料ボトル、Ｇが廃液回収用のドレインビンである。（ａ）の状態では、Ａ〜Ｇは、透析結晶化室１１側に接続している。半透膜１２が下降し、（ｂ）の状態になると、Ａ〜Ｇは、溶液混合室１３側に接続するようになる。試料の透析結晶化室１１への供給や透析結晶化室１１からの廃液の排出は、（ａ）の状態で行い、結晶化条件の検索は、（ｂ）の状態で行える。
【００１７】
本発明の装置で用いる半透膜は、本発明の装置で結晶化条件を探査する生体高分子の分子量等を考慮して、適宜選択することができる。例えば、半透膜としては、ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ社製の再生セルロース膜（５ｋＤａ ｃｕｔ ｏｆｆ， １０ｋＤａ ｃｕｔ ｏｆｆ， ３０ｋＤａｃｕｔ ｏｆｆ， ５０ｋＤａ ｃｕｔ ｏｆｆ， １００ｋＤａ ｃｕｔ ｏｆｆ）等を使用できるが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
［本発明の第１の探査方法］
以下に、本発明の第１の探査方法を、本発明の装置を模式的に表した図１を用いて説明する。
本発明の第１の探査方法では、２つの溶液を用意し、一方に生体高分子を含有させ、両者を半透膜で隔離する。図１の装置では、生体高分子含有溶液を透析結晶化室１１に入れ、透析結晶化室１１とは半透膜１２で隔離された溶液混合室１３に生体高分子を含有しない溶液を入れる。この時点で、生体高分子含有溶液、及び生体高分子含有溶液と半透膜１２で隔てられた溶液混合室１３中の溶液は、例えば、同一の種類と濃度のｐＨ緩衝剤を含有する水溶液であり、生体高分子含有溶液は、これにさらに生体高分子が含まれている物であることができる。この状態では、両方の溶液の組成が生体高分子を除き同一であるので、物質の移動は実質的に生じない。
【００１９】
そして、溶液混合室１３中の溶液に、試薬ボトル１４（１４ａ〜１４ｅのいずれか）から、例えば、ピエゾ素子を使った排出バルブ１８（１８ａ〜１８ｅ）を介して、溶液の物理化学的性質を変化させる物質を連続的または断続的に添加する。溶液の物理化学的性質を変化させる物質は、例えば、ｐＨ緩衝剤、沈殿化剤、塩類、添加剤、及び水から成る群から選ばれる少なくとも１種の物質であることができる。ｐＨ緩衝剤、沈殿化剤、塩類、添加剤は、生体高分子の結晶化にこれまで使用されている物質から適宜選択することができる。
【００２０】
ｐＨ緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム／カリウム、ＭＥＳ、カコジル酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等を挙げることができる。但し、これらの限定されるものではない。
沈殿化剤としては、例えば、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化リチウム、ポリエチレングリコール、２−メチル−２，４−ペンタンジオール等を挙げることができる。但し、これらの限定されるものではない。
塩類としては、例えば、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化亜鉛、塩化コバルト、硫酸リチウム、酢酸アンモニウム、酢酸マグネシウム、酢酸亜鉛、塩化セシウム等を挙げることができる。但し、これらの限定されるものではない。添加剤としては、例えば、エチレングリコール、グリセロール、尿素、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ＥＤＴＡ、ＤＤＴ、ヘキサンジオール、オクチルグルコシド等を挙げることができる。但し、これらの限定されるものではない。
【００２１】
溶液混合室１３中の溶液に、溶液の物理化学的性質を変化させる物質を添加すると、溶液混合室１３中の溶液と生体高分子溶液との間に濃度差ができ、半透膜１２を介して前記物質が生体高分子含有溶液に移行する。それにより、生体高分子含有溶液の物理化学的性質を連続的または断続的に変化させることができる。そして、その間の、生体高分子含有溶液の状態を、連続的または断続的にモニターすることで、生体高分子が結晶化する、溶液の物理化学的性質を探査することができる。
【００２２】
具体的には、生体高分子含有溶液の状態を、例えば、動的光散乱法によりモニターし、溶液中の生体高分子の分散状態を知ることで、生体高分子が結晶化し易い方向に向かっているか否かを判定することができる。動的光散乱法によるモニターは、透析結晶化室１１に設けられたレーザー窓１５を介してレーザーを照射することで行うことができる。また、一度結晶化が起これば、ＣＣＤカメラ１６により、結晶の生成及び成長状態をモニターすることができる。
生体高分子含有溶液の状態のモニターは、上記以外にも、例えば、紫外線吸収スペクトル、溶液の電気伝導度、溶液の示差熱吸収量の測定等により行うこともできる。
【００２３】
通常は、一度の操作で結晶化条件を探査することは難しい。そこで、一度、モニターが完了した後、溶液の物理化学的性質を変化させる物質を添加した溶液の一部又は全部を除去し、新たな溶液を補充し、条件を変えて、再度、生体高分子の結晶化条件を探査する。そして、最適結晶化条件が得られるまで、繰り返し、条件を変えて、生体高分子の結晶化条件を探査することが適当である。
【００２４】
より具体的には、図２に示すフローチャートにあるような結晶化制御アルゴリズムに従って、（１）生体高分子が安定に単分散状態で存在する条件を検索するステップ、（２）結晶化核形成条件検索ステップ、及び必要により（３）結晶化条件最適化ステップを行うことが適当である。
【００２５】
（１）生体高分子が安定に単分散状態で存在する条件を検索するステップでは、生体高分子を分散した溶液を準備し、動的光散乱法によって溶解している分子の分散状態を測定しつつ、試薬ボトルから緩衝剤、塩などを徐々に結晶化チャンバーに加えることによって、また半透膜を上下させることによって生体高分子濃度を変化させることによって、生体高分子が安定して単分散に存在する条件を検索する。
【００２６】
上記条件が検索できたら、（２）結晶化核形成条件検索ステップに進み、条件の検索ができなかったら、生体高分子を含まない側の溶液を廃棄し、新たな溶液を入れて、再度、１）生体高分子が安定に単分散状態で存在する条件を検索するステップを行う。
廃棄ステップにおいては、まず生体高分子を含まない側の溶液を水に置換し、生体高分子を含む側の溶液が半透膜を通過して、結果として生体高分子側の溶液が水に置換される。
【００２７】
（２）結晶化核形成条件検索ステップでは、溶液の物理化学的性質を変化させる物質の添加を行うが、各種の物質について単独で、または２つ以上を組み合わせて行うことができる。即ち、１つの物質（またはある組合せの物質）を、溶液混合室中の溶液へ供給し、溶液混合室中の溶液濃度を高め、それにより、結晶化核形成が起こるか、または起こりやすい状態になるか否かを、例えば、光散乱法でモニターする。
【００２８】
１つの物質（またはある組合せの物質）について所定の濃度まで検索が進み、核形成が起らなかったら、物質を変えて、さらに物質の添加を行うか、溶液混合室中の溶液を廃棄し、次の条件に移行して、再度、結晶化核形成条件検索ステップを行う。
このようなリサイクル過程を繰り返すうちに、生体高分子自体が変性してしまい、再検索に耐えられなくなる事態も考えられる。その際には、今度は生体高分子を含む側の溶液を廃棄し、数回程度、結晶化チャンバー内を水などで洗浄した後、再度生体高分子溶液を注入することによって、検索を再開することができる。
【００２９】
上記溶液廃棄と次の溶液への移行を、結晶化核形成が見られるまで繰り返し実施する。例えば、結晶化核形成が起こるかの光散乱法でのモニターと、物質の添加状況及び溶液廃棄と次の溶液への移行の制御とをコンピューターを使用してリンクさせることで、結晶化核形成が起こる条件に到達できるまで、繰り返し、物質の種類や組合せを変えて、結晶化核形成条件検索ステップを行うことができる。
例えば、溶液の物理化学的性質を変化させる物質の溶液を、物質の種類を変えて多数用意し、この溶液の、溶液混合室への添加の順番や組合せ（複数の溶液を同時に添加する場合の組合せ）と、溶液添加の中止及び溶液廃棄のタイミングをプログラミングしておき、結晶化核形成が観察されるまで順次行い、溶液の添加条件とモニター結果を記録し、結晶化核形成条件を検索する。
【００３０】
１つの物質（またはある組合せの物質）について所定の濃度まで検索が進み、核形成が起こったら、そのまま結晶成長をさせるか、あるいは結晶化はするが、良品が得られない場合、（３）結晶化条件最適化ステップを行う。
結晶化核形成ステップにおいて良／不良初期結晶は、動的光散乱の時間変化パターンを観察することにより判定できる。即ち、良結晶核が形成された場合、動的光散乱パターンは単分散付近でゆるやかにゆらいだ分散値を示す。これに対し、不良結晶核では、急激な分散状態の変化が観測される。こうして得られた良結晶核からは、良質の単結晶が成長する。
【００３１】
上記（１）〜（３）のいずれのステップにおいても、溶液の温度は一定になるように制御しておくこともできるし、溶液の添加と並行して温度を変化させることもできる。溶液添加時の温度を一定にする場合、同一条件の検索操作を、温度を変えて行うこともできる。本発明の方法を実施する溶液温度は、特に制限はなく、低くする場合、凍結が生じない範囲であればよく、また、高くする場合、生体高分子に変性等が生じない範囲であれば良い。例えば、０〜４０℃の範囲とすることができる。
【００３２】
［本発明の第２の探査方法］
次に、本発明の第２の探査方法を、図１を用いて説明する。
本発明の第２の探査方法でも、第１の方法と同様に、２つの溶液を用意し、一方に生体高分子を含有させ、両者を半透膜１２で隔離する。図１の装置では、生体高分子含有溶液を透析結晶化室１１に入れ、透析結晶化室１１とは半透膜１２で隔離された溶液混合室１３に生体高分子を含有しない溶液を入れる。この時点で、生体高分子含有溶液、及び生体高分子含有溶液と半透膜で隔てられた溶液混合室中の溶液は、例えば、同一の種類と濃度のｐＨ緩衝剤を含有する水溶液であり、生体高分子含有溶液は、これにさらに生体高分子が含まれている物であることができる。
【００３３】
本発明の第２の探査方法では、生体高分子含有溶液の容量を、連続的または断続的に減少または増大させる。生体高分子含有溶液の容量の減少または増大は、例えば、半透膜１２を可動式とし、図中の上下方向に移動させることにより行うことができる。あるいは、透析結晶化室１１の底部または側壁を、例えば、部分的に可動式としておき、可動式の底部または側壁を移動させることでも、生体高分子含有溶液の容量の減少または増大を行うことができる。
【００３４】
生体高分子含有溶液の容量を減少または増大させることで、生体高分子含有溶液中の生体高分子濃度を変化させることができる。即ち、容量を減少させることで透析結晶化室１１中の溶液から生体高分子以外の溶液が溶液混合室１３に移動し、その結果、透析結晶化室１１中の溶液の生体高分子濃度は増大する。逆に、容量を増大させることで生体高分子濃度は減少する。生体高分子濃度の変化に応じて、生体高分子含有溶液の状態を、連続的または断続的にモニターすることで、生体高分子結晶が生じる、溶液の条件を探査する。具体的には、生体高分子含有溶液の状態を、例えば、動的光散乱法によりモニターし、溶液中の生体高分子の分散状態を知ることで、生体高分子が結晶化し易い方向に向かっているか否かを判定することができ、一度結晶化が起これば、ＣＣＤカメラにより、結晶の生成及び成長状態をモニターすることができる。生体高分子含有溶液の状態のモニター方法は、第１の探査方法と同様である。
【００３５】
本発明の第２の探査方法では、生体高分子含有溶液の容量の変化と並行して、または生体高分子含有溶液の容量の変化とは独立に、第１の探査方法と同様に、生体高分子含有溶液と半透膜で隔てられた溶液に、溶液の物理化学的性質を変化させる物質を連続的または断続的に添加して、前記生体高分子含有溶液の物理化学的性質を連続的または断続的に変化させ、生体高分子含有溶液の状態を、連続的または断続的にモニターすることもできる。
【００３６】
例えば、生体高分子含有溶液の容量を減少または増大させることで、生体高分子濃度としては、生体高分子が結晶化し易い条件を見いだし、その上で、この生体高分子濃度において、溶液の物理化学的性質を変化させる物質を添加することで、さらに、生体高分子が結晶化する条件を第１の探査方法と同様に探査することができる。
溶液の物理化学的性質を変化させる物質の添加中においても、生体高分子含有溶液の容量を増減させて、より結晶化にふさわしい状態に変化させることも可能である。
【００３７】
第２の探査方法においても、溶液の物理化学的性質を変化させる物質の添加を併用する場合、第１の方法と同様に、一度、モニターが完了した後、溶液の物理化学的性質を変化させる物質を添加した溶液の一部又は全部を除去し、新たな溶液を補充し、条件を変えて、再度、生体高分子の結晶化条件を探査することができる。そして、最適結晶化条件が得られるまで、繰り返し、条件（生体高分子の濃度を含めて）を変えて、生体高分子の結晶化条件を探査することができる。
【００３８】
第１の探査方法においても、溶液の温度は一定になるように制御しておくこともできるし、生体高分子の濃度変化や溶液の添加と並行して温度を変化させることもできる。生体高分子の濃度変化時や溶液添加時の温度を一定にする場合、同一条件の検索操作を、温度を変えて行うこともできる。本発明の方法を実施する溶液温度は、特に制限はなく、低くする場合、凍結が生じない範囲であればよく、また、高くする場合、生体高分子に変性等が生じない範囲であれば良い。例えば、０〜４０℃の範囲とすることができる。
【００３９】
以上の方法により、良質な結晶が得られる条件が探査できたら、その結晶化条件を用いて、生体高分子結晶を製造する。製造する生体高分子結晶は、構造解析に適した品質とサイズを有するものであることが好ましい。この生体高分子結晶の製造は、常法により行うことができる。例えば、蒸気拡散法、透析法、バッチ法などが知られている。
【００４０】
本発明は、上記製造方法により製造された生体高分子結晶を包含し、そのような生体高分子としては、例えば、水溶性タンパク質、膜タンパク質、核酸、核酸−タンパク質複合体、または高分子炭化水素を挙げることができる。さらに、生体高分子は、ヒト由来の生体高分子であることができる。また、高分子炭化水素は、例えば、セルロース誘導体、キシロース誘導体等を挙げることができる。
【００４１】
得られた生体高分子結晶は、結晶構造解析に使用することができる。結晶構造解析は、例えば、ＭＡＤ法に従って行うことができ、例えば、放射光を使用して、結晶のＸ線回折データを測定する。この目的に使用できる放射光は、例えば、大型放射光施設ＳＰｒｉｎｇ−８／理研（ＲＩＫＥＮ）ビームラインＩＢＬ４４Ｂ２（ＢＬ４５ＸＵ）により発生させることかできる。
【００４２】
【発明の効果】
本発明の方法には以下の利点がある。
（１）結晶化条件を連続的に最適化しながら検索するため、結晶化条件を見逃す可能性が、従来法に比べて低い。
（２）一定量の生体高分子試料が有れば実施できるための、用意する生体高分子試料の量が、従来法に比べて格段に少なくて済む。
（３）第２の探査方法では、生体高分子の濃縮も可能であり、結晶化過程の初期に生体高分子濃度を低くすることができる。その結果、生体高分子試料の非特異的会合を回避することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の結晶化条件探査装置の１つの実施態様を模式的に示す説明図。
【図２】結晶化条件探査のための制御アルゴリズムを示すフローチャート。
【図３】本発明の装置の一実施態様を示す図。
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体高分子含有溶液からの生体高分子の結晶化条件を探査する方法、探査した条件での生体高分子結晶の製造方法、及び生体高分子の結晶化条件探査装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質のような生体高分子の立体構造は、生体高分子を結晶化し、Ｘ線回折試験に付すことにより解析される。しかし、生体高分子は多様であり、その結晶化は、必ずしも容易ではなく、物によっては結晶化しない場合もある。現在採用されている生体高分子の結晶化方法は、非常に多数の結晶化条件を絨毯爆撃的に試みることにより行われ、多分に偶然性に依存する非合理的過程に基づいている。
【０００３】
生体高分子の結晶化方法の代表例として、蒸発拡散法が最も広く行われている。結晶化条件が未知の生体高分子については、まず、蒸発拡散法により、結晶化条件の当たりを付け、その後、蒸気拡散法、透析法、バッチ法などにより精密な条件検討が行われるのが一般的である。
【０００４】
蒸発拡散法を用いて結晶化条件の当たりを付ける際に、粗マトリックス法と呼ばれる探査方法を利用する。粗マトリックス法では、生体高分子を含有する溶液のｐＨ、温度、緩衝剤、沈殿化剤等のパラメーターが異なる数百種類のサンプル溶液を用意し、溶液を静置して、結晶の析出を待ち、結晶の形成の有無を定期的に観察することで、結晶化条件が探査される。現在、パラメーターを変化させた数十種類のサンプルが一度に調整できるような蒸発拡散法用のキットが市販されている。しかし、このようなキットを複数使用し、数百種類のサンプルを用意するには、相当量の生体高分子サンプルが必要である。さらに、各サンプルの調製自体及び結晶生成の有無の観察は通常は人の手や目で行われており、非常に多数の条件を変化させる場合、作業者の負担は大きい。
【０００５】
そのような状況を改善する目的で、サンプル調製や観察を、ロボットを使用して自動で行う試みもなされている。しかし、依然として、パラメーターの異なる多数の溶液を用意する必要が有り、少量の生体高分子サンプルでは、結晶化条件の探査はできないという問題は解決されていない。また、検索範囲を広げれば、それだけ多量の生体高分子が必要になるという問題もある。さらに、上記方法では、結晶化条件を不連続で探査するので、結晶化条件の発見自体、偶然性に依存しているという問題を内在しており、本質的に結晶化条件を見逃す場合も有り得る。
【０００６】
さらに、蒸気拡散法による結晶化では、生体高分子の初期濃度を少なくとも結晶析出濃度の半分程度まで予め濃縮しておく必要がある。しかし、この濃縮が結晶化を阻害する生体高分子の非特異的会合の原因となることが多い、という問題もある。
生体高分子の結晶化には、生体高分子が単分散状態で溶液に溶解している必要が有り、生体高分子が単分散状態にあるかは、例えば、動的光散乱測定により、非破壊的に迅速に測定可能である。
それにしても、数百種類の生体高分子含有溶液について単分散状態となる条件を決定するのは手間である。
【０００７】
ポストゲノム時代を迎え、多量のタンパク質の構造解析が待たれている。複雑な構造解析のために、高性能のＸ線回折装置の開発も進んでいる。しかし、肝心な生体高分子の結晶化方法が、試行錯誤と偶然性に依存しており、タンパク質の構造解析の律速段階となっている。
【０００８】
そこで本発明の目的は、比較的少量の生体高分子であっても、より確実性高く、かつより簡便に生体高分子の結晶化条件を探査できる方法及び装置を提供することにある。さらに本発明の目的は、上記探査方法により見いだされた結晶化条件において生体高分子の結晶を製造する方法を提供することにある。
【０００９】
本発明は、生体高分子含有溶液からの生体高分子の結晶化条件を探査する方法であって、生体高分子含有溶液と半透膜で隔てられた溶液に、溶液の物理化学的性質を変化させる物質を連続的または断続的に添加して、前記生体高分子含有溶液の物理化学的性質を連続的または断続的に変化させ、その間の、生体高分子含有溶液の状態を、連続的または断続的にモニターすることで、生体高分子の結晶化条件を探査する方法（以下、第１の探査方法という）に関する。
【００１０】
さらに本発明は、生体高分子含有溶液からの生体高分子の結晶化条件を探査する方法であって、溶液と半透膜で隔てられた生体高分子含有溶液の容量を、連続的または断続的に減少または増大させることで生体高分子含有溶液中の生体高分子濃度を変化させ、その間の、生体高分子含有溶液の状態を、連続的または断続的にモニターすることで、生体高分子の結晶化条件を探査する方法（以下、第２の探査方法という）に関する。
【００１１】
第２の探査方法においては、生体高分子含有溶液の容量の変化と並行して、または独立に、生体高分子含有溶液と半透膜で隔てられた溶液に、溶液の物理化学的性質を変化させる物質を連続的または断続的に添加して、前記生体高分子含有溶液の物理化学的性質を連続的または断続的に変化させ、その間の、生体高分子含有溶液の状態を、連続的または断続的にモニターすることができる。
【００１２】
さらには、上記本発明の方法により探査された結晶化条件を用いて、生体高分子の結晶を製造する方法に関する。
【００１３】
加えて本発明は、移動可能な半透膜で隔離された透析結晶化室及び溶液混合室を有し、透析結晶化室は、室内をモニターするための窓を有し、かつ溶液混合室は、１つ以上の試薬ボトルと、試薬ボトルからの溶液が供給可能に接続されていることを特徴とする生体高分子の結晶化条件探査装置に関する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の第１及び第２の探査方法ともに、生体高分子含有溶液から生体高分子が結晶化する条件を探査する方法である。
本発明において、生体高分子としては、水溶性タンパク質、膜タンパク質、核酸、タンパク質−核酸複合体等を挙げることができる。生体高分子の由来は特に制限はないが、例えば、ヒト由来の生体高分子であることができる。
【００１５】
［本発明の探査装置］
以下に、まず、本発明の探査装置について概説する。
図１は、本発明の装置を模式的に表した図である。
図１中、１１は透析結晶化室、１２は半透膜、１３溶液混合室であり、透析結晶化室１１と溶液混合室１３とは上下に移動可能な半透膜１２で隔離されている。透析結晶化室１１と溶液混合室１３は、図示しない恒温槽内に配置され、透析結晶化室１１は、室内をモニターするためのレーザー窓１５及び試料注入口となるインジェクションバルブ１７を有する。透析結晶化室１１は、結晶観察用ＣＣＤカメラ１６が付属されている。溶液混合室１３は、１つ以上の試薬ボトル１４（１４ａ〜１４ｅ）と、例えば、ピエゾ素子を使った排出バルブ１８（１８ａ〜１８ｅ）を介して試薬ボトル１４からの溶液が供給可能に接続されている。さらに、透析結晶化室及び溶液混合室の一方又は両方に、溶液排出口を有する（図１には図示されていない。）半透膜１２はプランジャー３１を介して接続しているステップモーター３２により上下動される。
【００１６】
図３に本発明の装置の一実施態様を示す。
図３の装置は、基本的な構造及び機能は図１の装置と同様である。
（ａ）に半透膜１２が上昇した状態が示され、（ｂ）に半透膜１２が下降した状態が示されている。
Ａ〜Ｅが試薬ボトル１４（１４ａ〜１４ｅ）であり、Ｆが試料ボトル、Ｇが廃液回収用のドレインビンである。（ａ）の状態では、Ａ〜Ｇは、透析結晶化室１１側に接続している。半透膜１２が下降し、（ｂ）の状態になると、Ａ〜Ｇは、溶液混合室１３側に接続するようになる。試料の透析結晶化室１１への供給や透析結晶化室１１からの廃液の排出は、（ａ）の状態で行い、結晶化条件の検索は、（ｂ）の状態で行える。
【００１７】
本発明の装置で用いる半透膜は、本発明の装置で結晶化条件を探査する生体高分子の分子量等を考慮して、適宜選択することができる。例えば、半透膜としては、ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ社製の再生セルロース膜（５ｋＤａ ｃｕｔ ｏｆｆ， １０ｋＤａ ｃｕｔ ｏｆｆ， ３０ｋＤａｃｕｔ ｏｆｆ， ５０ｋＤａ ｃｕｔ ｏｆｆ， １００ｋＤａ ｃｕｔ ｏｆｆ）等を使用できるが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
［本発明の第１の探査方法］
以下に、本発明の第１の探査方法を、本発明の装置を模式的に表した図１を用いて説明する。
本発明の第１の探査方法では、２つの溶液を用意し、一方に生体高分子を含有させ、両者を半透膜で隔離する。図１の装置では、生体高分子含有溶液を透析結晶化室１１に入れ、透析結晶化室１１とは半透膜１２で隔離された溶液混合室１３に生体高分子を含有しない溶液を入れる。この時点で、生体高分子含有溶液、及び生体高分子含有溶液と半透膜１２で隔てられた溶液混合室１３中の溶液は、例えば、同一の種類と濃度のｐＨ緩衝剤を含有する水溶液であり、生体高分子含有溶液は、これにさらに生体高分子が含まれている物であることができる。この状態では、両方の溶液の組成が生体高分子を除き同一であるので、物質の移動は実質的に生じない。
【００１９】
そして、溶液混合室１３中の溶液に、試薬ボトル１４（１４ａ〜１４ｅのいずれか）から、例えば、ピエゾ素子を使った排出バルブ１８（１８ａ〜１８ｅ）を介して、溶液の物理化学的性質を変化させる物質を連続的または断続的に添加する。溶液の物理化学的性質を変化させる物質は、例えば、ｐＨ緩衝剤、沈殿化剤、塩類、添加剤、及び水から成る群から選ばれる少なくとも１種の物質であることができる。ｐＨ緩衝剤、沈殿化剤、塩類、添加剤は、生体高分子の結晶化にこれまで使用されている物質から適宜選択することができる。
【００２０】
ｐＨ緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム／カリウム、ＭＥＳ、カコジル酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等を挙げることができる。但し、これらの限定されるものではない。
沈殿化剤としては、例えば、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化リチウム、ポリエチレングリコール、２−メチル−２，４−ペンタンジオール等を挙げることができる。但し、これらの限定されるものではない。
塩類としては、例えば、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化亜鉛、塩化コバルト、硫酸リチウム、酢酸アンモニウム、酢酸マグネシウム、酢酸亜鉛、塩化セシウム等を挙げることができる。但し、これらの限定されるものではない。添加剤としては、例えば、エチレングリコール、グリセロール、尿素、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ＥＤＴＡ、ＤＤＴ、ヘキサンジオール、オクチルグルコシド等を挙げることができる。但し、これらの限定されるものではない。
【００２１】
溶液混合室１３中の溶液に、溶液の物理化学的性質を変化させる物質を添加すると、溶液混合室１３中の溶液と生体高分子溶液との間に濃度差ができ、半透膜１２を介して前記物質が生体高分子含有溶液に移行する。それにより、生体高分子含有溶液の物理化学的性質を連続的または断続的に変化させることができる。そして、その間の、生体高分子含有溶液の状態を、連続的または断続的にモニターすることで、生体高分子が結晶化する、溶液の物理化学的性質を探査することができる。
【００２２】
具体的には、生体高分子含有溶液の状態を、例えば、動的光散乱法によりモニターし、溶液中の生体高分子の分散状態を知ることで、生体高分子が結晶化し易い方向に向かっているか否かを判定することができる。動的光散乱法によるモニターは、透析結晶化室１１に設けられたレーザー窓１５を介してレーザーを照射することで行うことができる。また、一度結晶化が起これば、ＣＣＤカメラ１６により、結晶の生成及び成長状態をモニターすることができる。
生体高分子含有溶液の状態のモニターは、上記以外にも、例えば、紫外線吸収スペクトル、溶液の電気伝導度、溶液の示差熱吸収量の測定等により行うこともできる。
【００２３】
通常は、一度の操作で結晶化条件を探査することは難しい。そこで、一度、モニターが完了した後、溶液の物理化学的性質を変化させる物質を添加した溶液の一部又は全部を除去し、新たな溶液を補充し、条件を変えて、再度、生体高分子の結晶化条件を探査する。そして、最適結晶化条件が得られるまで、繰り返し、条件を変えて、生体高分子の結晶化条件を探査することが適当である。
【００２４】
より具体的には、図２に示すフローチャートにあるような結晶化制御アルゴリズムに従って、（１）生体高分子が安定に単分散状態で存在する条件を検索するステップ、（２）結晶化核形成条件検索ステップ、及び必要により（３）結晶化条件最適化ステップを行うことが適当である。
【００２５】
（１）生体高分子が安定に単分散状態で存在する条件を検索するステップでは、生体高分子を分散した溶液を準備し、動的光散乱法によって溶解している分子の分散状態を測定しつつ、試薬ボトルから緩衝剤、塩などを徐々に結晶化チャンバーに加えることによって、また半透膜を上下させることによって生体高分子濃度を変化させることによって、生体高分子が安定して単分散に存在する条件を検索する。
【００２６】
上記条件が検索できたら、（２）結晶化核形成条件検索ステップに進み、条件の検索ができなかったら、生体高分子を含まない側の溶液を廃棄し、新たな溶液を入れて、再度、１）生体高分子が安定に単分散状態で存在する条件を検索するステップを行う。
廃棄ステップにおいては、まず生体高分子を含まない側の溶液を水に置換し、生体高分子を含む側の溶液が半透膜を通過して、結果として生体高分子側の溶液が水に置換される。
【００２７】
（２）結晶化核形成条件検索ステップでは、溶液の物理化学的性質を変化させる物質の添加を行うが、各種の物質について単独で、または２つ以上を組み合わせて行うことができる。即ち、１つの物質（またはある組合せの物質）を、溶液混合室中の溶液へ供給し、溶液混合室中の溶液濃度を高め、それにより、結晶化核形成が起こるか、または起こりやすい状態になるか否かを、例えば、光散乱法でモニターする。
【００２８】
１つの物質（またはある組合せの物質）について所定の濃度まで検索が進み、核形成が起らなかったら、物質を変えて、さらに物質の添加を行うか、溶液混合室中の溶液を廃棄し、次の条件に移行して、再度、結晶化核形成条件検索ステップを行う。
このようなリサイクル過程を繰り返すうちに、生体高分子自体が変性してしまい、再検索に耐えられなくなる事態も考えられる。その際には、今度は生体高分子を含む側の溶液を廃棄し、数回程度、結晶化チャンバー内を水などで洗浄した後、再度生体高分子溶液を注入することによって、検索を再開することができる。
【００２９】
上記溶液廃棄と次の溶液への移行を、結晶化核形成が見られるまで繰り返し実施する。例えば、結晶化核形成が起こるかの光散乱法でのモニターと、物質の添加状況及び溶液廃棄と次の溶液への移行の制御とをコンピューターを使用してリンクさせることで、結晶化核形成が起こる条件に到達できるまで、繰り返し、物質の種類や組合せを変えて、結晶化核形成条件検索ステップを行うことができる。
例えば、溶液の物理化学的性質を変化させる物質の溶液を、物質の種類を変えて多数用意し、この溶液の、溶液混合室への添加の順番や組合せ（複数の溶液を同時に添加する場合の組合せ）と、溶液添加の中止及び溶液廃棄のタイミングをプログラミングしておき、結晶化核形成が観察されるまで順次行い、溶液の添加条件とモニター結果を記録し、結晶化核形成条件を検索する。
【００３０】
１つの物質（またはある組合せの物質）について所定の濃度まで検索が進み、核形成が起こったら、そのまま結晶成長をさせるか、あるいは結晶化はするが、良品が得られない場合、（３）結晶化条件最適化ステップを行う。
結晶化核形成ステップにおいて良／不良初期結晶は、動的光散乱の時間変化パターンを観察することにより判定できる。即ち、良結晶核が形成された場合、動的光散乱パターンは単分散付近でゆるやかにゆらいだ分散値を示す。これに対し、不良結晶核では、急激な分散状態の変化が観測される。こうして得られた良結晶核からは、良質の単結晶が成長する。
【００３１】
上記（１）〜（３）のいずれのステップにおいても、溶液の温度は一定になるように制御しておくこともできるし、溶液の添加と並行して温度を変化させることもできる。溶液添加時の温度を一定にする場合、同一条件の検索操作を、温度を変えて行うこともできる。本発明の方法を実施する溶液温度は、特に制限はなく、低くする場合、凍結が生じない範囲であればよく、また、高くする場合、生体高分子に変性等が生じない範囲であれば良い。例えば、０〜４０℃の範囲とすることができる。
【００３２】
［本発明の第２の探査方法］
次に、本発明の第２の探査方法を、図１を用いて説明する。
本発明の第２の探査方法でも、第１の方法と同様に、２つの溶液を用意し、一方に生体高分子を含有させ、両者を半透膜１２で隔離する。図１の装置では、生体高分子含有溶液を透析結晶化室１１に入れ、透析結晶化室１１とは半透膜１２で隔離された溶液混合室１３に生体高分子を含有しない溶液を入れる。この時点で、生体高分子含有溶液、及び生体高分子含有溶液と半透膜で隔てられた溶液混合室中の溶液は、例えば、同一の種類と濃度のｐＨ緩衝剤を含有する水溶液であり、生体高分子含有溶液は、これにさらに生体高分子が含まれている物であることができる。
【００３３】
本発明の第２の探査方法では、生体高分子含有溶液の容量を、連続的または断続的に減少または増大させる。生体高分子含有溶液の容量の減少または増大は、例えば、半透膜１２を可動式とし、図中の上下方向に移動させることにより行うことができる。あるいは、透析結晶化室１１の底部または側壁を、例えば、部分的に可動式としておき、可動式の底部または側壁を移動させることでも、生体高分子含有溶液の容量の減少または増大を行うことができる。
【００３４】
生体高分子含有溶液の容量を減少または増大させることで、生体高分子含有溶液中の生体高分子濃度を変化させることができる。即ち、容量を減少させることで透析結晶化室１１中の溶液から生体高分子以外の溶液が溶液混合室１３に移動し、その結果、透析結晶化室１１中の溶液の生体高分子濃度は増大する。逆に、容量を増大させることで生体高分子濃度は減少する。生体高分子濃度の変化に応じて、生体高分子含有溶液の状態を、連続的または断続的にモニターすることで、生体高分子結晶が生じる、溶液の条件を探査する。具体的には、生体高分子含有溶液の状態を、例えば、動的光散乱法によりモニターし、溶液中の生体高分子の分散状態を知ることで、生体高分子が結晶化し易い方向に向かっているか否かを判定することができ、一度結晶化が起これば、ＣＣＤカメラにより、結晶の生成及び成長状態をモニターすることができる。生体高分子含有溶液の状態のモニター方法は、第１の探査方法と同様である。
【００３５】
本発明の第２の探査方法では、生体高分子含有溶液の容量の変化と並行して、または生体高分子含有溶液の容量の変化とは独立に、第１の探査方法と同様に、生体高分子含有溶液と半透膜で隔てられた溶液に、溶液の物理化学的性質を変化させる物質を連続的または断続的に添加して、前記生体高分子含有溶液の物理化学的性質を連続的または断続的に変化させ、生体高分子含有溶液の状態を、連続的または断続的にモニターすることもできる。
【００３６】
例えば、生体高分子含有溶液の容量を減少または増大させることで、生体高分子濃度としては、生体高分子が結晶化し易い条件を見いだし、その上で、この生体高分子濃度において、溶液の物理化学的性質を変化させる物質を添加することで、さらに、生体高分子が結晶化する条件を第１の探査方法と同様に探査することができる。
溶液の物理化学的性質を変化させる物質の添加中においても、生体高分子含有溶液の容量を増減させて、より結晶化にふさわしい状態に変化させることも可能である。
【００３７】
第２の探査方法においても、溶液の物理化学的性質を変化させる物質の添加を併用する場合、第１の方法と同様に、一度、モニターが完了した後、溶液の物理化学的性質を変化させる物質を添加した溶液の一部又は全部を除去し、新たな溶液を補充し、条件を変えて、再度、生体高分子の結晶化条件を探査することができる。そして、最適結晶化条件が得られるまで、繰り返し、条件（生体高分子の濃度を含めて）を変えて、生体高分子の結晶化条件を探査することができる。
【００３８】
第１の探査方法においても、溶液の温度は一定になるように制御しておくこともできるし、生体高分子の濃度変化や溶液の添加と並行して温度を変化させることもできる。生体高分子の濃度変化時や溶液添加時の温度を一定にする場合、同一条件の検索操作を、温度を変えて行うこともできる。本発明の方法を実施する溶液温度は、特に制限はなく、低くする場合、凍結が生じない範囲であればよく、また、高くする場合、生体高分子に変性等が生じない範囲であれば良い。例えば、０〜４０℃の範囲とすることができる。
【００３９】
以上の方法により、良質な結晶が得られる条件が探査できたら、その結晶化条件を用いて、生体高分子結晶を製造する。製造する生体高分子結晶は、構造解析に適した品質とサイズを有するものであることが好ましい。この生体高分子結晶の製造は、常法により行うことができる。例えば、蒸気拡散法、透析法、バッチ法などが知られている。
【００４０】
本発明は、上記製造方法により製造された生体高分子結晶を包含し、そのような生体高分子としては、例えば、水溶性タンパク質、膜タンパク質、核酸、核酸−タンパク質複合体、または高分子炭化水素を挙げることができる。さらに、生体高分子は、ヒト由来の生体高分子であることができる。また、高分子炭化水素は、例えば、セルロース誘導体、キシロース誘導体等を挙げることができる。
【００４１】
得られた生体高分子結晶は、結晶構造解析に使用することができる。結晶構造解析は、例えば、ＭＡＤ法に従って行うことができ、例えば、放射光を使用して、結晶のＸ線回折データを測定する。この目的に使用できる放射光は、例えば、大型放射光施設ＳＰｒｉｎｇ−８／理研（ＲＩＫＥＮ）ビームラインＩＢＬ４４Ｂ２（ＢＬ４５ＸＵ）により発生させることかできる。
【００４２】
【発明の効果】
本発明の方法には以下の利点がある。
（１）結晶化条件を連続的に最適化しながら検索するため、結晶化条件を見逃す可能性が、従来法に比べて低い。
（２）一定量の生体高分子試料が有れば実施できるための、用意する生体高分子試料の量が、従来法に比べて格段に少なくて済む。
（３）第２の探査方法では、生体高分子の濃縮も可能であり、結晶化過程の初期に生体高分子濃度を低くすることができる。その結果、生体高分子試料の非特異的会合を回避することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の結晶化条件探査装置の１つの実施態様を模式的に示す説明図。
【図２】結晶化条件探査のための制御アルゴリズムを示すフローチャート。
【図３】本発明の装置の一実施態様を示す図。
Claims (20)
- 生体高分子含有溶液からの生体高分子の結晶化条件を探査する方法であって、生体高分子含有溶液と半透膜で隔てられた溶液に、溶液の物理化学的性質を変化させる物質を連続的または断続的に添加して、前記生体高分子含有溶液の物理化学的性質を連続的または断続的に変化させ、その間の、生体高分子含有溶液の状態を、連続的または断続的にモニターすることで、生体高分子の結晶化条件を探査する方法。
- 生体高分子含有溶液からの生体高分子の結晶化条件を探査する方法であって、溶液と半透膜で隔てられた生体高分子含有溶液の容量を、連続的または断続的に減少または増大させることで生体高分子含有溶液中の生体高分子濃度を変化させ、その間の、生体高分子含有溶液の状態を、連続的または断続的にモニターすることで、生体高分子の結晶化条件を探査する方法。
- 生体高分子含有溶液の容量の減少または増大を、半透膜を移動させることにより行う請求項２に記載の方法。
- 生体高分子含有溶液の容量の変化と並行して、または独立に、生体高分子含有溶液と半透膜で隔てられた溶液に、溶液の物理化学的性質を変化させる物質を連続的または断続的に添加して、前記生体高分子含有溶液の物理化学的性質を連続的または断続的に変化させ、その間の、生体高分子含有溶液の状態を、連続的または断続的にモニターする請求項２又は３に記載の方法。
- 条件を変化させる前の、生体高分子含有溶液、及び生体高分子含有溶液と半透膜で隔てられた溶液が、同一の種類と濃度のｐＨ緩衝剤を含有する水溶液である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 生体高分子が水溶性タンパク質、膜タンパク質、核酸、またはタンパク質−核酸複合体である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
- 溶液の物理化学的性質を変化させる物質が、ｐＨ緩衝剤、沈殿化剤、塩類、添加剤、及び水から成る群から選ばれる少なくとも１種の物質である請求項１、３〜６のいずれか１項に記載の方法。
- ｐＨ緩衝剤、沈殿化剤、塩類及び添加剤から成る群から選ばれる少なくとも１種の物質が、この物質を含有する溶液として使用される請求項７に記載の方法。
- モニターが完了した後、溶液の物理化学的性質を変化させる物質を添加した溶液の一部又は全部を除去し、新たな溶液を補充し、条件を変えて、再度、生体高分子の結晶化条件を探査する請求項１、３〜８のいずれか１項に記載の方法。
- 最適結晶化条件が得られるまで、繰り返し、条件を変えて、生体高分子の結晶化条件を探査する請求項９に記載の方法。
- 生体高分子含有溶液の状態のモニターを、光散乱法及び／又はＣＣＤカメラを用いて行う請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
- 温度を一定にして、または変動させて行う請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
- 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法により探査された結晶化条件を用いて、生体高分子の結晶を製造する方法。
- 請求項１３に記載の製造方法により製造された生体高分子結晶。
- 生体高分子が水溶性タンパク質、膜タンパク質、核酸、タンパク質−核酸複合体、または高分子炭化水素である請求項１４に記載の生体高分子結晶。
- 生体高分子がヒト由来する請求項１５に記載の生体高分子結晶。
- 移動可能な半透膜で隔離された透析結晶化室及び溶液混合室を有し、
透析結晶化室は、室内をモニターするための窓を有し、かつ
溶液混合室は、１つ以上の試薬ボトルと、試薬ボトルから溶液を供給可能に接続されていることを特徴とする生体高分子の結晶化条件探査装置。 - 室内をモニターするための窓が動的光散乱法によるモニターを行うためのレーザー窓である請求項１７に記載の装置。
- 透析結晶化室は試料注入口を有し、かつ透析結晶化室及び溶液混合室の一方又は両方が、溶液排出口を有する請求項１７または１８に記載の装置。
- 半透膜がプランジャーを介して上下動される請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の装置。
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