JP2004043348A - 皮膚外用剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】老化防止効果、美白効果に優れた皮膚外用剤の有効成分の開発が求められていた。本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、優れた効果を有する細胞賦活剤、抗酸化剤、メラニン産生抑制剤を見出し、老化防止効果および美白効果に優れた皮膚外用剤を提供することを目的とする。
【解決手段】様々な物質について細胞賦活効果、抗酸化効果、メラニン産生抑制効果に関する検討を鋭意加えた結果、ナツノハナワラビ属（Ｂｏｔｒｙｐｕｓ）、ヒメハナワラビ属（Ｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ）、オオハナワラビ属（Ｓｃｅｐｔｒｉｄｉｕｍ）、アリサンハナワラビ属（Ｊａｐａｎｏｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ）、ミヤコジマハナワラビ属（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｔａｃｈｙｓ）に属する植物の抽出物が、優れた細胞賦活効果、抗酸化効果及びメラニン産生抑制効果に優れていることを見出し、本発明を完成するに至った。
【選択図】 なし
【解決手段】様々な物質について細胞賦活効果、抗酸化効果、メラニン産生抑制効果に関する検討を鋭意加えた結果、ナツノハナワラビ属（Ｂｏｔｒｙｐｕｓ）、ヒメハナワラビ属（Ｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ）、オオハナワラビ属（Ｓｃｅｐｔｒｉｄｉｕｍ）、アリサンハナワラビ属（Ｊａｐａｎｏｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ）、ミヤコジマハナワラビ属（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｔａｃｈｙｓ）に属する植物の抽出物が、優れた細胞賦活効果、抗酸化効果及びメラニン産生抑制効果に優れていることを見出し、本発明を完成するに至った。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞賦活剤、抗酸化剤、メラニン産生抑制剤、及び老化防止効果と美白効果に優れた皮膚外用剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、皮膚の美観を保つことに対する女性の関心は非常に高く、シワ、シミ、タルミなどは女性の肌に対する悩みの上位に常に位置する。これらの悩みのうち、シワやタルミは、加齢等による真皮線維芽細胞の機能低下や、それに伴うコラーゲンやエラスチン等の真皮マトリックスの減少や変性、さらには紫外線等の外来ストレスによる酸化障害などが重要な要因となっている。また、もう一方の大きな悩みである、皮膚の色黒は一部不明な点もあるがホルモンの異常や日光の紫外線の刺激によるメラニン色素の産生が原因であり、その中でも、シミやソバカスはメラニン色素が異常沈着することが、その要因である。これまでの皮膚外用剤の分野では、上述の皮膚の美観を損なうような諸症状を防止、或いは改善するために、さまざまな細胞賦活剤や抗酸化剤及びメラニン産生抑制剤の検索及び配合検討が成されてきた。
【０００３】
例えば、細胞賦活剤としては、ポンカンのエッセンス（特開２００１−１３１０４５）、ツリガネニンジン属、クサギ及びそれらの抽出物（特開２０００−１７８１９８）、有機溶媒によるクロレラ抽出物（特開平１１−３３５２９３）等、抗酸化剤としては、キク科ヘテロテカ属植物抽出物（特開平１１−１８０８８６）やカユンアンギンの抽出物（特開平１０−１８２４１３）等、さらにメラニン産生抑制剤としては、ホンダワラの抽出物（特開平１０−３３０２２０）、ショウガ属植物の抽出物（特開２０００−１５９６２６）等が知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、既に報告されている上記の有効成分を含有する皮膚外用剤はいずれにおいてもその老化防止効果、美白効果は必ずしも十分ではなく、より優れた有効成分の開発が求められていた。本発明は、上記事情に鑑みてなされたものである。すなわち、優れた効果を有する細胞賦活剤、抗酸化剤、メラニン産生抑制剤を見出し、老化防止効果および美白効果に優れた皮膚外用剤を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、老化防止効果および美白効果に優れた有効成分を見出すために、様々な物質について細胞賦活効果、抗酸化効果、メラニン産生抑制効果に関する検討を鋭意加えた結果、ナツノハナワラビ属（Ｂｏｔｒｙｐｕｓ）、ヒメハナワラビ属（Ｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ）、オオハナワラビ属（Ｓｃｅｐｔｒｉｄｉｕｍ）、アリサンハナワラビ属（Ｊａｐａｎｏｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ）、ミヤコジマハナワラビ属（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｔａｃｈｙｓ）に属する植物の抽出物が、優れた細胞賦活効果、抗酸化効果及びメラニン産生抑制効果に優れていることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、ナツノハナワラビ属（Ｂｏｔｒｙｐｕｓ）、ヒメハナワラビ属（Ｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ）、オオハナワラビ属（Ｓｃｅｐｔｒｉｄｉｕｍ）、アリサンハナワラビ属（Ｊａｐａｎｏｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ）、ミヤコジマハナワラビ属（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｔａｃｈｙｓ）に属する植物の抽出物を含有する細胞賦活剤、抗酸化剤、メラニン産生抑制剤、及び老化防止用皮膚外用剤さらには美白用皮膚外用剤を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【０００８】
本発明にかかるナツノハナワラビ属（Ｂｏｔｒｙｐｕｓ）、ヒメハナワラビ属（Ｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ）、オオハナワラビ属（Ｓｃｅｐｔｒｉｄｉｕｍ）、アリサンハナワラビ属（Ｊａｐａｎｏｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ）、ミヤコジマハナワラビ属（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｔａｃｈｙｓ）は、真嚢シダ類であるハナヤスリ科（Ｏｐｈｉｏｇｌｏｓｓａｃｅａｅ）に属し、ハナヤスリ属（Ｏｐｈｉｏｇｌｏｓｓｕｍ）を加えて計６属に分類される。この６属のうち、本発明にかかる前５属は、ハナワラビ属（Ｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ）として、まとめて分類される場合もある。なお、ハナヤスリ科の名称の由来は、胞子葉の形が鑢に似て垂直に立ち、一見すると花に見えることにちなむ。
【０００９】
ナツノハナワラビ属は、ナツノハナワラビ（Ｂｏｔｒｙｐｕｓ ｖｉｒｇｉｎｉａｎｕｓ）、ナガホノナツノハナワラビ（Ｂ． ｓｔｒｉｃｔｕｓ）など３種からなり、主に温帯域に分布する。中でも、ナツノハナワラビの根つきの全草は、「シュンフケン（春不見）」と呼ばれる生薬のひとつで、煎じて飲用されたり、つぶして外用されていが、その抽出物を皮膚外用剤に配合することは知られていなかった。
【００１０】
ヒメハナワラビ属は、ボトリキウム・パラドクスム（Ｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ ｐａｒａｄｏｘｕｍ）、ヒメハナワラビ（Ｂ． ｌｕｎａｒｉａ）など、約２０種類の種からなり、北半球の周極地方、北アメリカ、および温帯の高山域に分布する。
【００１１】
オオハナワラビ属は、アカハナワラビ（Ｓｃｅｐｔｒｉｄｉｕｍ ｎｉｐｐｏ ｎｉｃｕｍ）、オオハナワラビ（Ｓ． ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、フユノハナワラビ（Ｓ． ｔｅｒｎａｔｕｍ）等の約２０種類の種からなり、亜寒帯から亜熱帯に分布し、日当たりの良い草原から薄暗い照葉樹林の林床まで多様な環境に生育する。また、このフユノハナワラビの根つきの全草は、「インジケツ（陰地蕨）」と呼ばれる生薬のひとつで、煎じて飲用されたり、つぶして外用されている。さらに、同植物を入浴剤として使用することが、特開平２−２３７９３２に記載されているが、その抽出物を皮膚外用剤に配合することに関しては、これまで全く知られていなかった。
【００１２】
アリサンハナワラビ属は、アリサンハナワラビ（Ｊａｐａｎｏｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ ｌａｎｇｉｎｏｓｕｍ）等、６種が知られており、そのうち５種までが東南アジアと西太平洋の島嶼に分布し、１種だけがアフリカ中部に隔離分布する。中でもアリサンハナワラビは、ハナヤスリ科の中では唯一、地上のみならず樹上でも生育できることで知られている。また、このアリサンハナワラビの根つきの全草は、「ドッケツキ（独蕨箕）」と呼ばれる生薬のひとつで、煎じて飲用されたり、つぶして外用されているが、その抽出物を皮膚外用剤に配合することは知られていなかった。
【００１３】
ミヤコジマハナワラビ属は、ミヤコジマハナワラビ（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｔａｃｈｙｓ ｚｅｙｌａｎｉｃａ）の１種のみからなる単型属であり、日本の西南諸島を北限とし、東南アジア、オセアニアに分布する。
【００１４】
以下、本発明の明細書中においては、本発明にかかるナツノハナワラビ属、ヒメハナワラビ属、オオハナワラビ属、アリサンハナワラビ属、ミヤコジマハナワラビ属の５属をまとめて、「ハナワラビ属」の名称を採用し、詳細な説明に使用する。
【００１５】
本発明にかかる植物の抽出物は、ハナワラビ属植物の胞子、胞子嚢穂、葉、茎、根等の何れの部分を用いて抽出しても良く、さらにはその全草を用いて抽出しても良い。また、その抽出方法は常法であればよく、各部位を生のまま、或いは乾燥・粉砕後に、各種溶媒により抽出することができる。
【００１６】
本発明において使用する植物抽出物を調製する方法について、さらに述べるが、これらの抽出溶媒および抽出方法に限定されるものではない。抽出溶媒としては、水、エタノール、メタノール、イソプロパノール、イソブタノール、ｎ−ヘキサノール、メチルアミルアルコール、２−エチルブタノール、ｎ−オクチルアルコールなどのアルコール類、グリセリン、エチレングリコール、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコール、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、トリエチレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ヘキシレングリコール等の多価アルコール又はその誘導体、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、メチル−ｎ−プロピルケトンなどのケトン類、酢酸エチル、酢酸イソプロピルなどのエステル類、エチルエーテル、イソプロピルエーテル、ｎ−ブチルエーテル等のエーテル類などの極性溶媒から選択される１種又は２種以上の混合溶媒が好適に使用でき、また、リン酸緩衝生理食塩水や尿素水溶液を用いることができる。
【００１７】
なお、上記溶媒のうち、水、アルコール及び多価アルコール又はその誘導体類（エタノール、メタノール、イソプロパノール、イソブタノール、ｎ−ヘキサノール、メチルアミルアルコール、２−エチルブタノール、ｎ−オクチルアルコール、グリセリン、エチレングリコール、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコール、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、トリエチレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ヘキシレングリコール等）およびそれらの混合溶媒については、その溶媒を留去せずに抽出物として構わない。
【００１８】
或いは、石油エーテル、ｎ−ヘキサン、ｎ−ペンタン、ｎ−ブタン、ｎ−オクタン、シクロヘキサン、流動パラフィン、スクワラン等の炭化水素類、四塩化炭素、クロロホルム、ジクロロメタン、トリクロロエチレン、ベンゼン、トルエンなどの低極性もしくは無極性溶媒から選択される１種又は２種以上の混合溶媒も好適に使用することもできる。
【００１９】
なお、これらの低極性、無極性の溶媒のうち流動パラフィンやスクワランなどに関しては、その溶媒を留去せずに抽出物として構わない。
【００２０】
さらには、水や二酸化炭素、エチレン、プロピレン、エタノール、メタノール、アンモニアなどの１種または２種以上の超臨界流体や亜臨界流体も用いることもできる。
【００２１】
抽出方法としては、常圧、若しくは加圧，減圧下で、室温、冷却又は加熱した状態で含浸させて抽出する方法、水蒸気蒸留などの蒸留法を用いて抽出する方法、本発明にかかる植物を圧搾して抽出物を得る圧搾法などが例示され、これらの方法を単独で、又は２種以上を組み合わせて抽出を行うこともできる。
【００２２】
このようにして得られた植物抽出物は、抽出物をそのまま用いることもできるが、その効果を失わない範囲で、脱臭、脱色、濃縮などの精製操作を加えたり、さらにはカラムクロマトグラフィーなどを用いて分画物として用いてもよい。これらの抽出物や、その精製物、分画物は、これらから溶媒を除去することによって乾固物とすることもでき、さらに、アルコールなどの溶媒に可溶化した形態、或いは乳剤の形態で用いることができる。
【００２３】
本発明により、ハナワラビ属に属する植物の抽出物を配合することにより、優れた効果を有する細胞賦活剤、抗酸化剤、メラニン産生抑制剤、老化防止効果および美白効果に優れた皮膚外用剤を提供することができる。
【００２４】
本発明にかかる植物抽出物の皮膚外用剤への配合量としては、乾燥物として一般的に０．０００１重量％〜１０．０重量％であり、好ましくは、０．００１重量％〜５．０重量％、さらに好ましくは、０．００１重量％〜１．０重量％である。
【００２５】
本発明の植物抽出物を有効成分として使用する場合、洗浄剤、クリーム、軟膏、ローション、乳液、固形状、散剤など任意の剤型とすることができる。その際、本発明の効果を損なわない範囲内で、油性成分、界面活性剤、保湿剤、顔料、紫外線吸収剤、本発明以外の抗酸化剤、香料、防菌防黴剤等の一般的な医薬品及び化粧料用原料や、本発明以外の細胞賦活剤、抗炎症剤、本発明以外の美白剤等の生理活性成分をも含有させることができる。
【００２６】
【実施例】
以下に、本発明にかかる植物抽出物の製造の実施例、皮膚外用剤としての実施例、および試験例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術範囲はこれによって何ら限定されるものではない。
【００２７】
はじめに、本発明で用いたハナワラビ属植物抽出物の調製方法を例示する。また、表１に、本発明で用いることのできるハナワラビ属植物の具体例と、抽出物の製造の実施例を、その使用部位および抽出方法とともに示す。
【００２８】
＜抽出方法１＞
乾燥・粉砕したハナワラビ属植物を、１０重量倍量の５０重量％エタノール水溶液に７日間室温にて浸漬した。これをろ過し、ナツノハナワラビ属植物抽出物を得る。
【００２９】
＜抽出方法２＞
乾燥・粉砕したハナワラビ属植物を、１０重量倍量の５０重量％１，３−ブチレングリコール水溶液に７日間室温にて浸漬した。これを、ろ過し、ハナワラビ属植物抽出物を得る。
【００３０】
＜抽出方法３＞
乾燥・粉砕したハナワラビ属植物を、超臨界抽出装置を用いて、加圧条件下二酸化炭素を溶媒に抽出した。これを減圧し、ハナワラビ属植物抽出物を得る。
【００３１】
【表１】
【００３２】
表１に基づいて得られた実施例１から実施例９のハナワラビ属植物の抽出物を用いて本発明にかかる皮膚外用剤の有効性について実施した試験の内容とその結果を以下に述べる。
【００３３】
＜細胞賦活効果の評価１＞
正常ヒト真皮線維芽細胞を１穴あたり２．０×１０４個となるように９６穴プレートに播種した。播種培地は５％牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加した市販培地であるダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（日研生物医学研究所製）を用いた。２４時間培養後、任意の濃度のハナワラビ属植物抽出物（実施例５）を添加した１重量％ＦＢＳ添加Ｄ−ＭＥＭ培地に交換し、さらに４８時間培養を行った。その後、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を４００μｇ／ｍＬ添加したＤ−ＭＥＭ培地に交換して２時間培養し、テトラゾリウム環の開環により生じるフォルマザンを２−プロパノールにて抽出し、５５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーにて測定した。同時に、濁度として６５０ｎｍにおける吸光度を測定し，両測定値の差により真皮線維芽細胞賦活作用を評価した。評価ではサンプル培養液の他にネガティブコントロールとして、１重量％ＦＢＳ添加Ｄ−ＭＥＭ培地を、ポジティブコントロールとして５重量％ＦＢＳ添加Ｄ−ＭＥＭ培地を用いた。評価はコントロールにおける細胞賦活作用を１００としたときの相対値を求めて行った。その結果を表２に示す。なお、実施例５の抽出液の溶媒は減圧下留去して、試験に供した。
【００３４】
【表２】
【００３５】
表２より明らかなように、コントロールに対して真皮線維芽細胞に対する賦活効果が有意に向上することが明らかとなった。実施例５の乾燥残分の添加濃度がそれぞれ７．８μｇ／ｍＬ以上で危険率５％、３１．３μｇ／ｍＬ以上の濃度で危険率が１％で、コントロールに対して有意に真皮線維芽細胞の賦活効果が認められた。
【００３６】
＜細胞賦活の効果の評価２＞
正常ヒト表皮ケラチノサイトを１穴あたり２．０×１０４個となるように９６穴プレートに播種した。播種培地は市販培地のＫＧ−２（クラボウ製）を用いた。２４時間培養後、任意の濃度のハナワラビ属植物抽出物（実施例５）（溶媒は減圧下留去したもの）を添加したＫＧ−２培地に交換し、さらに２４時間培養を行った。その後、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を１００μｇ／ｍＬ添加したＫＧ−２培地に交換して２時間培養し、テトラゾリウム環の開環により生じるフォルマザンを２−プロパノールにて抽出し、５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に、濁度として６５０ｎｍにおける吸光度を測定し，両測定値の差により表皮細胞賦活作用を評価した。その結果をハナワラビ属植物抽出物（実施例５）が無添加の場合の表皮細胞賦活作用を１００とした相対値として表３に示す。
【００３７】
【表３】
【００３８】
表３より明らかなように、２００μｇ／ｍＬの濃度でハナワラビ属植物抽出物（製造例５）の乾燥残分を添加した場合、無添加と比較して危険率１％で有意に表皮細胞賦活作用が向上することが認められた。
【００３９】
＜抗酸化効果の評価＞
０．１０重量％の濃度に希釈したハナワラビ属植物（実施例５）の乾燥残分の５０重量％エタノール溶液を９６穴プレートに１００μＬ添加した。次に０．２ｍＭの安定ラジカルである１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）エタノール溶液を、９６穴マイクロプレートに１００μＬ添加した。室温、暗所にて２４時間放置後、ＤＰＰＨラジカルに由来する波長５１６ｎｍの光の吸光度を測定した。サンプルが無添加の場合の吸光度を（Ａ）、サンプルを添加したときの吸光度を（Ｂ）としたとき、ラジカル消去率は次の式（１）で表すことができる。その結果は、表４に示す。
ラジカル消去率＝［１−（Ｂ）／（Ａ）］×１００ 式（１）
【００４０】
【表４】
【００４１】
表４より明らかなように、ハナワラビ属植物抽出物（実施例５）の乾燥残分を１．００重量％の濃度で添加した場合、ＤＰＰＨラジカルの消去率は９０％を上回った。このことから、ハナワラビ属植物の成分の優れた抗酸化効果が明らかとなった。
【００４２】
＜メラニン産生抑制効果の評価＞
Ｂ１６マウスＦ０ストレイン（Ｂ１６Ｆ０）細胞を９０ｍｍディッシュに１ディッシュあたり１５０００個にて播種した。２４時間後、ハナワラビ属植物抽出物（実施例５）の乾燥残分を任意の濃度となるように添加した５重量％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）添加ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）に交換した。７日間培養静置後、０．２５％トリプシンにて細胞を収獲し、１．５ｍＬマイクロチューブに移して遠心操作して細胞沈殿物を得た。最後に沈殿物の色を表５に示す判定表を基に肉眼判定した。
【００４３】
さらに、試験サンプルの変わりに、５重量％ＦＣＳ添加Ｄ−ＭＥＭ培地を用いたものをコントロールとし、試験の妥当性を確認するために５０ｍＭの乳酸ナトリウムと５重量％のＦＣＳを添加したＤ−ＭＥＭ培地を用いたものをポジティブコントロールとし、それぞれについても判定を行った。肉眼判定は表５に示す通り、５段階評価を実施した。評価結果を表６に示す。
【００４４】
【表５】
【００４５】
【表６】
【００４６】
表６より明らかなように、ハナワラビ属植物（実施例５）の乾燥残分を２０μｇ／ｍＬ以上の濃度で添加した培地を用いた場合、メラニン産生抑制効果が認められ、特に、添加濃度が１００μｇ／ｍＬの培地を用いた場合にはその効果は顕著であり、Ｂ１６マウスＦ０ストレイン（Ｂ１６Ｆ０）細胞の黒化は認められなかった。このことから、ハナワラビ属植物の成分の優れたメラニン産生抑制効果が明らかとなった。
【００４７】
以下、処方例を示すが、製法は常法により製造したものでよく、各処方におけるハナワラビ属植物抽出物とは上述の実施例１から実施例９に該当する成分であり、５０重量％エタノールおよび５０重量％１，３−ブチレングリコールにて抽出される成分に関しては溶媒は留去せずに用いた。
【００４８】
＜シワ、タルミ、ハリの改善効果＞
次に示す乳液の処方例１に、下表７に示すハナワラビ属植物より得られる成分を配合し、それぞれ実施例１０から実施例１４および比較例１として行なった試験について以下に説明する。試験は、シワ、タルミの形成、ハリの低下が顕著に認められる４０歳代から６０歳代の女性パネラー２０名を一群とし、各群に実施例及び比較例のそれぞれを１日２回、２ヶ月間連続で使用させて評価した。シワの程度については、肉眼観察及び写真撮影により評価し、タルミ及びハリについては肉眼観察及び手で触れることにより評価し、それぞれ使用試験開始前及び終了後の状態を比較し、「改善」、「やや改善」、「変化なし」の３段階で評価した。結果は、各評価を得たパネラー数にて表８に示した。
【００４９】
＜処方例１＞ 乳液
（１）ジステアリン酸ポリグリセリル ２．５０（重量％）
（２）トリ−２−エチルヘキサン酸グリセリル ８．００
（３）水素添加大豆リン脂質 ０．５０
（４）親油型モノステアリン酸グリセリン ０．５０
（５）ベヘニルアルコール ０．５０
（６）ハナワラビ属植物抽出物 表７に示した量
（７）グリセリン ７．５０
（８）精製水 １００とする残部
（９）キサンタンガム（１重量％水溶液） ４０．００
（１０）エタノール ８．００
製法：（１）〜（５）及び（６）〜（９）の成分をそれぞれ７０℃に加熱し混合、溶解した後、両成分を混合してホモミキサーで乳化する。撹拌しながら冷却し、４０℃で（１０）の成分を添加し、混合、均一化する。
【００５０】
【表７】
【００５１】
【表８】
【００５２】
表８より明らかなように、本発明の実施例使用群では、シワ、タルミ及びハリについてほとんどのパネラーで「やや改善」以上の改善効果が見られた。その割合は、シワについては９０％以上、タルミとハリに関しては８５％以上であり、比較例使用群のそれ（シワ／３０％、タルミ／４０％、ハリ／２０％）よりも顕著であった。なお、上記の使用期間において、いずれの実施例を使用した群においても、痛み，痒み等の皮膚刺激感やアレルギー反応などの皮膚症状を訴えたパネラーはいなかった。また乳化状態の悪化や配合成分の沈降、変質なども認められなかった。
【００５３】
＜美白効果＞
次に示すクリームの処方例２に、表９に示したハナワラビ属植物より得られる成分を配合し、それぞれ実施例１５から実施例１９および比較例２として、色素沈着症状の改善効果を評価した。色素沈着症状の改善効果は、顕著なシミ、ソバカス等の色素沈着症状を有する成人女性パネラー２０名を一群とし、各群に実施例１５から実施例１９及び比較例２をそれぞれブラインドにて１日２回、３ヶ月間連続で使用させ、３ヶ月後の皮膚の色素沈着の状態を観察して使用前と比較して評価した。色素沈着の状態は、表１０に示す判定基準に従って評価した。２０名の平均値を算出した結果を表１１に示した。
【００５４】
＜処方例２＞ クリーム
（１）スクワラン １０．００（重量％）
（２）ミリスチン酸オクチルドデシル ５．００
（３）水素添加大豆リン脂質 ０．２０
（４）バチルアルコール ３．００
（５）硬化油 ２．００
（６）ステアリン酸 １．５０
（７）親油型モノステアリン酸グリセリン １．５０
（８）モノステアリン酸ポリグリセリル １．５０
（９）ベヘニルアルコール ０．８０
（１０）モノミリスチン酸ポリグリセリル ０．７０
（１１）サラシミツロウ ０．３０
（１２）混合脂肪酸トリグリセリド ０．１０
（１３）ｄ−δ−トコフェロール ０．０５
（１４）ハナワラビ属植物抽出物 表９に示した量
（１５）精製水 １００とする残部
（１６）キサンタンガム（１重量％水溶液） ２０．００
（１７）１，３−ブチレングリコール １５．００
（１８）パラオキシ安息香酸エステル ０．１０
（１９）水酸化ナトリウム（１０重量％水溶液） ２．００
（２０）エタノール ２．００
製法：（１）〜（１４）の油相成分及び（１５）〜（１８）の水相成分をそれぞれ８０℃に加熱し、混合均一化した後、水相に油相を添加する。（１９）を加えてホモミキサーにて乳化する。撹拌しながら冷却し、４０℃で（２０）を添加し、撹拌、均一化する。
【００５５】
【表９】
【００５６】
【表１０】
【００５７】
【表１１】
【００５８】
表１１において明らかなように、ハナワラビ属植物より得られる成分を配合した実施例１５から実施例１９を使用した群では、使用試験終了後の色素沈着症状は軽度と評価される程度にまで改善され、明確な色素沈着症状の改善が認められた。これに対し、各種ハナワラビ属植物より得られる成分を精製水に代替した比較例２使用群では色素沈着症状の改善は認められなかった。なお、上記の使用期間において、いずれの実施例を使用した群においても、痛み，痒み等の皮膚刺激感やアレルギー反応などの皮膚症状を訴えたパネラーはいなかった。また乳化状態の悪化や配合成分の変質なども認められなかった。
【００５９】
以下に、本発明にかかるその他の皮膚外用剤の実施例を示す。
【００６０】
＜実施例２０＞ ジェル状化粧水
（１）精製水 １００とする残部（重量％）
（２）ハナワラビ属植物抽出物（製造例６） ６．００
（３）エタノール ８．００
（４）パラオキシ安息香酸メチル ０．０５
（５）カルボキシビニルポリマー（１重量％水溶液） ２０．００
（６）キサンタンガム（１重量％水溶液） ５．００
（７）１，３−ブチレングリコール ３．００
（８）濃グリセリン ６．００
（９）Ｌ−アルギニン（１０重量％水溶液） ４．００
製法：（１）に予め混合しておいた成分（２）〜（４）を加え、（５）〜（９）の成分を順次添加して、混合、溶解、均一化する。
【００６１】
＜実施例２１＞ クレンジングクリーム
（１）ステアリン酸 ２．００（重量％）
（２）セタノール ３．００
（３）ワセリン １０．００
（４）スクワラン ３８．００
（５）ミリスチン酸イソプロピル １０．００
（６）酢酸トコフェロール ０．１０
（７）グリセリルモノステアリン酸エステル ２．５０
（８）モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．） ２．５０
（９）プロピレングリコール ５．００
（１０）パラオキシ安息香酸メチル ０．１０
（１１）精製水 １００とする残部
（１２）水酸化カリウム（１０重量％水溶液） ２．００
（１３）香料 ０．１０
（１４）ハナワラビ属植物抽出物（製造例１） ３．００
製法：（１）〜（８）の油相成分を混合，加熱溶解して７０℃とする。一方（９）〜（１１）の水相成分を混合、溶解して７０℃に加熱する。この水相成分に前記油相成分を徐々に添加した後、（１２）を添加しホモミキサーにて均一に乳化する。乳化後、４０℃まで冷却した後、（１３）および（１４）を添加し混合する。
【００６２】
＜実施例２２＞ Ｗ／Ｏ乳化型クリーム
（１）スクワラン １５．００（重量％）
（２）デカメチルシクロペンタシロキサン １５．００
（３）架橋型メチルポリシロキサン １．００
（４）ジメチコンコポリオール ３．００
（５）クオタニウム−１８ヘクトライト １．００
（６）ハナワラビ属植物抽出物（製造例９） １０．００
（７）１，３−ブチレングリコール ３．００
（８）パラオキシ安息香酸メチル ０．２０
（９）精製水 １００とする残部
（１０）香料 ０．１０
製法：（１）〜（５）を混合した油相に、（６）〜（９）の水相を攪拌しながら徐々に添加しホモミキサーにて乳化する。乳化後、（１０）を添加し混合する。
【００６３】
＜実施例２３＞ クレンジングジェル
（１）濃グリセリン １５．００（重量％）
（２）１，３−ブチレングリコール １０．００
（３）無水ケイ酸 ７．００
（４）ポリオキシエチレンラウリルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ５．００
（５）ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（５０Ｅ．Ｏ．） ２．５０
（６）ジエチレングリコールモノエチルエーテル ５．００
（７）カルボキシビニルポリマー（１重量％水溶液） ５０．００
（８）水酸化カリウム（１０重量％水溶液） ４．５０
（９）ハナワラビ属植物抽出物（製造例４） ０．１５
（１０）香料 ０．１０
（１１）精製水 １００とする残部
製法：（３）、（７）を（１１）に添加し均質とした後、（１）及び（２）に（４）〜（６）を溶解させて加え、７０℃に加熱して均一に溶解させる。次いで冷却して４０℃にて（９）、（１０）を添加し、最後に（８）を加えて中和する。
【００６４】
＜実施例２４＞ 洗顔料
（１）ステアリン酸 １０．００（重量％）
（２）パルミチン酸 １０．００
（３）ミリスチン酸 １２．００
（４）ラウリン酸 ４．００
（５）オレイルアルコール １．５０
（６）ラノリンアルコール １．００
（７）水酸化カリウム ６．００
（８）精製水 １００とする残部
（９）濃グリセリン ２０．００
（１０）パラオキシ安息香酸メチル ０．２０
（１１）ハナワラビ属植物抽出物（製造例５） ３．００
（１２）香料 ０．１０
製法：（１）〜（６）の油相及び（７）〜（１０）の水相をそれぞれ混合し、７５℃まで加熱溶解した後、油相に水相を加えてケン化する。冷却後４０℃で（１１）および（１２）を添加して混合する。
【００６５】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明にかかるナツノハナワラビ属（Ｂｏｔｒｙｐｕｓ）、ヒメハナワラビ属（Ｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ）、オオハナワラビ属（Ｓｃｅｐｔｒｉｄｉｕｍ）、アリサンハナワラビ属（Ｊａｐａｎｏｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ）、ミヤコジマハナワラビ属（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｔａｃｈｙｓ）に属する植物の抽出物は優れた細胞賦活効果、抗酸化効果、メラニン産生抑制効果を有し、これを有効成分として配合することで、効果に秀でた細胞賦活剤、抗酸化剤、メラニン産生抑制剤、老化防止用皮膚外用剤、美白用皮膚外用剤を提供することができる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞賦活剤、抗酸化剤、メラニン産生抑制剤、及び老化防止効果と美白効果に優れた皮膚外用剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、皮膚の美観を保つことに対する女性の関心は非常に高く、シワ、シミ、タルミなどは女性の肌に対する悩みの上位に常に位置する。これらの悩みのうち、シワやタルミは、加齢等による真皮線維芽細胞の機能低下や、それに伴うコラーゲンやエラスチン等の真皮マトリックスの減少や変性、さらには紫外線等の外来ストレスによる酸化障害などが重要な要因となっている。また、もう一方の大きな悩みである、皮膚の色黒は一部不明な点もあるがホルモンの異常や日光の紫外線の刺激によるメラニン色素の産生が原因であり、その中でも、シミやソバカスはメラニン色素が異常沈着することが、その要因である。これまでの皮膚外用剤の分野では、上述の皮膚の美観を損なうような諸症状を防止、或いは改善するために、さまざまな細胞賦活剤や抗酸化剤及びメラニン産生抑制剤の検索及び配合検討が成されてきた。
【０００３】
例えば、細胞賦活剤としては、ポンカンのエッセンス（特開２００１−１３１０４５）、ツリガネニンジン属、クサギ及びそれらの抽出物（特開２０００−１７８１９８）、有機溶媒によるクロレラ抽出物（特開平１１−３３５２９３）等、抗酸化剤としては、キク科ヘテロテカ属植物抽出物（特開平１１−１８０８８６）やカユンアンギンの抽出物（特開平１０−１８２４１３）等、さらにメラニン産生抑制剤としては、ホンダワラの抽出物（特開平１０−３３０２２０）、ショウガ属植物の抽出物（特開２０００−１５９６２６）等が知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、既に報告されている上記の有効成分を含有する皮膚外用剤はいずれにおいてもその老化防止効果、美白効果は必ずしも十分ではなく、より優れた有効成分の開発が求められていた。本発明は、上記事情に鑑みてなされたものである。すなわち、優れた効果を有する細胞賦活剤、抗酸化剤、メラニン産生抑制剤を見出し、老化防止効果および美白効果に優れた皮膚外用剤を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、老化防止効果および美白効果に優れた有効成分を見出すために、様々な物質について細胞賦活効果、抗酸化効果、メラニン産生抑制効果に関する検討を鋭意加えた結果、ナツノハナワラビ属（Ｂｏｔｒｙｐｕｓ）、ヒメハナワラビ属（Ｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ）、オオハナワラビ属（Ｓｃｅｐｔｒｉｄｉｕｍ）、アリサンハナワラビ属（Ｊａｐａｎｏｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ）、ミヤコジマハナワラビ属（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｔａｃｈｙｓ）に属する植物の抽出物が、優れた細胞賦活効果、抗酸化効果及びメラニン産生抑制効果に優れていることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、ナツノハナワラビ属（Ｂｏｔｒｙｐｕｓ）、ヒメハナワラビ属（Ｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ）、オオハナワラビ属（Ｓｃｅｐｔｒｉｄｉｕｍ）、アリサンハナワラビ属（Ｊａｐａｎｏｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ）、ミヤコジマハナワラビ属（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｔａｃｈｙｓ）に属する植物の抽出物を含有する細胞賦活剤、抗酸化剤、メラニン産生抑制剤、及び老化防止用皮膚外用剤さらには美白用皮膚外用剤を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【０００８】
本発明にかかるナツノハナワラビ属（Ｂｏｔｒｙｐｕｓ）、ヒメハナワラビ属（Ｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ）、オオハナワラビ属（Ｓｃｅｐｔｒｉｄｉｕｍ）、アリサンハナワラビ属（Ｊａｐａｎｏｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ）、ミヤコジマハナワラビ属（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｔａｃｈｙｓ）は、真嚢シダ類であるハナヤスリ科（Ｏｐｈｉｏｇｌｏｓｓａｃｅａｅ）に属し、ハナヤスリ属（Ｏｐｈｉｏｇｌｏｓｓｕｍ）を加えて計６属に分類される。この６属のうち、本発明にかかる前５属は、ハナワラビ属（Ｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ）として、まとめて分類される場合もある。なお、ハナヤスリ科の名称の由来は、胞子葉の形が鑢に似て垂直に立ち、一見すると花に見えることにちなむ。
【０００９】
ナツノハナワラビ属は、ナツノハナワラビ（Ｂｏｔｒｙｐｕｓ ｖｉｒｇｉｎｉａｎｕｓ）、ナガホノナツノハナワラビ（Ｂ． ｓｔｒｉｃｔｕｓ）など３種からなり、主に温帯域に分布する。中でも、ナツノハナワラビの根つきの全草は、「シュンフケン（春不見）」と呼ばれる生薬のひとつで、煎じて飲用されたり、つぶして外用されていが、その抽出物を皮膚外用剤に配合することは知られていなかった。
【００１０】
ヒメハナワラビ属は、ボトリキウム・パラドクスム（Ｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ ｐａｒａｄｏｘｕｍ）、ヒメハナワラビ（Ｂ． ｌｕｎａｒｉａ）など、約２０種類の種からなり、北半球の周極地方、北アメリカ、および温帯の高山域に分布する。
【００１１】
オオハナワラビ属は、アカハナワラビ（Ｓｃｅｐｔｒｉｄｉｕｍ ｎｉｐｐｏ ｎｉｃｕｍ）、オオハナワラビ（Ｓ． ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、フユノハナワラビ（Ｓ． ｔｅｒｎａｔｕｍ）等の約２０種類の種からなり、亜寒帯から亜熱帯に分布し、日当たりの良い草原から薄暗い照葉樹林の林床まで多様な環境に生育する。また、このフユノハナワラビの根つきの全草は、「インジケツ（陰地蕨）」と呼ばれる生薬のひとつで、煎じて飲用されたり、つぶして外用されている。さらに、同植物を入浴剤として使用することが、特開平２−２３７９３２に記載されているが、その抽出物を皮膚外用剤に配合することに関しては、これまで全く知られていなかった。
【００１２】
アリサンハナワラビ属は、アリサンハナワラビ（Ｊａｐａｎｏｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ ｌａｎｇｉｎｏｓｕｍ）等、６種が知られており、そのうち５種までが東南アジアと西太平洋の島嶼に分布し、１種だけがアフリカ中部に隔離分布する。中でもアリサンハナワラビは、ハナヤスリ科の中では唯一、地上のみならず樹上でも生育できることで知られている。また、このアリサンハナワラビの根つきの全草は、「ドッケツキ（独蕨箕）」と呼ばれる生薬のひとつで、煎じて飲用されたり、つぶして外用されているが、その抽出物を皮膚外用剤に配合することは知られていなかった。
【００１３】
ミヤコジマハナワラビ属は、ミヤコジマハナワラビ（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｔａｃｈｙｓ ｚｅｙｌａｎｉｃａ）の１種のみからなる単型属であり、日本の西南諸島を北限とし、東南アジア、オセアニアに分布する。
【００１４】
以下、本発明の明細書中においては、本発明にかかるナツノハナワラビ属、ヒメハナワラビ属、オオハナワラビ属、アリサンハナワラビ属、ミヤコジマハナワラビ属の５属をまとめて、「ハナワラビ属」の名称を採用し、詳細な説明に使用する。
【００１５】
本発明にかかる植物の抽出物は、ハナワラビ属植物の胞子、胞子嚢穂、葉、茎、根等の何れの部分を用いて抽出しても良く、さらにはその全草を用いて抽出しても良い。また、その抽出方法は常法であればよく、各部位を生のまま、或いは乾燥・粉砕後に、各種溶媒により抽出することができる。
【００１６】
本発明において使用する植物抽出物を調製する方法について、さらに述べるが、これらの抽出溶媒および抽出方法に限定されるものではない。抽出溶媒としては、水、エタノール、メタノール、イソプロパノール、イソブタノール、ｎ−ヘキサノール、メチルアミルアルコール、２−エチルブタノール、ｎ−オクチルアルコールなどのアルコール類、グリセリン、エチレングリコール、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコール、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、トリエチレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ヘキシレングリコール等の多価アルコール又はその誘導体、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、メチル−ｎ−プロピルケトンなどのケトン類、酢酸エチル、酢酸イソプロピルなどのエステル類、エチルエーテル、イソプロピルエーテル、ｎ−ブチルエーテル等のエーテル類などの極性溶媒から選択される１種又は２種以上の混合溶媒が好適に使用でき、また、リン酸緩衝生理食塩水や尿素水溶液を用いることができる。
【００１７】
なお、上記溶媒のうち、水、アルコール及び多価アルコール又はその誘導体類（エタノール、メタノール、イソプロパノール、イソブタノール、ｎ−ヘキサノール、メチルアミルアルコール、２−エチルブタノール、ｎ−オクチルアルコール、グリセリン、エチレングリコール、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコール、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、トリエチレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ヘキシレングリコール等）およびそれらの混合溶媒については、その溶媒を留去せずに抽出物として構わない。
【００１８】
或いは、石油エーテル、ｎ−ヘキサン、ｎ−ペンタン、ｎ−ブタン、ｎ−オクタン、シクロヘキサン、流動パラフィン、スクワラン等の炭化水素類、四塩化炭素、クロロホルム、ジクロロメタン、トリクロロエチレン、ベンゼン、トルエンなどの低極性もしくは無極性溶媒から選択される１種又は２種以上の混合溶媒も好適に使用することもできる。
【００１９】
なお、これらの低極性、無極性の溶媒のうち流動パラフィンやスクワランなどに関しては、その溶媒を留去せずに抽出物として構わない。
【００２０】
さらには、水や二酸化炭素、エチレン、プロピレン、エタノール、メタノール、アンモニアなどの１種または２種以上の超臨界流体や亜臨界流体も用いることもできる。
【００２１】
抽出方法としては、常圧、若しくは加圧，減圧下で、室温、冷却又は加熱した状態で含浸させて抽出する方法、水蒸気蒸留などの蒸留法を用いて抽出する方法、本発明にかかる植物を圧搾して抽出物を得る圧搾法などが例示され、これらの方法を単独で、又は２種以上を組み合わせて抽出を行うこともできる。
【００２２】
このようにして得られた植物抽出物は、抽出物をそのまま用いることもできるが、その効果を失わない範囲で、脱臭、脱色、濃縮などの精製操作を加えたり、さらにはカラムクロマトグラフィーなどを用いて分画物として用いてもよい。これらの抽出物や、その精製物、分画物は、これらから溶媒を除去することによって乾固物とすることもでき、さらに、アルコールなどの溶媒に可溶化した形態、或いは乳剤の形態で用いることができる。
【００２３】
本発明により、ハナワラビ属に属する植物の抽出物を配合することにより、優れた効果を有する細胞賦活剤、抗酸化剤、メラニン産生抑制剤、老化防止効果および美白効果に優れた皮膚外用剤を提供することができる。
【００２４】
本発明にかかる植物抽出物の皮膚外用剤への配合量としては、乾燥物として一般的に０．０００１重量％〜１０．０重量％であり、好ましくは、０．００１重量％〜５．０重量％、さらに好ましくは、０．００１重量％〜１．０重量％である。
【００２５】
本発明の植物抽出物を有効成分として使用する場合、洗浄剤、クリーム、軟膏、ローション、乳液、固形状、散剤など任意の剤型とすることができる。その際、本発明の効果を損なわない範囲内で、油性成分、界面活性剤、保湿剤、顔料、紫外線吸収剤、本発明以外の抗酸化剤、香料、防菌防黴剤等の一般的な医薬品及び化粧料用原料や、本発明以外の細胞賦活剤、抗炎症剤、本発明以外の美白剤等の生理活性成分をも含有させることができる。
【００２６】
【実施例】
以下に、本発明にかかる植物抽出物の製造の実施例、皮膚外用剤としての実施例、および試験例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術範囲はこれによって何ら限定されるものではない。
【００２７】
はじめに、本発明で用いたハナワラビ属植物抽出物の調製方法を例示する。また、表１に、本発明で用いることのできるハナワラビ属植物の具体例と、抽出物の製造の実施例を、その使用部位および抽出方法とともに示す。
【００２８】
＜抽出方法１＞
乾燥・粉砕したハナワラビ属植物を、１０重量倍量の５０重量％エタノール水溶液に７日間室温にて浸漬した。これをろ過し、ナツノハナワラビ属植物抽出物を得る。
【００２９】
＜抽出方法２＞
乾燥・粉砕したハナワラビ属植物を、１０重量倍量の５０重量％１，３−ブチレングリコール水溶液に７日間室温にて浸漬した。これを、ろ過し、ハナワラビ属植物抽出物を得る。
【００３０】
＜抽出方法３＞
乾燥・粉砕したハナワラビ属植物を、超臨界抽出装置を用いて、加圧条件下二酸化炭素を溶媒に抽出した。これを減圧し、ハナワラビ属植物抽出物を得る。
【００３１】
【表１】
表１に基づいて得られた実施例１から実施例９のハナワラビ属植物の抽出物を用いて本発明にかかる皮膚外用剤の有効性について実施した試験の内容とその結果を以下に述べる。
【００３３】
＜細胞賦活効果の評価１＞
正常ヒト真皮線維芽細胞を１穴あたり２．０×１０４個となるように９６穴プレートに播種した。播種培地は５％牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加した市販培地であるダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（日研生物医学研究所製）を用いた。２４時間培養後、任意の濃度のハナワラビ属植物抽出物（実施例５）を添加した１重量％ＦＢＳ添加Ｄ−ＭＥＭ培地に交換し、さらに４８時間培養を行った。その後、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を４００μｇ／ｍＬ添加したＤ−ＭＥＭ培地に交換して２時間培養し、テトラゾリウム環の開環により生じるフォルマザンを２−プロパノールにて抽出し、５５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーにて測定した。同時に、濁度として６５０ｎｍにおける吸光度を測定し，両測定値の差により真皮線維芽細胞賦活作用を評価した。評価ではサンプル培養液の他にネガティブコントロールとして、１重量％ＦＢＳ添加Ｄ−ＭＥＭ培地を、ポジティブコントロールとして５重量％ＦＢＳ添加Ｄ−ＭＥＭ培地を用いた。評価はコントロールにおける細胞賦活作用を１００としたときの相対値を求めて行った。その結果を表２に示す。なお、実施例５の抽出液の溶媒は減圧下留去して、試験に供した。
【００３４】
【表２】
表２より明らかなように、コントロールに対して真皮線維芽細胞に対する賦活効果が有意に向上することが明らかとなった。実施例５の乾燥残分の添加濃度がそれぞれ７．８μｇ／ｍＬ以上で危険率５％、３１．３μｇ／ｍＬ以上の濃度で危険率が１％で、コントロールに対して有意に真皮線維芽細胞の賦活効果が認められた。
【００３６】
＜細胞賦活の効果の評価２＞
正常ヒト表皮ケラチノサイトを１穴あたり２．０×１０４個となるように９６穴プレートに播種した。播種培地は市販培地のＫＧ−２（クラボウ製）を用いた。２４時間培養後、任意の濃度のハナワラビ属植物抽出物（実施例５）（溶媒は減圧下留去したもの）を添加したＫＧ−２培地に交換し、さらに２４時間培養を行った。その後、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を１００μｇ／ｍＬ添加したＫＧ−２培地に交換して２時間培養し、テトラゾリウム環の開環により生じるフォルマザンを２−プロパノールにて抽出し、５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に、濁度として６５０ｎｍにおける吸光度を測定し，両測定値の差により表皮細胞賦活作用を評価した。その結果をハナワラビ属植物抽出物（実施例５）が無添加の場合の表皮細胞賦活作用を１００とした相対値として表３に示す。
【００３７】
【表３】
表３より明らかなように、２００μｇ／ｍＬの濃度でハナワラビ属植物抽出物（製造例５）の乾燥残分を添加した場合、無添加と比較して危険率１％で有意に表皮細胞賦活作用が向上することが認められた。
【００３９】
＜抗酸化効果の評価＞
０．１０重量％の濃度に希釈したハナワラビ属植物（実施例５）の乾燥残分の５０重量％エタノール溶液を９６穴プレートに１００μＬ添加した。次に０．２ｍＭの安定ラジカルである１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）エタノール溶液を、９６穴マイクロプレートに１００μＬ添加した。室温、暗所にて２４時間放置後、ＤＰＰＨラジカルに由来する波長５１６ｎｍの光の吸光度を測定した。サンプルが無添加の場合の吸光度を（Ａ）、サンプルを添加したときの吸光度を（Ｂ）としたとき、ラジカル消去率は次の式（１）で表すことができる。その結果は、表４に示す。
ラジカル消去率＝［１−（Ｂ）／（Ａ）］×１００ 式（１）
【００４０】
【表４】
表４より明らかなように、ハナワラビ属植物抽出物（実施例５）の乾燥残分を１．００重量％の濃度で添加した場合、ＤＰＰＨラジカルの消去率は９０％を上回った。このことから、ハナワラビ属植物の成分の優れた抗酸化効果が明らかとなった。
【００４２】
＜メラニン産生抑制効果の評価＞
Ｂ１６マウスＦ０ストレイン（Ｂ１６Ｆ０）細胞を９０ｍｍディッシュに１ディッシュあたり１５０００個にて播種した。２４時間後、ハナワラビ属植物抽出物（実施例５）の乾燥残分を任意の濃度となるように添加した５重量％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）添加ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）に交換した。７日間培養静置後、０．２５％トリプシンにて細胞を収獲し、１．５ｍＬマイクロチューブに移して遠心操作して細胞沈殿物を得た。最後に沈殿物の色を表５に示す判定表を基に肉眼判定した。
【００４３】
さらに、試験サンプルの変わりに、５重量％ＦＣＳ添加Ｄ−ＭＥＭ培地を用いたものをコントロールとし、試験の妥当性を確認するために５０ｍＭの乳酸ナトリウムと５重量％のＦＣＳを添加したＤ−ＭＥＭ培地を用いたものをポジティブコントロールとし、それぞれについても判定を行った。肉眼判定は表５に示す通り、５段階評価を実施した。評価結果を表６に示す。
【００４４】
【表５】
【表６】
表６より明らかなように、ハナワラビ属植物（実施例５）の乾燥残分を２０μｇ／ｍＬ以上の濃度で添加した培地を用いた場合、メラニン産生抑制効果が認められ、特に、添加濃度が１００μｇ／ｍＬの培地を用いた場合にはその効果は顕著であり、Ｂ１６マウスＦ０ストレイン（Ｂ１６Ｆ０）細胞の黒化は認められなかった。このことから、ハナワラビ属植物の成分の優れたメラニン産生抑制効果が明らかとなった。
【００４７】
以下、処方例を示すが、製法は常法により製造したものでよく、各処方におけるハナワラビ属植物抽出物とは上述の実施例１から実施例９に該当する成分であり、５０重量％エタノールおよび５０重量％１，３−ブチレングリコールにて抽出される成分に関しては溶媒は留去せずに用いた。
【００４８】
＜シワ、タルミ、ハリの改善効果＞
次に示す乳液の処方例１に、下表７に示すハナワラビ属植物より得られる成分を配合し、それぞれ実施例１０から実施例１４および比較例１として行なった試験について以下に説明する。試験は、シワ、タルミの形成、ハリの低下が顕著に認められる４０歳代から６０歳代の女性パネラー２０名を一群とし、各群に実施例及び比較例のそれぞれを１日２回、２ヶ月間連続で使用させて評価した。シワの程度については、肉眼観察及び写真撮影により評価し、タルミ及びハリについては肉眼観察及び手で触れることにより評価し、それぞれ使用試験開始前及び終了後の状態を比較し、「改善」、「やや改善」、「変化なし」の３段階で評価した。結果は、各評価を得たパネラー数にて表８に示した。
【００４９】
＜処方例１＞ 乳液
（１）ジステアリン酸ポリグリセリル ２．５０（重量％）
（２）トリ−２−エチルヘキサン酸グリセリル ８．００
（３）水素添加大豆リン脂質 ０．５０
（４）親油型モノステアリン酸グリセリン ０．５０
（５）ベヘニルアルコール ０．５０
（６）ハナワラビ属植物抽出物 表７に示した量
（７）グリセリン ７．５０
（８）精製水 １００とする残部
（９）キサンタンガム（１重量％水溶液） ４０．００
（１０）エタノール ８．００
製法：（１）〜（５）及び（６）〜（９）の成分をそれぞれ７０℃に加熱し混合、溶解した後、両成分を混合してホモミキサーで乳化する。撹拌しながら冷却し、４０℃で（１０）の成分を添加し、混合、均一化する。
【００５０】
【表７】
【表８】
表８より明らかなように、本発明の実施例使用群では、シワ、タルミ及びハリについてほとんどのパネラーで「やや改善」以上の改善効果が見られた。その割合は、シワについては９０％以上、タルミとハリに関しては８５％以上であり、比較例使用群のそれ（シワ／３０％、タルミ／４０％、ハリ／２０％）よりも顕著であった。なお、上記の使用期間において、いずれの実施例を使用した群においても、痛み，痒み等の皮膚刺激感やアレルギー反応などの皮膚症状を訴えたパネラーはいなかった。また乳化状態の悪化や配合成分の沈降、変質なども認められなかった。
【００５３】
＜美白効果＞
次に示すクリームの処方例２に、表９に示したハナワラビ属植物より得られる成分を配合し、それぞれ実施例１５から実施例１９および比較例２として、色素沈着症状の改善効果を評価した。色素沈着症状の改善効果は、顕著なシミ、ソバカス等の色素沈着症状を有する成人女性パネラー２０名を一群とし、各群に実施例１５から実施例１９及び比較例２をそれぞれブラインドにて１日２回、３ヶ月間連続で使用させ、３ヶ月後の皮膚の色素沈着の状態を観察して使用前と比較して評価した。色素沈着の状態は、表１０に示す判定基準に従って評価した。２０名の平均値を算出した結果を表１１に示した。
【００５４】
＜処方例２＞ クリーム
（１）スクワラン １０．００（重量％）
（２）ミリスチン酸オクチルドデシル ５．００
（３）水素添加大豆リン脂質 ０．２０
（４）バチルアルコール ３．００
（５）硬化油 ２．００
（６）ステアリン酸 １．５０
（７）親油型モノステアリン酸グリセリン １．５０
（８）モノステアリン酸ポリグリセリル １．５０
（９）ベヘニルアルコール ０．８０
（１０）モノミリスチン酸ポリグリセリル ０．７０
（１１）サラシミツロウ ０．３０
（１２）混合脂肪酸トリグリセリド ０．１０
（１３）ｄ−δ−トコフェロール ０．０５
（１４）ハナワラビ属植物抽出物 表９に示した量
（１５）精製水 １００とする残部
（１６）キサンタンガム（１重量％水溶液） ２０．００
（１７）１，３−ブチレングリコール １５．００
（１８）パラオキシ安息香酸エステル ０．１０
（１９）水酸化ナトリウム（１０重量％水溶液） ２．００
（２０）エタノール ２．００
製法：（１）〜（１４）の油相成分及び（１５）〜（１８）の水相成分をそれぞれ８０℃に加熱し、混合均一化した後、水相に油相を添加する。（１９）を加えてホモミキサーにて乳化する。撹拌しながら冷却し、４０℃で（２０）を添加し、撹拌、均一化する。
【００５５】
【表９】
【表１０】
【表１１】
表１１において明らかなように、ハナワラビ属植物より得られる成分を配合した実施例１５から実施例１９を使用した群では、使用試験終了後の色素沈着症状は軽度と評価される程度にまで改善され、明確な色素沈着症状の改善が認められた。これに対し、各種ハナワラビ属植物より得られる成分を精製水に代替した比較例２使用群では色素沈着症状の改善は認められなかった。なお、上記の使用期間において、いずれの実施例を使用した群においても、痛み，痒み等の皮膚刺激感やアレルギー反応などの皮膚症状を訴えたパネラーはいなかった。また乳化状態の悪化や配合成分の変質なども認められなかった。
【００５９】
以下に、本発明にかかるその他の皮膚外用剤の実施例を示す。
【００６０】
＜実施例２０＞ ジェル状化粧水
（１）精製水 １００とする残部（重量％）
（２）ハナワラビ属植物抽出物（製造例６） ６．００
（３）エタノール ８．００
（４）パラオキシ安息香酸メチル ０．０５
（５）カルボキシビニルポリマー（１重量％水溶液） ２０．００
（６）キサンタンガム（１重量％水溶液） ５．００
（７）１，３−ブチレングリコール ３．００
（８）濃グリセリン ６．００
（９）Ｌ−アルギニン（１０重量％水溶液） ４．００
製法：（１）に予め混合しておいた成分（２）〜（４）を加え、（５）〜（９）の成分を順次添加して、混合、溶解、均一化する。
【００６１】
＜実施例２１＞ クレンジングクリーム
（１）ステアリン酸 ２．００（重量％）
（２）セタノール ３．００
（３）ワセリン １０．００
（４）スクワラン ３８．００
（５）ミリスチン酸イソプロピル １０．００
（６）酢酸トコフェロール ０．１０
（７）グリセリルモノステアリン酸エステル ２．５０
（８）モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．） ２．５０
（９）プロピレングリコール ５．００
（１０）パラオキシ安息香酸メチル ０．１０
（１１）精製水 １００とする残部
（１２）水酸化カリウム（１０重量％水溶液） ２．００
（１３）香料 ０．１０
（１４）ハナワラビ属植物抽出物（製造例１） ３．００
製法：（１）〜（８）の油相成分を混合，加熱溶解して７０℃とする。一方（９）〜（１１）の水相成分を混合、溶解して７０℃に加熱する。この水相成分に前記油相成分を徐々に添加した後、（１２）を添加しホモミキサーにて均一に乳化する。乳化後、４０℃まで冷却した後、（１３）および（１４）を添加し混合する。
【００６２】
＜実施例２２＞ Ｗ／Ｏ乳化型クリーム
（１）スクワラン １５．００（重量％）
（２）デカメチルシクロペンタシロキサン １５．００
（３）架橋型メチルポリシロキサン １．００
（４）ジメチコンコポリオール ３．００
（５）クオタニウム−１８ヘクトライト １．００
（６）ハナワラビ属植物抽出物（製造例９） １０．００
（７）１，３−ブチレングリコール ３．００
（８）パラオキシ安息香酸メチル ０．２０
（９）精製水 １００とする残部
（１０）香料 ０．１０
製法：（１）〜（５）を混合した油相に、（６）〜（９）の水相を攪拌しながら徐々に添加しホモミキサーにて乳化する。乳化後、（１０）を添加し混合する。
【００６３】
＜実施例２３＞ クレンジングジェル
（１）濃グリセリン １５．００（重量％）
（２）１，３−ブチレングリコール １０．００
（３）無水ケイ酸 ７．００
（４）ポリオキシエチレンラウリルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ５．００
（５）ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（５０Ｅ．Ｏ．） ２．５０
（６）ジエチレングリコールモノエチルエーテル ５．００
（７）カルボキシビニルポリマー（１重量％水溶液） ５０．００
（８）水酸化カリウム（１０重量％水溶液） ４．５０
（９）ハナワラビ属植物抽出物（製造例４） ０．１５
（１０）香料 ０．１０
（１１）精製水 １００とする残部
製法：（３）、（７）を（１１）に添加し均質とした後、（１）及び（２）に（４）〜（６）を溶解させて加え、７０℃に加熱して均一に溶解させる。次いで冷却して４０℃にて（９）、（１０）を添加し、最後に（８）を加えて中和する。
【００６４】
＜実施例２４＞ 洗顔料
（１）ステアリン酸 １０．００（重量％）
（２）パルミチン酸 １０．００
（３）ミリスチン酸 １２．００
（４）ラウリン酸 ４．００
（５）オレイルアルコール １．５０
（６）ラノリンアルコール １．００
（７）水酸化カリウム ６．００
（８）精製水 １００とする残部
（９）濃グリセリン ２０．００
（１０）パラオキシ安息香酸メチル ０．２０
（１１）ハナワラビ属植物抽出物（製造例５） ３．００
（１２）香料 ０．１０
製法：（１）〜（６）の油相及び（７）〜（１０）の水相をそれぞれ混合し、７５℃まで加熱溶解した後、油相に水相を加えてケン化する。冷却後４０℃で（１１）および（１２）を添加して混合する。
【００６５】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明にかかるナツノハナワラビ属（Ｂｏｔｒｙｐｕｓ）、ヒメハナワラビ属（Ｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ）、オオハナワラビ属（Ｓｃｅｐｔｒｉｄｉｕｍ）、アリサンハナワラビ属（Ｊａｐａｎｏｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ）、ミヤコジマハナワラビ属（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｔａｃｈｙｓ）に属する植物の抽出物は優れた細胞賦活効果、抗酸化効果、メラニン産生抑制効果を有し、これを有効成分として配合することで、効果に秀でた細胞賦活剤、抗酸化剤、メラニン産生抑制剤、老化防止用皮膚外用剤、美白用皮膚外用剤を提供することができる。
Claims (10)
- ナツノハナワラビ属（Ｂｏｔｒｙｐｕｓ）、ヒメハナワラビ属（Ｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ）、オオハナワラビ属（Ｓｃｅｐｔｒｉｄｉｕｍ）、アリサンハナワラビ属（Ｊａｐａｎｏｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ）、ミヤコジマハナワラビ属（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｔａｃｈｙｓ）に属する植物の抽出物を有効成分として含有する細胞賦活剤。
- ナツノハナワラビ（Ｂｏｔｒｙｐｕｓ ｖｉｒｇｉｎｉａｎｕｓ）の抽出物を有効成分として含有してなる細胞賦活剤。
- ナツノハナワラビ属（Ｂｏｔｒｙｐｕｓ）、ヒメハナワラビ属（Ｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ）、オオハナワラビ属（Ｓｃｅｐｔｒｉｄｉｕｍ）、アリサンハナワラビ属（Ｊａｐａｎｏｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ）、ミヤコジマハナワラビ属（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｔａｃｈｙｓ）に属する植物の抽出物を有効成分として含有する抗酸化剤。
- ナツノハナワラビ（Ｂｏｔｒｙｐｕｓ ｖｉｒｇｉｎｉａｎｕｓ）の抽出物を有効成分として含有してなる抗酸化剤。
- ナツノハナワラビ属（Ｂｏｔｒｙｐｕｓ）、ヒメハナワラビ属（Ｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ）、オオハナワラビ属（Ｓｃｅｐｔｒｉｄｉｕｍ）、アリサンハナワラビ属（Ｊａｐａｎｏｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ）、ミヤコジマハナワラビ属（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｔａｃｈｙｓ）に属する植物の抽出物を有効成分として含有するメラニン産生抑制剤。
- ナツノハナワラビ（Ｂｏｔｒｙｐｕｓ ｖｉｒｇｉｎｉａｎｕｓ）の抽出物を有効成分として含有してなるメラニン産生抑制剤。
- ナツノハナワラビ属（Ｂｏｔｒｙｐｕｓ）、ヒメハナワラビ属（Ｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ）、オオハナワラビ属（Ｓｃｅｐｔｒｉｄｉｕｍ）、アリサンハナワラビ属（Ｊａｐａｎｏｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ）、ミヤコジマハナワラビ属（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｔａｃｈｙｓ）に属する植物の抽出物を有効成分として含有する老化防止用皮膚外用剤。
- ナツノハナワラビ（Ｂｏｔｒｙｐｕｓ ｖｉｒｇｉｎｉａｎｕｓ）の抽出物を有効成分として含有する老化防止用皮膚外用剤。
- ナツノハナワラビ属（Ｂｏｔｒｙｐｕｓ）、ヒメハナワラビ属（Ｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ）、オオハナワラビ属（Ｓｃｅｐｔｒｉｄｉｕｍ）、アリサンハナワラビ属（Ｊａｐａｎｏｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ）、ミヤコジマハナワラビ属（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｔａｃｈｙｓ）に属する植物の抽出物を有効成分として含有する美白用皮膚外用剤。
- ナツノハナワラビ（Ｂｏｔｒｙｐｕｓ ｖｉｒｇｉｎｉａｎｕｓ）の抽出物を有効成分として含有する美白用皮膚外用剤。
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