JP2004026866A - 遺伝子送達用担体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】新規な構造を有する糖含有共重合体、並びに該糖含有共重合体を用いて形成された遺伝子送達用担体。
【選択図】図2
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖を含有する共重合体、並びに該共重合体から形成される遺伝子送達用担体に関する。
【0002】
【従来の技術】
最近注目されている遺伝子治療では、患者の体内から取り出した細胞に培養系で外来遺伝子を導入し、形質転換細胞を増殖させた後に患者に再移植する「Ex vivo遺伝子導入法」が主として実施されている。この場合、患者から単離できる細胞は限られているため、多くの場合末梢血リンパ球が利用されている。しかし、ターゲットとなる細胞は、その対象疾患によって異なり、特に体細胞や臓器組織の細胞をターゲットとする場合には、外来遺伝子をコードするプラスミドDNAを直接生体に投与する必要がある(In vivo遺伝子導入法)。
【0003】
In vivo遺伝子導入法は、多くの研究者によって検討が行われており、遺伝子を効率よく生体内に導入し、安全性が確保できる遺伝子送達用担体の開発が強く望まれている。
【0004】
一方、米国FDAにより認可されている、遺伝子治療プロトコールの85%以上においては、アデノウィルスやレトロウィルスなどが使用されている(Annu.Rev.Microbiol., 49, 807, 1995)。ウィルスによる遺伝子導入効果は極めて高く、有効であるが、米国で実施された遺伝子治療においてはウィルスに対する免疫反応が原因と考えられる事故が起こるなど、ウィルス増殖などの危険性が指摘されていた。
【0005】
そのため、カチオニックリポソーム(Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 84, 7413, 1987)やカチオンポリマー(Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 92, 7297, 1995, Bioconjugate Chem., 6, 7, 1995)などの非ウィルス性担体を遺伝子送達用担体として用いることが検討されてきた。具体的には、従来、ジエチルアミノエチルデキストラン(DEAE−dex)やポリ−L−リジン(PLL)などの直鎖状ポリカチオンが検討されてきた。
【0006】
ポリカチオンの遺伝子導入効率はリポソームより低いが、リポソームに比べて生体内に直接投与したときに肝臓に集積する傾向が少なく、体内動態のコントロールが比較的容易であるという利点がある。しかし、ポリカチオンの一つで、従来、遺伝子送達用担体として精力的に検討されてきたポリ−L−リジンは、近年その遺伝子導入能が極めて低いことが報告された。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規な構造を有する糖含有共重合体、並びに、該糖含有共重合体から形成される遺伝子送達用担体を提供することを主な目的とする。
【0008】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、水溶性で体内動態制御が容易であって、効率的に遺伝子導入を行うことができる高分子化合物について鋭意研究した結果、特定の構造を有する糖含有共重合体から形成される担体が、優れた効果を奏することを見出し、本発明を完成するに至った。
【0009】
即ち、本発明は、以下の事項に係る。
【0010】
項1:下記一般式(I)及び(II)で表される繰り返し単位を有し、(I)と(II)のモル比率が1:9〜9:1であって、且つ、重量平均分子量が1×104〜5×108である糖含有共重合体。
一般式(I):
【0011】
【化3】
【0012】
(式中、nは1〜10を示す。)
一般式(II):
【0013】
【化4】
【0014】
(式中、S(OH)q−1は糖骨格Sとそれに結合するq個の水酸基からなる糖化合物から1個の水酸基を除いた糖残基を示し、mは2〜10を示す。)
項2:(I)と(II)のモル比率が2:8〜3:7である、項1に記載の糖含有共重合体。
【0015】
項3:重量平均分子量が5×106〜2×107である、項1又は2のいずれかに記載の糖含有共重合体。
【0016】
項4:一般式(I)におけるnが3であって、一般式(II)におけるmが4である、項1乃至3のいずれかに記載の糖含有共重合体。
【0017】
項5:項1乃至4のいずれかに記載の糖含有共重合体から形成される遺伝子送達用担体。
【0018】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について具体的に説明する。
【0019】
糖含有共重合体
本発明の糖含有共重合体は一般式(I)及び(II)で表される繰り返し単位を有する。
一般式(I):
【0020】
【化5】
【0021】
(式中、nは1〜10を示す。)
一般式(II):
【0022】
【化6】
【0023】
(式中、S(OH)q−1は、糖骨格Sとそれに結合するq個の水酸基からなる糖化合物から1個の水酸基を除いた糖残基を示し、mは2〜10を示す。)
糖含有共重合体における、一般式(I)及び(II)のモル比率は、1:9〜9:1程度であって、目的に応じて、適宜調整して使用される。
【0024】
特に、一般式(I)及び(II)のモル比率が2:8〜3:7程度であるものが、DNAと複合体を形成し易く、遺伝子の発現効率が高い点で好ましい。
【0025】
一般式(I)におけるnは1〜10、また一般式(II)におけるmは2〜10を示し、所望の性質を有する共重合体を得ることを目的として、適宜設定することができる。
【0026】
特に一般式(I)におけるnが3であって、かつ、一般式(II)におけるmが4である糖含有共重合体が、遺伝子との複合体形成のし易さ及び細胞への取り込み時に糖質の細胞への親和性が高まる点において、好ましい。
【0027】
糖含有共重合体の分子量は、通常、重量平均分子量で1×104〜5×108程度である。特に、5×106〜2×107程度であるものが、遺伝子の発現効率が高い点で好ましい。
【0028】
糖含有共重合体の製造方法
本発明の糖含有共重合体は、一般式(III)で表されるカチオン性単量体と、一般式(IV)で表される糖含有単量体を、重合することによって得ることができる。
一般式(III):
【0029】
【化7】
【0030】
(式中、nは1〜10を示す。)
一般式(IV):
【0031】
【化8】
【0032】
(式中、S(OH)q−1は、糖骨格Sとそれに結合するq個の水酸基からなる糖化合物から1個の水酸基を除いた糖残基を示し、mは2〜10を示す。)
一般式(III)で表されるカチオン性単量体におけるnの値は、目的に応じて適宜設定することができるが、特に、n=3である、ジメチルアミノプロピルアクリルアミドが、製造し易さなどの点から好ましい。
【0033】
また、一般式(IV)で表される糖含有単量体におけるmの値も、目的に応じて適宜設定することができるが、特にm=4であるビニルアジピン酸エステルが、安定性、合成し易さなどの点からみて、好適である。
【0034】
また、一般式(IV)における糖骨格Sを有する糖化合物としては、例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、スクロース、マルトース、デンプン、セルロース等の単糖、小糖、多糖及び多糖の加水分解生成物等の天然糖及び合成糖などが挙げられる。このうち、グルコースが、製造し易さなどの点で好ましい。
【0035】
一般式(III)で表されるカチオン性単量体と、一般式(IV)で表される糖含有単量体を、重合する方法としては、例えば、ラジカル重合等が挙げられる。
【0036】
また、重合開始剤としては、通常のラジカル重合開始剤を用いることができ、例えば、アゾイソブチルニトリル(AIBN)等のアゾ系開始剤や有機過酸化物などを使用することができる。
【0037】
遺伝子送達用担体
本発明の糖含有共重合体は、遺伝子送達用担体として、好適に使用することができる。
【0038】
遺伝子送達において、担体となる糖含有共重合体は、静電的作用によって遺伝子を凝縮し、複合体を形成する。この複合体がエンドサイトーシスによって細胞に取り込まれ、遺伝子が細胞内に送達されることとなる。
【0039】
本発明の糖含有共重合体は、一般式(I)で表される繰り返し単位を有し、生理的pH範囲内で正電荷を有する残基を含んでいることから、静電的作用によってDNA等の分子を凝縮し、より効率良く、遺伝子を導入することができる。
【0040】
また、本発明の共重合体は、一般式(II)で表される繰り返し単位を有し、糖骨格及び非電荷親水基を含んでいることから、水溶性や生分解性が向上し、体内動態制御がより容易となっている。
【0041】
特に、(I)と(II)をモル比率2:8〜3:7で有する共重合体とすることによって、より高い遺伝子発現効率が可能となる。
【0042】
担体により運ばれる遺伝子としては、DNA又はRNAであれば特に制限されないが、例としては、特定の蛋白質をコードする遺伝子やアンチセンスDNAなどが挙げられる。
【0043】
また複合体における糖含有共重合体と遺伝子の比率は、糖含有共重合体のカチオン基のモル数(C)のDNA又はRNAのリン酸基のモル数(A)に対する比率(以下、これをC/A比と言う)で表して、通常2.5以上、好ましくは5以上、さらに好ましくは10以上である。C/A比が大きくなるほど発現効率は高くなる。
【0044】
糖含有共重合体と遺伝子との複合体を形成する方法は特に限定されず、例えば、遺伝子を含有する溶液と、糖含有共重合体を含有する溶液を混合することによって、適宜調整することができる。
【0045】
【実施例】
以下、実施例及び比較例を用いて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されることはない。
【0046】
実施例1〜4:糖含有共重合体の作成
ジメチルアミノプロピルアクリルアミド(DMAPAA :Dimethylaminopropyl acrylamide)と6−ビニルアジポイルグルコース(GVA :6−vinyladipoyl glucose)を、表1に示した仕込み比で用いた。溶媒として、ジメチルスルホキシド(DMSO:Dimethyl sulfoxide)、重合開始剤として、アゾビスイソブチロニトリル(AIBN:Azobisisobutyronitrile)を用い、反応温度60℃で、真空下4時間重合した。
【0047】
得られた糖含有共重合体の収率、重量平均分子量、およびNMR測定により求めた共重合組成比を、表1に示す。なお、平均分子量は、ディテクターとしてGPC/RIDディテクター(島津社製)、またカラムとしてα−M(東ソー)を用い、プルラン換算分子量で算出した。
【0048】
【表1】
【0049】
実施例5:糖含有共重合体−DNA複合体の調製
DNAとしては、プラスミドpCMV−Lucを用いた。実施例2で作成した糖含有共重合体2.4mgを1000μlのD−MEM培地に溶解してストック溶液を作製した。このストック溶液5μlとpCMV−Luc溶液45μl(pCMV−Lucを100ng含有)を混合することで、C/A比=50とした。ストック溶液を段階希釈し、同濃度のpCMV−Luc溶液と混合することで、C/A比の異なる試料溶液(C/A比=0.5、1.0、3.0、5.0、10.0)を調製した。
異なるC/A比の試料について、ルシフェラーゼ遺伝子pCMV−Lucを混合して、電気泳動を行った。結果を図1に示す。
【0050】
この結果、糖含有共重合体とDNAとのC/A比が3より大きいもので、バンドが一本となり、本発明の糖含有共重合体とDNAとの複合体が形成されていることが確認できた。
【0051】
実施例6:遺伝子導入の評価
96穴マルチプレートの各ウェルにCOS−1細胞を1×104 cells/well播種し、24時間後にリン酸緩衝溶液(PBS)で洗浄後、上清を除去した。各ウェルに、上記実施例5で作成した複合体溶液50μl /wellを、種々のC/A比によって別々に添加し、さらに、200μMのクロロキンを含む血清不含のD−MEM 50μl添加した。37℃5%CO2条件下で12時間培養した後、PBSで洗浄して、10%の血清を含むD−MEM培地(100μl /ウェル)に交換し、さらに40時間培養を続けた。細胞をPBS洗浄後、50μlのTriton X−100で30分間処理して細胞を溶解し、その一部(20μl)をサンプリングし、100μlの発光基質液と混合した。各ウェルの発光強度をルミカウンターで定量することにより、遺伝子の発現効率を測定した。
【0052】
測定結果を図2〜図3に示す。
【0053】
図2は、遺伝子発現効率の測定結果を、ルシフェラーゼ活性で示したものである。また図3は、遺伝子発現効率の測定結果を、タンパク当たりのルシフェラーゼ活性で示したものである。
【0054】
図2〜図3に示されるように、DNA、細胞のみでは当然活性は見られなかった。また、比較例として、末端に荷電したアミノ基を有し、糖を含有しない重合体(SuperfectTM、C/A比=5.0、QIAGEN社)を用いて、発現効率の違いを調べたところ、本発明の糖含有共重合体を用いた複合体は、SuperfectTMと比べて、より高い遺伝子発現効率を有することが確認された。また、C/A比が大きくなるほど発現効率が高くなることが確認された。
【0055】
【発明の効果】
上述した結果に示されるように、本発明の糖含有共重合体から形成される遺伝子送達用担体は、従来の遺伝子送達用担体と比べて、より高い遺伝子発現効率を示す。また、本発明の共重合体は、生分解性や水溶性が向上しており、体内動態制御が容易であって、高分子分野や医学分野においてより有用に利用し得る。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、種々のC/A比からなる糖含有共重合体と遺伝子pCMV−Lucとの複合体の、アガロースゲル(0.8%)電気泳動を示す図である。
【図2】図2は、COS−1細胞へ遺伝子を導入し、遺伝子の発現効率を測定した図である(ルシフェラーゼ活性で示した場合)。
【図3】図3は、COS−1細胞へ遺伝子を導入し、遺伝子の発現効率を測定した図である(タンパク当たりのルシフェラーゼ活性で示した場合)。
Claims (5)
- (I)と(II)のモル比率が2:8〜3:7である、請求項1に記載の糖含有共重合体。
- 重量平均分子量が5×106〜2×107である、請求項1又は2のいずれかに記載の糖含有共重合体。
- 一般式(I)におけるnが3であって、一般式(II)におけるmが4である、請求項1乃至3のいずれかに記載の糖含有共重合体。
- 請求項1乃至4のいずれかに記載の糖含有共重合体から形成される遺伝子送達用担体。
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