JP2004024257A - 物質のホルモン作用を検査するための方法 - Google Patents
物質のホルモン作用を検査するための方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004024257A JP2004024257A JP2003168263A JP2003168263A JP2004024257A JP 2004024257 A JP2004024257 A JP 2004024257A JP 2003168263 A JP2003168263 A JP 2003168263A JP 2003168263 A JP2003168263 A JP 2003168263A JP 2004024257 A JP2004024257 A JP 2004024257A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- receptor
- hsrnaam
- fragment
- cells
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6875—Nucleoproteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Abstract
【解決手段】物質のホルモン作用、特にアンドロゲン作用または抗アンドロゲン作用の検査方法で、a)2つのベクターで形質転換した細胞を物質に暴露し、一方のベクターが核内受容体タンパク質またはその断片をコードするDNAを含み、他方のベクターがコモジュレーターHSRNAAMまたはその断片をコードするDNAを含み、b)コモジュレーターまたはその断片の存在下で核内受容体またはその断片が誘発する転写活性を測定したり、物質が受容体またはその断片とコモジュレーターまたはその断片との相互作用に与える影響を、タンパク質・タンパク質の相互作用またはタンパク質・タンパク質・DNAの相互作用により測定する。アンドロゲン受容体とHSRNAAMとの間のコモジュレーション機構における障害を規定する。
【選択図】 図2
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、物質のホルモン作用を検査するための方法、およびアンドロゲン受容体とコアクチベーター、アルギニンメチルトランスフェラーゼ(HSRNAAM)との間のコモジュレーション機構の障害を規定するための方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
ある物質がなんらかの製薬に使用するのに適しているか否かを判定する際、当該物質が場合によってはホルモン作用、特にアンドロゲン活性または抗アンドロゲン活性を有していないか調べる方法が一般的に用いられている。薬理作用のある物質を投与するに当たって、多くの場合に当該物質のホルモン作用、特にアンドロゲン作用または抗アンドロゲン作用に関する知見が重要となる。なぜならば、これらの作用は患者に好ましくない副作用を引き起こす恐れがあるからである。物質のホルモン作用を調べるためには、特に物質がホルモン受容体を当該物質に結合せしめて、それらの転写活動を活性化する能力を測定する方法が用いられる。
【0003】
しかし、物質のホルモン作用に関する知見は、可能な医薬物質のみならず、非医薬物質に関しても興味が持たれる。なぜならば、環境中に存在している多くの物質について、一部の住民の間でアンドロゲン活性もしくは抗アンドロゲン活性またはエストロゲン活性もしくは抗エストロゲン活性を有する可能性が推定されているからである。その結果として好ましくない有害な作用が引き起こされる恐れがある。
【0004】
それゆえ、物質のホルモン作用に関して、信頼性があり、感度が高く、簡単で廉価かつ迅速に判断を下すことのできる方法が非常に強く求められている。従来公知の方法では、この必要性を満たすことができない。
【非特許文献1】
Beato et al., 2000, Human Reproduct. Update, 6, 225−236
【非特許文献2】
Mangelsdorf & Evans, 1995;Cell, 83, 841−850
【非特許文献3】
Robyr et al., 2000, Mol. Endocrinol., 14, 329−347
【非特許文献4】
Brinkmann et al., 1999, J. Steroid Biochem. and Mol. Biol., 69, 307−313
【非特許文献5】
McKenna et al., 1999, Endocr. Rev., 20, 321−347
【非特許文献6】
Ding et al., 1998, Mol. Endocrinol., 12, 302−313
【非特許文献7】
Chao Qui et al., JBC Papers in Press 、2002年5 月30日、草稿M201053200
【非特許文献8】
Scott et al., 1998, Genomics, 48. 330−349
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、物質のホルモン作用に関して、信頼性があり、感度が高く、簡単で廉価かつ迅速に判断を下すことのできる方法を提供することである。
【0006】
【課題を解決するための手段】
上記の課題は本発明により驚くべきことに、物質のホルモン作用、特にアンドロゲン作用または抗アンドロゲン作用を検査するための方法であって、a)2つのベクターで形質転換した細胞を物質に暴露し、しかも一方のベクターが核内受容体タンパク質またはその断片をコードするDNAを含み、他方のベクターがコモジュレーターHSRNAAMまたはその断片をコードするDNAを含んでおり、b)コモジュレーターまたはその断片の存在下で核内受容体またはその断片が誘発する転写活性を測定し、および/または物質が受容体またはその断片とHSRNAAMまたその断片との相互作用に与える影響を、タンパク質・タンパク質の相互作用またはタンパク質・タンパク質・DNAの相互作用によって測定するようにした、物質のホルモン作用を検査するための方法によって解決される。
【0007】
本発明の方法によって驚くべきことに、たとえば環境関連または薬理学関連で興味の対象となり得る物質が、ホルモン作用、特にアンドロゲン作用または抗アンドロゲン作用を及ぼすか否かについて、高い信頼性と感度をもって、簡単で廉価かつ迅速にテストできることが分かった。
【0008】
本発明による方法ではベクターで形質転換された細胞を用いるが、ベクターは核内受容体タンパク質またはその断片をコードするDNAを含んでいる。
50種類以上のタンパク質が属している核内受容体(NRs)のスーパーファミリーは、それぞれの標的遺伝子の転写を、特異的なリガンド、たとえばホルモンに対する反応として制御する類似した転写因子のグループである。このファミリーは、特定の特徴、たとえば二量化状態、リガンドの種類またはDNA応答配列の構造によって幾つかのサブファミリーに区分できる(非特許文献1)。NRsの特徴は、機能ドメイン(A〜Fで表示)の構造が、自律的な構成的活性化機能(AF−1)を有する著しく可変的で保存性の低いN末端可変領域と、特異的なDNA応答配列の認識を受け持ち、2つの亜鉛フィンガーモチーフからなる保存性の高い結合ドメイン(DBD)と、可変なヒンジドメインと、そして二量化およびリガンドに依存したトランス活性化機能(AF−2)を有する、保存された多機能C末端リガンド結合ドメイン(LBD)と一致していることである。この後に最も遠位のC末端領域が続くが、その機能は知られておらず、PR(プロゲステロン受容体)、PPAR(ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体)およびRXR(レチノイドX受容体)などの受容体には欠如している(非特許文献2,3)。若干のNRs(たとえばアンドロゲン受容体(AR)) について、N末端領域はC 末端領域と相互作用できることが証明された(非特許文献4)。ステロイドホルモン受容体、たとえばエストロゲン受容体(ER)、プロゲステロン受容体(PR)、グルココルチコイド受容体(GR)、ミネラルコルチコイド受容体(MR)およびアンドロゲン受容体(AR)は、プレグネノロンから導かれるステロイドリガンド、たとえばプロゲスチン、エストロゲン、グルココルチコイドおよびミネラルコルチコイドおよびアンドロゲンを結合する。リガンド結合は受容体を活性化し、対応する標的遺伝子の発現を制御する。
【0009】
上述したように、本発明の方法の段階a)で使用する細胞は、さらにコモジュレーターHSRNAAMまたはその断片をコードするDNAを含んだベクターを有している。
【0010】
いわゆるコモジュレーターは、遺伝子転写の活性化(コアクチベーター)もしくは抑制(コリプレッサー)の際に、転写開始複合体とNRsとの間の橋渡し分子として働く種類のタンパク質である(非特許文献5)。コアクチベーターは、受容体機能を強化し、かつアゴニストの存在下でNRsの活性化ドメインと直接相互作用できなければならない。それはまた基本転写装置とも相互作用しなければならず、最終的にそれ自身基本転写活性を強化してはならない。ほとんどのコモジュレーターは1つ以上のLXXLLモチーフ(NRボックス)を用いてNRsのAF−2ドメインと相互作用するが、他のNR領域と相互作用するコモジュレーターも幾つか記載されている(非特許文献6)。Chao Quiらは、タンパク質PRMT2(protein arginine methyltransferase 2)をERαに対するコアクチベーターとして記述している(非特許文献7)。
【0011】
本発明による方法において、アルギニンメチルトランスファーゼ(HSRNAAM)と呼ぶコモジュレーターまたは特にアミノ酸271〜433を有するHSRNAAMの断片を使用する。cDNA配列は登録されており(GenBankアクセス番号X99209)、433アミノ酸を有している(非特許文献8)。HSRNAAMのアミノ酸1〜433もしくは271〜433をコードするプラスミドを含んでいるDH5α大腸菌は、2002年6月5日、ドイツ微生物・培地コレクションにDSM15041もしくはDSM15042で登録された。
【0012】
本発明による方法はこれらのタンパク質を使用すると、特に高い信頼性と感度で、簡単かつ廉価にして迅速に実施できる。さらにHSRNAAM断片、特にアミノ酸271〜433を有するHSRNAAMの断片は、取り扱いが簡単であり、クローン化可能であり、しかもなおHSRNAAMの機能的性質を持つという長所を有する。
【0013】
HSRNAAMとは、ヒト・アンドロゲン受容体およびその他の核内受容体に対するコアクチベーターであり、アンドロゲンと受容体との相互作用を強化する。HSRNAAMの配列はすでにGenBankアクセス番号X99209に登録されている。しかしここでは核内受容体、特にARとの相互作用は記載されてない。本発明は、核内受容体、特にARとHSRNAAMとの間に相互作用が存在し、さらにARに媒介されたトランス活性化を強化することが確認できたという驚くべき認識に基づいている。HSRNAAMは、ステロイドを核内受容体に結合した後、転写作用を強化または抑制し、さらには以前ホルモン作用が認められなかった分子への核内受容体の結合および活性化を促進することによって、コメディエーターとして機能するタンパク質である。
【0014】
タンパク質HSRNAAMとは、アンドロゲン受容体およびその他の核内受容体、たとえばエストロゲン受容体α、エストロゲン受容体β、プロゲステロン受容体A、プロゲステロン受容体B、グルココルチコイド受容体、ミネラルコルチコイド受容体、甲状腺ホルモン受容体、ビタミンD受容体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体、レチノイン酸受容体、レチノイドX受容体およびオーファン受容体に対するコアクチベーターである。本発明による方法では、これらの受容体を使用することが好ましい。なぜならば、それによって、上述した本発明による方法の利点を特に好都合に達成できるからである。
【0015】
本発明による方法では、上記のタンパク質の断片をコードするベクターも使用できる。上記のタンパク質に関連した「断片」という表現は、全長がタンパク質よりも短い1つ以上のアミノ酸を有しながら、なおも核内受容体またはコモジュレーターの機能的性質を有するタンパク質を意味している。
【0016】
上述したように、本発明による方法において、段階a)では特殊なタンパク質をコードする2つのベクターで形質転換した細胞を使用する。したがってこれらの細胞は、2種類のタンパク質を発現することができる。
【0017】
細胞が、確立された細胞株および/または真核細胞、特に前立腺細胞、神経細胞、グリア細胞、繊維芽細胞、血球、骨芽細胞、砕骨細胞、肝細胞、上皮細胞または筋肉細胞であることが好ましい。本発明による方法は、確立された細胞株により特に廉価かつ迅速に実施できる。本発明による方法で真核細胞、特に上述した真核細胞を使用すると、好都合にも非常に信憑性の高い結果が得られる。
【0018】
本発明による方法の好ましい実施形態では、真核発現ベクター、たとえばpCMX、pCMVまたはpSG5を使用する。これらのベクターを使用すると、特に上記の確立された細胞株および/または真核細胞と組み合わせると、本発明による方法は特に有利かつ迅速に実施でき、非常に信憑性の高い結果が得られる。
【0019】
当業者にとって、上記のタンパク質をコードするDNAをベクターに挿入し、次いでこのベクターを細胞内に入れ、こうして得られた細胞を適当な培養条件下で培養し、それによってこれらのタンパク質を発現できるようにする方法およびそれに必要な材料は公知である。
【0020】
本発明による段階b)に従い、コモジュレーターまたはその断片の存在下で核内受容体またはその断片が誘発する転写活性を測定できる。これはたとえばレポーター遺伝子の検出によって行うことができる。
【0021】
レポーター遺伝子とは、他の遺伝子または調節配列と結合して、この配列の活性を証明できるようにした遺伝子または遺伝子断片である。レポーター遺伝子は遺伝子産物を産生するが、それらはたとえば測光法を用いた色反応によって極めて簡単に検出できる。よく用いられるレポーター遺伝子は、βガラクトシダーゼに対する遺伝子、アルカリ性ホスファターゼに対する遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼに対する遺伝子、カテコール・ジオキシゲナーゼに対する遺伝子、緑色蛍光タンパク質に対する遺伝子、および細胞を発光させることができる種々のルシフェラーゼ遺伝子である。
【0022】
このようなレポーター遺伝子も同様にベクター、特に真核発現ベクターによって細胞内に導入できる。レポーター遺伝子をコードするDNAを含んだベクターの例は、物質のアンドロゲン作用の測定に用いられるベクターMMTVルシフェラーゼである。
【0023】
この場合、ホルモン作用、特にアンドロゲン作用/抗アンドロゲン作用を有する物質は、レポーター遺伝子の活性が増大しているか、または減少しているかによって認識できる。
【0024】
検査物質が受容体またはその断片とコモジュレーターまたはその断片との相互作用に与える影響の測定は、タンパク質・タンパク質の相互作用を、たとえばツーハイブリッド系、免疫沈降、GSTプルダウンアッセイ、FRET分析およびABCDアッセイで規定することによって、およびまたタンパク質・DNAの相互作用を、たとえばゲル遅延アッセイで規定することによって行うことができる。
【0025】
さらに、HSRNAAMはアンドロゲン由来疾患の指示薬として非常に効果的に使用できることが分かった。該当するアンドロゲン由来疾患は、たとえば前立腺癌、勃起不全、不妊症、脱毛症、アクネまたは性機能低下、およびアンドロゲン抵抗症候群、たとえば睾丸性女性化症が、ARとHSRNAAMとの間のコモジュレーション機構の欠陥に基づいている。そのような障害を持った患者の場合、ARとHSRNAAMの相対的濃度を測定することが可能である。この場合、測定は体液、体細胞または体組織で体外的に行うと好都合である。これはそれぞれの患者に、両分子の相対量を測定するための定量法を適用することによって可能であり、ARおよびHSRNAAMに対する抗体、またはそれらのmRNAに対して核酸プローブを患者に使用できる。この比較量を測定するための幾つかの方法が当業者に公知である。またこれに適した材料および装置、たとえばラジオイムノアッセイ、ELISAテスト、免疫染色、RT−PCR、ウエスタンブロットまたはノーザンブロット、DNAチップまたはタンパク質チップも当業者に知られている。さらに、HSRNAAM−cDNAを用いて、PCRアッセイ用のプローブを構成することも可能であり、これにより特定の患者において正常なDNA配列の突然変異を検出したり、ノーザンブロットアッセイ用の転写もしくはin situハイブリダイゼーションアッセイ用のDNAを生成できる。
【0026】
この場合、AR対HSRNAAMの測定比は、健康体におけるよりも高いか、または低いことがある。健康体における正常値は、たとえば多数の健康な被験者でAR対HSRNAAMの比の平均を求めることによって簡単に規定できる。被験患者で求めたAR対HSRNAAMの比と正常値とを比較することによって、求めた比の値が正常値よりも高いか低いかを確認できる。
【0027】
組織内におけるHSRNAAMおよび/またはARの濃度は多様であり得る。たとえばHSRNAAMの濃度は心房、骨髄、胸腺および子宮では非常に高いが、肝臓、肺および前立腺では非常に低いので、評価する際は組織によって異なる濃度を考慮しなければならない。すなわち検査値と正常値は、同じ組織のものでなければならない。
【0028】
ARとHSRNAAMとの間のコモジュレーション機構における欠陥を規定するための別の可能性は、HSRNAAMの濃度だけを測定することである。この場合、AR濃度は少なくともほぼ一定であることが前提となっている。もし正常なHSRNAAM濃度よりも低い濃度が測定されたら、それはAR対HSRNAAMの比が変化したことを意味しており、それはまたコモジュレーション機構に障害があることを示唆している。
【0029】
HSRNAAMに特異的なプローブを使って、HSRNAAM発現における変化、ひいてはARとの比を規定することが可能である。そのような変化は、種々の病像で原因に関与しているか、または随伴症状として生じることがある。
【0030】
AR/HSRNAAM比のこのような測定は、HSRNAAMの検出と特性把握に基づく次のような知見を基礎としている。すなわち、たとえばアンドロゲン抵抗症候群はAR優勢とHSRNAAM優勢の平衡状態の障害に起因することがある。HSRNAAMが過度に高いと、AR系の過敏症を招き、通常はアンドロゲン作用を有していない分子に反応することがある。反対に、HSRNAAMが欠如しているか、あるいはあらゆるレベルの機能不全の場合にアンドロゲン抵抗を招く。患者から過度のHSRNAAMが検出されたら、臨床条件下でそれぞれの患者のHSRNAAM力価濃度を下げるために、ダウンレギュレーションのための薬剤、たとえばアンチセンス薬やこれに類似の薬剤を使用すべきであろう。同じことは、ARとHSRNAAMとの相互作用を抑制することのできる分子によって達成できる。ある患者のHSRNAAMが不足している場合、それ自体公知の種々の機構を介してHSRNAAM−cDNA、HSRNAAMタンパク質またはHSRNAAM−DNAを患者に供給することによって、活性HSRNAAMの力価濃度を高めることができる。低分子薬剤により、または特異的なHSRNAAMプロモーター・タンパク質を用いて自家合成を刺激することによってHSRNAAMの濃度または活性を高めることも可能である。
【0031】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を図面に基づいて詳細に説明する。
以下の例を用いた説明は本発明を限定するものではない。
例1:
胎児の脳から採取したcDNAライブラリー(クローンテク社マッチメーカー)と、アミノ酸325〜919をコードするヒトAR断片をプローブとして使用し(図1)、アンドロゲン10−8M DHTの存在下で通常のツーハイブリッド酵母系を用いてスクリーニングを行った。メーカー(クローンテク社)の指示に従い、スクリーニングしたクローンの数は2×107であった。独立クローンの数はメーカーの申告によれば、3.5×108であった。このうち300個のポジティブクローンを選別し、βガラクトシダーゼアッセイでテストした結果、40個がlacZポジティブクローンであることが確認された。これらのクローンのインサートをPCRによって増幅した。制限断片分析と配列決定により、少なくとも39種類のクローンを同定した。そのうち1つは1110bp(739bp−2292bp)を含むクローンであった。これはHSRNAAMのORF(Open reading Frame)をコードする(GenBankアクセス番号:X99209)。
【0032】
HSRNAAM−cDNA配列の499bpからなる断片(986bp−1485bp)は、ヒト・ブロットに対するプローブとして用いられた。アルギニンメチルタランスフェラーゼの組織分布をNorthan Lights Human Multiple mRNA Blot(Life Technologies)で規定した(図2)。HSRNAAMプローブを使用して、転写が発見された(図2)。
【0033】
図2は、ノーザンブロット分析によりそれ自体公知の仕方で調べたHSRNAAMの組織分布を示している。種々のヒト組織から単離されたポリA+RNAをβ−アクチンで標準化して、ホルムアルデヒド含有アガロースゲルで分離し、ナイロン膜にブロットし、標準化したHSRNAAM−cDNA断片(986−1485bp)でハイブリダイズした。種々のヒト組織で転写が発見された(図2)。
【0034】
PCRと酵母ベクターに由来する特異的プライマーによって増幅された986−1485bp(AS271−433)のHSRNAAM−cDNAを、エンドヌクレアーゼEcoRIおよびXhoIにより通常のやり方でベクターpCMV−NFκBにクローン化し、またヒトの汎用cDNA(クローンテク社)に由来する特異的プライマーによって増幅された177bp−1485bp(AS1−433)のHSRNAAM−cDNA断片を、エンドヌクレアーゼEcoRIおよびXhoIにより通常のやり方でベクターpCMV−NFκBにクローン化して、ARを発現するPC3−ARwt細胞においてMMTVルシフェラーゼをやはり通常の仕方でトランスフェクションした。
【0035】
図3に見られるように、PC3−ARwt細胞におけるHSRNAAM−cDNA(AS1−433)の一過性トランスフェクションは、ARシグナル活動の強いコモジュレーションを招き、それによってアルギニンメチルトランスフェラーゼは核内受容体に対するコアクチベーターとして作用する。さらに、PC3−ARwt細胞においてNFκBのトランス活性化ドメインとインフレームで融合したHSRNAAM−cDNA断片(AS271−433)の一過性トランスフェクションは、ARシグナル活動の強い共役活性化を招いた(図4)。このことはアルギニンメチルトランスフェラーゼと核内受容体またはその他のコモジュレーターとの間の相互作用を示すものである。そのために、それぞれ凹部当たり2×105の細胞が入る細胞培養シャーレに、1.0μgMMTVルシフェラーゼプラスミドと、0.5μgのpCMX−HSRNAAM構成物(AS1−433)もしくはネガティブ対照群として0.37μgのpCMV−NFκBでトランスフェクションした(図3)。図4では、1.0μgMMTVルシフェラーゼプラスミドと、0.39μgのpCMV−NFκB−HSRNAAM構成物(AS271−433)もしくはネガティブ対照群として0.35μgのpCMV−NFκBまたはポジティブ対照群として0.5μgpCMV−NFκB−SRC1aでトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞は、上記濃度のジヒドロキシテストステロン(DHT)で24時間処理し、さらに24時間後に収穫した後、レポーター遺伝子(ルシフェラーゼ)の活性を測定した。さらに標準化のために全細胞タンパク質量を規定した。トランスフェクションバッチおよび物質濃度当たり、2回の実験と、それぞれ3回の測定を行った。誤差をSDで示した。活性は相対的単位で示した。
【0036】
【発明の効果】
以上詳述したように、この発明は物質のホルモン作用に関して、信頼性があり、感度が高く、簡単で廉価かつ迅速に判断を下すことのできるという優れた効果を発揮する。
【図面の簡単な説明】
【図1】アンドロゲンの存在下でHSRNAAMと相互作用ができる、アミノ酸325〜919に達するアンドロゲン受容体ドメイン(AR2)の表示を有するアンドロゲン受容体の概念図。
【図2】HSRNAAMの人間の組織における分布を示す説明図。
【図3】PC3−ARwt細胞におけるコモジュレーターとしてのHSRNAAM(AS1−433)とアンドロゲン受容体との作用を示す線図。
【図4】PC3−ARwt細胞におけるHSRNAAM断片(AS271−433)またはSRC−1aとアンドロゲン受容体との作用を示す線図。
Claims (8)
- 物質のホルモン作用、特にアンドロゲン作用または抗アンドロゲン作用を検査するための方法であって、
a)2つのベクターで形質転換した細胞を物質に暴露し、しかも一方のベクターが核内受容体タンパク質またはその断片をコードするDNAを含み、他方のベクターがコモジュレーターHSRNAAMまたはその断片をコードするDNAを含んでおり、
b)HSRNAAMまたはその断片の存在下で核内受容体またはその断片が誘発する転写活性を測定し、および/または物質が受容体またはその断片とHSRNAAMまたその断片との相互作用に与える影響を、タンパク質・タンパク質の相互作用またはタンパク質・タンパク質・DNAの相互作用によって測定するようにした、物質のホルモン作用を検査するための方法。 - HSRNAAMの断片が、HSRNAAMのアミノ酸271〜433を有している、請求項1記載の方法。
- 核内受容体を、アンドロゲン受容体、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体A、プロゲステロン受容体B、グルココルチコイド受容体、ミネラルコルチコイド受容体、甲状腺ホルモン受容体、ビタミンD受容体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体、レチノイン酸受容体、レチノイドX受容体およびオーファン受容体の中から選択するようにした、請求項1または2記載の方法。
- 細胞が確立された細胞株および/または真核細胞であることを特徴とする、請求項1から3までのいずれか1項記載の方法。
- 真核細胞を、前立腺細胞、神経細胞、グリア細胞、繊維芽細胞、血球、骨芽細胞、砕骨細胞、肝細胞、上皮細胞または筋肉細胞の中から選択するようにした、請求項4記載の方法。
- 前記ベクターが真核性発現ベクターである、請求項1から5までのいずれか1項記載の方法。
- アンドロゲン受容体とHSRNAAMとの間のコモジュレーション機構の障害を規定するための方法であって、HSRNAAMまたはその断片および/またはアンドロゲン受容体またはその断片の濃度を測定するようにした方法。
- 濃度測定が、ラジオイムノアッセイ、ELISAテスト、免疫染色、RT−PCR、ウエスタンブロットまたはノーザンブロットによって行われることを特徴とする、請求項7記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10226675A DE10226675B4 (de) | 2002-06-12 | 2002-06-12 | Verfahren zur Testung des hormonellen Effekts von Substanzen |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004024257A true JP2004024257A (ja) | 2004-01-29 |
Family
ID=27588643
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2003168263A Pending JP2004024257A (ja) | 2002-06-12 | 2003-06-12 | 物質のホルモン作用を検査するための方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7074566B2 (ja) |
EP (1) | EP1371988B1 (ja) |
JP (1) | JP2004024257A (ja) |
AT (1) | ATE294395T1 (ja) |
DE (2) | DE10226675B4 (ja) |
NO (1) | NO20032610D0 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100747034B1 (ko) * | 2006-06-08 | 2007-08-07 | 기아자동차주식회사 | 자동차의 운전석 무릎 보호장치 |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8097431B2 (en) * | 2004-08-04 | 2012-01-17 | University Of Utah Research Foundation | Methods and compositions for detecting steroids |
CN101469314B (zh) * | 2007-12-29 | 2011-04-06 | 中国科学院生态环境研究中心 | 检测类/抗甲状腺激素化合物的双杂交酵母及检测方法 |
CN105866441B (zh) * | 2015-01-19 | 2017-07-28 | 中国科学院生态环境研究中心 | 一种检测雌激素或类雌激素化合物浓度的方法 |
CN109085361B (zh) * | 2018-07-13 | 2020-09-29 | 北京大学 | 一种基于重组核受体蛋白的生物效应物质高通量筛查鉴定方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NO20021900L (no) * | 2001-05-04 | 2002-11-05 | Jenapharm Gmbh | FremgangsmÕte for analyse av forbindelsers hormonvirkning |
-
2002
- 2002-06-12 DE DE10226675A patent/DE10226675B4/de not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-06-06 AT AT03012913T patent/ATE294395T1/de not_active IP Right Cessation
- 2003-06-06 US US10/456,269 patent/US7074566B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-06-06 EP EP03012913A patent/EP1371988B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-06-06 DE DE50300480T patent/DE50300480D1/de not_active Expired - Fee Related
- 2003-06-10 NO NO20032610A patent/NO20032610D0/no not_active Application Discontinuation
- 2003-06-12 JP JP2003168263A patent/JP2004024257A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100747034B1 (ko) * | 2006-06-08 | 2007-08-07 | 기아자동차주식회사 | 자동차의 운전석 무릎 보호장치 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NO20032610D0 (no) | 2003-06-10 |
DE10226675B4 (de) | 2006-01-05 |
US20030232376A1 (en) | 2003-12-18 |
EP1371988A2 (de) | 2003-12-17 |
DE10226675A1 (de) | 2004-01-08 |
EP1371988A3 (de) | 2004-01-02 |
ATE294395T1 (de) | 2005-05-15 |
US7074566B2 (en) | 2006-07-11 |
DE50300480D1 (de) | 2005-06-02 |
EP1371988B1 (de) | 2005-04-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Wen et al. | The A and B isoforms of the human progesterone receptor operate through distinct signaling pathways within target cells | |
Masiello et al. | Recruitment of β-catenin by wild-type or mutant androgen receptors correlates with ligand-stimulated growth of prostate cancer cells | |
Ma et al. | FoxO1 mediates PTEN suppression of androgen receptor N-and C-terminal interactions and coactivator recruitment | |
Mettu et al. | The nuclear receptor-coactivator interaction surface as a target for peptide antagonists of the peroxisome proliferator-activated receptors | |
JP4071033B2 (ja) | 物質のホルモン作用の試験方法 | |
Cho et al. | Glucocorticoid receptor ligand binding domain is sufficient for the modulation of glucocorticoid induction properties by homologous receptors, coactivator transcription intermediary factor 2, and Ubc9 | |
JP2004024257A (ja) | 物質のホルモン作用を検査するための方法 | |
JP2008156360A (ja) | 新規な核内受容体の非ゲノム活性のモジュレーター(mnar)およびその使用 | |
JP2004016236A (ja) | 物質のホルモン作用を検査するための方法 | |
KR20010014368A (ko) | 에스트로겐 반응 조절 능력에 대한 핵전사인자의 선별 방법 | |
JP3862703B2 (ja) | 物質のホルモン作用を判定する方法 | |
JP3593529B2 (ja) | ヒト核内受容体に対する特異的共役活性化因子の医学的および診断的使用 | |
Chen et al. | ERAP75 functions as a coactivator to enhance estrogen receptor α transactivation in prostate stromal cells | |
Hulkko et al. | Functional interaction between the pro-apoptotic DAP3 and the glucocorticoid receptor | |
WO2003000730A1 (en) | Compounds that modulate estrogen actions | |
Schreiber | The transcriptional coactivator PGC-1 [alpha] as a modulator of ERR [alpha] and GR signaling: function in mitochondrial biogenesis | |
US20060051295A1 (en) | Estrogen receptor interaction with a transcription factor | |
Meima et al. | Human Liver and Neuronal Interactomes Reveal Novel Binding Partners for the T3 Receptor Isoform α1 | |
Loven | Estrogen receptors: Interaction with estrogen response elements and estrogen receptor-associated proteins | |
US20090226956A1 (en) | Runx-mediated action of nuclear receptors and utilities thereof | |
Duan | Regulation of c-fos protooncogene expression in human breast cancer cells | |
Leo et al. | The Regulation and Function of Nuclear Receptor Corepressor SMRT in Human Breast Cancer Cells | |
WO2000040756A1 (en) | Novel coactivator overexpressed in endocrine tumors | |
Loven et al. | A Novel Estrogen Receptor α-Associated Protein Alters Receptor-DNA Interactions and Represses Receptor-Mediated Transcription | |
Emtiazjoo | Role of charged amino acids flanking the LXXLL. motifs in modulating the interaction between coactivators and |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20040524 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20040524 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060905 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20061205 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20061208 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070131 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20081104 |