JP4071033B2

JP4071033B2 - 物質のホルモン作用の試験方法

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Publication number: JP4071033B2
Application number: JP2002123454A
Authority: JP
Inventors: オーベンドルフマイク; ヴォルフジークムント; シュレーダーイェンス
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 2001-05-04
Filing date: 2002-04-25
Publication date: 2008-04-02
Anticipated expiration: 2022-04-25
Also published as: EP1255113A1; DK1255113T3; US20030124508A1; EP1255113B1; NO20021900D0; PT1255113E; JP2003018996A; ATE267402T1; NO20021900L; DE50200452D1; TR200402024T4; ES2219601T3

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、物質のホルモン作用の試験方法、核内受容体の共同調節機序（Co-Modulationsmechanismus ）障害の測定方法、特にヒトアンドロゲン受容体および他の核内受容体のコアクチベーターＡＲＡＰ１１とそれをコードするＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】
医薬への適用について物質を評価する場合、通常、これらの物質の起こり得るホルモン作用、特に、存在するアンドロゲンまたは抗アンドロゲン活性を試験する。薬理効果のある物質を投与するとき、これらの物質のホルモン作用、特に、アンドロゲンまたは抗アンドロゲン作用の知識が重要である場合が少なくない。何故なら、これらの物質が患者で不都合な副作用を誘発し得るからである。物質のホルモン作用の試験には、特に、ホルモン受容体と結合し、その転写活性を活性化する物質の能力を測定する方法が用いられる。
【０００３】
しかし、物質のホルモン作用に関する知識は、薬剤の場合だけでなく、非医薬物質の場合でも重要である。何故なら、環境に存在する多くの物質の一部の集団で、アンドロゲンまたは抗アンドロゲンないしはエストロゲンまたは抗エストロゲン活性を示し得ると考えられるからである。場合によっては、それによって、不都合な有害作用が誘発される。
【０００４】
従って、コストが安く、簡易、迅速、高感度の信頼し得る様式で物質のホルモン作用を適切に表現し得る方法とその方法を実行するのに適した薬剤が非常に必要とされる。これまで公知の方法は、これを十分満たしていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、コストが安く、簡易、迅速、高感度の信頼し得る様式で試験すべき物質のホルモン作用を適切に表現し得る方法とそれに適した薬剤を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記問題点を解決するために、請求項１に記載の発明は、ある物質のアンドロゲン又は抗アンドロゲン作用の試験方法であって、ａ）一方のベクターはアンドロゲン受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含み、他方のベクターはコモジュレーターまたはそのフラグメントをコードするＤＮＡを含む二つのベクターで形質移入した細胞を物質に暴露する工程と、ｂ）アンドロゲン受容体がコモジュレーターまたはそのフラグメントの存在下で誘発する転写活性か、前記アンドロゲン受容体と前記コモジュレーターまたはそのフラグメントとの間の相互作用に及ぼす該物質の影響か、の少なくともいずれか一方を、タンパク質−タンパク質相互作用またはタンパク質−タンパク質−ＤＮＡ相互作用により測定する工程とから成り、コモジュレーターが配列番号２のアミノ酸配列からなるＡＲＡＰ１１であり、かつ該コモジュレーターのフラグメントがＡＲＡＰ１１のアミノ酸８１３〜１３９０からなる方法を要旨とする。
【０００９】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、細胞が株化細胞か真核細胞の少なくともいずれかであることを要旨とする。
【００１０】
請求項３に記載の発明は、請求項２に記載の方法において、真核細胞が、前立腺細胞、神経細胞、グリア細胞、繊維芽細胞、血球、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞、上皮細胞または筋細胞から選択されることを要旨とする。
【００１１】
請求項４に記載の発明は、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法において、ベクターが真核性発現ベクターであることを要旨とする。
【００１３】
請求項５に記載の発明は、配列番号２のＡＲＡＰ１１のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、アンドロゲン受容体に対してコモジュレーター特性を有するタンパク質を要旨とする。
請求項６に記載の発明は、請求項５に記載のタンパク質のフラグメントであって、前記フラグメントはＡＲＡＰ１１のアミノ酸８１３〜１３９０からなることを要旨とする。
【００１４】
請求項７に記載の発明は、請求項５に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ、をその要旨とする。
請求項８に記載の発明は、請求項６に記載のタンパク質のフラグメントをコードするＤＮＡ、をその要旨とする。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明によれば、ある物質のホルモン作用、特に、アンドロゲンまたは抗アンドロゲン作用の試験方法が提供される。本方法では、
ａ）二つのベクター（一方のベクターは核内受容体タンパク質またはそのフラグメント（特にヒト核内受容体タンパク質またはそのフラグメント）をコードするＤＮＡを含み、他方のベクターはコモジュレーターまたはそのフラグメントをコードするＤＮＡを含む）で形質移入した細胞を物質に暴露する工程と、
ｂ）前記核内受容体またはそのフラグメントが前記コモジュレーターまたはそのフラグメントの存在下で誘発する転写活性か、前記核内受容体またはそのフラグメントと前記コモジュレーターまたはそのフラグメント間の相互作用に及ぼす該物質の影響か、の少なくともいずれか一方を、タンパク質−タンパク質相互作用またはタンパク質−タンパク質−ＤＮＡ相互作用により測定する工程と、
から成る。
【００１６】
本発明の方法では、ベクターで形質転換した細胞を用いる。該ベクターは、核内受容体タンパク質またはそのフラグメントをコードするＤＮＡを含む。
５０を超える種々のタンパク質が属する核内受容体（ＮＲ）のスーパーファミリーは、特異的リガンド、例えば、ホルモンに対する反応としてそれぞれの目的遺伝子の転写を制御する類似転写因子の一群である。そのファミリーは、例えば、二量体化状態、リガンドの種類またはＤＮＡ反応要素の構造など、特定の特徴に従って、幾つかのサブファミリーに分類し得る（Ｂｅａｔｏら，２０００，ＨｕｍａｎＲｅｐｒｏｄｕｃｔ．Ｕｐｄａｔｅ，６，２２５−２３６）。
【００１７】
ＮＲの特徴的指標は、自律性構造的活性化機能（ＡＦ−１）を有する可変性が大きく保存性の低いＮ末端領域と、特異的なＤＮＡ反応要素認識のための、二つのジンクフィンガーモチーフからなる保存性の高いＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と、ヒンジドメインと、二量体化−およびリガンド−依存性トランス活性化機能（ＡＦ−２）を有する保存性の高い多機能性Ｃ末端リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）と、機能性ドメイン（記号Ａ〜Ｆ）の構造の一致である。この次ぎに、最も離れたＣ末端につながる領域が続く。その機能は未知で、例えば、ＰＲ（プロゲステロン受容体）、ＰＰＡＲ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体）およびＲＸＲ（レチノイドＸ受容体）などの受容体では、その領域が欠失している（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ＆Ｅｖａｎｓ，１９９５；Ｃｅｌｌ，８３，８４１−８５０；Ｒｏｂｙｒら，２０００，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１４，３２９−３４７）。若干のＮＲ（例えば、アンドロゲン受容体（ＡＲ））について、Ｎ末端領域が、Ｃ末端領域と相互に作用し得ることが検出された（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら１９９９，Ｊ．ＳｔｅｒｏｉｄＢｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，６９，３０７−３１３）。例えば、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）、鉱質コルチコイド受容体（ＭＲ）およびアンドロゲン受容体（ＡＲ）などのステロイドホルモン受容体は、プロゲスチン、エストロゲン、糖質コルチコイドおよび鉱質コルチコイド、ならびにアンドロゲンなどのプレグネノロンに由来するステロイド性リガンドと結合する。リガンドとの結合により、受容体が活性化され、該当の目的遺伝子の発現を制御する。
【００１８】
上記で説明したように、本発明の方法の工程ａ）では、コモジュレーターまたはそのフラグメントをコードするＤＮＡを有するベクターを含有する細胞が用いられる。
【００１９】
コモジュレーターは、遺伝子転写の活性化（コアクチベーター）ないしは抑制（コリプレッサー）時に、転写開始複合体とＮＲ間の架橋分子として働くクラスのタンパク質である（ＭｃＫｅｎｎａら，１９９９，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．，２０，３２１−３４７）。コアクチベーターは、受容体機能を増強し、作動剤の存在下でＮＲの活性化ドメインと直接相互に作用できなければならない。コアクチベーターは、基準の転写機構とも相互作用するにちがいないが、最終的に、基準の転写活性自体を増強してはいけない。大部分のコモジュレーターは、一つ以上のＬＸＸＬＬモチーフ（ＮＲ−Ｂｏｘ）を用いてＮＲのＡＦ−２ドメインと相互作用するが、他のＮＲ領域と相互作用する若干のコモジュレーターもまた記載されている（Ｄｉｎｇら，１９９８，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１２，３０２−３１３）。さらに、類似の方法で幾つかの様々なＮＲと相互に作用する多くのコモジュレーターが既に同定されているので、好都合なことに、それぞれのコモジュレーターの特異性の程度を試験できるようになるだろう。
【００２０】
本発明の方法の１つの好ましい実施態様では、ＡＲＡＰ１１と表記したコモジュレーターまたはアミノ酸８１３〜１３９０を含むＡＲＡＰ１１のフラグメントを使用する。コモジュレーターＡＲＡＰ１１の１３９０個のアミノ酸を有するｃＤＮＡ配列またはアミノ酸配列が、配列番号１または配列番号２で示される。これらのタンパク質を使用すると、特に、低コストで、簡易、迅速、高感度の信頼し得る様式で、本発明の方法を実行し得る。さらに、ＡＲＡＰ１１フラグメント、特に、ＡＲＡＰ１１のアミノ酸８１３〜１３９０を有するフラグメントは、簡単に取り扱え、クローニングし得るが、なおＡＲＡＰ１１の機能的特性を示すという利点を有する。
【００２１】
ＡＲＡＰ１１は、ヒトアンドロゲン受容体や、アンドロゲンとその受容体間の相互作用を増強する他の核内受容体に対するコアクチベーターである。ＡＲＡＰ１１の配列の一部分は、すでにＧｅｎｂａｎｋＸＭ００５２５３においてＰｒｏ２０００として記載されている。ただし、そこには機能はなにも報告されていない。今では、すでにＧｅｎｂａｎｋから既知の配列と比較して、ＡＲＡＰ１１のアミノ酸配列が公知配列よりも大きく、つまり、Ｎ末端領域にさらに別のアミノ酸を有することが確認された。さらに、核内受容体間（特に、一方がＡＲで他方がＡＲＡＰ１１）の相互作用ならびにＡＲ介在性トランス活性化の増強を確認し得た。ＡＲＡＰ１１は、核内受容体にステロイドが結合した後、転写作用を増強または抑制し、さらに、以前はホルモン作用がないとみなされた分子と核内受容体の結合および活性化を促進することによってコメディエーターとして機能するタンパク質である。
【００２２】
タンパク質ＡＲＡＰ１１は、アンドロゲン受容体および、エストロゲン受容体α、エストロゲン受容体β、プロゲステロン受容体Ａ、プロゲステロン受容体Ｂ、糖質コルチコイド受容体、鉱質コルチコイド受容体、甲状腺ホルモン受容体、ビタミンＤ受容体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体、レチン酸受容体、レチノイドＸ受容体およびオーファン受容体など、さらに別の核内受容体のコアクチベーターである。従って、本発明の方法では、これらの受容体を用いるのが好ましい。何故なら、それによって、本発明の方法の利点が特に好都合に達成され得るからである。
【００２３】
本発明の方法において、上記タンパク質のフラグメントをコードするベクターもまた使用し得る。上記タンパク質に関連した用語「フラグメント」とは、全長が上記タンパク質よりも短い１または複数のアミノ酸を含み、核内受容体またはコモジュレーターの機能的特性を示すものを指すと理解する。
【００２４】
すでに上記で説明したように、本発明の方法の工程ａ）では、特定タンパク質をコードするＤＮＡを含む二つのベクターで形質移入した細胞を用いる。従って、これらの細胞は、これら両方の異なるタンパク質を発現し得る。
【００２５】
特に、細胞は、株化細胞および／または真核細胞、特に、前立腺細胞、神経細胞、グリア細胞、繊維芽細胞、血球、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞、上皮細胞または筋細胞である。株化細胞を用いると、本発明の方法を特に低コストかつ迅速に実行し得る。真核細胞、特に、上記の真核細胞を用いると、本発明の方法を用いて都合よく特に証拠性の高い結果を獲得し得る。
【００２６】
本発明の方法の一好適実施態様では、真核性発現ベクター、例えば、ｐＣＭＸまたはｐＳＧ５を用いる。このベクターを、特に、上記の株化細胞および／または真核細胞に用いる場合、本発明の方法を、特に、好都合に、迅速に実行でき、特に証拠性の高い結果が得られる。
【００２７】
当業者には、上記のタンパク質をコードするＤＮＡをベクター内に挿入し、これを細胞に導入し、得られた細胞を、これらのタンパク質を発現し得るような適当な条件下で培養するための方法とそれに必要な物質が公知である。
【００２８】
本発明の方法の工程ｂ）によれば、核内受容体またはそのフラグメントがコモジュレーターまたはそのフラグメントの存在下で誘発する転写活性を測定することができる。これは、例えば、レポーター遺伝子を検出することにより行い得る。
【００２９】
レポーター遺伝子は、この配列の活性を検出可能にするため、他の遺伝子または調節配列と連結される遺伝子または遺伝子フラグメントである。レポーター遺伝子は、例えば、呈色反応により光度測定法で、できるだけ簡単に検出できる遺伝子生成物を産生する。よく用いられるレポーター遺伝子は、β−ガラクトシダーゼに対する遺伝子、アルカリ性ホスファターゼに対する遺伝子、クロラムフェニコール−アセチルトランスフェラーゼに対する遺伝子、カテコール−ジオキシゲナーゼに対する遺伝子、「緑色蛍光タンパク質」の遺伝子ならびに細胞を発光させ得る種々のルシフェラーゼに対する遺伝子である。
【００３０】
そのようなレポーター遺伝子も、同様に、ベクター、特に真核性発現ベクターを用いて細胞内に導入し得る。レポーター遺伝子をコードするＤＮＡを含むベクター例は、ベクターＭＭＴＶルシフェラーゼで、物質のアンドロゲン作用の測定に用いられる。
【００３１】
ホルモン作用、特に、アンドロゲン／抗アンドロゲン作用を有する物質は、レポーター遺伝子活性の上昇ないしは低下によって識別することができる。
工程ｂ）における、受容体またはそのフラグメントと、コモジュレーターまたはそのフラグメントとの間の相互作用に及ぼす試験物質の影響の測定は、同様に、例えば、二重ハイブリッド系、免疫沈降、ＧＳＴプルダウンアッセイ、ＦＲＥＴ分析およびＡＢＣＤアッセイによるタンパク質−タンパク質相互作用の測定ならびにゲル保持アッセイによるタンパク質−タンパク質−ＤＮＡ相互作用の測定により行い得る。
【００３２】
さらに、ＡＲＡＰ１１は、高齢になると一部発症するアンドロゲン誘発性疾患の指標として非常に良好に使用し得ることが認められた。例えば、前立腺癌、勃起能力機能障害、不妊、脱毛症、アクネまたは性機能低下などの関連アンドロゲン誘発性疾患ならびに、例えば、睾丸性女性化症などのアンドロゲン耐性症候群は、ＡＲとＡＲＡＰ１１間の共同調節機序の欠損に基づくものである。従って、そのような障害患者でのＡＲおよびＡＲＡＰ１１の相対濃度の測定は、一つの方法である。この測定は、好都合なことに、体液、体細胞または体組織を用いて体外で行われる。これは、それぞれの患者で両分子の相対量を測定する定量的方法を用いることにより可能になる。その方法では、例えば、ＡＲおよびＡＲＡＰ１１に対する抗体またはそれらのｍＲＮＡに対する核酸プローブを使用し得る。この比較比を測定するのに幾つかの方法があり、これらの方法は、当業者にとって公知である。同様に、当業者には、これに適した物質および、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ試験、免疫染色、ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット、ノーザンブロット、ＤＮＡチップまたはタンパク質チップなどの装置も周知である。さらに、通常の方法でＡＲＡＰ１１−ｃＤＮＡを用いて、ＰＣＲアッセイのプローブを構築し得る。このアッセイを用いて、特定の患者で正常なＤＮＡ配列の変異を検出し、またはノーザンブロットアッセイの転写物ないしはｉｎｓｉｔｕハイブリッダイゼーションアッセイのＤＮＡを生成させ得る。
【００３３】
その際、ＡＲ対ＡＲＡＰ１１の測定比は、健常者の場合よりも大きくまたは小さくなり得る。健常者での正常値は、例えば、多数の健常被験者でＡＲ対ＡＲＡＰ１１の比を算出することによって簡単に測定し得る。正常値を検査すべき患者のＡＲ対ＡＲＡＰ１１の算出比と比較することにより、算出比の値が正常値よりも大きいか、小さいかを確認し得る。
【００３４】
ＡＲＡＰ１１および／またはＡＲの濃度は、例えば、ＡＲＡＰ１１濃度は睾丸中で非常に高く、それに反して肝臓、心臓、胸腺および前立腺で低くなり、組織によって異なり得るので、評価には、様々な組織の濃度を考慮しなければならない。すなわち、試験値および正常値は、同じ組織に由来すべきである。
【００３５】
ＡＲとＡＲＡＰ１１間の共同調節機序の欠損は、ＡＲＡＰ１１濃度だけを測定する別の方法で測定し得る。その方法では、ＡＲ濃度が少なくとも、ほぼ一定であることに由来する。この場合、正常値より低いＡＲＡＰ１１濃度が測定されたら、ＡＲ対ＡＲＡＰ１１比が変動したことを意味し、これは同様に、指標として共同調節機序障害を示す。
【００３６】
従って、ＡＲＡＰ１１に特異的なプローブを用いてＡＲＡＰ１１発現変化を測定し、それを用いてＡＲに対する比を測定し得る。そのような変化は、種々の病像に因果関係的に付随するか、または続発症として発生し得る。
【００３７】
このようなＡＲ／ＡＲＡＰ１１比ないしはＡＲＡＰ１１の測定は、例えば、アンドロゲン抵抗性症候群が目的細胞中のＡＲ−とＡＲＡＰ１１優勢間の平衡障害により得るというＡＲＡＰ１１の同定および特性決定に基づく驚くべき知見に拠る。ＡＲＡＰ１１が高すぎると、ＡＲ系の過敏症が起こり、通常はアンドロゲン作用を持たない分子と反応し得るようになる。逆に、あらゆるレベルでＡＲＡＰ１１が欠失するかまたは機能不全であると、アンドロゲン抵抗性が生じる。高すぎるＡＲＡＰ１１が検出された患者では、臨床条件下でそれぞれの患者のＡＲＡＰ１１力価を低下させるため、例えば、アンチセンス−または類似の薬剤など、ダウンレギュレーションする薬剤の適用が支持されるだろう。同じことをＡＲとＡＲＡＰ１１間の相互作用を阻止できる分子によっても達成し得る。患者のＡＲＡＰ１１が低すぎれば、このように、活性ＡＲＡＰ１１の力価を高めるため、それ自体公知の種々の機序を介してＡＲＡＰ１１ｃＤＮＡ、ＡＲＡＰ１１タンパク質またはＡＲＡＰ１１ＤＮＡを患者に供給し得る。低分子医薬品により、または特異的なＡＲＡＰ１１プロモータータンパク質を用いる自己合成刺激により、ＡＲＡＰ１１の濃度または活性を上昇させることも可能である。
【００３８】
本発明の方法に関する上記の説明から明らかなように、タンパク質ＡＲＡＰ１１は本方法を実行するのに最も適している。従って、本発明の対象は、さらに、配列番号２のアミノ酸配列を有するＡＲＡＰ１１またはこのタンパク質のアミノ酸８１３〜１３９０を有するＡＲＡＰ１１フラグメントである。
【００３９】
本願のさらなる対象は、ＡＲＡＰ１１またはそのフラグメント（特にアミノ酸８１３〜１３９０を有するフラグメント）をコードするＤＮＡならびにそれとハイブリダイズするＤＮＡである。用語「ハイブリダイズするＤＮＡ」は、通常の条件下、特に、ＤＮＡの融点下、２０℃でコーディングＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡを示す。
【００４０】
以下の実施例は、本発明を詳しく説明するものであるが、それに限定されない。
実施例１：ＡＲＡＰ１１によるアンドロゲン受容体シグナルの同時活性化
ヒト胎児脳由来のｃＤＮＡライブラリー（ＣｌｏｎｔｅｃｈＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ）およびプローブ（図１）としてアミノ酸３２５〜９１９をコードするヒトＡＲフラグメントを使用して、通常の２ハイブリッド酵母系を用いてアンドロゲンの存在下でスクリーニングを行った。製造業者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の使用説明書通りにスクリーニングしたクローン数は６×１０⁷であった。独立したクローン数は、製造業者の記述によれば、３．５×１０⁶であった。その中から３５０陽性クローンを選択し、βガラクトシダーゼアッセイを用いて試験した。そのアッセイでは、ｌａｃＺ陽性クローンとして２４０クローンが確認された。これらのクローンの挿入体をＰＣＲにより増幅した。制限フラグメント分析および配列決定を用いて、少なくとも１７の種々のクローンを同定した。その内の一つは、１１６９ｂｐの包括的インサート（３２４３ｂｐ〜４４１２ｂｐ）を有するクローンであった。このインサートは、ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の１部をコードする。この配列は、すでにＰｒｏ２０００（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号ＸＭ００５２５３）に記載したＯＲＦのほぼ完全な部分も含む。
【００４１】
通常のＰＣＲ方法を用いて、次ぎに、コーディングＡＲＡＰ１１−ｃＤＮＡを完全長でクローンニングした。コーディングＡＲＡＰ１１−ｃＤＮＡは、１３９０アミノ酸から構成されるタンパク質（配列番号２）をコードし、３６２アミノ酸のタンパク質を表す、これまでに知られていたＰｒｏ２０００配列を著しく超える。５’と３’の非翻訳領域を合わせて、ここに記載の配列は、４４１２ｂｐの長さを有する（配列番号１）。
【００４２】
図２は、ノーザンブロット分析を用いるそれ自体公知の方法で算出したＡＲＡＰ１１の組織分布を示す。種々のヒト組織から単離したポリＡ＋ＲＮＡ（２μｇ）をホルムアルデヒド含有アガロースゲルを用いて分離し、ナイロン膜上にブロットした後、標識ＡＲＡＰ１１−ｃＤＮＡフラグメントとハイブリダイズさせた。図２ａと２ｂに記載の実験には、ＡＲＡＰ１１のｃＤＮＡ配列の３１１１〜４２１７ｂｐのフラグメントを用い、図２ｃに記載の実験には、２０６５〜２４７６ｂｐのフラグメントを用いた。洗浄後、膜をフィルム上に置き、２４時間（図２ａと２ｃ）または８日間（図２ｂ）露光後、現像した。図２から読み取れるように、ＡＲＡＰ１１の発現は睾丸中で非常に強く、それに対して肝臓、心臓、胸腺および前立腺では弱くしか検出されなかった。その際、二つの転写物（６．０ｋｂと５．２ｋｂ）が認められた。
【００４３】
ＡＲＡＰ１１のｃＤＮＡ配列の２０６５〜２４７６ｂｐの４１１ｂｐからなるフラグメントのプローブを用いても、睾丸中に二つの同じ大きさの転写物が検出されたため、検出された転写物は、図２ａと２ｂで３１１１〜４２１７のプローブで検出された転写物と同一であると考えられ得る。これは、ＧｅｎｂａｎｋにＸＭ００５２５３で寄託されたＰｒｏ２０００の配列が不完全であり、５’領域が２４８０ｂｐだけ長いことを証明するものである。
【００４４】
ＰＣＲを用いて得られた、アミノ酸８１３〜１３９０のＡＲＡＰ１１フラグメントをコードするＡＲＡＰ１１−ｃＤＮＡを通常の方法でベクターＣＭＸに入れてクローニングし、ｐＳＧ５−ＡＲおよびＭＭＴＶルシフェラーゼを用いて同様に通常の方法でＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞内に形質移入した。
【００４５】
図３から読み取れるように、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞でのＡＲＡＰ１１−ｃＤＮＡの一過性形質移入は、特に１０^-10〜１０^-12Ｍの低アンドロゲン濃度でＡＲシグナル作用の強い同時活性化をもたらした。そのため、ウェルを設けた細胞培養シャーレのウェル当り３×１０⁵細胞を１μｇコアクチベーター（ＡＲＡＰ１１−３もしくはＡＲＡＰ１１−１、それぞれＡＲＡＰ１１のアミノ酸８１３〜１３９０をコードする）のＣＭＸ、ないしは対照プラスミドとして１μｇのＣＭＸ、１．５μｇのＭＭＴＶルシフェラーゼプラスミドおよび０．７５μｇのｐＳＧ５ＡＲプラスミドで形質移入し、２４時間後、アンドロゲンとして上記濃度のジヒドロキシテストステロン（ＤＨＴ）で処理した。さらに２４時間後に形質移入細胞を収穫し、レポーター遺伝子のルシフェラーゼ活性を測定した。さらに、標準化のため、総細胞タンパク質量を測定した。形質移入沈積物および物質濃度ごとに、実験一回とそれぞれ４回の測定を行った。偏差はＳＤとして記載した。全シグナルで、ＤＨＴなしの該当対照値を差し引いた。活性は、相対単位で記載してある。
【００４６】
実施例２：ラット睾丸中のＡＲＡＰ１１の測定
図４は、ラット睾丸中のＡＲＡＰ１１とβ−アクチンの発現を示す。ラット睾丸組織からポリＡ＋ＲＮＡ（４μｇ）を単離し、ホルムアルデヒド含有アガロースゲルで分離し、ナイロン膜上に移し、標識化ＡＲＡＰ１１−ｃＤＮＡフラグメント（２２２６〜４２２８ｂｐ）か標識化β−アクチンｃＤＮＡ（ラット）のいずれかとハイブリダイズさせた。洗浄後、膜をフィルム上に置き、５日間露光後、現像した。ラットの睾丸組織中にＲＮＡ転写物（６．０ｋｂ）が認められた。レーン１に３週齢ラットの単離ＲＮＡ、レーン２に６週齢ラットの単離ＲＮＡおよびレーン３に２年齢ラットの単離ＲＮＡをアプライした。ＡＲＡＰ１１遺伝子発現の明らかな年齢に起因する依存性が認められる。このとき、β−アクチン遺伝子の発現は変化を示さない。出生後６週間でＡＲＡＰ１１の発現が明らかに低下し（５０％超）、老齢ラット（２年）ではさらに極僅かのＡＲＡＰ１１遺伝子の発現しか確認できない。コモジュレーターＡＲＡＰ１１の遺伝子発現変化の類似した挙動が、病像で予期し得る。
【００４７】
【発明の効果】
本発明によれば、低コストで簡易、迅速、高感度の信頼し得る様式で、環境関連的または薬理学的に重要な物質がアンドロゲン又は抗アンドロゲン作用を誘発するかどうかを試験することができる。
【００４８】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】アンドロゲンの存在下でＡＲＡＰ１１と相互作用可能な、アミノ酸３２５〜９１９にわたるアンドロゲン受容体ドメイン（ＡＲ２）を符号で図示したアンドロゲン受容体である。
【図２】ＡＲＡＰ１１の組織分布を示す。
【図３】ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞でのアンドロゲン受容体シグナルの同時活性化を示す。
【図４】ラット睾丸中のＡＲＡＰ１１およびβ−アクチンの発現を示す。

Claims

ある物質のアンドロゲン又は抗アンドロゲン作用の試験方法であって、前記方法は、
ａ）一方のベクターはアンドロゲン受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含み、かつ他方のベクターはコモジュレーターまたはそのフラグメントをコードするＤＮＡを含む二つのベクターで形質移入した細胞を物質に暴露する工程と、
ｂ）アンドロゲン受容体がコモジュレーターまたはそのフラグメントの存在下で誘発する転写活性か、前記アンドロゲン受容体と前記コモジュレーターまたはそのフラグメントとの間の相互作用に及ぼす該物質の影響か、の少なくともいずれか一方を、タンパク質−タンパク質相互作用またはタンパク質−タンパク質−ＤＮＡ相互作用により測定する工程と、から成り、
前記コモジュレーターが配列番号２のアミノ酸配列からなるＡＲＡＰ１１であり、かつ
前記コモジュレーターのフラグメントが前記ＡＲＡＰ１１のアミノ酸８１３〜１３９０からなる方法。
細胞が株化細胞か真核細胞の少なくともいずれかである、請求項１に記載の方法。
真核細胞が、前立腺細胞、神経細胞、グリア細胞、繊維芽細胞、血球、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞、上皮細胞または筋細胞から選択される、請求項２に記載の方法。
ベクターが真核性発現ベクターである、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
配列番号２のＡＲＡＰ１１のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、アンドロゲン受容体に対してコモジュレーター特性を有するタンパク質。
請求項５に記載のタンパク質のフラグメントであって、前記フラグメントは前記ＡＲＡＰ１１のアミノ酸８１３〜１３９０からなるフラグメント。
請求項５に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
請求項６に記載のタンパク質のフラグメントをコードするＤＮＡ。