JP2004000543A

JP2004000543A - ポリリン酸と水溶性コラーゲンの複合体材料とその製造方法

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Publication number: JP2004000543A
Application number: JP2003103986A
Authority: JP
Inventors: Hatsuichi Shiba; 柴　肇一; Toshie Shiba; 柴　利江; Minoru Yamaoka; 山岡　稔; Takashi Uematsu; 上松　隆司; Etsuji Takahashi; 高橋　悦治; Hitoshi Tanaka; 田中　仁
Original assignee: SHIBARIE GIJUTSU KENKYUSHO KK
Current assignee: SHIBARIE GIJUTSU KENKYUSHO KK
Priority date: 2002-04-08
Filing date: 2003-04-08
Publication date: 2004-01-08
Anticipated expiration: 2023-04-08
Also published as: JP4698932B2

Abstract

【課題】ポリリン酸の組織再生促進効果を利用した新しい生体適合性医療材料であって、医療材料としてより利用しやすく、かつポリリン酸の組織再生促進作用を有効に発揮し得るような、ポリリン酸と基材とを含む材料を提供する。
【課題手段】少なくとも１つのポリリン酸とコラーゲンとが結合してなる、ポリリン酸−コラーゲン複合体、及びその製造方法。
【選択図】　なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、骨、皮膚、内臓等の各種生体組織の組織再生を促進する生体適合性材料、及びその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ポリリン酸については、ＦＧＦ等の細胞成長因子を安定化することにより、細胞増殖効果及び組織再生効果をもつことが報告されている（特許文献１）。またポリリン酸は、骨分化促進効果も併せ持ち骨再生に効果があることも報告されている（特許文献２）。また、ポリリン酸の生体に対する安全性は古くから確かめられており、生体内で無毒なリン酸に分解される生分解性物質であることがわかっている。
【０００３】
一方、ポリリン酸は通常、水溶液として提供されているため、組織再生効果を生体組織に対して利用するためには、患部にポリリン酸を一定期間留めて効果を持続させることができる基材と混合することが必要となる。そこで従来は、ポリリン酸水溶液をコラーゲンスポンジやコラーゲンシート、カルボキシメチルセルロース、ポリ乳酸等の生体適合性材料（基材）にしみ込ませることで、複合材料を作製し、ポリリン酸含有組織再生材料として利用することが試みられている。
【０００４】
しかしながら、ポリリン酸水溶液を基材にしみ込ませる方法では、基材に正確な量のポリリン酸を均等に含有させることが難しく、一定の品質をもったポリリン酸含有製品を作製するのが困難となる。また、ポリリン酸が基材自体に強固に付着しない性質を有するために、患部に適応した時にポリリン酸のみが簡単に基材より遊離し、分解されやすいという問題もある。また、ポリリン酸をしみ込ませる操作によって基材自体の形状が変化してしまい、患部に適応しやすい形状で基材を利用するのが難しくなることもある。逆に、ポリリン酸をしみ込ませた後で、その基材を患部に適応しやすい形に成形することも困難である。
【０００５】
【特許文献１】
特開２０００−０６９９６１号公報
【特許文献２】
特開２０００−０７９１６１号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記のようなポリリン酸と基材との混合状態における問題を解決すべく、医療材料としてより利用しやすく、かつポリリン酸の組織再生促進作用を有効に発揮し得るような、ポリリン酸と基材とを含む材料を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、特定条件下でポリリン酸とコラーゲンとを混合することにより、ポリリン酸とコラーゲンとが結合した不溶性の複合体を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］　少なくとも１つのポリリン酸とコラーゲンとが結合してなる、ポリリン酸−コラーゲン複合体。
但しこの複合体のポリリン酸は、一般式　（Ｐ_ｎＯ_３ｎ＋１）^{（ｎ＋２）−}（式中、ｎは２〜５０００の整数を表す）で示される少なくとも１種のものであり得る。このポリリン酸は直鎖縮合ポリリン酸でもあり得る。該ポリリン酸は、上記式中のｎが２０〜２０００の整数であることがより好ましい。また、上記コラーゲンは好ましくはアテロコラーゲンである。さらに、上記複合体中のポリリン酸：コラーゲンの重量比は、０．１％：９９．９％〜２０％：８０％であることが好ましい。
［２］　上記［１］記載の複合体を含有する組織再生促進用医療材料。
［３］　上記［１］記載の複合体を含有する歯周病治療用医療材料。
［４］　濃度が０．５〜１０重量％のポリリン酸溶液と、濃度が０．１〜１０重量％のコラーゲン溶液とを混合し、生成される析出物を採取することを特徴とする、ポリリン酸−コラーゲン複合体の製造方法。
この方法における混合は、ｐＨ５．０〜８．０の条件下で行うことが好ましい。また、ここで用いるポリリン酸溶液は、ポリリン酸溶液が、一般式　（Ｐ_ｎＯ_３ｎ＋１）^{（ｎ＋２）}　Ｈ（式中、ｎは２〜５０００の整数を表す）で示される少なくとも１種のポリリン酸又はその塩の溶液であり得る。該ポリリン酸は、上記式中のｎが好ましくは２０〜２０００の整数であるものであり得る。ポリリン酸溶液は、平均鎖長６０〜７０のポリリン酸又はその塩の溶液であってもよい。また、コラーゲン溶液に含まれるコラーゲンは水溶性コラーゲン、特にアテロコラーゲンであることが好ましい。さらに、製造されるポリリン酸−コラーゲン複合体のポリリン酸：コラーゲンの重量比が０．１％：９９．９％〜２０％：８０％であることが好ましい。
［５］　濃度が０．１〜１０重量％のヘキサメタリン酸溶液と、８７〜１００％エタノールとを２：１〜９：１の体積比で混合し、析出したポリリン酸を反応液から分離することを特徴とする、平均鎖長６０〜７０のポリリン酸の濃縮分離方法。ここで、「平均鎖長」とは、上記ｎの値の平均値を意味する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明は、組織再生促進作用を有するポリリン酸と基材とが結合した複合体であり、その複合体を分離して材料として使用することにより、生体組織においてポリリン酸の組織再生促進作用を発揮させることができる医療材料である。
【００１０】
本発明では、ポリリン酸と基材の複合体を作製するにあたり、基材に、最も適した材料としてコラーゲンを選択した。本発明に従って、ポリリン酸溶液とコラーゲン溶液とを後述する特定の条件下で混合させることにより、不溶性のポリリン酸−コラーゲンの複合体を形成させることができる。この複合体は不溶性でゲル状の形態をとり、濾過や遠心分離により容易に溶液から分離することができる。このポリリン酸−コラーゲン複合体はゲル状形態のまま組織再生促進用材料として患部に適用することも可能であるし、乾燥させて、ブロック状やスポンジ状、シート状、繊維状、メッシュ状等に容易に成形することも可能である。また、この複合体は、ポリリン酸含有量が一定であり、さらにポリリン酸が容易に基材から遊離することがないため、均一な品質を備えた医療材料として製造することができて有用である。本発明の医療材料は、本発明にかかるポリリン酸−コラーゲン複合体に、必要に応じて他の成分（架橋剤、生物学的活性物質など）を加えたものであってもよい。また本発明の医療材料の形状は、特に限定されないが、ゲル状形態のものであってもよいし、乾燥させた後に所望の形状に成形したものであってもよい。
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．ポリリン酸
コラーゲンと結合して本発明の複合体を形成させるポリリン酸としては、限定するものではないが、オルトリン酸が脱水縮合して得られる直鎖縮合ポリリン酸（ヘキサメタリン酸を含む）、側鎖に有機基が導入された側鎖ポリリン酸及び環状ポリリン酸等が挙げられる。好ましくは該複合体中のポリリン酸は、一般式「（Ｐ_ｎＯ_３ｎ＋１）^{（ｎ＋２）−}」で表されるポリリン酸イオンであり、特に、２個以上のリン酸（ＰＯ_４）四面体が頂点の酸素原子を共有して直鎖状に連なった構造をした直鎖縮合ポリリン酸イオンである。本発明においては、上記一般式中のｎは少なくとも２以上の整数であって、好ましくは２〜５，０００、より好ましくは５〜５，０００、更に好ましくは１５〜２，０００、最も好ましくは２０〜２，０００である。本発明において、中長鎖のポリリン酸を使用する場合には、上記一般式中のｎは、好ましくは２０〜１，０００、より好ましくは３０〜５００、さらに好ましくは５０〜２００、なお好ましくは６０〜１００であり得る。本明細書中においては、ポリリン酸の鎖長とは、重合したリン酸の個数（上記一般式ではｎの値）を意味するものとする。従って、「平均鎖長」とは、重合したリン酸の個数（上記一般式ではｎ）の平均値を表す。
【００１２】
本発明のポリリン酸−コラーゲン複合体の製造においては、上記ポリリン酸イオンの供給源として、例えばオルトリン酸が脱水縮合して得られる直鎖縮合ポリリン酸（ヘキサメタリン酸を含む）、側鎖に有機基が導入された側鎖ポリリン酸若しくは環状ポリリン酸等のポリリン酸、及び／又はその塩の溶液を用いることができる。このようなポリリン酸は、一般式　（Ｐ_ｎＯ_３ｎ＋１）^{（ｎ＋２）}　Ｈで表され、かつ式中のｎが少なくとも２以上の整数であって、好ましくは２〜５，０００、より好ましくは５〜５，０００、更に好ましくは１５〜２，０００、最も好ましくは２０〜２，０００である化合物であることが好ましい。中長鎖のポリリン酸を使用する場合には、上記一般式中のｎは、好ましくは２０〜１，０００、より好ましくは３０〜５００、さらに好ましくは５０〜２００、なお好ましくは６０〜１００である。より一般的には、本発明においてポリリン酸−コラーゲン複合体の製造に用いるポリリン酸は、重合したリン酸の個数が２〜５，０００、好ましくは５〜５，０００、より好ましくは１５〜２，０００、さらに好ましくは２０〜２，０００であることが好ましい。本発明において中長鎖のポリリン酸を使用する場合には、該ポリリン酸の重合したリン酸の個数は、好ましくは２０〜１，０００、より好ましくは３０〜５００、さらに好ましくは５０〜２００、なお好ましくは６０〜１００である。本発明において、「ポリリン酸の塩」とは、ポリリン酸の水酸基の水素が金属と置換した分子構造をした化合物であり、この場合の金属としては、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等が挙げられる。
【００１３】
上記複合体の製造に用いるポリリン酸溶液は、以上説明したようなポリリン酸又はその塩の１種類のものを含むものでもよいし、複数種類のものを含むものでもよい。複数種類のポリリン酸又はその塩には、重合度の異なるポリリン酸又はその塩、分子構造の異なるポリリン酸又はその塩、及び金属イオンの異なるポリリン酸塩を包含する。また該ポリリン酸溶液は、ポリリン酸とその塩とを両方含むものでもよい。さらに、このように複数種類のポリリン酸又はその塩を含む溶液を上記複合体の製造に用いる場合、製造されるポリリン酸−コラーゲン複合体中のポリリン酸は、複数種類のポリリン酸であり得る。従って、本発明のポリリン酸−コラーゲン複合体中のポリリン酸は、１種又は複数種のものであり得る。
【００１４】
ところで、ポリリン酸の組織再生促進作用の点では、鎖長が２０以下の短いポリリン酸よりも、それ以上の長い鎖長のポリリン酸の方が効果が大きい。例えば、骨再生の指標となる骨芽細胞の骨分化促進を調べる実験において、骨芽細胞の培養液にポリリン酸を加える場合、その平均鎖長が１５のポリリン酸（ｎ＝１５）よりも、２５若しくは３５のポリリン酸を用いる方が骨形成促進効果が高い。従って、本発明の複合体を用いてポリリン酸の組織再生促進作用を発揮させる上では、２０以上の鎖長のポリリン酸を用いることが有利である。しかしながら一般に市販されている安価なポリリン酸は、ヘキサメタリン酸塩（ヘキサメタリン酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸カリウム等）であり、これは工業用もしくは食品添加物用の平均鎖長１５程度の直鎖ポリリン酸である。このヘキサメタリン酸塩に含まれるポリリン酸の鎖長は２０以下のものがほとんどであり、２０以上の鎖長のポリリン酸の含有率はごく低い。そこで本発明では、このように安価で容易に入手可能なヘキサメタリン酸塩を用いて、鎖長が２０以上の中長鎖ポリリン酸を取得する方法を新たに開発した。
【００１５】
この方法ではまず、ヘキサメタリン酸塩を０．１〜１０重量％、好ましくは１０重量％となるように水に溶解する。このヘキサメタリン酸水溶液に、８７〜１００％エタノール、好ましくは９６％エタノールを、ヘキサメタリン酸溶液とエタノールとの混合後の全体液量の１／１０〜１／３量で、すなわちヘキサメタリン酸水溶液：エタノールが２：１〜９：１の体積比となる量で添加する。この混合溶液を十分に攪拌し、その結果析出する沈殿物を、限定するものではないが、遠心分離またはフィルター濾過等の分離方法を用いて水溶液成分と分離する。このようにして分離した沈殿物が中長鎖ポリリン酸である。このポリリン酸を続いて７０％エタノールにより洗浄し、その後乾燥させる。このような分離操作で得られるポリリン酸の平均鎖長は６０から７０であり、１０以下の短鎖ポリリン酸はほとんど含まれていない（図１、レーン１及び２並びにレーン７参照）。したがって、この方法により得られるポリリン酸は、より高い組織再生促進作用を有するものである。このように、非常に安価な市販のヘキサメタリン酸塩を利用して、高い組織再生促進作用を有する中長鎖ポリリン酸を効率よく分離、濃縮することができるため、この本発明のポリリン酸の濃縮分離方法は有用である。
【００１６】
以上記載のようにして得られる中長鎖ポリリン酸、特に平均鎖長６０〜７０のポリリン酸は、本発明のポリリン酸−コラーゲン複合体の製造において好適に使用することができる。
【００１７】
２．コラーゲン
本発明の複合体を形成するための基材としては、生体適合性をもつ材料としてコラーゲンを用いる。コラーゲンとしては、黄紋構造を有する繊維状のタンパク質であり、限定するものではないが、主として軟骨以外の組織から得られるＩ型コラーゲン、ＩＩＩコラーゲン及びＶ型コラーゲン、主として軟骨組織から得られるＩＩ型コラーゲン、並びに網目状の会合体を形成しているＩＶ型コラーゲン及びＶＩ型コラーゲン等の各種コラーゲンが挙げられる。本発明においては、好ましくはこれらのコラーゲンは水溶性コラーゲンとして用いる。したがって本発明では、これらのコラーゲンは、そのタンパク質繊維の両端のテロペプチドを除去したアテロコラーゲンであることが望ましい。本発明のコラーゲンとして、例えば牛、豚、鶏、及び鮭等の魚類を含む動物の組織由来の水溶性コラーゲンであればすべて使用可能である。しかしながら、本発明で用いるコラーゲンは天然由来のものに限定されるものではなく、動物の生体組織から得られるものであってもよいし、遺伝子工学的手法を用いて微生物又は培養細胞におけるタンパク質製造により人工的に得られるものであってもよい。ヒトの体内に適用する場合には、抗原性及び微生物感染の危険性などを考慮し、ヒト由来又はヒト由来の遺伝子組換え体を用いることが好ましい。さらに、本発明で用いるコラーゲンは、後述するポリリン酸−コラーゲン複合体の形成を妨害しない限り、誘導体であってもよい。コラーゲン誘導体としては、エステル、エーテル、アミド、ウレタン、ウレア等の化学結合により、例えば水酸基、カルボキシル基、アミノ基、シアノ基、チオール基、飽和若しくは不飽和アルキル基、ベンゼン環、又は複素環構造を有する基等の各種官能基がコラーゲンに導入されているものが挙げられる。
【００１８】
３．ポリリン酸−コラーゲン複合体の製造
上記のポリリン酸とコラーゲンとを用いて、本発明の複合体を製造する方法について以下に述べる。
複合体のポリリン酸イオンの供給源として使用する上記記載のポリリン酸又はその塩は、ポリリン酸溶液の状態で用いる。このポリリン酸溶液は、滅菌蒸留水に溶解したものでもよいし、Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液又はリン酸緩衝液等の緩衝液に溶解したものでもよい。このときポリリン酸の濃度は０．５〜１０重量％であり、好ましくは１〜５重量％である。このような濃度のポリリン酸溶液と、０．１〜１０重量％、好ましくは０．１〜２重量％のコラーゲン溶液とを混合する。ここで、ポリリン酸溶液及びコラーゲン溶液の濃度は、溶解させたポリリン酸若しくはその塩、又はコラーゲンのそれぞれの乾燥重量の、各溶液の全重量に対するパーセンテージで示す。この混合を行う際には、ｐＨが５．０〜８．０であることが好ましく、特にｐＨ７．０〜８．０であることがより好ましい。このような条件下でポリリン酸とコラーゲンとを混合すると、不透明なゲル状物質が析出してくる。この析出物がポリリン酸−コラーゲン複合体である。
【００１９】
この複合体を、例えば遠心分離を行うか又はメッシュで濾過する等の任意の分離方法により水溶液成分と分離し、続いて何度か滅菌蒸留水で洗浄する。洗浄後のゲル状物質は、そのままでポリリン酸−コラーゲン複合体材料として利用することができる。あるいはこのポリリン酸−コラーゲン複合体は、乾燥させて使用及び保存することができる。この場合、例えば種々の形状の型に入れて凍結真空乾燥させることにより、所望の形状のポリリン酸−コラーゲン複合体材料とすることもできる。なお、このようなポリリン酸−コラーゲン複合体の析出は、ここに述べた溶液濃度範囲及びｐＨ条件下で、限定的に生ずる現象である。これまでに、本明細書で述べた方法でポリリン酸−コラーゲン複合体を形成させること及び複合体そのものに関する報告はされていない。
【００２０】
以上の方法により得られるポリリン酸−コラーゲン複合体は、ポリリン酸：コラーゲン＝０．１％：９９．９％〜２０％：８０％、好ましくは４．１％：９５．９％の乾燥後重量比を有する。この乾燥後重量比は、従来公知の手法により測定・算出することができる。例えばプラズマ発光分光分析法により乾燥させた複合体中のリン原子及び窒素原子の含有率を測定することができ、その複合体中のリン原子及び窒素原子の含有率からポリリン酸及びタンパク質であるコラーゲンの含有率を算出することができる。また、複合体の合成に用いたコラーゲンのみの乾燥重量を生成されたポリリン酸−コラーゲン複合体の乾燥重量から差し引くことによって、複合体の形成に寄与しているポリリン酸の乾燥重量を算出できる。このようにして算出される複合体の形成に寄与しているポリリン酸の重量と、複合体の合成に用いたコラーゲンのみの重量とについて、生成されたポリリン酸−コラーゲン複合体の重量に対するパーセンテージを算出し、それらの値を比の形で表すことによって、ポリリン酸−コラーゲン複合体中のポリリン酸：コラーゲンの重量比を求めることができる。このようにして測定される乾燥後重量比は、一定の条件範囲で本発明におけるポリリン酸−コラーゲン複合体製造を行う限り、得られるポリリン酸−コラーゲン複合体について均一な値が得られる。すなわち、本発明のポリリン酸−コラーゲン複合体は、コラーゲンに対して一定量のポリリン酸が結合している均一な物質である。
【００２１】
４．ポリリン酸−コラーゲン複合体を含有する組織再生促進用医療材料
上記の方法で製造されたポリリン酸−コラーゲン複合体は、生体適合性材料として様々な用途に使用することができる。特に、本発明のポリリン酸−コラーゲン複合体は、ポリリン酸の組織再生促進作用を利用して種々の組織再生促進用医療材料として使用することが可能である。
【００２２】
本発明のポリリン酸−コラーゲン複合体を各種材料として使用する際には、ゲル状の該複合体にさらに任意の添加剤等を適宜加えてもよい。例えば、該複合体に架橋剤を添加することにより、材料の柔軟性を変化させることができる。この場合、例えばポリフェノール系の架橋剤を添加することによって、複合体中のコラーゲンを架橋することもできる。このようなポリフェノール系架橋剤としては、生体適合性の観点から、タンニン酸、リグニン等の生体関連物質が好適である。このような架橋剤の使用量は、架橋によりコラーゲンのゲル化が阻害されないようにするには、コラーゲンに対して０．０５％〜５％であることが好ましい。また、上記複合体に紫外線を照射することによって、複合体中のポリリン酸を架橋することもできる。さらに、例えばポリリン酸の末端もしくは鎖の途中に適当な化合物を共有結合させ、その化合物を介して架橋する等の、当業者には公知の任意の架橋方法を、本発明の複合体に対して用いることができる。
【００２３】
また、添加剤として、本発明の複合体に生物学的活性を有する物質をさらに添加してもよい。このような添加剤としては、コラーゲンの合成を活性化するアスコルビン酸、リン酸カルシウム及びヒドロキシアパタイト等の生体適合性人工骨成分、ペニシリン系、セフェム系及びテトラサイクリン系製剤等の抗生物質、ＴＧＦ−βスーパーファミリー等の形質転換増殖因子、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−３等の骨形態形成タンパク質等が挙げられる。
【００２４】
以上記載のように材料として適宜調製した本発明のポリリン酸−コラーゲン複合体は、組織再生促進用医療材料、例えば歯周病治療用医療材料、骨再生促進用医療材料、人工臓器形成促進材料等として、有利に使用できる。
【００２５】
特に歯周組織の再生においては、ゲル状の上記複合体を歯周ポケット内に例えば０．０５〜０．５　ｍｌ程度注入することにより、歯周病のために破壊された歯槽骨や歯周靱帯、セメント質等の組織を積極的に修復する機能を発揮させることができる。また、乾燥させてシート状に成形した上記複合体を、細菌による汚染部位を除去した後の歯周ポケットに埋め込むことによって、ＥＮＡＰ手術、フラップ手術、ＧＴＲ法において組織再生を促すために非常に有用に使用することができる。このようなシート状の上記複合体は、例えば厚さ０．１〜３ｍｍ、０．２５〜１００　ｃｍ^２に成形したものを、幹部の歯周ポケットの形状に合わせて適宜切断・変形して用いればよい。また、該複合体を繊維状に形成し、該繊維を用いて布状若しくはメッシュ状の複合体材料を作製することもできる。このようにして作製した複合体材料は、シート状の複合体材料と同様、患部の面積、形状に合わせて適宜切断したり、変形させたりして使用すればよい。
【００２６】
本発明の複合体は、歯周組織再生促進材料としてだけでなく、その他の組織再生にも好適に使用できる。骨再生促進用には、本発明のゲル状の複合体をそのまま骨折部の隙間に塗り込むことによって骨再生の促進が期待できる。塗り込む複合体の量は、骨折部の面積に合わせて適宜決定すればよい。また、該複合体をブロック状形態もしくは患部の骨欠損部位に合わせた形態に成形し、そのまま骨欠損部位の修復促進用材料として利用することも可能である。例えば骨肉腫等の疾患において治療の結果骨の一部を欠損するケースにおいて、欠損部位を補い、骨再生を促進する目的で、欠損骨部位に適用して使用することができる。このような骨欠損部位の修復促進用材料は、例えば０．１〜１００　ｇの円筒形に成形したものであり得る。
【００２７】
また、本発明の複合体は、組織再生を促進するための人工皮膚又は人工臓器等の材料としても利用可能である。人工皮膚の場合は、該複合体材料をシート状又はメッシュ状に加工したものを火傷の患部等に適用することにより、真皮及び表皮の細胞の増殖を促し、傷口の早期治癒に貢献することが可能である。この場合、シート状又はメッシュ状の複合体材料は、患部全体が覆われるような面積及び形に裁断して使用すればよい。また傷が切り傷等であれば、ゲル状のものを直接患部に塗布し、組織再生を促進することも可能である。この場合の用量は患部の面積に合わせて適宜決定できるが、患部１０ｃｍ^２当り０．１〜１ｇが好ましい。
【００２８】
【実施例】
以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２９】
［実施例１］　中長鎖ポリリン酸の濃縮分離
食品添加物規格のヘキサメタリン酸ナトリウム２０ｇを精製水２００ｍｌに溶解し、これに９６％のエタノール３２ｍｌを徐々に加えた。これをよく攪拌し室温で３０分ほど放置した後，遠心分離（１０，０００×ｇ、２０分、２５℃）を行い、水溶液成分と沈殿物とを分離した。水溶液成分を廃棄し、回収した沈殿物に７０％エタノールを加えて洗浄し、真空乾燥した。このようにして、９．２ｇの中長鎖ポリリン酸塩を沈殿物として得た（収量４６．０％）。さらに、このポリリン酸塩をポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、その分子量を分析した。電気泳動には１５％ポリアクリルアミドゲルを用い、電気泳動後のゲルをトルイジンブルーによって染色して観察した。試料に含まれるポリリン酸の平均鎖長（平均分子量）は、既知鎖長のポリリン酸を鎖長マーカーとして同時に電気泳動し、その電気泳動結果と対比することによって、およその値を見積もった。この分析の結果である分子量分布は図１に示した。レーン１〜５は鎖長マーカーであり、レーン１は平均鎖長５、レーン２は平均鎖長１５、レーン３は平均鎖長３５、レーン４は平均鎖長４５、レーン５は平均鎖長６５のポリリン酸を示す。試料としては、レーン６には溶媒分割による中長鎖ポリリン酸分離前のヘキサメタリン酸ナトリウムを、レーン７には溶媒分割により分離した中長鎖ポリリン酸をロードした。
【００３０】
図１に示す通り、アルコールを用いた溶媒分割により食品添加物規格のヘキサメタリン酸ナトリウム（分離前；平均鎖長１５程度、図１、レーン６）から抽出されたポリリン酸は、レーン５に示された平均鎖長６５の鎖長マーカーポリリン酸とほぼ同等の移動度を示している（分離後；図１、レーン７）ことから、平均鎖長６０以上の中長鎖ポリリン酸を含むものであることが示された。従って、本発明の中長鎖ポリリン酸の濃縮分離方法により、ヘキサメタリン酸塩から平均鎖長６０以上の中長鎖ポリリン酸塩を抽出・分離することができることが示された。
【００３１】
［実施例２］　ポリリン酸−コラーゲン複合体の製造
ヘキサメタリン酸ナトリウムより実施例１に述べた方法で分離した中長鎖ポリリン酸塩１０．０　ｇを滅菌蒸留水１，０００　ｍｌに溶解した。その後、室温で鶏由来のアテロコラーゲン（アテロヘルゲン）２８６　ｇ（固形分１．７２　ｇ）を加え、ゲル状の析出物を得た。これをメッシュで濾過し７０％エチルアルコールで洗浄した結果、湿重量１２９．３　ｇの複合体を得た。さらにこれを真空乾燥機で乾燥することによって、乾燥重量２．７４　ｇの乾燥ポリリン酸−コラーゲン複合体を得ることができた。
【００３２】
このようにして製造したポリリン酸−コラーゲン複合体に含まれるリン原子の含有率をプラズマ発光分光分析法により定量分析した。その結果、該複合体に含まれるリン原子の割合は約４．５％であった。該複合体製造時に使用したコラーゲン中のリン原子量は検出限界値以下であったことから、ポリリン酸がコラーゲンと結合し、複合体を形成していることが証明された。また使用したポリリン酸塩のリン原子含有率は同様にプラズマ発光分光分析法により２９．８％と測定され、理論値である２９．５％とほぼ同等の結果が得られている。さらに、複合体製造時に使用するポリリン酸濃度を変化させても、得られた複合体に含まれるリン原子の含有率、すなわち複合体中のポリリン酸の含有率は変化しなかった。従って本発明のポリリン酸−コラーゲン複合体は、コラーゲンに一定量のポリリン酸が結合しているものであることが判明した。また、本実施例で得られたポリリン酸−コラーゲン複合体におけるポリリン酸：コラーゲンの乾燥重量比を、次の算出法により求めた。すなわち、複合体の合成に用いたコラーゲンのみの乾燥重量をポリリン酸−コラーゲン複合体の乾燥重量から差し引くことにより該複合体の形成に寄与しているポリリン酸の乾燥重量を算出し、算出されたこのポリリン酸の乾燥重量と、複合体の合成に用いたコラーゲンのみの乾燥重量とについて、ポリリン酸−コラーゲン複合体の乾燥重量に対するパーセンテージを算出し、それらの値を比の形で表すことによって、複合体中のポリリン酸：コラーゲンの重量比を求めた。その結果本実施例で製造されたポリリン酸−コラーゲン複合体におけるポリリン酸：コラーゲンの重量比は、４．１％：９５．９％と求められた。
【００３３】
［実施例３］　ポリリン酸−コラーゲン複合体の組織再生促進効果
次に、製造したポリリン酸−コラーゲン複合体の歯周組織再生効果を確認するために、ラットを用いて、歯周組織の再生実験をおこなった。Ｗｉｓｔｅｒ系雄ラット（８週齢、計１８匹）を麻酔し、１／２ラウンドバーを使用して下顎第一、第二臼歯の頬側歯槽骨頂より約２ｍｍを削除し、人工的な歯周ポケット（歯肉溝）を形成した。処理群（９匹）においては、シリンジを用いて、そのように形成した歯肉溝に実施例２で製造したポリリン酸−コラーゲン複合体を約０．１　ｍｌ注入した。また、比較群（９匹）には、コラーゲンのみを注入した。この注入操作は歯肉溝作製のための手術翌日から毎日行い、最長で３週間続行した。
【００３４】
一定期間処理したラットは吸入麻酔法（エンフルラン）にて安楽死させ、環流固定により組織の固定を行った。環流固定は生理食塩水３００　ｍｌを流し、その後１０％中性緩衝ホルマリン液（ｐＨ　７．４，　５００　ｍｌ）を血管中に流すことで行った。環流固定後、下顎骨を切断し、上記の１０％中性緩衝ホルマリン液を用いて、４℃で２４時間浸透固定した。その後１０％エチレンジアミン四酢酸溶液を用いて、４℃で約２週間脱灰した。脱灰終了後、第二臼歯で切除することによって標本のトリミングを行い、割面を下にして包埋し、−８０℃で凍結させた。凍結状態で組織切片を作製し、染色して光学顕微鏡下で観察した。また歯槽骨の骨再生面積に関して、切片上での骨面積を画像処理によって積算して、骨形成面積として測定した。
【００３５】
図２には、ポリリン酸−コラーゲン複合体（処理群）又はコラーゲンのみ（比較群）を注入したラットの組織染色の結果を示した。処理群においては歯槽骨の顕著な再生が認められ、骨改造も顕著であった。一方、比較群においては歯肉溝の治癒が認められただけで、歯槽骨の増加は認められなかった。
【００３６】
図３には骨形成面積の変化を示した。●はポリリン酸−コラーゲン複合体で処理した処理群、○はコラーゲンのみで処理した比較群（コントロール群）である。＊印は、ポリリン酸−コラーゲン複合体で処理した処理群の歯槽骨再生促進効果が、同週の比較群に対してＰ＜０．０５で有意であることを示す。ポリリン酸−コラーゲン複合体処理群（●）においては、コラーゲンのみで処理した比較群（○）のものと比べて、歯槽骨再生面積の著しい増大が示された。ポリリン酸−コラーゲン複合体処理群では、処理後１週間目においてすでに歯槽骨再生面積が比較群の２倍近くに達しており、歯槽骨再生が顕著に促進されていた。このように、ポリリン酸−コラーゲン複合体は、優れた骨再生促進効果を顕著かつ早期に発揮することができることが示された。
【００３７】
［実施例４］　歯槽骨再生促進効果におけるポリリン酸鎖長の影響
平均鎖長１５、３５、７５のポリリン酸ナトリウム（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｇｌａｓｓ、シグマ社製）を用いて、３種のポリリン酸−コラーゲン複合体を作製した。まず、各平均鎖長のポリリン酸ナトリウム１ｇを、ｐＨ　７．５の条件下で滅菌蒸留水１００　ｍｌに溶解して、３種のポリリン酸溶液を調製した。その後、室温で鶏由来のアテロコラーゲン（アテロヘルゲン）２８．６　ｇ（固形分０．１７２　ｇ）をそれぞれの溶液に加え、ゲル状の析出物を得た。それらをメッシュで濾過し７０％エチルアルコールで洗浄することにより、平均鎖長１５、３５、７５のポリリン酸をそれぞれ含有する３種のポリリン酸−コラーゲン複合体を得た。
【００３８】
次に、製造した３種のポリリン酸−コラーゲン複合体を用いて、ラットにおける歯周組織再生実験を行った。実施例３と同様にして、Ｗｉｓｔｅｒ系雄ラット（８週齢）を麻酔し、１／２ラウンドバーを使用して下顎第一、第二臼歯の頬側歯槽骨頂より約２ｍｍを削除し、人工的な歯周ポケット（歯肉溝）を形成した。処理群においては、シリンジを用いて、そのように形成した歯肉溝に上記のポリリン酸−コラーゲン複合体のうち１種を約０．１　ｍｌ注入した。処理群としては、平均鎖長１５のポリリン酸を含むポリリン酸−コラーゲン複合体で処理した群を処理群１、平均鎖長３５のポリリン酸を含むポリリン酸−コラーゲン複合体で処理した群を処理群２、平均鎖長７５のポリリン酸を含むポリリン酸−コラーゲン複合体で処理した群を処理群３とした。また比較群としては、コラーゲンのみで処理する群を比較群１、リン酸ナトリウム緩衝液とコラーゲンの混合液で処理する群を比較群２とし、それぞれの群で歯肉溝への注入（約０．１　ｍｌ）を処理群と同様に行った。全ての群にはそれぞれ３匹ずつのラットを用いた。なおこの注入は歯肉溝作製のための手術の翌日から毎日１回ずつ、１４日間継続して行った。
【００３９】
上記処理後、歯肉溝作製のための手術の１５日後に、各群のラットから実施例３と同様の手順で組織切片の標本を作製し、歯槽骨形成面積を測定した。３つの処理群及び２つの比較群に含まれるラット個体において測定された歯槽骨再生面積は、表１の通りであった。
【００４０】
【表１】

【００４１】
図４には、上記の歯槽骨再生面積の測定結果をグラフで示した。それぞれのポリリン酸−コラーゲン複合体で処理した処理群において、歯槽骨再生促進効果は、コラーゲンのみで処理した比較群１に対してＰ＜０．０１で有意に高かった（＊印）。
【００４２】
以上の結果は、ポリリン酸−コラーゲン複合体処理群においては、注入されるポリリン酸−コラーゲン複合体を構成するポリリン酸の平均鎖長が長いほど歯槽骨再生面積が大きくなることを示している。すなわち、平均鎖長のより長いポリリン酸を含む本発明のポリリン酸−コラーゲン複合体は、組織再生を促進する上でより高い効果を有することが証明された。
【００４３】
【発明の効果】
本発明のポリリン酸−コラーゲン複合体により、医療材料として利用しやすく、かつ組織再生促進作用を有効に発揮することのできる材料を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の中長鎖ポリリン酸濃縮分離法によって得られたポリリン酸の、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量分布の解析結果を示す。レーン１から５はポリリン酸の鎖長マーカーである。レーン１：平均鎖長５、レーン２：平均鎖長１５、レーン３：平均鎖長３５、レーン４：平均鎖長４５、レーン５：平均鎖長６５。レーン６：溶媒分割による中長鎖ポリリン酸分離前のヘキサメタリン酸ナトリウム（平均鎖長１５）。レーン７：溶媒分割により分離した中長鎖ポリリン酸（平均鎖長６０以上）。
【図２】図２は、ポリリン酸−コラーゲン複合体（処理群：右側パネル）又はコラーゲン（比較群：左側パネル）によって処理したラットにおける歯槽骨再生の様子を示す組織染色写真である。
【図３】図３は、ポリリン酸−コラーゲン複合体（処理群）又はコラーゲン（比較群）によって処理したラットにおける歯槽骨再生面積の変化を示すグラフである。●はポリリン酸−コラーゲン複合体で処理した処理群、○はコラーゲンのみで処理した比較群（コントロール群）である。＊印は、ポリリン酸−コラーゲン複合体で処理した処理群の歯槽骨再生促進効果が、同週の比較群に対してＰ＜０．０５で有意であることを示す。
【図４】図４は、平均鎖長の違うポリリン酸を用いて作製したポリリン酸−コラーゲン複合体により処理したラットにおける歯槽骨再生面積を示すグラフである。処理群１は平均鎖長１５のポリリン酸を含むポリリン酸−コラーゲン複合体で処理した群、処理群２は平均鎖長３５のポリリン酸を含むポリリン酸−コラーゲン複合体で処理した群、処理群３は平均鎖長７５のポリリン酸を含むポリリン酸−コラーゲン複合体で処理した群、比較群１はコラーゲンのみで処理した群、比較群２はリン酸緩衝液とコラーゲンの混合液で処理した群を示す。＊印は、当該群における歯槽骨再生促進効果が、比較群１における該効果と比較してＰ＜０．０１で有意に高いことを示す。

Claims

少なくとも１つのポリリン酸とコラーゲンとが結合してなる、ポリリン酸−コラーゲン複合体。
ポリリン酸が、一般式　（Ｐ_ｎＯ_３ｎ＋１）^{（ｎ＋２）−}（式中、ｎは２〜５０００の整数を表す）で示される少なくとも１種のものである、請求項１記載の複合体。
ポリリン酸が直鎖縮合ポリリン酸である請求項２記載の複合体。
式中のｎが２０〜２０００の整数である、請求項２又は３記載の複合体。
コラーゲンがアテロコラーゲンである、請求項１〜４のいずれか１項記載の複合体。
ポリリン酸：コラーゲンの重量比が０．１％：９９．９％〜２０％：８０％である、請求項１〜５のいずれか１項記載の複合体。
請求項１〜６のいずれか１項記載の複合体を含有する組織再生促進用医療材料。
請求項１〜６のいずれか１項記載の複合体を含有する歯周病治療用医療材料。
濃度が０．５〜１０重量％のポリリン酸溶液と、濃度が０．１〜１０重量％のコラーゲン溶液とを混合し、生成される析出物を採取することを特徴とする、ポリリン酸−コラーゲン複合体の製造方法。
ｐＨ５．０〜８．０の条件下で混合を行う、請求項９記載の方法。
ポリリン酸溶液が、一般式　（Ｐ_ｎＯ_３ｎ＋１）^{（ｎ＋２）}　Ｈ（式中、ｎは２〜５０００の整数を表す）で示される少なくとも１種のポリリン酸又はその塩の溶液である、請求項９又は１０記載の方法。
式中のｎが２０〜２０００の整数である、請求項１１記載の方法。
ポリリン酸溶液が平均鎖長６０〜７０のポリリン酸又はその塩の溶液である、請求項９〜１１のいずれか１項記載の方法。
コラーゲン溶液に含まれるコラーゲンが水溶性コラーゲンである、請求項９〜１３のいずれか１項記載の方法。
コラーゲン溶液に含まれるコラーゲンがアテロコラーゲンである、請求項１４記載の方法。
ポリリン酸−コラーゲン複合体のポリリン酸：コラーゲンの重量比が０．１％：９９．９％〜２０％：８０％である、請求項９〜１５のいずれか１項記載の方法。
濃度が０．１〜１０重量％のヘキサメタリン酸溶液と、８７〜１００％エタノールとを２：１〜９：１の体積比で混合し、析出したポリリン酸を反応液から分離することを特徴とする、平均鎖長６０〜７０のポリリン酸の濃縮分離方法。