JP2003536049A - 抗アポトーシス活性を有する化合物を識別する方法 - Google Patents
抗アポトーシス活性を有する化合物を識別する方法Info
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Abstract
Description
ty)を有する物質を識別する方法と該方法によって識別される物質とに関する
。また、本発明は、前記物質を含む製剤と血管の疾患の治療のための該製剤の使
用とにも関する。
ある。これは、血管容積の変化と内皮(内皮細胞)の病変とを伴い、したがって
血管壁の代謝および細胞反応がもたらされる。動脈血流の阻害が文明国において
はもっとも多い(約50%)死因である。動脈血流阻害の原因は大部分の場合動
脈硬化である。
酸素消費を低下させ、減少した冠動脈血流に適合させるということにもとづく。
これらの薬剤は、また、冠動脈の拡張をも引き起す。他方、動脈硬化性の冠動脈
狭窄の場合、病気にかかった血管を拡張させることはもはやできないので、冠動
脈血流を増大させる治療はほとんど不可能である。すべての薬剤が、疾患の非常
に遅い段階でしか作用しない。疾患の原因を直接に治療できるか、または早期診
断に適当でありうる薬剤はまだ知られていない。有効な早期診断の可能性がない
場合、大部分の患者は軽い心筋梗塞を起したあとにしか治療されない。進行した
段階では、通常、外科手術(たとえば、バイパス)のみが残された選択肢となる
。
の生理学的過程の調節、たとえば血圧の調節および血管の変性と再生、に関与し
ている。多くの病理学的状況には、内皮細胞の機能不全たとえば動脈硬化の限局
性進行、が伴う。
せることはできない。したがって、アポトーシス細胞の死は不可避である。
アポトーシス誘発物質を識別する方法が記載されている。免疫細胞の表面のイン
テグリンを伴う蛋白質(IAPまたはCD 47)に結合する物質がアポトーシ
スを誘発する能力を有しうる、ということが示されている。作用機構については
述べられていない。
提示されている(Schwartz、M.A.ほか、The Journal o
f Biological Chemistry、268:27、19931−1
9934)。この仮想的なカルシウムチャンネルの、アポトーシスの誘発におけ
る役割については、述べられていない。
点(分岐部)で頻繁に発生する。すでに、これらの病変領域におけるアポトーシ
ス内皮細胞を観察することが可能である。アポトーシス内皮細胞が動脈硬化の進
行に関与するということが示されている(Asakura、T.、Karino
、T.、Circulation Research、66、1045−106
6(1990))。
の薬剤は知られていない。
を見出すことのできる方法を提供するということである。この方法は、実施が簡
単であり、かつ実施における費用効率の高いものである。この方法で識別される
物質は、アポトーシスの阻止が必要である病気、特に血管の疾患特に好ましくは
動脈硬化の治療のための製剤の成分として使用すべきものである。
識別する方法であって、 i)IAPとインテグリンαvβ3との両方を発現する細胞を培養し、 かつ/または、 ii)前記細胞にアポトーシス誘発物質を生成させ、かつ/またはアポトーシスを
誘発する一つまたは複数の物質を加え、 iii)試験物質を加え、 iv)アポトーシス率を測定する、 ことを特徴とする方法、によって達成される。また、本発明は、特許請求の範囲
に記載された方法によって識別できる物質、該物質を活性成分として含む製剤、
および血管疾患の治療特に動脈硬化の治療のための前記製剤の使用をも含む。さ
らに、本発明は、本発明の方法によって識別された物質の、血管疾患の治療、特
に動脈硬化の治療のための使用を含む。
の、IAPとインテグリンαvβ3とへの同時結合により、内皮細胞におけるアポ
トーシスが誘発される。さらに、意外なこととして示しえたのは、TSP−1が
内皮細胞そのものによって生成され、したがってアポトーシスが自己誘発的また
は自発的であるということである。これらの研究は、通常の静置細胞培養によっ
てなされた。静置細胞培養というのは、細胞培養液内に流れが存在しない細胞培
養である。しかし、意外にも示すことができたのは、潅流培養では、すなわち細
胞が流動細胞培養液にさらされる条件下では、内皮細胞はTSP−1を生成せず
、したがってこの細胞培養液内ではアポトーシスはごくわずかな程度しか発生し
ないか、またはまったく発生しない。
トーシスが増大する。この増大は、大体、静置状態調節培養液(すなわち、すで
に静置培養液内でのHUVECの培養に使用した培養液)の効果に対応する(表
1)。これは、静置状態調節培養液は、媒介物質たとえばTSP−1により、ア
ポトーシスを誘発する能力がある、ということを示す。
いう言葉は、ここでは、他の細胞を培養するためにすでに使用された細胞培養液
を意味する。この培養液は、細胞培養中に細胞によって生成される可溶性媒介物
質たとえば成長因子、ホルモン、その他が溶解しているという点が特徴である。
、TSP−1が内皮細胞のアポトーシスの媒介物質である、ということを示すこ
とができた。添加TSP−1の効果は、静置状態調節培養液の効果とまさに同様
に、TSP−1に対するポリクローナル抗血清の添加、およびモノクローナル抗
TSP−1抗体の添加により、抑制することができる(表1)。
文字は、実施例9に示す研究と実施例9において選択した特定の実験条件とに対
応している(実施例9参照)。
によってのみ分泌される、ということを定性的に示した(図1)。分泌速度を、
密集後の動的および静置培養物に関して決定した(図2)。結果は、アポトーシ
スの誘発はTSP−1分泌速度によって制御することができるということを示し
た。
conditions)”)という言葉は、ここでは、細胞の周囲の細胞培養液
において不変のすなわち一定方向の層流が発生しないという条件下での細胞の培
養を意味する。したがって、ここで使用する意味での“静置細胞培養条件”は、
乱流または変動層流、すなわち、たとえば流れの方向の変化が起るようなまたは
流れの逆転さえ起るような乱流または変動層流、が発生する細胞培養条件を含む
。“動的細胞培養(条件)”(“dynamic cell culture
(conditions)”)という言葉は、ここでは、細胞培養液内で一定方
向の層流状態だけが支配的である細胞培養条件を意味する。すなわち、先行技術
において、たとえばいわゆる潅流培養(perfusion culture)
によって実現できるような細胞培養条件である。明らかに、理想的な物理的流動
構造状態は、血管系すなわち生体内状況においても、細胞培養条件下においても
実現されない。したがって、ここで述べる流動状態は、近似的に実現できるもの
であり、先行技術の細胞培養実験で一般に使用されているものである。
る。一定方向の層流の場合、0.001 dyn/cm2 よりも大きな剪断応力
が生じ、この剪断応力のベクトル和は流れの方向が変化する変動流動条件におけ
るものよりも大きい。静置細胞培養(条件)は、非常に小さな応力(<0.00
1 dyn/cm2)または完全な無応力を特徴とする。動的細胞培養の場合、>
0.001 dyn/cm2の剪断応力または>0.1のレイノルズ数となる。乱
流はレイノルズ数>200(〜1000)の場合に発生しうる(流動チャンバー
の形状による)もので、静置または変動流動条件の場合と同様に、もはやアポト
ーシスの誘発に対する防御的性質を有しない。
に影響を及ぼさない。これは、アポトーシスが、血液流内のTSP−1の生成に
依存するばかりでなく、他方では細胞の表面の特異性受容体の生成または接近可
能性にも依存する、ということを示す。このことに関連して、意外にも、インテ
グリンαvβ3受容体を静置および動的培養細胞上に検出することができ、一方I
AP受容体は静置培養物においてのみ検出可能な量が発現する、ということを示
すことができた。
1のαvβ3インテグリンへの結合はRGD配列モチーフによって媒介される。し
たがって、RGD媒介結合の効力ある作用物質である環状Arg−Gly−As
p−(D−Phe)−Valペプチド(環状RGDペプチド)(Merckから
供給された)を、密集後内皮細胞に添加した。しかし、これは意外にもアポトー
シス率に影響を与えなかった。これが示すのは、TSP−1のインテグリンαv
β3への結合は、少なくとも、それだけでは、アポトーシス誘発をもたらさない
、ということである(表2)。
は対照であり、静置細胞培養における自発アポトーシス率を示す。状態調節培養
液は、すでに48〜72時間、内皮細胞を培養したものであり、したがって内皮
細胞によって分泌された因子を含む。状態調節された培養液によって生じるアポ
トーシス率は、新鮮培養液+TSP−1と同じレベルであり、これは、一つ以上
のアポトーシス媒介物質がこの状態調節培養液中に存在するはずである、という
ことを示す。状態調節培養液の調製については、実施例4で説明する。
領域(CBD)によるIAPへの結合である。C末端細胞結合領域(CBD)は
、IAPと特異的に相互作用するTSP−1領域である。このC末端細胞結合領
域のみから成る切断TSP−1は、Bachem社から、CBDペプチドとして
市販されている。このCBDペプチドの添加はアポトーシス率の増大をもたらさ
ない(表2)。しかし、このCBDペプチドと環状RGDペプチドとを同時添加
すると、意外にも、アポトーシス率の顕著な増大がもたらされる(表2)。この
増大は、TSP−1の添加によるアポトーシス率の増大と同程度である。以上の
ことから、TSP−1とインテグリンαvβ3とへの同時結合のみがアポトーシス
に有効であると考えられる。
び効果が消滅する。二つの活性ペプチドと同時に抗TSP−1抗血清を添加する
ことは、アポトーシス率の増大に対して効果がない(表2)。これは、培養中の
TSP−1の生成が効果を有しないことを示している。したがって、意外にも、
自発アポトーシス誘発のためのTSP−1の活性はIAPとαvβ3とへの同時結
合によって媒介される、と考えることができる。
る(図3)。このカルシウム流入は、添加直後(2、3秒以内)に観察され、最
終的にアポトーシス誘発に導く信号伝達の一ステップである。したがって、蛍光
カルシウム指示薬(Merrit、J.E.ほか、Biochem.J.269
、513−519(1990))を使用することにより、カルシウム信号の不出
現によってアポトーシスの阻害を調べる非常に高速の試験法を確立することがで
きる(図3;実施例6で詳しく説明する)。
細胞におけるアポトーシス誘発がもたらされるばかりでなく、変動流または乱流
条件もアポトーシス誘発に十分なものである、ということを示すことができる。
潅流チャンバー内に障害物を置くことにより、いろいろな流線が得られる。一つ
のモデルを図4に示す。代表的な流れチャンバーは、流れチャンバー内を一定の
流量で通過する液体流を発生させることができるということを特徴とする。流れ
は、たとえばポンプまたは重力によって駆動することができる。それぞれの液体
は、適当な軟質管または硬質管を通してそのチャンバーに送られる。本出願のシ
ステムの場合、軟質管はシリコーン製であり、硬質管はステンレス鋼製である。
チャンバーは、ポリカーボネートインサートとシリコーンシールとを有するペト
リ皿によって定められる。
の回転またはプレート上の液体内の円柱形プラグの回転により流れが生成される
他の適当な装置たとえばコーン−プレート装置を使用することもできる。
域(the regions of variable flow profi
les)にある内皮細胞に誘発されるということを示すことができた。これは、
潅流系内のアポトーシス細胞の空間分解研究(a space−resolve
d investigation)によって示すことができた(図5)。
である。これにより、内皮細胞にTSP−1が分泌され、次にTSP−1がイン
テグリンαvβ3およびIAPとの相互作用によりアポトーシスを誘発させる。
する試験方法を開発することが可能である。たとえば、抗アポトーシス活性を有
する物質を識別することが可能である。この目的のためには、IAPとインテグ
リンαvβ3との両方を発現する細胞を培養する。この細胞は自然のものでも遺伝
子組み換えによって作られたものでも良い。そのような細胞は当業者には公知で
ある。この場合、好ましいのは培養された内皮細胞であり、また特に好ましい実
施態様においては、ヒトの臍静脈内皮細胞(HUVEC)を使用する。適当な細
胞のさらなる例としては、単球、赤血球、活性化T細胞、線維芽細胞、血小板、
CHO細胞、平滑筋細胞、および卵巣腫瘍細胞がある。完全細胞系、たとえば骨
髄細胞系も適当でありうる。本発明の方法で使用する細胞は、組み換えIAPま
たはインテグリンαvβ3を発現するように遺伝子的に改変された細胞とすること
もできる。これらの細胞は、場合に応じて、細胞表面の元来の結合特性を保存す
るように改変される。
される。この培養液は、通常、先行技術で一般に公知の標準培養液である。たと
えば、これらの細胞はDMEM、M−199、IF基本培養液などによって培養
される。現在では、適当な培養液は実質的にすべての細胞および細胞系について
入手できる。培養開始の前に、成長因子およびホルモンたとえば胎児子ウシ血清
(FCS)を、培養液に添加することができる。哺乳動物の細胞は、通常、5%
CO2雰囲気、37℃で培養する。この雰囲気を、細胞培養液中の緩衝剤たとえ
ば炭酸ナトリウム緩衝剤とともに使用することにより、細胞培養液のpHを安定
させることができる。もう一つ可能なことは、培養の開始前に、細胞培養液に、
抗生物質を加えることである。この抗生物質は、汚染をもたらす原核微生物と特
異的に相互作用して、その成長を妨げるが、真核細胞の成長には実質的に影響を
与えず、したがって細胞培養物を汚染から保護するようなものである。細胞培養
に関するその他のヒントおよび情報は、標準的な著作、たとえば、Zell−
und Gewebekultur、3rd edition、Toni Lin
dl、Joerg Bauer、(1994)、Gustav Fischer
Verlag、に見出すことができる。
1および実施例2に示す。
ス誘発物質を添加することによって、誘発することができる。このタイプの培養
条件は、好ましくは、前述のように不変の層流が発生しないようなものである。
えて、またはその代りに、試験系に媒介物質を添加することができる。媒介物質
の同時添加により、試験系の感度が増大する。静置細胞培養組織における自発ア
ポトーシス率は、たとえばTNF−αのような媒介物質によって誘発されるアポ
トーシス率に比べると割合に小さい。静置細胞培養条件によって誘発される自発
アポトーシス率の試験で実現されるアポトーシス率は、全細胞に対して0.5〜
7%の範囲にある。媒介物質によって誘発されるアポトーシスの場合、50%ま
でのアポトーシス率が達成されうる。
よるアポトーシス率の低下を測定する前に、アポトーシス率の増大をもたらす物
質を添加し、測定される信号が増強されるようにする。好ましくは、添加媒介物
質は少なくとも1%から10〜50%以上までのアポトーシス率を与えるもので
ある。これは、特に好ましくは、TSP−1を細胞培養系に加えることを含む。
TSP−1は、IAPおよびαvβ3細胞受容体との相互作用を抑制すべき、天然
のアポトーシス媒介物質だからである。TSP−1を加えることにより、この媒
介物質の濃度に応じて、5%好ましくは7%特に好ましくは10%のアポトーシ
ス率を実現することができる。しかし、明らかに、本発明においては、TSP−
1と同様にしてαvβ3およびIAPと相互作用する他の物質も適当である。この
の意味におけるTSP−1の代替物質は、RGDおよびCBDペプチドとの同時
添加によりアポトーシス率を増大させるためのものである。
。これらの媒介物質は溶解した形で細胞培養物に加えられ、また注意すべきこと
は使用する溶液が無菌でなければならないということである。溶液の無菌性は、
いろいろなやり方好ましくは熱処理(120℃、2 barでのオートクレーブ
処理)によって実現でき、あるいは、当該媒介物質が特に熱に敏感なために熱処
理が不適当な場合には、滅菌ろ過、たとえばNalgene使い捨て滅菌フィル
ターの使用による滅菌ろ過、によって実現できる。細胞培養物への添加物を滅菌
するためのこの種の方法は、当業者には周知である。
スに及ぼす影響を研究すべき試験物質を細胞培養物に添加する。これらの試験物
質は好ましくはモノクローナル抗体、抗体フラグメント、ポリクローナル抗体、
およびペプチドである。しかし、抗アポトーシス効果を示しうるのではないかと
思われる他の物質を加えることも可能である。これらの物質は好ましくは溶解し
た形で添加する。この場合の溶剤は細胞培養物に影響を及ぼさないものでなけれ
ばならない。したがって好ましくは、これらの試験物質は、細胞培養においてす
でに一般に広く使用されている緩衝剤溶液に溶解させる。これらの緩衝剤の例と
しては、りん酸塩緩衝剤、炭酸ナトリウム緩衝剤、その他がある。好ましくは、
溶解させた試験物質は滅菌ろ過(Nalgene 使い捨て滅菌フィルター)に
よってろ過滅菌(無菌化)してから、細胞培養物に添加し、汚染性の微生物また
は菌類の胞子、および不溶解成分を除去するようにする。
てから、細胞培養物に添加する。量は、使用する試験物質が到達すべき濃度に依
存し、また好ましくは、この量は、細胞培養液の希釈が起らないような小さな量
である。そのような試験物質を好ましくは溶解状態で細胞培養物に導入するのに
使用できる方法は、当業者には周知である。
る。特に適当な初期指標は、細胞内カルシウム指示薬の使用による、細胞へのカ
ルシウム流入の不出現の測定である。正確なアポトーシス率の決定のために適当
な方法は、アポトーシス細胞のDNAの染色と、それに続く形態計測的な細胞核
の解析またはフローサイトメーターによる細胞DNA含有量の解析である。適当
な蛍光染料の例としては、DAPIがある。これらの方法は先行技術において周
知であり、アポトーシス細胞の検出のために広く使用されている。アポトーシス
阻害剤となる可能性のある物質の使用後、アポトーシス細胞の数が、静置培養試
験系のアポトーシス細胞の数、場合によってはアポトーシス誘発物質添加後のア
ポトーシス細胞の数に対して、50%よりも大きく、好ましくは70%よりも大
きく、特に好ましくは90%よりも大きく、減少した場合、その物質は本発明に
より使用細胞におけるアポトーシスの阻害剤であると見なされる。細胞へのカル
シウム流入の不出現を、ふるい分けのための初期指標として使用することができ
る。そのあと、カルシウム流入の不出現をもたらす物質を、DAPI染色によっ
て検査しなければならない。
または通常の方法、たとえば、TUNEL検定(Tdt媒介X−dUTPニック
端標識付け;DNA断片)、アポトーシス酵素の検出(たとえば、PARP、カ
スパーゼ)、または蛋白質(たとえば、p53、CD95)、蛍光アネキシン(
annexin)によるホスファチジルセリンの転座、もしくはアガロースゲル
中でのDNAラダーの検出、を使用することも可能である。
ある。これらの物質は、好ましくは、細胞表面の受容体特に好ましくはIAPお
よび/もしくはインテグリンαvβ3、または血液循環における体液因子特に好ま
しくはTSP−1に結合する化合物である。ただし、この結合は、アポトーシス
誘発をもたらす、TSP−1とIAPおよびαvβ3とのここで述べる特異的な同
時相互作用が起らず、したがってアポトーシスが誘発されえず、それゆえまたア
ポトーシスが発生しない、ような形でなされる。
って細胞へのアポトーシス特異性のカルシウム流入を防止し、したがってアポト
ーシスが誘発されえず、それゆえ発生しない。
ましくは血管系において内皮細胞および他の細胞(たとえば、平滑筋細胞)のア
ポトーシスを抑制するために、使用できる製剤の製造のために適当である。原理
的には、抗アポトーシス活性を有し、本発明の方法により、IAPおよびαvβ3 を表面に発現するすべての細胞におけるアポトーシス状態を抑制することが明ら
かにできる物質を使用することができる。したがって、アポトーシスの抑制が必
要な病気、たとえば特に動脈硬化を治療することができ、この治療においては、
病変におけるプログラム細胞死の抑制により、血管の状態の改善がもたらされる
。製剤に前記の阻害剤を使用することにより、予防治療も可能である。
作の通常の方法により容易に得ることのできるモノクローナル抗体およびペプチ
ドである。しかし、明らかに、同様の効果を有する他の物質も本発明の試験法に
より見出すことができる。ここでは、“抗体”という言葉は、完全抗体(すなわ
ち、二つの重鎖と二つの軽鎖とを有する抗体)と抗原結合部位を有する抗体フラ
グメントとの両方を意味する。抗アポトーシス活性を有する抗TSP−1抗体の
識別について、実施例9で述べる。同様にして、アポトーシスの誘発を防ぐため
に多数の他の抗体および抗体フラグメントを試験することができる。
を明らかにできるペプチドと抗体(抗体フラグメント)との完全系列を作成する
ことが可能である。また、本発明の方法により、抗アポトーシス活性を有する、
抗体(抗体フラグメント)でもペプチドでもない他の物質を識別することもでき
る。
は、低分子量化合物である。そのような物質は、製剤組成物における有効成分と
して使用した場合に、まったく副作用を有しないかまたは小さな副作用しか有し
ないことが多い。そのような物質のさらなる利点は経口投与をなしうるというこ
とである。
c.1996、118、7461−7472、に記載されている環状ペンタペプ
チドがある。本発明における低分子量物質には、小さなペプチド、アミノ酸、お
よびアミノ酸類似体、ステロイド、ヌクレオチド、ならびに分子量≦5000、
好ましくは≦3000、特に好ましくは≦2000のその他の有機化学物質が含
まれる。(Haubner、R.、Gratias、R.、Diefenbac
h、B.、Goodman、S.L.、Jonczyk、A.、Kessler
、H.、Structural and Functional Aspects
of RGD−Containing Cyclic Pentapeptide
s as Highly Potent and Selective Integr
inαvβ3 Antagonists、118、7461−7472(1996
))。
の活性成分であるペプチドまたは抗体(抗体フラグメント)を薬剤的に許容され
る基剤に溶解させることができる。薬剤的に許容される基剤の例としては、緩衝
剤溶液たとえばリン酸塩緩衝剤またはクエン酸塩緩衝剤溶液が挙げられる。また
、薬剤的に許容される薬剤の添加によってペプチドの活性を維持すること、また
たとえば製剤における還元性環境を維持することも可能である。
ば、使用する特定化合物の活性、患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性、食
事療法、投与期間、投与経路、排出速度、他の薬剤との併用、および治療が加え
られるそれぞれの病患の深刻さ、に依存する。一回の投与量と薬量は、主治医に
より、これらの要因にもとづいて決定される。
され、たとえば吸入スプレー、直腸投薬により、皮下、静脈内、筋肉内、関節内
、クモ膜下注入もしくは投与法により、または、通常の薬剤的に許容される基剤
(carriers)、佐剤(adjuvants)、および賦形剤(vehi
cles)を含む製剤による外用薬として、使用される。他の経路による投与た
とえば経口投与も、見出されたそれぞれの物質の性質によっては適当なものとな
りうる。
有する物質を含む製剤を提供する。製薬基剤は、たとえば、固体または液体増量
剤、カプセル材料または溶剤である。製薬基剤として使用できる材料の例として
は、糖(たとえば、ラクトース、グルコース、およびスクロース)、デンプン(
たとえば、コーンスターチ、およびジャガイモデンプン)、セルロースおよびそ
の誘導体(たとえば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロー
ス、およびセテイン酸セルロース(cellulose cetate))、粉
末化トラガント、モルト、ゼラチン、タロー、薬物基剤(たとえば、カカオバタ
ー、および座剤ロウ)、油(たとえば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴ
マ油、オリーブ油、トウモロコシ油、および大豆油)、ポリオール(たとえば、
プロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、およびポ
リエチレングリコール)、エステル(たとえば、オレイン酸エチル、およびエチ
ルラウレエート(laureate))、寒天、緩衝剤(たとえば、水酸化マグ
ネシウム、および水酸化アルミニウム)、アルギン酸、発熱物質を含まない水、
等張生理食塩水、リンゲル液、エチルアルコール、およびリン酸塩緩衝剤溶液、
ならびに薬剤組成物に使用される他の非毒性の融和性の物質、がある。湿潤剤、
乳化剤、および滑沢剤(glidant)、たとえばラウリル硫酸ナトリウムお
よびステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、滑沢剤、被覆剤、ならびに芳
香剤(perfuming agent)および保存料も、同様に、製薬技術者
の要求に応じて、製剤中に存在することができる。一回分の服用量とするために
基剤物質に混合する活性成分の量は、治療を受ける患者および投与法によって変
わる。そのような薬剤組成物の一例を実施例10に示す。
スフェリン、5μg/ml ヘパリン、0.7μg/ml FGF、2mM L−
グルタミン、(IF 基本培養液:Iscoveの変更Dulbecco培養液
(IMDM)とHamのF12との1:1混合物;どちらの成分もイギリス国P
aisley市のLife Technology社から入手) − NCS:新生子ウシの血清(ドイツ国Aidenbach市のSebak社
から入手) − FGF:線維芽細胞増殖因子(豚の脳から精製した自前の製剤)
容器中で培養した。培養液は2〜3日ごとに交換した。密集するごとに、細胞を
分割比1:3〜1:5で継代した。HUVECは、厳重に接触を防止して成長さ
せ、典型的な玉石状形態の単層細胞地を形成させた。密集時に、培養物は4〜9
×104細胞/cm2の細胞密度に達した。継代1〜4のHUVEC培養物のみを
、アポトーシスの研究に使用した。
せた1gのゼラチン(細胞培養試験したもの)を1%(w/v)加え、121℃
、2 barで、20 min、オートクレーブ処理することにより、溶解させ、
室温で保存した。 − PBS(140mM NaCl、3mM KCl、8 mM Na2HPO4、1
.5 mM KH2PO4) − 8 g/l NaCl − 0.2 g/l KCl − 1.44 g/l Na2HPO4×2 H2O − 0.2 g/l KH2PO4 塩類を適当な体積のMilli−Q水に溶解させ、121℃、2 barで、2
0 min、オートクレーブ処理し、室温で保存した。pHを調べたところ、7
.2〜7.4であった。
器の底を滅菌ゼラチン溶液で被覆し、細胞培養容器を、15 min間、室温に
放置した。ゼラチン溶液を吸引除去してから、細胞培養容器をPBSで一回洗浄
すると、使用できるようになる。
た。
ら離した。培養液を吸引除去し、培養容器の底を、PBSで簡単に洗浄し、トリ
プシン/EDTA溶液(25cm2の培養容器の場合、〜1ml)で被覆した。
ただちにこの酵素溶液を、ふたたび吸引除去し、液体薄膜が細胞上に残留するよ
うにした。細胞を室温で1〜10min間放置し、顕微鏡下で細胞の取りはずし
を行った。細胞の取りはずしは、培養容器のへりを軽くたたくことにより、早め
ることができる。細胞を新鮮な培養液中に取りだし、場合によっては計数して、
新しい培養容器に植えつけることができる。
フェリン、20μg/ml ヘパリン。温度を37℃に調節。
器中で培養した。培養液は2〜3日ごとに交換した。密集するごとに、細胞を分
割比1:3〜1:5で継代した。BAECは、厳重に接触を防止して成長させ、
典型的な玉石上形態の単層細胞地を形成させた。細胞密度は7〜9×104細胞
/cm2であった。
細胞を潅流システムに導入することができる。この目的のためのシステムを組み
立てた。あらかじめすべての部品を、Milli−Q水によって完全に洗浄した
。完全に組み立てられたシステムを、40min間、オートクレーブ処理した。
溜め容器は、特殊な登録商標テフロンふたを有するショットビンから成る。この
ふたは三つの穴を有し、ステンレス鋼管(3cm、内径1mm)がこれらの穴を
通る。一つの管には、滅菌フィルターが備えてあり、また圧力釣合のために働く
。他の二つは培養液の入口と出口を形成する。一つの管は、シリコーン管により
、内部に延び、ビン内の培養液に浸漬されるようになっている。ここから、この
管は、シリコーン管およびマプレンポンプ管によって、15mlのグレイナー管
までつながっており、このグレイナー管も、同様に、特殊な登録商標テフロンふ
たによって閉じてあり、該ふたを、二つのステンレス鋼管が貫通している。この
グレイナー管は、培養液の予熱のために機能し、また空気泡トラップとして働く
。ここから、培養液は、さらなるシリコーン管を通って、プラグおよび該プラグ
の上側にあるピークコネクターに達する。このプラグは培養のために当該細胞の
はいったペトリ皿上に配置される。このプラグは側面をOリングによってシール
されている。特別なカットを施したシリコーンシートがペトリ皿の底面に配置さ
れ、細胞のつぶれを防ぐようになっている。このプラグからの出口は、ピークア
ダプターによってシリコーン管に接続されており、培養液を培養液溜めに戻す。
このシステムを始動させる前に、培養液溜め容器とグレイナー管とに予熱された
培養液を満たす。ペトリ皿内の培養液は細胞から吸引除去し、シリコーンシート
を慎重に内部に配置する。次に、プラグを迅速に押し込むと、システムをぜん動
ポンプに取りつけることができる。ポンプ輸送速度は当該細胞の要件にしたがっ
て調節することができる。このポンプ輸送速度は、ポンプ管の内径および選択し
たポンプ回転数に依存する。無制限で選択できる潅流時間のあと、システムを無
菌キャビネット内で分解し、細胞をそのあとの試験のために使用することができ
る。モジュール設計により、このシステムはいろいろに使用することができる。
弁とスイッチを使用することにより、高速液体クロマトグラフィー技術からの物
質をあとから導入することができ、また培養液のサンプルを取りだすことができ
る。さらに、調節した培養液(たとえば、25mM HEPES緩衝剤、12.
5mM NaCl、および0.5mM 炭酸ナトリウムを含むIF培養液)を使用
することにより、培養器の外で作業することもできる。その場合、温度制御のた
めに、ホットプレートまたは加熱チャンバーを使用する。
する(図4参照)。そのようにすれば、チャンバー内の流れ特性を変えることが
できる。
む培養液 − 70%(v/v)のエタノール
.Sci.Instrum.53、1851−1854 − ゼラチン被覆培養皿(φ=94mm)
、コーンを滅菌してから、装置を、加熱キャビネット内で、37℃で少なくとも
30分間滅菌した。予備培養した細胞を培養液で洗浄してから、0.06ml/
cm2の新鮮培養液を加え、培養皿を迅速にコーン−プレート剪断装置に取りつ
けた。
いるホルダーに挿入した。ふたをはずし、コーンを培養皿に向けて下降させ、コ
ーンの先端が細胞地から最小限の距離にあり、かつコーンがこすることなしに動
きまわるように、調節した。次に、組み立てたコーン−プレート剪断装置を、細
胞の動的培養のために、37℃の培養器内に置いた。このとき、雰囲気は、5%
(v/v)のCO2を含む水蒸気飽和大気とした。
え、48〜72時間状態調節した。次に、この状態調節した培養液を、1000
xgで5分間遠心分離した。使用まで、状態調節培養液を−20℃で凍結させた
。この状態調節HUVEC培養液を、アポトーシス研究のために使用した。この
目的のために、この培養液に、2mMのグルタミンと0.7μg/mlのFGF
を添加することができる。
染料は340〜360nmで励起され、放射ピークは480nmにある。この染
料はアポトーシス研究のために使用される(Cohenほか、Immunolo
gy Today、14、No.3、126−130(1993)参照)。
lのホルムアルデヒド溶液で固定し、2mlのPBSで2回洗浄し、0.5ml
のDAPI溶液で15分間処理し、PBSで洗浄してから、蛍光顕微鏡下で評価
した。UVフィルターセットと20×または40×の対物レンズを使用した。5
00〜1000個の細胞を無作為に選択し、アポトーシス核を有する細胞を計数
した。
。懸濁細胞を培養液中に取りだし、計数してから、800xgで5分間遠心分離
し、沈殿物を、0.5mlのIFに再懸濁させ、1.5mlの氷冷エタノールに
滴下させた。得られる懸濁液を−20℃で一晩保存した。あらためて遠心分離し
、2mlのPBSにもう一度懸濁させた沈殿物を、37℃で0.5時間、低温放
置し、もう一度遠心分離してから、沈殿物を5mlのDAPI溶液にもう一度懸
濁させて、フローサイトメーターにより、50〜300事象/秒の計数速度で計
数した。得られるグラフは、細胞周期のG1期にある細胞の大きなピークを示し
、一部の細胞は、S期にあり(中程度の蛍光強度)、高い蛍光強度の最後のピー
クは、G2期にある細胞を示した。アポトーシス細胞は、細胞あたりのDNA絶
対量の減少のため、副G1ピークに現れた(Darzynklewicz Z.ほ
か、Cytometry、13、795−808(1992);Zamai L
.ほか、Cytometry、14、891−897(1993))。これは、
選択した条件下でアポトーシスが起っていることを示す。
入の測定 Fluo−3はCa2+と結合したあと蛍光錯体を形成するCa指示薬である。
エステルFluo−3 AM は拡散により細胞に取り込まれる。Ca指示薬Fl
uo−3は、細胞内でこのエステルが加水分解されたあとにのみ生成される。し
たがって、細胞外染料エステルは測定を妨げない。測定は通常のフルオレセイン
フィルターを用いて実施した。励起波長488nm(500nm)のとき、放射
ピークは525nmにあり、Ca結合により、100(200)倍に増大した。
測定範囲は0.05〜20μM 遊離Ca2+である(Merritt、J.E.
ほか、Biochem.J.269、513−519(1990))。
r Probes、Leiden)(6mM) − Fluo−3 AMの使用濃度 血清を含まない培養液中に3μM
3回洗浄し、培養条件下で、30分間、Fluo−3 AM を含む予熱した血清
を含まない培養液で培養して、3回洗浄し、プレートを蛍光計で測定した。まず
、装置の感度を調節してから、細胞内のその瞬間のCaレベルに対応する蛍光値
を、1〜10秒ごとに測定した。測定を実施しながら、細胞に物質を添加するこ
とができる。ある物質がCaレベルに影響を及ぼすならば、それは蛍光値の増大
または減少によって知ることができる(図3参照)。この方法によって、Caレ
ベルを評価することができる。Ca流入はアポトーシス発生の初期指標となる。
密集に達したあと、試験に使用した。まず、トロンボスポンディン1をいろいろ
な濃度(1〜600μg/ml)で新鮮な培養液に添加し、HUVECの自然ア
ポトーシス率に及ぼす状態調節培養液の影響と比較した。下記の表は、トロンボ
スポンディンの添加がアポトーシス率の有意の増大をもたらすことを示している
。この増大は、状態調節培養液で達成しうるものと同程度である。新鮮培養液の
添加の場合に観察されるアポトーシスは、実験中に分泌されるトロンボスポンデ
ィンによって誘発される。トロンボスポンディンは潅流HUVECには影響を及
ぼさない。アポトーシス率は、DAPIによってアポトーシス細胞を染色するこ
とによって決定した。
(それぞれの場合について、平均値と標準偏差を示す)。パーセントアポトーシ
ス率は、全細胞カウント数に対するものである。
培養容器に植えつけて(たとえば、24ウェルプレート;ウェルあたり0.5m
l)、完全な密集に達したあと、試験に使用した。内皮細胞のアポトーシス率に
及ぼすいろいろなペプチドと蛋白質の影響に関する研究を実施した(表2)。こ
の目的のために、ペプチドと蛋白質(表2a)を培養液(実施例1)に溶解させ
、示されている濃度(表2a)で使用した。溶解試料を含む培養液を細胞に加え
、培養条件(実施例1)下で3日間培養した。次に、細胞をDAPIによって染
色し、実施例5に示すようにしてアポトーシス率を決定した。3回の独立の実験
の結果の平均値と標準偏差を、表2にまとめて示す。状態調節培養液、TSP−
1、および活性RGDペプチド、ならびにCBDペプチドのアポトーシス誘発効
果が明らかである。
この目的のために、まず、細胞を実施例6で述べたようにして前処理し、ペプチ
ドまたはTSP−1の添加時に蛍光計で測定した。TSP−1添加または二つの
ペプチドの同時添加の場合にのみ、細胞内Caレベルの上昇がもたらされた(図
3)。新鮮培養液の添加または一つのペプチドのみの添加は、Caレベルに影響
を及ぼさない。細胞へのCaの流入は初期指標として使用することができる。正
物質の確認(Ca信号)は、少なくとも24時間の培養後に、DAPIによって
アポトーシス率を測定する(実施例5)ことによって、行うことができる。この
ようにして、抗アポトーシス活性を有する化合物を迅速かつあいまいさなしで識
別することができる。
培養容器に植えつけて(たとえば、24ウェルプレート;ウェルあたり0.5m
l)、完全な密集に達したあと、試験に使用した。細胞に、次のように、新たに
培養液を供給した。(a)新鮮培養液(基本アポトーシス率)、(b)状態調節
培養液(実施例4)(アポトーシス誘発効果)、(c)ウサギの抗TSP−1抗
血清を含む状態調節した培養液(1:20)(アポトーシス誘発およびアポトー
シス阻害物質)、(d)ウサギの抗TSP−1抗血清を含む新鮮な培養液(1:
20)(アポトーシス阻害物質)、(e)1μg/mlのTSP−1を含む新鮮
な培養液(アポトーシス誘発物質)、(f)1μg/mlのTSP−1およびウ
サギの抗TSP−1抗血清を含む新鮮な培養液(1:20)(アポトーシス誘発
およびアポトーシス阻害物質)、(g)モノクローナル抗TSP−1抗体を含む
新鮮な培養液(1:30)(アポトーシス阻害物質)。培養条件(実施例1)下
での24時間の培養のあと、細胞を固定し、DAPIで染色して、蛍光顕微鏡下
で形態を調べるか、またはフローサイトメトリーによって調べた(実施例5)。
アポトーシス細胞数と全細胞数とをカウントし、アポトーシス率(アポトーシス
細胞の百分率)を算出した。3回の独立の実験のデータの平均値と標準偏差とを
表3に示す。
するポリクローナル抗体;蛋白質濃度:900μg/ml)による実験とTSP
−1に対するモノクローナル抗体(=mAb:未精製の、TSP−1 M 101
に対するモノクローナル抗体;蛋白質濃度:300μg/ml)による実験とに
おいては、アポトーシス率の有意の低下(>50%)が見られ、したがってこれ
らの物質は、天然のアポトーシス誘発物質(状態調節培養液およびTSP−1)
の阻害剤として使用することができる。したがって、これらの物質は抗アポトー
シスであると見なすことができる。抗血清およびモノクローナル抗体は、P.V
ischer教授(Institute fuer Arteriosklero
seforschung Muenster)から提供された。
る。そのために、細胞を、実施例1および実施例2に述べたようにして、培養し
た。細胞が完全な密集に達したあと、試験に使用した。細胞にCa指示薬を加え
(実施例6)、蛍光計内に配置して、測定した。測定中、物質b、c、e、f、
gを、細胞に加えた。これらの例のそれぞれには、活性化物質(状態調節培養液
またはTSP−1)が含まれている。例b)とe)では、Ca流入があり、した
がって測定蛍光値が増大した。例c)、f)、およびg)におけるように、同時
にアポトーシス誘発物質をも添加すると、この増大は見られなかった。TSP−
1またはポリクローナル抗血清に対するモノクローナル抗体はCaの流入を阻止
し、したがってアポトーシスの誘発を阻止する。したがって、活性化物質(たと
えば、TSP−1)と試験すべき物質との同時添加による、アポトーシス阻害物
質となる可能性のある物質の迅速な試験方法が確立されたと言える。
方法を用いることにより、識別した。すなわち、 1.インテグリンαvに対するモノクローナル抗体(Chemicon社
、No.MAB 1960)、クローン VNR 139(100μl);使用希
釈率1:100(mAb/αv) 2.ヒトのIAP(CD 47)に対するモノクローナル抗体(CYMB
US Biotechnology社から入手。No.CBL 489)、クロー
ン BRIC 126、濃度:100μg/ml;使用希釈率1:100(1μg
/ml)(mAb/IAP)
/ml)とともに添加した。静置条件下で、48時間、培養したあと、下記のア
ポトーシス率が測定された。
れるアポトーシスの抑制器材(実施例1に加えて): − 2.5mmol/1 EGTAを含む培養液
4時間、コーン−プレート剪断装置によって培養した(実施例4参照)。培養皿
を取りだし、適当なインサートを配置することにより、12の独立培養ウェル(
各ウェルの培養面積は0.8cm2)に分割した。培養物の半分を、EGTAを
含む培養液内で培養し、残りの半分をEGTAを含まない培養液内で培養した。
下記の表1によれば、EGTAを含む培養液内での培養の結果、アポトーシス率
が有意に減少している。すなわち、CaがEGTAと錯体を形成することにより
、アポトーシスの阻害がもたらされる。アポトーシス率はアポトーシス細胞をD
APIで染色することによって決定した。
て決定した(それぞれの場合について、平均値と標準偏差を示す)。パーセント
アポトーシス率は、全細胞カウント数に対するものである。
の抑制器材(実施例4に加えて): − 生体活性ペプチドを含む培養液(基本特許の実施例8、表2aと比較された
い)
らに24時間、コーン−プレート剪断装置によって培養した(実施例4参照)。
剪断装置から培養皿を取りだし、実施例11ですでに述べたように、適当なイン
サートを配置することにより、12の独立培養ウェルに分割した。一方で、生体
活性ペプチドを、0.5mMのEGTAを含む培養液に溶解し、他方で、EGT
Aを含まない培養液に溶解した(濃度:RGDペプチド:250μg/ml(0
.5mM);IAPペプチド:400μg/ml(0.5mM))。そのあと、
試料の半分を、EGTAと活性ペプチドを含む培養液で処理し、残りの半分を、
活性ペプチドを含むがEGTAを含まない培養液で処理した。これらの研究の結
果を、下記の表2に示す。
間の全体にわたって、アポトーシスの著しい増大がもたらされる。活性ペプチド
を含む培養液にEGTAを添加すると、アポトーシス率の有意の低下を実現する
ことができる。
て決定した(それぞれの場合について、平均値と標準偏差を示す)。パーセント
アポトーシス率は、全細胞カウント数に対するものである。
1抗体、モノクローナル抗体VNR 139、モノクローナル抗体BRIC 12
6を、薬剤組成物において活性物質として使用することができるであろう。
mg/lの濃度で使用した。 − 注射用の水 − ポリソルベート 80 − リン酸水素二ナトリウム/リン酸二水素ナトリウム − 塩化ナトリウム
ボスポンディンの検出を示す。抗トロンボスポンディン抗体によるウエスタンブ
ロット分析。第1列:血清を含まない培養液、第2列:4日間静置状態調節した
、血清を含まない培養液、第3列:500ngのTSP−1、第4列:3日間動
的に状態調節した、血清を含まない培養液。
1の定量検出結果を示す。
内皮細胞の細胞内Caレベルの変化を示す。
皮細胞は障害物のない領域で成長する。
潅流培養液中でのアポトーシスの発生の位置分解表示とを示す。2日間の潅流培
養のあと、各領域について、アポトーシス率を決定した。流れ分割器の背後で、
有意のアポトーシス率を検出することができた。アポトーシス率は潅流チャンバ
ー内の位置によって変わる。
潅流培養液中でのアポトーシスの発生の位置分解表示とを示す。2日間の潅流培
養のあと、各領域について、アポトーシス率を決定した。流れ分割器の背後で、
有意のアポトーシス率を検出することができた。アポトーシス率は潅流チャンバ
ー内の位置によって変わる。
Claims (23)
- 【請求項1】 抗アポトーシス活性を有する物質を識別する方法であって、 i)IAPとインテグリンαvβ3との両方を発現する細胞を培養し、 ii)前記細胞にアポトーシス誘発物質を生成させ、かつ/またはアポトーシスを
誘発する一つまたは複数の物質を加え、 iii)試験物質を加え、 iv)アポトーシス率を測定する、 ことを特徴とする方法。 - 【請求項2】 使用される細胞が、内皮細胞、好ましくは、ヒトの臍静脈の
内皮細胞(HUVEC)、ヒトの胎盤内皮細胞(HPEC)、ウシの大動脈内皮
細胞(BAEC)、ブタの脳の毛細血管内皮細胞(PBMEC)、ハイブリッド
細胞系(EA.hy 926)、およびヒトの微小血管内皮細胞(HMVEC)
であることを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 使用される細胞が平滑筋細胞または線維芽細胞であることを
特徴とする請求項1に記載の方法。 - 【請求項4】 使用される細胞が、IAPとαvβ3とを表面に発現する遺伝
子的に改変された細胞であることを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 【請求項5】 内皮細胞が、一定の向きの層流が発生しない条件下で培養さ
れることを特徴とする請求項1から4までのいずれか1つに記載の方法。 - 【請求項6】 TSP−1、または同じ結合特性を有する類似化合物を加え
ることを特徴とする請求項1から4までのいずれか1つに記載の方法。 - 【請求項7】 アポトーシスの誘発が、細胞内への増大したカルシウム流入
を測定することによって、決定されることを特徴とする請求項1から6までのい
ずれか1つに記載の方法。 - 【請求項8】 アポトーシス率が、それ自体は公知の方法で、DAPI染色
、TUNEL検定、DNAラダー、アネキシン(annexin)染色、または
酵素検出によって決定されることを特徴とする請求項1から6までのいずれか1
つに記載の方法。 - 【請求項9】 請求項1から8までのいずれか1つに記載の方法によって識
別できる物質であって、場合に応じて、TSP−1、IAP、およびαvβ3の中
から選択される少なくとも1つの化合物と、TSP−1のIAPまたはαvβ3へ
の同時結合が阻害されるように、結合することを特徴とする物質。 - 【請求項10】 内皮細胞、ヒトの胎盤内皮細胞(HPEC)、ウシの大動
脈内皮細胞(BAEC)、ブタの脳の毛細血管内皮細胞(PBMEC)、ハイブ
リッド細胞系(EA.hy 926)、およびヒトの微小血管内皮細胞(HMV
EC)、または対応する組み換え細胞の細胞表面のIAPまたはインテグリンαv β3へのTSP−1の結合を阻害することを特徴とする請求項9に記載の物質。 - 【請求項11】 平滑筋細胞または線維芽細胞の細胞表面のIAPまたはイ
ンテグリンαvβ3へのTSP−1の結合を阻害することを特徴とする請求項9に
記載の物質。 - 【請求項12】 請求項1から8までのいずれか1つに記載の方法によって
識別できる物質であって、細胞へのアポトーシス特異性のカルシウム流入が抑制
されるように、細胞膜内のカルシウムチャンネルに結合することを特徴とする物
質。 - 【請求項13】 IAPがカルシウムチャンネルの生成に関与することを特
徴とする請求項12に記載の物質。 - 【請求項14】 内皮細胞、ヒトの胎盤内皮細胞(HPEC)、ウシの大動
脈内皮細胞(BAEC)、ブタの脳の毛細血管内皮細胞(PBMEC)、ハイブ
リッド細胞系(EA.hy 926)、およびヒトの微小血管内皮細胞(HMV
EC)、または対応する組み換え細胞へのアポトーシス特異性カルシウム流入を
阻害することを特徴とする請求項12または13に記載の物質。 - 【請求項15】 平滑筋細胞または線維芽細胞へのアポトーシス特異性カル
シウム流入を阻害することを特徴とする請求項12または13に記載の物質。 - 【請求項16】 抗体の形であることを特徴とする請求項9から15までの
いずれか1つに記載の物質。 - 【請求項17】 ペプチドの形であることを特徴とする請求項9から15ま
でのいずれか1つに記載の物質。 - 【請求項18】 低分子量化合物の形であることを特徴とする請求項9から
15までのいずれか1つに記載の物質。 - 【請求項19】 請求項9から18までのいずれか1つに記載の物質を活性
成分として含むことを特徴とする製剤。 - 【請求項20】 血管の疾患の治療のためのものであることを特徴とする請
求項19に記載の製剤。 - 【請求項21】 動脈硬化の治療のためのものであることを特徴とする請求
項19に記載の製剤。 - 【請求項22】 血管の疾患の治療のためのものであることを特徴とする請
求項9から18までのいずれか1つに記載の物質の使用。 - 【請求項23】 動脈硬化の治療のためのものであることを特徴とする請求
項22に記載の使用。
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