JPH09295999A - アポトーシスを誘起する物質のスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 アポトーシスを誘起する物質のスクリーニン
グ方法等を提供する。 【解決手段】 ＩＡＰ（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ Ａｓｓｏｃ
ｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現している細胞を用
いてアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘起する性
質を有する物質を探索することを特徴とするアポトーシ
スを誘起する物質のスクリーニング方法。細胞が、骨髄
球様細胞である上記のスクリーニング方法。上記スクリ
ーニング方法で得られる物質を有効成分としてなる医薬
組成物。 【効果】 本発明のスクリーニング方法により取得され
た骨髄球様細胞等にアポトーシスを引き起こす作用を有
する物質は、その特性を利用して、抗ガン剤、骨髄性白
血病の治療等の分野において有用な骨髄性白血病治療薬
剤等の医薬組成物の有効成分として使用し得るものであ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アポトーシス（ａ
ｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘起する物質のスクリーニング方
法等に関するものであり、更に詳しくは、ＩＡＰ（Ｉｎ
ｔｅｇｒｉｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ）を発現している細胞を用いて、骨髄球様細胞等にア
ポトーシスを誘起する性質を有するモノクローナル抗体
等の物質を、簡便かつ高効率で探索することを可能とす
る新しいアポトーシスを誘起する物質のスクリーニング
方法、並びに、当該スクリーニング方法で得られるアポ
トーシスを誘起する物質、当該物質を有効成分としてな
る医薬組成物、ＩＡＰに結合能を有するアポトーシスを
誘起する物質、当該物質を有効成分としてなる医薬組成
物等に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来、顆粒球コロニー刺激因子、例え
ば、遺伝子組換え型顆粒球コロニー刺激因子（ｒＧ−Ｃ
ＳＦ）は、主に顆粒球系細胞の分化、増殖を促進させる
液性因子として知られているものであるが、マウスのｉ
ｎ ｖｉｖｏの実験では、このｒＧ−ＣＳＦを投与する
ことにより、骨髄の造血亢進のみならず、脾臓でも著し
い髄外造血が起こり造血幹細胞を始めとしてすべての造
血前駆細胞が脾臓で増殖することが報告されている。そ
して、この脾臓での髄外造血のメカニズムとして、ｒＧ
−ＣＳＦの刺激により脾臓の造血微小環境が変化し、造
血支持能力が亢進したことにより造血が生じたものであ
ると考えられた。

【０００３】そこで、本発明者は、この脾臓での造血機
能を解明するために、ｒＧ−ＣＳＦ連投後の脾臓の間質
細胞に着目し、間質細胞を介したｒＧ−ＣＳＦによる造
血機能亢進の解析を試みるべく、ｒＧ−ＣＳＦを連投し
たマウス脾臓より造血間質細胞株（ＣＦ−１細胞）を樹
立し、かかる造血間質細胞を用いてその造血支持能を検
討したところ、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのコロニー刺激活性
およびｉｎ ｖｉｖｏでの造血幹細胞支持能が認められ
た〔Ｂｌｏｏｄ，８０，１９１４（１９９２）〕。

【０００４】しかしながら、この脾臓間質細胞について
は、その一部が細胞株（ＣＦ−１細胞）として樹立され
て、その細胞学的特性の検討等はなされているものの、
これまでに、その細胞表面抗原を認識する特定の抗体を
作製することはほとんど行われておらず、ましてやその
特性等については全く知られていない状況にあった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者は、
脾臓間質細胞に関する前記したような知見とこれまでの
研究成果を踏まえ、この脾臓間質細胞を識別し得る特定
の抗体を開発することを目標として鋭意研究を積み重ね
る中で、当該脾臓間質細胞株を感作抗原として使用して
モノクローナル抗体を作製したところ、これまでに報告
された例のない新規モノクローナル抗体が得られた。

【０００６】そして、この取得されたモノクローナル抗
体の特性について検討したところ、当該モノクローナル
抗体は、骨髄球様細胞にアポトーシスを誘起する特性を
有するものであることを見い出し、既に報告したが、更
に、当該モノクローナル抗体が認識する抗原は、ＩＡＰ
（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ）と同一であること、また、ＩＡＰはアポトーシ
スに関する機能を有することを見い出すと共に、ＩＡＰ
を発現している細胞を用いることによりアポトーシスを
誘起する抗体等の物質を識別、同定し、スクリーニング
することが可能であるとの知見を得て、鋭意研究を積み
重ねる中で、本発明を完成するに至った。

【０００７】すなわち、本発明は、ＩＡＰを発現してい
る細胞を用いてアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を
誘起する性質を有する物質をスクリーニングする方法を
提供することを目的とするものであり、更には、当該ス
クリーニング方法により取得された細胞にアポトーシス
を誘起する新しい物質、当該物質を有効成分としてなる
医薬組成物等を提供することを目的とするものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】前記のモノクローナル抗
体は、骨髄球様細胞（ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌ）のア
ポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）〔核クロマチンＤＮ
Ａがヌクレオソーム単位で切断（いわゆるラダー・フォ
ーメーション）されること等を特徴とし、その結果、細
胞を死に至らしめる現象で、細胞自滅とも云う〕を引き
起こす抗原等を特異的に認識する抗体として、これらを
識別、同定する機能を有するものとして、あるいは骨髄
球様細胞にアポトーシスを誘起させる機能を有するもの
として極めて有用なものである。尚、骨髄球様細胞に
は、リンパ球以外の細胞、例えば、好中球、巨核球、骨
髄芽球、骨髄球、肥満細胞、マクロファージ、単球、赤
芽球が含まれるが、本発明で云う骨髄球様細胞もこれと
同義のものを意味する。従来、一般に、骨髄球様細胞に
アポトーシスを誘起する特性を有するモノクローナル抗
体は前記の他に全く知られておらず、従って、前記モノ
クローナル抗体は、骨髄球様細胞にアポトーシスを誘起
する特性を有するすべてのモノクローナル抗体を包括す
るものとして定義される。

【０００９】かかるモノクローナル抗体は、基本的に
は、例えば、次のようにして作製することができる。す
なわち、前記モノクローナル抗体は、例えば、ｒＧ−Ｃ
ＳＦ投与動物の脾臓間質細胞を感作抗原として使用し
て、基本的には、これを通常の免疫法を応用して免疫
し、通常の細胞融合法を応用して細胞融合させ、通常の
クローン化法を応用してクローン化することによって作
製することができる。

【００１０】前記モノクローナル抗体の作製方法は、よ
り具体的には、例えば、前記感作抗原として、本発明者
らによって培養細胞株として樹立されたｒＧ−ＣＳＦ投
与マウスの脾臓間質細胞であるＣＦ−１細胞〔Ｂｌｏｏ
ｄ，Ｖｏｌ．８０，１９１４（１９９２）〕を使用し、
当該感作抗原で免疫した哺乳動物の形質細胞（免疫細
胞）を、マウス等の哺乳動物のミエローマ細胞と融合さ
せ、得られた融合細胞（ハイブリドーマ）をクローン化
し、その中から前記細胞株を認識する前記抗体を産生す
るクローンを選別し、これを培養して目的とする抗体を
回収する方法が好適なものとして例示される。しかしな
がら、かかる方法はあくまで一例に過ぎず、例えば、こ
の場合、前記感作抗原としては、前記ＣＦ−１細胞に限
らず、ＣＦ−１細胞の場合に準じて得られるヒト脾臓間
質細胞由来の細胞株を使用することも適宜可能であり、
前記ＣＦ−１細胞の場合と同様にして目的とするヒト骨
髄球様細胞と結合するモノクローナル抗体を作製するこ
とができる。

【００１１】このようなモノクローナル抗体の作製方法
において、前記感作抗原で免疫される哺乳動物として
は、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用す
るミエローマ細胞との適合性などを考慮して選択するの
が好ましく、一般的には、マウス、ラット、ハムスター
等が好適なものとして使用される。

【００１２】次に、免疫は、一般的方法により、例え
ば、前記ＣＦ−１細胞等の脾臓間質細胞を哺乳動物に腹
腔内注射等により投与することにより、行われる。より
具体的には、ＰＢＳや生理食塩水等で適当量に希釈、懸
濁したものを、動物に１ヶ月毎に数回投与することが好
ましい。免疫細胞としては、前記細胞株の最終投与後に
摘出した脾細胞を使用するのが好ましい。

【００１３】次に、前記免疫細胞と融合される他方の親
細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞としては、すで
に公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ
８．６５３）〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４
８（１９７８）〕、ｐ３−Ｕ１〔Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏ
ｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１，１−７（１９７
８）〕、ＮＳ−１〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，
６，５１１−５１９（１９７６）〕、ＭＰＣ−１１〔Ｃ
ｅｌｌ，８，４０５−４１５（１９７６）〕、Ｓｐ２／
０−Ａｇ１４〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２７０
（１９７８）〕、ＦＯ〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔ
ｈ．，３５，１−２１（１９８０）〕、Ｓ１９４〔Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１４８，３１３−３２３（１９７
８）〕、およびＲ２１０〔Ｎａｔｕｒｅ，２７７，１３
１−１３３（１９７９）〕等が好適に使用される。

【００１４】前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融
合は、基本的には通常の方法、例えば、ミルシュタイン
ら（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．）の方法〔Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３，３−４６（１９８
１）〕等に準じて行うことができる。

【００１５】より具体的には、前記細胞融合は、例え
ば、融合促進剤の存在下に通常の栄養培地中で実施され
る。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用
され、更に、所望により融合効率を高めるためにジメチ
ルスルホキシド等の補助剤を適宜添加使用することもで
きる。免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例え
ば、ミエローマ細胞に対して、免疫細胞を１〜１０倍程
度とするのが好ましい。また、前記細胞融合に用いる培
地としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好
適なＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地、その他、こ
の種の細胞培養に使用される通常の培地が使用可能であ
り、更に、牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清補液を併用す
ることも可能である。

【００１６】細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細
胞との所定量を前記培地内でよく混合し、予め３７℃程
度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１，００
０〜６，０００程度のＰＥＧを、通常、培地に約３０〜
６０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で添加し、混合することによっ
て行われる。続いて、適当な培地を逐次添加し、遠心し
て上清を除去する操作を繰り返すことにより目的とする
ハイブリドーマが形成される。

【００１７】当該ハイブリドーマは、通常の選択培地、
例えば、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン
およびチミジンを含む培地）で培養することにより選択
される。当該ＨＡＴ培地による培養は、目的とするハイ
ブリドーマ以外の細胞（未融合細胞）が死滅するのに充
分な時間、通常、数日〜数週間継続する。次いで、通常
の限界希釈法に従って、目的とする抗体を産生するハイ
ブリドーマのスクリーニングおよび単一クローン化が実
施される。

【００１８】このようにして作製される前記モノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培地で継
代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期
保存することが可能である。

【００１９】当該ハイブリドーマから前記モノクローナ
ル抗体を採取するには、当該ハイブリドーマを常法に従
って培養し、その培養上清から得る方法、あるいはハイ
ブリドーマをこれと適合性のある哺乳動物に投与して増
殖させその腹水から得る方法など適宜の方法が採用され
る。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適した方法
であり、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適した
方法である。

【００２０】更に、前記した方法により得られる抗体
は、塩析法、ゲル濾過法、アフィニティークロマトフラ
フィー等の通常の精製手段を応用して高純度に精製する
ことができる。

【００２１】当該モノクローナル抗体は、後記する実施
例においてはＢＭＡＰ−１を用いたが、それに限らず、
実施例において具体的に示す固有の特性、すなわち骨髄
球様細胞等にアポトーシスを誘起する機能を有するもの
であれば、如何なるものであってもよく、当該機能を有
するものであれば、その種類を問わず利用することがで
きる。次に、ＩＡＰを発現している細胞としては、骨髄
球様細胞等が例示されるが、例えば、マウスＩＡＰ遺伝
子(Genbank, Accession number Z25524)〔TheJournal o
f Cell Biology, 123, 485-496 (1993)〕を常法により
導入したジャーカット細胞（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ
Ｊｕｒｋａｔ Ｃｅｌｌ）等が好適なものとして使用
される。ＩＡＰ遺伝子としては、マウスＩＡＰ遺伝子に
限定されるものではなく、他のＩＡＰ遺伝子、例えば、
ヒトＩＡＰ遺伝子等を使用することが可能である。その
他、ＩＡＰを発現している細胞（例えば、ヒト白血病細
胞等）であれば同様に使用できることは云うまでもな
い。そして、本発明に係るスクリーニング方法は、ＩＡ
Ｐを発現している細胞を用いる点に最大の特徴を有する
ものであり、当該細胞を用いてアポトーシスを誘起する
物質をスクリーニングする方法は、ＩＡＰを発現して無
い同一細胞をブランクとして、当該ＩＡＰを抗原として
特異的に認識するモノクローナル抗体、その断片等の物
質を、常法により識別、同定して、スクリーニングすれ
ば良く、その具体的方法は特に限定されるものではな
い。本発明のスクリーニング方法により取得されたモノ
クローナル抗体、その断片、ＩＡＰに結合能を有するア
ポトーシスを誘起する物質等は、その特性を利用して、
例えば、抗ガン剤、骨髄性白血病の治療等の分野におい
て有用な骨髄性白血病治療薬剤等の医薬組成物の有効成
分として使用し得るものである。

【００２２】このようなモノクローナル抗体を利用して
骨髄球様細胞にアポトーシスを引き起こす抗原等を特異
的に認識する抗体として、これらを識別、同定するため
の、あるいは、当該モノクローナル抗体の固有の特性を
利用して抗ガン剤、骨髄性白血病治療薬剤等の医薬組成
物として使用するための具体的システムの構築、その改
変および応用等は、当業者にとって自明の通常の方法を
応用して実施されるものであることは云うまでもない。

【００２３】

【発明の実施の形態】

【実施例】次に、本発明を参考例および実施例に基づい
て更に具体的に説明するが、本発明は当該実施例に限定
されるものではない。

【００２４】参考例 脾臓間質細胞株の樹立とその性質 １）脾臓間質細胞株の樹立 ｒＧ−ＣＳＦ連続投与による脾臓間質細胞株は、ｒＧ−
ＣＳＦ１００μｇ／ｋｇを５日間投与したＣ５７ＢＬ／
６Ｊマウスの脾臓細胞の初代培養から樹立された。すな
わち、ｒＧ−ＣＳＦ投与後に無菌条件下に脾臓を摘出
し、２５ｃｍ² プラスチック・フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎ
ｇ社製）で６週間培養し、１０％非働化血清（ＦＢＳ）
（三光純薬社製、東京）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンお
よび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＩ
ｓｃｏｖｅの改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）で３
７℃、５％ＣＯ₂ のインキュベータ内で培養し、週２回
新鮮培地に交換した。

【００２５】コンフルエント培養から０．０５％トリプ
シン＋０．０２％ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ社製）、Ｃａ−Ｍｇ−ｆｒｅｅ ＰＢＳを用いて付
着性細胞集団（間質細胞）を分取して別なフラスコに移
した。この継代培養を週に約１〜２回繰り返した。初期
の継代培養（１〜１０回目）での細胞のｓｐｌｉｔｒａ
ｔｉｏは１／４〜１／８であったが、その後の比率は１
／１６〜１／３２とした。約１０回目の継代培養後に間
質細胞は均質な線維芽細胞様となった。２０回目の継代
時に上述の方法で間質細胞を採集し、限界希釈法を用い
て細胞のクローニングを２回繰返して間質細胞株（ＣＦ
−１細胞株）を樹立した。

【００２６】次いで、これらの細胞を１０％非働化ＦＢ
Ｓを加えたＩＭＤＭ５ｍｌを入れた２５ｃｍ² フラスコ
（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）内で維持培養し、５日毎にｓｐ
ｌｉｔ ｒａｔｉｏ １／３２で継代培養した。尚、他
の哺乳動物についても、その脾臓間質細胞株を樹立する
ことができ、例えば、ヒトの場合には、細胞をＳＶ−４
０アデノウィルスベクターで形質転換すれば前述と同様
の方法でヒト脾臓間質細胞株を樹立することが可能であ
る〔Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１４８，２４５
（１９９１）〕。

【００２７】２）ＣＦ−１細胞の特性 前記の如くして細胞株として樹立されたＣＦ−１細胞に
ついては、標準的な細胞化学的手法を用いてアルカリ・
ホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、β−グルクロニ
ダーゼ、α−ナフチルアセテイトエステラーゼおよびオ
イル・レッドＯを検索すると共に下記のモノクローナル
およびポリクローナル抗体を用いて免疫酵素組織化学検
索によりその特性を検討した：ＭａｃＩ（Ｓｅｒｏ Ｔ
ｅｃ．社製）、第ＶＩＩＩ関連抗原（Ｄａｋｏｐａｔｔ
ｓ社製）、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲンおよび
フィブロネクチン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ社製）、貪食能はラテックス・ビーズ（粒
子径：１．０９μｍ，Ｓｉｇｍａ）を用い、また、脂肪
細胞への分化能は、２５ｃｍ² フラスコでコンフルエン
ト培養後１０^-6ｍｏｌ／ｌの燐酸ハイドロコルチゾン
（Ｓｉｇｍａ社製）を添加し、４週間の培養で検討し
た。

【００２８】その結果、ＣＦ−１細胞は、アルカリ・ホ
スファターゼ、第ＶＩＩＩ因子関連抗原、ＭａｃＩおよ
び貧食能は陰性であったが、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型
コラーゲンおよびフィブロネクチンは陽性であった。Ｃ
Ｆ−１細胞は、微かにリピッドを含むが、１０^-6ｍｏｌ
／ｌのハイドロコルチゾン存在下の４週間のコンフルエ
ント培養によっても脂肪細胞には分化しなかった。これ
らのデータから、ＣＦ−１細胞は、前脂肪細胞、マクロ
ファージおよび血管内皮細胞の特徴を備えていないと云
えることから、これらとは異なる間質細胞由来であるこ
とが明らかとなった。

【００２９】３）ＣＦ−１細胞による造血幹細胞の維持 造血幹細胞がＣＦ−１細胞によって維持されるか否かを
検討するため、Ｔｉｌｌ＆ＭｃＣｕｌｌｏｃｈの方法に
よるＣＦＵ−Ｓ ａｓｓａｙ（脾コロニー形成法）を行
なった。マウス１０匹／群に９００ｃＧｙを照射（ＭＢ
Ｒ−１５２０Ｒ，Ｈｉｔａｃｈｉ社製，東京）した後、
骨髄単核細胞（ＢＭ細胞）（１．０×１０⁵ ／ｈｅａ
ｄ、５．０×１０⁴ ／ｈｅａｄまたは２．５×１０⁴ ／
ｈｅａｄ）およびＣＦ−１細胞（１．０×１０⁵ ／ｈｅ
ａｄ）を静注し、１２日目に脾臓内のコロニー数を算え
てＣＦＵ−Ｓ（脾臓コロニー）とした。

【００３０】その結果、骨髄単核細胞（ＢＭ細胞）とＣ
Ｆ−１細胞とを放射線照射したマウスに同時に移植する
と、いずれのＢＭ細胞群についても脾コロニー数は、Ｃ
Ｆ−１細胞を移植しなかったマウスに比し有意に増加し
（１．４〜１．８倍）、また、ＢＭ細胞とＣＦ−１細胞
とを同時に移植したマウスの移植後１２日目の生存率
は、ＢＭ細胞を単独移植したマウスよりも高く、死亡率
が低下することから、造血幹細胞がＣＦ−１細胞によっ
て維持されることが明らかとなった。

【００３１】実施例 モノクローナル抗体の作製 １）感作抗原と免疫法 感作抗原として、前述の参考例で取得したＣＦ−１細胞
を用いて抗原感作を行った。細胞株は、１０％牛胎児血
清（ＦＢＳ、三光純薬社製）、Ｉｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌ
ｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−
Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を培地として使用し、５％ＣＯ
₂ インキュベーター中で３７℃の温度条件下で継代培養
を行った。

【００３２】細胞は、１ｍＭＥＤＴＡ、ＰＢＳ処理後、
軽いピペッティングによって培養フラスコより回収し
た。この細胞を約１×１０⁷ 個／ｍｌの細胞数で１ｍＭ
ＥＤＴＡ・ＰＢＳに懸濁し、浮遊させ、Ｗｉｓｔａｒ
Ｉｍａｍｉｃｈ系ラット（７週令、♀、動物繁殖研究
所）に免疫した。初回免疫には、約１×１０⁷ 個／ｍｌ
の細胞１ｍｌをラット腹腔内に注射し、１ヶ月後に１×
１０⁷ 個／ｍｌの細胞１ｍｌを追加免疫した。更に、１
ヶ月間隔にて１×１０⁷ 個／ｍｌの細胞１ｍｌを数回追
加免疫し、免疫されたラット抗体とＣＦ−１細胞との反
応性を確認後、最終免疫として、１×１０⁸ 個／ｍｌの
細胞１ｍｌを免疫した。最終免疫３日後にラットを屠殺
して脾臓を摘出した。

【００３３】２）細胞融合 １匹のラットから摘出した脾臓を細切後、遊離した脾細
胞を遠沈した後、ＩＭＤＭ培地（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
−Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）中に懸濁し、浮遊させ、充分
に洗浄を行った。一方、マウス・ミエローマ細胞株Ｓｐ
２／０−Ａｇ１４〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２
７０（１９７８）〕を、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ、三
光純薬社製）を含有するＩＭＤＭ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）培地にて培養して得た細胞
を、同様に前記ＩＭＤＭ培地で洗浄後、その１×１０⁸
個と、前記脾細胞２×１０⁸ 個とを遠心管に入れ混合
し、ポリエチレングリコール４０００（半井化学社製）
によって常法〔Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，
４２，４５８−４６２（１９８０）〕に従い細胞融合さ
せた。

【００３４】次いで、得られた融合細胞を、２０％ＦＢ
Ｓを含むＩＭＤＭ培地にて９６個のウエルプレートに分
注し、５％ＣＯ₂ インキュベーター中で３７℃で培養し
た。翌日よりＨＡＴ選択培地に徐々に置換させて培養を
続けた。培養開始後、上清を週２回の頻度に、それぞれ
新しいＨＡＴ培地に代え、培養を継続し、増殖維持させ
た。

【００３５】次に、このようにして得られた融合細胞を
常法により限界希釈法を用いてクローニングした。すな
わち、前記融合細胞の培養上清中の抗体を利用して、感
作抗原との結合性を調べ、感作抗原と強い結合性を有す
るクローンだけを常法により限界希釈法を用いてクロー
ニングした。

【００３６】３）スクリーニング 融合細胞（ハイブリドーマ）のスクリーニングは、フロ
ーサイトメトリー（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を
使った間接蛍光抗体法により行った。目的の抗体を産生
するクローンのスクリーニングは、ターゲット細胞とし
て、ＣＦ−１細胞を用いて行った。すなわち、反応バッ
ファー〔２％ＦＢＳ，０．０２％ＮａＮ₃ を含むＰＢ
Ｓ〕に懸濁した細胞を遠心し、ペレットとして回収した
後、ハイブリドーマ培養上清１００μｌ中に浮遊させ
（約１×１０⁶ 個／１００μｌ）、４℃にて１時間反応
させた。 前記バッファーにより１回洗浄した後、ＦＩ
ＴＣ標識ヤギ抗ラットＩｇＧ（ＦＣ）抗体（Ｃｈｅｍｉ
ｃｏｎ社製）を加えて１時間インキュベーションした。
１回洗浄した後、フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ Ｃ
ｙｔｏｍｅｔｒｙ）（ＦＡＣＳｃａｎ，ベクトン・デッ
キンソン社製）にて解析した。

【００３７】４）抗体の精製 前記３）でスクリーニングした融合細胞を常法に従って
培養し、培養上清中に産生される抗体を常法により分離
し、精製した。すなわち、各ウエルのうち前記感作抗原
に対する抗体価の高かったウエルからハイブリドーマを
採取し、組織培養プラスチックディッシュ（Ｃｏｒｎｉ
ｎｇ社製）に広げて５％ＣＯ₂ 中で３７℃にて継代培養
を行い、増殖させ、常法により精製することにより、モ
ノクローナル抗体ＧＳＰＳＴ−１、ＢＭＡＰ−１を得
た。

【００３８】ＧＳＰＳＴ−１については、得られた細胞
をプリスタン投与を施行したＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｎ
ｕ系ヌードマウス（８週令，♂，日本クレア社製）に腹
腔内注入した。１０〜１４日後、産生された腹水を採取
し、３３％硫酸アンモニウムで塩析しＰＢＳで透析し
た。また、ＢＭＡＰ−１抗体については、１０％ＦＢＳ
を含むＩｓｃｏｖｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＭＥＭ培地に
て、大量培養し、培養上清を濃縮後、３３％硫酸アンモ
ニウムで塩析し、ＰＢＳで透析後、プロテインＡカラム
キット（アマシャム社製）により再度精製し、ＰＢＳに
より透析を行った。尚、上記の実施例においては、感作
抗原として、前記ＣＦ−１細胞を使用した場合について
例示したが、他の造血幹細胞支持能を有する間質細胞を
使用した場合にも同様にしてモノクローナル抗体を作製
することが可能である。

【００３９】前記モノクローナル抗体のＢＭＡＰ−１を
産生するハイブリドーマは、Ｗｉｓｔａｒ Ｉｍａｍｉ
ｃｈ系ラット脾細胞とマウス・ミエローマ細胞株Ｓｐ２
／０−Ａｇ１４を親細胞として作製された新規な融合細
胞であり、公的微生物寄託機関である工業技術院生命工
学工業技術研究所に、ＢＭＡＰ−１（ラット マウスハ
イブリドーマ），受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４３８２と
して国際寄託されている。

【００４０】５）抗体の性質 抗体の反応性 （ＣＦ−１細胞に対する反応性）上記のようにして得ら
れたモノクローナル抗体ＧＳＰＳＴ−１、ＢＭＡＰ−１
のＣＦ−１細胞に対する反応性について免疫蛍光分析
（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎａｌｙ
ｓｉｓ）により検討した結果を図１〜図３に示す。ここ
で、図１は、抗体非存在下のコントロール、図２は、Ｇ
ＳＰＳＴ−１とＣＦ−１細胞との結合性、図３は、ＢＭ
ＡＰ−１とＣＦ−１細胞との結合性、の解析結果を示
す。尚、図中、縦軸は相対細胞数を、横軸は蛍光強度
を、示す。図１〜図３から明らかなとおり、モノクロー
ナル抗体ＧＳＰＳＴ−１、ＢＭＡＰ−１はＣＦ−１細胞
に対して結合性を有しており、ＣＦ−１細胞の表面抗原
を認識するものであることが分った。

【００４１】（骨髄細胞に対する反応性）次に、ＧＳＰ
ＳＴ−１、ＢＭＡＰ−１の正常の骨髄細胞に対する反応
性をフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔ
ｒｙ）（ＦＡＣＳｃａｎ，ベクトン・デッキンソン社
製）により検討した結果を図４〜図６に示す。ここで、
図４は、抗体非存在下のコントロール、図５は、ＧＳＰ
ＳＴ−１と骨髄細胞との結合性、図６は、ＢＭＡＰ−１
と骨髄細胞との結合性、の解析結果を示す。尚、図中、
縦軸は相対細胞数を、横軸は蛍光強度を、示す。図４〜
図６に示すように、ＧＳＰＳＴ−１は、骨髄細胞とは全
く結合せず、ＢＭＡＰ−１は、すべての骨髄細胞と結合
することが明らかとなった。

【００４２】（骨髄性白血病細胞株（ＮＦＳ−６０）に
対する反応性）ＧＳＰＳＴ−１およびＢＭＡＰ−１のＮ
ＦＳ−６０細胞〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，８２，６６８７−６６９１（１９８５）〕
に対する反応性をフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ Ｃ
ｙｔｏｍｅｔｒｙ）（ＦＡＣＳｃａｎ，ベクトン・デッ
キンソン社製）により検討した結果を図７〜図１０に示
す。ここで、図７は、抗体非存在下のコントロール、図
８は、ＧＳＰＳＴ−１とＮＦＳ−６０細胞との結合性、
図９は、市販のラットＩｇＧ１（Ｚｙｍｅｄ社製）を用
いたコントロール、図１０は、ＢＭＡＰ−１とＮＦＳ−
６０細胞との結合性の解析結果を示す。尚、図中、縦軸
は相対細胞数を、横軸は蛍光強度を、示す。図７〜図１
０に示すように、ＧＳＰＳＴ−１は、ＮＦＳ−６０細胞
とは反応せず、ＢＭＡＰ−１は、ＮＦＳ−６０細胞と結
合することが明らかとなった。

【００４３】（ＢＭＡＰ−１のＮＦＳ−６０細胞に対す
る細胞増殖抑制試験）ＢＭＡＰ−１のＮＦＳ−６０細胞
に対する作用を、Ｇ−ＣＳＦ１００ｎｇ／ｍｌおよびサ
イクロヘキシミド１０^-9Ｍ存在下にて、ＭＴＴアッセイ
法により検討した結果を図１１に示す。９６穴の培養プ
レートを用い、ＮＦＳ−６０細胞を４×１０³ ／ｗｅｌ
ｌ／１００μｌに対し、ＢＭＡＰ−１は０，１，１０，
１００ｎｇ／ｍｌ，１，１０μｇ／ｍｌ濃度のものをそ
れぞれ１０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、その２日後に、ＭＴ
Ｔ法により生細胞数を測定した。その結果、図１１に示
すように、ＮＦＳ−６０細胞はＢＭＡＰ−１により著し
く増殖が抑制されていることが明らかとなった。

【００４４】抗体のタイピング 次に、得られたモノクローナル抗体のＩｇＧのサブクラ
スをタイピングしたところ〔ラットＭｏｎｏ Ａｂ−Ｉ
Ｄ・Ｓｐキット（Ｚｙｍｅｄ社製）、およびビオチン標
識マウス抗ラットＩｇＧ１抗体（Ｚｙｍｅｄ社製）を使
用〕、ＧＳＰＳＴ−１はＩｇＧ２ａ、ＢＭＡＰ−１はＩ
ｇＧ１であることが明らかとなった。

【００４５】骨髄移植阻害作用 次に、これらの抗体を用いて骨髄移植阻害実試験を行
い、その特性について検討した。その結果を図１２〜図
１３に示す。図１２〜図１３に示されるように、ＢＭＡ
Ｐ−１は、骨髄移植阻害効果を有するが、ＧＳＰＳＴ−
１には、その効果は認められなかった。すなわち、致死
量の放射線照射（９００ｃＧｙ）をしたＣ５７ＢＬ／６
Ｊマウスに、１．０×１０⁵ ／ｈｅａｄの骨髄細胞およ
びモノクローナル抗体を、尾静脈より投与し、脾臓コロ
ニーの形成を観察したところ、上記の結果を得た。尚、
図１３のＮｏｎ−ｔｒｅａｔｅｄは、これらを投与しな
かった場合を示す。

【００４６】図１３に示されるように、ＢＭＡＰ−１
が、骨髄移植阻害試験において、移植を完全に抑制する
のは、このモノクローナル抗体が、骨髄細胞に反応しア
ポトーシスを引き起こすことに因るものであることが確
認された。すなわち、ＢＭＡＰ−１産生のハイブリドー
マをヌードマウスに腹腔内投与すると腹水がわずかに貯
留する時期にマウスは死亡した。また、正常のＣ５７Ｂ
Ｌ／６Ｊマウスに、５０μｇ／ｈｅａｄのＢＭＡＰ−１
を静脈内投与することにより骨髄細胞がすべて死滅する
ことが判明し、図１４にＢＭＡＰ−１静脈内投与６日後
の骨髄細胞が死滅したことを裏付ける顕微鏡写真を示し
た。この顕微鏡写真から明らかなように、リンパ球ばか
りでなく、好中球、巨核球、骨髄芽球、骨髄球、肥満細
胞、マクロファージ、単球、赤芽球等（いわゆる骨髄球
様細胞）が死滅していることが確認された。また、３０
μｇ／ｈｅａｄのＢＭＡＰ−１を投与したマウスの骨髄
細胞のＤＮＡを検討したところ、図１５に示すように、
明らかにラダー・フォーメーションが認められ、ＢＭＡ
Ｐ−１の骨髄細胞に対する前記反応は、アポトーシスに
因るものであることが確認された。

【００４７】なお、ＢＭＡＰ−１抗体について、そのＩ
ｇＧのＦｃ領域をペプシン（Ｓｉｇｍａ社製）により切
断し、Ｆ（ａｂ′）₂ としてＧＰＣカラムにより精製し
た後、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにその３３．５μｇ／ｈ
ｅａｄ（完全なＩｇＧの５０μｇ／ｈｅａｄに相当する
量）を静脈内投与した結果、骨髄において、骨髄細胞が
死滅することが認められた。このことにより、ＢＭＡＰ
−１による骨髄細胞の死滅には、抗体依存性細胞障害お
よび補体依存性細胞障害は関与していないことが明らか
となった。

【００４８】ところで、アポトーシスを引き起こす抗原
としては、細胞表面蛋白質のＦａｓ抗原が既に報告され
ているが、このＦａｓ抗原は、胸腺、心臓、肝臓、肺、
卵巣などでｍＲＮＡの発現が認められているが、骨髄で
はそのｍＲＮＡがほとんど検出されないことから〔Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８，１２７４−１２７９（１９
９２）〕、ＢＭＡＰ−１が認識する抗原は、従来知られ
ているＦａｓ抗原とは異なるものであることは明らかで
ある。

【００４９】更に、ＢＭＡＰ−１が認識する抗原が、Ｔ
ＮＦレセプターか否かを明らかにするため、ＴＮＦに反
応し細胞死を起こすＬ−９２９細胞を用い、ＢＭＡＰ−
１の作用を検討した。マウスＴＮＦα（Ｇｅｎｚｙｍｅ
社製）の最終濃度は、０，１，１０，１００ｐｇ／ｍ
ｌ，１，１０，１００ｎｇ／ｍｌ，１μｇ／ｍｌとし、
ＢＭＡＰ−１の最終濃度は、０，１０，１００ｐｇ／ｍ
ｌ，１，１０，１００ｎｇ／ｍｌ，１，１０μｇ／ｍｌ
とし、ＴＮＦαおよびＢＭＡＰ−１添加後２日目に、Ｌ
−９２９細胞の生細胞数をＭＴＴ法により測定した。そ
の結果、図１６、１７に示すように、ＴＮＦαによりＬ
−９２９細胞は著明に減少するのに対し、ＢＭＡＰ−１
はＬ−９２９細胞に対し作用を及ぼさなかった。従っ
て、ＢＭＡＰ−１が認識する抗原はＴＮＦレセプターで
ないことが明らかとなった。

【００５０】ＢＭＡＰ−１が認識する抗原が、ＭＨＣｃ
ｌａｓｓＩ抗原であるか否かをフローサイトメトリー
（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）（ＦＡＣＳｃａｎ，
ベクトン・デッキンソン社製）により検討した結果を図
１８〜図２１に示す。ここで、図１８は、市販のラット
ＩｇＧ２ａ（Ｚｙｍｅｄ社製）を用いたコントロール、
図１９は、抗マウスＭＨＣｃｌａｓｓＩ抗体（ラットＩ
ｇＧ２ａ，ＢＭＡ社製）とＢＷＶ１細胞（ＢＷ５１４７
細胞由来のマウスリンパ腫）との結合性、図２０は、市
販のラットＩｇＧ１（Ｚｙｍｅｄ社製）を用いたコント
ロール、図２１は、ＢＭＡＰ−１とＢＷＶ１細胞との結
合性の解析結果を示す。尚、図中、縦軸は相対細胞数
を、横軸は蛍光強度を、示す。その結果、ＢＭＡＰ−１
はＢＷＶ１細胞を認識しないが、ＭＨＣｃｌａｓｓＩ抗
体は、ＢＷＶ１細胞と反応した。

【００５１】以上のように、ＢＭＡＰ−１は、骨髄球様
細胞にアポトーシスを引き起こす作用を有するものであ
ることが実験的に確認されたが、本発明者の知るところ
によれば、前述の如く、従来、骨髄球様細胞にアポトー
シスを誘起するモノクローナル抗体について報告された
例はなく、かかる作用を有するモノクローナル抗体は、
本発明者が見い出したものである。

【００５２】前記ＢＭＡＰ−１が認識する抗原について
は、直接発現クローニング（Ｄｉｒｅｃｔ Ｅｘｐｒｅ
ｓｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ）によりマウスＩＡＰであ
ることが明らかとなった。次に、ＢＭＡＰ−１の作用を
マウスＩＡＰを遺伝子導入した組み換え体細胞を用いて
検討した。すなわち、マウスＩＡＰ（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ
Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現して
無いＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ Ｃｅｌｌ）に常
法によりＩＡＰ遺伝子を導入し、マウスＩＡＰを発現し
ている細胞（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｊｕｒｋａｔ
Ｃｅｌｌ）を用い、ＢＭＡＰ−１の当該ＩＡＰ発現細胞
に対する作用をＭＴＳ法およびフローサイトメトリーに
よるＤＮＡ断片化の検索により検討した。その結果を図
２２〜２６に示す。

【００５３】ＭＴＳ法は生細胞数を測定するアッセイ法
（プロメガ社）であり、この方法によりＢＭＡＰ−１の
組み換え体Ｊｕｒｋａｔ細胞への作用を検討した。すな
わち、９６穴の培養プレートを用い、Ｇ４１８（１ｍｇ
／ｍｌ最終濃度）（ギブコＢＲＬ社製）の存在下で、組
み換え体Ｊｕｒｋａｔ細胞を１×１０⁴ ／ｗｅｌｌ／１
００μｌに対し、ＢＭＡＰ−１を最終濃度で１、１０、
１００ｎｇ／ｍｌおよび１、１０μｇ／ｍｌ、対照とし
てＩｇＧ１を１０μｇ／ｍｌ添加し、２日間培養後に、
ＭＴＳ法により生細胞数を測定した。その結果、図２２
に示すように、組み換え体Ｊｕｒｋａｔ細胞はＢＭＡＰ
−１により著しく増殖が抑制されていることが明らかと
なった。ＢＭＡＰ−１による組み換え体Ｊｕｒｋａｔ細
胞のＤＮＡ断片化の解析は、フローサイトメトリー（Ｅ
ＰＩＣＳ（登録商標） ＸＬ−ＭＣＬ、コールター社
製）を用いて行った。すなわち、６穴の培養プレートを
用いＧ４１８（１ｍｇ／ｍｌ最終濃度）（ギブコＢＲＬ
社製）の存在下で、組み換え体Ｊｕｒｋａｔ細胞を１．
５×１０⁵ ／ｗｅｌｌ／３ｍｌに対し、ＩｇＧ１および
ＢＭＡＰ−１を最終濃度１μｇ／ｍｌ添加し２日間培養
後、測定に供した。細胞を培養プレートより回収し２０
０×ｇで細胞ペレットを２ｍｌの冷７０％エタノール中
に４℃で６０分間固定した。次いで、細胞を遠心し、１
ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁した。０．５ｍｌの細胞サンプ
ルに対して０．５ｍｌのＲＮＡｓｅ（Ｔｙｐｅ Ｉ−
Ａ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ、１
ｍｇ／ｍｌ ｉｎ ＰＢＳ）を加え、次いで、１ｍｌの
ヨウ化プロビジウム（ＰＩ、Ｓｉｇｍａ、１００μｇ／
ｍｌ ｉｎ ＰＢＳ）溶液に混合した。混合した細胞は
暗所で室温にて１５分間インキュベーションした後、４
℃の暗所に保持し、フローサイトメトリーによる測定に
供した。

【００５４】その結果、図２６に示すように、マウスＩ
ＡＰ遺伝子を導入した細胞はＢＭＡＰ−１によりアポト
ーシスが誘起されていることが明らかとなった。一方、
発現Ｖｅｃｔｏｒのみを導入しマウスＩＡＰを発現して
無いＪｕｒｋａｔ細胞に対しては、ＢＭＡＰ−１の上記
の作用は見られなかった（図２４）。これらのことか
ら、ＢＭＡＰ−１抗体が認識する抗原は、ＩＡＰと同一
であること、また、ＩＡＰがアポトーシスに関する機能
を有することが明らかとなった。

【００５５】現時点での情報では、ＩＡＰの機能として
は、インテグリンのα_v β₃ のβ鎖に結合しα_v β₃ と
そのリガンド（Ｌｉｇａｎｄ）であるビトロネクチン
（Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）との結合を支持する作用
（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２３，４８５−４９６
（１９９３））、好中球と血管内皮との接着に際し血管
内皮にＣａ²⁺の流入を誘導する作用（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，２６８，１９９３１−１９９３４（１９９
３））、あるいは好中球が血管内皮を通過することを支
持する作用が報告されているが（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，３９７８−３９８２
（１９９５））、アポトーシスに関する機能は報告され
ていない。

【００５６】ＢＭＡＰ−１は、上記のように、骨髄球様
細胞と結合し、骨髄球細胞にアポトーシスを誘起するモ
ノクローナル抗体の一種であることから、当該ＢＭＡＰ
−１抗体が特異的に認識する抗原としてのＩＡＰを発現
している細胞を利用すれば、骨髄球様細胞等にアポトー
シスを引き起こす物質を識別、同定し、スクリーニング
することが可能となる。

【００５７】以上のように、本発明は、ＢＭＡＰ−１抗
体が認識する抗原は、ＩＡＰと同一であること、また、
ＩＡＰがアポトーシスに関する機能を有すること、を明
らかとしたものであり、かかる知見に基づいて、ＩＡＰ
遺伝子を導入した細胞あるいはＩＡＰを発現している細
胞を用いることにより、骨髄球様細胞等にアポトーシス
を誘起する物質を簡便かつ高効率にスクリーニングする
方法を確立したものである。

【００５８】そして、本発明のスクリーニング方法によ
って取得されたモノクローナル抗体、その断片、ＩＡＰ
に結合能を有するアポトーシスを誘起する物質等の物質
の骨髄球様細胞等に対するアポトーシス作用を利用する
ことにより、当該モノクローナル抗体等の物質は、例え
ば、その抗原の発現が高いと考えられる骨髄性白血病細
胞を死滅させることが可能であると考えられることか
ら、前記骨髄球様細胞にアポトーシスを誘起するモノク
ローナル抗体、その断片等の物質は、抗ガン剤、骨髄性
白血病治療薬剤等の医薬組成物の有効成分として有用な
ものである。

【００５９】以上、本発明のスクリーニング方法につい
て実施例を示して具体的に説明したが、本発明で云うと
ころのアポトーシスを誘起する物質は、前記具体例とし
て例示したものが代表的なものとしてあげられるもの
の、必ずしもこれに限定されるものではなく、同様にス
クリーニングされた同様の特性および機能を有するすべ
ての物質を包含するものであることは云うまでもない。

【００６０】

【発明の効果】本発明は、ＩＡＰを発現している細胞を
用いることにより、骨髄球様細胞にアポトーシスを引き
起こす抗体等の物質を、その特異的結合反応を利用し
て、それらを識別、同定し、簡便かつ高効率でスクリー
ニングすることを可能とする。本発明のスクリーニング
方法により取得された骨髄球様細胞等にアポトーシスを
引き起こす作用を有する物質は、その特性を利用して、
抗ガン剤、骨髄性白血病の治療等の分野において有用な
骨髄性白血病治療薬剤等の医薬組成物の有効成分として
使用し得るものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】イムノフルオレッセンスによる解析（抗体非存
在下の対照，ＣＦ−１細胞）。

【図２】イムノフルオレッセンスによるＧＳＰＳＴ−１
抗体とＣＦ−１細胞との結合性の解析。

【図３】イムノフルオレッセンスによるＢＭＡＰ−１抗
体とＣＦ−１細胞との結合性の解析。

【図４】イムノフルオレッセンスによる解析（抗体非存
在下の対照，骨髄細胞）。

【図５】イムノフルオレッセンスによるＧＳＰＳＴ−１
抗体と骨髄細胞との結合性の解析。

【図６】イムノフルオレッセンスによるＢＭＡＰ−１抗
体と骨髄細胞との結合性の解析。

【図７】イムノフルオレッセンスによる解析（抗体非存
在下の対照，ＮＦＳ−６０）。

【図８】イムノフルオレッセンスによるＧＳＰＳＴ−１
とＮＦＳ−６０細胞との結合性。

【図９】イムノフルオレッセンスによる解析（ラットＩ
ｇＧ１による対照，ＮＦＳ−６０）。

【図１０】イムノフルオレッセンスによるＢＭＡＰ−１
とＮＦＳ−６０細胞との結合性。

【図１１】モノクローナル抗体の細胞増殖抑制試験（Ｂ
ＭＡＰ−１）。

【図１２】モノクローナル抗体の骨髄移植阻害試験（Ｇ
ＳＰＳＴ−１）。

【図１３】モノクローナル抗体の骨髄移植阻害試験（Ｂ
ＭＡＰ−１）。

【図１４】本発明のモノクローナル抗体のＢＭＡＰ−１
投与６日後の死滅した骨髄細胞（２）、抗体非存在下の
対照（１）、を示す説明図である〔骨髄標本（生物の形
態）の顕微鏡写真（Ｈ．Ｅ．染色）（×４００）〕。

【図１５】本発明のモノクローナル抗体のＢＭＡＰ−１
を投与した場合にみられる骨髄細胞のＤＮＡのラダー・
フォーメーションを示す説明図である（電気泳動クロマ
トグラフィーの泳動写真）。

【図１６】ＴＮＦによる細胞障害試験。

【図１７】モノクローナル抗体の細胞障害試験（ＢＭＡ
Ｐ−１）。

【図１８】イムノフルオレッセンスによる解析（ラット
ＩｇＧ２ａによる対照，ＢＷＶ１）。

【図１９】イムノフルオレッセンスによる抗マウスＭＨ
ＣｃｌａｓｓＩ抗体とＢＷＶ１細胞との結合性。

【図２０】イムノフルオレッセンスによる解析（ラット
ＩｇＧ１による対照，ＢＷＶ１）。

【図２１】イムノフルオレッセンスによるＢＭＡＰ−１
とＢＷＶ１細胞との結合性。

【図２２】ＢＭＡＰ−１の細胞（マウスＩＡＰ遺伝子を
導入したジャーカット細胞）に対する増殖抑制作用。

【図２３】Ａｐｏｐｔｏｓｉｓの解析───発現Ｖｅｃ
ｔｏｒのみを導入したＪｕｒｋａｔ ｃｅｌｌｓに対す
る作用（ＩｇＧ１ １μｇ／ｍｌ，Ａ：Ａｐｏｐｔｏｓ
ｉｓ ｒａｔｉｏ，６．２％）。

【図２４】Ａｐｏｐｔｏｓｉｓの解析───発現Ｖｅｃ
ｔｏｒのみを導入したＪｕｒｋａｔ ｃｅｌｌｓに対す
るＢＭＡＰ−１の作用（ＢＭＡＰ−１ １μｇ／ｍｌ，
Ａ：Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｒａｔｉｏ，３．５％）。

【図２５】Ａｐｏｐｔｏｓｉｓの解析───マウスＩＡ
Ｐ遺伝子を導入したＪｕｒｋａｔｃｅｌｌｓに対する作
用（ＩｇＧ１ １μｇ／ｍｌ，Ａ：Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ
ｒａｔｉｏ，３．２％）。

【図２６】Ａｐｏｐｔｏｓｉｓの解析───マウスＩＡ
Ｐ遺伝子を導入したＪｕｒｋａｔｃｅｌｌｓに対するＢ
ＭＡＰ−１の作用（ＢＭＡＰ−１ １μｇ／ｍｌ，Ａ：
Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｒａｔｉｏ，２５．６％）。

【符号の説明】

ａ ＢＭＡＰ−１投与したマウス胸腺のＤＮＡ（２４時
間） ｂ ＢＭＡＰ−１投与したマウス骨髄のＤＮＡ（２４時
間） ｃ ＢＭＡＰ−１投与したマウス骨髄のＤＮＡ（８時
間） ｄ ＢＭＡＰ−１投与したマウス骨髄のＤＮＡ（４時
間） ｅ 無処理マウスの骨髄のＤＮＡ（骨髄細胞） ｆ 分子量マーカー

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/15 9282−4Ｂ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＩＡＰ（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ Ａｓｓｏｃ
   ｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現している細胞を用
   いてアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘起する性
   質を有する物質を探索することを特徴とするアポトーシ
   スを誘起する物質のスクリーニング方法。
2. 【請求項２】 細胞が、骨髄球様細胞である請求項１記
   載のスクリーニング方法。
3. 【請求項３】 請求項１または請求項２記載のスクリー
   ニング方法で得られるアポトーシスを誘起する物質。
4. 【請求項４】 アポトーシスを誘起する物質が抗体であ
   るところの請求項３記載の物質。
5. 【請求項５】 請求項３および／または請求項４記載の
   物質を有効成分としてなる医薬組成物。
6. 【請求項６】 医薬組成物が抗ガン剤であるところの請
   求項５記載の医薬組成物。
7. 【請求項７】 医薬組成物が骨髄性白血病治療薬剤であ
   るところの請求項５記載の医薬組成物。
8. 【請求項８】 ＩＡＰに結合能を有するアポトーシスを
   誘起する物質。
9. 【請求項９】 請求項８記載の物質を有効成分としてな
   る医薬組成物。
10. 【請求項１０】 医薬組成物が抗ガン剤であるところの
    請求項９記載の医薬組成物。
11. 【請求項１１】 医薬組成物が骨髄性白血病治療薬剤で
    あるところの請求項１０記載の医薬組成物。