DE10154399A1

DE10154399A1 - Verfahren zur Identifizierung von Wirksubstanzen für die Modulation der pip92-vermittelten Apoptose

Info

Publication number: DE10154399A1
Application number: DE2001154399
Authority: DE
Inventors: Armin Schneider; Daniela Spielvogel; Sigrid Scheek
Original assignee: BASF Lynx Bioscience AG
Current assignee: Sygnis Pharma AG
Priority date: 2001-11-06
Filing date: 2001-11-06
Publication date: 2003-05-15
Also published as: WO2003040387A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Identifizierung von Wirkstoffsubstanzen, die in die vom Protein pip92-vermittelte apoptotische Signalkaskade eingreifen ebenso wie Verfahren, die zur Identifizierung von mit pip92 interagierenden Proteinen herangezogen werden können.

Description

Der Schlaganfall stellt die dritthäufigste Todesursache und die Hauptursache für Behinderungen in den westlichen Industrienationen dar. Jedes Jahr erleiden in Deutschland ungefähr 250 000 Menschen einen Schlaganfall, ein Drittel stirbt innerhalb des ersten Monats daran, 60% behalten Behinderungen zurück. Bislang gibt es keine wirksame Therapie für die Mehrzahl dieser Patienten. Im Stand der Technik sind umfangreiche Untersuchungen zu den molekularen Mechanismen, die der Pathophysiologie des Schlaganfalls zugrunde liegen, zu finden. So etwa ist seit langem bekannt, daß ein in höheren Eukaryoten hochkonserviertes, nukleares Enzym, die Poly(ADP-ribose)polymerase (EC 2.3.2.30, PARP) sowohl an der DNA-Reparatur als auch an der apoptotischen Zellantwort beteiligt ist. Die Inaktivierung von PARP geht mit einer proteolytischen Spaltung der aktiven Vorläuferform einher. Darüber hinaus ist bekannt, daß eine Hochregulation der PARP-mRNA auf molekularer Ebene und eine erhöhte Spaltung des Proteins PARP mit den Folgen eines Schlaganfalls in Zusammenhang steht.

Auch für das Protein pip92 (ein hydrophiles, leicht basisches Protein von 221 AS Länge), dessen zelluläre Funktion nicht abschließend geklärt ist, liegen im Stand der Technik Ergebnisse vor, die eine Assoziation mit den Vorgängen bei der Differenzierung und Apoptose vermuten lassen. Bei Coleclough et al. (PNAS, Vol. 87, 1990, 1753 ff.) wurde eine Hochregulation von pip92-mRNA (dort als chx1 bezeichnet) nach Zugabe von Cycloheximid auf aktivierte T- Lymphozyten beobachtet, und Shimizu et al. (J. biol. Chem., 1991, Vol. 266, No. 19, S. 12157 ff.) konnten zeigen, daß pip92 durch Stimulierung mit TPA in einer humanen promyeloischen Leukämiezellinie induziert wird. Darüber hinaus ist dem Stand der Technik zu entnehmen, daß Anisomycin-induzierter Zelltod bei der Fibroblasten-Zellinie NIH3T3 auf der Aktivierung einer Signaltransduktionskette beruht, die über eine Aktivierung von MAP-Kinasen, wie bspw. JNK und p38, verläuft. Die nachfolgende Induktion von pip92 ist im wesentlichen auf die Induktion des pip92-Promotors zurückzuführen (Chung et al. Eur. J. Biochem., 267, 2000, S. 4676 ff.).

Gleichzeitig ist dem Stand der Technik zu entnehmen, daß pip92 nach Stimulation mit Substanzen, die eine Zelldifferenzierung auslösen, reguliert ist. Chung et al. belegen (Mol. Cell Biol. 1998, 18(4), S. 2272 ff.), daß die Differenzierungsfaktoren bFGF oder aktiviertes Raf-1 in hippocampalen Rattenneuronen zu einer Induktion der pip92- mRNA führen. Weiterhin zeigen sie, daß der Mechanismus der Regulation sowohl über Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK-)unabhängige als auch über MAPK-abhängige Signalwege stattfindet.

Darüber hinaus wurde im Stand der Technik berichtet, daß eine systemische Verabreichung von NMDA pip92 im Hippocampus induziert (Chung et al., J. Neurochem., Vol. 75, No. 1, 2000). NMDA kann neuronalen Zelltod auslösen. Aus diesen Gründen spekulieren Chung et al., daß pip92 mit apoptotischen Prozessen in Verbindung steht. Gleichwohl werden durch pleitrope Stimuli, bspw. NMDA, oder durch MAP- Kinasen zahlreiche Gene induziert, von denen a priori keine Aussage über eine proapoptotische Wirkung getroffen werden kann. Die Ergebnisse werden dahingehend interpretiert, daß der durch Glutamat (und die entsprechenden Ionenkanal- Glutamatrezeptoren) auf neuronalen Zellen induzierte Zelltod mit neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung stehen könnte.

Im Stand der Technik ist jedoch gänzlich unbekannt, auf welche Weise nach Induktion von pip92 apoptotische Signale, die schließlich zur Morphologie der apoptotischen Zelle führen, weitergeleitet werden. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, die weiter stromabwärts gelegene Signalkaskade aufzuklären und auf diese Weise in vitro Verfahren zur Verfügung zu stellen, die die Identifizierung entsprechender Wirkstoffe erlauben. Damit ist auch das Bereitstellen von entsprechenden Pharmaka eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung.

Die vorliegende Erfindung löst diese Aufgabe durch die Gegenstände der Ansprüche 1 und 7 . . . Vorteilhafte Ausführungsformen sind in den jeweiligen Unteransprüchen beschrieben.

Die vorliegende Erfindung beruht dabei einerseits auf der Erkenntnis, daß in einem etablierten Tiermodellsystem für cerebrale Ischämie, deren ausgeprägteste Form der Schlaganfall darstellt, Veränderungen der Genexpression von pip92 registriert werden konnten, die in funktionellem Zusammenhang mit dem Ausmaß der Hirnschädigung stehen. Bei diesem Tiermodell ("filament model") wird ein beschichteter Nylonfaden, der die Abzweigung der A. cerebri media verschließt, eingeführt. Durch Zurückziehen des Fadens wird eine Wiederdurchblutung des Infarktgebietes möglich. Aus der Analyse des Transkriptoms zu unterschiedlichen postischämischen Zeitpunkten konnte erfindungsgemäß pip92 als therapeutisches Zielmolekül erstmals eindeutig für die Indikation Schlaganfall identifiziert und verifiziert werden. Andererseits liegt der vorliegenden Erfindung die weitergehende Erkenntnis zugrunde, daß eine kausale Beziehung zwischen der Überexpression des im Stand der Technik bekannten Proteins pip92 und dem zellulären Phänotyp der Apoptose besteht und daß eine Überexpression von pip92 zu einer Aktivierung der Poly(ADP-ribose)polymerase (PARP), d. h. zu deren Spaltung, führt. Derart konnte erfindungsgemäß ein Glied der durch pip92 ausgelösten Signaltransduktionskaskade identifiziert werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Testverfahren (Assay-Verfahren), die einerseits für in vitro Diagnosezwecke und andererseits für ein ggf. skalierbares "Screening" nach Wirkstoffsubstanzen, die mit der durch pip92-vermittelten Signalkaskade interferieren, insbesondere auch zu einer therapeutischen Behandlung von ischämischen Infarkten führen.

Gemäß Anspruch 1 der vorliegenden Erfindung werden Verfahren offenbart, die es erlauben die Apoptose-modulierende, insbesondere Apoptose-inhibierende, insbesondere auf die Behandlung von ischämischen Infarkten abstellende Wirkung von Testsubstanzen auf pip92 zu untersuchen, also ein Verfahren, das zur Identifizierung von pharmazeutisch wirksamen Verbindungen dient, wobei (a) ein geeignetes Wirtszellsystem zur Verfügung gestellt wird und (b) ein zur Beobachtung der pip92-vermittelten Funktion, insbesondere ein zur Beobachtung der Apoptose, nach Zugabe einer Testverbindung im Vergleich zur Kontrolle ohne Zugabe einer Testverbindung für das gemäß (a) erhaltene Wirtszellsystem in einem geeigneten Testsystem gemessen wird. Vorteilhaft sind hierbei Wirtzellsysteme aus Säugetieren, vor allem neuronale Zellinien, insbesondere humane, Mäuse- oder Rattenzellinien (bspw. COS-1-Zellen, H19-7-Zellen, Raji- Zellen, HEK-Zellen, PC12-Zellen, THP-1-Zellen, oder primäre Zellen, wie z. B. Neurone, Astrozyten, Mikro- und Astroglia etc.). Grundsätzlich kommen auch andere immortalisierte und primäre Zellinien (bspw. Astrogliome, SY-5Y) nach Bedarf in Betracht.

Da die Induktion von Apoptose ggf. Zelltyp-spezifisch ist, werden nach einem erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise mehrere Zellinien und primäre Zellen untersucht.

Derartige Wirtszellsysteme können auch durch Transfektion modifiziert sein, bspw. durch Transfektion mit einem Expressionsvektor, der für das Protein pip92 (mit humaner Sequenz oder bspw. der Sequenz aus dem Genom eines anderen Säugers) oder ein Fragment desselben oder eine Variante mit mindestens 90%iger, vorteilhafter Weise mindestens 95%iger Sequenzhomologie, codiert. Ein derartiger Expressionsvektor kann das pip92-Gen gemeinsam seiner nativen oder einer alternativen, insbesondere einer extern regulierbaren (induzierbaren, insbesondere durch Temperaturvariation oder Aktivator(Repressor)zugabe) Regulationssequenz (Promotorsequenz) enthalten. Vorteilhafte Regulationssequenzen für das pip92-Gen im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind beispielsweise die Bakterien-Promotoren von cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacIq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, 1-PR- oder 1-PL-Promotor, oder Hefepromotoren von ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH oder Mammaliapromotoren von CaM-KinaseII, CMV, Nestin, L7, BDNF, NF, MBP, NSE, beta-Globin, GFAP, GAP43, Tyrosin Hydroxylase, Kainat-Rezeptor-Untereinheit 1 oder der Glutamat-Rezeptor-Untereinheit B. Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die bspw. oben genannten für einen erfindungsgemäße Expressionsvektor verwendet werden.

Ggf. kann der Expressionsvektor auch für mindestens ein weiteres Gen codieren, bspw. für ein Reporter-Gen (bspw. EGFP) oder ein Resistenz-Gen (bspw. ein Antibiotika- Resistenz-Gen). Alternativ können derartige weitere Gene jedoch auch auf mindestens einem weiteren separaten Expressionsvektor in das Wirtszellsystem eingeführt werden.

Alternativ zu derartigen Wirtzellsystemen kann das oben beschriebene Verfahren jedoch auch mit Zellextrakten durchgeführt werden. Hierzu werden nach dem Fachmann geläufigen Verfahren Zellextrakte bereitgestellt, ggf. wird der Zellaufschluß mit einer Zellfraktionierung verbunden sein, bspw. einer Isolierung der cytosolischen Fraktion und/oder einer Fraktion des Zellkerns. In einer weiteren alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann auch bspw. eine Signalkaskade in vitro rekonstituiert werden, so daß weder Wirtszellen noch Zellextrakte zum Einsatz gelangen. In einer weiteren alternativen Ausgestaltung des Verfahrensschrittes (a), insbesondere geeignet zur Zelltoddetektion in Verfahrensschritt (b), kann ein Nematode, der pip92 oder Varianten, bspw. Fragmente von pip92, exprimiert, als Wirtsorganismus zur Verfügung gestellt werden und gemäß Verfahrensschritt (b) Veränderungen des Zelltods in diesem transgenischen Wirtsorganismus im Vergleich zur Kontrolle detektiert wird. Hierbei erlaubt bspw. der Nematode C. elegans die Untersuchung jeder einzelnen Zelle im Wirtsorganismus.

Das gemäß Verfahrensschritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens (Screening-Verfahren) bereitgestellte Testsystem erlaubt die Identifizierung einer Verbindung, die als Wirkstoff, bspw. für die Indikation ischämischer Infarkt, insbesondere Schlaganfall, in Betracht käme, in einer bevorzugten Ausführungsform durch die Detektion eines biologischen Signals, das apoptotische Ereignisse indiziert. Als Signal kann jede strukturelle oder funktionelle Veränderung von Proteinen, die durch eine pip92- (Über)expression ausgelöst werden, erfindungsgemäß in Betracht kommen. Insbesondere handelt es sich dabei um solche Proteine, die weiter stromabwärts in der von pip92- vermittelten Signalkaskade stehen. Als strukturellen oder funktionellen Veränderungen wären bspw. zu nennen: proteolytische Spaltung von Proteinen, Aktivierung von Proteinen durch kovalente oder non-kovalente Veränderungen (bspw. Anlagerung von Phosphatgruppen, Glykosylierung, Anlagerung weiterer Proteinliganden zur Bildung von Proteinkomplexen, Homodi- oder oligomerisierung), Veränderung des Expressionsmusters von nachgeschalteten Proteinen, Veränderung der Zellokalisation von Proteinen (bspw. vom Cytoplasma in den Zellkern, bspw. GADPH, in das ER oder Sekretion) und/oder Veränderungen der Proteinstruktur (bspw. strukturellen Umlagerungen durch sog. "Hinge"-Regionen).

Ganz besonders bevorzugt ist in diesem Zusammenhang Detektion von proteolytisch gespaltenen Proteinen der pip92- vermittelten Signalkaskade als "Marker" für entsprechende apoptotische Ereignisse, bspw. die PARP-Spaltung oder die Detektion von DNA-Histon-Bruchstücken (bspw. durch einen "cell-death" ELISA, insbesondere durch das System von Roche Diagnostics, (Mannheim, DE)). Im Falle der PARP-Spaltung wird insbesondere die Anwesenheit und/oder die Intensität der Spaltprodukte detektiert. Ein unterbliebenes oder ein im Vergleich zur Kontrolle schwaches Signal für ein PARP- Spaltprodukt indiziert hierbei die Wirksamkeit einer Testverbindung bei der Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Detektion eines Spaltprodukts, vorzugsweise eines ca. 89 kDa-Spaltprodukts von PARP (oder speziesabhängig anderer entsprechender Spaltprodukte), kann bspw. durch Verwendung von spezifischen, das oder die Spaltprodukte erkennenden Antikörpern, insbesondere eines Antikörpers, der die PARP-Bindungsdomäne, vor allem deren C- Terminus, erkennt, erfolgen.

Die folgenden Verfahren sind als Nachweisverfahren für gespaltenes PARP oder Spaltprodukten von anderen Proteinen auf der Basis von anti-(PARP)-Spaltprodukt-Antikörpern zur quantitativen oder qualitativen Detektion von Spaltprodukten in einer Probe im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens insbesondere bevorzugt.

Die biologische Probe wird nach Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens vorzugsweise auf einem Festphasenträger, wie z. B. Nitrocellulose oder auf einem anderen Trägermaterial, aufgetragen, so daß die Zellen, Zellteile, Zellfraktionen oder löslichen Proteine immobilisiert werden. Der Träger kann dann mit einem geeigneten Puffer ein- oder mehrfach gewaschen werden, wobei nachfolgend mit einem detektierbar markierten Antikörper nach der vorliegenden Erfindung behandelt wird. Der Festphasenträger kann danach mit dem Puffer ein zweites Mal gewaschen werden, um nicht-gebundenen Antikörper zu beseitigen. Die Menge an gebundener Markierung auf dem Festphasenträger kann dann mit einem herkömmlichen Verfahren bestimmt werden.

Als Träger eignen sich insbesondere Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon-Amylasen, natürliche oder modifizierte Zellulosen, Polyacrylamide und Magnetit. Der Träger kann entweder bedingt löslichen oder unlöslichen Charakters sein, um die Bedingungen nach Maßgabe der vorliegenden Erfindung zu erfüllen. Das Trägermaterial kann beliebige Formen einnehmen, z. B. in Form von Kügelchen ("beads"), oder zylindrisch oder sphärisch sein, wobei Polystyrol-Kügelchen als Träger bevorzugt sind.

Eine detektierbare Antikörpermarkierung kann auf verschiedene Weise erfolgen. Beispielsweise kann der Antikörper an ein Enzym gebunden werden, wobei das Enzym schließlich in einem Immunoassay (EIA) eingesetzt werden kann. Das Enzym kann dann später mit einem entsprechenden Substrat reagieren, so daß eine chemische Verbindung entsteht, die auf eine dem Fachmann geläufige Art und Weise detektiert und ggf. quantifiziert werden kann, z. B. durch Spektrophotometrie, Fluorometrie oder andere optische Verfahren. Bei dem Enzym kann es sich um Malat- Dehydrogenase, Staphylokokken-Nuklease, delta-5-Steroid Isomerase, Hefealkohol-Dehydrogenase, alpha- Glycerophosphat-dehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phsophatase, Aspariginase, Glucoseoxidase, beta-Galactosidase, Ribonuklease, Urease, Katalase, Glucose-6-phosphat- Dehydrogenase, Glucoamylase oder Acetylcholinesterase handeln. Die Detektion wird dann über ein chromogenes Substrat, das spezifisch für das für die Markierung eingesetzte Enzym ist, ermöglicht und kann schließlich z. B. über Sichtvergleich des durch die Enzymreaktion umgesetzten Substrats im Vergleich zu Kontrollstandards erfolgen.

Weiterhin kann die Detektion durch andere Immunoassays sichergestellt werden, z. B. durch radioaktive Markierung der Antikörper oder Antikörperfragmente (also durch einen Radioimmunoassay (RIA; Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, Work, T. et al. North Holland Publishing Company, New York (1978). Das radioaktive Isotop kann dabei durch die Verwendung von Szintillationszählern oder durch Autoradiographie detektiert und quantifiziert werden.

Fluoreszierende Verbindungen können gleichfalls zur Markierung eingesetzt werden, beispielsweise Verbindungen wie Fluorescinisothiocyanat, Rhodamin, Phyoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthaldehyd und Fluorescamin. Auch fluoreszensemittierende Metalle, wie z. B. ¹⁵²E oder andere Metalle aus der Lanthanid-Gruppe, können eingesetzt werden. Diese Metalle werden an den Antikörper über Chelatgruppen, wie z. B. Diethylentriaminpentaessigsäure (ETPA) oder EDTA angekoppelt. Weiterhin kann der erfindungsgemäße Antikörper über eine mit Hilfe von Chemilumineszenz wirkende Verbindung angekoppelt werden. Die Gegenwart des Chemilumineszenzmarkierten Antikörpers wird dann über die Lumineszenz, die im Verlauf einer chemischen Reaktion entsteht, detektiert. Beispiele für derartige Verbindungen sind Luminol, Isoluminol, Acridiniumester, Imidazol, Acridiniumsalz oder Oxalatester. Gleichermaßen können auch biolumineszente Verbindungen zum Einsatz kommen. Biolumineszenz ist eine Unterart der Chemilumineszenz, die bei biologischen Systemen vorgefunden wird, wobei ein katalytisches Protein die Effizienz der chemilumineszenten Reaktion verstärkt. Die Detektion des biolumineszenten Proteins erfolgt wiederum über die Lumineszenz, wobei als biolumineszente Verbindung beispielsweise Luciferin, Luciferase oder Aequorin in Betracht kommen.

Ein erfindungsgemäßer Antikörper kann für die Verwendung in einem immunometrischen Assay, auch bekannt als "two-site" oder "sandwich" Assay, zur Anwendung gelangen. Typische immunometrische Assay-Systeme schließen sog. "Vorwärts"- Assays ein, die sich dadurch auszeichnen, daß erfindungsgemäße Antikörper an ein Festphasensystem gebunden sind und daß der Antikörper mit der Probe, die untersucht wird, auf diese Weise in Kontakt gebracht wird. Derart wird das Antigen aus der Probe durch die Bildung eines binären Festphasen-Antikörper-Antigen-Komplexes aus der Probe isoliert. Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird der feste Träger gewaschen, um den verbleibenden Rest der flüssigen Probe zu beseitigen, einschließlich des ggf. nicht gebundenen Antigens, und daraufhin mit einer Lösung in Kontakt gebracht, die eine unbekannte Menge an markiertem Detektionsantikörper enthält. Der markierte Antikörper dient hierbei als sog. Reporter-Molekül. Nach einer zweiten Inkubationszeit, die es den markierten Antikörper erlaubt, mit dem an die Festphase gebundenen Antigen zu assoziieren, wird der Festphasenträger erneut gewaschen, um markierte Antikörper, die nicht reagiert haben, zu beseitigen.

In einer alternativen Assay-Form kann auch ein sog. "sandwich"-Assay zum Einsatz kommen. Hierbei kann ein einziger Inkubationsschritt ausreichen, wenn der an die Festphase gebundene Antikörper und der markierte Antikörper beide gleichzeitig auf die zu testende Probe aufgebracht werden. Nach Abschluß der Inkubation wird der Festphasenträger gewaschen, um Rückstände der flüssigen Probe und der nicht-assoziierten markierten Antikörper zu beseitigen. Die Anwesenheit von markiertem Antikörper auf dem Festphasenträger wird genau so bestimmt, wie bei den konventionellen "Vorwärts"-Sandwich-Assay. Bei dem sog. reversen Assay wird schrittweise zunächst eine Lösung des markierten Antikörpers zur Flüssigprobe hinzugefügt, gefolgt von der Beimischung von nicht-markiertem Antikörper, gebunden an einen Festphasenträger, nach Ablauf einer geeigneten Inkubationszeit. Nach einem zweiten Inkubationsschritt wird der Festphasenträger in herkömmlicher Weise gewaschen, um ihn von Probenüberresten und von markiertem Antikörper, der nicht reagiert hat, zu befreien. Die Bestimmung des markierten Antikörpers, der mit dem Festphasenträger reagiert hat, wird dann, so wie oben beschrieben, durchgeführt.

Besonders bevorzugt sind Western-Blot-Techniken zur Identifizierung von Spaltprodukten, insbesondere PARP- Spaltprodukten, wobei auch alle vorgenannten Detektionsmöglichkeiten, einschließlich aller Methoden, die ausschließlich auf Molekulargewichtsbestimmungen beruhen (bspw. durch Gelelektrophorese ohne Einsatz von Antikörpern, Gelfiltration, ggf. chromatographische Methoden), zum Einsatz kommen können. Alternativ können auch massenspektrometrische Verfahren zum Einsatz kommen (bspw. MALDI-TOF), wobei die Signalintensität des entsprechenden Spaltprodukts (mit bekanntem Molekulargewicht), bspw. auch des PARP-Spaltprodukts, im Verhältnis zur Signalintensität des nicht gespaltenen Proteins das bestimmt wird.

Aber auch morphologische Veränderungen, die mit der Apoptose einhergehen, können als biologisches Signal in einem erfindungsgemäßen Assay herangezogen werden, um auf diese Weise als "Marker" für die Wirksamkeit für die pip92- vermittelte apoptotische Signalkaskade dienen zu können. So etwa können Veränderungen der Zellmembran, der Zellmorphologie, der DNA-Morphologie, insbesondere Veränderungen der Chromatinstruktur (bspw. auch eine DNA- Fragmentierung), erfaßt werden. Hierbei kann die Detektion über die folgenden Systeme erfolgen: Herstellung eines Virus, mit dem z. B. Neurone, infiziert werden können, und so eine mRNA, die pip92 codiert in Neurone geschleust wird. Die Detektion der Kernkondensation nach einer solchen Überexpression von pip92 in Neuronen kann über eine DAPI- Färbung, die der DNA-Fragmentierung mittels TUNEL-Färbung und der PARP-Spaltung mittels spezifischer Antikörper für gespaltenes PARP erfolgen.

Eine weitere Möglichkeit, apoptotische Ereignisse zu bestimmen und diese als Systeme als Marker für Kandidatensubstanzen in einem erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzen, besteht in der Anfärbung mit Annexin (bspw. durch das Verfahren von Fa. Roche Diagnostics, Mannheim, DE). Entsprechend kann auch über eine FACS-Analyse ("Fluorescence Activated Cell Sorting") eine Messung apoptotischer Ereignisse vorgenommen werden, indem bspw. entweder über Anfärbung der betroffenen Zellen, durch Reaktion mit Fluoreszenz-markierten Antikörpern oder auch durch Kotransfektion mit bspw. GFP eine Fraktionierung von Zellen vorgenommen werden.

Ein Verfahren der erfindungsgemäßen Art kann auch als sog. Hochdurchsatz-(HTS)-Screening-Verfahren zur Identifizierung entsprechender Verbindungen ausgestaltet sein. Die beschriebenen Testsysteme erlauben daher das Durchsuchen von chemischen Bibliotheken nach Substanzen, die hemmende oder aktivierende Wirkungen auf pip92, bspw. durch Wirkung auf dessen Transkription, dessen Translation, dessen biologische Funktion (bspw. auf dessen DNA- oder Proteinbindungsfähigkeit oder dessen enzymatische Eigenschaften), haben. Die Identifizierung solcher Substanzen stellt den ersten Schritt auf dem Weg zur Identifizierung neuartiger Medikamente dar, die spezifisch auf die pip92-vermittelte Signaltransduktion, insbesondere zur Auslösung der Apoptose, aber auch bspw. in Hinblick auf etwaiges pip92-vermitteltes Zellwachstums, Zellproliferation und/oder Zellplastizität, wirken.

Da die Induktion von Apoptose ggf. auch Stimulus-spezifisch sein kann, werden in einem erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise mehrere Streß-Situationen als externe Stimuli zugrundegelegt, z. B. Hitzeschock, Hypoxiebedingungen und/oder Cytokin-Behandlungen (z. B. Il-1, Il-6, TNF-alpha, Staurosporin, H₂O₂-Behandlung). Auf diese Weise können Kandidatenverbindungen in mehreren parallelen erfindungsgemäßen Ansätzen auf ihre Wirksamkeit hin untersucht werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens wird in einem Verfahrensschritt (c) der Bindungsplatz der nach Maßgabe des erfindungsgemäßen Verfahrens pharmazeutisch wirksamen Verbindung auf pip92 durch ein geeignetes biochemisches oder strukturbiologisches Verfahren ermittelt (Rationales Drug Design (Böhm, Klebe, Kubinyi, 1996, Wirkstoffdesign, Spektrum-Verlag, Heidelberg)).

Nach Identifizierung selektiver wirksamer Substanzen nach vorgenanntem erfindungsgemäßen Verfahren können die Bindungsplätze dieser Substanzen an pip92 bspw. mit Hilfe des two-hybrid Systems oder anderen Assays biochemisch oder strukturbiologisch ermittelt werden, d. h., daß die für die Interaktion verantwortlichen Aminosäuren eingegrenzt werden. Auf diese Weise können auch Substanzen aufgefunden werden, mit denen die Interaktion zwischen pip92 und etwaigen nativen intrazellulären Interaktionspartnern derselben beeinflußt, insbesondere inhibiert, werden kann. Derartige Verfahren werden typischerweise in einem Verfahrensschritt (c) durchgeführt. Hierdurch wird erfindungsgemäß ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen mit spezifischer Bindungsaffinität zum Protein pip92 offenbart.

Alternativ zu den oben offenbarten biochemischen Verfahren oder ergänzend zu diesen kann die Struktur oder eine Teilstruktur von pip92 nach Zugabe der Kandidaten- Verbindung, d. h. komplexiert mit dieser, über NMR- oder Röntgenkristallographie-Verfahren (nach entsprechender Kristallisierung oder Kokristallisierung (z. B. nach der Methode des "hängenden Tropfens) oder "Soaking"-Techniken" (Zugabe der Kandidaten-Verbindung zum pip92-Kristall) ermittelt werden. Liegt die 3D-Struktur von pip92 nach Röntgenkristallisation bereits vor, so kann nach der Aufnahme des Beugungsmusters von Kristall und Kandidaten- Verbindung im Komplex die Phaseninformation der 3D-Struktur von pip92 allein zur Strukturberechnung eingesetzt werden. Mit Unterstützung von Molecular Modelling Programmen/Methoden (SYBIL-Programmpaket, O, X-PLORE) können nach Aufklärung der Interaktionen zwischen Kandidaten- Verbindung und pip92, die als Agonisten oder Antagonisten wirkenden Verbindungen so modifiziert werden, daß bspw. eine noch höhere Affinität der modifizierten Kandidaten- Verbindung zu pip92 die Folge sein sollte. Derart können bspw. die chemischen Charakteristika der Testverbindung durch Veränderung der sterischen Anordnung funktioneller Gruppen, der Modifikation der funktionellen Gruppen, der Veränderung des Hydrophobizitätsprofils der Verbindung und/oder seines Wasserstoffbrückenbindungspotential etc., durch in silico Methoden, insbesondere in einem Verfahrensschritt (d), modifiziert werden.

Die insoweit modifizierte Verbindung kann erneut dem erfindungsgemäßen Verfahren mit den Verfahrensschritten (a), (b), (c) und/oder (d) unterzogen und auf diese Weise iterativ optimiert werden, wobei als Zielfunktion insbesondere eine Optimierung der biologischen Eigenschaften der Testverbindung eingesetzt wird, bspw. die Inhibition der pip92-vermittelten Apoptose.

Nach struktureller Optimierung der ursprünglichen Leitstruktur der Kandidaten-Verbindung kann diese in weiteren in vitro Assays oder in einem Tiermodell auf ihre Wirksamkeit bspw. gegen Schlaganfall getestet werden, bevor entsprechende klinischen Untersuchungen durchgeführt werden können.

Einem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren wird vorzugsweise vor der Bereitstellung eines Verfahrens gemäß Anspruch 1 ein Ligandenbindungsassay vorausgehen. In einem derartigen Primärassay wird die Bindungsfähigkeit von Kandidatensubstanzen, bspw. erhältlich aus Substanzbibliotheken oder Syntheseverfahren der kombinatorischen Chemie, an pip92 untersucht, insbesondere die Bindungskonstante ermittelt. Derartige Bindungsassays können nach allen dem Fachmann geläufigen Verfahren durchgeführt werden, bspw. mit Hilfe von BIACORE-Geräten, wobei mittels eines Sensorchips, der bspw. pip92 immobilisiert enthält, die Massenzunahme gemessen wird, die sich ergibt, wenn ein Ligand (bspw. die Testsubstanz) durch die Durchflußzelle am Sensorchip vorbeifließt. Auch kalorimetrisch kann die Bindungskonstante bestimmt werden, bspw. mit Hilfe von Differentiellen "Scanning" Kalorimetern. Alternativ kann die Ligandenbindung auch in silico simuliert werden, indem das Bindungsvermögen entsprechender Kandidatensubstanzen, deren räumliche Struktur aufgeklärt oder durch semiquantenmechanische Verfahren berechnet worden ist, an die pip92-3D-Struktur unter Einsatz entsprechender "Docking"-Programme untersucht wird (bspw. "Dock, Kuntz et al. 1982 J. Mol. Biol. 161, S. 269 ff.; Sybyl/Base-Programm "FLEX-X" des TRIPOS-Programmpakets, s. Rarey et al., J. Mol. Biol. 261, S. 470 ff., 1996). Hierbei werden in einem in silico Primärassay geeignete Kandidatensubstanzen identifiziert (bspw. Substanzen aus einer Datenbank: CCDC (Cambridge Crystal Data Centre, 12 Union Road, Cambridge, GB; oder auch die bei TRIPOS erhältlichen Datenbanken (bspw. Derwent WORLD Drug Index)) und anschließend erfindungsgemäß auf ihre biologischen Eigenschaften untersucht.

Erfindungsgemäß können auch weitere biologische Untersuchungen einem erfindungsgemäßen verfahren vor- oder nachgeschaltet sein, bspw. kann die Zelltoxizität, das Membrandurchtrittsvermögen oder auch Metabolisierungseigenschaften gemessen werden.

Erfindungsgemäße Verfahren finden insbesondere in der in vitro Diagnostik Anwendung, wobei Krankheiten, Störungen oder pathologische Zustände, die durch Zelltodereignisse charakterisiert sind, insbesondere ischämische Infarkte (bspw. auch Schlaganfall oder Herzinfarkt), diagnostiziert werden können. Auf der Basis der Aktivität von pip92 (Überexpression von pip92) (bspw. detektierbar durch pip92- mRNA oder das Protein) oder auf der Basis einer Aktivierung der nachgeschalteten Proteine der Signalkaskade, bspw. der proteolytischen Spaltung, insbesondere der PARP-Spaltung, kann ein diagnostischer Assay ausgestaltete sein. Alle oben im Rahmen der Offenbarung von Verfahren zur Identifizierung von Liganden genannten Detektionsmöglichkeiten für ein biologisches Signal können auch im Zuge eines in vitro Verfahrens zum Einsatz kommen. Grundsätzlich wird erfindungsgemäß eine Überexpression von pip92 als diagnostischer Marker für auf hyperapoptotischen Störungen beruhenden Erkrankungen, bspw. ischämischem Infarkt, offenbart. Erfindungs- und verfahrensgemäß kann bereits prognostisch der durch pip92-Überexpression hervorgerufene Risikofaktor für die Manifestation von degenerativen Erkrankungen, ischämischen Infarkten, bspw. Schlaganfall, etc. ermittelt werden. Aber auch posttraumatisch kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Unterstützung einer klinischen Diagnose, bspw. einer Schlaganfall-Diagnose, eingesetzt werden. Grundsätzlich werden daher erfindungsgemäß Verfahren zur in vitro Diagnose von Erkrankungen, die auf pip92-vermittelter Fehlsteuerung von Signalkaskaden, insbesondere apoptotischer Signalkaskaden beruhen, offenbart, wobei (a) eine Patientenprobe, bspw. in Form einer durch Biopsie gewonnenen Gewebeprobe, entnommen wird und/oder entnommene Zellen von Patienten in vitro kultiviert werden, und (b) ein zur Beobachtung der pip92- vermittelten Funktion, insbesondere ein zur Beobachtung der Apoptose, des Zellwachstums, der Zellproliferation und/oder der Zellplastizität geeigneter Parameter im Vergleich zur Kontrolle für die gemäß (a) erhaltenen Probe in einem geeigneten Testsystem gemessen wird. Bevorzugt sind dabei Verfahren, bei denen in Verfahrensschritt (b) die Spaltung des Proteins PARP, die Anfärbung von Zellen mit Annexin und/oder eine Apoptose-Signal durch FACS-Analyse detektiert wird.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind solche Verbindungen, die mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden oder erhältlich sind, deren Eignung als Arzneimittel bzw. Verfahren zum therapeutischen Einsatz derartiger Verbindungen, insbesondere zur Behandlung der erfindungsgemäß genannten Indikationen.

Vorzugsweise wird es sich bei diesen im Rahmen des vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahrens zu testenden Verbindungen um organisch-chemische Verbindungen, mit einem Molekulargewicht von < 5000, insbesondere < 3000, vor allem < 1500 handeln, die typischerweise physiologisch gut verträglich ist und vorzugsweise die Blut-Hirn-Schranke passieren können, insbesondere auch zumindest unilateral hydrophile Gruppen aufweisen. Besonders bevorzugt als Kandidaten-Substanz in einem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein organisches Molekül dann sein, wenn die Bindungskonstante (die im Rahmen eines primären Ligandenbindungsassay bestimmt wird) für die Bindung an pip92 mindestens 10⁷ mol^-1 beträgt. Die erfindungsgemäße Verbindung wird vorzugsweise so beschaffen sein, daß sie die Zellmembran passieren kann, sei es durch Diffusion oder über (intra)membranöse Transportproteine, ggf. nach entsprechender Modifikation (bspw. Glykosylierung). Insbesondere werden derartige verfahrens- und erfindungsgemäß selektierte Verbindungen Positionen auf der Oberfläche von pip92 besetzen (und dadurch dessen Bindungs- oder enzymatische Aktivität bspw. blockieren) oder bei pip92 einen lokalen Konformationswechsel hervorrufen, so daß die Bindung eines nativen Bindungspartners von pip92 verhindert wird. Neben der transkriptionellen Regulation, d. h. Regulation der mRNA-Menge von pip92 in der Zelle, kann eine erfindungsgemäße pharmazeutisch wirksame Verbindung auch in andere Kontrollprozesse der Zelle eingreifen, die bspw. die Expressionsrate des Proteins pip92 beeinflussen können (z. B. Translation, Spleißvorgänge, native Derivatisierung von pip92, bspw. Phosphorylierungen, oder Regulation der Degradation von pip92). Insbesondere kann auch die Wirkung der Kandidaten-Verbindung durch Bindung an die Regulationssequenz des pip92-Gens oder durch Bindung an einen das pip92-Gen steuernden Transkriptionsfaktor hervorgerufen werden.

Schließlich kann der Wirkungsmechanismus erfindungsgemäßer Substanzen auch auf einer Modulation der PARP-Spaltung beruhen, bspw. können erfindungsgemäße Substanzen die PARP- Spaltung inhibieren, bspw. durch Zugabe eines nicht-nativen Oligopeptids (Peptidomimetikum), das die Spaltungssequenz (proteolytische Schnittstelle) von PARP enthält, bspw. ein Dekamer mit (mindestens) 5 AS N-terminal und (mindestens) 5 AS C-terminal von der Spaltungsstelle oder als Peptidomimetikum diese abbildet.

Alternativ zu den vorgenannt offenbarten organischchemischen Verbindungen kann in einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine erfindungsgemäße Verbindung, bspw. erhältlich aus einem erfindungsgemäßen Verfahren, ein Antikörper, vorzugsweise ein gegen pip92 gerichteter Antikörper, ein gegen die zugrundeliegende pip92-mRNA gerichteter Antikörper, oder auch ein gegen einen Transkriptionsfaktor von pip92 gerichteter Antikörper sein, der vorzugsweise ex vivo in retransplantierte Wirtszellen oder durch gentherapeutische in vivo Verfahren in Wirtszellen eingeschleust wird und dort als "intrabody" nicht sekretiert wird, sondern intrazellulär seine Wirkung entfalten kann. Durch derartige "Intrabodies" als Verbindungen können die Zellen vor einer fehlgeleiteten apoptotischen Reaktion, bspw. durch Überexpression des Proteins pip92, geschützt werden. Eine derartige Vorgehensweise wird typischerweise für Zellen jener Gewebe in Betracht kommen, die beim Patienten ein pathophysiologisch übersteigertes apoptotisches Verhalten zeigen, insbesondere bei Neuronen. Zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Testung derartiger Antikörper werden die Wirtszellsysteme gleichzeitig auch mit einem entsprechenden Expressionsvektor für einen oben beschriebenen Antikörper transfiziert (vorzugsweise gekoppelt an einen induzierbaren Promotor) und dessen Wirksamkeit für die Beobachtung oder Nicht-Beobachtung eines biologischen Signals (wie oben beschrieben), bspw. der PARP- Spaltung, untersucht. Als weitere potentielle Verbindungen, die in einem erfindungsgemäßen Verfahren getestet werden können, sind zu nennen: anti-sense Oligonukleotide (bspw. gegen pip92-mRNA) oder Ribozyme, die bspw. pip92-mRNA schneiden können.

In einer weiteren Alternative der erfindungsgemäß identifizierten Verbindungen kann es sich um eine inhibitorisch wirkende Variante von pip92 handeln, bspw. um ein Fragment oder eine biologisch inaktive Variante (Mutante, mit Substitutionen oder Deletionen in biologisch aktiven Bereichen von pip92) oder ein Peptidomimetikum, wobei der Wirkungsmechanismus auf Kompetition mit nativem pip92 in Zellen beruht.

Insgesamt können Verbindungen, die aus einem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind oder erhalten werden, als Arzneimittel Verwendung finden. Hierbei sind als Verbindungen alle vorgenannten Varianten eingeschlossen, also bspw. organisch-chemische Verbindungen oder anti-sense- Oligonukleotide oder "Intrabody"-Antikörper. Insbesondere ist eine erfindungsgemäße Verbindung (zur Herstellung eines Arzneimittels) zur Behandlung von Erkrankungen, für die zumindest tw. eine pathologische hyperapoptotische oder hypernekrotische oder ggf. auch inflammatorische Reaktionen kausal oder symptomatisch ist, geeignet. Damit kann eine erfindungsgemäß identifizierte Substanz, bspw. ein Inhibitor der pip92-vermittelten Signalkaskade, also bspw. der apoptotischen Reaktion, als Arzneimittel und ganz besonders bei der Behandlung der folgenden Erkrankungen bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der folgenden Erkrankungen eingesetzt werden: Tumorerkrankungen, Autoimmunerkrankungen, insbesondere Diabetes, Psoriasis, multiple Sklerose, rheumatoide Arthritis oder Asthma, virale Infektionserkrankungen (bspw. HIV), degenerativen Erkrankungen, insbesondere neurodegenerativen Erkrankungen, bspw. Morbus Alzheimer oder Morbus Parkinson, Epilepsie oder Muskeldystrophien, GvHD (bspw. Leber, Niere oder Herz), ischämischer Infarkt, vor allem Schlaganfall oder Herzinfarkt, Hypoxie, Schädel-Hirn-Trauma.

Die vorgenannten apoptoseinhibitorischen erfindungsgemäß identifizierten Substanzen können auch Bestandteil einer pharmazeutischen Zusammensetzung sein, die weitere pharmazeutische Träger-, Hilfs- und/oder Zusatzstoffe enthalten kann, um derartige Zusammensetzungen für die therapeutische Verabreichung bspw. zu stabilisieren, die biologische Verfügbarkeit und/oder die Pharmakodynamik zu verbessern. Erfindungsgemäße Verbindungen oder Zusammensetzungen, enthaltend derartige Verbindungen, können nasal, oral, intraperitoneal, okular, topisch, intravenös, intraarteriell und/oder subkutan eingesetzt werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Verfahren zur Identifizierung von zellulären Interaktionspartnern von pip92, insbesondere von Proteinen, die an der apoptotischen Signalweitergabe stromabwärts von pip92 beteiligt sind, insbesondere von Proteinen, die nach Aktivierung von pip92 an der Spaltung von bspw. PARP beteiligt sind.

Es können demnach direkte (und auch - wie weiter unten beschrieben - mittelbare) Interaktionspartner von pip92 identifiziert werden, d. h. solche Proteine, die zu pip92 spezifische Bindungsaffinitäten aufweisen. Ein derartiges erfindungsgemäßes Verfahren bzw. die Verwendung von pip92 zur Durchführung derartiger Verfahren wird vorzugsweise mit Hilfe einer "Yeast-two-hybrid"-Durchmusterung (y2h- "Screens") allein oder in Kombination mit anderen biochemischen Verfahren durchgeführt (Fields and Song, 1989, Nature, 340, 245-6). Derartige Screens finden sich auch bei Van Aelst et al. (1993, Proc Natl Acad Sci U S A, 90, 6213-7) und Vojtek et al. (1993, Cell, 74, 205-14). Typischerweise können anstelle von Hefesystemen auch Säugetiersysteme zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden, bspw. wie bei Luo et al. (1997, Biotechniques, 22, 350-2) beschrieben. Für einen y2h-Screen wird das offene Leseraster von pip92 (oder deren Varianten, bspw. Fragmente) bspw. in einen sog. bait-Vektor "in-frame" mit der GAL4-Bindungsdomäne kloniert (z. B. pGBT10, Fa. Clontech). Damit kann vorzugsweise eine sog. "prey-library" in einem Hefestamm nach gängigem Protokoll auf interagierende Proteine durchsucht werden.

Erfindungsgemäß können Interaktionspartner auch über Co- Immunpräzipitationen aus mit pip92- (bzw. deren native Varianten) Expressionsvektoren transfizierten Zellen zu benutzen, um daran bindende Proteine aufzureinigen, und über Proteinsequenzierungsmethoden (z. B. MALDI-TOF, ESI-tandern- MALDI) nachfolgend die dazugehörigen Gene zu identifizieren.

Ferner werden gemäß vorliegender Erfindung Sequenzen offenbart, wie in den Fig. 6 bis 14 wiedergegeben, einschließlich solcher Sequenzen, die mit den in den Fig. 6 bis 14 abgebildeten Sequenzen zu mindestens 90%, vorzugsweise zu mindestens 95% und noch stärker bevorzugt zu mindestens 97% homolog sind oder im Falle der DNA-Sequenzen mit der abgebildeten DNA-Sequenzen unter bspw. mäßig stringenten Bedingungen hybridisieren. Mit der Offenbarung der DNA-Sequenzen gemäß Fig. 6, 7, 9, 10, 12 und 13 werden auch entsprechende Expressionsvektoren und Wirtszellen, die mit diesen DNA-Sequenzen oder mit entsprechenden Expressionsvektoren transfiziert sind, mitoffenbart. Sowohl für die vorgenannten DNA-Sequenzen bzw. Proteinsequenzen als auch für Expressionsvektoren und Wirtszellen wird deren Verwendung zur (Herstellung eines Arzneimittels zur) Behandlung von Tumorerkrankungen, Autoimmunerkrankungen, insbesondere Diabetes, Psoriasis, multiple Sklerose, rheumatoide Arthritis oder Asthma, virale Infektionserkrankungen (bspw. HIV), degenerativen Erkrankungen, insbesondere neurodegenerativen Erkrankungen, bspw. Morbus Alzheimer oder Morbus Parkinson, Morbus Huntington, Epilepsie oder Muskeldystrophien, Senilität, GvHD (bspw. Leber, Niere oder Herz), ischämischer Infarkt, vor allem Schlaganfall oder Herzinfarkt, Hypoxie, Schädel- Hirn-Trauma, spinobulbare muskuläre Atrophie, Machoado- Joseph-Syndrom. Insbesondere wird hierbei auf die entsprechenden therapeutischen Verfahren der in vivo oder ex vivo (bspw. Transfektion von Knochenmarkszellen) Gentherapie verwiesen.

Darüber hinaus können die in den Fig. 6 bis 14 dargestellten Sequenzen, deren Homologe i. S. der obigen Definition (oder Fragmente derselben von mindestens 40 Nukleotiden bzw. mindestens 25 AS Länge) oder die offenbarten Expressionsvektoren oder Wirtszellen in einem der erfindungsgemäßen Verfahren zur Identifizierung von Interaktionspartners oder zur Identifizierung von Wirkstoffsubstanzen zum Einsatz kommen.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Figuren näher erläutert.

Fig. 1a zeigt einen Ausschnitt eines RMDD-Gels, auf dem die regulierte Sequenz 13C5 identifiziert wurde. Die neun Spuren repräsentieren Hirn-RNA aus einem Modell des Schlaganfalls bei Mäusen, middle cerebral artery occlusion (MCAO). Hier wurden 90 min Okklusion der A. cerebri media durchgeführt (die linke Hirnhemisphäre ist jeweils die ischämische), gefolgt von 2, 6 oder 20 h Reperfusion. Auftragsordnung: linke Hemisphäre (L), rechte Hemisphäre (R), und shamoperierte Tiere (S, linke Hemisphäre), jeweils für die unterschiedlichen Reperfusionszeiten.

Im Ergebnis zeigt sich eine Regulation zu allen 3 Zeitpunkten, wobei mit zunehmender Reperfusionszeit die Spezifität der Regulation auf der ischämischen Seite zunimmt. Dieses Verhalten teilt das Protein 13C5 (pip92) mit einer Anzahl weiterer sog. "immediate early genes" in diesem Modell.

Fig. 1b bestätigt die Hochregulation von 13C5 durch quantitative PCR mit Hilfe des LightCycler Systems. Hierbei wurde die Expression von 13C5 (relativ zum Standard Cyclophilin) jeweils gegenüber sham-operierten Tieren (l/sham, grau schraffiert) und im Vergleich beider Hemisphären zueinander (l/r, schwarz) gemessen. Auch hier bestätigt sich die initiale Beobachtung aus der RMDD-Membran (s. Fig. 1a) einer zunehmend spezifischeren Regulation im beobachteten Zeitfenster. Besonders deutlich ist der Effekt nach 20 h Reperfusion.

In Fig. 2 wird ein Westernblot von COS1-Zellen, die mit pip92 oder dem Leervektor als Kontrolle transfiziert wurden, dargestellt. Ein spezifischer Antikörper für gespaltenes PARP-Protein zeigt deutlich die Apoptose-induzierende Wirkung von pip92. Auch ohne Zugabe von Staurosporin läßt sich gespaltenes PARP beobachten.

Fig. 3 gibt das Ergebnis einer Analyse kultivierter Zellen mittels eines ELISA, der Mono- und Oligonukleosomen im Zytoplasma apoptotischer Zellen nachweist, in Form eines Balkendiagramms wieder. Zellen, die pip92 exprimierten (rechter Balken), weisen mehr Mono- und Oligonukleosomen im Zytoplasma auf als stimulierte, mit dem Leervektor transfizierte Zellen (linker, wegen der rel. Angabe auf der y-Achse nicht eingezeichneter Balken). Ähnliche Effekte sieht man bei Gabe von Staurosporin (0,2 µM) auf Zellen, die mit dem Leervektor transfiziert wurden (mittlerer Balken). In Fig. 4 ist die Annexin V Bindung von EGFP und EGFP/pip92 exprimierenden Zellen dargestellt. COS-1 Zellen wurden durch Elektroporation mit EGFP oder mit EGFP und pip92 transfiziert und 48 h nach der Transfektion der Anteil an apoptotischen (Annexin V-PE-positiven und PI-negativen) Zellen (dunkel schraffiert) und bereits abgestorbenen (Annexin V-PE- und PI-positiven) Zellen (hell schraffiert) für den EGFP positiven Zellpool durch FACS Analyse ermittelt. Im Ergebnis ist deutlich erkennbar, daß beide Fraktionen (Annexin V-PE- positiv und (i) PI-negativ oder (ii) PI-positiv) im Falle der pip92-Überexpression (rechter Balken) gegenüber der Kontrolle (linker Balken) signifikant erhöht sind.

Fig. 5 zeigt die Ergebnisse von Experimenten mit dem Annexin V-positiven Zellpool nach Staurosporin-Behandlung von EGFP und EGFP/pip92 exprimierenden Zellen. COS-1 Zellen wurden durch Elektroporation mit EGFP oder mit EGFP und pip92 transfiziert. 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen mit PBS gewaschen und für weitere 24 h mit Staurosporin (0,2-1,0 µM) in Vollmedium stimuliert. Kontrollen erhielten Vollmedium ohne Staurosporin. 24 h nach Staurosporin-Zugabe wurde der Anteil an apoptotischen (Annexin V-PE-positiven und PI-negativen) Zellen und bereits abgestorbenen (Annexin V-PE- und PI-positiven) Zellen für den EGFP positiven Zellpool durch FACS-Analyse ermittelt. Auch hier ist der Anteil der sterbenden Zellen aus dem Pool der EGFPexprimierenden Zellen im Falle der Expression von pip92 gegenüber der Kontrolle deutlich erhöht.

Die Fig. 6 bis 14 stellen verschiedene pip92-Sequenzen (DNA- oder AS-Sequenzen) humanen Ursprungs oder von Mäusen dar. Fig. 6 zeigt die cDNA-Sequenz von pip92 der Maus, Fig. 7 das offene Leseraster (ORF) von pip92 (s. Fig. 6) der Maus, Fig. 8 die AS-Sequenz von pip92 der Maus (221 AS)(s. Fig. 7), Fig. 9 das offene Leseraster einer kürzeren Spleißform von maus-pip92, Fig. 10 ein alternatives Fragment aus Fig. 7, das in Fig. 9 fehlt,

Fig. 11 die AS-Sequenz entsprechend ORF aus Fig. 9, Fig. 12 die cDNA-Sequenz des humanen pip92, Fig. 13 das offene Leseraster (ORF) der humanen pip92-Sequenz (s. Fig. 12) und Fig. 14 die humane pip92-AS-Sequenz (223 AS) entsprechend ORF aus Fig. 13.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Ausführungsbeispiele näher charakterisiert:

Ausführungsbeispiele

Ausführungsbeispiel 1

A) Identifizierung von 13C5 (pip92)

1. Herbeiführen des Fadenmodells in Mäusen

Zum Herbeiführen einer transienten fokalen cerebralen Ischämie in c57/b16 Mäusen wurden 3 Monate alte Mäuse benutzt. Nach Herbeiführen einer Inhalationsnarkose (70% N20, 30% O2, 0,8-1% Halothan) wurde ein 5-0 Prolenefaden (Fa. Ethicon), der mit 0.1% Poly-L-Lysin beschichtet war, über die A. carotis externa in die A. carotis interna bis zum Abgang der A. cerebri media vorgeschoben. Die richtige Position des Fadens wird durch einen Abfall des Laser- Doppler-Signals (Fa. Perimed) auf 10-20% des Ausgangssignals angezeigt. Nach Durchführung dieser Operation und gegebenenfalls Bestimmung zusätzlicher physiologischer Parameter (Blutdruck, Puls, Blutgase, Blutglukose) erwachen die Mäuse aus der Narkose. Nach 90 min Okklusionszeit werden die Mäuse wieder einer Narkose unterzogen, und der Faden zurückgezogen. Dadurch findet eine Reperfusion des Gewebes statt. Nach bestimmten Reperfusionszeiten (2 h, 6 h und 20 h) werden die Mäuse durch intraperitoneale Injektion mit Rompun/Ketanest terminal betäubt, transcardial mit warmer NaCl-Lösung perfundiert, und das Gehirn sofort präpariert und auf Trockeneis weggefroren. Die Kontrolltiere ("sham-operated") wurden ebenso einer Inhalationsnarkose und Eröffnung des Operationssitus unterzogen.

2. Präparation von mRNA aus den Hirnen

Nach der Entfernung von Kleinhirn und Hirnstamm wurden die Hirnhälften getrennt und eine RNA-Präparation mit der Guanidinium-Isothiocyanat/saures Phenol Extraktion nach Chomczynski & Sacchi (Anal. Biochem. 162, S. 156 ff., 1987) durchgeführt. Das Gewebe wurde mit einem Ultra-Turrax (IKA Labortechnik, Germany) homogenisiert. Danach erfolgte eine weitere RNA-Aufreinigung (100 µg) über Silica-Columns (RNAeasy, Fa. Qiagen, Deutschland). RNA Konzentrationen wurden mittels photometrischer Messungen bestimmt, und die Proben bei -80°C aufbewahrt.

3. Durchführung des RMDD Protokolls

Dabei wurde im wesentlichen nach der Offenbarung der Druckschriften EP 0 743 367 A2 und US 5,876,932, die vollinhaltlich Bestandteil der vorliegenden Offenbarung sind, verfahren, mit der Änderung, daß 10 ug RNA für die Erststrangsynthese eingesetzt wurden. Nach Durchführung von Erststrangsynthese, Zweitstrangsynthese und Restriktionsverdau wird eine Adapterligation mit Adaptoren durchgeführt. Nach erfolgter PCR-Amplifikation mit Adapter- und cDNA-Primern werden die Amplifikationsprodukte auf ein denaturierendes Gel geladen und auf eine Nylonmembran geblottet (Fa. GATC). Die Biotin-markierten Banden werden mit Hilfe einer gebräuchlichen Streptavidin-Peroxidase- Reaktion (Roche Molecular Biochemicals) visualisiert. Auf das Gel wurden jeweils PCR-Proben von der ischämischen und kontralateralen Hemisphäre und Kontrolltiere zusammen aufgetragen (2 h, 6 h, 20 h Reperfusion). Banden unterschiedlicher Intensität in der rechten oder linken Hemisphäre werden ausgeschnitten, und eine Reamplifikation des entsprechenden PCR-Produktes durchgeführt. Erhaltene amplifizierte Produkte werden in den TOPO TA Vektor pcDNA 2.1 (Fa. Invitrogen) kloniert und mit T7 und M13rev-Primern sequenziert (ABI 3700 Kapillar-Elektrophorese-Sequencer). Erhaltene Sequenzen werden mit der EMBL-Datenbank verglichen. Dabei ergab sich starke Ähnlichkeit zu den Sequenzen M59821 und M33756 (pip92).
Die Ergebnisse der gelelektophoretischen Analyse sind in Fig. 1a dargestellt.

B) Verifizierung der Regulation

Die Regulation von 13C5 wurde in cDNA aus MCAO-Proben (middle cerebral artery occlusion, Schlaganfallmodell) mittels quantitativer PCR verifiziert. Dazu wurde cDNA aus 20 ug Gesamt-RNA mittels der Superscript II Reversen Transkriptase (Gibco Life Technologies) und oligo-dT Primern synthetisiert, und aufgereinigt mittels PCR-Reinigungssäulen (Qiagen, Germany). Die quantitative PCR wurde mit Hilfe des LightCycler Systems durchgeführt (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany), wie bereits beschrieben (Brambrink et al., J. Cereb. Flow Metab. 20, 2000, S. 1425 ff.). Dabei wird die Bildung von doppelsträngigen Produkten durch Echtzeit-Fluoreszenzdetektion von interkaliertem SYBR-green gemessen. cDNAs wurden seriell 3-fach verdünnt, um 4 Konzentrationen für eine Standardkurve zu erhalten. Die Konzentration von 13C5 in verschiedenen cDNA Proben wurde normalisiert zu dem Standard-Gen Cyclophilin. 60°C wurden als Annealing-Temperatur gewählt. Cyclophilin und 13C5 wurden bei 84°C gemessen, um mögliche Primer-Dimere von der Messung auszuschließen. Folgende Primerpaare wurden für die PCR-Reaktion benutzt:
cyc5, ACCCCACCGTGTTCTTCGAC; acyc300, CATTTGCCATGGACAAGATG (Cyclophilin, das Produkt ist 300 bp lang)
pip92-s-new1, AAGCGGTCAGAGTTGCGTCAT; pip92-a-new-1, CACCGTGGGAAAAGTAAACAGA (13C5; das Produkt ist etwa 360 bp lang).
Die Spezifität der PCR-Reaktion wurde mittels Schmelzpunkt- Bestimmung und durch Agarose-Gelelektrophorese überprüft. Die gemessenen Werte wurden aus mindestens 3 Verdünnungen pro Wert gemittelt. Die Ergebnisse sind in Fig. 1b dargestellt, deren Fehlerbalken der Standardabweichung entsprechen.

Ausführungsbeispiel 2

1. Klonierung eines Expressionskonstruktes

Der kodierende Bereich der pip92 cDNA wurde unter Verwendung spezifischer Primer (pip92_m_B1: 5'- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCTACCATGGAAGTACAGAAAGAAGCGCAGCG -3'; pip92_m_B2: 5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAGAAGGCCACCACAGCTCGC-3') mittels einer PCR aus Maus-cDNA amplifiziert. Die verwendeten Primer enthalten an ihren Enden sogenannte B- Sites (sense-Primer, B1-site: 5'- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCT-3' antisense-Primer, B2- Site: 5'-GGGGACCACTTT GTACAAGAAAGCTGGGTC-3'), um die PCR- Produkte via Gateway-System (INVITROGEN; Durchführung nach Herstellerangaben) in den Vektor pcDNA12.2 (INVITROGEN) zu klonieren.

2. Elektroporation von COS-1 Zellen

COS-1 Zellen wurden mit Trypsin aus den Kulturschalen gelöst, abzentrifugiert und die Zellpellets in 300 µl Elektroporationspuffer resuspendiert und anschließend mit 7,5 µl 1 M MgSO₄-Lösung versetzt. Je 30 µl dieser Zellsuspension wurden mit 1-5 µg Plasmid-DNA in 4 mm- Elektroporationsküvetten (PEQLAB) überführt. Die Elektroporation erfolgte mittels eines Gene-Pulser II (BIORAD) bei 500 µF/230 V. Die Zellen wurden mit 5 ml COS-1 Medium im Brutschrank inkubiert.

3. Nachweis der PARP-Spaltung

Zum Nachweis der Spaltung von PARP wurden COS-1 Zellen transient mit dem Expressionskonstrukt für pip92 oder dem Leervektor transfiziert. Am 2. Tag nach der Transfektion wurden die Zellen fünf Stunden mit 0 oder 0,2 µM Staurosporin (CALBIOCEM) im Medium stimuliert. Nach Ablauf der Zeit wurde der Überstand abgenommen und die übrigen Zellen mittels Abschaben von den Platten gelöst und in gekühltem (4°C) PBS mit Inhibitoren (Pepstatin [2,5 mg/ml] und Aprotinin, beides SIGMA; 1 : 1000) aufgenommen. Die Zellen wurden abzentrifugiert (4 min, 4000 rpm) und nochmals mit 1 ml PBS mit Inhibitoren gewaschen. Die erhaltenen Pellets wurden in einem Volumen 2% SDS aufgenommen und je 5 µl Benzonase-Lösung (40 µl 100 mN MgCl₂ + 9 µl Benzonase, BOEHRINGER) zugegeben. Nachdem sich die Pellets bei Raumtemperatur gelöst hatten, wurden die Proben mit einem Volumen PBS versetzt. Je 1 µl jeder Probe wurde für eine Proteinbestimmung (BCA-Test, PIERCE, Durchführung nach Herstellerangaben) eingesetzt. Für anschließende Westernblot-Analysen wurden je 100 µg Protein eingesetzt und diese mit 5 µl 4× Ladepuffer (Laemmli) versetzt. Die Proben wurden 5 min bei 95°C denaturiert und anschließend mittels 8%igen denaturierenden SDS-Polyacrylamid-Gelen bei 20 mA pro Gel aufgetrennt. Die Proteine wurden mittels einer Semi-Dry- Blottingkammer (BIOMETRA) in Transferpuffer (25 mN Tris-HCl, 150 mM Glycin, 10% Methanol, pH 8,3) für 60 min auf Nitrozellulosemembranen (Protan BA79, SCHLEICHER & SCHUELL) transferiert (ca. 150 mA/Gel). Die Membranen wurden zunächst mit 5% Magermilchpulver (frema Reform, NEUFORM) in PBS/0,02% Tween20 geblockt, dann 3 × 5 min mit PBS/0,02% Tween20 gewaschen und eine Stunde bei Raumtemperatur mit dem Erstantikörper inkubiert (COS-Zellen: anti-cleaved-PARP- Antikörper, PROMEGA, 1 : 800). Nach dreimaligem Waschen mit PBS/Tween 20 wurden die Blots mit dem Zweitantikörper (anti- Kaninchen-Antikörper HRP-gekoppelt, Dianova, 1 : 5000) eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Detektion erfolgte mit dem SuperSignal Chemiluminiszens-System von PIERCE nach Herstellerangaben auf Hyperfilm-ECL (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH).
In den COS-1 Zellen, die mit der cDNA für pip92 transfiziert wurden, ließ sich - verglichen mit Zellen, die nur mit dem Leervektor transfiziert waren - eine vermehrte Spaltung von PARP nachweisen - sowohl ohne als auch nach Stimulation mit 0,2 µM Staurosporin (CALBIOCEM). (s. Fig. 2)

Ausführungsbeispiel 3

Nachweis der DNA-Fragmentierung mittels Cell Death Detection ELISA^PLUS (ROCHE)

COS-1 Zellen wurden mit 3 ml Trypsin aus Kulturschalen gelöst. Die Zellen wurden in 30 ml COS-1 Medium aufgenommen und ein Aliquot 1 : 1 mit Trypanblau (Sigma) verdünnt. Die Zellzahl wurde unter Zuhilfenahme einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. Die übrigen Zellen wurden abzentrifugiert und in 30 µl Elektroporationspuffer resuspendiert und anschließend 7,5 µl 1 M MgSO₄-Lösung versetzt. Je 30 µl dieser Zellsuspension wurden mit 1-5 µg Plasmid-DNA in 4 mm- Elektroporationsküvetten (PEQLAB) überführt. Die Elektroporation erfolgte mittels eines Gene-Pulser II (BIORAD) bei 500 µF/230 V. Die Zellen wurden so ausplattiert, daß sich ca. 7500 Zellen mit 100 µl COS-1 Medium in einer Vertiefung einer 96-Loch-Platte (NUNC) befanden, und bei 37°C im Brutschrank inkubiert. 7-16 Stunden nach der Elektroporation wurde das Medium gewechselt.
Zum Nachweis der DNA-Fragmentierung wurden COS-1 Zellen transient mit dem Expressionskonstrukt für pip92 (s. Ausführungsbeispiel 2) oder einem Leervektor als Kontrolle transfiziert. Am 2. Tag nach der Transfektion wurden die Zellen fünf Stunden mit 0 oder 0,2 µM Staurosporin (CALBIOCEM) im Medium stimuliert. Nach Ablauf der Zeit wurde der Cell Death Detection ELISA^PLUS (ROCHE) nach Herstellerangaben durchgeführt.
Die Messung der Absorption erfolgte in einem Plattenlesegerät (platereader Fluostar; BMG) bei 390 nm und 485 nm. Der Anreicherungsfaktor an Mono- und Oligonucleosomen im Zytoplasma wurde nach Herstellerangaben ermittelt, wobei die Werte auf 0 µM Staurosporin-behandelte, mit Leervektor transfizierte Zellen normalisiert wurden.
Zellen, die pip92 exprimierten, zeigten einen signifikant höheren Anteil an Mono- und Oligonukleosomen im Zytoplasma. Vergleichbare Werte ließen sich durch die Gabe von 0,2 µM Staurosporin, einem Apoptoseauslöser, erreichen (s. Fig. 3).

Ausführungsbeispiel 4

Annexin-V-Phycoerythrin-Bindung von pip92-transfizierten COS-1 Zellen

COS-1-Zellen wurden mit dem in Ausführungsbeispiel 2 beschriebenen pip92-Expressionskonstrukt und einem Expressionskonstrukt für EGFP ("Enhanced Green Fluorescence Protein"; pEGFP-N1) kotransfiziert. Kontrollen wurden entsprechend mit pEGFP-N1 und einem Leervektor (pcDNA3.1) kotransfiziert. Dazu wurden für eine Elektroporation 3,5 × 106 Zellen nach Trypsinierung in 300 µl Elektroporationspuffer (50 mM K₂HPO₄, 20 mM CH₃COOK, 20 mM KOH, pH 7,4) resuspendiert und die Pufferlösung mit 25 µl MgSO₄ (1 M)/ml Elektroporationspuffer versetzt. Die Zellsuspension wurde anschließend mit je 5,25 µg DNA (0,2 µg/µl) der jeweiligen Plasmide gemischt und in eine Elektroporationsküvette (EquiBio Küvette; 0,4 cm Elektrode) überführt. Die Elektroporation erfolgte mittels eines Gene Pulser II (BioRad) bei 500 µF und einer Spannung von 230 V. Die elektroporierte Zellsuspension wurde mit einer Zelldichte von 1.10⁶ Zellen auf 6 cm Kulturschalen mit COS-Vollmedium (high-Glucose DMEM (Sigma), 10% FCS, Penicillin/Streptomycin) ausplattiert.
Als Kontrolle wurde statt des Konstruktes für pip92 ein Leervektor (pcDNA3.1) zusammen mit pEGFP-N1 kotransfiziert. Nach 24 h Kultivierung wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit Staurosporin (0,2-1,0 µM; Calbiochem) in Vollmedium stimuliert. Kontrollen erhielten Vollmedium ohne Staurosporin. 24 h nach Staurosporin-Zugabe wurde das Medium abgenommen, in ein 15 ml Falcon-Tube überführt und die Zellen 1× mit PBS gewaschen. Die Waschlösung wurde mit dem Medium vereinigt. Nach Trypsinierung wurden die Zellen ebenfalls in das Falcontube überführt und nach Mischen ausgezählt. Je 3 × 10⁵ Zellen wurden bei 250 g für 5 min abzentrifugiert, in 300 µl Annexin V-Binding Buffer (10 mM HEPES pH 7,4; 150 mM NaCl; 2,5 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 4% BSA) resuspendiert und in ein 1,5 ml Eppendorf Tube überführt. Anschließend wurde für 5 min bei 4°C mit 250 g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen in 300 µl Annexin V-Binding Buffer mit 15 µl Phycoerythrin konjugiertem Annexin V (Annexin V-PE; PharMingen) resuspendiert. Die Zellsuspension wurde für 15 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend für 5 min bei 250 g zentrifugiert. Die Zellsedimente wurden in 300 µl eiskaltem Annexin V-Binding Buffer mit 5 µl Propidium Iodid (PI; 30 µg/µl; Oncogene) resuspendiert und in FACS- Röhrchen überführt. Die FACS Analyse wurde direkt im Anschluß durchgeführt, wobei die Röhrchen bis zur Messung auf Eis gehalten und dunkel gelagert wurden. Es wurden jeweils 1 × 10⁵ Zellen pro Ansatz mit einem FACSCalibur Gerät (Becton Dickinson) analysiert.
Im Ergebnis wurde der Anteil der Annexin V-PE positiven und gleichzeitig PI negativen Zellen für die EGFP positive Zellfraktion ermittelt (s. Fig. 4 und 5). SEQUENCE LISTING

Claims

1. Verfahren zur Identifizierung einer pharmazeutisch wirksamen Verbindung, dadurch gekennzeichnet, daß

a) ein geeignetes, insbesondere neuronales Wirtszellsystem, ein Wirtsorganismus oder ein Zellextrakt, insbesondere ein Extrakt aus neuronalen Zellen, zur Verfügung gestellt wird, und

b) ein zur Beobachtung der pip92-vermittelten Funktion, insbesondere ein zur Beobachtung der Apoptose, des Zellwachstums, der Zellproliferation und/oder der Zellplastizität geeigneter Parameter nach Zugabe einer Testverbindung im Vergleich zur Kontrolle ohne Zugabe einer Testverbindung für das gemäß (a) erhaltene Wirtszellsystem oder Zellextrakt in einem geeigneten Testsystem gemessen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Verfahrensschritt (b) die Spaltung des Proteins PARP, die Anfärbung von Zellen mit Annexin und/oder eine Apoptose-Signal durch FACS-Analyse detektiert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungskonstante der Testverbindung an pip92 in vivo, in vitro oder in silico ermittelt wird.

4. Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Bindungsplatz der pharmazeutisch wirksamen Verbindung auf dem Protein pip92 durch ein geeignetes biochemisches und/oder strukturbiologisches Verfahren, insbesondere in einem Verfahrensschritt (c), ermittelt wird.

5. Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die 3-dimensionale Raumstruktur der gemäß Verfahrensschritt (b) identifizierten Verbindung im Komplex mit dem Protein pip92 bestimmt wird und nachfolgend die chemischen Charakteristika, insbesondere die sterische Anordnung funktioneller Gruppen, deren Hydrophobizität, das Wasserstoffbrückenbindungspotential etc., dieser Verbindung durch in silico Methoden, insbesondere in einem Verfahrensschritt (d), modifiziert werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Verfahrensschritte (a), (b), (c) und/oder (d) iterativ durchgeführt werden, wobei als Zielfunktion insbesondere eine Optimierung der biologischen Eigenschaften der Testverbindung eingesetzt wird.

7. Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass gemäß Verfahrensschritt (a) ein geeignetes Wirtszellsystem, insbesondere neuronale Wirtszellen, zur Verfügung gestellt wird, das mit einem pip92-exprimierenden Expressionsvektor und ggf. mindestens einem Expressionsvektor, der für mindestens ein Reporter-Gen codiert, transfiziert ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass gemäß Verfahrensschritt (a) ein Nematode, der pip92 oder Varianten, bspw. Fragmente von pip92, exprimiert, als Wirtsorganismus zur Verfügung gestellt wird und gemäß Verfahrensschritt (b) Veränderungen des Zelltods in diesem transgenischen Wirtsorganismus im Vergleich zur Kontrolle detektiert werden.

9. Verfahren zur in vitro Diagnose von Erkrankungen, die auf pip92-vermittelter Fehlsteuerung von Signalkaskaden, insbesondere apoptotischer Signalkaskaden beruhen, dadurch gekennzeichnet, dass

a) eine Patientenprobe, bspw. in Form einer durch Biopsie gewonnenen Gewebeprobe, entnommen wird und/oder entnommene Zellen von Patienten in vitro kultiviert werden

b) ein zur Beobachtung der pip92-vermittelten Funktion, insbesondere ein zur Beobachtung der Apoptose, des Zellwachstums, der Zellproliferation und/oder der Zellplastizität geeigneter Parameter im Vergleich zur Kontrolle für die gemäß (a) erhaltenen Probe in einem geeigneten Testsystem gemessen wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß in Verfahrensschritt (b) die Spaltung des Proteins PARP, die Anfärbung von Zellen mit Annexin und/oder eine Apoptose-Signal durch FACS-Analyse detektiert wird.

11. Verbindung, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche 1 bis 8 erhältlich ist.

12. Verbindung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie die intrazelluläre Funktion des Proteins pip92, insbesondere die pip92-vermittelte Apoptose, moduliert, insbesondere inhibiert.

13. Verbindung nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine organisch-chemische Verbindung mit einem Molekulargewicht von vorzugsweise < 3000, eine antisense-RNA, insbesondere eine antisense-RNA für die pip92-mRNA, ein gegen pip92 gerichteter Intrabody oder ein Ribozym, insbesondere mit Aktivität gegen die pip92-mRNA, ist.

14. Verbindung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Zellmembran durch Diffusion oder über membranöse Transportproteine passiert.

15. Verbindung nach einem der Ansprüche 11 bis 14 als Arzneimittel.

16. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 11 bis 14 zur Behandlung von (bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von) Tumorerkrankungen, Autoimmunerkrankungen, insbesondere Diabetes, Psoriasis, multiple Sklerose, rheumatoide Arthritis oder Asthma, virale Infektionserkrankungen (bspw. HIV), degenerativen Erkrankungen, insbesondere neurodegenerativen Erkrankungen, bspw. Morbus Alzheimer oder Morbus Parkinson, Epilepsie oder Muskeldystrophien, GvHD (bspw. Leber, Niere oder Herz), ischämischer Infarkt, vor allem Schlaganfall oder Herzinfarkt, Hypoxie und/oder Schädel-Hirn-Trauma.

17. Zusammensetzung, enthaltend mindestens eine Verbindung nach einem der Ansprüche 11 bis 14, einschließlich pharmazeutisch verträglicher Hilfs-, Träger- oder Zusatzstoffe.

18. Verfahren zur Identifizierung eines zellulären Interaktionspartner des Proteins pip92 oder eines nativen Allels, Fragments oder Derivats desselben, wobei ein sog. "yeast-two-hybrid"-System oder Immunopräzipitationsmethoden eingesetzt wird/werden.