JP4634682B2 - 抗アポトーシス活性を有する化合物を識別する方法 - Google Patents

Description

【０００１】
本発明は、抗アポトーシス活性（ａｎｔｉａｐｏｐｔｏｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を有する物質を識別する方法と該方法によって識別される物質とに関する。また、本発明は、前記物質を含む製剤と血管の疾患の治療のための該製剤の使用とにも関する。
【０００２】
動脈硬化（“動脈石灰沈着”）は、もっとも重要かつありふれた動脈の病変である。これは、血管容積の変化と内皮（内皮細胞）の病変とを伴い、したがって血管壁の代謝および細胞反応がもたらされる。動脈血流の阻害が文明国においてはもっとも多い（約５０％）死因である。動脈血流阻害の原因は大部分の場合動脈硬化である。
【０００３】
冠動脈性心疾患に対して現在使用されている薬剤の効力は、本質的に、心筋の酸素消費を低下させ、減少した冠動脈血流に適合させるということにもとづく。これらの薬剤は、また、冠動脈の拡張をも引き起す。他方、動脈硬化性の冠動脈狭窄の場合、病気にかかった血管を拡張させることはもはやできないので、冠動脈血流を増大させる治療はほとんど不可能である。すべての薬剤が、疾患の非常に遅い段階でしか作用しない。疾患の原因を直接に治療できるか、または早期診断に適当でありうる薬剤はまだ知られていない。有効な早期診断の可能性がない場合、大部分の患者は軽い心筋梗塞を起したあとにしか治療されない。進行した段階では、通常、外科手術（たとえば、バイパス）のみが残された選択肢となる。
【０００４】
すべての血管の内壁は内皮細胞によって内張りされている。内皮細胞は、各種の生理学的過程の調節、たとえば血圧の調節および血管の変性と再生、に関与している。多くの病理学的状況には、内皮細胞の機能不全たとえば動脈硬化の限局性進行、が伴う。
【０００５】
アポトーシス（同意語：プログラム細胞死）は、不可逆的過程であり、停止させることはできない。したがって、アポトーシス細胞の死は不可避である。
【０００６】
ヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ−０ ９０３ １４９号明細書には、免疫細胞内のアポトーシス誘発物質を識別する方法が記載されている。免疫細胞の表面のインテグリンを伴う蛋白質（ＩＡＰまたはＣＤ ４７）に結合する物質がアポトーシスを誘発する能力を有しうる、ということが示されている。作用機構については述べられていない。
【０００７】
すでに、ＩＡＰが特異性カルシウムチャンネルの形成に関与するという考えが提示されている（Ｓｃｈｗａｒｔｚ、Ｍ．Ａ．ほか、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６８：２７、１９９３１−１９９３４）。この仮想的なカルシウムチャンネルの、アポトーシスの誘発における役割については、述べられていない。
【０００８】
動脈硬化性の病変は、血管系において、血管の分岐していない領域よりも分岐点（分岐部）で頻繁に発生する。すでに、これらの病変領域におけるアポトーシス内皮細胞を観察することが可能である。アポトーシス内皮細胞が動脈硬化の進行に関与するということが示されている（Ａｓａｋｕｒａ、Ｔ．、Ｋａｒｉｎｏ、Ｔ．、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６６、１０４５−１０６６（１９９０））。
【０００９】
現在、血管系の内皮細胞におけるアポトーシスの発生の防止または治療のための薬剤は知られていない。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、内皮細胞におけるアポトーシスを防止する物質を見出すことのできる方法を提供するということである。この方法は、実施が簡単であり、かつ実施における費用効率の高いものである。この方法で識別される物質は、アポトーシスの阻止が必要である病気、特に血管の疾患特に好ましくは動脈硬化の治療のための製剤の成分として使用すべきものである。
【００１１】
前記目的は、アポトーシス阻害物質および抗アポトーシス活性を有する物質を識別する方法であって、
ｉ）ＩＡＰとインテグリンα_vβ₃との両方を発現する細胞を培養し、
かつ／または、
ii）前記細胞にアポトーシス誘発物質を生成させ、かつ／またはアポトーシスを誘発する一つまたは複数の物質を加え、
iii）試験物質を加え、
iv）アポトーシス率を測定する、
ことを特徴とする方法、によって達成される。また、本発明は、特許請求の範囲に記載された方法によって識別できる物質、該物質を活性成分として含む製剤、および血管疾患の治療特に動脈硬化の治療のための前記製剤の使用をも含む。さらに、本発明は、本発明の方法によって識別された物質の、血管疾患の治療、特に動脈硬化の治療のための使用を含む。
【００１２】
ここでの発見によれば、意外にも、トロンボスポンディン−１（ＴＳＰ−１）の、ＩＡＰとインテグリンα_vβ₃とへの同時結合により、内皮細胞におけるアポトーシスが誘発される。さらに、意外なこととして示しえたのは、ＴＳＰ−１が内皮細胞そのものによって生成され、したがってアポトーシスが自己誘発的または自発的であるということである。これらの研究は、通常の静置細胞培養によってなされた。静置細胞培養というのは、細胞培養液内に流れが存在しない細胞培養である。しかし、意外にも示すことができたのは、潅流培養では、すなわち細胞が流動細胞培養液にさらされる条件下では、内皮細胞はＴＳＰ−１を生成せず、したがってこの細胞培養液内ではアポトーシスはごくわずかな程度しか発生しないか、またはまったく発生しない。
【００１３】
新鮮な培養液にＴＳＰ−１を補充すると、静置培養内皮細胞における自発アポトーシスが増大する。この増大は、大体、静置状態調節培養液（すなわち、すでに静置培養液内でのＨＵＶＥＣの培養に使用した培養液）の効果に対応する（表１）。これは、静置状態調節培養液は、媒介物質たとえばＴＳＰ−１により、アポトーシスを誘発する能力がある、ということを示す。
【００１４】
“状態調節された”培養液（“ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ” ｍｅｄｉｕｍ）という言葉は、ここでは、他の細胞を培養するためにすでに使用された細胞培養液を意味する。この培養液は、細胞培養中に細胞によって生成される可溶性媒介物質たとえば成長因子、ホルモン、その他が溶解しているという点が特徴である。
【００１５】
ＴＳＰ−１に結合してＴＳＰ−１の効力を消す抗ＴＳＰ−１抗体の使用により、ＴＳＰ−１が内皮細胞のアポトーシスの媒介物質である、ということを示すことができた。添加ＴＳＰ−１の効果は、静置状態調節培養液の効果とまさに同様に、ＴＳＰ−１に対するポリクローナル抗血清の添加、およびモノクローナル抗ＴＳＰ−１抗体の添加により、抑制することができる（表１）。
【００１６】
【表１】

【００１７】
アポトーシス率（％）を、実施例６に示すように決定した。（ａ）〜（ｇ）の文字は、実施例１０に示す研究と実施例１０において選択した特定の実験条件とに対応している（実施例１０参照）。
【００１８】
さらにまた、ウエスタンブロット研究により、ＴＳＰ−１は静置培養内皮細胞によってのみ分泌される、ということを定性的に示した（図１）。分泌速度を、密集後の動的および静置培養物に関して決定した（図２）。結果は、アポトーシスの誘発はＴＳＰ−１分泌速度によって制御することができるということを示した。
【００１９】
“静置細胞培養（条件）”（“ｓｔａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ （ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）”）という言葉は、ここでは、細胞の周囲の細胞培養液において不変のすなわち一定方向の層流が発生しないという条件下での細胞の培養を意味する。したがって、ここで使用する意味での“静置細胞培養条件”は、乱流または変動層流、すなわち、たとえば流れの方向の変化が起るようなまたは流れの逆転さえ起るような乱流または変動層流、が発生する細胞培養条件を含む。“動的細胞培養（条件）”（“ｄｙｎａｍｉｃ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ （ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）”）という言葉は、ここでは、細胞培養液内で一定方向の層流状態だけが支配的である細胞培養条件を意味する。すなわち、先行技術において、たとえばいわゆる潅流培養（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ）によって実現できるような細胞培養条件である。明らかに、理想的な物理的流動構造状態は、血管系すなわち生体内状況においても、細胞培養条件下においても実現されない。したがって、ここで述べる流動状態は、近似的に実現できるものであり、先行技術の細胞培養実験で一般に使
用されているものである。
【００２０】
前記のような場合、培養細胞に作用する剪断応力は、流動条件によって変化する。一定方向の層流の場合、０．００１ ｄｙｎ／ｃｍ² よりも大きな剪断応力が生じ、この剪断応力のベクトル和は流れの方向が変化する変動流動条件におけるものよりも大きい。静置細胞培養（条件）は、非常に小さな応力（＜０．００１ ｄｙｎ／ｃｍ²）または完全な無応力を特徴とする。動的細胞培養の場合、＞０．００１ ｄｙｎ／ｃｍ²の剪断応力または＞０．１のレイノルズ数となる。乱流はレイノルズ数＞２００（〜１０００）の場合に発生しうる（流動チャンバーの形状による）もので、静置または変動流動条件の場合と同様に、もはやアポトーシスの誘発に対する防御的性質を有しない。
【００２１】
しかし、意外にも、潅流培養組織へのＴＳＰ−１の添加は一般にアポトーシスに影響を及ぼさない。これは、アポトーシスが、血液流内のＴＳＰ−１の生成に依存するばかりでなく、他方では細胞の表面の特異性受容体の生成または接近可能性にも依存する、ということを示す。このことに関連して、意外にも、インテグリンα_vβ₃受容体を静置および動的培養細胞上に検出することができ、一方ＩＡＰ受容体は静置培養物においてのみ検出可能な量が発現する、ということを示すことができた。
【００２２】
ＴＳＰ−１は、インテグリンα_vβ₃に結合することが知られている。ＴＳＰ−１のα_vβ₃インテグリンへの結合はＲＧＤ配列モチーフによって媒介される。したがって、ＲＧＤ媒介結合の効力ある作用物質である環状Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ｖａｌペプチド（環状ＲＧＤペプチド）（Ｍｅｒｃｋから供給された）を、密集後内皮細胞に添加した。しかし、これは意外にもアポトーシス率に影響を与えなかった。これが示すのは、ＴＳＰ−１のインテグリンα_vβ₃への結合は、少なくとも、それだけでは、アポトーシス誘発をもたらさない、ということである（表２）。
【００２３】
【表２】

【００２４】
アポトーシス率は、実施例６に示すように決定された。新鮮培養液中での培養は対照であり、静置細胞培養における自発アポトーシス率を示す。状態調節培養液は、すでに４８〜７２時間、内皮細胞を培養したものであり、したがって内皮細胞によって分泌された因子を含む。状態調節された培養液によって生じるアポトーシス率は、新鮮培養液＋ＴＳＰ−１と同じレベルであり、これは、一つ以上のアポトーシス媒介物質がこの状態調節培養液中に存在するはずである、ということを示す。状態調節培養液の調製については、実施例５で説明する。
【００２５】
ＴＳＰ−１と内皮細胞上の受容体との別の可能な相互作用は、Ｃ末端細胞結合領域（ＣＢＤ）によるＩＡＰへの結合である。Ｃ末端細胞結合領域（ＣＢＤ）は、ＩＡＰと特異的に相互作用するＴＳＰ−１領域である。このＣ末端細胞結合領域のみから成る切断ＴＳＰ−１は、Ｂａｃｈｅｍ社から、ＣＢＤペプチドとして市販されている。このＣＢＤペプチドの添加はアポトーシス率の増大をもたらさない（表２）。しかし、このＣＢＤペプチドと環状ＲＧＤペプチドとを同時添加すると、意外にも、アポトーシス率の顕著な増大がもたらされる（表２）。この増大は、ＴＳＰ−１の添加によるアポトーシス率の増大と同程度である。以上のことから、ＴＳＰ−１とインテグリンα_vβ₃とへの同時結合のみがアポトーシスに有効であると考えられる。
【００２６】
他の二つのペプチドの一つを不活性なＲＧＤペプチドで置き換えると、ふたたび効果が消滅する。二つの活性ペプチドと同時に抗ＴＳＰ−１抗血清を添加することは、アポトーシス率の増大に対して効果がない（表２）。これは、培養中のＴＳＰ−１の生成が効果を有しないことを示している。したがって、意外にも、自発アポトーシス誘発のためのＴＳＰ−１の活性はＩＡＰとα_vβ₃とへの同時結合によって媒介される、と考えることができる。
【００２７】
ＴＳＰ−１がＩＡＰとα_vβ₃とに結合すると、細胞内へのカルシウム流入が起る（図３）。このカルシウム流入は、添加直後（２、３秒以内）に観察され、最終的にアポトーシス誘発に導く信号伝達の一ステップである。したがって、蛍光カルシウム指示薬（Ｍｅｒｒｉｔ、Ｊ．Ｅ．ほか、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６９、５１３−５１９（１９９０））を使用することにより、カルシウム信号の不出現によってアポトーシスの阻害を調べる非常に高速の試験法を確立することができる（図３；実施例６で詳しく説明する）。
【００２８】
本出願の発明者が実施したさらなる研究によれば、静置培養条件により適当な細胞におけるアポトーシス誘発がもたらされるばかりでなく、変動流または乱流条件もアポトーシス誘発に十分なものである、ということを示すことができる。潅流チャンバー内に障害物を置くことにより、いろいろな流線が得られる。一つのモデルを図４に示す。代表的な流れチャンバーは、流れチャンバー内を一定の流量で通過する液体流を発生させることができるということを特徴とする。流れは、たとえばポンプまたは重力によって駆動することができる。それぞれの液体は、適当な軟質管または硬質管を通してそのチャンバーに送られる。本出願のシステムの場合、軟質管はシリコーン製であり、硬質管はステンレス鋼製である。チャンバーは、ポリカーボネートインサートとシリコーンシールとを有するペトリ皿によって定められる。
【００２９】
また、層流を発生させることもできる。そのために、液体を満たしたプレートの回転またはプレート上の液体内の円柱形プラグの回転により流れが生成される他の適当な装置たとえばコーン−プレート装置を使用することもできる。
【００３０】
さらに、生体外研究により、はじめて、アポトーシスが間違いなく変動流線領域（ｔｈｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｌｏｗ ｐｒｏｆｉｌｅｓ）にある内皮細胞に誘発されるということを示すことができた。これは、潅流系内のアポトーシス細胞の空間分解研究（ａ ｓｐａｃｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）によって示すことができた（図５）。
【００３１】
ここで示す結果によれば、アポトーシス誘発の真の原因は、不変層流の非存在である。これにより、内皮細胞にＴＳＰ−１が分泌され、次にＴＳＰ−１がインテグリンα_vβ₃およびＩＡＰとの相互作用によりアポトーシスを誘発させる。
【００３２】
ここで示す発見にもとづいて、アポトーシス過程の誘発の阻害物質を標的探索する試験方法を開発することが可能である。たとえば、抗アポトーシス活性を有する物質を識別することが可能である。この目的のためには、ＩＡＰとインテグリンα_vβ₃との両方を発現する細胞を培養する。この細胞は自然のものでも遺伝子組み換えによって作られたものでも良い。そのような細胞は当業者には公知である。この場合、好ましいのは培養された内皮細胞であり、また特に好ましい実施態様においては、ヒトの臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を使用する。適当な細胞のさらなる例としては、単球、赤血球、活性化Ｔ細胞、線維芽細胞、血小板、ＣＨＯ細胞、平滑筋細胞、および卵巣腫瘍細胞がある。完全細胞系、たとえば骨髄細胞系も適当でありうる。本発明の方法で使用する細胞は、組み換えＩＡＰまたはインテグリンα_vβ₃を発現するように遺伝子的に改変された細胞とすることもできる。これらの細胞は、場合に応じて、細胞表面の元来の結合特性を保存するように改変される。
【００３３】
これらの細胞は、適当な細胞培養容器を使用して、適当な細胞培養液中で培養される。この培養液は、通常、先行技術で一般に公知の標準培養液である。たとえば、これらの細胞はＤＭＥＭ、Ｍ−１９９、ＩＦ基本培養液などによって培養される。現在では、適当な培養液は実質的にすべての細胞および細胞系について入手できる。培養開始の前に、成長因子およびホルモンたとえば胎児子ウシ血清（ＦＣＳ）を、培養液に添加することができる。哺乳動物の細胞は、通常、５％ＣＯ₂雰囲気、３７℃で培養する。この雰囲気を、細胞培養液中の緩衝剤たとえば炭酸ナトリウム緩衝剤とともに使用することにより、細胞培養液のｐＨを安定させることができる。もう一つ可能なことは、培養の開始前に、細胞培養液に、抗生物質を加えることである。この抗生物質は、汚染をもたらす原核微生物と特異的に相互作用して、その成長を妨げるが、真核細胞の成長には実質的に影響を与えず、したがって細胞培養物を汚染から保護するようなものである。細胞培養に関するその他のヒントおよび情報は、標準的な著作、たとえば、Ｚｅｌｌ− ｕｎｄ Ｇｅｗｅｂｅｋｕｌｔｕｒ、３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｔｏｎｉ Ｌｉｎｄｌ、Ｊｏｅｒｇ Ｂａｕｅｒ、（１９９４）、Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、に見出すことができる。
【００３４】
ＨＵＶＥＣおよびその他の内皮細胞を培養するのに適当な培養条件を、実施例１および実施例２に示す。
【００３５】
このとき、アポトーシスは、培養条件によって、または一つ以上のアポトーシス誘発物質を添加することによって、誘発することができる。このタイプの培養条件は、好ましくは、前述のように不変の層流が発生しないようなものである。
【００３６】
アポトーシス誘発またはアポトーシス率の増大のために選択した流れ条件に加えて、またはその代りに、試験系に媒介物質を添加することができる。媒介物質の同時添加により、試験系の感度が増大する。静置細胞培養組織における自発アポトーシス率は、たとえばＴＮＦ−αのような媒介物質によって誘発されるアポトーシス率に比べると割合に小さい。静置細胞培養条件によって誘発される自発アポトーシス率の試験で実現されるアポトーシス率は、全細胞に対して０．５〜７％の範囲にある。媒介物質によって誘発されるアポトーシスの場合、５０％までのアポトーシス率が達成されうる。
【００３７】
この理由により、本発明の方法においては、特に好ましくは可能な阻害物質によるアポトーシス率の低下を測定する前に、アポトーシス率の増大をもたらす物質を添加し、測定される信号が増強されるようにする。好ましくは、添加媒介物質は少なくとも１％から１０〜５０％以上までのアポトーシス率を与えるものである。これは、特に好ましくは、ＴＳＰ−１を細胞培養系に加えることを含む。ＴＳＰ−１は、ＩＡＰおよびα_vβ₃細胞受容体との相互作用を抑制すべき、天然のアポトーシス媒介物質だからである。ＴＳＰ−１を加えることにより、この媒介物質の濃度に応じて、５％好ましくは７％特に好ましくは１０％のアポトーシス率を実現することができる。しかし、明らかに、本発明においては、ＴＳＰ−１と同様にしてα_vβ₃およびＩＡＰと相互作用する他の物質も適当である。このの意味におけるＴＳＰ−１の代替物質は、ＲＧＤおよびＣＢＤペプチドとの同時添加によりアポトーシス率を増大させるためのものである。
【００３８】
これらの媒介物質は、アポトーシス活性を有するホルモンその他の物質である。これらの媒介物質は溶解した形で細胞培養物に加えられ、また注意すべきことは使用する溶液が無菌でなければならないということである。溶液の無菌性は、いろいろなやり方好ましくは熱処理（１２０℃、２ ｂａｒでのオートクレーブ処理）によって実現でき、あるいは、当該媒介物質が特に熱に敏感なために熱処理が不適当な場合には、滅菌ろ過、たとえばＮａｌｇｅｎｅ使い捨て滅菌フィルターの使用による滅菌ろ過、によって実現できる。細胞培養物への添加物を滅菌するためのこの種の方法は、当業者には周知である。
【００３９】
抗アポトーシス活性を有する物質を識別するためには、培養細胞のアポトーシスに及ぼす影響を研究すべき試験物質を細胞培養物に添加する。これらの試験物質は好ましくはモノクローナル抗体、抗体フラグメント、ポリクローナル抗体、およびペプチドである。しかし、抗アポトーシス効果を示しうるのではないかと思われる他の物質を加えることも可能である。これらの物質は好ましくは溶解した形で添加する。この場合の溶剤は細胞培養物に影響を及ぼさないものでなければならない。したがって好ましくは、これらの試験物質は、細胞培養においてすでに一般に広く使用されている緩衝剤溶液に溶解させる。これらの緩衝剤の例としては、りん酸塩緩衝剤、炭酸ナトリウム緩衝剤、その他がある。好ましくは、溶解させた試験物質は滅菌ろ過（Ｎａｌｇｅｎｅ 使い捨て滅菌フィルター）によってろ過滅菌（無菌化）してから、細胞培養物に添加し、汚染性の微生物または菌類の胞子、および不溶解成分を除去するようにする。
【００４０】
好ましくは、溶解試験物質は温度調節し、すなわち細胞培養物の温度に合わせてから、細胞培養物に添加する。量は、使用する試験物質が到達すべき濃度に依存し、また好ましくは、この量は、細胞培養液の希釈が起らないような小さな量である。そのような試験物質を好ましくは溶解状態で細胞培養物に導入するのに使用できる方法は、当業者には周知である。
【００４１】
アポトーシス率の低下は、任意の適当な測定方法によって決定することができる。特に適当な初期指標は、細胞内カルシウム指示薬の使用による、細胞へのカルシウム流入の不出現の測定である。正確なアポトーシス率の決定のために適当な方法は、アポトーシス細胞のＤＮＡの染色と、それに続く形態計測的な細胞核の解析またはフローサイトメーターによる細胞ＤＮＡ含有量の解析である。適当な蛍光染料の例としては、ＤＡＰＩがある。これらの方法は先行技術において周知であり、アポトーシス細胞の検出のために広く使用されている。アポトーシス阻害剤となる可能性のある物質の使用後、アポトーシス細胞の数が、静置培養試験系のアポトーシス細胞の数、場合によってはアポトーシス誘発物質添加後のアポトーシス細胞の数に対して、５０％よりも大きく、好ましくは７０％よりも大きく、特に好ましくは９０％よりも大きく、減少した場合、その物質は本発明により使用細胞におけるアポトーシスの阻害剤であると見なされる。細胞へのカルシウム流入の不出現を、ふるい分けのための初期指標として使用することができる。そのあと、カルシウム流入の不出現をもたらす物質を、ＤＡＰＩ染色によって検査しなければならない。
【００４２】
他のＤＮＡ染料（たとえば、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８）を使用すること、または通常の方法、たとえば、ＴＵＮＥＬ検定（Ｔｄｔ媒介Ｘ−ｄＵＴＰニック端標識付け；ＤＮＡ断片）、アポトーシス酵素の検出（たとえば、ＰＡＲＰ、カスパーゼ）、または蛋白質（たとえば、ｐ５３、ＣＤ９５）、蛍光アネキシン（ａｎｎｅｘｉｎ）によるホスファチジルセリンの転座、もしくはアガロースゲル中でのＤＮＡラダーの検出、を使用することも可能である。
【００４３】
本発明の方法により、抗アポトーシス活性を有する物質を見出すことが可能である。これらの物質は、好ましくは、細胞表面の受容体特に好ましくはＩＡＰおよび／もしくはインテグリンα_vβ₃、または血液循環における体液因子特に好ましくはＴＳＰ−１に結合する化合物である。ただし、この結合は、アポトーシス誘発をもたらす、ＴＳＰ−１とＩＡＰおよびα_vβ₃とのここで述べる特異的な同時相互作用が起らず、したがってアポトーシスが誘発されえず、それゆえまたアポトーシスが発生しない、ような形でなされる。
【００４４】
別の好ましい実施態様においては、これらの物質は、ＩＡＰに結合し、したがって細胞へのアポトーシス特異性のカルシウム流入を防止し、したがってアポトーシスが誘発されえず、それゆえ発生しない。
【００４５】
これらの阻害剤は、アポトーシスの抑制が望ましい病気を治療するために、好ましくは血管系において内皮細胞および他の細胞（たとえば、平滑筋細胞）のアポトーシスを抑制するために、使用できる製剤の製造のために適当である。原理的には、抗アポトーシス活性を有し、本発明の方法により、ＩＡＰおよびα_vβ₃を表面に発現するすべての細胞におけるアポトーシス状態を抑制することが明らかにできる物質を使用することができる。したがって、アポトーシスの抑制が必要な病気、たとえば特に動脈硬化を治療することができ、この治療においては、病変におけるプログラム細胞死の抑制により、血管の状態の改善がもたらされる。製剤に前記の阻害剤を使用することにより、予防治療も可能である。
【００４６】
本発明の方法により試験すべき活性物質は、特に、分子生物学および遺伝子操作の通常の方法により容易に得ることのできるモノクローナル抗体およびペプチドである。しかし、明らかに、同様の効果を有する他の物質も本発明の試験法により見出すことができる。ここでは、“抗体”という言葉は、完全抗体（すなわち、二つの重鎖と二つの軽鎖とを有する抗体）と抗原結合部位を有する抗体フラグメントとの両方を意味する。抗アポトーシス活性を有する抗ＴＳＰ−１抗体の識別について、実施例１０で述べる。同様にして、アポトーシスの誘発を防ぐために多数の他の抗体および抗体フラグメントを試験することができる。
【００４７】
明らかに、同様にして本発明の方法により、抗アポトーシス活性を有することを明らかにできるペプチドと抗体（抗体フラグメント）との完全系列を作成することが可能である。また、本発明の方法により、抗アポトーシス活性を有する、抗体（抗体フラグメント）でもペプチドでもない他の物質を識別することもできる。
【００４８】
本発明の試験法において試験物質として調べることのできる特に好ましい物質は、低分子量化合物である。そのような物質は、製剤組成物における有効成分として使用した場合に、まったく副作用を有しないかまたは小さな副作用しか有しないことが多い。そのような物質のさらなる利点は経口投与をなしうるということである。
【００４９】
それらの物質の例としては、Ｈａｕｂｎｅｒほか、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９６、１１８、７４６１−７４７２、に記載されている環状ペンタペプチドがある。本発明における低分子量物質には、小さなペプチド、アミノ酸、およびアミノ酸類似体、ステロイド、ヌクレオチド、ならびに分子量≦５０００、好ましくは≦３０００、特に好ましくは≦２０００のその他の有機化学物質が含まれる。（Ｈａｕｂｎｅｒ、Ｒ．、Ｇｒａｔｉａｓ、Ｒ．、Ｄｉｅｆｅｎｂａｃｈ、Ｂ．、Ｇｏｏｄｍａｎ、Ｓ．Ｌ．、Ｊｏｎｃｚｙｋ、Ａ．、Ｋｅｓｓｌｅｒ、Ｈ．、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ＲＧＤ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｃｙｃｌｉｃ Ｐｅｎｔａｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ Ｈｉｇｈｌｙ Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｉｎｔｅｇｒｉｎα_vβ₃ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ、１１８、７４６１−７４７２（１９９６））。
【００５０】
対応する製品は、通常の方法によって製造することができる。たとえば、製剤の活性成分であるペプチドまたは抗体（抗体フラグメント）を薬剤的に許容される基剤に溶解させることができる。薬剤的に許容される基剤の例としては、緩衝剤溶液たとえばリン酸塩緩衝剤またはクエン酸塩緩衝剤溶液が挙げられる。また、薬剤的に許容される薬剤の添加によってペプチドの活性を維持すること、またたとえば製剤における還元性環境を維持することも可能である。
【００５１】
それぞれの患者に対する一回の投与量および薬量は、いくつかの要因、たとえば、使用する特定化合物の活性、患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性、食事療法、投与期間、投与経路、排出速度、他の薬剤との併用、および治療が加えられるそれぞれの病患の深刻さ、に依存する。一回の投与量と薬量は、主治医により、これらの要因にもとづいて決定される。
【００５２】
ポリペプチド薬剤、たとえば蛋白質薬剤または抗体薬剤は、通常、非経口投与され、たとえば吸入スプレー、直腸投薬により、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、クモ膜下注入もしくは投与法により、または、通常の薬剤的に許容される基剤（ｃａｒｒｉｅｒｓ）、佐剤（ａｄｊｕｖａｎｔｓ）、および賦形剤（ｖｅｈｉｃｌｅｓ）を含む製剤による外用薬として、使用される。他の経路による投与たとえば経口投与も、見出されたそれぞれの物質の性質によっては適当なものとなりうる。
【００５３】
本発明は、また、通常の製薬基剤とともに、有効量の、抗アポトーシス活性を有する物質を含む製剤を提供する。製薬基剤は、たとえば、固体または液体増量剤、カプセル材料または溶剤である。製薬基剤として使用できる材料の例としては、糖（たとえば、ラクトース、グルコース、およびスクロース）、デンプン（たとえば、コーンスターチ、およびジャガイモデンプン）、セルロースおよびその誘導体（たとえば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、およびセテイン酸セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅｃｅｔａｔｅ））、粉末化トラガント、モルト、ゼラチン、タロー、薬物基剤（たとえば、カカオバター、および座剤ロウ）、油（たとえば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、および大豆油）、ポリオール（たとえば、プロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール）、エステル（たとえば、オレイン酸エチル、およびエチルラウレエート（ｌａｕｒｅａｔｅ））、寒天、緩衝剤（たとえば、水酸化マグネシウム、および水酸化アルミニウム）、アルギン酸、発熱物質を含まない水、等張生理食塩水、リンゲル液、エチルアルコール、およびリン酸塩緩衝剤溶液、ならびに薬剤組成物に使用される他の非毒性の融和性の物質、がある。湿潤剤、乳化剤、および滑沢剤（ｇｌｉｄａｎｔ）、たとえばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、滑沢剤、被覆剤、ならびに芳香剤（ｐｅｒｆｕｍｉｎｇａｇｅｎｔ）および保存料も、同様に、製薬技術者の要求に応じて、製剤中に存在することができる。一回分の服用量とするために基剤物質に混合する活性成分の量は、治療を受ける患者および投与法によって変わる。そのような薬剤組成物の一例を実施例１３に示す。
【００５４】
略語
ＩＡＰ： インテグリンを伴う蛋白質（ＣＤ ４７）
ＣＢＤ： Ｃ末端細胞結合領域
ＴＳＰ−１： トロンボスポンディン１（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ １）
ＲＧＤ： Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ
ＨＵＶＥＣ： ヒトの臍静脈内皮細胞
ＨＰＥＣ： ヒトの胎盤の内皮細胞
ＤＡＰＩ： ４´，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール
【００５５】
以下、添付の図面と実施例を用いて、本発明をさらに詳しく説明する。
【００５６】
実施例１
臍静脈からのヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の培養
溶液（無菌）：
− 培養液：ＩＦ基本培養液＋１５％（ｖ／ｖ）ＮＣＳ、５μｇ／ｍｌ トランスフェリン、５μｇ／ｍｌ ヘパリン、０．７μｇ／ｍｌ ＦＧＦ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、（ＩＦ 基本培養液：Ｉｓｃｏｖｅの変更Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培養液（ＩＭＤＭ）とＨａｍのＦ１２との１：１混合物；どちらの成分もイギリス国Ｐａｉｓｌｅｙ市のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から入手）
− ＮＣＳ：新生子ウシの血清（ドイツ国Ａｉｄｅｎｂａｃｈ市のＳｅｂａｋ社から入手）
− ＦＧＦ：線維芽細胞増殖因子（豚の脳から精製した自前の製剤）
【００５７】
器材：
− 細胞培養容器、ゼラチン被覆
【００５８】
ＨＵＶＥＣを、水蒸気飽和大気中、５％ＣＯ₂、３７℃で、ゼラチン被覆培養容器中で培養した。培養液は２〜３日ごとに交換した。密集するごとに、細胞を分割比１：３〜１：５で継代した。ＨＵＶＥＣは、厳重に接触を防止して成長させ、典型的な玉石状形態の単層細胞地を形成させた。密集時に、培養物は４〜９×１０⁴細胞／ｃｍ²の細胞密度に達した。継代１〜４のＨＵＶＥＣ培養物のみを、アポトーシスの研究に使用した。
【００５９】
補足
培養容器の被覆
溶液（無菌）：
− ゼラチン溶液、１００ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水にＭｉｌｌｉ−Ｑ水に懸濁させた１ｇのゼラチン（細胞培養試験したもの）を１％（ｗ／ｖ）加え、１２１℃、２ ｂａｒで、２０ ｍｉｎ、オートクレーブ処理することにより、溶解させ、室温で保存した。
− ＰＢＳ（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、８ ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、１．５ ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄）
− ８ ｇ／ｌ ＮａＣｌ
− ０．２ ｇ／ｌ ＫＣｌ
− １．４４ ｇ／ｌ Ｎａ₂ＨＰＯ₄×２ Ｈ₂Ｏ
− ０．２ ｇ／ｌ ＫＨ₂ＰＯ₄
塩類を適当な体積のＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解させ、１２１℃、２ ｂａｒで、２０ ｍｉｎ、オートクレーブ処理し、室温で保存した。ｐＨを調べたところ、７．２〜７．４であった。
【００６０】
器材：
− 細胞培養容器
【００６１】
手順：
培養容器を、付着成長細胞の培養のために、ゼラチンで被覆した。細胞培養容器の底を滅菌ゼラチン溶液で被覆し、細胞培養容器を、１５ ｍｉｎ間、室温に放置した。ゼラチン溶液を吸引除去してから、細胞培養容器をＰＢＳで一回洗浄すると、使用できるようになる。
【００６２】
付着細胞の継代培養
溶液（無菌）：
− ＰＢＳ
− トリプシン／ＥＤＴＡ（０．０５％（ｗ／ｖ）／０．０２％（ｗ／ｖ））
− ０．１ｍｌのトリプシン貯蔵溶液
− ０．０５ｍｌのＥＤＴＡ貯蔵溶液
無菌ＰＤＳにより５０ｍｌに増量し、１０ｍｌずつに分割して−２０℃で保存した。
【００６３】
器材：
細胞培養容器、ゼラチン被覆
【００６４】
手順：
形成されたすべての細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液によって培養容器面から離した。培養液を吸引除去し、培養容器の底を、ＰＢＳで簡単に洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（２５ｃｍ²の培養容器の場合、〜１ｍｌ）で被覆した。ただちにこの酵素溶液を、ふたたび吸引除去し、液体薄膜が細胞上に残留するようにした。細胞を室温で１〜１０ｍｉｎ間放置し、顕微鏡下で細胞の取りはずしを行った。細胞の取りはずしは、培養容器のへりを軽くたたくことにより、早めることができる。細胞を新鮮な培養液中に取りだし、場合によっては計数して、新しい培養容器に植えつけることができる。
【００６５】
実施例２
ウシの大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）の培養
溶液（無菌）：
− 培養液：ＩＦ基本培養液＋５％（ｖ／ｖ）ＮＣＳ、５μｇ／ｍｌ トランスフェリン、２０μｇ／ｍｌ ヘパリン。温度を３７℃に調節。
【００６６】
器材：
− 細胞培養容器、ゼラチン被覆
【００６７】
手順：
ＢＡＥＣを、水蒸気飽和大気中、５％ＣＯ₂、３７℃で、ゼラチン被覆培養容器中で培養した。培養液は２〜３日ごとに交換した。密集するごとに、細胞を分割比１：３〜１：５で継代した。ＢＡＥＣは、厳重に接触を防止して成長させ、典型的な玉石上形態の単層細胞地を形成させた。細胞密度は７〜９×１０⁴細胞／ｃｍ²であった。
【００６８】
実施例３
潅流システムにおける培養
溶液（無菌）：
− 培養液（特定細胞／ＨＵＶＥＣのためのもの、例１参照）
− Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（細胞培養のための純化水）
【００６９】
器材：
− 小さなペトリ皿、ゼラチン被覆
− ペトリ皿のためのポリカーボネートプラグ
− シリコーンシート
− ピーク（Ｐｅｅｋ）ねじ
− シリコーン管、内径０．５ｍｍ
− マプレン（Ｍａｐｒｅｎｅ）ポンプ管、内径１ｍｍ
− プラグのための取りつけ具を有するアルミニウムプレート
− グレイナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ管）
− ショット（Ｓｃｈｏｔｔ）ビン、登録商標テフロンふたシール付き
【００７０】
手順：
細胞を前述のようにして継代培養した。付着細胞が密集状態に達したら、この細胞を潅流システムに導入することができる。この目的のためのシステムを組み立てた。あらかじめすべての部品を、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水によって完全に洗浄した。完全に組み立てられたシステムを、４０ｍｉｎ間、オートクレーブ処理した。溜め容器は、特殊な登録商標テフロンふたを有するショットビンから成る。このふたは三つの穴を有し、ステンレス鋼管（３ｃｍ、内径１ｍｍ）がこれらの穴を通る。一つの管には、滅菌フィルターが備えてあり、また圧力釣合のために働く。他の二つは培養液の入口と出口を形成する。一つの管は、シリコーン管により、内部に延び、ビン内の培養液に浸漬されるようになっている。ここから、この管は、シリコーン管およびマプレンポンプ管によって、１５ｍｌのグレイナー管までつながっており、このグレイナー管も、同様に、特殊な登録商標テフロンふたによって閉じてあり、該ふたを、二つのステンレス鋼管が貫通している。このグレイナー管は、培養液の予熱のために機能し、また空気泡トラップとして働く。ここから、培養液は、さらなるシリコーン管を通って、プラグおよび該プラグの上側にあるピークコネクターに達する。このプラグは培養のために当該細胞のはいったペトリ皿上に配置される。このプラグは側面をＯリングによってシールされている。特別なカットを施したシリコーンシートがペトリ皿の底面に配置され、細胞のつぶれを防ぐようになっている。このプラグからの出口は、ピークアダプターによってシリコーン管に接続されており、培養液を培養液溜めに戻す。このシステムを始動させる前に、培養液溜め容器とグレイナー管とに予熱された培養液を満たす。ペトリ皿内の培養液は細胞から吸引除去し、シリコーンシートを慎重に内部に配置する。次に、プラグを迅速に押し込むと、システムをぜん動ポンプに取りつけることができる。ポンプ輸送速度は当該細胞の要件にしたがって調節することができる。このポンプ輸送速度は、ポンプ管の内径および選択したポンプ回転数に依存する。無制限で選択できる潅流時間のあと、システムを無菌キャビネット内で分解し、細胞をそのあとの試験のために使用することができる。モジュール設計により、このシステムはいろいろに使用することができる。弁とスイッチを使用することにより、高速液体クロマトグラフィー技術からの物質をあとから導入することができ、また培養液のサンプルを取りだすことができる。さらに、調節した培養液（たとえば、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝剤、１２．５ｍＭ ＮａＣｌ、および０．５ｍＭ 炭酸ナトリウムを含むＩＦ培養液）を使用することにより、培養器の外で作業することもできる。その場合、温度制御のために、ホットプレートまたは加熱チャンバーを使用する。
【００７１】
流れ分割器を使用する実験の場合、もう一枚のシリコーンシートを内部に配置する（図４参照）。そのようにすれば、チャンバー内の流れ特性を変えることができる。
【００７２】
実施例４
コーン−プレート剪断装置による培養
溶液：
− ２００Ｕ／ｍｌのペニシリン、２００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含む培養液
− ７０％（ｖ／ｖ）のエタノール
【００７３】
器材：
− コーン−プレート剪断装置、Ｂｕｓｓｏｌｏｒｉほか（１９８２） Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｉｎｓｔｒｕｍ．５３、１８５１−１８５４
− ゼラチン被覆培養皿（φ＝９４ｍｍ）
【００７４】
手順：
まず、コーン−プレート剪断装置を柔らかい布と７０％のエタノールで洗浄し、コーンを滅菌してから、装置を、加熱キャビネット内で、３７℃で少なくとも３０分間滅菌した。予備培養した細胞を培養液で洗浄してから、０．０６ｍｌ／ｃｍ²の新鮮培養液を加え、培養皿を迅速にコーン−プレート剪断装置に取りつけた。
【００７５】
コーンを粗調節により上昇させ、培養皿をふたと一緒に、慎重に、備えられているホルダーに挿入した。ふたをはずし、コーンを培養皿に向けて下降させ、コーンの先端が細胞地から最小限の距離にあり、かつコーンがこすることなしに動きまわるように、調節した。次に、組み立てたコーン−プレート剪断装置を、細胞の動的培養のために、３７℃の培養器内に置いた。このとき、雰囲気は、５％（ｖ／ｖ）のＣＯ₂を含む水蒸気飽和大気とした。
【００７６】
実施例５
状態調節培養液の調製
溶液（無菌）：
− ＨＵＶＥＣ培養液
【００７７】
器材：
− ＨＵＶＥＣ、密集
− グレイナー管
【００７８】
手順：
実施例１からのＨＵＶＥＣ培養液を、ヒトの臍静脈内皮細胞の密集細胞地に加え、４８〜７２時間状態調節した。次に、この状態調節した培養液を、１０００ｘｇで５分間遠心分離した。使用まで、状態調節培養液を−２０℃で凍結させた。この状態調節ＨＵＶＥＣ培養液を、アポトーシス研究のために使用した。この目的のために、この培養液に、２ｍＭのグルタミンと０．７μｇ／ｍｌのＦＧＦを添加することができる。
【００７９】
実施例６
ＤＡＰＩによるアポトーシス細胞の染色を用いるアポトーシス率の決定
ＤＡＰＩはインドール染料のグループに属し、選択的ＤＮＡ染料である。この染料は３４０〜３６０ｎｍで励起され、放射ピークは４８０ｎｍにある。この染料はアポトーシス研究のために使用される（Ｃｏｈｅｎほか、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、１４、Ｎｏ．３、１２６−１３０（１９９３）参照）。
【００８０】
形態評価：
溶液：
− ＰＢＳ
− ホルムアルデヒド溶液
ＰＢＳに４％（ｖ／ｖ）溶解させたホルムアルデヒド
− ＤＡＰＩ溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ、ライデン、オランダ）
メタノールに２μｇ／ｍｌ溶解させたＤＡＰＩ
【００８１】
器材：
− 培養中の細胞のはいったペトリ皿（３５ｍｍ）
【００８２】
手順：
培養上澄み液をペトリ皿から吸引除去し、細胞地を、氷上で、１５分間、１ｍｌのホルムアルデヒド溶液で固定し、２ｍｌのＰＢＳで２回洗浄し、０．５ｍｌのＤＡＰＩ溶液で１５分間処理し、ＰＢＳで洗浄してから、蛍光顕微鏡下で評価した。ＵＶフィルターセットと２０×または４０×の対物レンズを使用した。５００〜１０００個の細胞を無作為に選択し、アポトーシス核を有する細胞を計数した。
【００８３】
アポトーシス率は下記の式によって計算する。
アポトーシス率（％）＝（アポトーシス細胞の数）／（細胞の総数）
×１００
【００８４】
フローサイトメトリー：
溶液：
− ＰＢＳ
− 培養液
− エタノール（氷冷（−２０℃）分析試薬）
− ＤＡＰＩ緩衝剤
− ＤＡＰＩ貯蔵溶液
− ＤＡＰＩ染色溶液
【００８５】
手順：
培養上澄み液を吸引除去し、細胞をＰＢＳでの洗浄なしでトリプシン処理した。懸濁細胞を培養液中に取りだし、計数してから、８００ｘｇで５分間遠心分離し、沈殿物を、０．５ｍｌのＩＦに再懸濁させ、１．５ｍｌの氷冷エタノールに滴下させた。得られる懸濁液を−２０℃で一晩保存した。あらためて遠心分離し、２ｍｌのＰＢＳにもう一度懸濁させた沈殿物を、３７℃で０．５時間、低温放置し、もう一度遠心分離してから、沈殿物を５ｍｌのＤＡＰＩ溶液にもう一度懸濁させて、フローサイトメーターにより、５０〜３００事象／秒の計数速度で計数した。得られるグラフは、細胞周期のＧ₁期にある細胞の大きなピークを示し、一部の細胞は、Ｓ期にあり（中程度の蛍光強度）、高い蛍光強度の最後のピークは、Ｇ₂期にある細胞を示した。アポトーシス細胞は、細胞あたりのＤＮＡ絶対量の減少のため、副Ｇ₁ピークに現れた（Ｄａｒｚｙｎｋｌｅｗｉｃｚ Ｚ．ほか、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、１３、７９５−８０８（１９９２）；Ｚａｍａｉ Ｌ．ほか、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、１４、８９１−８９７（１９９３））。これは、選択した条件下でアポトーシスが起っていることを示す。
【００８６】
実施例７
細胞内Ｃａ指示薬Ｆｌｕｏ−３ ＡＭ の使用による、細胞内への誘発Ｃａ流入の測定
Ｆｌｕｏ−３はＣａ²⁺と結合したあと蛍光錯体を形成するＣａ指示薬である。エステルＦｌｕｏ−３ ＡＭ は拡散により細胞に取り込まれる。Ｃａ指示薬Ｆｌｕｏ−３は、細胞内でこのエステルが加水分解されたあとにのみ生成される。したがって、細胞外染料エステルは測定を妨げない。測定は通常のフルオレセインフィルターを用いて実施した。励起波長４８８ｎｍ（５００ｎｍ）のとき、放射ピークは５２５ｎｍにあり、Ｃａ結合により、１００（２００）倍に増大した。測定範囲は０．０５〜２０μＭ 遊離Ｃａ²⁺である（Ｍｅｒｒｉｔｔ、Ｊ．Ｅ．ほか、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６９、５１３−５１９（１９９０））。
【００８７】
溶液：
− ＰＢＳ
− 培養液
− Ｆｌｕｏ−３保存溶液
１０μｌのＤＭＳＯジメチルスルホキシド中に５０μｇ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｌｅｉｄｅｎ）（６ｍＭ）
− Ｆｌｕｏ−３ ＡＭの使用濃度
血清を含まない培養液中に３μＭ
【００８８】
器材：
− 培養液中の細胞
【００８９】
手順：
２４ウェルのプレート内の密集ＨＵＶＥＣ細胞地を、血清を含まない培養液で３回洗浄し、培養条件下で、３０分間、Ｆｌｕｏ−３ ＡＭ を含む予熱した血清を含まない培養液で培養して、３回洗浄し、プレートを蛍光計で測定した。まず、装置の感度を調節してから、細胞内のその瞬間のＣａレベルに対応する蛍光値を、１〜１０秒ごとに測定した。測定を実施しながら、細胞に物質を添加することができる。ある物質がＣａレベルに影響を及ぼすならば、それは蛍光値の増大または減少によって知ることができる（図３参照）。この方法によって、Ｃａレベルを評価することができる。Ｃａ流入はアポトーシス発生の初期指標となる。
【００９０】
実施例８
ＴＳＰ−１によって培養した内皮細胞におけるアポトーシスの誘発
細胞を、実施例１と実施例２に述べたようにして培養した。この細胞が完全な密集に達したあと、試験に使用した。まず、トロンボスポンディン１をいろいろな濃度（１〜６００μｇ／ｍｌ）で新鮮な培養液に添加し、ＨＵＶＥＣの自然アポトーシス率に及ぼす状態調節培養液の影響と比較した。下記の表は、トロンボスポンディンの添加がアポトーシス率の有意の増大をもたらすことを示している。この増大は、状態調節培養液で達成しうるものと同程度である。新鮮培養液の添加の場合に観察されるアポトーシスは、実験中に分泌されるトロンボスポンディンによって誘発される。トロンボスポンディンは潅流ＨＵＶＥＣには影響を及ぼさない。アポトーシス率は、ＤＡＰＩによってアポトーシス細胞を染色することによって決定した。
【００９１】
【表３】

【００９２】
アポトーシス率は、実施例６に示すようにしてＤＡＰＩ染色したあと測定した（それぞれの場合について、平均値と標準偏差を示す）。パーセントアポトーシス率は、全細胞カウント数に対するものである。
【００９３】
実施例９
抗アポトーシス活性を有するペプチドまたは蛋白質に関する試験系
細胞を、実施例１および実施例２に述べたようにして培養した。細胞を適当な培養容器に植えつけて（たとえば、２４ウェルプレート；ウェルあたり０．５ｍｌ）、完全な密集に達したあと、試験に使用した。内皮細胞のアポトーシス率に及ぼすいろいろなペプチドと蛋白質の影響に関する研究を実施した（表２）。この目的のために、ペプチドと蛋白質（表４）を培養液（実施例１）に溶解させ、示されている濃度（表４）で使用した。溶解試料を含む培養液を細胞に加え、培養条件（実施例１）下で３日間培養した。次に、細胞をＤＡＰＩによって染色し、実施例６に示すようにしてアポトーシス率を決定した。３回の独立の実験の結果の平均値と標準偏差を、表２にまとめて示す。状態調節培養液、ＴＳＰ−１、および活性ＲＧＤペプチド、ならびにＣＢＤペプチドのアポトーシス誘発効果が明らかである。
【００９４】
細胞内Ｃａの測定値（実施例７）を、初期指標として使用することができる。この目的のために、まず、細胞を実施例７で述べたようにして前処理し、ペプチドまたはＴＳＰ−１の添加時に蛍光計で測定した。ＴＳＰ−１添加または二つのペプチドの同時添加の場合にのみ、細胞内Ｃａレベルの上昇がもたらされた（図３）。新鮮培養液の添加または一つのペプチドのみの添加は、Ｃａレベルに影響を及ぼさない。細胞へのＣａの流入は初期指標として使用することができる。正物質の確認（Ｃａ信号）は、少なくとも２４時間の培養後に、ＤＡＰＩによってアポトーシス率を測定する（実施例６）ことによって、行うことができる。このようにして、抗アポトーシス活性を有する化合物を迅速かつあいまいさなしで識別することができる。
【００９５】
【表４】

【００９６】
実施例１０
本発明の方法を使用した抗アポトーシス活性を有する抗体の識別
細胞を、実施例１および実施例２に述べたようにして培養した。細胞を適当な培養容器に植えつけて（たとえば、２４ウェルプレート；ウェルあたり０．５ｍｌ）、完全な密集に達したあと、試験に使用した。細胞に、次のように、新たに培養液を供給した。（ａ）新鮮培養液（基本アポトーシス率）、（ｂ）状態調節培養液（実施例５）（アポトーシス誘発効果）、（ｃ）ウサギの抗ＴＳＰ−１抗血清を含む状態調節した培養液（１：２０）（アポトーシス誘発およびアポトーシス阻害物質）、（ｄ）ウサギの抗ＴＳＰ−１抗血清を含む新鮮な培養液（１：２０）（アポトーシス阻害物質）、（ｅ）１μｇ／ｍｌのＴＳＰ−１を含む新鮮な培養液（アポトーシス誘発物質）、（ｆ）１μｇ／ｍｌのＴＳＰ−１およびウサギの抗ＴＳＰ−１抗血清を含む新鮮な培養液（１：２０）（アポトーシス誘発およびアポトーシス阻害物質）、（ｇ）モノクローナル抗ＴＳＰ−１抗体を含む新鮮な培養液（１：３０）（アポトーシス阻害物質）。培養条件（実施例１）下での２４時間の培養のあと、細胞を固定し、ＤＡＰＩで染色して、蛍光顕微鏡下で形態を調べるか、またはフローサイトメトリーによって調べた（実施例６）。アポトーシス細胞数と全細胞数とをカウントし、アポトーシス率（アポトーシス細胞の百分率）を算出した。３回の独立の実験のデータの平均値と標準偏差とを表１に示す。
【００９７】
ポリクローナル抗血清（＝抗血清：未精製の、ＴＳＰ−１（ウサギから）に対するポリクローナル抗体；蛋白質濃度：９００μｇ／ｍｌ）による実験とＴＳＰ−１に対するモノクローナル抗体（＝ｍＡｂ：未精製の、ＴＳＰ−１ Ｍ １０１に対するモノクローナル抗体；蛋白質濃度：３００μｇ／ｍｌ）による実験とにおいては、アポトーシス率の有意の低下（＞５０％）が見られ、したがってこれらの物質は、天然のアポトーシス誘発物質（状態調節培養液およびＴＳＰ−１）の阻害剤として使用することができる。したがって、これらの物質は抗アポトーシスであると見なすことができる。抗血清およびモノクローナル抗体は、Ｐ．Ｖｉｓｃｈｅｒ教授（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｕｅｒ Ａｒｔｅｒｉｏｓｋｌｅｒｏｓｅｆｏｒｓｃｈｕｎｇ Ｍｕｅｎｓｔｅｒ）から提供された。
【００９８】
この試験方法は、Ｃａ指示薬Ｆｌｕｏ−３ＡＭを用いて実施することもできる。そのために、細胞を、実施例１および実施例２に述べたようにして、培養した。細胞が完全な密集に達したあと、試験に使用した。細胞にＣａ指示薬を加え（実施例７）、蛍光計内に配置して、測定した。測定中、物質ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、ｇを、細胞に加えた。これらの例のそれぞれには、活性化物質（状態調節培養液またはＴＳＰ−１）が含まれている。例ｂ）とｅ）では、Ｃａ流入があり、したがって測定蛍光値が増大した。例ｃ）、ｆ）、およびｇ）におけるように、同時にアポトーシス誘発物質をも添加すると、この増大は見られなかった。ＴＳＰ−１またはポリクローナル抗血清に対するモノクローナル抗体はＣａの流入を阻止し、したがってアポトーシスの誘発を阻止する。したがって、活性化物質（たとえば、ＴＳＰ−１）と試験すべき物質との同時添加による、アポトーシス阻害物質となる可能性のある物質の迅速な試験方法が確立されたと言える。
【００９９】
アポトーシス阻害剤として使用できる別の二つの抗体を、前記のやり方でこの方法を用いることにより、識別した。すなわち、
１．インテグリンα_vに対するモノクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、Ｎｏ．ＭＡＢ １９６０）、クローン ＶＮＲ １３９（１００μｌ）；使用希釈率１：１００（ｍＡｂ／α_v）
２．ヒトのＩＡＰ（ＣＤ ４７）に対するモノクローナル抗体（ＣＹＭＢＵＳ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から入手。Ｎｏ．ＣＢＬ ４８９）、クローン ＢＲＩＣ １２６、濃度：１００μｇ／ｍｌ；使用希釈率１：１００（１μｇ／ｍｌ）（ｍＡｂ／ＩＡＰ）
【０１００】
細胞が密集に達したあと、抗体を、前記濃度の活性化物質ＴＳＰ−１（１μｇ／ｍｌ）とともに添加した。静置条件下で、４８時間、培養したあと、下記のアポトーシス率が測定された。
【表５】

【０１０１】
【表６】

【０１０２】
実施例１１
Ｃａの錯体形成またはＣａ流入の抑制による、静置培養条件によって誘発されるアポトーシスの抑制
器材（実施例１に加えて）：
− ２．５ｍｍｏｌ／１ ＥＧＴＡを含む培養液
【０１０３】
手順：
細胞は、実施例１に述べたようにして調製し、密集に到達したあと、さらに２４時間、コーン−プレート剪断装置によって培養した（実施例４参照）。培養皿を取りだし、適当なインサートを配置することにより、１２の独立培養ウェル（各ウェルの培養面積は０．８ｃｍ²）に分割した。培養物の半分を、ＥＧＴＡを含む培養液内で培養し、残りの半分をＥＧＴＡを含まない培養液内で培養した。下記の表５によれば、ＥＧＴＡを含む培養液内での培養の結果、アポトーシス率が有意に減少している。すなわち、ＣａがＥＧＴＡと錯体を形成することにより、アポトーシスの阻害がもたらされる。アポトーシス率はアポトーシス細胞をＤＡＰＩで染色することによって決定した。
【０１０４】
【表７】

【０１０５】
アポトーシス率は、基本特許の実施例６に示すような、ＤＡＰＩ染色法を用いて決定した（それぞれの場合について、平均値と標準偏差を示す）。パーセントアポトーシス率は、全細胞カウント数に対するものである。
【０１０６】
実施例１２
Ｃａの錯体形成による、生体活性ペプチドによって誘発されるアポトーシスの抑制器材（実施例４に加えて）：
− 生体活性ペプチドを含む培養液（基本特許の実施例１０、表４と比較されたい）
【０１０７】
手順：
細胞は、実施例１に述べたようにして調製し、完全な密集に到達したあと、さらに２４時間、コーン−プレート剪断装置によって培養した（実施例４参照）。剪断装置から培養皿を取りだし、実施例１１ですでに述べたように、適当なインサートを配置することにより、１２の独立培養ウェルに分割した。一方で、生体活性ペプチドを、０．５ｍＭのＥＧＴＡを含む培養液に溶解し、他方で、ＥＧＴＡを含まない培養液に溶解した（濃度：ＲＧＤペプチド：２５０μｇ／ｍｌ（０．５ｍＭ）；ＩＡＰペプチド：４００μｇ／ｍｌ（０．５ｍＭ））。そのあと、試料の半分を、ＥＧＴＡと活性ペプチドを含む培養液で処理し、残りの半分を、活性ペプチドを含むがＥＧＴＡを含まない培養液で処理した。これらの研究の結果を、下記の表６に示す。
【０１０８】
【表８】

【０１０９】
ＥＧＴＡを含まない培養液に生体活性ペプチドを添加することにより、実験時間の全体にわたって、アポトーシスの著しい増大がもたらされる。活性ペプチドを含む培養液にＥＧＴＡを添加すると、アポトーシス率の有意の低下を実現することができる。
【０１１０】
アポトーシス率は、基本特許の実施例６に示すような、ＤＡＰＩ染色法を用いて決定した（それぞれの場合について、平均値と標準偏差を示す）。パーセントアポトーシス率は、全細胞カウント数に対するものである。
【０１１１】
実施例１３
薬剤組成物における、抗体またはペプチドの活性物質としての使用
実施例９で識別した抗アポトーシス活性を有する化合物、すなわち抗ＴＳＰ−１抗体、モノクローナル抗体ＶＮＲ １３９、モノクローナル抗体ＢＲＩＣ １２６を、薬剤組成物において活性物質として使用することができるであろう。
【０１１２】
これらの抗体を活性物質として、目的に合わせて、下記の処方において３〜５ｍｇ／ｌの濃度で使用した。
− 注射用の水
− ポリソルベート ８０
− リン酸水素二ナトリウム／リン酸二水素ナトリウム
− 塩化ナトリウム
【０１１３】
この組成物は注射用の溶液として投与される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 血清を含まない条件で培養した内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の上澄み液中のトロンボスポンディンの検出を示す。抗トロンボスポンディン抗体によるウエスタンブロット分析。第１列：血清を含まない培養液、第２列：４日間静置状態調節した、血清を含まない培養液、第３列：５００ｎｇのＴＳＰ−１、第４列：３日間動的に状態調節した、血清を含まない培養液。
【図２】 静置および動的培養した内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の上澄み液中の分泌ＴＳＰ−１の定量検出結果を示す。
【図３】 トロンボスポンディンおよび二つの活性ペプチドの使用後の、静置培養液中の内皮細胞の細胞内Ｃａレベルの変化を示す。
【図４】 潅流チャンバーにおける、流れチャンバー内と流れ分割器との形状を示す。内皮細胞は障害物のない領域で成長する。
【図５Ａ】 流れ分割器を使用する実験のための評価格子と、いろいろな流れ条件下にある潅流培養液中でのアポトーシスの発生の位置分解表示とを示す。２日間の潅流培養のあと、各領域について、アポトーシス率を決定した。流れ分割器の背後で、有意のアポトーシス率を検出することができた。アポトーシス率は潅流チャンバー内の位置によって変わる。
【図５Ｂ】 流れ分割器を使用する実験のための評価格子と、いろいろな流れ条件下にある潅流培養液中でのアポトーシスの発生の位置分解表示とを示す。２日間の潅流培養のあと、各領域について、アポトーシス率を決定した。流れ分割器の背後で、有意のアポトーシス率を検出することができた。アポトーシス率は潅流チャンバー内の位置によって変わる。

Claims (6)

1. 抗アポトーシス活性を有する物質を識別する方法であって、
   i）ＩＡＰとインテグリンα_vβ₃との両方を発現する細胞を培養し、
   ii）前記細胞にＴＳＰ−１（トロンボスポンディン−１）を生成させ、かつ／またはＴＳＰ−１、または同じ結合特性を有する類似化合物を加え、
   iii）試験物質を加え、
   iv）アポトーシス率が、それ自体は公知の方法で、ＤＡＰＩ染色、ＴＵＮＥＬ検定、ＤＮＡラダー、アネキシン（ａｎｎｅｘｉｎ）染色によって、または、細胞内への増大したカルシウム流入を測定することによって、決定される、
   ことを特徴とする方法。
2. 使用される細胞が内皮細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 使用される細胞が平滑筋細胞または線維芽細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 使用される細胞が、ＩＡＰとα_vβ₃とを表面に発現する遺伝子的に改変された細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
5. 内皮細胞が、一定の向きの層流が発生しない条件下で培養されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
6. 内皮細胞が、ヒトの臍静脈の内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒトの胎盤内皮細胞（ＨＰＥＣ）、ウシの大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）、ブタの脳の毛細血管内皮細胞（ＰＢＭＥＣ）、ハイブリッド細胞系（ＥＡ．ｈｙ９２６）、およびヒトの微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）であることを特徴とする請求項２に記載の方法。

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