JP2003533182A - ニワトリ感染性貧血ウイルスを単離し、同定し、定量し、かつ増殖させるための、改良された方法および高力価ワクチン - Google Patents
ニワトリ感染性貧血ウイルスを単離し、同定し、定量し、かつ増殖させるための、改良された方法および高力価ワクチンInfo
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、ニワトリ感染性貧血ウイルス(CIAV)を増殖させる方法に関する。本方法は、マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物を提供する段階、およびウイルスを培養物中で増殖させるのに有効な条件下でニワトリ感染性貧血ウイルスを培養物に接種する段階を伴う。本発明はまた、生物試料を提供する段階、マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物を提供する段階、ニワトリ感染性貧血ウイルスを培養物に感染させるのに有効な条件下で培養物を生物試料と共にインキュベートする段階、および培養物中のウイルスを単離、同定または定量する段階を含む、試料中のニワトリ感染性貧血ウイルスを単離、同定および定量する方法に関する。本発明はまた、マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物中で増殖させた免疫学的有効量のニワトリ感染性貧血ウイルスを含む、ニワトリ感染性貧血ウイルス用の高力価ワクチン製剤に関する。本発明の別の局面は、マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物中で増殖させたニワトリ感染性貧血ウイルスから調製した、ウイルスに対する免疫応答を誘導するのに有効量のワクチンを投与する段階を含む、ニワトリ感染性貧血ウイルスに対して家禽を免疫化する方法である。
Description
【０００１】
発明の分野
本発明は、特にワクチンを作製するために、ニワトリ感染性貧血ウイルスを単
離し、同定し、定量し、かつ増殖させる方法に関する。
離し、同定し、定量し、かつ増殖させる方法に関する。
【０００２】
発明の背景
ニワトリ貧血ウイルス(CAV)またはニワトリ貧血物質(CAA)としても知られてい
るニワトリ感染性貧血ウイルス（CIAV）はサーコウイルス科（Circoviridae）群
に属する。CIAVは、マレック病ワクチン接種中断（break）の調査中に1979年に
日本において最初に単離された(Yuasaら、Avian Dis. 23: 266-385(1979))。そ
の時以来、CIAVは、主要な家禽産生国全てにおける市販用家禽において検出され
ている(von Bulowら、「家禽の疾病（Disease of Poultry）」内、第10版、Iowa State University Press、pp. 739-756(1997))。
るニワトリ感染性貧血ウイルス（CIAV）はサーコウイルス科（Circoviridae）群
に属する。CIAVは、マレック病ワクチン接種中断（break）の調査中に1979年に
日本において最初に単離された(Yuasaら、Avian Dis. 23: 266-385(1979))。そ
の時以来、CIAVは、主要な家禽産生国全てにおける市販用家禽において検出され
ている(von Bulowら、「家禽の疾病（Disease of Poultry）」内、第10版、Iowa State University Press、pp. 739-756(1997))。
【０００３】
CIAVは、感受性のある若いニワトリにおいて貧血、出血および免疫抑制によっ
て特徴づけられる臨床疾患を生ずることがある。胸腺および骨髄の萎縮は、CIAV
に感染したニワトリの特徴的で一貫した病変である。胸腺における、および時折
ファブリキウス嚢における、リンパ球欠損は、免疫抑制をもたらし、かつ二次的
なウイルス性、細菌性または真菌性の感染に対する感受性を増加させ、これは疾
患の経過を複雑にする。若いニワトリ（3週齢未満）の感染は、その若いニワト
リがCIAVに対する移行抗体（materal antibody）を持たない場合には、貧血、免
疫抑制、罹病（morbidity）を引き起こし、時には致死を引き起こすこともある
。移行抗体を有するニワトリにおいては、約3週齢で抗体が消失するまで、ウイ
ルスの複製は抑制される。3週齢後は感染はほとんどが不顕性であるが、自然感
染およびワクチン接種に対する最適な免疫応答の発達に影響を与える、サイトカ
イン産生の変化をもたらしうる。免疫抑制は、マレック病ウイルス(MDV)、感染
性ファブリキウス嚢病ウイルス、細網内皮症ウイルス、アデノウイルスまたはレ
オウイルスの内一つ又は複数に感染後、疾患のさらなる悪化を生じうる。MDVの
病原性はCIAVによって増大されることが報告されている(deBoerら、「第38回西
部家禽疾病会議会報（Proceedings of the 38th Western Poultry Diseases Con
ference）」内、p.28、Tempe、Ariz.(1989))。さらに、CIAVは、感染性ファブリ
キウス嚢病の徴候を悪化させることが報告されている（Rosenbergerら、Avian D
is.、33: 707-713(1989)）。また、老齢のニワトリにおけるCIAV不顕性感染はブ
ロイラーの群の性能（performance）の低下に関連がある(McNultyら、Avian Dis
. 35: 263-268(1991))。CIAVは環境的不活性化およびいくつかの一般的な殺菌剤
に対する耐性が大きく、疾患の伝染を強めうる特徴を有する。CIAV感染が家禽産
業へ与える経済的な影響は、疾患大流行時の致死率が10％〜30％であること、ワ
クチン不全における、潜在的な役割および不顕性感染による感染群の性能の低さ
によって反映される。
て特徴づけられる臨床疾患を生ずることがある。胸腺および骨髄の萎縮は、CIAV
に感染したニワトリの特徴的で一貫した病変である。胸腺における、および時折
ファブリキウス嚢における、リンパ球欠損は、免疫抑制をもたらし、かつ二次的
なウイルス性、細菌性または真菌性の感染に対する感受性を増加させ、これは疾
患の経過を複雑にする。若いニワトリ（3週齢未満）の感染は、その若いニワト
リがCIAVに対する移行抗体（materal antibody）を持たない場合には、貧血、免
疫抑制、罹病（morbidity）を引き起こし、時には致死を引き起こすこともある
。移行抗体を有するニワトリにおいては、約3週齢で抗体が消失するまで、ウイ
ルスの複製は抑制される。3週齢後は感染はほとんどが不顕性であるが、自然感
染およびワクチン接種に対する最適な免疫応答の発達に影響を与える、サイトカ
イン産生の変化をもたらしうる。免疫抑制は、マレック病ウイルス(MDV)、感染
性ファブリキウス嚢病ウイルス、細網内皮症ウイルス、アデノウイルスまたはレ
オウイルスの内一つ又は複数に感染後、疾患のさらなる悪化を生じうる。MDVの
病原性はCIAVによって増大されることが報告されている(deBoerら、「第38回西
部家禽疾病会議会報（Proceedings of the 38th Western Poultry Diseases Con
ference）」内、p.28、Tempe、Ariz.(1989))。さらに、CIAVは、感染性ファブリ
キウス嚢病の徴候を悪化させることが報告されている（Rosenbergerら、Avian D
is.、33: 707-713(1989)）。また、老齢のニワトリにおけるCIAV不顕性感染はブ
ロイラーの群の性能（performance）の低下に関連がある(McNultyら、Avian Dis
. 35: 263-268(1991))。CIAVは環境的不活性化およびいくつかの一般的な殺菌剤
に対する耐性が大きく、疾患の伝染を強めうる特徴を有する。CIAV感染が家禽産
業へ与える経済的な影響は、疾患大流行時の致死率が10％〜30％であること、ワ
クチン不全における、潜在的な役割および不顕性感染による感染群の性能の低さ
によって反映される。
【０００４】
CIAVは、直径25nmの、非エンベロープ型の（non-enveloped）小さな正二十面
体ウイルスで、2.3kbの環状1本鎖DNAからなるゲノムを含有する。2つのポリペプ
チドが精製ウイルス調製物中で検出されている：VP1と名づけられた約50キロダ
ルトン(kDa)の主要なポリペプチドおよびVP2と名づけられた24kDaのポリペプチ
ド。これらの2つのポリペプチドは共に、ウイルス中和抗体作製のための主要な
エピトープを形成する。CIAVのいくつかの異なる単離物のゲノムDNA配列が報告
されている。Cux-1単離物はノーテボーン（Noteborn）らに配列決定され(Notebo
rnら、J. Virol. 65: 3131-3139(1991))、51.6kDa、24.0kDaおよび13.6kDaのポ
リペプチドを潜在的にコードする3つのオープンリーディングフレーム（ORF）が
示された。ゲノム中に配置された場合、3つのORFは互いに、部分的または完全に
重複している。ORFの上流にプロモーター-エンハンサー領域が1つだけ存在し、O
RFの下流に1つのポリアデニル化シグナルが存在する。2100塩基のスプライシン
グされていない1つのmRNAがCux-1ゲノムから転写される(Notebornら、Gene 118:
267-271(1992))。別の研究グループもまたCux-1株を配列決定したが、彼らの配
列データとノーテボーン（Noteborn）らのデータには違いが見られた（Mechanら
、Arch. Viol. 124: 301-319(1992))。Cux-1の配列と比較した場合、米国におい
て単離された26P4株のヌクレオチド配列もまた、数多くのヌクレオチドの差異を
示した(Claessensら、J. Gen. Virol. 72: 2003-2006(1991))。世界中からの種
々の単離物中でヌクレオチド配列の違いが見出されているにもかかわらず、アミ
ノ酸配列のごくわずかな違いしか注目されていない。このため、CIAVは高く保存
されているウイルスであると推測されている。
体ウイルスで、2.3kbの環状1本鎖DNAからなるゲノムを含有する。2つのポリペプ
チドが精製ウイルス調製物中で検出されている：VP1と名づけられた約50キロダ
ルトン(kDa)の主要なポリペプチドおよびVP2と名づけられた24kDaのポリペプチ
ド。これらの2つのポリペプチドは共に、ウイルス中和抗体作製のための主要な
エピトープを形成する。CIAVのいくつかの異なる単離物のゲノムDNA配列が報告
されている。Cux-1単離物はノーテボーン（Noteborn）らに配列決定され(Notebo
rnら、J. Virol. 65: 3131-3139(1991))、51.6kDa、24.0kDaおよび13.6kDaのポ
リペプチドを潜在的にコードする3つのオープンリーディングフレーム（ORF）が
示された。ゲノム中に配置された場合、3つのORFは互いに、部分的または完全に
重複している。ORFの上流にプロモーター-エンハンサー領域が1つだけ存在し、O
RFの下流に1つのポリアデニル化シグナルが存在する。2100塩基のスプライシン
グされていない1つのmRNAがCux-1ゲノムから転写される(Notebornら、Gene 118:
267-271(1992))。別の研究グループもまたCux-1株を配列決定したが、彼らの配
列データとノーテボーン（Noteborn）らのデータには違いが見られた（Mechanら
、Arch. Viol. 124: 301-319(1992))。Cux-1の配列と比較した場合、米国におい
て単離された26P4株のヌクレオチド配列もまた、数多くのヌクレオチドの差異を
示した(Claessensら、J. Gen. Virol. 72: 2003-2006(1991))。世界中からの種
々の単離物中でヌクレオチド配列の違いが見出されているにもかかわらず、アミ
ノ酸配列のごくわずかな違いしか注目されていない。このため、CIAVは高く保存
されているウイルスであると推測されている。
【０００５】
現在、CIAVがニワトリ感染性貧血を引き起こす過程はほとんど理解されていな
い。CIA-1株を1日齢の感受性のあるニワトリに導入すると、CIA-1は、低ヘマト
クリット値、骨髄中の赤血球およびリンパ系細胞の欠乏、胸腺の髄質および皮質
のリンパ系細胞の欠乏（本明細書ではT細胞と呼ばれる）ならびに肝臓、心臓お
よび腎臓の炎症性変化を含む、ニワトリ感染性貧血に特徴的な徴候および病変を
生ずる(Lucioら、Avian Dis. 34: 146-153(1990))。CIAV ORFによってコードさ
れる一つ又は複数のポリペプチドは、感受性細胞への侵入を促進すること、およ
び/またはT細胞アポトーシスを開始することによって、ニワトリ感染性貧血の発
生に役割を果たしうる。
い。CIA-1株を1日齢の感受性のあるニワトリに導入すると、CIA-1は、低ヘマト
クリット値、骨髄中の赤血球およびリンパ系細胞の欠乏、胸腺の髄質および皮質
のリンパ系細胞の欠乏（本明細書ではT細胞と呼ばれる）ならびに肝臓、心臓お
よび腎臓の炎症性変化を含む、ニワトリ感染性貧血に特徴的な徴候および病変を
生ずる(Lucioら、Avian Dis. 34: 146-153(1990))。CIAV ORFによってコードさ
れる一つ又は複数のポリペプチドは、感受性細胞への侵入を促進すること、およ
び/またはT細胞アポトーシスを開始することによって、ニワトリ感染性貧血の発
生に役割を果たしうる。
【０００６】
雌鳥をCIAVに曝露すると、子孫におけるCIAV感染を防御する助けとなりうる移
行抗体がニワトリ内で誘導されうる。しかし、任意のCIAV株を用いたこのような
ワクチン接種は、（卵を介する）垂直感染および環境汚染の可能性を含む本質的
な問題を有する。従って、CIAVに関連する精製ポリペプチドを免疫原として有す
るワクチンを開発することが望ましい。
行抗体がニワトリ内で誘導されうる。しかし、任意のCIAV株を用いたこのような
ワクチン接種は、（卵を介する）垂直感染および環境汚染の可能性を含む本質的
な問題を有する。従って、CIAVに関連する精製ポリペプチドを免疫原として有す
るワクチンを開発することが望ましい。
【０００７】
CIAVが1979年に最初に単離されたとき（Yuasaら、「ヒナにおいて貧血を誘導
する物質の単離およびいくつかの特徴付け（Isolation and Some Characteristi
cs of an Agent Inducing Anemia in Chicks）」、Avian Dis. 23: 366-385(197
9)）、唯一の増殖方法はヒナ（chick）接種によるものであった。その後、CIAV
のGifu株がユアサ（Yuasa）らによって見出され、(Yuasa、「マレック病リンパ
腫由来の細胞系(MDCC-MSB1)におけるニワトリ貧血物質のGifu-1株の増殖および
感染性力価測定（Propagation and Infectivity Titration of the Gifu-1 Stra
in of Chicken Anemia Agent in a Cell Line (MDCC-MSB1) Derived From Marek
's Disease Lymphoma）」、Nat. Inst. Anim. Health O. 23: 13-20(1983))、2
つのリンパ芽球腫（lymphoblastoid）細胞系であるマレック病細胞培養物(MDCC)
-MSB1(MSB1)(Akiyamaら、「マレック病リンパ腫由来の二つの細胞系（Two Cell
Lines From Lymphomas of Marek's Disease）」、Biken J. 17:105-116(1974))
およびMDCC-JP2(Yamaguchiら、「B型のBABKを有するニワトリ由来のマレック病
リンパ芽球細胞系の確立（Establishment of Marek's Disease Lymphoblastoid
Cell Lines from Chickens with BABK of B Blood Groups）」、Biken J. 22: 3
5-40(1979))ならびにリンパ芽球腫トリ白血病ウイルス形質転換細胞系、LSCC-11
04X5(Hiharaら、「トリリンパ球白血症を有するニワトリから培養された腫瘍細
胞系の確立（Establishment of Tumor Cell Lines Cultured From Chickens Wit
h Avian Lymphoid Leukosis）」、Nat. Inst. Anim. Health O. 14: 163-173(19
74))内で複製された。他の2つのマレック病細胞系であるMDCC-RP1(Nazerianら、
「マレック病移植可能腫瘍由来の非産生Tリンパ芽球細胞系（A Nonproducer T L
ymphoblastoid Cell Line From Marek's Disease Transplantable Tumor(JMV)）
」、Avian Dis. 21: 69-76(1977))およびMDCC-BP1(Yuasa、「マレック病リンパ
腫由来の細胞系(MDCC-MSB1)におけるニワトリ貧血物質のGifu-1株の増殖および
感染性力価測定（Propagation and Infectivity Titration of the Gifu-1 Stra
in of Chicken Anemia Agent in a Cell Line(MDCC-MSB1) Derived From Marek'
s Disease Lymphoma）」、Nat. Inst. Anim. health Q. 23: 13-20(1983))、な
らびに1つのリンパ系白血病系、LSCC-TLT-1(current terminology: LSCC-CU 10)
(Calnekら、「初期リンパ腫に対する移植可能性からのマレック病リンパ芽球細
胞系の確立（Establishment of Marek's Disease Lymphoblastoid Cell Lines F
rom Transplanable Versus Primary Lymphomas）」、Int. J. Cancer 21: 100-1
97(1978))は、明らかにウイルスの増殖を支持できなかった。さらに最近の報告(
Chandratillekeら、「モノクローナル抗体を用いたニワトリ感染性貧血ウイルス
のタンパク質の特徴付け（Characterization of Proteins of Chicken Infectio
us Anemia Virus with Monoclonal Antibodies）」、Avian Dis. 35: 854-862(1
991) およびRenshawら、「ニワトリ感染性貧血ウイルスのVP1における超可変部
は、組織培養における蔓延および細胞屈性の速度に影響を与える（A Hypervaria
ble Region in VP1 of Chicken Infectious Anemia Virus Mediates Rate of Sp
read and Cell Tropism in Tissue Culture）」、J. Virology 70: 8872-8878(1
996))により、MDCC-CU22(Calnekら、「マレック病腫瘍細胞系における自発的か
つ誘導性のヘルペスウイルスゲノム発現（Spontaneous and Induced Herpesviru
s Genome Expression in Marek's Disease Tumor Cell Lines）」、Infect. Imm
un. 34: 483-491(1981))などのその他のMD細胞系および細網内皮症ウイルス形質
転換T細胞系であるRECC-CU205(Schatら、「細網内皮症ウイルス形質転換リンパ
芽球細胞系の安定なトランスフェクション（Stable Transfection of Reticuloe
ndotheliosis Virus-Transformed Lymphoblastoid Cell Lines）」、Avian Dis.
36: 432-439(1992))もまた、一つ又は複数のCIAVの株に感受性であることが示
唆されている。ウイルスはまた、ニワトリ胚内でも増殖することができる(von B
ulowら、「Chicken Vermehrung des Erregers der Aviaren Infektiosen Anamie
(CAA) in Embryonierten Huhnereiem）」、J. Vet. Med. B 33:664-669(1986))
。
する物質の単離およびいくつかの特徴付け（Isolation and Some Characteristi
cs of an Agent Inducing Anemia in Chicks）」、Avian Dis. 23: 366-385(197
9)）、唯一の増殖方法はヒナ（chick）接種によるものであった。その後、CIAV
のGifu株がユアサ（Yuasa）らによって見出され、(Yuasa、「マレック病リンパ
腫由来の細胞系(MDCC-MSB1)におけるニワトリ貧血物質のGifu-1株の増殖および
感染性力価測定（Propagation and Infectivity Titration of the Gifu-1 Stra
in of Chicken Anemia Agent in a Cell Line (MDCC-MSB1) Derived From Marek
's Disease Lymphoma）」、Nat. Inst. Anim. Health O. 23: 13-20(1983))、2
つのリンパ芽球腫（lymphoblastoid）細胞系であるマレック病細胞培養物(MDCC)
-MSB1(MSB1)(Akiyamaら、「マレック病リンパ腫由来の二つの細胞系（Two Cell
Lines From Lymphomas of Marek's Disease）」、Biken J. 17:105-116(1974))
およびMDCC-JP2(Yamaguchiら、「B型のBABKを有するニワトリ由来のマレック病
リンパ芽球細胞系の確立（Establishment of Marek's Disease Lymphoblastoid
Cell Lines from Chickens with BABK of B Blood Groups）」、Biken J. 22: 3
5-40(1979))ならびにリンパ芽球腫トリ白血病ウイルス形質転換細胞系、LSCC-11
04X5(Hiharaら、「トリリンパ球白血症を有するニワトリから培養された腫瘍細
胞系の確立（Establishment of Tumor Cell Lines Cultured From Chickens Wit
h Avian Lymphoid Leukosis）」、Nat. Inst. Anim. Health O. 14: 163-173(19
74))内で複製された。他の2つのマレック病細胞系であるMDCC-RP1(Nazerianら、
「マレック病移植可能腫瘍由来の非産生Tリンパ芽球細胞系（A Nonproducer T L
ymphoblastoid Cell Line From Marek's Disease Transplantable Tumor(JMV)）
」、Avian Dis. 21: 69-76(1977))およびMDCC-BP1(Yuasa、「マレック病リンパ
腫由来の細胞系(MDCC-MSB1)におけるニワトリ貧血物質のGifu-1株の増殖および
感染性力価測定（Propagation and Infectivity Titration of the Gifu-1 Stra
in of Chicken Anemia Agent in a Cell Line(MDCC-MSB1) Derived From Marek'
s Disease Lymphoma）」、Nat. Inst. Anim. health Q. 23: 13-20(1983))、な
らびに1つのリンパ系白血病系、LSCC-TLT-1(current terminology: LSCC-CU 10)
(Calnekら、「初期リンパ腫に対する移植可能性からのマレック病リンパ芽球細
胞系の確立（Establishment of Marek's Disease Lymphoblastoid Cell Lines F
rom Transplanable Versus Primary Lymphomas）」、Int. J. Cancer 21: 100-1
97(1978))は、明らかにウイルスの増殖を支持できなかった。さらに最近の報告(
Chandratillekeら、「モノクローナル抗体を用いたニワトリ感染性貧血ウイルス
のタンパク質の特徴付け（Characterization of Proteins of Chicken Infectio
us Anemia Virus with Monoclonal Antibodies）」、Avian Dis. 35: 854-862(1
991) およびRenshawら、「ニワトリ感染性貧血ウイルスのVP1における超可変部
は、組織培養における蔓延および細胞屈性の速度に影響を与える（A Hypervaria
ble Region in VP1 of Chicken Infectious Anemia Virus Mediates Rate of Sp
read and Cell Tropism in Tissue Culture）」、J. Virology 70: 8872-8878(1
996))により、MDCC-CU22(Calnekら、「マレック病腫瘍細胞系における自発的か
つ誘導性のヘルペスウイルスゲノム発現（Spontaneous and Induced Herpesviru
s Genome Expression in Marek's Disease Tumor Cell Lines）」、Infect. Imm
un. 34: 483-491(1981))などのその他のMD細胞系および細網内皮症ウイルス形質
転換T細胞系であるRECC-CU205(Schatら、「細網内皮症ウイルス形質転換リンパ
芽球細胞系の安定なトランスフェクション（Stable Transfection of Reticuloe
ndotheliosis Virus-Transformed Lymphoblastoid Cell Lines）」、Avian Dis.
36: 432-439(1992))もまた、一つ又は複数のCIAVの株に感受性であることが示
唆されている。ウイルスはまた、ニワトリ胚内でも増殖することができる(von B
ulowら、「Chicken Vermehrung des Erregers der Aviaren Infektiosen Anamie
(CAA) in Embryonierten Huhnereiem）」、J. Vet. Med. B 33:664-669(1986))
。
【０００８】
成熟ヘルパーTリンパ球(CD3+、CD4+、CD8-、TCR2+)(Adairら、「実験的に感染
させたニワトリにおいて、ニワトリ貧血ウイルスに感染した細胞表面に存在する
マーカーの特徴付け（Characterization of Surface Markers Present on Cells
Infected by Chicken Anemia Virus in Experimentally Infected Chickens）
」、Avian Dis. 37: 943-950(1993))として特徴付けられるMSB1細胞は、CIAVの
インビトロにおける単離、増殖および滴定のために使用される最も一般的に報告
されている基質である(von Bulowら、「ニワトリ感染性貧血（Chicken Infectio
us Anemia）」、Diseases of Poultry、第10版、Iowa State University Press
、pp. 739-756(1997)およびMcNulty、「ニワトリ貧血物質：総説（Chicken Anae
mia Agent: a Review）」、Avian Pathol. 20: 187-203(1991))。MSB1培養物の
感染の基準は、細胞変性効果、および免疫蛍光(IF)試験または他の方法によるウ
イルス抗原の検出を含む。これらの細胞は、CIAVの多くの株を用いたインビトロ
感染のための好ましい基質であると思われるが、いくつかのウイルス株はMSB1の
ある亜系に感染しないか、またはごくわずかにしか感染しないことが報告されて
いる。例えば、Cux-1(von Bulowら、「Fruhsterblichkeitssyndrom bei Kuken n
ach Doppelinfektion mit dem Virus der Marekshen Krankheit(MDV) und einem
Anami-Erreger(CAA)）」、Veterinaermed Reihe B 30: 742-750(1983))、CIA-1
(Lucioら、「ニワトリ貧血物質の同定、疾病の再現、および米国における血清学
的調査（Identification of the Chicken Anemia Agent, Reproduction of the
Disease, and Serological Survey in the United States）」、Avian Dis. 34:
146-153(1990))およびL-208(Renshawら、「ニワトリ感染性貧血ウイルスのVP1
における超可変部は、組織培養における蔓延および細胞屈性の速度に影響を与え
る（A Hypervariable Region in VP1 of Chicken Infectious Anemia Virus Med
iates Rate of Spread and Cell Tropism in Tissue Culture）」、J. Virology
70: 8872-8878(1996))は全て、MSB1の1つの亜系であるMSB1(S)において複製す
ることが見出されているが、Cux-1だけは第二の亜系であるMSB1(L)において複製
し、次いで少ない程度であるがMSB1(S)において複製することが見出されている
。さらに、株CIA-1は、MSB1(S)細胞においてCux-1より増殖が遅かった。ルシオ
（Lucio）らによる1992年の予備的な報告において(Lucio-Martinezら、「ニワト
リ感染性貧血ウイルスに対するトリ細胞系の比較感受性（概論）（Comparative
Susceptibility of Avian Cell Lines to Chicken Infectious Anemia Virus(ab
stract)）」、Proc, 129th Ann. Meet. Amer. Vet. Med. Assoc. Boston、MA(19
92))において、C細胞系内にはCIAV感受性における実質的な差が存在すると思わ
れ、CIAVのCux-1株に対していくつかの系はMSB1(L)より感受性であると思われる
。
させたニワトリにおいて、ニワトリ貧血ウイルスに感染した細胞表面に存在する
マーカーの特徴付け（Characterization of Surface Markers Present on Cells
Infected by Chicken Anemia Virus in Experimentally Infected Chickens）
」、Avian Dis. 37: 943-950(1993))として特徴付けられるMSB1細胞は、CIAVの
インビトロにおける単離、増殖および滴定のために使用される最も一般的に報告
されている基質である(von Bulowら、「ニワトリ感染性貧血（Chicken Infectio
us Anemia）」、Diseases of Poultry、第10版、Iowa State University Press
、pp. 739-756(1997)およびMcNulty、「ニワトリ貧血物質：総説（Chicken Anae
mia Agent: a Review）」、Avian Pathol. 20: 187-203(1991))。MSB1培養物の
感染の基準は、細胞変性効果、および免疫蛍光(IF)試験または他の方法によるウ
イルス抗原の検出を含む。これらの細胞は、CIAVの多くの株を用いたインビトロ
感染のための好ましい基質であると思われるが、いくつかのウイルス株はMSB1の
ある亜系に感染しないか、またはごくわずかにしか感染しないことが報告されて
いる。例えば、Cux-1(von Bulowら、「Fruhsterblichkeitssyndrom bei Kuken n
ach Doppelinfektion mit dem Virus der Marekshen Krankheit(MDV) und einem
Anami-Erreger(CAA)）」、Veterinaermed Reihe B 30: 742-750(1983))、CIA-1
(Lucioら、「ニワトリ貧血物質の同定、疾病の再現、および米国における血清学
的調査（Identification of the Chicken Anemia Agent, Reproduction of the
Disease, and Serological Survey in the United States）」、Avian Dis. 34:
146-153(1990))およびL-208(Renshawら、「ニワトリ感染性貧血ウイルスのVP1
における超可変部は、組織培養における蔓延および細胞屈性の速度に影響を与え
る（A Hypervariable Region in VP1 of Chicken Infectious Anemia Virus Med
iates Rate of Spread and Cell Tropism in Tissue Culture）」、J. Virology
70: 8872-8878(1996))は全て、MSB1の1つの亜系であるMSB1(S)において複製す
ることが見出されているが、Cux-1だけは第二の亜系であるMSB1(L)において複製
し、次いで少ない程度であるがMSB1(S)において複製することが見出されている
。さらに、株CIA-1は、MSB1(S)細胞においてCux-1より増殖が遅かった。ルシオ
（Lucio）らによる1992年の予備的な報告において(Lucio-Martinezら、「ニワト
リ感染性貧血ウイルスに対するトリ細胞系の比較感受性（概論）（Comparative
Susceptibility of Avian Cell Lines to Chicken Infectious Anemia Virus(ab
stract)）」、Proc, 129th Ann. Meet. Amer. Vet. Med. Assoc. Boston、MA(19
92))において、C細胞系内にはCIAV感受性における実質的な差が存在すると思わ
れ、CIAVのCux-1株に対していくつかの系はMSB1(L)より感受性であると思われる
。
【０００９】
本発明は、ニワトリ感染性貧血ウイルスを単離し、同定し、定量し、かつ増殖
させる際の従来技術における欠点を克服することに関する。
させる際の従来技術における欠点を克服することに関する。
【００１０】
発明の概要
本発明は、ニワトリ感染性貧血ウイルスを増殖させる方法に関する。本方法は
、マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物を提供する段階および、培養物中でウ
イルスを増殖させるのに有効な条件下で培養物にニワトリ感染性貧血ウイルスを
接種する段階を伴う。
、マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物を提供する段階および、培養物中でウ
イルスを増殖させるのに有効な条件下で培養物にニワトリ感染性貧血ウイルスを
接種する段階を伴う。
【００１１】
本発明はまた、試料からニワトリ感染性貧血ウイルスを単離する方法に関する
。本方法は、ニワトリ感染性貧血ウイルスに感染した生物試料を提供する段階、
マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物を提供する段階、ウイルスを培養物に感
染させるのに有効な条件下で培養物を生物試料と共にインキュベートする段階、
および培養物からウイルスを単離する段階を伴う。
。本方法は、ニワトリ感染性貧血ウイルスに感染した生物試料を提供する段階、
マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物を提供する段階、ウイルスを培養物に感
染させるのに有効な条件下で培養物を生物試料と共にインキュベートする段階、
および培養物からウイルスを単離する段階を伴う。
【００１２】
本発明の別の局面は、試料中のニワトリ感染性貧血ウイルスを同定する方法で
ある。本方法は、ニワトリ感染性貧血ウイルスを潜在的に含む生物試料を提供す
る段階、マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物を提供する段階、生物試料中に
存在する任意のウイルスを培養物に感染させるのに有効な条件下で培養物と生物
試料をインキュベートする段階、および培養物中の任意のウイルスの存在を同定
する段階を伴う。
ある。本方法は、ニワトリ感染性貧血ウイルスを潜在的に含む生物試料を提供す
る段階、マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物を提供する段階、生物試料中に
存在する任意のウイルスを培養物に感染させるのに有効な条件下で培養物と生物
試料をインキュベートする段階、および培養物中の任意のウイルスの存在を同定
する段階を伴う。
【００１３】
本発明のさらに別の局面は、試料中のニワトリ感染性貧血ウイルスを定量する
方法である。本発明は、ある量のニワトリ感染性貧血ウイルスを含有する生物試
料を提供する段階、マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物を提供する段階、ウ
イルスを培養物に感染させるのに有効な条件下で培養物と生物試料をインキュベ
ートする段階、および培養物中のウイルスの量を滴定する段階を伴う。
方法である。本発明は、ある量のニワトリ感染性貧血ウイルスを含有する生物試
料を提供する段階、マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物を提供する段階、ウ
イルスを培養物に感染させるのに有効な条件下で培養物と生物試料をインキュベ
ートする段階、および培養物中のウイルスの量を滴定する段階を伴う。
【００１４】
本発明はまた、マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物中で増殖した免疫学的
有効量のニワトリ感染性貧血ウイルスを含む、ニワトリ感染性貧血ウイルス用の
高力価ワクチン製剤に関する。
有効量のニワトリ感染性貧血ウイルスを含む、ニワトリ感染性貧血ウイルス用の
高力価ワクチン製剤に関する。
【００１５】
本発明の別の局面は、マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物中で増殖したニ
ワトリ感染性貧血ウイルスから調製された、ウイルスに対する免疫応答を誘導す
るのに有効量のワクチンを投与する段階を含む、ニワトリ感染性貧血ウイルスに
対して家禽を免疫化する方法である。
ワトリ感染性貧血ウイルスから調製された、ウイルスに対する免疫応答を誘導す
るのに有効量のワクチンを投与する段階を含む、ニワトリ感染性貧血ウイルスに
対して家禽を免疫化する方法である。
【００１６】
本発明の方法を、従来技術の方法よりも高力価までウイルスを複製するために
使用することができる。また、ワクチンを産生するための本発明の方法の使用に
より、ウイルスの収率が改良され、従って、ワクチン産生が改良される。さらに
、本発明の方法を、診断アッセイ法に使用される高収率のウイルスおよびウイル
ス抗原を調製するために使用することができる。
使用することができる。また、ワクチンを産生するための本発明の方法の使用に
より、ウイルスの収率が改良され、従って、ワクチン産生が改良される。さらに
、本発明の方法を、診断アッセイ法に使用される高収率のウイルスおよびウイル
ス抗原を調製するために使用することができる。
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、ニワトリ感染性貧血ウイルス(CIAV)を増殖させる方法に関する。本
方法は、マレック病ニワトリ細胞系-CU147(MDCC-CU147)培養物(ATCCアクセッシ
ョン番号PTA-1476)を提供する段階、および培養物中でウイルスを増殖させるの
に有効な条件下で培養物にニワトリ感染性貧血ウイルスを接種する段階を伴う。
方法は、マレック病ニワトリ細胞系-CU147(MDCC-CU147)培養物(ATCCアクセッシ
ョン番号PTA-1476)を提供する段階、および培養物中でウイルスを増殖させるの
に有効な条件下で培養物にニワトリ感染性貧血ウイルスを接種する段階を伴う。
【００１８】
CIAVの好適なウイルス株には、CIA-1株(GenBankアクセッション番号L14767、
これは参照として本明細書に組み入れられている）、Cux-1株（GenBankアクセッ
ション番号M55918、これは参照として本明細書に組み入れられている)、Gifu株(
Yuasa、「マレック病リンパ腫由来の細胞系(MDCC-MSB1)におけるニワトリ貧血物
質のGifu-1株の増殖および感染性力価測定（Propagation and Infectivity Titr
ation of the Gifu-1 Strain of Chicken Anemia Agent in a Cell LIne (MDCC-
MSB1) Derived From Marek's Disease Lymphoma）」、Nat. Inst. Anim. Health
Q. 23: 13-20(1983)、これは参照として本明細書に組み入れられている)、TK-5
803株(Goryoら、「MDCC-MSB1細胞系におけるニワトリ貧血物質の連続的増殖およ
び精製（Serial Propagation and Purification of Chicken Anaemia Agent in
MDCC-MSB1 Cell Line）」、Avian Pathology 16:149-163(1987)、これは参照と
して本明細書に組み入れられている)、CAA82-2株(Otakiら、「シチメンチョウヘ
ルペスウイルスをワクチン接種したニワトリおよび両物質の接種によりヒナにお
いて誘導された病変からの、ニワトリ貧血物質およびマレック病ウイルスの単離
（Isolation of Chicken Anaemia Agent and Marek's Disease Virus from Chic
kens Vaccinated with Turkey Herpesvirus and Lesions Induced in Chicks by
Inoculation Both Agents）」、Avian Pathology 16: 291-306(1987)、これは
参照として本明細書に組み入れられている)、L-028株(ORF1: GenBankアクセッシ
ョン番号U69549、これは参照として本明細書に組み入れられている)、Conn株(Co
nnB: ORF1: GenBankアクセッション番号U69548、これは参照として本明細書に組
み入れられている)、GA株(Goodwinら、「パルボウイルス様ウイルス（ヒナにお
いて感染性貧血を引き起こす、いわゆるヒナ貧血物質（CAA)）の単離および同定
（Isolation and Identification of a Parvovirus-Like Virus(The So-Called
Chick Anemia Agent(CAA) that Causes Infectious Anemia in Chicks）」、Pro
c. 38th Western Poultry Disease Conference、Tenpe、Arizona、pp. 21-23(19
89)、これは参照として本明細書に組み入れられている）、26P4株(GenBankアク
セッション番号I-1141、これは参照として本明細書に組み入れられている)、SR4
3株(Zhouら、「中国におけるニワトリ感染性貧血ウイルスの単離および同定（Is
olation and Identification of Chicken Infectious Anemia Virus in China）
」、Avian Diseases 41: 361-364(1997)、これは参照として本明細書に組み入れ
られている)およびCL-1株(Lamichhanceら、「CL-1ニワトリ貧血物質の病原性（P
athogenicity of CL-1 Chicken Anemia Agent）」、Avian Diseases 35: 515-52
2(1991)、これは参照として本明細書に組み入れられている)が含まれるが、これ
らに限定されない。
これは参照として本明細書に組み入れられている）、Cux-1株（GenBankアクセッ
ション番号M55918、これは参照として本明細書に組み入れられている)、Gifu株(
Yuasa、「マレック病リンパ腫由来の細胞系(MDCC-MSB1)におけるニワトリ貧血物
質のGifu-1株の増殖および感染性力価測定（Propagation and Infectivity Titr
ation of the Gifu-1 Strain of Chicken Anemia Agent in a Cell LIne (MDCC-
MSB1) Derived From Marek's Disease Lymphoma）」、Nat. Inst. Anim. Health
Q. 23: 13-20(1983)、これは参照として本明細書に組み入れられている)、TK-5
803株(Goryoら、「MDCC-MSB1細胞系におけるニワトリ貧血物質の連続的増殖およ
び精製（Serial Propagation and Purification of Chicken Anaemia Agent in
MDCC-MSB1 Cell Line）」、Avian Pathology 16:149-163(1987)、これは参照と
して本明細書に組み入れられている)、CAA82-2株(Otakiら、「シチメンチョウヘ
ルペスウイルスをワクチン接種したニワトリおよび両物質の接種によりヒナにお
いて誘導された病変からの、ニワトリ貧血物質およびマレック病ウイルスの単離
（Isolation of Chicken Anaemia Agent and Marek's Disease Virus from Chic
kens Vaccinated with Turkey Herpesvirus and Lesions Induced in Chicks by
Inoculation Both Agents）」、Avian Pathology 16: 291-306(1987)、これは
参照として本明細書に組み入れられている)、L-028株(ORF1: GenBankアクセッシ
ョン番号U69549、これは参照として本明細書に組み入れられている)、Conn株(Co
nnB: ORF1: GenBankアクセッション番号U69548、これは参照として本明細書に組
み入れられている)、GA株(Goodwinら、「パルボウイルス様ウイルス（ヒナにお
いて感染性貧血を引き起こす、いわゆるヒナ貧血物質（CAA)）の単離および同定
（Isolation and Identification of a Parvovirus-Like Virus(The So-Called
Chick Anemia Agent(CAA) that Causes Infectious Anemia in Chicks）」、Pro
c. 38th Western Poultry Disease Conference、Tenpe、Arizona、pp. 21-23(19
89)、これは参照として本明細書に組み入れられている）、26P4株(GenBankアク
セッション番号I-1141、これは参照として本明細書に組み入れられている)、SR4
3株(Zhouら、「中国におけるニワトリ感染性貧血ウイルスの単離および同定（Is
olation and Identification of Chicken Infectious Anemia Virus in China）
」、Avian Diseases 41: 361-364(1997)、これは参照として本明細書に組み入れ
られている)およびCL-1株(Lamichhanceら、「CL-1ニワトリ貧血物質の病原性（P
athogenicity of CL-1 Chicken Anemia Agent）」、Avian Diseases 35: 515-52
2(1991)、これは参照として本明細書に組み入れられている)が含まれるが、これ
らに限定されない。
【００１９】
MDCC-CU147細胞系などの細胞系を、当業者に周知の数多くの技法によって提供
することができる。特に、MDCC-CU147細胞系は、ニワトリにおいて誘導されたマ
レック病リンパ腫に由来しうる。腫瘍を誘導するために使用することができるウ
イルス株には、低発癌性株CU-2(Smithら、「マレック病における抗体産生に対す
るウイルス病原性の影響（Effect of Virus Pathogenicity on Antibodey Produ
ction in Marek's Disease）」、Avian Dis. 17: 727-736(1873)、これは参照と
して本明細書に組み入れられている)；中程度の発癌性株BC-1(Murthyら、「マレ
ック病の病原：感染ニワトリにおけるマレック病腫瘍関連表面抗原の早期出現（
Pathogenesis of Marek's Disease: Early Appearance of Marek's Disease Tum
or-Associated Surface Antigen in Infected Chiskens）」、J. Natl. Cancer
Inst. 61: 849-854(1978)、これは参照として本明細書に組み入れられている)、
ConnB(Jakowskiら、「ニワトリ内のマレック病ウイルスにおける造血破壊（Hema
topoietic Destruction in Marek's Disease viruses in Chickens）」、Avian
Dis. 14: 374-385(1970)、これは参照として本明細書に組み入れられている)お
よびJM-10(Calnek、「マレック病の病原体への曝露における年齢の影響（Influe
nce of Age at Exposure on the Pathogenesis of Marek's Disease）」、J. Na
tl. Cancer Inst. 51：929-939(1973)、これは参照として本明細書に組み入れら
れている)；高発癌性株GA-5(Calnek、「マレック病の病原体への曝露における年
齢の影響（Influence of Age at Exposure on the Pathogenesis of Marek's Di
sease）」、J. Natl. Cancer Inst. 51: 929-939(1973)、これは参照として本明
細書に組み入れられている)；および超高発癌性株RB-1B(Schatら、「遺伝的耐性
の評価におけるマレック病の発癌性の影響（Influence of Oncogenicity of Mar
ek's Disease Virus on Evaluation of Genetic Resistance）」、Poult. Sci.
60: 2559-2566(1981)、これは参照として本明細書に組み入れられている)が挙げ
られる。
することができる。特に、MDCC-CU147細胞系は、ニワトリにおいて誘導されたマ
レック病リンパ腫に由来しうる。腫瘍を誘導するために使用することができるウ
イルス株には、低発癌性株CU-2(Smithら、「マレック病における抗体産生に対す
るウイルス病原性の影響（Effect of Virus Pathogenicity on Antibodey Produ
ction in Marek's Disease）」、Avian Dis. 17: 727-736(1873)、これは参照と
して本明細書に組み入れられている)；中程度の発癌性株BC-1(Murthyら、「マレ
ック病の病原：感染ニワトリにおけるマレック病腫瘍関連表面抗原の早期出現（
Pathogenesis of Marek's Disease: Early Appearance of Marek's Disease Tum
or-Associated Surface Antigen in Infected Chiskens）」、J. Natl. Cancer
Inst. 61: 849-854(1978)、これは参照として本明細書に組み入れられている)、
ConnB(Jakowskiら、「ニワトリ内のマレック病ウイルスにおける造血破壊（Hema
topoietic Destruction in Marek's Disease viruses in Chickens）」、Avian
Dis. 14: 374-385(1970)、これは参照として本明細書に組み入れられている)お
よびJM-10(Calnek、「マレック病の病原体への曝露における年齢の影響（Influe
nce of Age at Exposure on the Pathogenesis of Marek's Disease）」、J. Na
tl. Cancer Inst. 51：929-939(1973)、これは参照として本明細書に組み入れら
れている)；高発癌性株GA-5(Calnek、「マレック病の病原体への曝露における年
齢の影響（Influence of Age at Exposure on the Pathogenesis of Marek's Di
sease）」、J. Natl. Cancer Inst. 51: 929-939(1973)、これは参照として本明
細書に組み入れられている)；および超高発癌性株RB-1B(Schatら、「遺伝的耐性
の評価におけるマレック病の発癌性の影響（Influence of Oncogenicity of Mar
ek's Disease Virus on Evaluation of Genetic Resistance）」、Poult. Sci.
60: 2559-2566(1981)、これは参照として本明細書に組み入れられている)が挙げ
られる。
【００２０】
さらに、MDCC-CU147細胞系などの細胞系を、参照として本明細書に組み入れら
れている、カトウ（Kato）ら編、「マレック病研究の発展（Advances in Marek'
s Disease Research）」内、カルネック（Calnek）ら、「マレック病ウイルス誘
導性局所病変の病原体 2.ウイルス株および宿主表現型の影響（Pathogenesis of
Marek's Disease Virus-Induced Local Lesions. 2. Influence of Virus Stra
in and Host Genotype）」、Gapanses Association on Marek's Disease、Osaka
、Japan、pp. 324-330(1988) およびカルネック（Calnek） ら、「マレック病ウ
イルス誘導性局所病変の病原体 1.病変の特徴付けおよび細胞系の確立（Pathoge
nesis of Marek's Disease Virus-Induced Local Lesions.1.Lesion Characteri
zation and Cell Line Establishment）」、Avian Dis. 33: 291-301(1989)に記
載されているように、マレック病ウイルスおよび同種抗原によって誘導された早
期局所病変から確立することができる。
れている、カトウ（Kato）ら編、「マレック病研究の発展（Advances in Marek'
s Disease Research）」内、カルネック（Calnek）ら、「マレック病ウイルス誘
導性局所病変の病原体 2.ウイルス株および宿主表現型の影響（Pathogenesis of
Marek's Disease Virus-Induced Local Lesions. 2. Influence of Virus Stra
in and Host Genotype）」、Gapanses Association on Marek's Disease、Osaka
、Japan、pp. 324-330(1988) およびカルネック（Calnek） ら、「マレック病ウ
イルス誘導性局所病変の病原体 1.病変の特徴付けおよび細胞系の確立（Pathoge
nesis of Marek's Disease Virus-Induced Local Lesions.1.Lesion Characteri
zation and Cell Line Establishment）」、Avian Dis. 33: 291-301(1989)に記
載されているように、マレック病ウイルスおよび同種抗原によって誘導された早
期局所病変から確立することができる。
【００２１】
MDCC-CU147細胞系の培養物の調製および維持は、当業者に周知の技法によって
実施することができる。例えば、培養物をプラスチックフラスコまたは24ウェル
プラスチックプレート内の、LM Hahn培地またはライボビッツ（Leinbovitz's）L
-15-マッコイ（McCoy's）5A培地などの適当な培地に250,000細胞/mlの密度で播
種し(Calnekら、「マレック病腫瘍細胞系における自発的かつ誘導性のヘルペス
ウイルスゲノム発現（Spontaneous and Induced Herpesvirus Genome Expressio
n in Marek's Disease Tumor Cell Lines）」、Infect. Immun. 34:483-491(198
1)、これは参照として本明細書に組み入れられている)、次いで例えば、5％CO2
雰囲気下において約40℃〜41℃においてインキュベートすることができる。
実施することができる。例えば、培養物をプラスチックフラスコまたは24ウェル
プラスチックプレート内の、LM Hahn培地またはライボビッツ（Leinbovitz's）L
-15-マッコイ（McCoy's）5A培地などの適当な培地に250,000細胞/mlの密度で播
種し(Calnekら、「マレック病腫瘍細胞系における自発的かつ誘導性のヘルペス
ウイルスゲノム発現（Spontaneous and Induced Herpesvirus Genome Expressio
n in Marek's Disease Tumor Cell Lines）」、Infect. Immun. 34:483-491(198
1)、これは参照として本明細書に組み入れられている)、次いで例えば、5％CO2
雰囲気下において約40℃〜41℃においてインキュベートすることができる。
【００２２】
好ましい態様において、接種は培養物1mlあたり未希釈ウイルス約20μlから、
培養物1mlあたり未希釈ウイルス約100μlのレベルである。
培養物1mlあたり未希釈ウイルス約100μlのレベルである。
【００２３】
本発明の方法において、MDCC-CU147を用いて、MSB-1の亜系においてよりも高
力価まで、CIAVを複製することができる（以下の実施例における表2、表3、およ
び表4を参照されたい）。同様の表現型（表1および表3）を有するその他の細胞
系はCIAVを用いた感染およびCIAVの複製物に対する感受性が非常に低かったため
、これらの結果は、MDCC-CU147の表現型に基づいては予想されなかった。また、
その他の細胞系（例えばMSB-1）の代わりにMDCC-CU147をCIAVワクチン作製用に
用いることにより、ワクチン作製およびその他の目的でMDCC-CU147を用いる任意
の企業に対する競合的利点を提供するような、ウイルス収量の改良がもたらされ
る。特に、MDCC-CU147を用いることにより、診断アッセイ法に用いることのでき
る高収量のウイルスおよびウイルス抗原が産生される。
力価まで、CIAVを複製することができる（以下の実施例における表2、表3、およ
び表4を参照されたい）。同様の表現型（表1および表3）を有するその他の細胞
系はCIAVを用いた感染およびCIAVの複製物に対する感受性が非常に低かったため
、これらの結果は、MDCC-CU147の表現型に基づいては予想されなかった。また、
その他の細胞系（例えばMSB-1）の代わりにMDCC-CU147をCIAVワクチン作製用に
用いることにより、ワクチン作製およびその他の目的でMDCC-CU147を用いる任意
の企業に対する競合的利点を提供するような、ウイルス収量の改良がもたらされ
る。特に、MDCC-CU147を用いることにより、診断アッセイ法に用いることのでき
る高収量のウイルスおよびウイルス抗原が産生される。
【００２４】
本発明はまた、試料からニワトリ感染性貧血ウイルスを単離する方法に関する
。本方法は、ニワトリ感染性貧血ウイルスに感染した生物試料を提供する段階、
マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物を提供する段階、ウイルスを培養物に感
染させるのに有効な条件下で培養物を生物試料と共にインキュベートする段階、
および培養物からウイルスを単離する段階を伴う。
。本方法は、ニワトリ感染性貧血ウイルスに感染した生物試料を提供する段階、
マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物を提供する段階、ウイルスを培養物に感
染させるのに有効な条件下で培養物を生物試料と共にインキュベートする段階、
および培養物からウイルスを単離する段階を伴う。
【００２５】
好適な生物試料は、血液、粘膜擦過物、精液、組織生検、胚組織、分泌物およ
び排泄物ならびに体液のぬぐい液を含む。
び排泄物ならびに体液のぬぐい液を含む。
【００２６】
ウイルスを、当業者に周知の方法を使用して培養物の感染細胞から単離するこ
とができる。特に、ウイルスを、感染細胞とMDCC-CU147細胞系の同時培養によっ
て感染細胞から単離することができ、または超音波処理、遠心分離および凍結融
解などの任意の典型的なウイルス抽出法によって得られた感染細胞の抽出物から
単離することができ、または分泌物、排泄物もしくはその他の体液のぬぐい液か
ら単離することができる。
とができる。特に、ウイルスを、感染細胞とMDCC-CU147細胞系の同時培養によっ
て感染細胞から単離することができ、または超音波処理、遠心分離および凍結融
解などの任意の典型的なウイルス抽出法によって得られた感染細胞の抽出物から
単離することができ、または分泌物、排泄物もしくはその他の体液のぬぐい液か
ら単離することができる。
【００２７】
本発明の別の局面は、試料中のニワトリ感染性貧血ウイルスを同定する方法で
ある。本方法は、ニワトリ感染性貧血ウイルスを潜在的に含む生物試料を提供す
る段階、マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物を提供する段階、生物試料に存
在する任意のウイルスを培養物に感染させるのに有効な条件下で培養物と生物試
料をインキュベートする段階、および培養物中の任意のウイルスの存在を同定す
る段階を伴う。
ある。本方法は、ニワトリ感染性貧血ウイルスを潜在的に含む生物試料を提供す
る段階、マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物を提供する段階、生物試料に存
在する任意のウイルスを培養物に感染させるのに有効な条件下で培養物と生物試
料をインキュベートする段階、および培養物中の任意のウイルスの存在を同定す
る段階を伴う。
【００２８】
培養物中のウイルスの存在を同定するため、すなわち、培養物中のウイルスタ
ンパク質の存在を示すための好適な方法は、ウイルスタンパク質の1つに対する
モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体(von Bulowら、Diseases of Po
ultry内、第10版、Iowa State University Press、pp. 739-756(1997)、これは
参照として本明細書に組み入れられている)、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、もし
くは入れ子状態の（nested）PCR(Soineら、Avian Diseases 37: 467-476(1993)
、これは参照として本明細書に組み入れられている)、ELISA(von Bulowら、「家
禽の疾病（Diseases of Poultry）」内、第10版、Iowa State University Press
、pp. 739-756(1997)、これは参照として本明細書に組み入れられている)、ウイ
ルス中和、または特異的なウイルスタンパク質を同定する任意の一般的な組織化
学的方法を使用してもよい、免疫蛍光試験を含む。
ンパク質の存在を示すための好適な方法は、ウイルスタンパク質の1つに対する
モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体(von Bulowら、Diseases of Po
ultry内、第10版、Iowa State University Press、pp. 739-756(1997)、これは
参照として本明細書に組み入れられている)、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、もし
くは入れ子状態の（nested）PCR(Soineら、Avian Diseases 37: 467-476(1993)
、これは参照として本明細書に組み入れられている)、ELISA(von Bulowら、「家
禽の疾病（Diseases of Poultry）」内、第10版、Iowa State University Press
、pp. 739-756(1997)、これは参照として本明細書に組み入れられている)、ウイ
ルス中和、または特異的なウイルスタンパク質を同定する任意の一般的な組織化
学的方法を使用してもよい、免疫蛍光試験を含む。
【００２９】
本発明の試料においてニワトリ感染性貧血ウイルスを同定する方法は、診断試
験の開発に特に適用可能である。特に、培養物中のウイルスの存在が同定された
ら、ウイルスタンパク質を培養物から抽出し、例えば、ELISA、免疫蛍光技法お
よびPCR技法のような診断試験の基質として使用することができる。
験の開発に特に適用可能である。特に、培養物中のウイルスの存在が同定された
ら、ウイルスタンパク質を培養物から抽出し、例えば、ELISA、免疫蛍光技法お
よびPCR技法のような診断試験の基質として使用することができる。
【００３０】
本発明のさらに別の局面は、試料中のニワトリ感染性貧血ウイルスを定量する
方法である。本発明の方法は、ある量のニワトリ感染性貧血ウイルスを含有する
生物試料を提供する段階、マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物を提供する段
階、培養物中でウイルスを複製するのに有効な条件下で培養物と生物試料をイン
キュベートする段階、および培養物のウイルスの量を滴定する段階を伴う。
方法である。本発明の方法は、ある量のニワトリ感染性貧血ウイルスを含有する
生物試料を提供する段階、マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物を提供する段
階、培養物中でウイルスを複製するのに有効な条件下で培養物と生物試料をイン
キュベートする段階、および培養物のウイルスの量を滴定する段階を伴う。
【００３１】
培養物中のウイルス量の滴定を、参照として本明細書に組み入れられている、
パーチャス（Purchase）ら編、「トリ病原体の単離および同定のための実験室マ
ニュアル（A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Av
ian Pathogens）」、第3版内、ビレガス（Villegas）ら、「生物懸濁液の滴定（
Titration of Biological Suspensions）」、Kendall/Hunt Publishing Co.、Du
buque、Iowa、pp. 186-190(1989)に記載されているように、当技術上周知の技法
によって実施することができる。
パーチャス（Purchase）ら編、「トリ病原体の単離および同定のための実験室マ
ニュアル（A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Av
ian Pathogens）」、第3版内、ビレガス（Villegas）ら、「生物懸濁液の滴定（
Titration of Biological Suspensions）」、Kendall/Hunt Publishing Co.、Du
buque、Iowa、pp. 186-190(1989)に記載されているように、当技術上周知の技法
によって実施することができる。
【００３２】
本発明はまた、マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物中で増殖したニワトリ
感染性貧血ウイルスの免疫学的有効量を含むニワトリ感染性貧血ウイルス用の高
力価製剤に関する。
感染性貧血ウイルスの免疫学的有効量を含むニワトリ感染性貧血ウイルス用の高
力価製剤に関する。
【００３３】
CIAVを、MDCC-CU147培養物中で少なくとも5×107組織培養物感染量-50パーセ
ント（TCID50）の力価まで培養することができる。
ント（TCID50）の力価まで培養することができる。
【００３４】
本発明の一つの態様は生ワクチンである。生弱毒ワクチン（live attenuated
）は当技術上周知の方法によって作製することができる。例えば、生弱毒ワクチ
ンを、適当な細胞培養物、例えば、MDCC-CU147培養物中でCIAVを継代して増殖さ
せ、次に発育鶏卵中でその後増殖させてかつ継代培養することによって作製する
ことができる（参照として本明細書に組み入れられている、Schrierらに付与さ
れた米国特許第5,728,569号参照）。生弱毒CIAV株を含有する本発明のワクチン
を、本質的に周知の方法で懸濁液の形態または凍結乾燥産物として作製し、出荷
することができる。
）は当技術上周知の方法によって作製することができる。例えば、生弱毒ワクチ
ンを、適当な細胞培養物、例えば、MDCC-CU147培養物中でCIAVを継代して増殖さ
せ、次に発育鶏卵中でその後増殖させてかつ継代培養することによって作製する
ことができる（参照として本明細書に組み入れられている、Schrierらに付与さ
れた米国特許第5,728,569号参照）。生弱毒CIAV株を含有する本発明のワクチン
を、本質的に周知の方法で懸濁液の形態または凍結乾燥産物として作製し、出荷
することができる。
【００３５】
本発明の別の態様は、MDCC-CU147培養物中で増殖させた不活性化CIAVの1つ又
は複数の単離物を含む不活性化ワクチンである。
は複数の単離物を含む不活性化ワクチンである。
【００３６】
本発明のワクチンに使用するためのCIAVの不活性化（ウイルス再生をさせなく
するため）を、一般に、化学的または物理的手段によって達成することができる
(参照として本明細書に組み入れられている、Schrierに付与された米国特許第5,
728,569号参照)。化学的不活性化は、例えば、酵素、ホルムアルデヒド、β-プ
ロピオラクトン、エチレン-イミンまたはそれらの誘導体でウイルスを処理する
ことによって達成できる。必要ならば、不活性化が完了した後で不活性化化合物
を中和することができる。例えば、ホルムアルデヒドで不活性化させた材料を、
チオ硫酸塩で中和することができる。物理的な不活性化は、例えば、UV光、X線
またはγ線のような高エネルギー照射にウイルスをさらすことによって実施する
ことができる。望ましい場合には、処理後pHを約7にすることができる。
するため）を、一般に、化学的または物理的手段によって達成することができる
(参照として本明細書に組み入れられている、Schrierに付与された米国特許第5,
728,569号参照)。化学的不活性化は、例えば、酵素、ホルムアルデヒド、β-プ
ロピオラクトン、エチレン-イミンまたはそれらの誘導体でウイルスを処理する
ことによって達成できる。必要ならば、不活性化が完了した後で不活性化化合物
を中和することができる。例えば、ホルムアルデヒドで不活性化させた材料を、
チオ硫酸塩で中和することができる。物理的な不活性化は、例えば、UV光、X線
またはγ線のような高エネルギー照射にウイルスをさらすことによって実施する
ことができる。望ましい場合には、処理後pHを約7にすることができる。
【００３７】
本発明のワクチンが、CIAVに対する免疫応答を誘導するのに十分な用量が投与
される（参照として本明細書に組み入れられている、Schrierに付与された米国
特許第5,728,569号参照）。
される（参照として本明細書に組み入れられている、Schrierに付与された米国
特許第5,728,569号参照）。
【００３８】
本発明のワクチンを、経口的に、非経口的に、皮下的に、静脈内で、筋肉内で
、腹腔内で、鼻腔内滴下により、腔内滴下によりもしくは嚢内滴下により、眼内
で、動脈内で、病巣内でまたは鼻、喉および気管支などの粘膜への塗布によって
投与することができる。それらは単独で投与してもよく、または薬学的もしくは
生理学的に許容されうる担体、賦形剤もしくは安定剤と共に投与してもよく、粉
末、溶液、懸濁液またはエマルジョンなどの固体または液体の形態であってもよ
い。
、腹腔内で、鼻腔内滴下により、腔内滴下によりもしくは嚢内滴下により、眼内
で、動脈内で、病巣内でまたは鼻、喉および気管支などの粘膜への塗布によって
投与することができる。それらは単独で投与してもよく、または薬学的もしくは
生理学的に許容されうる担体、賦形剤もしくは安定剤と共に投与してもよく、粉
末、溶液、懸濁液またはエマルジョンなどの固体または液体の形態であってもよ
い。
【００３９】
本発明のマレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物中で増殖したCIAVを、生理学
的に許容されうる希釈剤中のこれらの材料の溶液または懸濁液として薬学的担体
と共に注射可能用量で投与してもよい。このような担体は、界面活性剤ならびに
、アジュバント、賦形剤または安定剤を含む、他の薬学的かつ生理学的に許容さ
れうる担体を添加したまたは添加しない、水およびオイルなどの滅菌液体を含む
。例示的なオイルは、石油、動物、植物または合成起源のものであり、例えば、
落花生油、大豆油または鉱物油である。一般に、水、生理食塩液、デキストロー
ス水溶液および関連する糖溶液ならびにプロピレングリコールまたはポリエチレ
ングリコールなどのグリコールが、特に注射用溶液に好ましい液体担体である。
的に許容されうる希釈剤中のこれらの材料の溶液または懸濁液として薬学的担体
と共に注射可能用量で投与してもよい。このような担体は、界面活性剤ならびに
、アジュバント、賦形剤または安定剤を含む、他の薬学的かつ生理学的に許容さ
れうる担体を添加したまたは添加しない、水およびオイルなどの滅菌液体を含む
。例示的なオイルは、石油、動物、植物または合成起源のものであり、例えば、
落花生油、大豆油または鉱物油である。一般に、水、生理食塩液、デキストロー
ス水溶液および関連する糖溶液ならびにプロピレングリコールまたはポリエチレ
ングリコールなどのグリコールが、特に注射用溶液に好ましい液体担体である。
【００４０】
エアゾールとして使用するためには、本発明のマレック病ニワトリ細胞系-CU1
47培養物中で増殖されたCIAV溶液または懸濁液を、好適なプロペラント、例えば
、プロパン、ブタンまたはイソブタンのような炭化水素プロペラントおよび従来
のアジュバントと共に加圧エアゾール容器に充填することができる。本発明の材
料はまた、ネブライザーまたはアトマイザーなどの非加圧形態で投与することも
できる。
47培養物中で増殖されたCIAV溶液または懸濁液を、好適なプロペラント、例えば
、プロパン、ブタンまたはイソブタンのような炭化水素プロペラントおよび従来
のアジュバントと共に加圧エアゾール容器に充填することができる。本発明の材
料はまた、ネブライザーまたはアトマイザーなどの非加圧形態で投与することも
できる。
【００４１】
上記のように、安定剤をワクチン組成物に添加することができる。好適な安定
剤はSPGA(Bavarnikら、J. Bacteriology、59: 509-522(1950)、これは参照とし
て本明細書に組み入れられている）、炭水化物(ソルビトール、マンニトール、
デンプン、ショ糖、デキストランまたはグルコースなど)、タンパク質（アルブ
ミンまたはカゼインなど）またはそれらの分解生成物、および緩衝液(アルカリ
金属リン酸塩など)を含む。
剤はSPGA(Bavarnikら、J. Bacteriology、59: 509-522(1950)、これは参照とし
て本明細書に組み入れられている）、炭水化物(ソルビトール、マンニトール、
デンプン、ショ糖、デキストランまたはグルコースなど)、タンパク質（アルブ
ミンまたはカゼインなど）またはそれらの分解生成物、および緩衝液(アルカリ
金属リン酸塩など)を含む。
【００４２】
また、好適なアジュバントをワクチン製剤に添加することができる。アジュバ
ント活性を有する好適な化合物は、ビタミンEアセテート水中油型（oil-in-wate
r）エマルジョン、水酸化アルミニウム、リン酸塩または酸化物、鉱物油（例え
ば、BAYOL（登録商標）およびMARCOL（登録商標）)およびサポニンを含む。
ント活性を有する好適な化合物は、ビタミンEアセテート水中油型（oil-in-wate
r）エマルジョン、水酸化アルミニウム、リン酸塩または酸化物、鉱物油（例え
ば、BAYOL（登録商標）およびMARCOL（登録商標）)およびサポニンを含む。
【００４３】
TWEEN（登録商標）およびSPAN（登録商標）などの乳化剤もまた、ワクチン製
剤に添加することができる。
剤に添加することができる。
【００４４】
本発明によるワクチンは、MDCC-CU147培養物中で増殖させたCIAVおよび1つ又
は複数の非関連トリウイルスの組み合わせを含有してもよい。好適な非関連トリ
ウイルスは、ニューキャッスル病ウイルス(「NDV」)、感染性気管支炎ウイルス(
「IBV」)(ATCCアクセッション番号VR-21、VR-22、VR-817およびVR-841)、感染性
ファブリキウス嚢病ウイルス(IBVD)(ATCCアクセッション番号VR-478、VR-2041お
よびVR-2161)、マレック病ウイルス(「MDV」)(ATCCアクセッション番号VR-585、
VR-624、VR-987、VR-2001、VR-2002、VR-2103、VR-2175、VR-2176およびVR-2260
)、シチメンチョウヘルペスウイルス(「HVT」)(ATCCアクセッション番号VR-584B
)、感染性喉頭気管炎ウイルス(ATCCアクセッション番号VR-783)または他のトリ
ヘルペス、レオウイルス、産卵低下症候群ウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス(ATC
Cアクセッション番号VR-7173およびVR-2058)、細網内皮症ウイルス(ATCCアクセ
ッション番号VR-770、VR-994、45011、45012、45013、および45158)、白血症ウ
イルス(ATCCアクセッション番号VR-247、335、VR-658およびVR-773)、鶏痘ウイ
ルス(ATCCアクセッション番号VR-229、VR-249、VR-250およびVR-251)、シチメン
チョウ鼻気管炎ウイルス(「TRTV」)、アデノウイルスおよびトリインフルエンザ
ウイルス(ATCCアクセッション番号VR-40)を含む。
は複数の非関連トリウイルスの組み合わせを含有してもよい。好適な非関連トリ
ウイルスは、ニューキャッスル病ウイルス(「NDV」)、感染性気管支炎ウイルス(
「IBV」)(ATCCアクセッション番号VR-21、VR-22、VR-817およびVR-841)、感染性
ファブリキウス嚢病ウイルス(IBVD)(ATCCアクセッション番号VR-478、VR-2041お
よびVR-2161)、マレック病ウイルス(「MDV」)(ATCCアクセッション番号VR-585、
VR-624、VR-987、VR-2001、VR-2002、VR-2103、VR-2175、VR-2176およびVR-2260
)、シチメンチョウヘルペスウイルス(「HVT」)(ATCCアクセッション番号VR-584B
)、感染性喉頭気管炎ウイルス(ATCCアクセッション番号VR-783)または他のトリ
ヘルペス、レオウイルス、産卵低下症候群ウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス(ATC
Cアクセッション番号VR-7173およびVR-2058)、細網内皮症ウイルス(ATCCアクセ
ッション番号VR-770、VR-994、45011、45012、45013、および45158)、白血症ウ
イルス(ATCCアクセッション番号VR-247、335、VR-658およびVR-773)、鶏痘ウイ
ルス(ATCCアクセッション番号VR-229、VR-249、VR-250およびVR-251)、シチメン
チョウ鼻気管炎ウイルス(「TRTV」)、アデノウイルスおよびトリインフルエンザ
ウイルス(ATCCアクセッション番号VR-40)を含む。
【００４５】
本発明の別の局面は、マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物中で増殖したニ
ワトリ感染性貧血ウイルスから調製された、ウイルスに対する免疫応答を誘導す
るのに有効量のワクチンを投与する段階を含む、ニワトリ感染性貧血ウイルスに
対して家禽を免疫化する方法である。
ワトリ感染性貧血ウイルスから調製された、ウイルスに対する免疫応答を誘導す
るのに有効量のワクチンを投与する段階を含む、ニワトリ感染性貧血ウイルスに
対して家禽を免疫化する方法である。
【００４６】
本方法は、生ワクチンまたは弱毒化ワクチンの投与を含む。
【００４７】
実施例実施例1
-細胞系の調製
MSB1(S)およびMSB1(L)はすでに記載されている(Renshawら、「ニワトリ感染性
貧血ウイルスのVP1における超可変部は、組織培養における蔓延および細胞屈性
の速度に影響を与える（A Hypervariable Region in VP1 of Chicken Infectiou
s Anemia Virus Mediates Rate of Spread and Cell Tropism in Tissue Cultur
e）」、J. Virology 70: 8872-8878(1996)、これは参照として本明細書に組み入
れられている)。簡単に説明すると、「S」亜系（未知の継代レベル）をG.ティリ
ー（Thiry）、ソルベーアニマルヘルス（Solvay Animal Health）、メンドサヘ
イツ（Mendota Heights）、MNより入手した一方、「L」亜系を、R.L. ウィッタ
ー（Witter）、USDA動物疾病および腫瘍学実験室（Animal Disease and Oncolog
y Laboratory）、E. ランシング（Lansing）、MIから継代96代目として受け取っ
た。使用したMSB1(S)培養物を、受領後、約26日間〜58日間培養(DIC)して実験室
内で維持した(X+26DIC〜X+58DIC)。MSB1(L)細胞を122代目〜367代目継代培養物
として使用した。
貧血ウイルスのVP1における超可変部は、組織培養における蔓延および細胞屈性
の速度に影響を与える（A Hypervariable Region in VP1 of Chicken Infectiou
s Anemia Virus Mediates Rate of Spread and Cell Tropism in Tissue Cultur
e）」、J. Virology 70: 8872-8878(1996)、これは参照として本明細書に組み入
れられている)。簡単に説明すると、「S」亜系（未知の継代レベル）をG.ティリ
ー（Thiry）、ソルベーアニマルヘルス（Solvay Animal Health）、メンドサヘ
イツ（Mendota Heights）、MNより入手した一方、「L」亜系を、R.L. ウィッタ
ー（Witter）、USDA動物疾病および腫瘍学実験室（Animal Disease and Oncolog
y Laboratory）、E. ランシング（Lansing）、MIから継代96代目として受け取っ
た。使用したMSB1(S)培養物を、受領後、約26日間〜58日間培養(DIC)して実験室
内で維持した(X+26DIC〜X+58DIC)。MSB1(L)細胞を122代目〜367代目継代培養物
として使用した。
【００４８】
MDCC-CU12、MDCC-CU14、MDCC-CU32およびMDCC-CU36(Calnekら、「マレック病
腫瘍細胞系における自発的かつ誘導性のヘルペスウイルスゲノム発現（Spontane
ous and Induced Herpesvirus Genome Expression in Marek's Disease Tumor C
ell Lines）」、Infect. Immun. 34: 483-491(1981)、これは参照として本明細
書に組み入れられている)をマレック病(MD)リンパ腫から得て、それぞれ、90、1
50、115および115DIC後に使用した。他の細胞系は全て、マレック病ウイルス（M
DV）および同種抗原によって誘導された早期局所病変から確立した(Calnekら、
「マレック病ウイルス誘導性局所病変の病原体 1.病変の特徴付けおよび細胞系
の確立（Pathogenesis of Marek's Disease Virus-Induced Local Lesions. 1.
Lesion Characterization and Cell Line Establishment）」、Avian Dis. 33:
291-302(1989)およびSchatら、「マレック病ヘルペスウイルスによるTリンパ球
サブセットの形質転換（Transformation of T-Lymphocyte Subsets by Marek's
Disease Herpesvirus）」、J. Virology 65: 1408-1413(1991)、これは参照とし
て本明細書に組み入れられている)。これらの系は全て同じ遺伝子型であり、す
なわちS-13ニワトリ(B13B13)由来であり（Schatら、「ナチュラルキラー活性を
有するトリリンパ球の培養および特徴付け（Cultivation and Characterization
of Avian Lymphocytes with Natural Killer Activity）」、Avian Pathol. 15
:539-556(1986)、これは参照として本明細書に組み入れられている）、MDVのGA-
5株に感染した（Calnek、「マレック病の病原体への曝露における年齢の影響（I
nfluence of Age at Exposure on the Pathogenesis of Marek's Disease）」、
J. Nat. Cancer Inst.、51: 929-939(1973)、これは参照として本明細書に組み
入れられている）。これらを21〜131DIC後に使用した。全ての細胞系および表面
マーカーの特徴を以下の表1に列挙する。
腫瘍細胞系における自発的かつ誘導性のヘルペスウイルスゲノム発現（Spontane
ous and Induced Herpesvirus Genome Expression in Marek's Disease Tumor C
ell Lines）」、Infect. Immun. 34: 483-491(1981)、これは参照として本明細
書に組み入れられている)をマレック病(MD)リンパ腫から得て、それぞれ、90、1
50、115および115DIC後に使用した。他の細胞系は全て、マレック病ウイルス（M
DV）および同種抗原によって誘導された早期局所病変から確立した(Calnekら、
「マレック病ウイルス誘導性局所病変の病原体 1.病変の特徴付けおよび細胞系
の確立（Pathogenesis of Marek's Disease Virus-Induced Local Lesions. 1.
Lesion Characterization and Cell Line Establishment）」、Avian Dis. 33:
291-302(1989)およびSchatら、「マレック病ヘルペスウイルスによるTリンパ球
サブセットの形質転換（Transformation of T-Lymphocyte Subsets by Marek's
Disease Herpesvirus）」、J. Virology 65: 1408-1413(1991)、これは参照とし
て本明細書に組み入れられている)。これらの系は全て同じ遺伝子型であり、す
なわちS-13ニワトリ(B13B13)由来であり（Schatら、「ナチュラルキラー活性を
有するトリリンパ球の培養および特徴付け（Cultivation and Characterization
of Avian Lymphocytes with Natural Killer Activity）」、Avian Pathol. 15
:539-556(1986)、これは参照として本明細書に組み入れられている）、MDVのGA-
5株に感染した（Calnek、「マレック病の病原体への曝露における年齢の影響（I
nfluence of Age at Exposure on the Pathogenesis of Marek's Disease）」、
J. Nat. Cancer Inst.、51: 929-939(1973)、これは参照として本明細書に組み
入れられている）。これらを21〜131DIC後に使用した。全ての細胞系および表面
マーカーの特徴を以下の表1に列挙する。
【００４９】
【表１】 細胞系の表現型の特徴A
Aモノクローナル抗体を用いた間接的免疫蛍光試験に基づいた分類。B
以前にCD4+/CD8-、TCR2と分類された（Schatら、「マレック病ヘルペスウイル
スによるTリンパ球サブセットの形質転換（Transformation of T-lymphocyte Su
bsets by Marek's Disease Herpesvirus）」、J. Virology 65: 1408-1413(1991
)、これは参照として本明細書に組み入れられている）。C 以前にCD4-/CD8+、TCR3と分類された（Schatら、「マレック病ヘルペスウイル
スによるTリンパ球サブセットの形質転換（Transformation of T-lymphocyte Su
bsets by Marek's Disease Herpesvirus）」、J. Virology 65: 1408-1413(1991
)、これは参照として本明細書に組み入れられている）。D 以前にCD4-/CD8-、TCR2と分類された（Schatら、「マレック病ヘルペスウイル
スによるTリンパ球サブセットの形質転換（Transformation of T-lymphocyte Su
bsets by Marek's Disease Herpesvirus）」、J. Virology 65: 1408-1413(1991
)、これは参照として本明細書に組み入れられている）。
スによるTリンパ球サブセットの形質転換（Transformation of T-lymphocyte Su
bsets by Marek's Disease Herpesvirus）」、J. Virology 65: 1408-1413(1991
)、これは参照として本明細書に組み入れられている）。C 以前にCD4-/CD8+、TCR3と分類された（Schatら、「マレック病ヘルペスウイル
スによるTリンパ球サブセットの形質転換（Transformation of T-lymphocyte Su
bsets by Marek's Disease Herpesvirus）」、J. Virology 65: 1408-1413(1991
)、これは参照として本明細書に組み入れられている）。D 以前にCD4-/CD8-、TCR2と分類された（Schatら、「マレック病ヘルペスウイル
スによるTリンパ球サブセットの形質転換（Transformation of T-lymphocyte Su
bsets by Marek's Disease Herpesvirus）」、J. Virology 65: 1408-1413(1991
)、これは参照として本明細書に組み入れられている）。
【００５０】
表面マーカーを測定するために、参照として本明細書に組み入れられている、
シャット（Schat）ら、「マレック病ヘルペスウイルスによるTリンパ球サブセッ
トの形質転換（Transformation of T-lymphocyte Subsets by Marek's Disease
Herpesvirus）」、J. Virology 65: 1408-1413(1991)に記載されている方法およ
びモノクローナル抗体を使用して、全ての細胞系をIF試験に供した。
シャット（Schat）ら、「マレック病ヘルペスウイルスによるTリンパ球サブセッ
トの形質転換（Transformation of T-lymphocyte Subsets by Marek's Disease
Herpesvirus）」、J. Virology 65: 1408-1413(1991)に記載されている方法およ
びモノクローナル抗体を使用して、全ての細胞系をIF試験に供した。
【００５１】実施例2
-培養物の接種および維持
培養物を、25cm2のプラスチックフラスコまたは24ウェルプラスチックプレー
ト中の、ニワトリ血清を4％に減少させることによって改変したLM Hahn培地(Cal
nekら、「マレック病腫瘍細胞系における自発的かつ誘導性のヘルペスウイルス
ゲノム発現（Spontaneous and Induced Herpesvirus Genome Expression in Mar
ek's Disease Tumor Cell Lines）」、Infect. Immun. 34: 483-491(1981)、こ
れは参照として本明細書に組み入れられている)に250,000細胞/mlで播種し、41
℃の5％CO2雰囲気下でインキュベートした。培地に使用したニワトリ血清は、CI
AV感染していないことがわかっている特定の病原体非含有ニワトリから採取され
、以下に記載するようにPCRによってCIAV非含有であることが確認された。ウイ
ルスの接種は100μL/ml（実験1）または20μL/ml（その他全て）の割合であった
。一般にサンプリング時に、2日〜3日ごとに追加の培地を添加することによって
培養物を分割した。
ト中の、ニワトリ血清を4％に減少させることによって改変したLM Hahn培地(Cal
nekら、「マレック病腫瘍細胞系における自発的かつ誘導性のヘルペスウイルス
ゲノム発現（Spontaneous and Induced Herpesvirus Genome Expression in Mar
ek's Disease Tumor Cell Lines）」、Infect. Immun. 34: 483-491(1981)、こ
れは参照として本明細書に組み入れられている)に250,000細胞/mlで播種し、41
℃の5％CO2雰囲気下でインキュベートした。培地に使用したニワトリ血清は、CI
AV感染していないことがわかっている特定の病原体非含有ニワトリから採取され
、以下に記載するようにPCRによってCIAV非含有であることが確認された。ウイ
ルスの接種は100μL/ml（実験1）または20μL/ml（その他全て）の割合であった
。一般にサンプリング時に、2日〜3日ごとに追加の培地を添加することによって
培養物を分割した。
【００５２】実施例3
-ウイルス株、滴定
2つのウイルス株の起源であるCux-1(von Bulowら、「Fruhsterblichkeitssynd
rom bei Kuken nach Doppelinfektion mit dem Virus der Marekshen Krankheit
(MDV) und einem Anami-Erreger(CAA)」、Veterinaermed Reihe B 30: 742-750(
1983)、これは参照として本明細書に組み入れられている)およびCIA-1(Lucioら
、「ニワトリ貧血物質の同定、疾病の再現、および米国における血清学的調査（
Identification of the Chicken Anemia Agent, Reproduction of the Disease,
and Serological Survey in the United States）」、Avian Dis. 34: 146-153
(1990)、これは参照として本明細書に組み入れられている)が記載されている（R
enshawら、「ニワトリ感染性貧血ウイルスのVP1における超可変部は、組織培養
における蔓延および細胞屈性の速度に影響を与える（A Hypervariable Region i
n VP1 of Chicken Infectious Anemia Virus Mediates Rate of Spread and Cel
l Tropism in Tissue Culture）」、J. Virology 70: 8872-8878(1996)、これは
参照として本明細書に組み入れられている）。これらの研究のため、2つのバッ
チのCux-1株を使用した。バッチ1は、受領後、MSB1(L)細胞中で合計6回継代培養
された。バッチ2は、CU147細胞中での最後の継代培養の前に、MSB1(L)細胞中で3
回、MSB1(S)細胞中で1回継代培養された。CIA-1は、感染肝臓抽出物の形態（3.9
×104ニワトリ最小感染量/ml）のトリ増殖（bird-propagated）ウイルスとして
使用され（バッチ1）、またはCU147細胞内でのその後の2回の継代培養の後使用
された（バッチ2）。
rom bei Kuken nach Doppelinfektion mit dem Virus der Marekshen Krankheit
(MDV) und einem Anami-Erreger(CAA)」、Veterinaermed Reihe B 30: 742-750(
1983)、これは参照として本明細書に組み入れられている)およびCIA-1(Lucioら
、「ニワトリ貧血物質の同定、疾病の再現、および米国における血清学的調査（
Identification of the Chicken Anemia Agent, Reproduction of the Disease,
and Serological Survey in the United States）」、Avian Dis. 34: 146-153
(1990)、これは参照として本明細書に組み入れられている)が記載されている（R
enshawら、「ニワトリ感染性貧血ウイルスのVP1における超可変部は、組織培養
における蔓延および細胞屈性の速度に影響を与える（A Hypervariable Region i
n VP1 of Chicken Infectious Anemia Virus Mediates Rate of Spread and Cel
l Tropism in Tissue Culture）」、J. Virology 70: 8872-8878(1996)、これは
参照として本明細書に組み入れられている）。これらの研究のため、2つのバッ
チのCux-1株を使用した。バッチ1は、受領後、MSB1(L)細胞中で合計6回継代培養
された。バッチ2は、CU147細胞中での最後の継代培養の前に、MSB1(L)細胞中で3
回、MSB1(S)細胞中で1回継代培養された。CIA-1は、感染肝臓抽出物の形態（3.9
×104ニワトリ最小感染量/ml）のトリ増殖（bird-propagated）ウイルスとして
使用され（バッチ1）、またはCU147細胞内でのその後の2回の継代培養の後使用
された（バッチ2）。
【００５３】
力価測定（titration）のため、接種した培養物試料をIF試験によって調査し
、力価は感染の有無に基づいていた。最小感染量(MID)エンドポイント（end poi
nt）は、希釈率あたり1つの培養物だけが接種された場合に陽性である最終希釈
率として決定された。希釈率あたり4培養物を用いた力価測定では、エンドポイ
ントは、リード（Reed）およびムンチ（Muench）の方法によって算出した(Reed
ら、「50％のエンドポイントを推定するための簡便な方法（A Simple Method fo
r Estimating Fifty Percent Endpoints）」、Amer. J. Hygiene 27:493-497(19
38)、これは参照として本明細書に組み入れられている)。バッチ1の力価はMSB1(
L)細胞中では約10 MID/mlであったが、バッチ3の力価はMSB1(S)細胞中で5.0×105 組織培養物感染量-50％(TCID50)/mlであると測定された。組織培養物-増殖CIA-
Iウイルスであるバッチ2は、MSB1(S)細胞において力価が6.9×106TCID50/mlであ
った。
、力価は感染の有無に基づいていた。最小感染量(MID)エンドポイント（end poi
nt）は、希釈率あたり1つの培養物だけが接種された場合に陽性である最終希釈
率として決定された。希釈率あたり4培養物を用いた力価測定では、エンドポイ
ントは、リード（Reed）およびムンチ（Muench）の方法によって算出した(Reed
ら、「50％のエンドポイントを推定するための簡便な方法（A Simple Method fo
r Estimating Fifty Percent Endpoints）」、Amer. J. Hygiene 27:493-497(19
38)、これは参照として本明細書に組み入れられている)。バッチ1の力価はMSB1(
L)細胞中では約10 MID/mlであったが、バッチ3の力価はMSB1(S)細胞中で5.0×105 組織培養物感染量-50％(TCID50)/mlであると測定された。組織培養物-増殖CIA-
Iウイルスであるバッチ2は、MSB1(S)細胞において力価が6.9×106TCID50/mlであ
った。
【００５４】実施例4
-ウイルス抗原についての免疫蛍光試験
CIAVウイルスタンパク質3に特異的なモノクローナル抗体51.3(Chandratilleke
ら、「モノクローナル抗体を用いたニワトリ感染性貧血ウイルスのタンパク質の
特徴付け（Characterization of Proteins of Chicken Infectious Anemia Viru
s with Monoclonal Antibodies）」、Avian Dis. 35: 854-862(1991)、これは参
照として本明細書に組み入れられている)を、12-ウェルスライド上の、空気乾燥
してアセトン固定した50,000細胞のスメアに適用した。37℃の湿性チャンバー内
で15分間インキュベーションした後、スライドをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で
洗浄し、次いで湿ったチャンバー内でさらに15分間、フルオレセインイソチオシ
アネートが接合したヤギ抗マウス抗体で染色した。さらにPBS洗浄をした後スラ
イドガラスを用いて、落射照明を有する蛍光顕微鏡を使用してスメアを調べた。
スメア全体を調べることによって陽性細胞を計測するか、中程度に感染した培養
物中の既知の部分のスメアを計測することによって数を推定するか、または重度
に感染した細胞の感染細胞の割合を推定することによって測定した。感染率は50
,000個あたりの陽性細胞数として報告した。
ら、「モノクローナル抗体を用いたニワトリ感染性貧血ウイルスのタンパク質の
特徴付け（Characterization of Proteins of Chicken Infectious Anemia Viru
s with Monoclonal Antibodies）」、Avian Dis. 35: 854-862(1991)、これは参
照として本明細書に組み入れられている)を、12-ウェルスライド上の、空気乾燥
してアセトン固定した50,000細胞のスメアに適用した。37℃の湿性チャンバー内
で15分間インキュベーションした後、スライドをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で
洗浄し、次いで湿ったチャンバー内でさらに15分間、フルオレセインイソチオシ
アネートが接合したヤギ抗マウス抗体で染色した。さらにPBS洗浄をした後スラ
イドガラスを用いて、落射照明を有する蛍光顕微鏡を使用してスメアを調べた。
スメア全体を調べることによって陽性細胞を計測するか、中程度に感染した培養
物中の既知の部分のスメアを計測することによって数を推定するか、または重度
に感染した細胞の感染細胞の割合を推定することによって測定した。感染率は50
,000個あたりの陽性細胞数として報告した。
【００５５】実施例5
-DNA抽出
DNAを、ある程度改変した標準的な技法(Moore、「DNAの調製および分析（Prep
aration and Analysis of DNA）」、Current Protocols in Molecular Biology
、Vol.1、Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience、John Wiley
and Sons, Inc.、New York、NY(1998)、これは参照として本明細書に組み入れ
られている)を使用して各組織培養物試料から抽出した。簡単に説明すると、懸
濁液中で増殖中の細胞1ml〜2mlをペレット化し、0.5mlの培養上清に再懸濁した
。次いで、試料を消化緩衝液(100mM Tris-HCl、pH 8.0、10mM NaCl、0.5％ドデ
シル硫酸ナトリウムおよび0.2μg/mlのプロテイナーゼK)中で37℃〜41℃で一晩
インキュベートした。各試料を、フェノール:クロロホルム：イソアミルアルコ
ール(25:24:1)混合液を用いて1回抽出し、1容量のイソプロピルアルコールおよ
び1/10容量の3M NaClを用いて-20℃で一晩DNAを沈殿させた。4℃で20分、14,000
×gで遠心分離することによって、DNAをペレット化した。70％エタノールでDNA
を洗浄し、Tris-EDTA pH 7.4に再懸濁し、TD-360フルオロメーター(Turner Desi
gns, Inc.、Sunneyvale、CA)を使用して定量した。
aration and Analysis of DNA）」、Current Protocols in Molecular Biology
、Vol.1、Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience、John Wiley
and Sons, Inc.、New York、NY(1998)、これは参照として本明細書に組み入れ
られている)を使用して各組織培養物試料から抽出した。簡単に説明すると、懸
濁液中で増殖中の細胞1ml〜2mlをペレット化し、0.5mlの培養上清に再懸濁した
。次いで、試料を消化緩衝液(100mM Tris-HCl、pH 8.0、10mM NaCl、0.5％ドデ
シル硫酸ナトリウムおよび0.2μg/mlのプロテイナーゼK)中で37℃〜41℃で一晩
インキュベートした。各試料を、フェノール:クロロホルム：イソアミルアルコ
ール(25:24:1)混合液を用いて1回抽出し、1容量のイソプロピルアルコールおよ
び1/10容量の3M NaClを用いて-20℃で一晩DNAを沈殿させた。4℃で20分、14,000
×gで遠心分離することによって、DNAをペレット化した。70％エタノールでDNA
を洗浄し、Tris-EDTA pH 7.4に再懸濁し、TD-360フルオロメーター(Turner Desi
gns, Inc.、Sunneyvale、CA)を使用して定量した。
【００５６】実施例6
-ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)
CIAVスクリーニングのため、標準的なPCR法を使用した。最初の反応は100ngの
全DNA、1.5mMのMgCl2、0.25単位のTaq DNAポリメラーゼ(Gibco-BRL、Life Techn
ologies、Gaitherburg、MD)、1×PCR緩衝液(Gibco-BRL)、50pmolの各プライマー および0.25mMの各ヌクレオチド三リン酸(NTP)を含有し、総量50μLであった。94
℃で5分間の変性後、反応を35サイクル実施し（各サイクルは94℃で1分間、45℃
で2分間および72℃で1分間）、その後72℃で10分間の伸長段階1回を実施した。
全DNA、1.5mMのMgCl2、0.25単位のTaq DNAポリメラーゼ(Gibco-BRL、Life Techn
ologies、Gaitherburg、MD)、1×PCR緩衝液(Gibco-BRL)、50pmolの各プライマー および0.25mMの各ヌクレオチド三リン酸(NTP)を含有し、総量50μLであった。94
℃で5分間の変性後、反応を35サイクル実施し（各サイクルは94℃で1分間、45℃
で2分間および72℃で1分間）、その後72℃で10分間の伸長段階1回を実施した。
【００５７】
各PCR反応の1/10容量を1.5％アガロースゲル上で電気泳動させ、臭化エチジウ
ムで染色し、紫外線を用いて可視化した。
ムで染色し、紫外線を用いて可視化した。
【００５８】実施例7
-配列決定
参照として本明細書に組み入れられている、レンショー（Renshaw）ら、「ニ
ワトリ感染性貧血ウイルスのVP1における超可変部は、組織培養における蔓延お
よび細胞屈性の速度に影響を与える（A Hypervariable Region in VP1 of Chick
en Infectious Anemia Virus Mediates Rate of Spread and Cell Tropism in T
issue Culture）」、J. Virology 70: 8872-8878(1996)によって同定された、VP
-1の超可変部領域由来の461bpの断片をCIA-1のプライマーを使用して増幅した。
PCR反応混合物は、100ngのDNA、1.5mMのMgCl2、0.25単位のTaq DNAポリメラーゼ
、1×PCR緩衝液、50pmolの各プライマー および0.25mMの各NTPを含有し、総量50μLであった。94℃で5分間の最初の変性
段階後、PCR反応を35サイクル実施し（各サイクルは94℃で1分間、45℃で2分間
、および72℃で1分間）、次に72℃で10分間の伸長段階を1回実施した。PCR反応
物を1.5％アガロースゲル上で電気泳動させ、バンドを取り出し、製造業者の指
示に従い、DNAをConcertゲル抽出キット（Gibco-BRL、Life Technologies、Gait
hersburg、MD）を用いて抽出した。コーネル大学（Cornell University）のバイ
オリソースセンター（BioResource Center）において染料-ターミネーター化学
を使用してパーキンエルマーバイオシステムズ377-XLモデル（Perkin Elmer Bio
systems model 377-1）（The Perkin-Elmer Corporation、Norwalk、CT)によりD
NA配列決定を行った。
ワトリ感染性貧血ウイルスのVP1における超可変部は、組織培養における蔓延お
よび細胞屈性の速度に影響を与える（A Hypervariable Region in VP1 of Chick
en Infectious Anemia Virus Mediates Rate of Spread and Cell Tropism in T
issue Culture）」、J. Virology 70: 8872-8878(1996)によって同定された、VP
-1の超可変部領域由来の461bpの断片をCIA-1のプライマーを使用して増幅した。
PCR反応混合物は、100ngのDNA、1.5mMのMgCl2、0.25単位のTaq DNAポリメラーゼ
、1×PCR緩衝液、50pmolの各プライマー および0.25mMの各NTPを含有し、総量50μLであった。94℃で5分間の最初の変性
段階後、PCR反応を35サイクル実施し（各サイクルは94℃で1分間、45℃で2分間
、および72℃で1分間）、次に72℃で10分間の伸長段階を1回実施した。PCR反応
物を1.5％アガロースゲル上で電気泳動させ、バンドを取り出し、製造業者の指
示に従い、DNAをConcertゲル抽出キット（Gibco-BRL、Life Technologies、Gait
hersburg、MD）を用いて抽出した。コーネル大学（Cornell University）のバイ
オリソースセンター（BioResource Center）において染料-ターミネーター化学
を使用してパーキンエルマーバイオシステムズ377-XLモデル（Perkin Elmer Bio
systems model 377-1）（The Perkin-Elmer Corporation、Norwalk、CT)によりD
NA配列決定を行った。
【００５９】実施例8
-配列分析
配列を、MegAlign(Windows 32 3.18DNASTAR)ソフトウェア(DNASTAR, Inc.、Ma
dison、WI)のClustal法を使用して、公表されているCIAV配列と共に整列化した
。アラインメントに使用した配列のGenBankアクセッション番号は、以下の通り
である：Cux-1がM55918、およびCIA-1がL14767。
dison、WI)のClustal法を使用して、公表されているCIAV配列と共に整列化した
。アラインメントに使用した配列のGenBankアクセッション番号は、以下の通り
である：Cux-1がM55918、およびCIA-1がL14767。
【００６０】実施例9
-実験的設計
3つの群、CD4+/8-、CD4-/8+およびCD4-/8-を示す種々の細胞系の相対的感受性
を比較するために2つの実験を実施した。2つの試行（trial）は、0.1ml未希釈ウ
イルス/1ml培養物（1MID/培養物）の割合で細胞系にバッチ1 Cux-1ウイルスを接
種する実験1を含んだ。試行1では接種後4日目、7日目、10日目および17日目(DPI
)、試行2では3DPIよび7DPIにおいて培養物を調べた。実験2では、20μLの10-3ウ
イルス希釈液（約10TICD50）/ml培養物の割合で接種したバッチ2 Cux-1を使用し
て5回の試行を行った。調査を、3DPIから9DPIまたは10DPIまで、2日〜3日間隔で
実施した。
を比較するために2つの実験を実施した。2つの試行（trial）は、0.1ml未希釈ウ
イルス/1ml培養物（1MID/培養物）の割合で細胞系にバッチ1 Cux-1ウイルスを接
種する実験1を含んだ。試行1では接種後4日目、7日目、10日目および17日目(DPI
)、試行2では3DPIよび7DPIにおいて培養物を調べた。実験2では、20μLの10-3ウ
イルス希釈液（約10TICD50）/ml培養物の割合で接種したバッチ2 Cux-1を使用し
て5回の試行を行った。調査を、3DPIから9DPIまたは10DPIまで、2日〜3日間隔で
実施した。
【００６１】
2つの試行中に、MSB1(L)、MSB1(S)およびCU147細胞を使用して、Cux-1（バッ
チ2）およびCIA-1（バッチ2）の比較力価測定を実施した（実験3）。実験の終了
時にPCRによりCIAVについていくつかの個々の培養物由来の試料をスクリーニン
グした。
チ2）およびCIA-1（バッチ2）の比較力価測定を実施した（実験3）。実験の終了
時にPCRによりCIAVについていくつかの個々の培養物由来の試料をスクリーニン
グした。
【００６２】実施例10
-細胞系の表現型の特徴付け
試験した全ての細胞系の表現型の分類を表1に示す。以前に報告された表現型
の分類（Schatら、「マレック病ヘルペスウイルスによるTリンパ球サブセットの
形質転換（Transformation of T-Lymphocyte Subsets by Marek's Disease Herp
esvirus）」、J. Virology 65: 1408-1413(1991)）との矛盾が、3つの系CU14、C
U109およびCU145に存在した（表1の脚注参照）。
の分類（Schatら、「マレック病ヘルペスウイルスによるTリンパ球サブセットの
形質転換（Transformation of T-Lymphocyte Subsets by Marek's Disease Herp
esvirus）」、J. Virology 65: 1408-1413(1991)）との矛盾が、3つの系CU14、C
U109およびCU145に存在した（表1の脚注参照）。
【００６３】実施例11
-Cux-1 CIAVに対する細胞系の比較感受性（実験1および実験2）
表2で報告した実験1の結果は、CIAVのCux-1株に対する感受性の系の間の明ら
かな差異を示している。
かな差異を示している。
【００６４】
【表２】 ニワトリ感染性貧血ウイルスのCux-1に対するMDCC系の相対的感受性
（実験1）A A250,000細胞の培養物1mlに100μLの未希釈バッチ1 Cux-1 CIAV（1最小感染量と
推定される）を接種した。未接種対照培養物は全て7DPIにおいて陰性であった。
BDPI=接種後日数C この培養物は17DPIにおいてもまだ陰性であったD ...=実施していない
（実験1）A A250,000細胞の培養物1mlに100μLの未希釈バッチ1 Cux-1 CIAV（1最小感染量と
推定される）を接種した。未接種対照培養物は全て7DPIにおいて陰性であった。
BDPI=接種後日数C この培養物は17DPIにおいてもまだ陰性であったD ...=実施していない
【００６５】
試験した5つのCD4+/8-系のうち、CU12およびCU36の二つだけは、7日目〜17日
目の実験期間中に感染の徴候を示した。一方、3つのCD4-/8+系全ておよび5つのC
D4-/8-系全ては、7DPIまで抗原陽性細胞を含有していた。試行の1つにおいて、M
SB1(L)細胞は、17日目以降も未だ陰性であり、この培養物は実は感染していない
ことを示唆している。本実験の接種物の力価は非常に低い（培養物あたりわずか
に1MID）ことに留意するべきであり、従っていくつかの系において感染が見られ
ないことを注意深く考察すべきであり、培養物が感染に無反応であることを意味
するとは必ずしもみなされるべきでない。
目の実験期間中に感染の徴候を示した。一方、3つのCD4-/8+系全ておよび5つのC
D4-/8-系全ては、7DPIまで抗原陽性細胞を含有していた。試行の1つにおいて、M
SB1(L)細胞は、17日目以降も未だ陰性であり、この培養物は実は感染していない
ことを示唆している。本実験の接種物の力価は非常に低い（培養物あたりわずか
に1MID）ことに留意するべきであり、従っていくつかの系において感染が見られ
ないことを注意深く考察すべきであり、培養物が感染に無反応であることを意味
するとは必ずしもみなされるべきでない。
【００６６】
実験2では（表3）、Cux-1ウイルスの用量は幾分高かった（約10TCID50/培養物
）。
）。
【００６７】
【表３】 ニワトリ感染性貧血ウイルスのCux-1株に対するMDCC系の相対的感受
性（実験2）A A250,000細胞の培養物1mlに20μLの10-3バッチ2 Cux-1 CIAVを接種した。未接種
対照培養物は全て5DPIにおいて陰性であった。B 未知のMSB1(S)の培養日数。X=最初の継代レベル（これらの検討のために得られ
た）；その後の培養日数は、例えば、+26として示す。C DPI=接種後日数D ...=実施していない
性（実験2）A A250,000細胞の培養物1mlに20μLの10-3バッチ2 Cux-1 CIAVを接種した。未接種
対照培養物は全て5DPIにおいて陰性であった。B 未知のMSB1(S)の培養日数。X=最初の継代レベル（これらの検討のために得られ
た）；その後の培養日数は、例えば、+26として示す。C DPI=接種後日数D ...=実施していない
【００６８】
この場合、6つのCD4+/8-系では全く見られなかったのに比べ、8つのCD4-/8+系
のうち4つおよび3つのCD4-/8-系のうち1つが、3DPIまで感染の証拠を示した。MS
B1(L)を除いて、全ての系が5DPIまで陽性であり、逐次的なサンプリングにおい
て全てが陽性細胞の割合の増加を示した。CU147細胞の5つの複製物（replicates
）、MSB1(S)の4つの複製物、ならびにそれぞれMSB1(L)およびCU95細胞の複製物2
つを、実験2を含む5つの試行に使用した。これらの系の試行ごとに得られる結果
は顕著に類似していた。
のうち4つおよび3つのCD4-/8-系のうち1つが、3DPIまで感染の証拠を示した。MS
B1(L)を除いて、全ての系が5DPIまで陽性であり、逐次的なサンプリングにおい
て全てが陽性細胞の割合の増加を示した。CU147細胞の5つの複製物（replicates
）、MSB1(S)の4つの複製物、ならびにそれぞれMSB1(L)およびCU95細胞の複製物2
つを、実験2を含む5つの試行に使用した。これらの系の試行ごとに得られる結果
は顕著に類似していた。
【００６９】実施例12
-CIAVのCux-1株およびCIA-1株に対するMSBIおよびCU147細胞系の比較感
受性 バッチ1ウイルス（肝抽出物）を平行接種されたMSB1(S)細胞およびCU147にお
いて、細胞培養物に対してCIA-1ウイルスを適合化させる最初の試みを実施した
。IF試験においてCU147培養物がわずかな(3/50,000)陽性細胞しか有さない場合
、9PDIまでの定期的な調査において感染の証拠は見られなかった。13DPIまでに
、感染率は896/50,000細胞陽性まで増加し、17DPIには、1,920/50,000に倍増し
た。MSB1(S)細胞の平行培養物は、27DPIまで陰性のままであった。感染CU147細
胞由来の上清液として15DPIにおいて採取した未希釈ウイルスを、2回目の継代の
ために、MSB1(S)細胞およびCU147細胞に接種した（0.5ml/培養物）。2DPIにおい
て、CU147細胞における感染が明らかであったが(60/50,000陽性)、MSB1(S)細胞
では明らかではなく、4DPIまでに、MSB1培養物が4つの陽性細胞/50,000を示し、
CU147細胞における感染は7,168陽性まで増加した。5DPIにおいてCU147細胞から
採取したウイルスを、他の実験に使用するCIA-1ウイルスのバッチ2ストックとし
た。
受性 バッチ1ウイルス（肝抽出物）を平行接種されたMSB1(S)細胞およびCU147にお
いて、細胞培養物に対してCIA-1ウイルスを適合化させる最初の試みを実施した
。IF試験においてCU147培養物がわずかな(3/50,000)陽性細胞しか有さない場合
、9PDIまでの定期的な調査において感染の証拠は見られなかった。13DPIまでに
、感染率は896/50,000細胞陽性まで増加し、17DPIには、1,920/50,000に倍増し
た。MSB1(S)細胞の平行培養物は、27DPIまで陰性のままであった。感染CU147細
胞由来の上清液として15DPIにおいて採取した未希釈ウイルスを、2回目の継代の
ために、MSB1(S)細胞およびCU147細胞に接種した（0.5ml/培養物）。2DPIにおい
て、CU147細胞における感染が明らかであったが(60/50,000陽性)、MSB1(S)細胞
では明らかではなく、4DPIまでに、MSB1培養物が4つの陽性細胞/50,000を示し、
CU147細胞における感染は7,168陽性まで増加した。5DPIにおいてCU147細胞から
採取したウイルスを、他の実験に使用するCIA-1ウイルスのバッチ2ストックとし
た。
【００７０】
両細胞型においてCux-1およびCIA-1の平行力価測定を実施することによって、
MSB1(S)およびCU147の相対的感受性をさらに調査した。結果を表4に示す。
MSB1(S)およびCU147の相対的感受性をさらに調査した。結果を表4に示す。
【００７１】
【表４】 MSB1(S)細胞およびCU147細胞におけるCIAVのCux-1（バッチ2）株およ
びCIA-I(バッチ2)株の力価測定（実験3）A A各ウイルス希釈液を4つの複製培養物に（10-7希釈液には単一の培養物）、20μ
L/250,000細胞1mlの割合で接種した。 IF試験によって調査した。括弧内の数字=陽性の複製物の数/PCRによって調査し
た数C ...=実施していない
びCIA-I(バッチ2)株の力価測定（実験3）A A各ウイルス希釈液を4つの複製培養物に（10-7希釈液には単一の培養物）、20μ
L/250,000細胞1mlの割合で接種した。 IF試験によって調査した。括弧内の数字=陽性の複製物の数/PCRによって調査し
た数C ...=実施していない
【００７２】
MSB1(S)細胞内よりもCU147細胞内において、両ウイルス株についてのエンドポ
イントの力価が高く、（ウイルス数-陽性細胞数に基づく）ウイルス蔓延（sprea
d）率が実質的に高かったことが示されうる。MSB1(S)細胞およびCU147細胞にお
けるCuX-1ウイルスについてのTCID50力価（8DPIにおける調査から算出）は、そ
れぞれ、10-5.7/mlおよび10-7.4/mlであった。CIA-1ウイルスでは、8DPIにおけ
るTCID50力価は10-6.7であった。残念なことにCU147細胞の力価は8DPIにおいて
は測定されなかったが、6DPIにおけるCIA-1ウイルス株のMID力価は、MSB1細胞よ
りCU147細胞において少なくとも10倍高かった。また、CU147細胞における感染蔓
延速度は非常に迅速であることが示され、少量のウイルスを用いても6日〜8日以
内に細胞の大半が感染することに留意すべきである。
イントの力価が高く、（ウイルス数-陽性細胞数に基づく）ウイルス蔓延（sprea
d）率が実質的に高かったことが示されうる。MSB1(S)細胞およびCU147細胞にお
けるCuX-1ウイルスについてのTCID50力価（8DPIにおける調査から算出）は、そ
れぞれ、10-5.7/mlおよび10-7.4/mlであった。CIA-1ウイルスでは、8DPIにおけ
るTCID50力価は10-6.7であった。残念なことにCU147細胞の力価は8DPIにおいて
は測定されなかったが、6DPIにおけるCIA-1ウイルス株のMID力価は、MSB1細胞よ
りCU147細胞において少なくとも10倍高かった。また、CU147細胞における感染蔓
延速度は非常に迅速であることが示され、少量のウイルスを用いても6日〜8日以
内に細胞の大半が感染することに留意すべきである。
【００７３】実施例13
-CIAVのCux-1株およびCIA-1株のDNA配列比較
8DPIにおける力価測定エンドポイント培養物のPCRスクリーニングにより、わ
ずかに例外はあるものの、蛍光抗体の所見が確認された。3つの例において（表4
参照：10-4希釈率のMSB1細胞中のCux-1、10-6希釈率のCU-147細胞中のCux-1、10-5 希釈率のMSB1細胞中のCIA-1）、4つの複製物のうち1つまたは2つがPCRによっ
て陽性であったが、IFによって陰性であった。再度10DPIにおいて試験した培養
物のうち、1つだけ（MSB1細胞における10-4Cux-1の複製物）はIF試験において陰
性から陽性に状態を変えた。
ずかに例外はあるものの、蛍光抗体の所見が確認された。3つの例において（表4
参照：10-4希釈率のMSB1細胞中のCux-1、10-6希釈率のCU-147細胞中のCux-1、10-5 希釈率のMSB1細胞中のCIA-1）、4つの複製物のうち1つまたは2つがPCRによっ
て陽性であったが、IFによって陰性であった。再度10DPIにおいて試験した培養
物のうち、1つだけ（MSB1細胞における10-4Cux-1の複製物）はIF試験において陰
性から陽性に状態を変えた。
【００７４】
Cux-1力価測定由来の4つの試料（MSB1細胞中の10-3および10-4、ならびにCU-1
47細胞中の10-5および10-6）およびCIA-1力価測定由来の3つの試料(MSB1細胞中
の10-3および10-5、ならびにCU-147細胞中の10-5)を増幅し、配列決定した。各
場合において、これらの試料の配列は、2つの株が互いに異なる位置全てにおい
て、それぞれの接種物（Cux-1またはCIA-1）の配列と一致した。
47細胞中の10-5および10-6）およびCIA-1力価測定由来の3つの試料(MSB1細胞中
の10-3および10-5、ならびにCU-147細胞中の10-5)を増幅し、配列決定した。各
場合において、これらの試料の配列は、2つの株が互いに異なる位置全てにおい
て、それぞれの接種物（Cux-1またはCIA-1）の配列と一致した。
【００７５】実施例14
-CIAVに対するマレック病(MD)細胞系の比較感受性
これは、CIAVに対する相対的な感受性を測定するための、種々のMD細胞系の最
初の広範な比較であった。ユアサ（Yuasa）(Yuasa、「マレック病リンパ腫由来
の細胞系(MDCC-MSB1)におけるニワトリ貧血物質のGifu-1株の増殖および感染性
力価測定（Propagation and Infectivity Titration of the Gifu-1 Strain of
Chicken Anemia Agent in a Cell Line(MDCC-MSB1) Derived From Marek's Dise
ase Lymphoma）」、Nat. Inst. Anim. Health O. 23:13-20(1983)、これは参照
として本明細書に組み入れられている)、チャンドラティレック（Chandratillek
e）ら(Chandratillekeら、「モノクローナル抗体を用いたニワトリ感染性貧血ウ
イルスのタンパク質の特徴付け（Characterization of Proteins of Cheicken I
nfectious Anemia Virus with Monoclonal Antibodies）」、Avian Dis. 35: 85
4-862(1991)、これは参照として本明細書に組み入れられている)およびレンショ
ー（Renshaw）ら(Renshawら、「ニワトリ感染性貧血ウイルスのVP1における超可
変部は、組織培養における蔓延および細胞屈性の速度に影響を与える（A Hyperv
ariable Region in VP1 of Chicken Infectious Anemia Virus Mediates Rate o
f Spread and Cell Tropism in Tissue Culture）」、J. Virology 70:8872-887
8(1996)、これは参照として本明細書に組み入れられている)による以前の検討は
、そのほとんどが公知であるか、またはCD4+/8-、TCR2+もしくは3+であると推定
されるごく少数の細胞系を除いていくつかのウイルス株を調査した。細胞系また
はウイルス株に関連する感受性の差が報告された。本発明の研究では、通常のCD
4+/8-系以外にCD4-/8+およびCD4-/8-などの種々の表現型の系を加えた。これは
、MD局所病変由来の系（Calnekら、「マレック病ウイルス誘導性局所病変の病原
体 1.病変の特徴付けおよび細胞系の確立（Pathogenesis of Marek's Disease V
irus-Induced Local Lesions. 1. Lesion Characterization and Cell Line Est
ablishment）」、Avian Dis. 33:291-302(1989)、これは参照として本明細書に
組み入れられている）は多種多様の表現型グループを有するからである（Schat
ら、「マレック病ヘルペスウイルスによるTリンパ球サブセットの形質転換（Tra
nsformation of T-lymphocyte Subsets by Marek's Disease Herpesvirus）」、
J. Virology 65: 1408-1413(1991)、これは参照として本明細書に組み入れられ
ている）。大半の試験される細胞系を形成する後者は全て、遺伝子型およびMDV
を形質転換する株ということに関して同一であった。従って、表現型だけに基づ
いた差について系を比較することが可能であった。
初の広範な比較であった。ユアサ（Yuasa）(Yuasa、「マレック病リンパ腫由来
の細胞系(MDCC-MSB1)におけるニワトリ貧血物質のGifu-1株の増殖および感染性
力価測定（Propagation and Infectivity Titration of the Gifu-1 Strain of
Chicken Anemia Agent in a Cell Line(MDCC-MSB1) Derived From Marek's Dise
ase Lymphoma）」、Nat. Inst. Anim. Health O. 23:13-20(1983)、これは参照
として本明細書に組み入れられている)、チャンドラティレック（Chandratillek
e）ら(Chandratillekeら、「モノクローナル抗体を用いたニワトリ感染性貧血ウ
イルスのタンパク質の特徴付け（Characterization of Proteins of Cheicken I
nfectious Anemia Virus with Monoclonal Antibodies）」、Avian Dis. 35: 85
4-862(1991)、これは参照として本明細書に組み入れられている)およびレンショ
ー（Renshaw）ら(Renshawら、「ニワトリ感染性貧血ウイルスのVP1における超可
変部は、組織培養における蔓延および細胞屈性の速度に影響を与える（A Hyperv
ariable Region in VP1 of Chicken Infectious Anemia Virus Mediates Rate o
f Spread and Cell Tropism in Tissue Culture）」、J. Virology 70:8872-887
8(1996)、これは参照として本明細書に組み入れられている)による以前の検討は
、そのほとんどが公知であるか、またはCD4+/8-、TCR2+もしくは3+であると推定
されるごく少数の細胞系を除いていくつかのウイルス株を調査した。細胞系また
はウイルス株に関連する感受性の差が報告された。本発明の研究では、通常のCD
4+/8-系以外にCD4-/8+およびCD4-/8-などの種々の表現型の系を加えた。これは
、MD局所病変由来の系（Calnekら、「マレック病ウイルス誘導性局所病変の病原
体 1.病変の特徴付けおよび細胞系の確立（Pathogenesis of Marek's Disease V
irus-Induced Local Lesions. 1. Lesion Characterization and Cell Line Est
ablishment）」、Avian Dis. 33:291-302(1989)、これは参照として本明細書に
組み入れられている）は多種多様の表現型グループを有するからである（Schat
ら、「マレック病ヘルペスウイルスによるTリンパ球サブセットの形質転換（Tra
nsformation of T-lymphocyte Subsets by Marek's Disease Herpesvirus）」、
J. Virology 65: 1408-1413(1991)、これは参照として本明細書に組み入れられ
ている）。大半の試験される細胞系を形成する後者は全て、遺伝子型およびMDV
を形質転換する株ということに関して同一であった。従って、表現型だけに基づ
いた差について系を比較することが可能であった。
【００７６】
表2および表3のデータから明らかなように、種々の表現型の系間には、Cux-1
ウイルスに対する感受性に差があるが、表現型にばらつきがあるので、表現型自
体の影響に関する結論を引き出すのは困難である。最も感受性のある系はCD4-/8
+またはCD4-/8-であったが、これらのグループ内のいくつかの系はCD4+/8-系よ
り感受性が強くなかった。TCR2+とTCR3+系間には感受性の明らかな差はなかった
。1つの系、CU147は、Cux-1ウイルスに対する高い感受性があるという点が顕著
に一致していた。そのため、Cux-1とCIA-1ウイルスによる比較試験をMSB1(S)お
よびCU147細胞において実施した。表4びデータは、IF試験において初期に感染細
胞が出現すること、所定の培養物において大半の細胞に関与する蔓延速度および
10日間の培養期間以内に検出されるウイルスの力価に関して、CIAVのどちらかの
株を検出するということについて後者が優れていることを例示している。
ウイルスに対する感受性に差があるが、表現型にばらつきがあるので、表現型自
体の影響に関する結論を引き出すのは困難である。最も感受性のある系はCD4-/8
+またはCD4-/8-であったが、これらのグループ内のいくつかの系はCD4+/8-系よ
り感受性が強くなかった。TCR2+とTCR3+系間には感受性の明らかな差はなかった
。1つの系、CU147は、Cux-1ウイルスに対する高い感受性があるという点が顕著
に一致していた。そのため、Cux-1とCIA-1ウイルスによる比較試験をMSB1(S)お
よびCU147細胞において実施した。表4びデータは、IF試験において初期に感染細
胞が出現すること、所定の培養物において大半の細胞に関与する蔓延速度および
10日間の培養期間以内に検出されるウイルスの力価に関して、CIAVのどちらかの
株を検出するということについて後者が優れていることを例示している。
【００７７】
MSB1の2つの亜系間の感受性の差は、参照として本明細書に組み入れられてい
る、レンショー（Renshaw）ら、「ニワトリ感染性貧血ウイルスのVP1における超
可変部は、組織培養における蔓延および細胞屈性の速度に影響を与える（A Hype
rvariable Region in VP1 of Chicken Infctious Anemia Virus Mediates Rate
of Spread and Cell Tropism in Tissue Culture）」、J. Viroligy 70: 8872-8
878(1996)によって報告された結果に一致していた。表3および表4のデータは、M
SB1(L)細胞はCux-1ウイルスによる感染に無反応であったことを示唆しているが
、これは、低力価の接種量および/またはそれらの試行のいくつかにおける観察
期間の短さを反映するかもしれない。より長い期間または大量のウイルスを用い
て実施した他の試行は、程度は低いが、その系は感受性であることを確認した。
る、レンショー（Renshaw）ら、「ニワトリ感染性貧血ウイルスのVP1における超
可変部は、組織培養における蔓延および細胞屈性の速度に影響を与える（A Hype
rvariable Region in VP1 of Chicken Infctious Anemia Virus Mediates Rate
of Spread and Cell Tropism in Tissue Culture）」、J. Viroligy 70: 8872-8
878(1996)によって報告された結果に一致していた。表3および表4のデータは、M
SB1(L)細胞はCux-1ウイルスによる感染に無反応であったことを示唆しているが
、これは、低力価の接種量および/またはそれらの試行のいくつかにおける観察
期間の短さを反映するかもしれない。より長い期間または大量のウイルスを用い
て実施した他の試行は、程度は低いが、その系は感受性であることを確認した。
【００７８】
参照として本明細書に組み入れられている、レンショー（Renshaw）ら、「ニ
ワトリ感染性貧血ウイルスのVP1における超可変部は、組織培養における蔓延お
よび細胞屈性の速度に影響を与える（A Hypervariable Region in VP1 of Chick
en Infectious Anemia Virus Mediates Rate of Spread and Cell Tropism in T
issue Culture）」、J. Viroligy 70: 8872-8878(1996)によって報告された結果
と上記の実施例において得られたものの間に大きな矛盾があることにより、CIA-
1ウイルスがCU147細胞中で増殖する能力で処理する必要がある。レンショー（Re
nshaw）らは、CU147細胞において繰り返し行ったCIA-1を増殖させる試みは失敗
したことを記載している。しかしながら、上記の実施例において、この系はMSB1
細胞よりはるかに感受性が高いことがみいだされた（これは、以前の検討の著者
らは、CU147細胞系を増殖させる際に若干技術的に困難があったかもしれないと
いう事実によって説明されるだろう）。また、CIA-1ウイルスは、トリ増殖ウイ
ルスを接種した最初の培養物中ではCU147細胞では増殖が遅いが、2回継代培養後
では増殖が早いことが注目されるべきである。一方、MSB1(S)細胞は、CU147細胞
を感染させるために使用した同じトリ増殖ウイルスにより感染されず、CU147細
胞における継代2代目のウイルスはCU147細胞と比較してMSB1細胞ではわずかにし
か増殖しなかった。2つの検討のばらつきは、CIA-1株の誤った同定によるもので
はなかった。力価測定から得られたCux-1およびCIA-1の超可変領域を配列決定す
ることによって、交差汚染は除外された。2つのウイルス接種物およびCIA-1の力
価測定の最終希釈率から採取したウイルスを用いて実施したDNA配列比較は、そ
のウイルスは意図したものであることを結論として確認した。これらの実験時に
は研究室において他の株は増殖されていなかった。感染を検出するためのPCRとI
Fの比較試験は、一般に一致しているが、PCRは、IF試験で見逃された少数の最終
希釈率培養物を検出した。
ワトリ感染性貧血ウイルスのVP1における超可変部は、組織培養における蔓延お
よび細胞屈性の速度に影響を与える（A Hypervariable Region in VP1 of Chick
en Infectious Anemia Virus Mediates Rate of Spread and Cell Tropism in T
issue Culture）」、J. Viroligy 70: 8872-8878(1996)によって報告された結果
と上記の実施例において得られたものの間に大きな矛盾があることにより、CIA-
1ウイルスがCU147細胞中で増殖する能力で処理する必要がある。レンショー（Re
nshaw）らは、CU147細胞において繰り返し行ったCIA-1を増殖させる試みは失敗
したことを記載している。しかしながら、上記の実施例において、この系はMSB1
細胞よりはるかに感受性が高いことがみいだされた（これは、以前の検討の著者
らは、CU147細胞系を増殖させる際に若干技術的に困難があったかもしれないと
いう事実によって説明されるだろう）。また、CIA-1ウイルスは、トリ増殖ウイ
ルスを接種した最初の培養物中ではCU147細胞では増殖が遅いが、2回継代培養後
では増殖が早いことが注目されるべきである。一方、MSB1(S)細胞は、CU147細胞
を感染させるために使用した同じトリ増殖ウイルスにより感染されず、CU147細
胞における継代2代目のウイルスはCU147細胞と比較してMSB1細胞ではわずかにし
か増殖しなかった。2つの検討のばらつきは、CIA-1株の誤った同定によるもので
はなかった。力価測定から得られたCux-1およびCIA-1の超可変領域を配列決定す
ることによって、交差汚染は除外された。2つのウイルス接種物およびCIA-1の力
価測定の最終希釈率から採取したウイルスを用いて実施したDNA配列比較は、そ
のウイルスは意図したものであることを結論として確認した。これらの実験時に
は研究室において他の株は増殖されていなかった。感染を検出するためのPCRとI
Fの比較試験は、一般に一致しているが、PCRは、IF試験で見逃された少数の最終
希釈率培養物を検出した。
【００７９】
インビトロにおいてCIAVを増殖するための標準的な基質はMSB1細胞系であった
（von Bulowら、「ニワトリ感染性貧血（Chicken Infectious Anemia）」、Dise
ases of Poultry、第10版、Iowa State University Press、pp.739-756(1997)お
よびMcNulty、「ニワトリ貧血物質（Chicken Anemia Agent）」、A Laboratory
Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens、第3版、K
endall/Hunt Publishing Co.、Dbuque、IA、pp. 108-109(1989)、これらは参照
として本明細書に組み入れられている）。本発明は、インビトロにおけるCIAV（
Cux-1およびCIA-1）の少なくとも2つの株を増殖するための別の細胞系としてのC
U147の有用性および明らかな卓越性を証明している。
（von Bulowら、「ニワトリ感染性貧血（Chicken Infectious Anemia）」、Dise
ases of Poultry、第10版、Iowa State University Press、pp.739-756(1997)お
よびMcNulty、「ニワトリ貧血物質（Chicken Anemia Agent）」、A Laboratory
Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens、第3版、K
endall/Hunt Publishing Co.、Dbuque、IA、pp. 108-109(1989)、これらは参照
として本明細書に組み入れられている）。本発明は、インビトロにおけるCIAV（
Cux-1およびCIA-1）の少なくとも2つの株を増殖するための別の細胞系としてのC
U147の有用性および明らかな卓越性を証明している。
【００８０】
本発明は、例示の目的のために詳細に記載されているが、このような詳細な説
明は単に例示の目的のためだけであって、以下の請求の範囲によって規定される
本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の変更を当業者が加えるこ
とができることが理解される。
明は単に例示の目的のためだけであって、以下の請求の範囲によって規定される
本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の変更を当業者が加えるこ
とができることが理解される。
【配列表】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｋ 39/235 Ａ６１Ｋ 39/235
39/245 39/245
39/255 39/255
39/295 39/295
Ａ６１Ｐ 31/12 １７１ Ａ６１Ｐ 31/12 １７１
Ｃ１２Ｎ 7/02 Ｃ１２Ｎ 7/02
15/09 Ｃ１２Ｑ 1/70
Ｃ１２Ｑ 1/70 Ｃ１２Ｎ 7/00
//(Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:93
Ｃ１２Ｒ 1:93） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ
Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ
，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，
ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ
Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ
，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，
ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ
Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ
，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，
ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 カルドナ キャロル
アメリカ合衆国 カリフォルニア州 デイ
ビス ディー ストリート 523
(72)発明者 ハリス レイモンド ダブリュ．
アメリカ合衆国 ニューヨーク州 ドライ
デン レイク ストリート 122
(72)発明者 シャット カレル エー．
アメリカ合衆国 ニューヨーク州 イサカ
ハント ヒル ロード 147
Ｆターム(参考） 4B024 AA10 AA11 BA32 CA04 HA19
4B063 QA01 QQ10 QR32 QR55 QR62
QS25 QS34
4B065 AA90X AA95X BA14 BA22
BB40 CA43
4C085 AA03 AA04 BA51 BA55 BA59
BA71 BA77 BA78 BA81 CC08
DD24 EE01 FF02 FF18 GG02
GG03 GG04 GG06 GG08
Claims (38)
- 【請求項１】 マレック病（Marek's disease）ニワトリ細胞株-CU147培養
物を提供する段階；および 培養物中でウイルスを増殖させるのに有効な条件下で培養物にニワトリ感染性貧
血ウイルスを接種する段階 を含む、ニワトリ感染性貧血ウイルスを増殖させる方法。 - 【請求項２】 ニワトリ感染性貧血ウイルスが、CIA-1株、Cux-1株、Gifu株
、TK-5803株、CAA82-2株、L-028株、Conn株、GA株、26P4株、SR43株、およびCL-
1株からなる群より選択される、請求項1記載の方法。 - 【請求項３】 マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物がマレック病リンパ
腫細胞に由来する、請求項1記載の方法。 - 【請求項４】 マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物が、マレック病ウイ
ルスによって誘導された早期局所病変から確立される、請求項1記載の方法。 - 【請求項５】 マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物が、マレック病ウイ
ルスおよび同種抗原によって誘導された早期局所病変から確立される、請求項1
記載の方法。 - 【請求項６】 接種する段階が、培養物1mlあたり未希釈ウイルス約20μL〜
培養物1mlあたり未希釈ウイルス約100μLの割合である、請求項1記載の方法。 - 【請求項７】 ニワトリ感染性貧血ウイルスに感染した生物試料を提供する
段階； マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物を提供する段階； ウイルスを培養物に感染させるのに有効な条件下で培養物を生物試料と共にイン
キュベートする段階；および 培養物からウイルスを単離する段階 を含む、試料からニワトリ感染性貧血ウイルスを単離する方法。 - 【請求項８】 生物試料が、血液、粘膜擦過物（mucosal scrapings）、精
液、組織生検、胚組織、分泌物および排泄物、ならびに、体液のぬぐい液（swab
）からなる群より選択される、請求項7記載の方法。 - 【請求項９】 ニワトリ感染性貧血ウイルスが、CIA-1株、Cux-1株、Gifu株
、TK-5803株、CAA82-2株、L-028株、Conn株、GA株、26P4株、SR43株およびCL-1
株からなる群より選択される、請求項7記載の方法。 - 【請求項１０】 マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物がマレック病リン
パ腫細胞に由来する、請求項7記載の方法。 - 【請求項１１】 マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物が、マレック病ウ
イルスによって誘導された早期局所病変から確立される、請求項7記載の方法。 - 【請求項１２】 マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物が、マレック病ウ
イルスおよび同種抗原によって誘導された早期局所病変から確立される、請求項
7記載の方法。 - 【請求項１３】 ニワトリ感染性貧血を潜在的に含む生物試料を提供する段
階； マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物を提供する段階； 生物試料中に存在する任意のウイルスを培養物に感染させるのに有効な条件下で
培養物と生物試料をインキュベートする段階；および 培養物中の任意のウイルスの存在を同定する段階 を含む、試料中のニワトリ感染性貧血ウイルスを同定する方法。 - 【請求項１４】 生物試料が、血液、粘膜擦過物、精液、組織生検、胚組織
、分泌物および排泄物、ならびに体液のぬぐい液からなる群より選択される、請
求項13記載の方法。 - 【請求項１５】 ニワトリ感染性貧血ウイルスが、CIA-1株、Cux-1株、Gifu
株、TK-5803株、CAA82-2株、L-028株、Conn株、GA株、26P4株、SR43株およびCL-
1株からなる群より選択される、請求項13記載の方法。 - 【請求項１６】 マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物が、マレック病リ
ンパ腫細胞に由来する、請求項13記載の方法。 - 【請求項１７】 マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物が、マレック病ウ
イルスによって誘導された早期局所病変から確立される、請求項13記載の方法。 - 【請求項１８】 マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物が、マレック病ウ
イルスおよび同種抗原によって誘導された早期局所病変から確立される、請求項
13記載の方法。 - 【請求項１９】 一定量のニワトリ感染性貧血ウイルスを含有する生物試料
を提供する段階； マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物を提供する段階； ウイルスを培養物に感染させるのに有効な条件下で培養物と生物試料をインキュ
ベートする段階；および 培養物中のウイルスの量を滴定する段階 を含む、試料中のニワトリ感染性貧血ウイルスを定量する方法。 - 【請求項２０】 生物試料が、血液、粘膜擦過物、精液、組織生検、胚組織
、分泌物および排泄物、ならびに体液のぬぐい液からなる群より選択される、請
求項19記載の方法。 - 【請求項２１】 ニワトリ感染性貧血ウイルスが、CIA-1株、Cux-1株、Gifu
株、TK-5803株、CAA82-2株、L-028株、Conn株、GA株、26P4株、SR43株およびCL-
1株からなる群より選択される、請求項19記載の方法。 - 【請求項２２】 マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物が、マレック病リ
ンパ腫細胞に由来する、請求項19記載の方法。 - 【請求項２３】 マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物が、マレック病ウ
イルスによって誘導された早期局所病変から確立される、請求項19記載の方法。 - 【請求項２４】 マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物が、マレック病ウ
イルスおよび同種抗原によって誘導された早期局所病変から確立される、請求項
19記載の方法。 - 【請求項２５】 マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物中で増殖したニワ
トリ感染性貧血ウイルスの免疫学的有効量を含む、ニワトリ感染性貧血ウイルス
用の高力価ワクチン製剤。 - 【請求項２６】 生ワクチンである、請求項25記載のワクチン製剤。
- 【請求項２７】 不活性化ワクチンである、請求項25記載のワクチン製剤。
- 【請求項２８】 薬学的に許容されうる担体をさらに含む、請求項25記載の
ワクチン製剤。 - 【請求項２９】 少なくとも1つの非関連トリ病原体の1つ又は複数の抗原を
さらに含む混合ワクチンである、請求項25記載のワクチン製剤。 - 【請求項３０】 少なくとも1つの非関連トリ病原体が、ニューキャッスル
病ウイルス、感染性気管支炎ウイルス、感染性ファブリキウス嚢病ウイルス（in
fectious bursal disease virus）、マレック病ウイルス、シチメンチョウヘル
ペスウイルス、感染性喉頭気管炎ウイルスまたは他のトリヘルペス、レオウイル
ス、産卵低下（egg drop）症候群ウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、細網内皮症
ウイルス、白血症ウイルス、鶏痘ウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、
アデノウイルスおよびトリインフルエンザウイルスからなる群より選択される、
請求項29記載のワクチン製剤。 - 【請求項３１】 ニワトリ感染性貧血ウイルスが、マレック病ニワトリ細胞
系-CU147培養物中で少なくとも5×107TCID50の力価まで増殖する、請求項25記載
のワクチン製剤。 - 【請求項３２】 マレック病ニワトリ細胞系-CU147培養物中で増殖したニワ
トリ感染性貧血ウイルスから調製された、ウイルスに対する免疫応答を誘導する
のに有効量のワクチンを投与する段階 を含む、ニワトリ感染性貧血ウイルスに対して家禽を免疫化する方法。 - 【請求項３３】 ワクチンが生ワクチンである、請求項32記載の方法。
- 【請求項３４】 ワクチンが不活性化ワクチンである、請求項32記載の方法
。 - 【請求項３５】 ワクチンが、薬学的に許容されうる担体をさらに含む、請
求項32記載の方法。 - 【請求項３６】 ワクチンが、少なくとも1つの非関連トリ病原体の1つ又は
複数の抗原をさらに含む、請求項32記載の方法。 - 【請求項３７】 少なくとも1つの非関連トリ病原体が、ニューキャッスル
病ウイルス、感染性気管支炎ウイルス、感染性ファブリキウス嚢病ウイルス、マ
レック病ウイルス、シチメンチョウヘルペスウイルス、感染性喉頭気管炎ウイル
スまたは他のトリヘルペス、レオウイルス、産卵低下症候群ウイルス、トリ脳脊
髄炎ウイルス、細網内皮症ウイルス、白血症ウイルス、鶏痘ウイルス、シチメン
チョウ鼻気管炎ウイルス、アデノウイルスおよびトリインフルエンザウイルスか
らなる群より選択される、請求項36記載の方法。 - 【請求項３８】 ニワトリ感染性貧血ウイルスが、マレック病ニワトリ細胞
系-CU147培養物中で少なくとも5×107TCID50の力価まで増殖する、請求項32記載
の方法。
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