JP2003529335A - Ｎｆ１遺伝子の改良突然変異解析 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、患者の神経線維腫症１（ＮＦ１）遺伝子の突然変異解析方法に関し、該方法は、前期患者の末梢血リンパ球からＤＮＡを抽出する工程と、前記患者によるリンパ球を用いてＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球腫細胞系を確立する工程と、前記ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球腫細胞系培養物をピューロマイシンによって処理する工程と、前記細胞系の培養物からＲＮＡをただちに抽出する工程と、適切なプライマーを用いて前記ＲＮＡを増幅する工程と、前記増幅断片のインビトロ転写／翻訳によってペプチド断片を得る工程より成る。この新たなアプローチによって、不安定で、誤ってスプライスされた転写物によって通常は実施するのが困難であった、はるかに迅速で、感受性および信頼性の高いＮＦ１突然変異の解析が行える。この技術を用いると、ＮＦ１遺伝子内の突然変異はすべての患者の８３％で検出可能であり、これは以前に述べた解析技術（７１％）と比較して著しく高く、他の試験で予想される偽陽性を生じない。本発明は、新たなホットスポットおよび特異性ＮＦ１突然変異の同定にも関する。本発明は、上述の特異性突然変異およびホットスポットドメインを検出する診断キット、特異性突然変異ＮＦ１タンパク質の構造を修正する化合物、これらの治療用化合物のスクリーニングに使用できるインビトロおよび生体内システムを含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 ＮＦ１遺伝子改良突然変異解析

【０００２】 本発明は、神経線維腫症１型（ＮＦ１）の改良された遺伝子診断方法の分野に
関する。さらに詳細には、本発明は、Ｎ．Ｉ．Ｈ．診断基準を満足する散発性Ｎ
Ｆ１患者と同様に家族性ＮＦ１患者において少なくとも８３％以上の突然変異の
同定につながる、より迅速で信頼性が高いタンパク質切断解析によるＮＦ１遺伝
子の最適化された突然変異解析に関する。現在の技術により、ＮＦ１遺伝子の突
然変異特異性を定義することができる。

【０００３】 神経線維腫症１型は、最も一般的な常染色体優性障害の１つであり、すべての
民族において約３５００人に１人に影響を及ぼしている。主要な特徴は、皮膚お
よび皮下神経線維腫、カフェオレ（ＣＡＬ）皮膚斑、虹彩Ｌｉｓｃｈ小結節およ
び色素斑である（Husonら、1994）。少数の患者のみに見られる他の特徴として
は、脊柱側彎症、大頭蓋症、偽関節、低身長、悪性腫瘍および学習障害を含む。
ＮＦ１の最も恐れられている合併症の１つは、悪性腫瘍である。この障害は、腫
瘍抑制遺伝子の突然変異により、遺伝性癌症候群と共通の特徴を共有している。
これらは以下の通りである：ｉ） 神経堤および骨髄系細胞における原発性癌の
組織限定的な発生； ii） 全体的な母集団と比較して、悪性腫瘍の発症年令の
低下； iii） 一部の患者における複数の原発性腫瘍の発生。

【０００４】 ＮＦ１遺伝子は、1７ｑ１１．２にマップされており、位置クローニングされ
ていた（Cawthonら、1990; Viskochilら、1990; Wallaceら、1990）。ＮＦ１遺
伝子は、大きさがほぼ３５０kbであり、６０のエキソンを含み、２８１８アミノ
酸をコード化する読み取り枠によって、遍在的に発現される１１−〜１３−kb転
写物をコード化する（Marchukら、1991）。コード化配列の中心部は、ＧＴＰａ
ｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）に相同性を示し、タンパク質はこのＧＡＰ関連
ドメインによってＲａｓ経路をダウンレギュレートする（KimおよびTamanoiにに
よる総説、1998）。

【０００５】 ＮＦ１遺伝子の突然変異率は、ヒト遺伝子について既知の遺伝子のうち最も高
いものの１つであり（HusonおよびHughesによる総説、1994）、ＮＦ１患者全体
の約５０％が、デノボ生殖系列突然変異を有すると思われる散発性症例として提
示している。これらの患者の場合、病原性生殖系列突然変異の同定のみによって
、子孫の前駆症状／出生前検査が可能となる。突然変異は、ＷＴタンパク質に加
えて突然変異形の合成を引き起こす両方の対立遺伝子のうちの１つに位置してい
る。ＷＴ ＮＦ１タンパク含有量が減少すると、細胞の疾病状態が結果として生
じる。ＮＦ１が優性障害であるため、ＮＦ１突然変異についてヘテロ接合性であ
る個体は、５０％またはそれ以下のレベルでＮＦ１をなお発現することがある。
腫瘍において、残りの対立遺伝子の第２ヒット（ヘテロ接合性の欠如または点突
然変異）によってさらに、細胞中ののニューロフィブロミン含有量が減少する。
すべての人種でこの障害の頻度が高いにもかかわらず、分子レベルで同定された
突然変異は比較的少ない。ＮＦ１患者の突然変異解析は、労力を要することが判
明し、大きなサイズの遺伝子、多数のエキソン、複数の偽遺伝子の存在（Cummin
gら、1993；Hulsebosら、1996）および多様な突然変異（すなわちナンセンス、
フレームシフトおよびミスセンス突然変異、小規模な挿入または欠損、遺伝子全
体を含む大規模な欠損、転座など）によって妨げられる。検出率が１０〜６５％
に範囲に渡る多くの技術が、ＮＦ１突然変異の研究に利用されている（Abernath
yら、1997, Fabsoldら、2000, Arsら、2000）。

【０００６】 限られた数の突然変異「ホットスポット」が報告されている：エキソン３１の
Ｒ１９４７Ｘ（Ｃ５８３９Ｔ）、エキソン３７のヌクレオチド６７８９と６７９
２の間の４ｂｐ領域はどちらも、ＮＦ１患者の約２％に関係している（Upadhyay
aおよびCooperによる総説、1998)。また、エキソン4bは、他者によりによって突
然変異ホットスポットを含むと考えられている(Toliatら、2000）。最近、我々
は他の突然変異ホットスポットがエキソン１０ｂに存在し、異常スプライシング
に関連したミスセンス突然変異が潜んでいることを発見した（Messiaenら、1999
）。

【０００７】 これまで、相補性技術を段階的に組み合わせて用いた広範な解析によってＮＦ
１遺伝子の突然変異のスペクトルを描写しようとした研究はなかった。散発性患
者の子孫について遺伝検査が要求された場合、病原性突然変異の同定のみによっ
て出生前／予測検査が可能であるため、高い突然変異検出率は特に重要である。
さらに、ＮＦ１遺伝子の突然変異を高感度で発見できる技術が利用可能になれば
、Ｎ．Ｉ．Ｈ．診断基準をいまだに満足しない患者の診断に役立つであろう。

【０００８】 タンパク切断試験（ＰＴＴ）は、Roestらによって１９９３年に最初に述べら
れた突然変異検出の形式である。ＰＴＴは、ＲＴ−ＰＣＲ断片のインビトロ転写
および翻訳により、遺伝子の全コード化領域を解析することが可能とし、未熟な
停止コドンの発生によって、またはエキソンまたはエキソン断片のたとえばフレ
ーム内読み飛ばしによって切断タンパク質が生じる突然変異を特異的に検出する
。

【０００９】 インビトロタンパク質合成に基づくタンパク質切断試験（ＰＴＴ）は、２１名
の無関係な患者のＮＦ１コード化配列全体に対して、Heimら（1995）により最初
に実施され、ｃＤＮＡレベルで１４の突然変異が同定された（検出率６６％）。
しかし、著者らがゲノムレベルで突然変異を同定できたのは、患者のうち１１名
のみであり、ゲノムレベルでの検出レベルに到達できたのはわずか１１／２１で
あった（５２％）。この失敗の理由は論文では議論しなかった。Parkら（1998）
は１４名の無関係を研究し、１０の突然変異が開示された（７１％）。ここでも
、ｃＤＮＡで見られた変化の１つは、ゲノムＤＮＡレベルで解明不可能であり、
９／１４（６４％）という検出レベルに達した。Heimら（1995）の実験は血液細
胞またはリンパ芽球腫細胞系のいずれかから開始したのに対し、Parkら（1998）
末梢血のみを使用した。

【００１０】 ＰＴＴを使用して高いスループットのスクリーニングを実行可能にするために
は、手順を大きく改良することが要求される（Den DunnenおよびVan Ommen, 199
9）。特に、ＮＦ１突然変異の実験室での試験は困難である。タンパク質切断試
験は市販されているが、その感度、特異性および予測値は確立されていない（Ra
smussenおよびFriedman, 2000）。

【００１１】 それゆえ本発明の目的は、現在周知のタンパク質切断解析システムより高速で
信頼性が高い、ＮＦ１遺伝子の最適化された突然変異解析方法を提供することで
ある。この最適化システムは、迅速な遺伝ＮＦ１診断に使用できるキットの開発
に適用可能である。 加えて本発明は、ＮＦ１遺伝子の突然変異特異性の定義を可能にする、新規の
ホットスポットドメインおよび特異性突然変異のキャラクタリゼーションへのこ
の最適化方法の使用にも関する。

【００１２】 これらの目的は、以下の態様によって満たされている。

【００１３】 本発明はさらに詳細には、以下の工程を含む、患者のＮＦ１遺伝子の突然変異
解析の方法に関する（図１および２を参照）： ａ） 前記患者の末梢血リンパ球を分離する工程、 ｂ） 前記患者の前期末梢血リンパ球によってＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球腫細
胞系を確立するか、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）刺激により血液リンパ球を
短期間培養する工程、 ｃ） ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球腫細胞系又は短期間培養物を、タンパク質合
成阻害剤を有するタンパク質合成阻害剤によって処理する工程、 ｄ） 前記ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球腫細胞系より培養物のＲＮＡをただちに
除去する工程、 ｅ） 適切なプライマーを用いて、前記ＲＮＡを増幅する工程、 ｆ） 工程ｅ）の前記増幅断片のインビトロ転写／翻訳によって、ペプチド断片
を得る工程。

【００１４】 さらなる態様により、本発明は、ｆ）に少なくとも以下の工程（図１を参照）
が続く、上述の方法にも関する： ｇ） 前記ペプチド断片の分離； ｈ） ＰＴＴアッセイにおいて切断ペプチドを生じたｃＤＮＡ断片のサイクル配
列決定。タンパク質合成阻害剤によって処理した場合と、処理しない場合のＥＢ
Ｖ形質転換Ｂリンパ芽球腫細胞系より調製されたｃＤＮＡのサイクル配列決定を
比較した。これにより、以下で説明するように、以上断片をより容易に検出でき
るようになり、影響を受ける細胞のミュータント転写物の安定性に関する情報が
与えられる。 ｉ） 内部ｃＤＮＡ欠損によりゲノム変化がありそうな部位を判定できると思わ
れる場合、「ニューラルネットワークを使用したスプライス部位予測」（http:/
/www-hgc.lbl.gov/projects/splice.html, Messiaenら、2000）を使用した推定
スプライス部位に関する、サイクル配列決定クロマトグラムの評価。 ｊ） 興味のあるエキソンのサイクル配列決定によるゲノム突然変異の同定。

【００１５】 遺伝子解析により、疾病進行の初期段階で遺伝子突然変異を発見する可能性が
生まれるため、処置が可能となる場合には、初期フェーズにて症状を軽減させる
か、停止させることさえ可能である。本発明は、神経線維腫症１型（ＮＦ１）遺
伝子の遺伝子解析方法を提供する。遺伝子のサイズが大きいことと、比較的感受
性の低い技術によって、特にこのＮＦ１遺伝子については、原因突然変異の検出
が特に困難となっている。ＮＦ１は最も一般的な、突然変異率の高い常染色体優
位性障害の１つであるため、本症を診断するために有効で信頼性が高い方法が利
用可能であることは、医学の主要な関心事である。したがって、特に無／少症候
性であることの多い新生児および幼児でのＮＦ１突然変異のスクリーニングは、
本発明の主要な用途の１つである。ＮＦ１遺伝子は遍在的に発現するため、被検
者の試験サンプルは様々な組織または血液から得ることができる。ＮＦ１ ＤＮ
Ａ、ＲＮＡまたはタンパク質は羊水および絨毛膜絨毛でも評価できるため、ＮＦ
１試験は出生前試験のパネルに含めることもできる。本発明のさらなる説明によ
って、血液細胞から始まる技術を説明するが、それにもかかわらず説明された原
理は他の細胞から開始する場合にも適用可能である。

【００１６】 解析は、開業医の診療または病院などのあらゆる場所から送り出される血液に
実施できる。末梢血リンパ球はフィトヘマグルチニン刺激を使用して、短時間で
培養できる。あるいは、ＥＢＶ形質転換細胞系によっても、制御された環境での
反復解析が可能となる。

【００１７】 好ましくは、本発明は、前記たんぱく合成阻害剤がピューロマイシン、アクチ
ノマイシンＤ、シクロヘキシミドまたはその可能性のある類似体から成る群より
選択される、上に記載の方法を提供する。これらはすべて、ミュータント転写物
のナンセンス仲介減衰を防止する。突然変異は、ミュータント転写物の不安定性
および「未成熟終止コドン誘起」ｍＲＮＡ減衰により、ピューロマイシン処理を
行わない培養物から開始する突然変異は、失われる可能性がある。ピューロマイ
シンは、提案された方法において好ましい。ピューロマイシンは連鎖停止を引き
起こすｔＲＮＡ類似体であって、ｈＭＳＨ２遺伝子の場合であるとを示されたよ
うに、細胞系のナンセンス仲介減衰を阻止する（Andreutti-Zauggら、1997）。
ＮＦ１ミュータント転写物の安定性に対するピューロマイシンの効果は、以前に
実験的に調査されなかった。本発明の発明者は、細胞培養へのピューロマイシン
の添加も、ＮＦ１遺伝子ミュータント転写物の解析を改良することが可能であり
、それによりＮＦ１遺伝子診断の効率が向上することを初めて証明した。

【００１８】 現在までＮＦ１突然変異解析の場合、ＲＮＡ分離を開始する場合に、何の指標
も利用できなかった。発明者らは、特異的状態において新たに生成されるＮＦ１
メッセンジャＲＮＡが最も重要であることを指摘している。確かに本発明により
、前記ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球腫細胞系の培養物またはＰＨＡ刺激血リンパ
球の短期培養物をインキュベータから回収したら、ただちにＲＮＡを抽出するこ
とが不可欠である。発明者らが示すように、室温での細胞培養物のインキュベー
ションは、ＮＦ１解析の解釈に影響するスプライス生成物を代わりに作成するＮ
Ｆ１メッセンジャのスプライシングに影響する。発明者らは、ＰＴＴを疾患原因
突然変異の発見のために正しく適用するための重要なパラメータは、手順を開始
するのに用いるＲＮＡの品質であることを示した。室温でしばらくの間保管され
る末梢血細胞から抽出されるＲＮＡを用いて開始すると、ＰＴＴ ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにおいてと同様に、ＲＴ−ＰＣＲの後に「偽性」バンドが非常に頻繁に存在
していることに注目した。前記ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球腫細胞系を室温で培
養する場合、これも考えられる人為的結果を説明していることは、当業者には明
白である。したがって、発明者らにより、ＲＮＡをインキュベータから取り出し
たら、ＲＮＡを細胞系からただちに抽出する必要があることも示唆される。イン
キュベータは、安定したＣＯ₂圧および温度（３７℃）によって、細胞発育のた
めの最適化環境を作る。結果として、細胞を除去後にただちに解析すると、後成
的因子が、これらの欠損転写物の発生につながる潜在性スプライス部位の活性化
に影響を与える時間がない。発明者は、「加齢」の血液サンプルから抽出したＲ
ＮＡがエキソンの読み飛ばし増加につながり、それゆえ、ゲノム変化のない場合
に突然変異の存在を模倣することを示した。これは患者のゲノムバックグラウン
ドを誤って解釈させ、医学的診断では許すことはできない。ＲＮＡが「加齢」の
血液から分離される場合に、不正確なスプライシングプロセスがＴＳＧ１０１お
よびＦＨＩＴの特異性遺伝子転写物に発生する可能性があることがわかっている
が（Gaytherら、1997）、この不正確さは遺伝子特異性であり、一般化した現象
ではない。確かに、これはＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＵＳＨ１、ｈＭＳＨ２
、ＩＧＦ２受容体ＰＣＴＤβおよびＲＢなどの、他の腫瘍抑制遺伝子の他の転写
物では発生しない（Gaytherら、1997）。したがって、ＮＦ１遺伝子ではこの現
象は明らかには発見されなかった。

【００１９】 好ましい態様によれば、本発明は、前記患者のＤＮＡに存在する突然変異をさ
らに解析するために、前記患者のただちに分離された末梢血リンパ球から、ただ
ちにＲＮＡを抽出する、上に記載の方法に関する（図１）。またこの場合、後成
的因子には、潜在性部位の活性化に影響を及ぼす時間がない。用語「ただちに」
は、血液採取後より２時間以内、好ましくはできるだけ早くを意味する。サンプ
ルが海外から発送される臨床慣例の場合によくあるように、ＲＮＡは血液のプレ
レベーション（prelevation）直後に抽出できない場合が多く、リンパ球は、３
７℃におけるフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）刺激により、短期間（４８−１６
８時間）の培養で再生する。短時間培養によってさらに、ＲＮＡ抽出のためには
るかに大規模な細胞個体群を得ることができる。

【００２０】 好ましくは、本発明による方法は、逆転写酵素（ＲＴ）工程と、それに続く、
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である増幅工程を含む（図１）。この工程によ
り、ＮＦ１遺伝子をコードするドメイン全体をカバーする遺伝子断片の増幅が可
能となり、複数にエキソンより成る遺伝子の解析がさらに容易になる。

【００２１】 好ましくは、本発明は、工程ｄ）で抽出する前記ＲＮＡがＲＮＡ全体である、
上に記載の方法を提供する。ＲＮＡ全体の分離は、ｍＲＮＡの分離と比較して安
価であり、増幅条件およびプライマーを方法に説明されているように適切に選択
した場合、特異性遺伝子生成物の増幅が結果としてなお生じる。増幅生成物を用
いて、対応するＤＮＡ配列を検証するか、対応するタンパク質を生成することが
できる（図１および２）。

【００２２】 前記ＰＣＲ生成物をインビトロ翻訳システムに使用できるので、ＮＦ１−ペプ
チド断片が作成可能である。さらに本発明は好ましくは、工程ｆ）に前記ペプチ
ド断片の分離が続く、上に記載の方法を提供する。この分離は、ＳＤＳ ＰＡＧ
Ｅ（１次元または２次元）などの当業界で周知のいかなる技術によっても実施で
きる。Heimら（1995）およびParkら（1998）が述べたように、前の実験において
等方性３５Ｓ−メチオニンがそのように分離されたペプチドに含まれているため
、Ｘ線写真を使用して分離されたペプチドを容易に描出できる。従来技術とは反
対に、発明者らは標識を３Ｈ−ロイシンに変更した。ラベルの変更により、突然
変異解析の感受性が著しく上昇した。この上昇は、ＮＦ１タンパク質には、この
タンパク質中に存在するメチオニンの数と比較してロイシン残基が豊富であるた
めに、特性標識をより多く含有することが可能となり、それゆえ検出効率が上昇
する、という事実によって説明できる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの代わりに、得られた
ペプチド個体群を解析するために、質量解析またはMalditoffを使用できる。

【００２３】 本発明は、体細胞モザイクと表される、散発性患者のＮＦ１突然変異を同定可
能なほど感受性である方法を提供する。さらに詳細には、試験の感受性によって
、調査中の細胞の１０％以上にＮＦ１突然変異が存在すれば、それを検出するこ
とができる（図１７）。今まで、体細胞モザイクは、ＦＩＳＨ解析によってのみ
、大規模な欠損のある患者についてのみ検出可能であった。他の研究は、散発性
患者の突然変異を、同等の効率で同定できなかった（Arsら（1995）：散発性患
者において検出率５１％；Fahsoldら（2000）：家族性と散発性の間で特異化な
しの検出率５３％；我々のデータ：ＰＴＴのみによる散発性症例において検出率
８３％）。そこで、検出効率を向上させることにより、点突然変異がある場合で
さえ、我々はこの異常を検出できる。これは、病原性突然変異の同定によっての
み、将来の世代の前駆症状／出生前診断が可能である散発性患者に関しては、最
も重要である。

【００２４】 本発明は、タンパク質分離によって切断ペプチドが観察される場合、工程ｅ）
で得られた増幅ｃＤＮＡ断片が、ｍＲＮＡレベルでの突然変異の影響のキャラク
タリゼーションを可能にするサイクル配列決定によって解析される、上に記載の
方法も提供する。この増幅ｃＤＮＡ断片がインビトロのＰＴＴ系などによって与
えられるヒントなしで解析可能なことは、除外されない。さらに、ピューロマイ
シンを用いて、あるいは用いずに処理した細胞からのｃＤＮＡ解析の比較によっ
て、影響を受ける細胞のミュータントｍＲＮＡの安定に関する情報を与えること
ができる。安定したｍＲＮＡによって、切断ニューロフィブロミンが生成される
ことがあるため、この情報はニューロフィブロミンにおける新しい推定機能性ド
メインを示すことがある。

【００２５】 好ましくは、前記解析は、適切なプライマーによる適切な断片のサイクル配列
決定によって実施できる。ペプチド断片の長さから、どのプライマーが適切であ
るかは大部分が知られている。これらの断片それぞれの増幅用プライマーは、既
知であるか、または直ちに作成できる（表２および３、またはいずれかの所与の
表を参照）。断片増幅に使用するプライマーは、増幅断片のそれぞれの配列に適
用できる。この後者の場合、プライマーは、当業者によって周知であるように、
標識される。

【００２６】 好ましくは、本発明によるそのような方法は、図２またはいずれかの表または
実施例または図説明文に示す工程ｅ）プライマーのプライマーとして使用する。

【００２７】 本発明による好ましい方法は、非等方性標識プライマーを使用する。前記標識
は、蛍光、ビオチン、Ｃｙ５、ＦＡＭ６、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸより成る群から選
択される。

【００２８】 生成されたｃＤＮＡ断片は、ＡＬＦ−シーケンサ（Pharmacia）、ＡＢＩ−３
７０（Perkin Elmer）または他のいかなる感受性半自動または全自動配列決定シ
ステムによってさらに解析される。

【００２９】 現在、大量の患者のためにルーチンＮＦ１突然変異診断アッセイを実施してい
る研究所は、世界のどこにもない。この理由の１つは、ＮＦ１遺伝子突然変異の
ルーチンの診断試験用の高感受性および高特異性方法を発見できないためである
。したがって、ＮＦ１突然変異の有無に関する改良診断方法を有することは、非
常に望ましい。

【００３０】 現在の最適化タンパク質切断検査によって、Ｎ．Ｉ．Ｈ．診断基準を満足する
ＮＦ１患者の生殖系列突然変異の８３％以上が同定ができる。ＰＴＴによって検
出できる突然変異のスペクトルは、ナンセンス突然変異、フレームシフト突然変
異、スプライス突然変異、使用されたプライマーによってフランキングられてい
る領域を含まない欠損に限定され、すべては未熟終止コドンにつながる。ミスセ
ンス突然変異、小規模な（ヌクレオチド８０未満）、フレーム内欠損および／ま
たは挿入、大規模な欠損および転座などの細胞発生異常を検出するには、別の方
法が必要である。

【００３１】 本発明の方法は、ＮＦ１疾患関連突然変異の効果的な分子診断のための階層シ
ステムに関する。突然変異のスペクトルにより、異常なスプライス突然変異の発
生率が高いことが明らかになる。これらの突然変異の多くは、多くのスプライス
突然変異が限界スプライス受容体／供与体の外側のイントロン突然変異によって
引き起こされるように、ゲノム走査技術を用いて消失させる。さらに、ゲノムレ
ベルで「沈黙」と呼ばれる一部の突然変異は、新しいスプライス受容体または供
与部位を作成し、ＲＮＡベースの突然変異検出法によって病原であることが証明
される。

【００３２】 階層システムにおいて、最適化ＰＴＴシステムによって陰性と評価された患者
の第２レベルの解析には、ミスセンス突然変異および／または小規模なフレーム
内挿入および／または欠損を検出する方法を含む。これらの解析は、ヘテロ二重
鎖解析（ＨＡ）および／または一本鎖配座多型（ＳＳＣＰ）解析および／または
変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）および／または配座感受性ゲル電気泳動（Ｃ
ＳＧＥ）および／または（サブクローニングの有無にかかわらない）直接サイク
ル配列決定によって実施できる。

【００３３】 前記ＨＡまたは一本鎖確認解析は、異常な移動性ＰＣＲ断片を検出するために
実施され、この断片はサイクル配列決定によってさらに解析される。

【００３４】 本発明による、ＮＦ１生殖系列突然変異のキャラクタリゼーションのための、
好ましい複合アプローチは、上で詳細に述べ、実施例および図説明文に示すＥＢ
Ｖ形質転換細胞系によるタンパク質切断試験と、その後の直接ｃＤＮＡおよびｇ
ＤＮＡＤＮＡ配列決定、ヘテロ二重鎖解析、その後の直接ｇＤＮＡ配列決定、Ma
rchukら、1991で述べられているプローブＧＥ２−ＦＦ１３−ＦＦ１−ＦＢ５Ｄ
ＡＥ２５−Ｐ５−Ｂ３Ａを使用したサザンブロット解析（これらのクローンは
、Francis Collinsの寄贈による）、遺伝子内コスミドまたはＰＡＣクローンを
使用したＦＩＳＨ（蛍光原位置ハイブリダイゼーション）解析、そして細胞遺伝
解析を含む。

【００３５】 本発明は好ましくは、図７および８に示すように、前記プライマーがそれぞれ
、ＮＦ１遺伝子の配置されたフランキングエキソン４ｂ、７、１０ａ−１０ｃ、
１３、２３．２、２７ａ、２９、３７また３９である、上に記載の患者のＮＦ１
遺伝子の突然変異解析方法を提供する。我々は前に定義したように、ＮＦ１の突
然変異スペクトルおよび突然変異ホットスポットの同定が、ＮＦ１遺伝子のコー
ド化領域全体が以前の研究でスクリーニングされなかったという事実によってと
同様に、使用された技術の限界によって偏っていることを発見した。我々は、そ
の例として、以前に同定されなかったＮＦ１遺伝子における突然変異の複数のホ
ットスポットドメイン：すなわちエキソン７、エキソン１０ａ−１０ｂ−１０ｃ
、エキソン１３（２０３３ｉｎｓＣ）、エキソン２３．２（Ｒ１３６２Ｘ）、エ
キソン２７ａ（Ｒ１５１３Ｘ）、エキソン２９（Ｒ１８４９Ｘ）、エキソン３９
（２２６６ｄｅｌＮＦ）について説明する。本発明の原理による、これらの特異
性新規ホットスポット内の突然変異のスクリーニングおよび診断用のアッセイキ
ットも提供される。これらのドメインに焦点を当てることによって、突然変異を
診断できるスピードが改善される。

【００３６】 本発明は、以前に発表した突然変異以外に、以下の新規特異性のフレームシフ
ト、ナンセンスまたはスプライス突然変異も検出する方法も提供する（表１を参
照）：Ｋ３３Ｋ （９９ｄｅｌ１０５）， Ｃ９３Ｙ （２７８Ｇ＞Ａ）， Ｃ
１ ＄８７Ｙ （５６０Ｇ＞Ａ）， Ｒ１９２Ｘ （５７４Ｃ＞Ｔ）， ６０３
−６０４ｉｎｓＴ （同上）， Ｑ２０９Ｘ （６２５Ｃ＞Ｔ）， ８１９−８
２１ｄｅｌＣＣＴ （同上）， ８８９−４５４ｄｅｌ４７４ｎｔ （８８８ｄ
ｅｌ１７４）） ９８７−９８８ｉｎｓＡ （同上）， １２６１−１９Ｇ＞Ａ
（１２６０ｉｎｓＴＴＴＧＴＴＴＴＴＣＴＣＴＡＧＴＣ）， Ｗ４２５Ｘ （
１２７５Ｇ＞Ａ）， Ｒ４６１Ｘ （１３８１Ｃ＞Ｔ）， Ｙ４８９Ｃ （１４
６５ｄｅｌ６２）， １４６６ｉｎｓＣ （同上）， １５２７＋５Ｇ＞Ａ （
１３９２ｄｅｌ１３５）， Ｅ５２４Ｘ （１５７０Ｇ＞Ｔ）， １６０５ｉｎ
ｓＡ （同上）， Ｓ５３６Ｘ （１６０７Ｃ＞Ａ）， １６４２−３Ｃ＞Ｇ
（１６４１ｄｅｌ８０）， ２３０５ｉｎｓＴ （同上）， ２５８５ｉｎｓＡ
（同上）， ２８３６ｉｎｓＴ （同上）， ２８５０＋２ｄｅｌ６ （２６
１７ｄｅｌ２３３）， ２８５１−６ｄｅｌ４ （２８５０ｄｅｌ１４０），
Ｑ９５９Ｘ （２８７５Ｃ＞Ｔ）， Ｑ９６３Ｘ （２８８７Ｃ＞Ｔ）， ２９
９０＋３Ａ＞Ｃ （２８５０ｄｅｌ１４０）， Ｙ１０４４Ｘ （３１３２Ｃ＞
Ａ）， ３１９３ｄｅｌＣ （同上）， Ｖ１０９３Ｍ （３２７７Ｇ＞Ａ／
３２７４ ｄｅｌ４０）， ３１０８−３Ｃ＞Ｇ （３３１４ｄｅｌ１８２），
Ｅ１１２３Ｘ （３３６７Ｇ＞Ｔ）， ３４５７ｄｅｌＣＴＣＡ （同上），
Ｑ１１７４Ｘ （３５２０Ｃ＞Ｔ）， ３７０４ｄｅｌＡ （同上）， ３７
０８＋１Ｇ＞Ｃ （３４９６ｄｅｌ２１２）， ４０２６ｄｅｌＧ （同上），
４２９９ｄｅｌＣ （同上）， Ｑ１４９４Ｘ （４４８０Ｃ＞Ｔ）， ４５
１５−２Ａ＞Ｔ （４５１５−１４ｉｎｓ１ ４／４５１５−１７ｉｎｓ１７）
， ４７７３−２Ａ＞Ｔ （４７７２ｄｅｌ４３３／４７７２ｄｅｌ２９３），
５０３３ｄｅｌＧ （同上）， ５１１７ｄｅｌＴ （同上）， Ｒ１８４９
（５０２ｄｅｌ３４１／５２０５ｄｅｌ５４４）， Ｓ１７５５Ｘ （５２６
４Ｃ＞Ｇ）， Ｓ１７６５Ｘ （５２１５ｄｅｌ９０／５２９４Ｃ＞Ａ）， ５
５６７ｄｅｌＴ （同上）， ５７９８ｄｅｌＣ （同上）， Ｑ１９６６Ｘ
（５８９６Ｃ＞Ｔ）， ６５７７ｄｅｌＧＡＧｇｔａ （６３６４ｄｅｌ２１５
）， Ｒ２２３７Ｘ （６７０９Ｃ＞Ｔ）， ６８５８Ｇ＞Ｃ （６７５６ｄｅ
ｌ１０２）， ７１ ２７−１２Ｔ＞Ａ （７１２６ｄｅｌ１３２／７１２７−
１０ｉｎｓ１０）， ７２６８ｄｅｌＣＡ （同上）， Ｋ２４０１Ｘ （７２
０１Ａ＞Ｔ）， Ｒ２４２９Ｘ （７２８５Ｃ＞Ｔ）， ７８８４−７８８５ｄ
ｅｌＧＴ （同上）， ８０１６ｄｅｌＡ （同上）。ＮＦ１タンパク質に関し
て発見された突然変異の名称は、Antonarakis(1998）が推奨するとおりである。
ｍＲＮＡレベルでの突然変異の効果は括弧の間にある。すべての突然変異は、ゲ
ノムＤＮＡレベルで存在することが確認された。新規にバランスされた転座ｔ（
１４；１７）（ｑ３２；ｑ１１．２）は、ＮＦ１遺伝子を妨害する：ＰＡＣ９２
８ｂ９はｄｅｒ（１７）上で発見され、ＰＡＣ１００２ｇ３はｄｅｒ（１４）に
発見された。

【００３７】 本発明は、ゲノムＤＮＡ内の特異性突然変異によって「フレーム内で」スキッ
プされ、結果として安定なｍＲＮＡを生成する、ＮＦ１遺伝子の多数の領域を示
している。多数のミスセンス突然変異も同定された。どちらのタイプの突然変異
も、切断／変性ニューロフィブロミンの生成につながることがあり、これらの突
然変異はニューロフィブロミンの新しい機能性ドメインを示す。

【００３８】 これまでは、中央のＧＡＰ関連ドメインのみが、よくキャラクタリーぜーショ
ンされていた（図７および８のＧＲＤ）。ｃＡＭＰ仲介シグナル伝達に関与する
領域はショウジョウバエに存在し、おそらく人間にも存在するが、ＮＦ１遺伝子
内のその位置はいまだに定義されていない。ニューロフィブロミンの微小管への
結合を仲介する領域も、定義されていない。本明細書で示す研究のように、注意
深い突然変異解析は、ＮＦ１遺伝子のこれらおよび他の機能に関与する領域を示
すことができる。特に以下の領域は重要であり、ここで最初に説明する：エキソ
ン２（Ｋ３３Ｋにより仲介）の最後の１０５ｎｔのフレーム内スキッピング、Ｃ
８３Ｙ（エキソン３）、Ｃ９３Ｙ（エキソン４ｂ）、２７４ｄｅｌＬ（エキソン
６）、（たとえば５２７＋５Ｇ＞Ａによって仲介された）エキソン１０ｂのフレ
ーム内スキッピング、エキソン１１および１２ａ両方のエキソンのフレーム内ス
キッピング（ＩＶＳＩ２ａ＋１Ｇ＞Ｔ）、Ｌ８４７Ｐ（エキソン１６）、（たと
えば Ｓ１７６５Ｘによって仲介された）エキソン２９の最初の９０ｎｔのフレ
ーム内スキッピング、（たとえば６７９２Ｃ＞Ａ、６７９２Ｃ＞Ｇ、 Ｋ２２８
６Ｎによって仲介された）エキソン３７のフレーム内スキッピング、（たとえば
１ＶＳ３９−１２Ｔ＞Ａによって仲介された）エキソン４０のフレーム内スキッ
ピング。これらの特異性突然変異を含む確立されたＥＢＶ細胞系は、ＮＦ１タン
パク質上への追加の機能性領域を定義する目的で、タンパク質研究をさらに実施
するのに有用なツールである。たとえば、特異性転写物をこれらのＥＢＶ細胞系
から分離し、２−ハイブリッドスクリーニングのセットアップに使用することが
できる。

【００３９】 本発明は、上述した新規特異性突然変異または新規突然変異ホットスポット領
域を含む遺伝子ドメインを特に増幅するプライマーを含む、患者のＮＦ１遺伝子
の突然変異解析用の診断キットにも関する。

【００４０】 本発明は、上述した新規突然変異ホットスポット領域および新規突然変異を含
む遺伝子ドメインを特に検出するプローブを含む、患者のＮＦ１遺伝子の突然変
異解析用の診断キットにも関する。

【００４１】 用語「核酸」は、生体サンプル中に存在する一本鎖または二重鎖核酸配列を指
し、前記核酸サンプルはデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドより
成り、増幅ｃＤＮＡまたは増幅ゲノムＤＮＡである。

【００４２】 用語「プローブ」は一本鎖オリゴヌクレオチドを指し、デオキシリボヌクレオ
チドまたはリボヌクレオチド、ヌクレオチド類似体または修飾ヌクレオチドより
成り、増幅ｃＤＮＡまたは増幅ゲノムＤＮＡである。

【００４３】 本発明のプロセスで使用されるプローブは、対応するヌクレオチド配列を含む
挿入物を含む組換えプラスミドのクローニングなどの、当業界で周知のどの方法
によっても、必要ならば、適切なヌクレアーゼを用いながら、クローン化プラス
ミドから対応するヌクレオチド配列を開裂させて、（たとえば分子量による分画
により）それらを回収することによって生成できる。プローブはたとえば、従来
のホスホトリエステル法によって、化学的に合成することもできる。

【００４４】 本発明のプローブは選択的にいずれかの従来の標識を使用して標識することが
できる。これは、増幅のポリメラーゼ工程の間に、あるいは当業者に周知の他の
方法によって、組込まれる標識ヌクレオチドの使用を含む。

【００４５】 用語「プライマー」は、複製される核酸鎖に対する相補性であるプライマー伸
張生成物の合成のための開始点として作用することのできる、一本鎖ヌクレオチ
ド配列を指す。プライマーの長さおよび配列は、伸張生成物の合成を初回刺激可
能である必要がある。好ましくは、プライマーは約５〜５０ヌクレオチドである
。特異的な長さおよび配列は、複雑性あるいは要求されるＤＮＡまたはＲＮＡ標
的はもちろんのこと、温度およびイオン強度などのプライマーの使用条件にも依
存する。

【００４６】 本発明は、ＮＦ１遺伝子またはそのミュータントバージョンの約１５以上の連
続ヌクレオチド、好ましくはから１５〜５０ヌクレオチドの核酸配列も都合よく
提供する。これらの配列は、上に記載の発明の配列に特異的にハイブリダイズす
るプローブとして、または上に記載の本発明の配列の特異性増幅または複製を開
始するためのプライマーなどとして使用される。これらは本発明による核酸の存
在を検出する診断キットなどにも使用できる。これらの試験は一般に、ハイブリ
ダイズ条件下でプローブをサンプルと接触させることと、プローブとサンプル中
のいずれかの核酸との間で、二重または三重鎖形成の存在を検出することを含む
。

【００４７】 ＮＦ１遺伝子における特異性突然変異の同定は、治療の意味も有する。突然変
異ＮＦ１タンパク質の欠陥構造を修正する化合物を同定する方法は、実施例の１
つである。突然変異ＮＦ１タンパク質は、上述したようにＮＦ１コード化領域の
特異性突然変異から生じることが可能である。ＮＦ１機能の修飾は、治療剤また
は薬物を用いて行える。これらは、ＮＦ１タンパク質構造または機能の異なる側
面と相互作用するように設計できる；ある薬物は、欠陥構造を修正したり、基質
または補助因子のへの親和性を向上させることができる。薬物または薬剤の有効
性は、欠陥ＮＦ１タンパク質が発現される細胞システムを用いて、結節形成をイ
ンビトロで監視するスクリーニングプログラムによって同定できる。あるいは、
薬物は、ＮＦ１タンパク質の構造相関の知識から、そして、さまざまなＮＦ１突
然変異タンパク質の特異性欠陥の知識からＮＦ１活性を調節するよう設計するこ
とができる（Capseyら、1988）。

【００４８】 本発明は上に記載のように、治療用薬物のスクリーニングに使用できるＮＦ１
遺伝子突然変異を含むモデルシステムにも関する。インビトロおよび生体内の両
方のモデルにおいて、ミュータントＮＦ１タンパク質が発現され、ミュータント
ＮＦ１活性を修正のためのスクリーニングに使用される。インビトロ試験におい
て、精製ＮＦ１タンパク質またはミュータントＮＦ１タンパク質を発現する細胞
系の両方を使用できる；インビトロモデルにおいて、ミュータントＮＦ１タンパ
ク質を発現する遺伝子導入動物を使用できる。

【００４９】 ＮＦ１遺伝子の１つに突然変異を持つ遺伝子導入マウスは、明白な病理学的症
状を示す。Vogelら(1999)は、ｃｉｓ−Ｎｆ１＋／−：ｐ５３＋／−マウスが、
柔組織肉腫の著しい発生率を示すことについて述べた。ヘテロ接合性ＮＦ１突然
変異の存在によって、腫瘍形成を加速され、ｐ５３＋／−バックグラウンド含有
量の腫瘍スペクトルが変化する。さらに、ホモ接合性ＮＦ１変化を有するＮｆ１
−／−細胞によって、一部が構成されるキメラマウスは、神経線維腫を発症しな
い（Cichowskiら、1999）。結果として、両方のマウスモデルが、治療戦略を試
験する手段を提供する。

【００５０】 以下の実施例および図説明文は、単に本発明を説明するものであり、決して本
発明を制限すると理解されるものではない。 図および図説明文：

【００５１】 表１：ＰＴＴ、ＨＡ、細胞遺伝学およびＦＩＳＨ解析によるＮＦ１遺伝子のコ
ード化領域全体の解析によって検出された突然変異。

【００５２】 表２：ＮＦ１ｃＤＮＡ配列決定プライマー。

【００５３】 表３：ＨＡ用のＮＦ１遺伝子のすべてのエキソンの増幅用プライマー。

【００５４】 表４：ＨＡ−ＰＣＲプライマーおよび条件。

【００５５】 表５：６７名の無関係なＮＦ１患者の解析による、ＰＴＴおよびＨＡによるＮ
Ｆ１遺伝子のコード化領域全体の解析によって検出された突然変異。

【００５６】 表６：配列決定クロマトグラムの突然変異／野生種ピーク高さ間の割合によっ
て測定された、ＰｍｉｎおよびＰｐｌｕｓ ＥＢＶ培養物から開始する、直接ｃ
ＤＮＡサイクル配列決定によってＮＦ１突然変異を検出する感受性の比較。

【００５７】 表７：ＮＦ１遺伝子におけるスプライス突然変異に関与するスプライス部位（
ｓｓ）の共通値（ＣＶ）およびスプライス部位スコア（ＳＳＳ）

【００５８】 インキュベータから取出した直後の、ピューロマイシンによって処理した、あ
るいは処理しなかったＥＢＶ形質転換リンパ芽球腫細胞培養物から抽出したＲＮ
Ａから開始した、ＰＴＴ結果を示す別の例を得た。ピューロマイシン処理を行っ
ても、行わなくても両方とも、切断ペプチドの存在が同定された。野生種ペプチ
ドと比較した切断ペプチドの強度は、ピューロマイシン処理後、大きく向上した
。配列決定の結果は、レーン４および５に示されるペプチドにつながる断片のみ
について示されている。ここでも、ピューロマイシン処理培養物から開始した、
サブクローニングを行わなかったｃＤＮＡのサイクル配列決定により、エキソン
１０ｃ：１５７ＯＧｔｏＴ、Ｅ５２４Ｘの突然変異の明快な同定につながる、明
確な結果が得られた。ピューロマイシン処理を行わない培養物から開始する直接
サイクル配列決定のみが行われる場合、ミュータント転写物の不安定性および「
未熟終止コドン誘起」ｍＲＮＡ崩壊の不安定によって、突然変異は再び消失する
であろう。この減衰によって、ミュータントメッセンジャは少量のみ存在し、そ
れがバックグラウンド／ノイズピークを超えてピークに達しないために、関連配
列情報は失われる。

【００５９】 エキソン６に位置する５′フルオレセイン標識フォワードプライマーおよびエ
キソン８に位置するリバースプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ生成物の断片解
析を行った。２０サイクルの増幅を実施した、すなわちプラトーに達するはるか
前のＰＣＲの対数期である。したがって、実験は半定量的である。ＲＴ−ＰＣＲ
断片は、ＡＬＦ自動ＤＮＡシーケンサ（Pharmacia）によって、５％変性ポリア
クリルアミドゲル上で分離した。断片の長さは、内外のマーカー（Ｍ）を使用し
て、Fragment Managerソフトウェアを用いて評価した。各転写物の量は、曲線に
よる面積として決定し、この面積はFragment Manageｒソフトウェア（Pharmacia
）で評価し、特定のサンプルで得られるすべての断片の和に対して正規化した。
これは、スキップ／全体として表される。

【００６０】 解析により、エキソン７を含まない（エキソン７スキッピング）「加齢」血液
（室温にて４８時間）中の転写物は〜９％であることが示された（レーン２）。

【００６１】 ともにエキソン７に同一のナンセンス突然変異を持つ患者ＡおよびＢは、その
転写物中でやや高いレベルのエキソン７スキッピングを示した（レーン３〜６）
。

【００６２】 エキソン７スキッピングは、ＲＮＡをprelevation直後に抽出した新鮮血サン
プル（レーン１）中にも、ＮＦ１エキソン７に突然変異を持たない患者（患者Ｃ
）によるＥＢＶ細胞系（レーン７および８）中にも存在しなかった（少なくとも
使用した技術によって検出可能な量ではない）。

【００６３】 Ｐ＋は、ピューロマイシンを用いた処理を示し、Ｐ−はピューロマイシンを用
いない処理を示す。Ｍは、内部サイズマーカーを示す。

【００６４】 解析により、エキソン３７を含まない（エキソン３７スキッピング）加齢血液
（室温にて４８時間）中の転写物は〜１４％であることが示された。Ｐ＋は、ピ
ューロマイシンを用いた処理を示し、Ｐ−はピューロマイシン処理を示す。Ｍは
、内部サイズマーカーを示す。エキソン３７にナンセンス突然変異を持つ患者Ｃ
は、その転写物において著しく高いレベルのエキソン３７スキッピングを示した
。

【００６５】 エキソン３７スキッピングは、新鮮血サンプルではほとんどなく（最高２％）
（レーン１）、ＮＦ１の別のエキソンに突然変異を有する患者からによるＥＢＶ
細胞系では検出できなかった（レーン５および６）。

【００６６】

【実施例】

実施例１．患者 患者全員から、ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球様細胞系統および／または短期間
フィトヘムアグルチニン刺激血液リンパ球培養に関して、ＲＮＡおよびＤＮＡに
基づく外延的な研究を考慮した許諾を得ている。ＤＮＡはリンパ球から直接抽出
されてもいる。患者は、ゲント、ブリュッセル、リエージュ（ベルギー）の医療
遺伝学センターで確認されている。その解析が開始される前に、詳細な臨床上の
評価が行われ、また、患者全員のその臨床上の特徴が「ＮＮＦＦ国際ＮＦ１突然
変異解析コンソーティアム」の形式を用いて文書化された。１９８８年のＮ．Ｉ
．Ｈ．共同声明（Stumpfら、1988）により提案され、また１９９７年に更新され
た（Gutmannら）診断基準を満たした患者のみが本研究に参加を許された。本研
究は、ゲント大学病院（ベルギー）の倫理委員会により承認されている。

【００６７】 実施例２．ＤＮＡ分離、ＲＮＡ分離およびｃＤＮＡ合成 ＥＢＶ形質転換細胞系統はＲＰＭＩ−１６４０で増殖された。ＲＮＡ分離の前
に、ＥＢＶ形質転換細胞系統培養が分割された。ナンセンス仲介ｍＲＮＡの崩壊
を防ぐために、１つの継代培養は、ピューロマイシンの存在下で維持され〔１６
時間、２００μg/mlピューロマイシン（Sigma社製、ｐ７２５５）、さらに進ん
だものは、Ｐｐｌｕｓ培養と呼ばれる〕、一方、その他の継代培養では、ピュー
ロマイシンはまったく添加されなかった（さらに進んだものは、Ｐｍｉｎ培養と
呼ばれる）。ＲＮＡは患者全員について、両方のタイプの培養から抽出された。

【００６８】 細胞内完全ＲＮＡはすべて、製造業者の指示により、TRIzol LS試薬（Gibco B
RL社製、10296-010）によって抽出された。

【００６９】 ｃＤＮＡは、ランダム六量体（Amersham Pharmacia Biotech社製）および２０
０ＵスーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（Gibco BRL社製）を使用して２〜３μg
完全ＲＮＡにより合成された。

【００７０】 実施例３．タンパク質切断試験 タンパク質切断試験（ＰＴＴ）測定に使用されたプライマーはHeimら（1995）
により記述されている。ＰＴＴは最適化されたプロトコルを使用して実施された
（Claesら、1998）。その技術の感度は、ピューロマイシン処理ＥＢＶ−形質転
換細胞培養および／またはフィトヘムアグルチニン刺激血液リンパ球培養、およ
びインキュベータから取り出された直後のＲＮＡ抽出物を使用してさらに、向上
させた。本発明者らは、非常に大きな、また非常に小さな、異常なペプチド断片
の検出を最大限に行うために、１０％および１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で全
てのサンプルを解析した。

【００７１】 実施例４．改善されたＰＴＴ結果 現在までに報告された突然変異の非常に多くのものは、未成熟停止コドンを生
成すると予測されているので、ＮＦ１遺伝子の突然変異解析に適用される技術の
カスケードから成る、それらを組み合わせた突然変異アプローチの第１工程にお
いて、タンパク質切断試験（ＰＴＴ）によって開始するよう選択された。しかし
ながら、ＰＴＴによる切断突然変異を検出する効率は、調査しているその突然変
異ｍＲＮＡの純度だけではなく、安定度に拠る。ナンセンス仲介ｍＲＮＡの崩壊
が、突然変異ＮＦ１対立遺伝子に報告されており（Hoffmeyerら、1995）、ピュ
ーロマイシン処理ＥＢＶ細胞系統を使用してＮＦ１遺伝に対する最適化ＰＴＴを
開発することも決められた。ピューロマイシンは、連鎖終結を引き起こすｔＲＮ
Ａ類似体であり、ｈＭＳＨ２遺伝子の場合で示されているように、諸細胞系統に
おいてナンセンス仲介崩壊を阻止する（Andreutti-Zauggら、1997）。 ＮＦ１突然変異転写物の安定度に対するピューロマイシンの効果は以前には研
究調査されていなかった。ＮＦ１患者から得た６７ＥＢＶ細胞系統は確立細胞系
統であった。確立細胞系統は、Ｔ２５培養フラスコが含んでいる直径０．２〜０
．３mm/cm²を有するおよそ１００クラスターになるまで増殖させ、またその後に
、２つの分離ウェル（１０cm²）に分割した：一方のウェルはピューロマイシン
（２００μg/ml）で１５時間処理され、もう一方のウェルはさらに、ＲＰＭＩ−
１６４０組織培養培地の中でインキュベートされた。完全ＲＮＡは、両方の培養
培地から抽出され、またさらに、タンパク質切断試験によりさらに解析された。
放射性同位元素³Ｈ−ロイシンを組み込んだものをベースにしたＰＴＴシステム
が非常に感受性が高いことが主な成因となり、本発明者らは、ピューロマイシン
処理していない培養培地から得たＲＮＡを使用して、切断ペプチドを見逃すこと
はなかったが、切断ペプチドにつながる全ての断片の直接サイクルシークエンシ
ングが、そのピューロマイシン処理培養培地から作成されたｃＤＮＡから開始す
るという点では、驚くほど大いに促進された（図３、４、１５）。最適化された
ＰＴＴ解析により、研究調査された患者の８３％におけるｃＤＮＡおよびｇＤＮ
Ａレベルでその生殖突然変異が成功裡に同定された。

【００７２】 突然変異の原因となっている疾患を発見するのにＰＴＴを成功裡に適用したも
のにおいてみられる非常に重要なもう１つのパラメーターは、その手順を開始す
るのに使用されたＲＮＡの品質である。末梢血液細胞から抽出されたＲＮＡから
始まって、ＰＴＴ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中だけではなく、ＲＴ−ＰＣＲ後も非常に
頻繁に「擬似」バンドが出現した。

【００７３】 これらの擬似バンドの出所はさらに、採取後あるいは室温にて４８時間インキ
ュベーション後に、直接末梢血液リンパ球からＲＮＡが抽出されるときに得られ
た転写物を比較することにより、探索された。これらの実験に対する理論的解釈
は２つの面を有する。すなわち、ｉ）自然な状況では、その血液サンプルはある
一定時間その医師の部屋にあり、その後に検査室に運ばれる。この輸送に必要な
時間は、そのサンプルが参照される場所にもよるが、２４時間以上を考慮するこ
とができる。ii）ＴＳＧ１０１やＦＨＩＴなどの腫瘍サプレッサー遺伝子はしば
しばＤＮＡにおける突然変異を見つけ出すことができるｃＤＮＡレベルで欠失す
ることが示されている。特に、腫瘍組織においては、また、「加齢」（これはそ
の血液サンプルが、ＲＮＡを抽出するまでに６０時間室温で放置されていたこと
を意味する）血液サンプルにおいては、両方の遺伝子が、スプライシングプロセ
スに関して忠実なものではないことを示した。注目すべき点は、本発明者らは、
潜在性スプライシング供与体あるいは受容体部位、あるいはエクソン全体の飛び
越しに伴ってそれと同時に、その欠失した転写物の区切りの点が発生するのを観
察していることである。そのスプライシングの不義性は遺伝子特異的に観察され
ており、解析されたその他の遺伝子転写物、すなわち、その他のものの中でもＢ
ＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｈＭＳＨ２、ＩＧＦ２、ＲＢでは起こらなかった。後生
的発現因子が、これらの欠失した転写物の発生につながるこれらの不解明部位の
活性化に影響を与えている可能性がある。 したがって、エクソン７および３７を含む転写物に比較した、エクソン７と３
７の転写飛び越し率に対する半定量実験が実施された。 新鮮血、４８時間室温で放置された「加齢」血液、正常対照者から得たＥＢＶ
細胞系統、各エクソンの増加飛び越しにつながるエクソン７および３７における
特定の突然変異を潜伏させている患者から得られたＥＢＶ細胞系統を含めた、異
なる資源からＲＮＡが抽出された（図５と６）。 これらの実験では、「加齢」血液サンプルから得られたＲＮＡが、これらのエ
クソンの飛び越し増加につながり、したがって、擬態、そしてゲノムの変化が存
在しない場合は、突然変異の存在というふうにつながっていく。ＮＦ１遺伝子は
、後生的発現因子に応答して、ＲＮＡ処理において改変に容易に陥りやすい遺伝
子であると考えざるをえない。

【００７４】 全てのミスセンス突然変異、大きな欠失だけではなく、小さなフレーム挿入／
欠失および、ＰＴＴ解析による染色体に必然的な再配列逸脱検出のように、第１
工程では突然変異が同定されなかった患者全員はさらに、一連の第２次解析試験
により解析された。この第２工程には、以下のものが含まれる。すなわち、すべ
ての６０エクソンのＤＮＡヘテロ二重鎖解析、３遺伝子内コスミド／ＰＡＣクロ
ーンを使用したＦＩＳＨ解析、５遺伝子内プローブと最終的な核型決定を使用し
たサザンブロット解析、である。

【００７５】 それらを組み合わせたアプローチでは、驚くべきことに、解析が行われた６７
人の患者中６４人の患者（＞９５％、表５）で、生殖突然変異の同定へとつなが
った。ＰＴＴにより、その６７人の患者中５６人の患者で、生殖突然変異のみ（
ｃＤＮＡおよびゲノム配列決定後）が同定可能であった。これは、いままで報告
されたもっとも高い検出率となっている。

【００７６】 本研究では、ＮＦ１遺伝子における生殖突然変異の２９％は、異常型スプライ
シング、他のヒト遺伝子障害の調査に報告されたものよりもずっと高い頻度と関
連性を有しているが（Krawczakら、1992およびRuttledgeら、1996）、ＡＴＭ遺
伝子において見つけ出された状況の再現である（Teraokaら、1999）。神経線維
腫症タイプ１に対する原因としてのスプライシングエラーは、ＮＦ１遺伝子にお
いて特に頻度が高いという事実が判明しており、その自然環境生息場所（血流）
以外での血液リンパ球の室温でのインキュベーションなどの後生的発現因子によ
り起こるスプランシングされた転写物の発生を回避するのには最高度に重要な事
柄である。

【００７７】 ＥＢＶリンパ球様細胞系統による作業および、そのインキュベータからその培
養培地が引き出された直後の抽出により得ることができる。

【００７８】 実施例６：ＮＦ１遺伝子のエクソン１０ｂは突然変異ホットスポットを示し、
また 異常スプライシングと関連性を有している再発性ミスセンス突然変異Ｙ４
８９Ｃに潜在する。

【００７９】 現行の技術により、いくつかの新規な突然変異ホットスポットが同定されてい
る。１つのこうした突然変異ホットスポットはエクソン１０ｂにある。この領域
にはスプライシング突然変異を擬態するミスセンス突然変異が含まれる。

【００８０】 材料および方法 ＮＦ１患者 患者全員について、ＮＦ１の診断は、１９８８年のＮ．Ｉ．Ｈ．共同声明（St
umpfら）により提案され、また１９９７年に更新された（Gutmannら）診断基準
が２つあるいはそれ以上存在することが前提となっている。本研究は倫理研究委
員会により承認されており、また、インフォームド・コンセントが、研究される
患者から得られている。患者は、医学的フォローアップと遺伝学的アドバイスの
ために面談されるよう、公正に無作為に選ばれた。患者は、一般的な突然変異研
究調査の一部として選ばれた。３７人の患者がゲントの医療遺伝学部門およびエ
ラスームブリュッセル病院の遺伝子部門により助言を受けた。

【００８１】 核酸抽出 ＤＮＡおよびＲＮＡサンプルが、ＥＢＶ形質転換リンパ球様細胞系統からの抽
出により、３７人の血縁関係を有していないＮＦ１患者から得られた。細胞内完
全ＲＮＡおよびゲノムＤＮＡが記載されているように（Messiaenら、1997）分離
された。

【００８２】 ｃＤＮＡ解析およびインビトロ転写／翻訳解析 第１鎖ｃＤＮＡがランダムプライミング（Messienら、1997）により合成され
、およびｃＤＮＡは、全コード領域の増幅に対して、５プライマー対を使用して
増幅された（１０）。４μl ＰＣＲ産物が、記載されているように（Messiaen
ら、1997；Claesら、1998）、最適化されたインビトロ転写／翻訳反応において
使用された。５５kDaの同じ切断ペプチド断片が、エクソン１から１２ａにわた
る断片のインビトロ転写／翻訳により、３７人の患者のうち２人で観察され、ま
た、それに相当するｃＤＮＡが、ヌクレオチド位置により設計された、０．１５
μM蛍光イソチオシアン酸（ＦＩＴＣ）標識プライマーを使用して、サブクロー
ン化を行って、また行わずに、サイクルシークエンシングにより解析された。す
なわち、５′−ＣＴＴＣＧＧＡＡＴＴＣＴＧＣＣＴＣＴ−３′（４００−４１８
）、５′−ＣＴＧＡＴＡＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＴＧ−３′（７１９−７３６）、
５′−ＧＣＣＴＧＴＧＴＣＡＡＡＣＴＧＴＧＴ−３′（９６７−９８４）および
５′−ＣＡＣＡＣＣＣＡＧＣＡＡＴＡＣＧＡＡ−３′（１３６７−１３８４）お
よび熱シークエナーゼ蛍光標識プライマーサイクルシークエンシングキット（Am
ersham社製）。サンプルは７Ｍ尿素を含有する６％LongRangerゲル（ＦＭＣ）上
に載せられ、またＡＬＦ自動化されたＤＮＡシークエンサー上で解析された。ｃ
ＤＮＡの部分の中にミスセンス突然変異の存在をチェックするために、ＰＲ−Ｐ
ＣＲ断片は、ｐＣＲ−ＴＯＰＯクローニングキット（Invitrogen社製）を使用し
てクローン化され、また、９０の個々のクローンがさらにサイクルシークエンシ
ングにより解析された。

【００８３】 ゲノムＤＮＡ解析 エクソン１０ｂは、記述されているように、そのプライマー対を使用して増幅
され（Purandareら、1994）、およびＰＣＲ産物はさらに、サブクローン化せず
に、サイクルシークエンス法により解析された（Messiaenら、1997）。突然変異
は、命名法作業グループの推奨により、ｃＤＮＡおよびゲノムの変化の両方に関
して、ヌクレオチド１と称される翻訳の開始部位により、開始されることが報告
されている（Antonarikis、1998）。

【００８４】 結果 ＮＦ１遺伝子の全コード領域が、ＥＢＶリンパ芽球様細胞系統が入手できた３
７人の血縁関係を有していないＮＦ１患者におけるタンパク質切断試験により解
析された（Heimら、1995）。２人の患者で、エクソン１から１２ａまでを含む領
域で、およそ５５kDaの同じ短くなった断片が認識された。両方の患者とも、他
の領域に関するインビトロ転写／翻訳では、正常サイズの断片を示した。ＲＴ−
ＰＣＲ断片の電気泳動により、患者１から、２つの分離バンド、すなわち、１８
６８−ｂｐの正常サイズのバンドと、およそ６０−ｂｐ小さかったバンドである
が、１．５％アガロースゲル上で認識された。しかし、患者２では、正常サイズ
のバンドのみがみられ、この患者では、同じサイズの切断タンパク質が異なる方
法で形成されていることが示された。この領域におけるＤＮＡシークエンス法に
より、両方の患者において異なる突然変異が明らかにされた。患者２では、エク
ソン１０ｂにおいてｎｔ １４６５−１４６６でＣの挿入がみられ、即時的にこ
の部位で停止コドンの創成という結果となった。患者１では、エクソン１０ｂの
最後部の６２ヌクレオチド欠失／飛び越しが、両方のリンパ球およびＥＢＶリン
パ芽球様細胞から得られたＲＮＡで観察された（図１２Ｂ）。ここでも、即時的
な結果では、この部位での停止コドンの形成となり、タンパク質切断解析により
みられた同じ画像を説明していた。ゲノムレベルでのエクソン１０ｂのさらなる
解析では、患者２における挿入１４６５ｉｎｓＣの存在が確認された。しかしな
がら、患者１では、ミスセンス突然変異が同定された。すなわち、ＴｙｒからＣ
ｙｓ（Ｙ４８９Ｃ）へとそのコドンを換える、Ａ１４６６Ｇである（図１２Ａ）
。 この散発性患者の両親はこのミスセンス突然変異を担体してはいなかった。
このミスセンス突然変異は、１つのスプライシング欠陥を擬態している。すなわ
ち、実際には、ゲノムＤＮＡの位置１４６６におけるＡからＧへの置換は新しい
スプライシング供与体部位を作り出す（ＣＴ／ＧＴＡＡＧ）（図１２Ｃ）。ニュ
ーラルネットワークによりスプライシング部位予想に関するプログラム（http:/
/www-hgc.lbl.gov/projects/splice.html）を使用した正常と突然変異配列の解
析では、正常エクソン１０ｂ供与体部位（ＧＣＴＴＴＧＴ／ｇｔａａｇｔａｔ）
に関しては０．８６スコア、また、ミスセンス突然変異Ｙ４８９Ｃ（ＡＧＡＡＧ
ＣＴ／ｇｔａａｇｔａｔ）により創成される新しい供与体に関しては、より高い
０．９７スコアを示した。患者１のＥＢＶリンパ芽球様細胞系統から得られたＲ
Ｔ−ＰＣＲ断片がクローン化され、また９０の個々のクローンがさらに、ｃＤＮ
Ａ分画中のミスセンス突然変異の存在に関してチェックするためサイクルシーク
エンス法により解析された。１．５％アガロースゲル上の１８６８−ｂｐの正常
サイズバンドを示す５０ ｃＤＮＡクローンでは、野生型配列のみが見つかり、
また、それらのうちのいずれにも、ミスセンス突然変異は存在していなかった。
アガロースゲル電気泳動による証拠として、ごく小さな挿入断片（およそ６０−
ｂｐ）を含有する４０クローンには、さらに小さなサイズがｍＲＮＡの中にある
イントロン１０ｂに沿ってエクソン１０ｂの最後部６２ヌクレオチドの飛び越し
によるものであった（図１２Ｂ）。これは、ｃＤＮＡレベルで突然変異Ｙ４８９
Ｃの主要なアウトカムが、エクソン１０ｂの最後部６２ヌクレオチドの飛び越し
であることを示している。Ｙ４８９Ｃおよび１４６５−１４６６ｉｎｓＣはゲノ
ムレベルでは異なる突然変異であるが、ニューロフィブロミンのＧＡＰドメイン
の前では、正確に同じ位置ではうまいことに未成熟の停止コドンの形成という結
果になる。同じスポットにおける２つの異なる突然変異（すなわち、１４６５−
１４６６ｉｎｓＣおよび１４６６Ａ＞Ｇ）の発見がそれ自体の中に突然変異ホッ
トスポット（Cooperら、1998）を示しているので、これらの発見により、本発明
者らはより大きな患者集団におけるエクソン１０ｂを解析することが促されるこ
ととなった。本発明者らは、この時点で、１０５人の調査研究されて判明したＮ
Ｆ１患者の総数について、４人の血縁関係を有していないＮＦ１患者における突
然変異Ｙ４８９Ｃを同定しており、ＮＦ１集団におけるこの突然変異の罹患率を
約４％であると推定することができた。

【００８５】 実施例７：ＮＦ１遺伝の徹底した突然変異解析により、突然変異の９５％を同
定することができ、また、通常ではみられないスプライシング欠陥の高い頻度が
明らかにされる。 患者、材料および方法 この予見的な研究には、臨床上のフォローアップと遺伝子カウンセリングのた
めに、ゲント大学病院、リエージュ大学、ブリエ（Vrije）大学ブリュッセル、
およびブリッセル自由大学の医療遺伝学部門でみられた６７人の無関係な指標と
なる患者が含められた。患者全員の臨床上の特徴は、「ＮＮＦＦ国際ＮＦ１突然
変異解析コンソーティアム」の形式を用いて文書化された。１９８８年のＮ．Ｉ
．Ｈ．共同声明（Stumpfら、1988）により提案され、また１９９７年に更新され
た（Gutmannら、1997）診断基準を満たした患者のみが本研究に含められた。本
研究は、ゲント大学病院（ベルギー）の倫理委員会により承認されている。患者
全員から得られたＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球様細胞系統は確立細胞系統であっ
た。３８人の患者は新規症例として呈示され、また、２９人の患者は家族性であ
った。突然変異のその家族性あるいは散発性の性質は、家族の構成員の解析によ
り証明された。全ての突然変異が第２の個々のサンプルについて証明された。そ
の突然変異は血縁関係を有していない１００人の正常な染色体上には存在しなか
った。

【００８６】 ＲＮＡ分離およびｃＤＮＡ合成 ＲＮＡ分離の前に、ＥＢＶ形質転換細胞系統培養が分割された。ナンセンス仲
介ｍＲＮＡの崩壊を防ぐために、１つの継代培養は、ピューロマイシンの存在下
で維持され〔１６時間、２００μg/mlピューロマイシン（Sigma社製、ｐ７２５
５）、さらに進んだものは、Ｐｐｌｕｓ培養と呼ばれる〕、一方、その他の継代
培養では、ピューロマイシンはまったく添加されなかった（さらに進んだものは
、Ｐｍｉｎ培養と呼ばれる）。ＲＮＡは患者全員について、両方のタイプの培養
から抽出された。

【００８７】 細胞内完全ＲＮＡはすべて、製造業者の指示により、TRIzol LS試薬（Gibco B
RL社製、10296-010）によって抽出された。

【００８８】 ｃＤＮＡは、ランダム六量体（Amersham Pharmacia Biotech社製） および２
００ＵスーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（Gibco BRL社製）を使用して２〜３
μg完全ＲＮＡにより合成された。

【００８９】 ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＴＴ ５重複断片における総ＮＦ１ ｃＤＮＡの増幅に使用されたプライマーは以前
に記述されたとおりのものであった（Heimら、1995）。３〜５μl ＰＣＲ産物
、２０μMアミノ酸混合マイナスロイシン（Promega社製、L4610）および１．６
μl３Ｈロイシン（特異的活性１mCi/mmol；Amersham社製）がＴＮＴ^TM結合網状
赤血球可溶化液システム（Promega社製）に添加された。反応は記述されている
ように実施された（Claesら、1998）。サンプルは１０％および１５％ＳＤＳ−
ＰＡＧＥゲル上で電気泳動にかけられ（ProteanII Biorad、２０×２４cmゲル）
、１６時間、３０mA（１０％ゲル）および４０mA（１５％ゲル）で運転した。１
４Ｃメチル化タンパク質（Amersham Pharmacia Biotech CFA626）がタンパク質
重量マーカーとして使用された。合成されたポリペプチドは、Ｘ線フィルムに２
０および６０時間曝露後、オートラジオグラフ法により視覚化された。

【００９０】 突然変異とは関連のないスプライシング突然変異体の半定量解析 ｃＤＮＡは、以下のプライマー対を使用してＰＣＲの２０サイクルにかけた。
すなわち、５′−ＦＩＴＣ−ＴＴＧＡＣＴＴＧＧＴＧＧＡＴＧＧＴＴＴ−３′（
ｃＤＮＡ ７４９−７７７）およびエクソン７（Ｅ７）飛び越しの解析のための
５′−ＴＴＧＡＧＡＡＴＧＧＣＴＴＡＣＴＴＧＧＡ−３′（ｃＤＮＡ １０９６
−１０７７）；５′−ＦＩＴＣ−ＧＧＧＣＡＧＡＴＡＡＡＧＣＡＧＡＴＡＡＴ−
３′（ｃＤＮＡ ６７２１−６７４０）およびＥ３７飛び越しの解析のための５
′−ＣＣＧＧＡＴＴＧＣＣＡＴＡＡＡＴＡＣ−３′（ｃＤＮＡ ７０２９−７０
１２）である。

【００９１】 転写物の半定量解析は、記述されているように（Lambertら、1998）、ＡＬＦ
自動化ＤＮＡシークエンサー（Amersham Parmacia Biotech社製）上で、５％変
性アクリルアミドゲル上で実施された。短縮転写物の性質は、記述されているよ
うに直接サイクルシークエンス法によりサブクローン化した後に証明された（Me
ssiaenら、1997）。

【００９２】 スプライス部位スコア 全てのスプライシング突然変異の配列環境が、ニューラルネットワークによる
スプライシング部位予測（ＳＳＰＮＮ）を使用して解析され、また、スプライシ
ング部位スコア（ＳＳＳ）が得られた（ＵＲＬアドレス：http://www.fruityfly
.org/seq tools/splice.html）。５′および３′スプライシング部位（ｓｓ）の
全てに関して、コンセンサス値（ＣＶ）がShapiroとSenepathy(1987）により開
発されたとおりに計算された。

【００９３】 ｃＤＮＡシークエンシング ＰＴＴゲルから得たオートラジオグラムにより、特異的な切断ペプチドを引き
起こした突然変異のもっとも曖昧な位置を予測することができ、またＲＴ−ＰＣ
Ｒ断片が、コード配列（頼めば入手可能な配列）に沿って分布している５′−フ
ルオレセインあるいは５′−Ｃｙ５標識配列決定プライマーを使用して、熱シー
クエナーゼＴＭ蛍光標識化プライマーサイクルシークエンシングキット（Amersh
am Pharmacia Biotech社製）により、対応する領域においてサイクル配列決定さ
れた。

【００９４】 ヘテロ二重鎖解析（ＨＡ） エクソンはゲノムＤＮＡから増幅された。いくつかのエクソンに関しては、Ｐ
ＣＲプライマーはＯＬＩＧＯ Ｖ５ソフトウェア（表６）を使用して、開発され
た。他のエクソンに関してはＰＣＲプライマーは記述のとおりのものであった（
Purandareら、1994；Hoffmeyerら、1998；Maynardら、1997；Abernathyら、1997
；Cawthonら、1990；Liら、1995）。エクソン１および４９はまだ研究されてい
なかった。大きなエクソン１６、２１、２８、２９、３１、３３、３５、３７お
よび３８に関しては、ＨＡの感度は、２００〜３００ｎｔの間の最適サイズを有
する断片を入手するために、特異的なＲＥによる加水分解により改善された。増
幅後、断片は５′に関しては９８℃で変性させた。また、６８℃で１時間再アニ
ーリングが可能であった。ＰＣＲ産物の２〜４μlが、８μl負荷緩衝液（２５％
ブロモフェノールブルー、２５％キシレンシアノール、３０％グリセロール）と
混合され、また、１０％グリセロールを含有する１ｘＭＤＥゲル上に戴置された
（ＦＭＣ、メイン州ロックランド市）。電気泳動後、ゲルはＥｔＢｒ（０．５μ
g/l）により染色され、また、ライトボックス下で評価された。異常断片はさら
に、前進増幅プライマーあるいは配列決定のための入れ子状態のプライマーを使
用してサイクルシークエンシング法によりさらに解析された。

【００９５】 細胞遺伝学的解析および蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳ
Ｈ）ＰＴＴおよびＨＡによっては突然変異がまったくみつからなかった患者は、
細胞遺伝学的解析おびＦＩＳＨにより解析された。細胞遺伝学的解析は、標準的
な手順により、ＰＨＡ刺激Ｇバンド分裂中期に実施された。超顕微鏡的欠失を検
出するために、二重色調ＦＩＳＨが、Correaら(199９）により記述されているＰ
ＡＣクローン２２（９２６Ｂ９；５′ＮＦ１）および１３（１００２Ｇ３；３′
ＮＦ１）を使用して、Van Royら（1994）により実施された。

【００９６】 サザンブロット解析 ゲノムＤＮＡの６μlがＥｃｏＲＩおよびＢｇ／ＩＩ（ともにGibco BRL社製）
の３０Ｕにより、６時間３７℃加水分解された。加水分解されたＤＮＡが、０．
８％アガロースで電気泳動にかけられ、また、正に荷電されたナイロン膜（Hybo
nd N+Amersham）に移された。ハイブリダイゼーションは、記述されているよう
に、ｃＤＮＡプローブＧＥ２、ＦＦ１３、ＦＥ５Ｄ、Ｐ５およびＢ３Ａを使用し
て（Machukら、1991）、標準的な手順を使用して実施された（Sambrookら、1989
）。

【００９７】 結果 組み合わせたアプローチおよび突然変異スペクトルを使用した突然変異検出率 本発明者らは、すべての２９人の家族性症例および３８人の散発性患者のうち
３５人を含む、真正の病因となる突然変異を６７人の血縁関係を有していないＮ
Ｆ１患者中６４人において同定した（９５．５％）（表５）。

【００９８】 ピューロマイシン処理ＥＢＶ−リンパ芽球様細胞系統から開始する最適化ＰＴ
Ｔにより、その突然変異は５６人の患者におけるｃＤＮＡおよびｇＤＮＡレベル
の両方で完全に特徴付けを行った（５６／６７の患者：８３．５％）。２５人が
ナンセンスであった（２５／６７の患者；３７％）、１２人がフレームシフトで
あった（１２／６７の患者；１８％：１つあるいは数個の塩基対のうち、５挿入
と７欠失）。および１９人がインフレームあるいはアウトオブフレームスプライ
シング突然変異（１９人／６７人；２８％）であった。

【００９９】 ＨＡによる残りの患者のさらなる研究調査では、６人の単一アミノ酸（９％）
のミスセンス突然変異および／または欠失：Ｃ９３Ｙ、Ｃ１８７Ｙ、Ｌ８４７Ｐ
、２９７０〜２９７２ｄｅｌＡＡＴあるいは９９１ｄｅｌＭおよび７０９６−７
１０１ｄｅｌＡＡＣＴＴＴあるいは２２６６ｄｅｌＮＦを同定するという結果に
なった。

【０１００】 ４４人（４１％）の単一塩基対置換のうちの１８人は、メチル化すると、突然
変異に容易に陥ることが知られているＣｐＧジヌレオチドで、Ｃ＞ＴあるいはＧ
＞Ａ塩基転移によるものであった。

【０１０１】 ＮＦ１遺伝子全体の欠失は、５′（９２６Ｂ９）および３′（１００２Ｇ３）
ＰＡＣクローンが存在しないことにより、証拠とされるＦＩＳＨ解析により発見
された。細胞遺伝学的およびＦＩＳＨ解析では、大きなＮＦ１ファミリーの中で
均衡転座が示されている。すなわち、ＰＡＣ ９２６Ｂ９としてＮＦ１遺伝子を
切断するｔ（１４；１７）（ｑ３２；ｑ１１２）がｄｅｒ（１７）およびｄｅｒ
（１４）上のＰＡＣ １００２Ｇ３でみつかった（データは図示せず）。

【０１０２】 同定された突然変異（転座を含めて）の３２人は最新のデータ（１９９９年３
月以前の国際ＮＦ１突然変異解析コンソーティアム；ＵＲＬアドレス：http://w
ww.nf.org/nf1gene/nf1gene.home.html、Arsら、2000、Fahsoldら、2000、およ
び、UpadhyayaとCooper、1998による公表データの最新の総説）と比較しても新
規なものである。

【０１０３】 翻訳阻害がＰＴＴおよび直接サイクルシークエンシングによる未成熟終結コド
ンの検出を容易にする

【０１０４】 ナンセンス仲介ｍＲＮＡの崩壊が、ＲＮＡに基づく突然変異検出の諸方法をも
っとも損なうが、ピューロマイシンを使用して回避することができる（Andreutt
i-Zauggら、1997）。Ｐｍｉｎ ＥＢＶ培養培地から抽出されたＲＮＡからか開
始して、ＰＴＴは突然変異体転写が高度に不安定である場合であっても、切断ペ
プチドを検出する。しかし、蛍光染料を使用したｃＤＮＡ断片の直接サイクルシ
ークエンシング法が、そのナンセンス仲介崩壊によりひどく損傷をうけるが、そ
の信号雑音比は、Ｐｐｌｕｓ ＥＢＶ培養培地から開始されているものよりもず
っと良好になっている。代表的な結果を図４Ｂに示す。

【０１０５】 本発明者らは、ＰＴＴの感受性と直接サイクルシークエンシング法を、ピュー
ロマイシンにより処理された、および処理されない、１３ ＥＢＶリンパ芽球様
細胞培養培地の中で、比較した（６、図３、４、１５および１７）。ＰＴＴによ
り、培養培地の両方のタイプから得られる全ての切断ペプチドがオートラジオグ
ラムの６０時間曝露後に認識された。しかしながら、Ｐｍｉｎ ＥＢＶ培養培地
の７においてのみ、その突然変異体転写物は直接ｃＤＮＡシークエンシングによ
り遍く同定された。その残りの６つの培養培地では、突然変異体転写物の発現は
、シークエンシングクロマトグラムにおける野生型ピークの高さに対する突然変
異体の割合が＜０．３５である正常転写物に比較して高度に減少している。直接
ｃＤＮＡサイクルシークエンシングは、これらの症例における病因となる突然変
異を明らかにすることはできない。対照的に、すべてのＰｐｌｕｓ ＥＢＶ培養
培地においては、その突然変異が同定され、また、シークエンシングクロマトグ
ラムにおける突然変異体と野生型ピークの高さとの間のその割合は、０．８と１
．００の間で変化した。

【０１０６】 突然変異、突然変異ホットスポットおよび再発突然変異の分布 突然変異はその遺伝子に沿って等しく分布されるようにみえる。しかしながら
、ある種のエクソンはより高い突然変異濃度を有することがある（図９Ａ）。研
究調査されている患者の１５％では、突然変異は、エクソン１０ａ−１０ｂ−１
０ｃ内でみつかったが、その領域は、コード領域の４．５％のみから成る。この
領域では、３つの再発性突然変異（Ｒ４４０Ｘ、Ｒ４６１ＸおよびＹ４８９Ｃ）
がみつかった。Ｅ３７では、コード領域のたった１．２％のみから成り、突然変
異がその患者の５．９％にみつかった。１０の再発性突然変異が、２０の血縁関
係を有していない患者で同定され、合計するとこの研究調査（５）に見つかった
突然変異の３０％の割合を占める。すなわち、Ｒ３０４Ｘ、Ｒ４４０Ｘ、Ｒ４６
１Ｘ、Ｙ４８９Ｃ、２０３３−２０３４ｉｎｓＣ、Ｒ１３６２Ｘ、Ｒ１５１３Ｘ
、Ｒ１８４９Ｑ、Ｙ２２６４Ｘ、７０９６−７１０１ｄｅｌＡＡＣＴＴＴ（図９
Ｂ）である。ＮＦ１ハプロタイプが突然変異Ｒ１８４９Ｑを担体する両方の家族
で異っていたので、再発は子孫でも同一のものになるとすることはできない。

【０１０７】 Ｒ３０４Ｘ、Ｒ４４０Ｘ、Ｒ４６１Ｘ、Ｒ１３６２Ｘ、Ｒ１５１３Ｘ、Ｒ１８
４９Ｑはその再発を説明することが可能な、ＣｐＧジヌクレオチドＣ＞Ｔあるい
はＧ＞Ａ置換である。この突然変異ホットスポットを取り巻く配列に集中してい
る１４６６Ａ＞Ｇ（Ｙ４８９Ｃ）の再発を説明する証拠はない。本発明者らは、
この突然変異を５／２３２の血縁関係を有していない患者で見つけ出した（Mess
iaenら、1999）。２０３３ｉｎｓＣの再発は、７シトシンのひと配列においてポ
リメラーゼが滑ることにより引き起こされることがある。突然変異Ｙ２２６４Ｘ
（Ｃ６７９２ＡおよびＣ６７９２Ｇ）はパリンドローム配列だけではなく直接的
なＡＣ−反復を含む配列環境にも存する。７０９６ｄｅｌＡＡＣＴＴＴは二つの
ＡＡＣＴＴＴタンデムリピート（縦列反復配列）の間で滑って起こる誤対合によ
り引き起こされることがある。

【０１０８】 ＮＦ１遺伝子におけるミスセンス突然変異およびそれらの病原性 本発明者らは、単一アミノ酸の６つの真正のミスセンス突然変異あるいは欠失
、すなわち、Ｃ９３Ｙ、Ｃ１８７Ｙ、Ｌ８４７Ｐ、２９７０−２９７２ｄｅｌＡ
ＡＴおよび７０９６−７１０１ｄｅｌＡＡＣＴＴＴを同定した。これらは３００
の正常な対照染色対には存在せず、ラット（Ｄ４５２０１）、マウス（Ｌ１０３
７０）、フグ（ＡＦ０６４５６４）、ショウジョウバエ（Ｌ２６５０１）におい
て進化時に保存され、５つの家族性の症例における障害により分離され、１つの
散発性の症例で新規のものであることが証明された。総コード領域がゲノムレベ
ルで非反復の観点から研究されれば、４つのさらなる突然変異がミスセンス突然
変異であると誤って考えられている可能性がある。すなわち、Ｙ４８９Ｃ（２Ｘ
）、Ｖ１０９３Ｍ（１Ｘ）およびＲ２６１６Ｑ（１Ｘ）である。Ｙ４８９Ｃはス
プライシング突然変異として報告されている（Messiaenら、1999）。Ｖ１０９３
Ｍは、Ｅ１９ｂの真中に、新規なスプライシング供与体を作り出すことにより、
スプライシング突然変異と同様に作用する。家族性の患者ＮＦ−０２７でみつか
ったＲ２６１６Ｑは、３００人の対照正常染色体ではみつかっておらず、ポリペ
プチド鎖における劇的な変化を引き起こすことが予測され、また、ラット、マウ
ス、フグおよびショウジョウバエ（図１６）で保存されている。しかしながら、
この変化はその家族内での障害とは分離しなかった（図１６）。この指標となる
患者はＲ２６１６ＱおよびＲ３０４Ｘに関してヘテロ接合性の複合体であり、後
者はＰＴＴにより同定されている。Ｒ３０４Ｘは、彼女の健康な娘がＲ２６１６
Ｑ対立遺伝子を受け継いでおり、また罹患している娘の方がＲ３０４Ｘを受け継
いでいるように、この家族における真正の病原性突然変異である。この発見は、
ミスセンス突然変異の病原性について確たる結論が下される前に行われる、切断
突然変異に関する総コード領域の解析の重要性を強調するものである。

【０１０９】 スプライシング欠陥という結果を生じる突然変異 スプライシングエラーは、１９／６７（２８％）の患者で検出された（表５お
よび７）。

【０１１０】 たった４つのスプライシング突然変異のみが、正準ＧＴスプライシング供与体
あるいはＡＧスプライシング受容体にあった。すなわち、ＩＶＳ１２ａ＋１Ｇ＞
Ｔ、６５７７ｄｅｌＧＡＧｇｔａ、ＩＶＳ２６−２Ａ＞ＴおよびＩＶＳ２７ｂ−
２Ａ＞Ｔである。

【０１１１】 ６つの突然変異は、５′あるいは３′スプライシング部位（ｓｓ）のより保存
されることが少ない位置にあった。すなわち、ＩＶＳ１６＋３ｄｅｌａａａｇｔ
ｇ、Ｒ１８４９Ｑ、Ｋ２２８６Ｎ、ＩＶＳ１６−６ｄｅｌｃｔｔｔ、ＩＶＳ１９
ｂ−３Ｃ＞ＧおよびＩＶＳ３９−１２Ｔ＞Ａである。

【０１１２】 １つのナンセンスおよび２つのミスセンス突然変異が、新規の５′および３′
ｓｓを作り出し、また、スププライシング突然変異、すなわち、Ｓ１７６５Ｘ、
Ｙ４８９ＣおよびＶ１０９３Ｍである。

【０１１３】 Ｙ２２６４Ｘ（Ｃ６７９２ＸおよびＣ６７９２Ｇ）はＥ３７飛び越しを結果的
に生じ、またＲ３０４Ｘはそのナンセンスコドンの保持の他にＥ７飛び越しを部
分的に結果的に生じている（図５）。両方の突然変異とも、現存する正常ｓｓを
改変することもなく、また新規のものを作り出すこともなく、エクソンスプライ
シングエンハンサーとｍＲＮＡスプライシング因子の間の改変された相互作用に
よりその影響を発揮することがある（Messiaenら、1997、Hoffmeyerら、1998）
。その残りの２５のナンセンス突然変異はスプライシング欠陥と関連しているも
のではなく、またしたがって、ナンセンス仲介エクソンの飛び越しはＮＦ１にお
いてはどちらかというと例外的なものである。

【０１１４】 ShapiroとSenepathy(1987）によるコンセンサス値（ＣＶ）、およびニューラ
ルネットワークによるスプライシング部位予測（ＳＳＰＮＮ）スプライシング部
位スコア（ＳＳＳ）が、スプライシング突然変異に関与していた全てのスプライ
シング部位について計算が行われた（表７）。

【０１１５】 そのエクソンの５′および３′コンセンサスｓｓにおける突然変異による単純
な飛び越しは、たった４症例でのみ観察された。すなわち、６５７７ｄｅｌＧＡ
Ｇｇｔａ、Ｋ２２８６Ｎ、ＩＶＳ１６−６ｄｅｌｃｔｔおよびＩＶＳ１９ｂ−３
Ｃ＞Ｇである。Ｋ２２８６Ｎだけは、翻訳される場合は、その読み枠を完全に残
す転写を結果的に生じる。残りのスプライシング突然変異は複合的な影響を有し
ていた。

【０１１６】 ＩＶＳ１２ａ＋１Ｇ＞ＴはＥ１１と１２ａの両方の飛び越しにつながる。注目
すべきことは、突然変異がＥ１２ａの５′ｓｓに影響を及ぼす場合には、両方の
エクソンについての飛び越しを説明するＥ１１の正常５′および３′ｓｓとＥ１
２ａの３′ｓｓに関するＣＶとＳＳＳが非常に弱いことである。Ｒ１８４９Ｑ（
５５４７Ｇ＞Ａ）は、Ｅ２９（ｅｘ２９ｄｅｌ）を欠いている転写物をまた、同
じ分量のＥ２９＋３０（ｅｘ２９／３０ｄｅｌ）の両方を欠いている転写物を結
果的に生じる。同じ転写物が、突然変異ＩＶＳ２９＋１Ｇ＞Ｃを有する患者で見
つかっている（Osbornら、1999）。この領域はヒト脳組織でのみ発現するｅｘ２
９ｄｅｌまた全ての組織で低いレベルで検出可能なｅｘ２９／３０ｄｅｌの組織
特異的代替スプライシングに関与している（Parkら、1998）。非脳組織における
ｅｘ２９ｄｅｌ発現の構成上の増加は、この家族におけるＮＦ１を引き起こす病
原性病変部になると考えられる。

【０１１７】 いくつかの症例におけるエクソンの飛び越しの他に７つの突然変異、潜在性ｓ
ｓの活性化あるいは新規に創成されたｓｓの使用、すなわち、ＩＶＳ１６＋３ｄ
ｅｌａａａｇｔｇ、Ｙ４８９Ｃ、Ｖ１０９３Ｍ、ＩＶＳ２６−２Ａ＞Ｔ（図１０
）、ＩＶＳ３９−１２Ｔ＞Ａ（図１１）およびＳ１７６６Ｘが誘発された。ＮＦ
１エクソンの５′ｓｓに影響を与える全ての突然変異に関して、突然変異ｓｓ（
Ｍ）のＣＶとＳＳＳは、野生型ｓｓ（Ｎ）よりも低かったが、しかし、ＳＳＳの
間の差異はさらに顕著なものであった。

【０１１８】 Ｙ４８９Ｃ（図１２）およびＶ１０９３Ｍ（図１３）の両方とも、野生型５′
ｓｓに比較して、ほとんど同じＣＶにより新規の５′ｓｓを創成する。ＳＳＰＮ
Ｎによるｓｓ強度の予測は、わずかに良好な結果を生んでいる（表７）。Ｅ１９
ｂの天然５′ｓｓは、Ｖ１０９３Ｍにより創成された弱い供与体ｓｓによっても
それが非活性化される理由が説明できるが、霊長類には一般的なものではない（
ＡＡ／ｇｔａａａｔ、下線部は稀少なヌクレオチド）。

【０１１９】 ３′ｓｓにおける突然変異は、野生型３′ｓｓに比較して低いか（３／５）あ
るいはほとんど同じ（２／５）ＣＶおよびＳＳＳを有していた。ＣＶあるいはＳ
ＳＳの両方ともが、その突然変異が潜在性の３′ｓｓのエクソン飛び越しおよび
／または活性化につながるかどうかを予測することはうまくいっていない。

【０１２０】 ＩＶＳ１６−６ｄｅｌｃｔｔｔおよびＩＶＳ３９−１２Ｔ＞Ａの両方ともが、
タンデムリピート、ｃｔｔｔとｇｔｔｔをそれぞれ分断した。両方の突然変異に
関して、突然変異体配列のＣＶおよびＳＳＳは、野生型３′ｓｓと比較して同じ
であり、その上、ミススプライシングが起こり、また両方の突然変異のアウトカ
ムが異なる。ＩＶＳ１６−６ｄｅｌｃｔｔｔは「単純な」Ｅ１７飛び越しにつな
がるが、強い潜在性の３′ｓｓが５７ｎｔ上流（ＳＳＳ ０．９６）に存し、ま
た、活性化される場合は、２９アミノ酸のフレーム挿入という結果を生じること
になる。ＩＶＳ３９−１２−Ｔ＞Ａに関しては、突然変異体３′ｓｓ配列（ｇｔ
ｔｔｇｔｔａｇｔｔｔｔｔｔｇｔａｇ／ｇｇｔａｃａｇ）はまだ高いＳＳＳ（０
．９９）を有しており、その上、明らかに不活性化され、また、ＩＶＳ３９−１
２（ｇｔｔｔｇｔｔｔｇｔｔｔｇｔｔｔｇｔｔａｇ／ｔｔｔｔｔｔｇｔａｇｇｇ
）新規に創成された３′ｓｓが使用され、インビトロ翻訳後に２０９アミノ酸の
ペプチドを形成する、ＩＶＳ３９の最後部の１０ヌクレオチドを保持している転
写物に部分的につながっていく。その突然変異はさらに、たった４４アミノ酸の
みにより短縮されたペプチドに導かれるＥ４０の飛び越しの原因となる。両方の
切断ペプチドは、複数の突然変異体転写物を検出するこの技術の倍率を図示説明
するＰＴＴ（図１１）により認識された。

【０１２１】 Ｓ１８６５Ｘにより創成された新規３′ｓｓは、野生型ｓｓと比較すると、低
いＣＶとＳＳＳを有しているが、その上、Ｅ２９の最初の９０ヌクレオチドのイ
ンフレーム飛び越しが観察されている（図１４）。DietzとKendzior(1994）によ
り提案されているナンセンスコドンを認識することができ、またオープンリーデ
ィングフレームの維持に第一義的に関与している核内スキャニングメカニズムが
このアウトカムを仲介している可能性がある。

【０１２２】 Ｒ３０４Ｘおよびスプライシング Ｒ３０４Ｘは、突然変異体転写物におけるナンセンスコドンの保持をせずにイ
ンフレームＥ７を結果的に生じるように、（Hoffmeyerら、1997）により示され
た。本発明者らは、２つの血縁関係のない家族から突然変異Ｒ３０４Ｘを有する
３人の患者を研究調査した。ＰｐｌｕｓおよびＰｍｉｎ ＥＢＶ培養培地から抽
出されたＲＮＡから開始して、ＰＰＴはそのナンセンスコドンが、すべての患者
で保持されている場合に想定されるサイズであるおよそ３３kDaの切断ペプチド
を明瞭に示した（図１５）。Ｐｍｉｎ培養培地から得られるｃＤＮＡのサイクル
シークエンシングは、ナンセンスコドンを含む突然変異体転写物の不等発現を示
した（図１５）。転写物の半定量ＲＴ−ＰＣＲ解析は、Ｅ７飛び越しが、その転
写物の小さな部分に存在したことを示している（６〜１３％；図５）。ピューロ
マイシン処理は、Ｅ７飛び越し対完全長転写物の割合を改変することはなかった
（図５）。ＥＢＶリンパ芽球様細胞系統では、Ｅｘ７ｄｅｌ転写物は正常対照者
および突然変異Ｙ２２６４Ｘ（図５）を有する患者では検出することができなか
った（データは図示せず）。本発明者らによる結果からは、少なくともＥＢＶ培
養培地においては、Ｅ７飛び越しは、突然変異Ｒ３０４Ｘの主要なアウトカムで
はないということが示されている。本発明者らは、細胞タイプ依存性スプライシ
ングの差異が両方の研究調査の間で明らかな差異があるのかどうかを除外するこ
とはできない。

【０１２３】 環境因子による突然変異体スプライシングおよび突然変異には関連していない
突然変異体スプライシング ＴＳＧ１０１およびＦＨＩＴなどの特異的腫瘍抑制遺伝子では、内的欠失を伴
ういくつかの転写物は、採取直後に処理されなかったリンパ球（「加齢」血液）
では特に、必ずしもゲノム突然変異には関連していないだけではなく、また、正
常組織から得られるＲＮＡにおいてみつけることもできる。当初血液サンプルか
ら開始されるＰＴＴが開発されたが、しかし、しばしば擬似バックグランドバン
ドがオートラジオグラム上に視覚化され、ＥＢＶ形質転換細胞系統から開始する
技術を開発することがわれわれには必要となった。ある種の血液サンプルは、病
院から検査室まで運ばれる差異に当然のことながら遅くなり、またそのバックグ
ランドバンドが、ＰＴＴにおける切断ペプチドの形成へとつながる「加齢」血液
細胞の誤ってスプライシングされたＮＦ１転写物により引き起こされる可能性が
ある。本発明者らは、ＮＦ１転写物における２つの領域に関して、４人の血縁関
係がない正常な対照者か得られた血液サンプルを解析した。すなわち、突然変異
Ｒ３０４Ｘを有する患者において、Ｅ７飛び越しが低程度に観察された領域、お
よび、Ｅ３７飛び越しを伴う転写物の等しい発現が、突然変異Ｙ２２６４Ｘを有
する患者で観察された領域である（Messiaenら、1997）。半定量解析では、Ｅ７
および３７の飛び越しは、その血液の採取直後に処理された全ての対照サンプル
では検出することができなかった。しかし、全ての４つの「加齢」血液サンプル
では、その転写物の一部分で、Ｅ７および３７の飛び越しが示された。典型的に
は、Ｅ７および３７に関する完全長転写物に対する誤ってスプライシングされた
ものの比率は、０．０９および０．１４の間の範囲にあった。血液サンプルの採
取直後に抽出されなかったＲＮＡから開始する解析では、ＲＴ−ＰＣＲにおいて
短い転写物が発生するという結果を生じうる。

【０１２４】 検討 本研究調査では、６７人の血縁関係を有していない典型的なＮＦ１患者が、相
補的な技術のカスケードを使用して解析され、またその突然変異が、６４人の患
者で同定された（＞９５％）。したがって、ＮＦ１に関する感受性分子診断試験
は、伝統的なＮＦ１患者が複数の相補的および最適化された技術により研究調査
される場合には、達成することができる。

【０１２５】 ＰＴＴによって、本発明者らは、５６／６７の患者（８３％）において突然変
異を同定した。ミスセンス突然変異あるいは小さなインフレーム挿入／欠失が、
６／６７の患者（９％）でＨＡにより発見された。４４の単一塩基対置換のうち
１８がＣｐＧジヌクレオチドにおけるＣ＞ＴあるいはＧ＞Ｔ塩基転位によるもの
であった。細胞遺伝学的および／またはＦＩＳＨ解析により、ＮＦ１遺伝子を切
断する遺伝子全体のうち１つの欠失および１つの均衡転座ｔ（１４；１７）（３
２；ｑ１１．２）が発見された。

【０１２６】 その突然変異はＮＦ１コード配列に沿って均等に分布していた。しかしながら
、エクソン１０ａ−１０ｃおよびＥ３７は、突然変異が無作為に分布した場合に
予想されるように、さらに突然変異豊富であるなものであると考えられる。本発
明者らは、Fahsoldら（印刷中）により示されているように、Ｅ４ｂが驚くほど
突然変異豊富な領域になることを発見した。これは、本発明者らの小規模な患者
コホート研究によるものであるとすることができる。代替的には、Fahsoldらに
より報告されている再発性のＥ４ｂ突然変異のいくつかが、散発性対家族性のス
テータスあるいはハプロタイプについてのデータが入手可能ではないので、子孫
により同定することができる。両方の研究調査に関して、本発明者らは、Ｅ４ｂ
突然変異の数対、対発見された突然変異の数の代わりに、研究調査された患者の
数を考慮する場合は、Ｅ４ｂに関する同様の寄せ集めた割合が得られる。（Faho
ldらによる５２１人の患者のうち１６人および本研究調査における６７人の患者
のうち２人；ともに〜３％）。１０の突然変異が本発明者らによる研究調査では
再発しており、また、それぞれ、その生殖突然変異の〜２．９％に上る。再発性
突然変異の高いレベルの数字は予測されていなかった。本発明者らによる結果で
は、エクソン７、１０ａ−１０ｃ、１３、２３．２、２７ａ、２９、３７、３９
が再発性突然変異に潜在することが示唆されており、また、これらのエクソンが
、再発性突然変異を含むことが他者により報告されているエクソン４ｂ、２２お
よび３１と一緒に（Fahsoldら、印刷中およびUpdyayaとCooper、1998)、ＮＦ１
突然変異解析においては、優先的に実施されるべきである。

【０１２７】 １つの突然変異が３９人の散発性患者のうち３６人で同定された（９２％）。
本研究調査では、初めて、散発性ＮＦ１患者においても、その病原性突然変異が
高い効率をもって同定することができることを示している。この努力のもっとも
即時的な結果は、散在性患者の子孫における前症候性／出生前試験を提供する能
力である。さらに、感受性試験は、ＮＦ１関連症状を呈する若年患者を診断する
のを助けることができるが、しかし、まだ、Ｎ．Ｉ．Ｈ．診断基準を満たしては
いない。

【０１２８】 ＮＦ１におけるように、高く、また新たな突然変異率を伴う諸条件においては
、体細胞モザイク症の存在が予測されている（Hall、1988）。散在性対家族性Ｎ
Ｆ１患者における総コード領域を解析した後の突然変異検出率間の比較は現在ま
でのところ公表されていない。本発明者らによる研究調査では、２人の患者のｇ
ＤＮＡ直接シークエンシングクロマトグラムからは、その突然変異体と野生型配
列は等しい量で存在するわけではないことが示唆されている。これは、体細胞モ
ザイク症を反映するものとなる可能性もあり、また、現在さらに研究調査が行わ
れている。本発明者らが突然変異を発見しなかった患者は全員、散発性であり、
また、低いレベルの体細胞モザイク症は、その突然変異を発見することに失敗す
る可能性がある。技術が１００％感受性のものではないため、本発明者らがその
突然変異を見逃した可能性があるか、あるいは、いままで解析されることがなか
った、エクソン１あるいは４９にある５′あるいは３′ＵＴＲにその突然変異が
存する可能性がある。

【０１２９】 症例の大半では、ＮＦ１の臨床上の特徴は、ＰＴＣにつながっていく突然変異
によりまた、その突然変異体ＲＮＡの急速な崩壊によるハプト不全により引き起
こされる。本研究調査では、優性−陰性様式でその影響を発揮する可能性がある
６つのミスセンス突然変異および／または小さなインフレーム欠失が同定された
。ある種の切断されたニューロフィブロミンを作り出す可能性がある突然変異の
もう１つの群は、スプライシングに影響を与える突然変異である。ＮＦ１遺伝子
におけるスプライシングエラーの頻度は、他の遺伝子障害に比較して、非常に高
い（２８％）か、あるいは、相対的な標的サイズの計算により予測することがで
きる（Krawczakら、1992）。スプライシング突然変異の少数のみ（４／１９）が
不突然変異体ＡＧ／ＧＴジヌクレオチドで発見され、また３′ｓｓにおける突然
変異は、５′ｓｓにおけるのと同様の頻度であった。８つのスプライシング突然
変異は、総エクソンあるいはエクソンの一部のインフレームの飛び越しを誘発し
、また、「漏出性」である潜在性を有する。これらのスプライシング突然変異の
うち４つ（Ｓ１７６５Ｘ、Ｋ２２８６Ｎ、Ｃ６７９２ＡおよびＣ６７９２Ｇ）は
、安定した突然変異体転写物を形成するので、切断ニューロフィブリンが形成さ
れるという可能性が残る。

【０１３０】 観察されたスプライシング欠陥により、スプライシング部位競合およびスプラ
イシング部位選択のスプライシング決定因子を調べる、通常ではない機会が提供
される。

【０１３１】 ＮＦ１遺伝子のいくつかの領域に関しては、本発明者らは、正常対照者におけ
るエクソン欠失転写物を発見した。これらの転写物の存在は、「加齢」リンパ球
から抽出されたＲＮＡではさらに顕著であった。複数の代替的なスプライシング
された転写物がＮＦ１に関して記述されている（Danglotら、1995；Suzukiら、1
991；Cawthonら、1990；Parkら、1998）。他の特異的なスプライシング突然変異
体が明らかに形成される観察は、それが典型的には低いレベルであっても、血液
リンパ球が、生理学温度で維持されていない場合には、問題となる。その結果に
より、特定のスプライシング突然変異体の割合を改変することにより、後生的発
現因子が、ＮＦ１患者における表現型の可変性に寄与する可能性があるという仮
説支持が付与される。

【０１３２】 エクソン欠失産物がＰＴＴ測定において容易に検出されるという事実から、ゲ
ノムＤＮＡにおいて信頼できる潜在的な突然変異が同定されるまでは、「陽性」
ＰＴＴ結果の解釈において、注意することが必要であることが示される。特に、
ｃＤＮＡとゲノムＤＮＡにおける突然変異を同定することができない場合には、
診断目的でそのＰＴＴの結果を使用することは賢明なことではない。

【０１３３】 しばしば、臨床サンプルは輸送で遅滞し、またこうしたサンプルのｃＤＮＡ解
析は、スプライシングエラーを擬態するという結果を生むことがある。本発明者
らは、ＥＢＶ形質転換細胞培養を確立することによりこの問題を回避したが、し
かし、これは、時間を浪費し、また経費がかかる工程である。したがって、本発
明者らは、現行では、効率ならびにフィトヘムアグルチニン刺激リンパ球の短期
間培養から開始するＰＴＴの感受性を評価する。刺激リンパ球の短期培養とピュ
ーロマイシン処理の組み合わせは、ＰＴＴによるＮＦ１遺伝子における突然変異
を信頼ができ、かつ感受性の高い方法で同定するのに必要とされる時間を有意に
減少させることができる。

【０１３４】 ＮＦ１遺伝子に対する強力な突然変異検出技術が有効なものになることにより
、ｉ）ＮＦ１遺伝子の、部分的ＮＦ、胃腸管ＮＦ、家族性らせん状ＮＦ、家族性
カフェオレスポット、遅発性発症ＮＦおよびＮＦ１関連条件に対する、付加的な
特徴を伴った寄与とは何か、ii）ＮＦ１における遺伝子型−表現型相関性が存在
するのか、iii）散発性ＮＦ１症例における体細胞モザイク症の寄与は何かとい
った積年の問題に取り組むことが可能となる。

【０１３５】

【表１】

【０１３６】

【表２】

【０１３７】

【表３】

【０１３８】

【表４】

【０１３９】

【表５】

【０１４０】

【表６】

【０１４１】

【表７】

【０１４２】

【表８】

【０１４３】

【表９】

【図面の簡単な説明】

【図１】 最適化ＮＦ１遺伝子突然変異解析の概観。 末梢血リンパ球は患者から採取し、ＤＮＡはリンパ球から抽出する。随伴する
ＥＢＶ形質転換リンパ芽球腫細胞系はが開始されるか、ＰＨＡ刺激リンパ球の短
期間培養が開始される。いったん培養物が安定したら、培養物を分割し、培養物
１（Ｐ＋培養物；ここでピューロマイシンを添加する）を２００μg/mlのピュー
ロマイシンを用いて１６時間培養し、第２の培養物（Ｐ−培養物；ここではピュ
ーロマイシンを添加しない）をＲＰＭＩ１６４０培地でさらにインキュベートす
る。ｃＤＮＡのサイクル配列決定の良好な信号対雑音比を得るために、Ｐ＋培養
物から全ＲＮＡを抽出する。ｃＤＮＡはランダムヘキサマーを用いて調製し、コ
ード化領域はＴ７プロモータを含む修飾フォワードプライマー、ＫＯＺＡＫ配列
、および解析される配列を含むフレーム内のメチオニン開始コドンを用いて、５
個の重複断片において増幅する。その後、インビトロ転写／翻訳ペプチド断片を
、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分離する。切断ペプチドがある場合、この
切断ペプチドにつながるＲＴ−ＰＣＲ断片をサイクル配列決定によって解析する
。ｃＤＮＡ配列パターンが解釈されると、我々は、ＮＦ１遺伝子コード化ドメイ
ン全体をカバーするリンパ球から直接抽出されるＤＮＡのサイクル配列決定によ
って、ゲノムレベルで解析を続ける。それゆえ、同定される突然変異がＥＢＶ形
質転換そのものによって導入されたことは、除外できる。

【図２】 ＮＦ１遺伝子（尺度スケールに描かれた６０エクソン）およびインビトロ転写
／翻訳に使用される５重複ＲＴ−ＰＣＲ断片の位置の全コード領域の概略図 ５個の重複ＲＴ−ＰＣＲ断片の位置を示す。エキソン番号を示す。隣接断片間
の重複は、アミノ酸（ＡＡ）中に示す。短い縦線は、ＲＴ−ＰＣＲ断片の直接サ
イクル配列決定を実施するのに用いる配列決定プライマーの位置を示す。下は、
５個の断片のインビトロ転写／翻訳後に得られた正常なペプチドを示すＳＤＳ−
ＰＡＧＥによる画像である。各ゲルは、タンパク質マーカー（１４Ｃメチル化タ
ンパク質ＣＦＡ６２６（Amersham））を装填する。６９kDaは、タンパク質マー
カーによる最大のペプチド帯のサイズを示す。タンパク質マーカーのより小さい
断片のサイズは、４６kDa、３０kDaおよび１４．３kDaである。ＧＲＤはＧａｐ
関連ドメインを示し、これは触媒作用ＧＴＰａｓｅ刺激活性（KimおよびTamanoi
, 1998）を持つドメインである。ＧＲＤは、タンパク質アミノ酸１１７２−１５
３８ に広がる。

【図３】 ＮＦ１エキソン２０の解析へのピューロマイシンの効果 ＲＮＡは、２００μl/mlのピューロマイシンを用いて１５時間インキュベーショ
ンしたリンパ芽球腫細胞培養物と、インキュベーションを行わないリンパ芽球腫
細胞培養物から抽出した。 Ａ． ＮＦ１患者ＮＦ−０３９によるＰｐｌｕｓおよびＰｍｉｎ ＥＢＶ培養物
からのＰＴＴ。レーン１：タンパク質マーカー（サイズはkDa）。レーン２、３
、ピューロマイシン処理を行った、または行わないＰｐｌｕｓおよびＰｍｉｎ培
養物で、切断ペプチドの存在はＰＴＴ解析によって同定された。 野生種ペプチドと比較した切断ペプチドの強度は、ピューロマイシン処理後に大
きく向上した。 Ｂ． ピューロマイシン処理を行わなかった培養物から開始した、サブクローニ
ングを行わないｃＤＮＡエキソン２０の直接サイクル配列決定は、ナンセンス仲
介ｍＲＮＡの崩壊によって、エキソン２０のナンセンス突然変異の存在を明確に
同定することができなかった。 Ｃ． ピューロマイシン処理培養物から開始した、サブクローニングを行わなか
ったｃＤＮＡの直接配列決定により、エキソン２０：３３６７ＧｔｏＴ、Ｅ１１
２３Ｘの突然変異の明快な同定につながる、明確な結果が得られた。

【図４】 ＮＦ１エキソン１０ｃの解析へのピューロマイシンの効果 Ａ． 正常な対照およびＮＦ１患者ＮＦ−０３３によるＰｐｌｕｓおよびＰｍｉ
ｎ ＥＢＶ培養物からのＰＴＴ。レーン１：タンパク質マーカー（サイズはkDa
）。レーン２、４：Ｐｐｌｕｓ培養物。レーン３、５：Ｐｍｉｎ培養物。レーン
２および３：野性種（ＷＴ）ＮＦ１のみを示す正常な対照。レーン４および５：
アミノ酸５２４のＮＦ１停止コドン突然変異の存在により、切断ペプチドを示す
患者ＮＦ−０３３。 Ｂ． Ｐｍｉｎ（上のパネル）およびＰｐｌｕｓ（下のパネル）の患者ＮＦ−０
３３のＥＢＶ培養物のｃＤＮＡ配列クロマトグラム。矢印、ヘテロ接合性ピーク
：アミノ酸５２４におけるＧＡＡ＞ＴＡＡ。

【図５】 ＮＦ１エクソン７における特異的ナンセンス突然変異を担体する 「加齢」血
液と、ＥＢＶ細胞系統に存在するＮＦ１エクソン７飛び越しの断片解析に基づく
ＡＬＦであるが、エクソン７における突然変異を担体することのない新鮮血およ
びＥＢＶ細胞系統は存在しない。 未処理血液のprelevationの直後細胞培養用インキュベータから取出した後にＲ
ＮＡを抽出する重要性の図解。ＲＮＡ全体をＰｐｌｕｓおよびＰｍｉｎ ＥＢＶ
培養物から、そしてただちに処理した（「新鮮」）末梢血リンパ球か、室温で保
存しprevelationの４８時間後に処理した（「加齢」）末梢血リンパ球から抽出
し、Ｅ６（５′−ＴＴＧＡＣＴＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＴ−３′）の５′−フル
オレセイン標識フォワードプライマーおよびＥ８（５′−ＴＴＧＡＧＡＡＴＧＧ
ＣＴＴＡＣＴＴＧＧＡ−３′）のリバースプライマーを用いたＥ７の半定量ＲＴ
−ＰＣＲ解析を行った。レーン１、（新しい末梢血リンパ球）。レーン２、「加
齢」末梢血リンパ球。レーン３および５、ともに突然変異Ｒ３０４Ｘを持つ患者
ＮＦ−０２７ （Ａ）およびＮＦ−０６４（Ｂ）によるＰｍｉｎ ＥＢＶ培養物
。レーン４および６、ともに突然変異Ｒ３０４Ｘ３を持つ患者ＮＦ−０２７ （
Ａ）およびＮＦ−０６４（Ｂ）によるＰｐｌｕｓ ＥＢＶ培養物。レーン７およ
び８、突然変異Ｒ２２６４Ｘを持つ患者ＮＦ−０１９によるＰｍｉｎ（レーン７
）およびＰｐｌｕｓ（レーン８）ＥＢＶ培養物。

【図６】 ＮＦ１エクソン３７における特異的ナンセンス突然変異を担体する 「加齢」
血液と、ＥＢＶ細胞系統に存在するＮＦ１エクソン７飛び越しの断片解析に基づ
くＡＬＦであるが、エクソン３７における突然変異を担体することのない新鮮血
およびＥＢＶ細胞系統は存在しない。 未処理血液のprelevationの直後に細胞培養用インキュベータから取出した後に
ＲＮＡを抽出する重要性の別の図解。 エキソン３６に位置する５′フルオレセイン標識フォワードプライマーおよびエ
キソン３８に位置するリバースプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ生成物の断片
解析を行った。２０サイクルの増幅を実施した。ＲＴ−ＰＣＲ断片は、ＡＬＦ自
動ＤＮＡシーケンサ（Pharmacia）によって、５％変性ポリアクリルアミドゲル
上で分離した。断片の長さは、内外のマーカー（Ｍ）を使用して、Fragment Man
agerソフトウェアを用いて評価した。各転写物の量は、曲線による面積として決
定し、この面積はFragment Managerソフトウェア（Pharmacia）で評価し、特定
のサンプルで得られるすべての断片の和に対して正規化した。これは、スキップ
／全体として表される。

【図７】 １０５人の患者を解析することにより、ＮＦ１遺伝子の全コード領域のＰＴＴ
により同定された８５突然変異の分布 この図は、拡大したＮＦ１遺伝子のコード化領域全体のの概略図を示す。１０５
名の患者のうち８５名で、ＮＦ１遺伝子の突然変異をＰＴＴを用いて描出するこ
とができた（表１を参照）。エキソン番号はViskochil D.(1998）が述べたとお
りに示した。突然変異ホットスポットは、同じヌクレオチドで２名の無関係な患
者のの少なくとも２個の独立発生突然変異の発生によって定義される。例として
は、Ｒ３０４Ｘ（エキソン７）、Ｒ４４０Ｘ（エキソン１０ａ）、Ｒ４６１Ｘ（
エキソン１０ａ）、Ｙ４８９Ｃ（エキソン１０ｂ）、２０３３−２０３４ｉｎｓ
Ｃ（エキソン１３）、Ｒ１３６２Ｘ（エキソン２３．２）、Ｒ１５１３Ｘ（エキ
ソン２７ａ）、Ｒ１８４９Ｑ（エキソン２９）、２３６６ｄｅｌＮＦ（エキソン
３９）である。また、同一スポットにおける２個の異なる突然変異（たとえば、
エキソン１０ｂの１４６５−１４６６ｉｎｓＣおよび１４６６Ａ＞Ｇ）の発見は
それ自体、突然変異ホットスポットを示す（Cooperら、1998）。さらに、解析さ
れる患者数で同定される突然変異の数をエキソンのサイズに対して重み付けする
場合、突然変異高密度領域、すなわちエキソンエキソン７、１０ａ−１０ｂ−１
０ｃおよびエキソン３７が突出する。エキソン３１は、突然変異ホットスポット
、すなわちＲ１９４７Ｘを含むことが以前に説明されていた（UpadhyayaおよびC
ooper, 1998）。我々は、これまでこの突然変異を一度発見しただけであったが
、これは複数の研究グループによってすでに発見され、それゆえ反復性突然変異
である。しかしこの突然変異を突然変異ホットスポットと呼ぶことは、偏見によ
って、最近まで、研究グループおよび突然変異を以前に他者が報告したこれらの
領域を調査したグループが優先的に調査した、遺伝子の限定された部分のみであ
る。

【図８】 １０５人の患者を解析することにより、ＮＦ１遺伝子の全コード領域のＰＴＴ
を使用して本発明者らがいままでに同定したすべての突然変異の分布ならびに、
突然変異がＰＴＴによっては同定されなかった患者のヘテロ二重鎖解析、ＦＩＳ
Ｈ解析、サザンブロット解析、および細胞遺伝学解析 ＰＴＴアッセイで陰性であったすべての患者のすべてのエキソンについてヘテロ
二重鎖解析が完了していない。これまで６個の興味深いミスセンス突然変異およ
び／またはフレーム内欠損が開示された：Ｃ９３Ｙ（エキソン３）、Ｃ１８７Ｙ
（エキソン４ｂ）、２７４ｄｅｌＬ（エキソン６）、Ｌ８４７Ｐ（エキソン１６
）、９９１ｄｅｌＭ（エキソン１７）、２３６６ｄｅｌＮＦ（エキソン３９）。
それらの分布は、ＮＦ１遺伝子のコード化領域全体を表示しているバー上に与え
られている。また、遺伝子全体の欠損は、４名の患者と１個の転座Ｔ（１４；１
７）（ｑ３２；１１．２）見られた。これまで全部で１０５名の患者の解析によ
り同定されたすべての突然変異を表１にまとめる。

【図９Ａ】 ＮＦ１遺伝子における「突然変異豊富な」領域の概観 我々の研究において、エキソン７、１０ａ、１０ｂ、１０ｃおよび３７は、特に
突然変異が豊富な領域として有効である。あるエキソンのコード化領域のパーセ
ンテージを定義するために、我々は所与のエキソンのヌクレオチド数とコード化
領域全体（すなわち８４５７ｎｔ）のヌクレオチド数の比を求めた。分母におい
て、突然変異が発見されたことのない、代わりにスプライスされたエキソン９ｂ
ｒ、２３ａおよび４８ａを除いて、ＡＴＧからＴＧＡまでのコード化領域全体が
採取された。

【図９Ｂ】 本研究調査でみつかった再発性突然変異の概観 括弧内に示す：反復突然変異を起こしやすいエキソン、患者が散発性（Ｓ）であ
るか、家族性（Ｆ）であるかにかかわらず、本研究で発見された特異性突然変異
を持つ患者の数。同一の突然変異を有する２名の明らかに無関係な患者が発見さ
れ、患者が家族性である場合、両方の患者が本当に無関係であり、そのために突
然変異が別個に発生したことを確認するために、ハプロタイプ解析を実施した。

【図１０】 突然変異ＩＶＳ２６−２Ａ＞Ｔにより活性化されたＩＶＳ２６における２つの
異なる潜在性スプライシング受容体を検出する現行の方法の倍率の説明図 Ａ． 突然変異４５１５−２Ａ＞Ｔの存在を示すゲノムＤＮＡ配列クロマトグラ
ム。 Ｂ． ピューロマイシン処理ＥＢＶ細胞系から開始した、エキソン２６および
２７領域の直接サイクル配列決定クロマトグラムは、野生種対立遺伝子に由来す
るエキソン２７を含む正常な転写物以外に、２個のミュータント転写物母集団：
ＩＶＳ２６（ミュータント転写物）の最後の１４ｎｔの挿入を含む画分およびＩ
ＶＳ２６（ミュータント転写物）の最後の１７ｎｔの挿入を含む別の画分が存在
することを示した。ミュータント転写物は、ＩＶＳ２６の２個の異なる潜在性ス
プライス受容体の使用によって生成される（表９を参照）。 Ｃ． 患者ＮＦ−０４４で生成されたサブクローニングの後の、２個のミュータ
ント転写物母集団のｃＤＮＡ配列決定クロマトグラム。ＩＶＳ２６（左パネル）
の最後の１４ｎｔの挿入を含む画分およびＩＶＳ２６（右パネル）の最後の１７
ｎｔの挿入を含む別の画分。

【図１１】 突然変異ＩＶＳ３９−１２Ｔ＞Ａの存在により生成された２個の異なるミスス
プライス転写物を検出する現在の方法の能力の図解。 患者ＮＦ−００５のＩＶ３３９−１２Ｔ＞ＡのゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびサ
ブクローン化ｃＤＮＡ配列のクロマトグラム。 Ａ． ＰＴＴの結果。レーン１および２：正常な対照ＥＢＶ培養物からインビト
ロ合成されたペプチド。レーン３：患者ＮＦ−００５のＰｍｉｎ ＥＢＶ培養物
からインビトロ合成されたペプチド。矢印は２個の異なる切断ペプチドの存在を
示す：エキソン４０がスキップされた転写物に由来するペプチドと、ＩＶＳの最
後の１０ｎｔの挿入につながるＩＶＳ中の新規スプライス受容体の使用によって
生成される転写物に由来する別のペプチド。 Ｂ． ミュータントクローン化ｃＤＮＡ転写物のサイクル配列決定。上パネル、
７１２７−１２Ｔ＞Ａによって生成された新規スプライス受容体（ｇｔｔｔｇｔ
ｈｇｍｇｔｆｌｇｔｔａｇ／ｔｔｔｔｔｇｔａｇ）に使用による、ＩＶＳ３９の
最後の１０ヌクレオチドの挿入による転写物。転写物はインビトロ翻訳の後、２
０９アミノ酸の切断ペプチドとなる。下パネル、インビトロ翻訳の後、わずか４
４のアミノ酸によって短縮されたペプチドを生じるＥ４０スキッピングによる転
写物。 Ｃ． Ｅ４０のスプライス受容体部位ゲノム領域のサイクル配列決定。矢印、７
１２７−１２Ｔ＞Ａ突然変異を示すペテロ接合性ピーク。

【図１２】 新規スプライシング供与体部位の形成という結果を生じた、エクソン１０ｂに
おける突然変異Ｙ４８９Ｃあるいは１４６６Ａ＞Ｇを示す患者のゲノムおよびｃ
ＤＮＡ解析 ＮＦ１遺伝子のエキソン１０ｂ：１４６６ＡｔｏＧ（Ｙ４８９Ｃ）は、スプライ
シング突然変異を装う「ミスセンス突然変異」である。この突然変異は、エキソ
ン１０ｂの最後の６２ｎｔのスキッピングに至る正常な不変スプライス供与体と
うまく競合する、新規のスプライス供与部位を作成する。 Ａ． スプライス供与部位ＣＴ／ｇｔａａｇの生成を引き起こす、ｎｔ１４６６
におけるＡからＧへの変換を示す患者ＮＦ−０１７のエキソン１０ｂのゲノム領
域の、サブクローニングを行わないサイクル配列決定； Ｂ． 患者ＮＦ−０１７のミュータントクローン化ｃＤＮＡ対立遺伝子のサイク
ル配列決定。エキソン１０ｂの最後の６２ｂｐはスキップされ、ただちにエキソ
ン１０ｃが続き、アミノ酸４８９に停止コドンが生成される。 Ｃ． エキソン１０ｂ周囲のゲノム領域の概略図。影を付けた箱はエキソンを表
し、正常および新規スプライス供与体配列を示す。ｎｔ１４６６におけるＡから
Ｇへの変換によって、新規スプライス供与体が生成される。

【図１３】 スプライシング機器を使用した新規スプライシング供与体部位の形成という結
果を生じた、エクソン１９ｂにおける突然変異Ｖ１０９３Ｍあるいは３２７７Ｇ
＞Ａを示す患者のゲノムおよびｃＤＮＡ解析 ＮＦ１遺伝子のエキソン１９ｂ：３２７７ＧｔｏＡ（Ｖ１０９３Ｍ）は、スプラ
イシング突然変異を装う「ミスセンス突然変異」である。この突然変異は、エキ
ソン１９ｂの最後の４０ｎｔのスキッピングに至る正常な不変スプライス供与体
とうまく競合する、新規のスプライス供与部位を作成する。Splice Site Predic
tion（スプライス部位予測）を使用したＮＦ１遺伝子におけるスプライス優先度
に関する新しい情報は、Neural Networks（ニューラルネットワーク）（http://
www-hgc.lbl.gov/projects/splice.html）を使用して得られる。これをsilico予
測に使用する配列の評価は、野生種エキソン１９ｂが非常に弱いスプライス供与
体を含み、別の弱いスプライス供与体が上流に作成されても不活化する可能性が
あることを示している。 Ａ． 弱いスプライス供与部位ＴＧ／ｇｔａｔｇの生成を引き起こす、ｎｔ３２
７７におけるＧからＡへの変換を示す患者ＮＦ−０６３のエキソン１９ｂのゲノ
ム領域の、サブクローニングを行わないサイクル配列決定；表９を参照。 Ｂ． 患者ＮＦ−０６３のミュータントｃＤＮＡ対立遺伝子の直接サイクル配列
決定。エキソン１０ｂの最後の４０ｂｐはスキップされ、ただちにエキソン２０
が続く； Ｃ． エキソン１９ｂ周囲のゲノム領域の概略図。影を付けた箱はエキソンを表
し、正常および新規スプライス供与体配列を示す。ｎｔ３２７７におけるＧから
Ａへの変換によって、新規スプライス供与体が生成される。

【図１４】 ５２９４Ｃ＞Ａ（Ｓ１７６５Ｘ）ナンセンス突然変異。 ＮＦ１遺伝子のエキソン２９：５２９４ＣｔｏＡ（Ｓ１７６５Ｘは、スプライシ
ング突然変異を装う「ナンセンス突然変異」である。この突然変異は、エキソン
２９の最初の９０ｎｔのスキッピングに至る正常な不変スプライス受容とうまく
競合する、新規のスプライス受容部位を作成する。Splice Site Prediction（ス
プライス部位予測）を使用したＮＦ１遺伝子におけるスプライス優先度に関する
新しい情報は、Neural Networks（ニューラルネットワーク）（http://www-hgc.
lbl.gov/projects/splice.html）を使用して得られる。エキソン２９は、しかし
ながら、弱いスプライス受容体が下流に作成されても不活性化する可能性がすで
にある強力なスプライス受容体を含む。 Ａ． 新規のスプライス受容部位の生成を引き起こす、ｎｔ５２５９におけるＣ
からＡへの置換を示す患者ＮＦ−００９のエキソン２９のゲノム領域の、サブク
ローニングを行わないサイクル配列決定；表９を参照。 Ｂ． 患者ＮＦ−００９のミュータントｃＤＮＡ対立遺伝子の直接サイクル配列
決定。エキソン２９の最初の９０ｂｐである； Ｃ． エキソン２９周囲のゲノム領域の概略図。影を付けた箱はエキソンを表
し、正常および新規スプライス供与体配列を示す。ｎｔ５２９４におけるＣから
Ａへの置換によって、新規スプライス受容体が生成される。

【図１５】 スプライシングに対するナンセンス突然変異の影響 突然変異Ｒ３０４Ｘを持つ患者ＮＦ−０２７のＰＴＴ、ｃＤＮＡおよびｇＤＮＡ
配列決定の結果、突然変異Ｙ２２６４Ｘを持つ患者ＮＦ−００３およびＮＦ−０
１９のＰＴＴの結果。 Ａ． ＮＦ１エキソン２８−３８を含むプライマーを使用したＰＴＴの結果。レ
ーン１および２ 患者ＮＦ−００３（レーン１）および患者ＮＦ−０１９（レー
ン２）で生成された正常および切断ペプチド。我々は、これらの特異性ナンセン
ス突然変異を含むエキソンのスキッピングを引き起こす第１のナンセンス突然変
異を同定した（６７９２Ｃ＞Ａおよび６７９２Ｃ＞Ｇ；Messiaenらで発表， 199
7）。Hoffmeyerら（1998）はその後、ＮＦ１遺伝子内の他のナンセンスコドンは
、不同性スプライスエフェクタであると主張した。我々は、我々の詳細な突然変
異解析技術を使用して、ＮＦ１遺伝子のわずかなナンセンス突然変異のみ、すな
わち以前述べた６７９２Ｃ＞Ａおよび６７９２Ｃ＞Ｇが、エキソン・スキッピン
グを誘起していることを示す。我々は、Ｒ３０４Ｘの支配的な影響が、エキソン
７のスキッピングであるということに関して、Hoffmeyerらと意見を異にする。
図１５ＢおよびＣを参照。我々の実験は、Ｒ３０４Ｘの存在の支配的な効果が、
ＰＴＴアッセイとｃＤＮＡのサイクル配列決定によって明確に立証されるように
、停止コドンの生成であることを示す。 Ｂ． ＮＦ１エキソン１−１２ａを含むプライマーを用いたＰＴＴの結果。ピュ
ーロマイシンによって処理しないＥＢＶ形質転換リンパ芽球腫細胞培養物および
インキュベータから取り出した直後のＲＮＡ抽出物から開始する上述のプライマ
ーを用いた、切断ペプチドを持つ２名の患者の解析。レーン２、３、４は正常な
対照であり、正常に観測されたバンドの存在を示しており、この図ではさらに説
明せず、関連しない。レーン５は、エキソン２８−３８間の領域の突然変異を担
持している他の患者の切断ペプチドの存在を示す。レーン６は、患者ＮＦ−０２
７の約３３kDaの切断ペプチドの存在を示す。レーン１：タンパク質マーカー。
Ｃ． 以下の、サブクローニングを行わないサイクル配列決定。（ａ） Ｒ３０
４を停止コドンに変化させる９１０Ｃ＞Ｔ置換の存在を示す患者ＮＦ−０２７の
ｇＤＮＡ、ｂ） 患者ＮＦ−０２７ Ｐｍｉｎ ＥＢＶ培養物のｃＤＮＡ。矢印
：転写物のわずかな画分中のＴＧＡ対立遺伝子の存在（不等式）、（ｃ） 患者
ＮＦ−０２７ Ｐｐｌｕ ｓ ＥＢＶ培養物のｃＤＮＡ。矢印：ナンセンス仲介
ｍＲＮＡ減衰の抑制による、等量存在するＴＧＡ対立遺伝子の存在。ナンセンス
コドンが保持される場合に、ＰＴＴ反応で予測されるサイズは３３kDaであり、
最適化ＰＴＴは転写に対するＲ３０４Ｘの主要な効果を正しく同定することがで
きた。

【図１６】 試験の組み合わせカスケードの使用により、（非常に稀少な）多型現象および
真正病理学的突然変異の間の同定が可能になる。 ミスセンス突然変異の病理学的影響の評価は、タンパク質中のすべての機能的ド
メインの知識が存在しないため、非常に困難である。 これらの結論を強調する確実なデータが不足しているにもかかわらず、ミスセン
ス突然変異は真の突然変異としてしばしば報告される（Lambertら、2000）。我
々は、ＮＦ１遺伝子のエキソン４５、Ｒ２６１６Ｑのミスセンス突然変異を同定
した：この突然変異は３００の正常な対照染色体で見られず、アルギニンはショ
ウジョウバエ、マウス、ラット、およびフグで保存され、アルギニンのグルタミ
ンへの変化はポリペプチド鎖の劇的な変化を引き起こすことが予測される。しか
し、ミスセンス突然変異は、研究した家族の障害によって分離しなかった。コー
ド化領域全体のＰＴＴによって、真の病原性損傷、すなわちエキソン７のＲ３０
４Ｘが同定され、技術の強さが例証されている。最近の発見の最も直接的な成果
が前駆症状および／または出生前診断を提供することであるため、有効で正確な
分子突然変異解析は極めて重要である。

【図１７】 散発性ＮＦ１患者ＮＦ−０７５におけるＲ２４２９Ｘの体細胞モザイク症。 患者ＮＦ−０７５は１９８９年生まれの男性患者であり、小規模なＣＡＬ斑（＜
５mm）、鎖骨上の皮下神経線維腫、Ｒ心房および隔壁を囲み、心臓周囲に浸潤し
ている叢状神経線維腫、縦隔における多発性内部神経線維腫、左腋窩のシミ、左
眼の２個の虹彩小結節を有する。 Ａ： 断片５の概略図、短い棒は、この断片を研究する配列決定プライマーの存
在を示し、アスタリスクは患者ＮＦ−０７５に見られる停止コドンの位置を示す
。 Ｂ： パネル１：ピューロマイシンで処理した（レーン４）、処理しなかった（
レーン５）患者ＮＦ−０５５のＥＢＶ細胞系の、断片５によるＰＴＴ解析ならび
にピューロマイシンで処理した２個の正常な対照細胞系（レーン２、３）におけ
る、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動およびオートラジオグラムの２０時間露光
。この患者ＮＦ−０５５は、生殖系列突然変異Ｒ２４２９Ｘを有する。患者ＮＦ
−０７５では、別の患者ＮＦ−０５５で以前検出された切断ペプチドとまったく
同じ位置に弱い切断バンドがあることがわかった。このように弱い切断バンドは
、最適の信号対雑音比だけを用いて同定することが可能である。インキュベータ
からＥＢＶ細胞系を取り出した直後に抽出したＲＮＡから開始し、非常に感受性
の高い３Ｈ−ロイシン含有物を用いたＰＴＴは、その後の分子研究のために、興
味のある領域を効率的に特定できる。 パネル２：ピューロマイシンで処理した（レーン１および３）、処理しなかった
（レーン２および４）、患者ＮＦ−０５５（レーン１および２）および患者ＮＦ
−０７５（レーン２および４）による細胞系における、断片５によるＰＴＴ解析
ならびに１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動およびオートラジオグラムの２０時間
露光。 パネル３：パネル２と同じゲルであるが、露光時間を延長した（２０時間の代わ
りに６０時間）。より長い露光を用いると、患者ＮＦ−０７５の切断ペプチドが
さらに速く見られる。 Ｃ．（１）ＮＦ−０５５のゲノムＤＮＡ直接サイクル配列決定のクロマトグラム
により、その血液リンパ球に突然変異Ｒ２４２９Ｘが存在することが明らかにな
る。すべての細胞の１ ＮＦ１コピーに存在する生殖系列突然変異について予想
できるのと同様に、ミュータントは野生種対立遺伝子と等量存在している。 （２） 正常な対照者のゲノムＤＮＡ直接サイクル配列決定のクロマトグラム；
（３） ＮＦ−０７５の直接サイクル配列決定により、その配列において、細胞
の画分中の位置７２８５のＴヌクレオチドの存在を示す小さな信号の存在が明ら
かになる。サイクル配列決定自体そのような信号に病理学的重要性を与えるほど
高感受性ではない； （４） サブクローニングによる患者ＮＦ−０７５のゲノムＤＮＡのそれ以上の
解析により、その血液細胞の画分で突然変異Ｒ２４２９Ｘの存在が明らかになっ
た。これは、ＮＦ１遺伝子のナンセンス突然変異に関する「体細胞性モザイク」
であると同定できた最初の散発性患者である。断片解析（図示せず）は、突然変
異が血液細胞の１０％未満に存在することを示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ６０／２１１，９２９ (32)優先日 平成12年６月16日(2000．6．16) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA12 AA20 CA04 CA11 GA30 HA19 4B063 QA08 QA13 QA17 QQ42 QQ52 QR55 QR62 QS25 QS34 【要約の続き】 よびホットスポットドメインを検出する診断キット、特 異性突然変異ＮＦ１タンパク質の構造を修正する化合 物、これらの治療用化合物のスクリーニングに使用でき るインビトロおよび生体内システムを含む。

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 患者のＮＦ１遺伝子の突然変異解析のための方法であって、
   以下の工程： ａ） 前記患者の末梢血リンパ球を単離する工程、 ｂ） 前記患者の前記末梢血リンパ球を用いてＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球腫細
   胞系を確立するか、又はフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）刺激により血液リンパ
   球を短期間培養する工程、 ｃ） ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球腫細胞系又は短期間培養物を、タンパク質合
   成阻害剤を有するタンパク質合成阻害剤によって処理する工程、 ｄ） 前記ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球腫細胞系より培養物のＲＮＡをただちに
   除去する工程、 ｅ） 適切なプライマーを用いて、前記ＲＮＡを増幅する工程、 ｆ） 工程ｅ）の前記増幅断片のインビトロ転写／翻訳によって、ペプチド断片
   を得る工程 を含む方法。
2. 【請求項２】 前記タンパク質合成阻害剤が、ピューロマイシン、シクロヘ
   キシイミド、アクチノマイシンＤまたは可能性のある類似体である、請求項１記
   載の方法。
3. 【請求項３】 ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球腫細胞系のタンパク質合成阻害
   剤による処理直後に、ＲＮＡが、室温にて４８時間未満の期間に、優先的に抽出
   される、請求項１〜２のいずれか一項記載の方法。
4. 【請求項４】 前記増幅工程が、ポリメラーゼ連鎖反応である、請求項１〜
   ３のいずれか一項記載の方法。
5. 【請求項５】 請求項１記載の工程ｄ）で抽出した前記ＲＮＡが、全ＲＮＡ
   である、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
6. 【請求項６】 請求項１記載の工程ｆ）に、前記ペプチド断片の分離が続く
   、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
7. 【請求項７】 タンパク質分離によって切断されたペプチドが観察される場
   合、請求項１記載の工程ｅ）で得られた増幅されたｃＤＮＡ断片を、前記ｃＤＮ
   Ａ断片内に存在する一部またはすべてのエクソンの特徴づけを可能とするために
   、適切なプライマーによって解析する、請求項６記載の方法。
8. 【請求項８】 前記解析を、適切なプライマーを用いた適切な断片のサイク
   ル配列決定によって実施する、請求項７記載の方法。
9. 【請求項９】 工程ｅ）の前記プライマーが、図２またはいずれかの表に示
   されている、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
10. 【請求項１０】 フレームシフト、ミスセンスまたは沈黙突然変異の検出を
    含む、患者のＮＦ１遺伝子の突然変異解析のための、請求項１〜９のいずれか一
    項記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記プライマーが、エキソン４ｂ、７、１０ａ−１０ｃ、
    １３、２２、２３．２、２７ａ、２９、３７または３９に位置している、請求項
    １〜９のいずれか一項記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記プライマーが標識されている、請求項１〜１１のいず
    れか一項記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記ｃＤＮＡ断片をＡＬＦまたは別の（半）自動化配列決
    定方法によってさらに解析する、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記患者のＤＮＡに存在するゲノム突然変異をさらに解析
    するために、前記患者の前記抹消血リンパ球からさらにＤＮＡも抽出する、請求
    項１〜１３のいずれか一項記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記解析を、ヘテロ二重鎖解析および／または一本鎖配座
    多型解析および／または（次にサイクル配列決定によってさらに解析される異常
    な移動性ＰＣＲ断片を検出するために）配座感受性ゲル電気泳動または直接サイ
    クル配列決定によって実施する、請求項１４記載の方法。
16. 【請求項１６】 エクソン７、１０ａ−１０ｂ−１０ｃ、１３、２３．２、
    ２７ａ、２９または３９における突然変異の検出を含む、患者のＮＦ１遺伝子の
    突然変異の解析方法。
17. 【請求項１７】 ＮＦ１遺伝子の以下の１個以上の特異的突然変異：Ｋ３３
    Ｋ （９９ｄｅｌ１０５）， Ｃ９３Ｙ （２７８Ｇ＞Ａ）， Ｃ１８７Ｙ （
    ５６０Ｇ＞Ａ）， Ｒ１９２Ｘ （５７４Ｃ＞Ｔ）， ６０３−６０４ｉｎｓＴ
    （同上）， Ｑ２０９Ｘ （６２５Ｃ＞Ｔ）， ８１９−８２１ｄｅｌＣＣＴ
    （同上）， ８８９−４５４ｄｅｌ４７４ｎｔ （８８８ｄｅｌ１７４））
    ９８７−９８８ｉｎｓＡ （同上）， １２６１−１９Ｇ＞Ａ （１２６０ｉｎ
    ｓＴＴＴＧＴＴＴＴＴＣＴＣＴＡＧＴＣ）， Ｗ４２５Ｘ （１２７５Ｇ＞Ａ）
    ， Ｒ４６１Ｘ （１３８１Ｃ＞Ｔ）， Ｙ４８９Ｃ （１４６５ｄｅｌ６２）
    ， １４６６ｉｎｓＣ （同上）， １５２７＋５Ｇ＞Ａ （１３９２ｄｅｌ１
    ３５）， Ｅ５２４Ｘ （１５７０Ｇ＞Ｔ）， １６０５ｉｎｓＡ （同上），
    Ｓ５３６Ｘ （１６０７Ｃ＞Ａ）， １６４２−３Ｃ＞Ｇ （１６４１ｄｅｌ
    ８０）， ２３０５ｉｎｓＴ （同上）， ２５８５ｉｎｓＡ （同上）， ２
    ８３６ｉｎｓＴ （同上）， ２８５０＋２ｄｅｌ６ （２６１７ｄｅｌ２３３
    ）， ２８５１−６ｄｅｌ４ （２８５０ｄｅｌ１４０）， Ｑ９５９Ｘ （２
    ８７５Ｃ＞Ｔ）， Ｑ９６３Ｘ （２８８７Ｃ＞Ｔ）， ２９９０＋３Ａ＞Ｃ
    （２８５０ｄｅｌ１４０）， Ｙ１０４４Ｘ （３１３２Ｃ＞Ａ）， ３１９３
    ｄｅｌＣ （同上）， Ｖ１０９３Ｍ （３２７７Ｇ＞Ａ／ ３２７４ ｄｅｌ
    ４０）， ３１０８−３Ｃ＞Ｇ （３３１４ｄｅｌ１８２）， Ｅ１１２３Ｘ
    （３３６７Ｇ＞Ｔ）， ３４５７ｄｅｌＣＴＣＡ （同上）， Ｑ１１７４Ｘ
    （３５２０Ｃ＞Ｔ）， ３７０４ｄｅｌＡ （同上）， ３７０８＋１Ｇ＞Ｃ
    （３４９６ｄｅｌ２１２）， ４０２６ｄｅｌＧ （同上）， ４２９９ｄｅｌ
    Ｃ （同上）， Ｑ１４９４Ｘ （４４８０Ｃ＞Ｔ）， ４５１５−２Ａ＞Ｔ
    （４５１５−１４ｉｎｓ１４／４５１５−１７ｉｎｓ１７）， ４７７３−２Ａ
    ＞Ｔ （４７７２ｄｅｌ４３３／４７７２ｄｅｌ２９３）， ５０３３ｄｅｌＧ
    （同上）， ５１１７ｄｅｌＴ （同上）， Ｒ１８４９ （５０２ｄｅｌ３
    ４１／５２０５ｄｅｌ５４４）， Ｓ１７５５Ｘ （５２６４Ｃ＞Ｇ）， Ｓ１
    ７６５Ｘ （５２１５ｄｅｌ９０／５２９４Ｃ＞Ａ）， ５５６７ｄｅｌＴ （
    同上）， ５７９８ｄｅｌＣ （同上）， Ｑ１９６６Ｘ （５８９６Ｃ＞Ｔ）
    ， ６５７７ｄｅｌＧＡＧｇｔａ （６３６４ｄｅｌ２１５）， Ｒ２２３７Ｘ
    （６７０９Ｃ＞Ｔ）， ６８５８Ｇ＞Ｃ （６７５６ｄｅｌ１０２）， ７１
    ２７−１２Ｔ＞Ａ （７１２６ｄｅｌ１３２／７１２７−１０ｉｎｓ１０），
    ７２６８ｄｅｌＣＡ （同上）， Ｋ２４０１Ｘ （７２０１Ａ＞Ｔ）， Ｒ２
    ４２９Ｘ （７２８５Ｃ＞Ｔ）， ７８８４−７８８５ｄｅｌＧＴ （同上），
    ８０１６ｄｅｌＡ （同上）；（前記文字および番号付けは、最初に示される
    アミノ酸レベルでの突然変異を指し、前記突然変異のｍＲＮＡレベルでの効果は
    かっこ内に示す） ；またはＮＦ１遺伝子を妨害するゲノム突然変異ｔ（１４；
    １７）（ｑ３２；ｑ１１．２）を検出する方法。
18. 【請求項１８】 請求項１６または１７に記載の突然変異領域または位置を
    特異的に増幅するプライマーを含む、診断キット。
19. 【請求項１９】 請求項１６または１７に記載の突然変異領域または位置を
    特異的に増幅するプローブを含む、診断キット。
20. 【請求項２０】 請求項１７に記載の突然変異ＤＮＡによってコードされた
    、突然変異ＮＦ１タンパク質の欠陥構造を修正する化合物を同定する方法。
21. 【請求項２１】 治療剤のスクリーニングに使用可能な、請求項１７に記載
    のＮＦ１遺伝子突然変異を含むモデルシステム。