JP2003527862A - 異種重金属輸送および複合体生成タンパク質を含む遺伝的に改変された植物および植物細胞 - Google Patents
異種重金属輸送および複合体生成タンパク質を含む遺伝的に改変された植物および植物細胞Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は異種金属輸送タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝的に改変された植物および植物細胞に関する。
Description
【０００１】発明の技術分野
本発明は、エキソ細胞質重金属抵抗性システムの発現（排出および複合体生成
）に基づく、増加された植物生長およびバイオマス生産による、改良された重金
属耐性および蓄積性を有する遺伝的に改変された植物または植物細胞の分野にあ
る。
）に基づく、増加された植物生長およびバイオマス生産による、改良された重金
属耐性および蓄積性を有する遺伝的に改変された植物または植物細胞の分野にあ
る。
【０００２】
より具体的には、本発明は異種重金属輸送タンパク質および種々の起源のエキ
ソ細胞質金属結合性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、遺伝的に
改変された植物および植物細胞に関する。
ソ細胞質金属結合性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、遺伝的に
改変された植物および植物細胞に関する。
【０００３】発明の背景および先行技術
重金属抵抗性をコードする異種核酸配列は、これらの毒性要素に対するその耐
性を改善するために、植物中で機能的に発現された。例えば、異種重金属抵抗遺
伝子は、重金属排出システムまたは重金属封鎖に関与する機能のいずれかを示す
。
性を改善するために、植物中で機能的に発現された。例えば、異種重金属抵抗遺
伝子は、重金属排出システムまたは重金属封鎖に関与する機能のいずれかを示す
。
【０００４】
現在までに、増加された重金属抵抗性を提供する細胞質機能のみが植物中で発
現された：
現された：
【０００５】
１．植物中の異種メタロチオネインおよびファイトキレチン（phytochelatine）
の発現 非常に安定な複合体中に重金属イオンを結合および隔離するシステインのスル
フィドリル残基に富むメタロチオネインおよびファイトキレチン(Karin, 1985)
は、真核生物中に見出されているが、近年、シネココッカス(Synechococcus)中
にも見出されている。種々のＭＴ遺伝子−マウスＭＴＩ、ヒトＭＴＩＡ（アルフ
ァドメイン）、ヒトＭＴＩＩ、チャイニーズハムスターＭＴＩＩ、酵母ＣＵＰ１
、エンドウ豆ＰｓＭＴＡ−は、タバコ、カリフラワーまたはシロイヌナズナ(Ara
bidopsis thaliana)へ形質移入されている(Lefebreら、1987; Maitiら、1988, 1
989, 1991; MisraおよびGedamu, 1989: Evansら、1992; Yearganら、1992; Bran
dleら、1993; Panら、1993; ElmayanおよびTepfer、1994; Hattoriら、1994; Pa
nら、1994a, b; Hasegawaら、1997)。その結果、強化されたＣｄ耐性の程度を変
化させることが達成され、コントロールに比べると、最大２０倍となる。金属吸
収の程度は非常に大きくは変化されず、ある場合では、相違がなかったが、他の
場合では最大７０％未満または６０％以上より多量のＣｄが、シュートまたは葉
によって吸収された。植物起源のＭＴにより産生されたトランスジェニック植物
に関して、唯一の研究が報告されている。エンドウ豆（ピサム・サチブム(Pisum
sativum)のＭＴ様遺伝子ＰｓＭＴＡがシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)
中で発現された場合、より多くのＣｕ（ある植物では数倍）が、コントロール植
物中よりも形質転換植物中に蓄積された(Evans ら、1992)。
の発現 非常に安定な複合体中に重金属イオンを結合および隔離するシステインのスル
フィドリル残基に富むメタロチオネインおよびファイトキレチン(Karin, 1985)
は、真核生物中に見出されているが、近年、シネココッカス(Synechococcus)中
にも見出されている。種々のＭＴ遺伝子−マウスＭＴＩ、ヒトＭＴＩＡ（アルフ
ァドメイン）、ヒトＭＴＩＩ、チャイニーズハムスターＭＴＩＩ、酵母ＣＵＰ１
、エンドウ豆ＰｓＭＴＡ−は、タバコ、カリフラワーまたはシロイヌナズナ(Ara
bidopsis thaliana)へ形質移入されている(Lefebreら、1987; Maitiら、1988, 1
989, 1991; MisraおよびGedamu, 1989: Evansら、1992; Yearganら、1992; Bran
dleら、1993; Panら、1993; ElmayanおよびTepfer、1994; Hattoriら、1994; Pa
nら、1994a, b; Hasegawaら、1997)。その結果、強化されたＣｄ耐性の程度を変
化させることが達成され、コントロールに比べると、最大２０倍となる。金属吸
収の程度は非常に大きくは変化されず、ある場合では、相違がなかったが、他の
場合では最大７０％未満または６０％以上より多量のＣｄが、シュートまたは葉
によって吸収された。植物起源のＭＴにより産生されたトランスジェニック植物
に関して、唯一の研究が報告されている。エンドウ豆（ピサム・サチブム(Pisum
sativum)のＭＴ様遺伝子ＰｓＭＴＡがシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)
中で発現された場合、より多くのＣｕ（ある植物では数倍）が、コントロール植
物中よりも形質転換植物中に蓄積された(Evans ら、1992)。
【０００６】
２．重金属還元の異種発現
公知である唯一の例は、フレクスナー赤痢菌(Shigella flexneri)のＴｎ２１
のｍｅｒオペロンである。植物中でのその発現は、水銀（Ｈｇ２＋）のその金属
形態（Ｈｇ０）への還元を生ずる。この金属性水銀は、細胞から揮発される(Rug
hら、1996)。
のｍｅｒオペロンである。植物中でのその発現は、水銀（Ｈｇ２＋）のその金属
形態（Ｈｇ０）への還元を生ずる。この金属性水銀は、細胞から揮発される(Rug
hら、1996)。
【０００７】発明の目的
本発明は、改善された重金属耐性特性、および所望により、重金属蓄積性を有
する植物および植物細胞を得る新規な方法を提供することを目的とする。
する植物および植物細胞を得る新規な方法を提供することを目的とする。
【０００８】
本発明の他の目的は、重金属汚染箇所の植物再生および植物固定化のための増
加された重金属抵抗性を可能とする、このような植物および植物細胞を提供する
ことにある。
加された重金属抵抗性を可能とする、このような植物および植物細胞を提供する
ことにある。
【０００９】
本発明の別な目的は、重金属の植物抽出（包括的根粒濾過）を可能とする増加
された重金属耐性と組み合わせた増加された重金属蓄積性を特徴とする、植物お
よび植物細胞を提供することにある。
された重金属耐性と組み合わせた増加された重金属蓄積性を特徴とする、植物お
よび植物細胞を提供することにある。
【００１０】
本発明の最後の目的は、重金属耐性および蓄積性の高いバイオマス生産におい
て、重要な農産物種を改良する可能性を生じる方法を提供することにある。
て、重要な農産物種を改良する可能性を生じる方法を提供することにある。
【００１１】発明の要約
本発明は、種々の原核生物または真核生物起源の１種または複数の異種重金属
輸送および／または封鎖タンパク質をコードする少なくとも１つのヌクレオチド
配列を含む、改良された（誘発または増加された）重金属抵抗性を有する遺伝的
に改変された植物および植物細胞に関する。
輸送および／または封鎖タンパク質をコードする少なくとも１つのヌクレオチド
配列を含む、改良された（誘発または増加された）重金属抵抗性を有する遺伝的
に改変された植物および植物細胞に関する。
【００１２】
前記輸送体は、好ましくは膜タンパク質であり、これは細胞からの重金属の排
出による毒性低下を生じ、かつ、Ｐ型ＡＴＰａｓｅ、３成分排出ポンプ、ＡＢＣ
輸送体およびＣＤＦタンパク質（カチオン拡散ファシリティタータンパク質）か
らなる群から好ましくは選択される。
出による毒性低下を生じ、かつ、Ｐ型ＡＴＰａｓｅ、３成分排出ポンプ、ＡＢＣ
輸送体およびＣＤＦタンパク質（カチオン拡散ファシリティタータンパク質）か
らなる群から好ましくは選択される。
【００１３】
Ｐ型ＡＴＰａｓｅのファミリーは、機能的抵抗性のために一つのタンパク質し
か要求されないという利点を有するから好ましい。
か要求されないという利点を有するから好ましい。
【００１４】
前記タンパク質は原核生物および植物を含む真核生物の両方に見出される。
【００１５】
前記輸送体の他の利点は、環境問題の多くの毒性微量元素、銅、カドミウム、
鉛、亜鉛および銀などに対する抵抗性メカニズムに見られる。
鉛、亜鉛および銀などに対する抵抗性メカニズムに見られる。
【００１６】
予期せぬことに、前記タンパク質のコード配列において構造的変更を行う必要
がなかったが、植物中での機能発現を得るために、ｍｅｒＡ遺伝子ではこれが必
要である(Rughら、1996)。
がなかったが、植物中での機能発現を得るために、ｍｅｒＡ遺伝子ではこれが必
要である(Rughら、1996)。
【００１７】
好ましくは、植物または植物細胞中に導入される遺伝子は、ｃａｄＡ遺伝子な
どの細菌Ｐ型ＡＴＰａｓｅ、好ましくはカドミウムＡＴＰａｓｅをコードする遺
伝子である。
どの細菌Ｐ型ＡＴＰａｓｅ、好ましくはカドミウムＡＴＰａｓｅをコードする遺
伝子である。
【００１８】
本発明の他の態様は、植物または植物細胞中への増加された重金属抵抗性を誘
発（または改良）する方法に関し、前記方法は下記工程を含む： 植物中で活性な１種または複数の制御配列に操作可能に連結される、１種また
は複数の異種重金属輸送および／または封鎖タンパク質をコードする少なくとも
１つのヌクレオチド配列を調製し、 前記ヌクレオチド配列で植物または植物細胞を形質転換し、かつ、 所望により、形質転換された植物または植物細胞から（トランスジェニック）
植物を再生する。
発（または改良）する方法に関し、前記方法は下記工程を含む： 植物中で活性な１種または複数の制御配列に操作可能に連結される、１種また
は複数の異種重金属輸送および／または封鎖タンパク質をコードする少なくとも
１つのヌクレオチド配列を調製し、 前記ヌクレオチド配列で植物または植物細胞を形質転換し、かつ、 所望により、形質転換された植物または植物細胞から（トランスジェニック）
植物を再生する。
【００１９】
本発明の第２実施態様では、このシステムはｐｃｏＡファミリータンパク質（
より好ましくは、ｐｃｏＡ遺伝子）などの原核生物の重金属封鎖システムに基づ
く。
より好ましくは、ｐｃｏＡ遺伝子）などの原核生物の重金属封鎖システムに基づ
く。
【００２０】
異種重金属輸送タンパク質をコードする種々のヌクレオチド配列は、効率的な
重金属輸送または蓄積性に関与しない非特異的ヌクレオチド配列から部分的に欠
失され得る。
重金属輸送または蓄積性に関与しない非特異的ヌクレオチド配列から部分的に欠
失され得る。
【００２１】
前記遺伝子配列は、図１に記載されるように、ｐＢＩ１２１ベクターなどの前
記植物または植物細胞の形質移入のためのベクターに導入され得た。前記ベクタ
ーは有利には大腸菌(E. coli)／アグロバクテリウム(Agrobacterium)／植物シャ
トルベクターであり、前記ベクターは、好ましくはＣａＭＶ３５Ｓプロモーター
（植物中で恒常的に発現される強プロモーター）を含む。
記植物または植物細胞の形質移入のためのベクターに導入され得た。前記ベクタ
ーは有利には大腸菌(E. coli)／アグロバクテリウム(Agrobacterium)／植物シャ
トルベクターであり、前記ベクターは、好ましくはＣａＭＶ３５Ｓプロモーター
（植物中で恒常的に発現される強プロモーター）を含む。
【００２２】
好ましくは、このシステムは植物中に導入され、このようなシステムはアグロ
バクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)技術を使用する
植物の形質転換を可能とする。
バクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)技術を使用する
植物の形質転換を可能とする。
【００２３】
本発明は汚染箇所のファイトレメディエーション、または微量元素を含む医薬
品または食品／飼料補助剤の調製に使用され得る。
品または食品／飼料補助剤の調製に使用され得る。
【００２４】
本発明の植物または植物細胞は、種々の用途、特に重金属で汚染された箇所（
重金属で汚染された地面を有する領域または重金属で汚染された水性または半水
性領域など）のファイトレメディエーションの分野での用途を有する。汚染箇所
のファイトレメディエーションは通常、前記重金属の微量元素で汚染された土壌
および／または水の植物再生、植物固定化、植物抽出の工程を含む。
重金属で汚染された地面を有する領域または重金属で汚染された水性または半水
性領域など）のファイトレメディエーションの分野での用途を有する。汚染箇所
のファイトレメディエーションは通常、前記重金属の微量元素で汚染された土壌
および／または水の植物再生、植物固定化、植物抽出の工程を含む。
【００２５】
本発明の植物または植物細胞の他の用途は、医療および農産業の用途である。
ここでは前記植物または植物細胞は微量元素の天然源である。
ここでは前記植物または植物細胞は微量元素の天然源である。
【００２６】
したがって、本発明の最後の態様は、重金属微量元素とともに前記植物または
植物細胞を含む、食品または飼料組成物または添加剤の医薬品組成物に関する。
植物細胞を含む、食品または飼料組成物または添加剤の医薬品組成物に関する。
【００２７】図面の簡単な説明
図１は、ｐＢＩ１２１中のｃａｄＡのクローニングを示す概要図である。
【００２８】
図２は、３５０μＭ Ｃｄを含むＮｔ ＷＴ ＳＲ１（野生型）、Ｎｔ ＰＢＩ１
４（ｐＢＩ１２１）およびＮｔ Ｃｄ ３０９（ｐＢＩ１２１−ｃａｄＡ）、およ
びＣｄを含まないコントロール培地を使用した葉のディスク試験を示す。
４（ｐＢＩ１２１）およびＮｔ Ｃｄ ３０９（ｐＢＩ１２１−ｃａｄＡ）、およ
びＣｄを含まないコントロール培地を使用した葉のディスク試験を示す。
【００２９】
図３は、１００μＭ Ｃｕを含むＮｔ ＷＴ ＳＲ１（野生型）、Ｎｔ ＰＢＩ１
４（ｐＢＩ１２１）およびＮｔ Ｃｕ １２２（ｐＢＩ１２１−ｐｃｏＡ）の再生
および生長を示す。植物生長は上部（左）および頂部（右）から示される。
４（ｐＢＩ１２１）およびＮｔ Ｃｕ １２２（ｐＢＩ１２１−ｐｃｏＡ）の再生
および生長を示す。植物生長は上部（左）および頂部（右）から示される。
【００３０】発明の詳細な説明 ｃａｄＡの異種発現
重金属排出システムは、原核生物および真核生物の両者に見出されたタンパク
質のＰ型重金属排出ＡＴＰａｓｅファミリーの一員、ＣａｄＡであった。Ｐ型Ａ
ＴＰａｓｅは全て、吸収、排出またはカチオン交換のいずれかのためのカチオン
ポンプである。これらの酵素は、輸送サイクル中にＡＴＰから一過的にリン酸化
される保存アスパラギン酸残基を有し、それ故、「Ｐ型」ＡＴＰａｓｅと称する
(Silverら、1993）。
質のＰ型重金属排出ＡＴＰａｓｅファミリーの一員、ＣａｄＡであった。Ｐ型Ａ
ＴＰａｓｅは全て、吸収、排出またはカチオン交換のいずれかのためのカチオン
ポンプである。これらの酵素は、輸送サイクル中にＡＴＰから一過的にリン酸化
される保存アスパラギン酸残基を有し、それ故、「Ｐ型」ＡＴＰａｓｅと称する
(Silverら、1993）。
【００３１】
スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)由来のｃａｄＡ遺
伝子は、ＰＣＲで増幅され、ｐＢＩ１２１ベクター中にクローン化された。
伝子は、ＰＣＲで増幅され、ｐＢＩ１２１ベクター中にクローン化された。
【００３２】
ＰＣＲ中、適当な植物特異的翻訳シグナルは、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ制限
酵素部位とともに加えられ、正しい方向の挿入物のクローニングを可能とした。
酵素部位とともに加えられ、正しい方向の挿入物のクローニングを可能とした。
【００３３】
ｃａｄＡ断片は、大腸菌／アグロバクテリウム／植物シャトルベクターｐＢＩ
１２１中にクローン化された。このベクターでは、ｃａｄＡ発現は、植物中で恒
常的に発現される強プロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターから誘導される
。このシステムはアグロバクテリウム・ツメファシエンス形質転換を経て、植物
ニコチアナ・タバクム(Nicotiana tabacum)ｃｖ．プチット・ハバナ(Petit Hava
na)ラインＳＲ１中に導入された(Horschら、1985)。使用された選択マーカーは
カナマイシンであった。
１２１中にクローン化された。このベクターでは、ｃａｄＡ発現は、植物中で恒
常的に発現される強プロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターから誘導される
。このシステムはアグロバクテリウム・ツメファシエンス形質転換を経て、植物
ニコチアナ・タバクム(Nicotiana tabacum)ｃｖ．プチット・ハバナ(Petit Hava
na)ラインＳＲ１中に導入された(Horschら、1985)。使用された選択マーカーは
カナマイシンであった。
【００３４】
カナマイシン抵抗性形質転換体は形質転換後に得られた。試験されたカナマイ
シン抵抗性形質転換体の全ては、野生型および遺伝子を含まないｐＢＩ１２１ベ
クターの形質転換体と比較して、（葉ディスク分析により試験された）カドミウ
ムに対する増加された抵抗性を示した（図１）。これは、ＣａｄＡＰ型ＡＴＰａ
ｓｅが植物中で機能的に発現され、微量元素（例えば、カドミウム）に対する植
物の増加された抵抗性となることを証明する。
シン抵抗性形質転換体の全ては、野生型および遺伝子を含まないｐＢＩ１２１ベ
クターの形質転換体と比較して、（葉ディスク分析により試験された）カドミウ
ムに対する増加された抵抗性を示した（図１）。これは、ＣａｄＡＰ型ＡＴＰａ
ｓｅが植物中で機能的に発現され、微量元素（例えば、カドミウム）に対する植
物の増加された抵抗性となることを証明する。
【００３５】
近接した関連タンパク質（構造的および機能的の両方）のファミリーを編成す
るＰ型ＡＴＰａｓｅファミリーの他のメンバーでも、特定微量元素に対する抵抗
性において同じポジティブ効果が見出されるであろうことが予期され得る。現在
まで、Ｚｎ、Ｃｄ、Ｐｂ、ＣｕおよびＡｇと相互作用することが見出された原核
生物および真核生物由来のＰ型ＡＴＰａｓｅが同定されている（表１参照）。放
射性同位元素を含む他の微量元素に対する抵抗性をコードするＰ型ＡＴＰａｓｅ
が同定されるであろうことは、除外され得ない。
るＰ型ＡＴＰａｓｅファミリーの他のメンバーでも、特定微量元素に対する抵抗
性において同じポジティブ効果が見出されるであろうことが予期され得る。現在
まで、Ｚｎ、Ｃｄ、Ｐｂ、ＣｕおよびＡｇと相互作用することが見出された原核
生物および真核生物由来のＰ型ＡＴＰａｓｅが同定されている（表１参照）。放
射性同位元素を含む他の微量元素に対する抵抗性をコードするＰ型ＡＴＰａｓｅ
が同定されるであろうことは、除外され得ない。
【表１】
表１：Ｚｎ、Ｃｄ、Ｐｂ、ＣｕおよびＡｇなどの微量元素に対する抵抗性をコー
ドする、原核生物および真核生物起源のＰ型ＡＴＰａｓｅのファミリーの異なっ
た代表例。
ドする、原核生物および真核生物起源のＰ型ＡＴＰａｓｅのファミリーの異なっ
た代表例。
【００３６】ｐｃｏＡの異種発現
他の重金属抵抗性システムは、エキソ細胞質重金属封鎖に関与する。ここで、
試験された遺伝子は大腸菌由来のｐｃｏＡであり(Brownら、1995)、これはｃａ
ｄＡについて記載されたものと同様な方法で、ｐＢＩ１２１中にクローン化され
、アグロバクテリウム・ツメファシエンス形質転換により、ニコチアナ・タバク
ム中に導入された。カナマイシン抵抗性形質転換体は形質転換後に得られた。試
験されたカナマイシン抵抗性形質転換体の全ては、野生型および遺伝子を含まな
いｐＢＩ１２１ベクターでの形質転換体と比較して、（葉ディスク分析により試
験された）銅に対する増加された抵抗性を示した（図３）。
試験された遺伝子は大腸菌由来のｐｃｏＡであり(Brownら、1995)、これはｃａ
ｄＡについて記載されたものと同様な方法で、ｐＢＩ１２１中にクローン化され
、アグロバクテリウム・ツメファシエンス形質転換により、ニコチアナ・タバク
ム中に導入された。カナマイシン抵抗性形質転換体は形質転換後に得られた。試
験されたカナマイシン抵抗性形質転換体の全ては、野生型および遺伝子を含まな
いｐＢＩ１２１ベクターでの形質転換体と比較して、（葉ディスク分析により試
験された）銅に対する増加された抵抗性を示した（図３）。
【００３７】
ｐｃｏＡタンパク質は、Ｃｕに対する抵抗性に関与することが見出された多く
の近接した関連メンバーを有する。さらに、これらの銅抵抗性決定基を有する他
のタンパク質もまた、ＰｃｏＣ／ＣｏｐＣおよびＣｏｐＥなどのＣｕ封鎖に関与
することが示されている。これらのタンパク質はまた、構造は異なるけれども、
細菌周辺質において活性であり、ｐｃｏＡと同様な重金属結合部位を所有する。
さらに、ＳｉｌＥと称するＣｏｐＥ様タンパク質は、Ａｇ抵抗性をコードするサ
ルモネラ・シル(Salmonella sil)オペロン中に同定された。異種発現が改良され
た抵抗性となり得る潜在的遺伝子は、表２に要約される。
の近接した関連メンバーを有する。さらに、これらの銅抵抗性決定基を有する他
のタンパク質もまた、ＰｃｏＣ／ＣｏｐＣおよびＣｏｐＥなどのＣｕ封鎖に関与
することが示されている。これらのタンパク質はまた、構造は異なるけれども、
細菌周辺質において活性であり、ｐｃｏＡと同様な重金属結合部位を所有する。
さらに、ＳｉｌＥと称するＣｏｐＥ様タンパク質は、Ａｇ抵抗性をコードするサ
ルモネラ・シル(Salmonella sil)オペロン中に同定された。異種発現が改良され
た抵抗性となり得る潜在的遺伝子は、表２に要約される。
【表２】
【００３８】本発明の遺伝的に改変された植物または植物細胞の使用
本発明の植物または植物細胞は、いくつかの用途に使用され得る。本発明の植
物は汚染箇所のファイトレメディエーション、すなわち汚染された土壌および／
または水の植物再生、植物固定化、植物抽出のために使用され得ることが明らか
である。遺伝的改変は植物がこのような汚染環境で生長することを可能するが、
これらは微量元素を蓄積し、かつ、土壌および／または水からこれらを除去する
であろう。
物は汚染箇所のファイトレメディエーション、すなわち汚染された土壌および／
または水の植物再生、植物固定化、植物抽出のために使用され得ることが明らか
である。遺伝的改変は植物がこのような汚染環境で生長することを可能するが、
これらは微量元素を蓄積し、かつ、土壌および／または水からこれらを除去する
であろう。
【００３９】
他の可能性ある用途は、ヒトおよび動物の健康において必要であるかあるいは
有益である、ある種の微量元素を含む媒体（固体または液体）で前記遺伝的に改
変された植物または植物細胞を生長させることにある。
有益である、ある種の微量元素を含む媒体（固体または液体）で前記遺伝的に改
変された植物または植物細胞を生長させることにある。
【００４０】
次いで、容易に吸収され得る有益な微量元素を含むこれらの植物から、食品／
飼料補助剤を調製することが可能である。さらに、植物は医薬品の調製の基礎と
して役立ち得る。
飼料補助剤を調製することが可能である。さらに、植物は医薬品の調製の基礎と
して役立ち得る。
【参考文献】
【図１】
ｐＢＩ１２１中のｃａｄＡのクローニングを示す概要図である。
【図２】
３５０μＭ Ｃｄを含むＮｔ ＷＴ ＳＲ１（野生型）、Ｎｔ ＰＢＩ１４（ｐＢ
Ｉ１２１）およびＮｔＣｄ ３０９（ｐＢＩ１２１−ｃａｄＡ）、およびＣｄを
含まないコントロール培地を使用した葉のディスク試験を示す。
Ｉ１２１）およびＮｔＣｄ ３０９（ｐＢＩ１２１−ｃａｄＡ）、およびＣｄを
含まないコントロール培地を使用した葉のディスク試験を示す。
【図３】
１００μＭ Ｃｕを含むＮｔ ＷＴ ＳＲ１（野生型）、Ｎｔ ＰＢＩ１４（ｐＢ
Ｉ１２１）およびＮｔＣｕ １２２（ｐＢＩ１２１−ｐｃｏＡ）の再生および生
長を示す。
Ｉ１２１）およびＮｔＣｕ １２２（ｐＢＩ１２１−ｐｃｏＡ）の再生および生
長を示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１５年１月２４日（２００３．１．２４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｋ 35/78 Ａ６１Ｋ 48/00 ４Ｃ０８４
48/00 Ａ６１Ｐ 3/00 ４Ｃ０８８
Ａ６１Ｐ 3/00 Ｃ０２Ｆ 3/32 ４Ｄ００４
Ｂ０９Ｃ 1/10 Ｃ１２Ｎ 1/00 Ｒ ４Ｄ０４０
Ｃ０２Ｆ 3/32 15/00 ＺＮＡＡ
Ｃ１２Ｎ 1/00 5/00 ＺＡＢＣ
5/10 ＺＡＢ Ｂ０９Ｂ 3/00 Ｅ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ
Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ
，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，
ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ
Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ
，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，
ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ
Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ
，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，
ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(71)出願人 カーレンランピ， シルパ， オルヴォキ
フィンランド， エフアイエヌ−70400
クオピオ， アーマンティエ 12
(71)出願人 テルヴァハウタ， アルジャ， イルメリ
フィンランド， エフアイエヌ−79100
レッパヴィルタ，ツオミラナンティエ ６
(72)発明者 カーレンランピ， シルパ， オルヴォキ
フィンランド， エフアイエヌ−70400
クオピオ， アーマンティエ 12
(72)発明者 テルヴァハウタ， アルジャ， イルメリ
フィンランド， エフアイエヌ−74700
キウルヴェシ， エレンポルク ２ エー
エス． ２
(72)発明者 ボーレマン， ブリジット
ベルギー， ベ−3360 ビエルビーク，
ティエンセスティーンウェグ 346
(72)発明者 ブスマン， ナタリー
ベルギー， ベ−1640 シン−ジェネシウ
ス−ロード， スムートモレン 15
(72)発明者 ジャコブ， ミシェル
ベルギー， ベ−1190 ブリュッセル，
アルベルトラーン 189
(72)発明者 メルジェアイ， マキシミリエン
ベルギー， ベ−2470 レティエ， ペペ
ールストラート 30
(72)発明者 ヴァン デル レリ， ダニエル
ベルギー， ベ−2400 モル， ボーレタ
ン 246
(72)発明者 ヴァングロンスヴェルド， ジャコ
ベルギー， ベ−3590 ディエペンビー
ク， ブス 22， クルーステルストラー
ト ２
Ｆターム(参考） 2B030 AD04 CA15 CA17 CA19
2B150 DD31
4B018 LB10 MD05 ME14
4B024 AA05 AA08 BA11 BA80 CA01
DA01 DA05 DA06 EA04 GA11
GA17 HA08
4B065 AA01X AA26X AA89X AA89Y
AB01 AC14 BA02 BA25 CA29
CA41 CA53 CA56
4C084 AA13 CA13 CA53 MA01 NA14
ZC212
4C088 AB99 MA01 NA14 ZC21
4D004 AA41 AB03 AC07 CA17 CC20
4D040 CC01
Claims (11)
- 【請求項１】 増加された重金属抵抗性を有し、かつ、異種重金属輸送体ま
たは封鎖タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする少なくと
も１つのヌクレオチド配列を含む遺伝的に改変された植物または植物細胞。 - 【請求項２】 前記ヌクレオチド配列は、原核生物ヌクレオチド配列である
ことを特徴とする、請求項１記載の遺伝的に改変された植物または植物細胞。 - 【請求項３】 重金属輸送体は、Ｐ型ＡＴＰａｓｅ、３成分排出ポンプ、Ａ
ＢＣ輸送体またはカチオン拡散ファシリティタータンパク質からなる群から選択
される輸送体である、請求項１または２記載の遺伝的に改変された植物または植
物細胞。 - 【請求項４】 輸送体はカドミウムＡＴＰａｓｅである、請求項３記載の遺
伝的に改変された植物または植物細胞。 - 【請求項５】 ヌクレオチド配列は、重金属輸送を可能とするｃａｄＡまた
はその一部分である、請求項３または４記載の遺伝的に改変された植物または植
物細胞。 - 【請求項６】 重金属封鎖タンパク質はｃｏｐＡファミリーに属する、請求
項１記載の遺伝的に改変された植物または植物細胞。 - 【請求項７】 以下の工程を含む、植物または植物細胞中に重金属抵抗性を
誘発または増加させる方法： 植物中で活性な１種または複数の制御配列に操作可能に連結された、異種重金
属輸送体または封鎖タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードす
るヌクレオチド配列を調製し、 前記ヌクレオチド配列で植物または植物細胞を形質転換し、そして、 所望により、形質転換植物細胞から植物を再生する。 - 【請求項８】 汚染された重金属のファイトレメディエーションのための、
請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝的に改変された植物または植物細胞の使用
。 - 【請求項９】 汚染箇所のファイトレメディエーションは、微量元素で汚染
された土壌および／または水の植物再生、植物固定化、植物抽出からなる群から
選択される、請求項８記載の使用。 - 【請求項１０】 適当な医薬担体および請求項１〜６のいずれかに記載の十
分な量の遺伝的に改変された植物または植物細胞を含む医薬組成物。 - 【請求項１１】 請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝的に改変された植物
または植物細胞を含む飼料または食品組成物または添加物。
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