JP4797171B2 - 熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するアラビノガラクタンタンパク質 - Google Patents
熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するアラビノガラクタンタンパク質 Download PDFInfo
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Description
本発明は、少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するアラビノガラクタンタンパク質をコードするＤＮＡや、少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するアラビノガラクタンタンパク質や、トランスジェニック植物などのこれらＤＮＡやタンパク質の利用に関する。
自然界に存在する生物は塩、高温、低温、凍結、乾燥、水分ストレス等の種々の環境ストレスに曝されている。特に、塩ストレスは多くの高等植物の生育を阻害する最も大きな要因の１つである。高等植物の耐塩性強化は、農産物生産の増大につながるため、遺伝子導入により高等植物の耐塩性を強化させる試みが、活発に進められている。耐塩性を強化する機能を有するタンパク質は、大別して適合溶質（グリシンベタイン、マンニトール、トレハロース、プロリン）合成酵素や、イオンホメオスタシスに関与する酵素（Ｎａ+／Ｈ+アンチポーター）、及びこれらの遺伝子の発現を制御する転写調節因子に大別することができる。これらのタンパク質を発現した形質転換細胞で、耐塩性の向上が認められた例が近年多数報告されている。例えば、コリンオキシダーゼをコードする遺伝子が染色体ＤＮＡ中に導入されたユーカリ属の植物体（特許文献１参照）や、耐塩性藍藻 (Aphanothece halopytica) 由来Ｎａ+／Ｈ+アンチポーターをコードするＤＮＡ（特許文献２参照）や、植物の細胞内におけるプロリン分解系の酵素をコードする遺伝子の発現を抑制することを特徴とする植物のストレス耐性を上昇させる方法（特許文献３参照）がそれぞれ報告されている。しかし、上記の耐塩性強化因子を発現した生物（特に植物）において、約５００ｍＭのＮａＣｌを含む海水に耐える形質転換体は未だ得られておらず、海水に耐える形質転換体を作製するためには、適合溶質合成系酵素やイオンホメオスタシスに関与する酵素だけでは不十分であると思われる。
一方、自然界にはその進化の過程で強力な耐塩性機構を獲得した植物（塩生植物）がある。このような植物群がもつ耐塩性因子を、単独、あるいは複数組み合わせて使用することで、塩生植物並みの強力な耐塩性を獲得した形質転換体（特に植物）を作出できると期待されている。例えば、本発明者らは塩生植物の一種であるマングローブに着目し、既に培養細胞系が確立されているBruguiera sexangulaの培養細胞の分与を得て、この細胞株を１００ｍＭのＮａＣｌ存在下で培養し、培養細胞から抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡライブラリーを作製し、この中からマングローブの耐塩性に関与する遺伝子の探索を試み、単離したストレス耐性に関与する遺伝子群の中の１つの遺伝子を導入することにより、酵母、植物細胞（タバコ培養細胞）、そして植物体（タバコ）の耐塩性を強化させることに成功している（特許文献４参照）。また、マングローブの１種である、メヒルギ中に新規な耐塩性増大遺伝子を見い出し、その塩基配列及びそれがコードするアミノ酸を決定し、さらに該遺伝子を他の植物に導入してその耐塩性が増大することを確認している（特許文献５、６参照）。しかし、現在までに塩生植物由来の耐塩性因子に関する知見は大変少ない。
本発明の課題は、塩、水分、熱ストレス等の環境ストレス、特に熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するタンパク質の遺伝子や、環境ストレス耐性向上活性を有するタンパク質や、環境ストレス耐性が増強されたトランスジェニック植物等を提供することにある。
本発明者らは、アカザ科に属する一年生草本で、塩湿地に群落を形成し、１Ｍ程度のＮａＣｌを含む環境でも生育することが可能な最も強力な耐塩性を有する塩生植物の１つであるアッケシソウ（Salicornia europaea）に着目した。アッケシソウは、高等植物の耐塩性を強化するための貴重な遺伝子資源といえる。しかしながら、これまでアッケシソウの耐塩性遺伝子に関する知見はほとんどない。その主な理由は、本種が海岸の開発により減少傾向にあり（絶滅危惧種に指定）、研究を進める上で安定した植物材料の入手が困難であるためと考えられた。このため、本発明者らは実験室内でも安定した生育が可能な培養細胞系の確立を進めてきた。その結果、明暗条件下で培養を続けたところ、赤色、緑色、白色の３タイプの系統のカルスを安定して維持することが可能になった。これら３系統のカルスの塩存在下における生育を評価した結果、どの系統も４００ｍＭのＮａＣｌが存在する極めて高い塩分存在下での生育が確認された。
次に、アッケシソウの細胞レベルで耐塩性機構の詳細な解析を行うために、懸濁培養細胞系の確立を試みた。その結果、白色系統のカルスのみ、懸濁培養細胞化に成功した。そこで、この懸濁培養細胞を用いて、耐塩性の評価を行ったところ、ＮａＣｌを含まない液体培地では培養開始後、約３週間でFresh weightが１３５ｍｇ／ｍｌであったのに対し、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む培地では１９５ｍｇ／ｍｌに達した。また、３００ｍＭ ＮａＣｌを含む培地では１２４ｍｇ／ｍｌであり、０ｍＭ ＮａＣｌの条件とほぼ同等の生育を示した。一般に、塩生植物から培養細胞系を確立する際、得られた培養細胞は耐塩性を失ってしまう場合が多い。しかしながら、得られたアッケシソウ懸濁培養細胞は、植物体が示す耐塩性（好塩性）を反映する強い耐塩性を維持していた。また、アッケシソウ懸濁培養細胞内におけるナトリウムイオン含量を、イオンクロマトグラフィーを用いて経時的に測定したところ、１００ｍＭ、３００ｍＭ ＮａＣｌを含む培地で培養した場合、ともに細胞内にナトリウムイオンを蓄積していく傾向が見られた。これはアッケシソウが葉において高濃度の塩分を蓄積する現象と類似した傾向を示すものだと考えられた。これらの結果から、得られたアッケシソウ懸濁培養細胞は、アッケシソウの有する強力な耐塩性機構を細胞レベルで解析するための良いモデルシステムになると期待できた。そこで、アッケシソウの耐塩性機構に関与する遺伝子群（ｃＤＮＡ）の単離を目指し、大腸菌の遺伝子発現系を用いた機能スクリーニング法により、アッケシソウの耐塩性に関与する遺伝子の探索を試みた。そして、Arabidopsis thalianaのFasciclin-like arabinogalactan proteinと部分的な相同性がある４２７アミノ酸からなるアラビノガラクタンタンパク質が、耐塩性、水分ストレス耐性（ソルビトール耐性）、耐熱性を強化する機能を有することを見い出し、本発明を完成するに至った。アラビノガラクタンタンパク質が熱・水分ストレス耐性向上活性を有することは未だ知られていない。また、このアラビノガラクタンタンパク質の水分ストレス耐性（ソルビトール耐性）及び耐熱性強化活性には、分泌性シグナルペプチドと推定されるアミノ酸配列（１−２５）、又は、ＧＰＩアンカーシグナル配列と推定されるアミノ酸配列（４０１−４２７）が必要であると考えられ、分泌タンパク質で微生物の水分ストレス又は熱ストレス耐性を向上させた例は今までに知られていない。
すなわち本発明は、（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡや、（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、（３）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、（４）配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡや、（５）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、（６）配列番号１に示される塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡに関する。
また本発明は、（７）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、（８）配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するタンパク質や、（９）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するタンパク質や、（１０）上記（７）〜（９）のいずれか記載のタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクターや、（１１）上記（１）〜（６）のいずれか記載のＤＮＡを含む組換えベクターや、（１２）上記（１０）又は（１１）記載の組換えベクターを宿主細胞に導入することにより得られる形質転換細胞に関する。
さらに本発明は、（１３）宿主細胞が、植物細胞である上記（１２）記載の形質転換細胞や、（１４）宿主細胞が、微生物細胞である上記（１２）記載の形質転換細胞や、（１５）上記（１２）〜（１４）のいずれか記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞又はその培養液の上清から組換えタンパク質を回収することを特徴とする少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するタンパク質の製造方法や、（１６）上記（７）〜（９）のいずれか記載のタンパク質をコードするＤＮＡを植物細胞に導入し、該植物細胞の分裂・増殖と再分化を行わせることにより得られる少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するトランスジェニック植物や、（１７）上記（１）〜（６）のいずれか記載のＤＮＡを植物細胞に導入し、該植物細胞の分裂・増殖と再分化を行わせることにより得られる少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するトランスジェニック植物や、（１８）上記（１２）又は（１３）記載のベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞の分裂・増殖と再分化を行わせることにより得られる少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するトランスジェニック植物に関する。
本発明の少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、塩生植物由来の遺伝子であるため、高等植物、微生物等幅広い生物群の環境ストレス（塩、水分、熱ストレス他）耐性向上への利用が期待できる。特に近年、土壌における塩分の集積により可耕地が激減している状態にあり、本発明は、農業における生産性向上、砂漠緑化に利用できる。また、微生物によるアミノ酸等の有用物質生産を行う場合、生産物 （代謝産物） による水分ストレスが生じ、それが微生物の持つ有用物質生産能に悪影響をもたらす現象が知られているが、水分ストレスによる悪影響を受けることなく有用物質生産を行うことができる。さらに、本発明で得られた成果は各種微生物産業にも応用することができる。
本発明のＤＮＡとしては、（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ；（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と相同性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；（Ｄ）配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡ；（Ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；又は（Ｆ）上記の（Ｄ）又は（Ｅ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば特に制限されず、また、本発明のタンパク質としては、（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と相同性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するタンパク質；又は（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するタンパク質であれば特に制限されず、ここで「水分ストレス耐性向上活性」とは、所定濃度のソルビトールに対して向上した耐性を示す活性をいい、例えば、水分ストレス耐性向上活性を有するタンパク質を発現する植物や微生物は、該蛋白質を発現しない植物や微生物に比べて、所定濃度のソルビトール存在下において統計学上有意に優れた増殖を示すことになるが、これに限定されるものではない。また、「熱ストレス耐性向上活性」とは、高温に対して向上した耐性を示す活性をいい、例えば、熱ストレス耐性向上活性を有するタンパク質を発現する植物や微生物は、該蛋白質を発現しない植物や微生物に比べて、高温度下において統計学上有意に優れた増殖を示すことになるが、これに限定されるものではない。
また、本発明のＤＮＡは、少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするが、上記熱ストレス耐性向上活性や水分ストレス耐性向上活性の他、塩などの環境ストレスに対する耐性向上活性を有するタンパク質をコードするものが好ましい。そしてまた、本発明のタンパク質は、少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するが、上記熱ストレス耐性向上活性や水分ストレス耐性向上活性の他、塩などの環境ストレスに対する耐性向上活性を有するものが好ましい。
上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜３０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。また、上記「１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を意味する。上記数個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列として、Ｎ末端の２５個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列や、Ｃ末端の８個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を具体的に例示することができる。
例えば、これら１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.以後 "モレキュラークローニング第２版" と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
上記「配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、配列番号２に示されるアミノ酸配列との相同性が７０％以上であれば特に制限されるものではなく、例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上であることを意味する。
上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げることができ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。
本発明のＤＮＡの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列又は塩基配列情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該ＤＮＡが存在することが予測されるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的の遺伝子ＤＮＡを単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。
具体的には、本発明の遺伝子ＤＮＡが単離されたアッケシソウより、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、次いで、このライブラリーから、本発明の遺伝子ＤＮＡに特有の適当なプローブを用いて所望クローンを選抜することにより、本発明の遺伝子ＤＮＡを取得することができる。上記ｃＤＮＡの起源としては、上記植物由来の各種の細胞または組織を例示することができ、また、これらの細胞又は組織からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本発明の遺伝子をｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、モレキュラークローニング第２版に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。
また、上記（Ｂ）〜（Ｆ）のいずれかに示される塩基配列からなる本発明の変異遺伝子又は相同遺伝子ＤＮＡとしては、配列番号１に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡ断片を利用し、他の生物体等より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる他、前述の変異ＤＮＡの作製方法により調製することもできる。
本発明のタンパク質の取得・調製方法は特に限定されず、天然由来の単離されたタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組換え技術により作製した組み換えタンパク質の何れでもよい。天然由来の単離されたタンパク質を取得する場合には、かかるタンパク質を発現している細胞又は組織からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせることにより、本発明のタンパク質を取得することができる。化学合成によりタンパク質を調製する場合には、例えば、Ｆｍｏｃ法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、ｔＢｏｃ法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本発明のタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。遺伝子組換え技術によりタンパク質を調製する場合には、該タンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を調製することができる。これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい。
例えば、遺伝子組換え技術によって、本発明のタンパク質を調製する場合、かかるタンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのタンパク質の精製物を得ることができる。また、本発明のタンパク質が細胞膜に発現している場合は、細胞膜分解酵素を作用させた後、上記の精製処理を行うことにより精製標品を得ることができる。
さらに、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の一例を示す配列番号１に示される塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜調製又は取得することができる。例えば、配列番号１に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡをプローブとしてアッケシソウ以外の生物より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。このホモログＤＮＡの全長ＤＮＡをクローニング後、発現ベクターに組み込み適当な宿主で発現させることにより、該ホモログＤＮＡによりコードされるタンパク質を製造することができる。
上記本発明のタンパク質とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させて融合タンパク質とすることもできる。マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰ等の酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰ等の蛍光物質などを具体的に挙げることができ、またペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した本発明のタンパク質の精製や、本発明のタンパク質の検出や、本発明のタンパク質に対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。
上記本発明のＤＮＡやタンパク質を用いると、植物・動物及びそれらの組織、器官、細胞並びに細菌、酵母、カビ等の微生物の耐塩性、水分ストレス耐性（ソルビトール耐性）、耐熱性等の環境ストレス耐性を向上させることができる。
本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体としては、前記本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体であればどのようなものでもよく、かかる抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、配列番号２に示されるアミノ酸配列と相同性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するタンパク質や、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するタンパク質を抗原として用いて作製することができる。これら抗体は、例えば、環境ストレス耐性向上活性を有するタンパク質の分子機構を明らかにする上で有用である。
上記少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するタンパク質に対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に該少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するタンパク質又はエピトープを含む断片、類似体若しくは細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ技法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc.,1985）など任意の技法を用いることができる。
上記少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するタンパク質に対する一本鎖抗体をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,946,778 号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニック植物又はトランスジェニック動物等を利用したり、上記抗体を用いて、その環境ストレス耐性向上活性を有するタンパク質を発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。
本発明の組換えベクターとしては、前記本発明のＤＮＡを含み、かつ少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するタンパク質を発現することができる組換えベクターであれば特に制限されず、本発明の組換えベクターは、本発明の遺伝子ＤＮＡを発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。かかる発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明の遺伝子を発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。
例えば、植物細胞用の発現ベクターとしては、Ｔｉプラスミド（Tumor inducing plasmid）、pSPORT1、pT7Blue-Ｔベクター、pIG121−Hm〔Plant Cell Report, 15, 809-814(1995)〕、pBI121〔EMBO J. 6, 3901-3907(1987)〕などのプラスミド、あるいはタバコモザイクウイルス、カリフラワーモザイクウイルス、ジェミニウイルスなどの植物ウイルスベクター等を例示することができる。植物細胞用のプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター〔Mol.Gen.Genet (1990) 220, 389-392〕、ルブロースビスフォスフェートカルボキシラーゼスモールサブユニットプロモーター等を挙げることができ、ターミネーターとしては、例えばノパリン合成酵素遺伝子のターミネーターを挙げることができる。
酵母用の発現ベクターとして、例えば、pYES2（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、YEp13（ＡＴＣＣ３７１１５）、YEp24（ＡＴＣＣ３７０５１）、Ycp5O（ＡＴＣＣ３７４１９）、pHS19、pHS15等を例示することができる。酵母用のプロモーターとしては、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターを具体的に挙げることができる。発現ベクターとしては、酵母用発現ベクター、植物細胞用発現ベクター、細菌用発現ベクター、動物細胞用発現ベクター等を用いることができるが、酵母用発現ベクターや植物細胞用発現ベクターを用いた組換えベクターが好ましい。
細菌用の発現ベクターとしては、例えば、pBTrP2、pBTac1、pBTac2(いずれもべ一リンガーマンハイム社製)、pKK233-2(Pharmacia社製)、pSE280(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)、pGEMEX-1(Ｐｒｏｍｅｇａ社製)、pQE‐8(ＱＩＡＧＥＮ社製)、pQE‐30(ＱＩＡＧＥＮ社製)、pKYP10(特開昭58-110600)、pKYP200〔Agrc.Biol.Chem., 48, 669(1984)〕、PLSA1〔Agrc. Blo1. Chem., 53, 277(1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＵＣ１８〔Gene, 33, 103(1985)〕、pUC19〔Gene, 33, 103(1985)〕、pSTV28(宝酒造社製)、pSTV29(宝酒造社製)、等を例示することができる。細菌用のプロモーターとしては、例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。
また、本発明の形質転換細胞としては、上記本発明の組換えベクターが導入され、かつ少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するタンパク質を発現する形質転換細胞であれば特に制限されず、形質転換植物細胞、形質転換動物細胞、形質転換細菌、形質転換酵母を挙げることができるが、形質転換大腸菌、形質転換酵母、形質転換植物細胞などを好適に例示することができる。これら、形質転換大腸菌、形質転換酵母、形質転換植物細胞などの形質転換細胞は、アミノ酸生産など各種微生物産業に好適に応用することができる。
形質転換植物細胞の作製に用いられる宿主植物細胞としては、その種類は特に限定されず、花卉、果実植物、野菜、根菜、穀類、観葉植物、果樹を含む樹木などの植物、例えばナス科、イネ科、アブラナ科、キク科、ゴマ科、モクセイ科、フトモモ科、バラ科、マメ科、ヤシ科又はアカネ科に属する植物の培養細胞のうちから適宜選択することができる。この形質転換植物細胞を作製するには、本発明の遺伝子ＤＮＡを含有した上記本発明の組換えベクターを用い、この組換えベクターを植物細胞内に導入し、植物細胞内のゲノムＤＮＡ中に本発明の遺伝子ＤＮＡを導入する方法を採用することができる。植物の形質転換は、植物の種類等に応じて、リーフディスク共存培養法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法等の公知の方法を適宜用いて行うことができる。その他、物理的または化学的に植物細胞の透過性を高めて本発明の組換えベクターを受容体細胞内に直接取り入れて形質転換植物を作製する方法を採用することもできる。
形質転換酵母の作製に用いられる酵母宿主の具体例としては、サッカロミセス・セレビシェ(Saccharomyces cerevisae)、シゾサッカロミセス・ボンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クリュイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、トリコスポロン・プルランス(Trichosporon pu11ulans)、シュワニオミセス・アルビウス(Schwanniomyces a11uvius)等を挙げることができる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
形質転換細菌の作製に用いられる細菌の宿主細胞の具体例としては、エッシェリヒア（Escherichia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、バチラス（Bacillus）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、セラチア（Serratia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、エルウニア（Erwinia）属、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、ストレプトミセス（Streptomyces）属、ザイモモナス（Zymomonas）属等に属する微生物を挙げることができる。細菌宿主へ組換えベクターを導入する方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法やプロトプラスト法等を挙げることができる。
また、本発明の少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するタンパク質の製造方法としては、上記本発明の形質転換酵母、形質転換細菌、形質転換植物細胞等の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞又はその培養液の上清から組換えタンパク質を回収する方法であれば特に制限されるものではない。さらに、本発明のトランスジェニック植物としては、前記少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ又は前記ベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞の分裂・増殖と再分化を行わせることにより得られるものであれば特に制限されるものではない。以下、上記本発明のベクター、形質転換細胞、環境ストレス耐性向上活性を有するタンパク質の製造方法、及びトランスジェニック植物について説明する。
上記のように、本発明のＤＮＡは組換えタンパク質の調製に利用することができる。組換えタンパク質の調製は、上記本発明のＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な宿主細胞に導入して、該ＤＮＡを発現させ、次いで、発現させたタンパク質を該形質転換細胞又はその培養上清から回収することにより行うことができる。組換えタンパク質の発現に用いられる宿主−ベクター系としては、例えば、IMPACT-CN System（宿主: E. coli strain ER2566、ベクター:pTYB1、pYB2、pYB11、pYB12 (ＢｉｏＬａｂｓ社)）、あるいはpET Expression System（宿主: Epicurian Coli BL21、ベクター:pET3シリーズ(Ｎｏｖａｇｅｎ社)）を挙げることができる。宿主細胞へのベクターの導入法としては、当業者に公知の方法、例えば、エレクトロポレーション法やヒートショック法が挙げられる（遺伝子ライブラリーの作製法、羊土社（１９９４）、植物細胞工学入門、学会出版センター（１９９８））。また、組換えタンパク質を発現させるための形質転換体の培養は、当業者に一般的に用いられている方法および条件にて行なうことができる。発現させたタンパク質は、例えば、IMPACT-CN Systemを利用した場合にはキチンビーズ(ＢｉｏＬａｂｓ社)で、pET Expression Systemを利用した場合にはHis Bind Resin（Ｎｏｖａｇｅｎ社）により精製できる。
上記本発明のＤＮＡは、また、少なくとも熱又は水分ストレス耐性が強化されたトランスジェニック植物の作出に利用できる。本発明のＤＮＡを用いてトランスジェニック植物を作出する生物種としては特に限定されるものではないが、高等植物であることが好ましい。かかるトランスジェニック植物の作出は、該ＤＮＡを植物細胞内でその発現を保証するベクターに挿入し、これを植物細胞に導入し、トランスジェニック植物を得るために該形質転換植物細胞を再生させることにより有利に行うことができる。
トランスジェニック植物の作出に用いられるベクターとしては、例えば、東洋紡から市販されているpBI101、あるいはpIG121Hm (Plant J, Vol 6, p271-282(1994)) を好適に用いることができる。ベクターを導入する植物細胞の種類に特に制限はないが、例えばイネ、小麦、トウモロコシ、大豆、タバコ、ニンジン等が考えられる。植物細胞の形態としては、例えば、プロトプラスト、カルス、植物体の部分(リーフディスク、ヒポコチル等) がある。宿主植物細胞へのベクターの導入法としては、アグロバクテリウム法が好適であるがその他にも、例えば、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などを用いることができる(モデル植物の実験プロトコール、秀潤社(1996))。
ベクターの導入された植物細胞を植物体へ再生させる方法は、植物種により異なる。例えば、イネの場合、以下のようにして行なうことができる。完熟種子からカルス誘導を行い、これにｃＤＮＡを導入したアグロバクテリウムを感染させる。共存培養を経て、選抜培地に移し培養する。約３週間後カルスを再分化培地に移し、再分化するまで培養する。４、５日馴化させた後ポットに移すことで形質転換体を再生させる（モデル植物の実験プロトコール、秀潤社（1996））。また、ニンジン、タバコ等の再生の方法としては、それぞれ加藤、庄野博士等の方法（植物組織培養の技術朝倉書店（1983）） を好適に例示することができる。
これによりトランスジェニック植物体が得られれば、さらに該植物体から繁殖材料（例えば、植物の種類に応じて、種子、塊根、切穂、メリクローン等の培養増殖）を得て、これを基に本発明のトランスジェニック植物を量産することが可能である。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［アッケシソウｃＤＮＡライブラリーの作製］
アッケシソウ (Salicornia europaea) は被子植物、双子葉類、アカザ科の一年草で、高等植物の中で最高レベルの耐塩性（１Ｍ ＮａＣｌ以上でも生育可能）を示す。アッケシソウの ｃＤＮＡ ライブラリーの作成は、葉を使用し、以下に示す手順で行った。まず、Ostremらの方法 (Plant Physiol Vol.84 p1270-1275(1987)) に従って全ｍＲＮＡを抽出し、ここからOligotex-dT30<super> (第一化学社) を用いｐｏｌｙ(Ａ)＋ＲＮＡを精製した。精製したｐｏｌｙ(Ａ)＋ＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、λZap II (Stratagene社) ラムダファージベクターに導入してｃＤＮＡライブラリーを構築した。λZap IIを用いたｃＤＮＡライブラリーの構築方法は周知の方法であり、実際の手順はStratagene社の手引き書に従った。その結果、５ｘ１０5 の独立クローンを含むアッケシソウｃＤＮＡライブラリーの構築に成功した。
アッケシソウ (Salicornia europaea) は被子植物、双子葉類、アカザ科の一年草で、高等植物の中で最高レベルの耐塩性（１Ｍ ＮａＣｌ以上でも生育可能）を示す。アッケシソウの ｃＤＮＡ ライブラリーの作成は、葉を使用し、以下に示す手順で行った。まず、Ostremらの方法 (Plant Physiol Vol.84 p1270-1275(1987)) に従って全ｍＲＮＡを抽出し、ここからOligotex-dT30<super> (第一化学社) を用いｐｏｌｙ(Ａ)＋ＲＮＡを精製した。精製したｐｏｌｙ(Ａ)＋ＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、λZap II (Stratagene社) ラムダファージベクターに導入してｃＤＮＡライブラリーを構築した。λZap IIを用いたｃＤＮＡライブラリーの構築方法は周知の方法であり、実際の手順はStratagene社の手引き書に従った。その結果、５ｘ１０5 の独立クローンを含むアッケシソウｃＤＮＡライブラリーの構築に成功した。
［アッケシソウｃＤＮＡライブラリーからの環境ストレス耐性遺伝子の探索］
アッケシソウｃＤＮＡライブラリーからの環境ストレス耐性遺伝子の探索は、山田らの開発した大腸菌を用いた機能スクリーニング法（Plant Cell Physiol Vol.43 p903-910(2002)）で行われた。その結果、図１に示す全長１７６５ ｂｐ からなるｃＤＮＡが導入された大腸菌に耐塩性の向上が認められた。遺伝情報処理ソフトウエア (ソフトウエア開発株式会社) で塩基配列を解析した結果、４２７アミノ酸からなるタンパク質をコードしていることが判明した。ＢＬＡＳＴ相同性検索プログラムを用い、これらのＤＮＡがコードするアミノ酸配列の相同性検索を行った。その結果、図２に示されるアミノ酸配列は、Arabidopsis thalianaのFasciclin-like arabinogalactan protein （ＦＬＡ１）（At5g55730）と部分的な相同性（図２のアミノ酸配列の１−４２７番目の領域に５８％ の相同性あり）を有することが確認された。SignalP（HYPERLINK"http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/"www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)を用いた解析の結果、このタンパク質（以下ＳｅＦＬＡ）の１−２５番目までのアミノ酸配列は分泌性シグナルペプチドと考えられた。また、ＤＧＰＩ（http://129.194.186.123/ＧＰＩ-anchor/ＤＧＰＩ_demo_en.html)と、big-PI plant predictor（http://mendel.imp.univie.ac.at/gpi/plant_server.html）を用いた解析の結果、前者ではＳｅＦＬＡのＣ末端側である４１２−４２７番目までのアミノ酸配列、後者では４０１、４０２番目のアミノ酸配列が疎水性グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーシグナル配列と考えられた。
アッケシソウｃＤＮＡライブラリーからの環境ストレス耐性遺伝子の探索は、山田らの開発した大腸菌を用いた機能スクリーニング法（Plant Cell Physiol Vol.43 p903-910(2002)）で行われた。その結果、図１に示す全長１７６５ ｂｐ からなるｃＤＮＡが導入された大腸菌に耐塩性の向上が認められた。遺伝情報処理ソフトウエア (ソフトウエア開発株式会社) で塩基配列を解析した結果、４２７アミノ酸からなるタンパク質をコードしていることが判明した。ＢＬＡＳＴ相同性検索プログラムを用い、これらのＤＮＡがコードするアミノ酸配列の相同性検索を行った。その結果、図２に示されるアミノ酸配列は、Arabidopsis thalianaのFasciclin-like arabinogalactan protein （ＦＬＡ１）（At5g55730）と部分的な相同性（図２のアミノ酸配列の１−４２７番目の領域に５８％ の相同性あり）を有することが確認された。SignalP（HYPERLINK"http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/"www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)を用いた解析の結果、このタンパク質（以下ＳｅＦＬＡ）の１−２５番目までのアミノ酸配列は分泌性シグナルペプチドと考えられた。また、ＤＧＰＩ（http://129.194.186.123/ＧＰＩ-anchor/ＤＧＰＩ_demo_en.html)と、big-PI plant predictor（http://mendel.imp.univie.ac.at/gpi/plant_server.html）を用いた解析の結果、前者ではＳｅＦＬＡのＣ末端側である４１２−４２７番目までのアミノ酸配列、後者では４０１、４０２番目のアミノ酸配列が疎水性グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーシグナル配列と考えられた。
［ＳｅＦＬＡ部分長 ｃＤＮＡ の作製］
ＳｅＦＬＡの分泌性シグナルペプチドと推定される１−２５番目までのアミノ酸配列を除去した部分長配列（ＳｅＦＬＡΔＮ）は、Ｆ１プライマー (5'-CCCACCACAACATAAＡＴＧCACAACATCACC-3'；配列番号３) と、Ｔ７プライマー (5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'；配列番号４) を用い、上記のスクリーニングで得られた全長ＳｅＦＬＡ ｃＤＮＡ (pBluescript SKにクローニングされている) をテンプレートとしてＰＣＲで増幅した (図３)。得られたＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡ Polymeraseおよびklenowにより末端平滑化した。一方、大腸菌発現ベクターであるpBluescript SKをEcoRVで切断し、アルカリフォスフォターゼ処理した後、上記のＰＣＲ断片をクローニングした。クローニングされた断片に変異が入っていないことを確認し、以後の実験に用いた。また、ＳｅＦＬＡのＧＰＩアンカーシグナル配列と推定される４０１−４２７番目までのアミノ酸配列を除去した部分長配列（ＳｅＦＬＡΔＣ）は、Ｆ２プライマー (5'-GTCTAGTGTCTACTAACCCAACCAACCＡＴＧ-3'；配列番号５) と、Ｒ１プライマー(5'- CTCTCCTCCGTCTCACTAATCGTCCGCCGT-3'；配列番号６) を用いて上記と同様にＰＣＲで増幅し (図３)、得られたＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡ Polymeraseおよびklenowにより末端平滑化した。一方、大腸菌発現ベクターであるpBluescript SKをEcoRVで切断し、アルカリフォスフォターゼ処理した後、上記のＰＣＲ断片をクローニングした。クローニングされた断片に変異が入っていないことを確認し、以後の実験に用いた。
なお、プライマー上の開始コドンは全角文字で示し、終止コドンはアンダーラインで示した。
ＳｅＦＬＡの分泌性シグナルペプチドと推定される１−２５番目までのアミノ酸配列を除去した部分長配列（ＳｅＦＬＡΔＮ）は、Ｆ１プライマー (5'-CCCACCACAACATAAＡＴＧCACAACATCACC-3'；配列番号３) と、Ｔ７プライマー (5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'；配列番号４) を用い、上記のスクリーニングで得られた全長ＳｅＦＬＡ ｃＤＮＡ (pBluescript SKにクローニングされている) をテンプレートとしてＰＣＲで増幅した (図３)。得られたＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡ Polymeraseおよびklenowにより末端平滑化した。一方、大腸菌発現ベクターであるpBluescript SKをEcoRVで切断し、アルカリフォスフォターゼ処理した後、上記のＰＣＲ断片をクローニングした。クローニングされた断片に変異が入っていないことを確認し、以後の実験に用いた。また、ＳｅＦＬＡのＧＰＩアンカーシグナル配列と推定される４０１−４２７番目までのアミノ酸配列を除去した部分長配列（ＳｅＦＬＡΔＣ）は、Ｆ２プライマー (5'-GTCTAGTGTCTACTAACCCAACCAACCＡＴＧ-3'；配列番号５) と、Ｒ１プライマー(5'- CTCTCCTCCGTCTCACTAATCGTCCGCCGT-3'；配列番号６) を用いて上記と同様にＰＣＲで増幅し (図３)、得られたＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡ Polymeraseおよびklenowにより末端平滑化した。一方、大腸菌発現ベクターであるpBluescript SKをEcoRVで切断し、アルカリフォスフォターゼ処理した後、上記のＰＣＲ断片をクローニングした。クローニングされた断片に変異が入っていないことを確認し、以後の実験に用いた。
なお、プライマー上の開始コドンは全角文字で示し、終止コドンはアンダーラインで示した。
［酵母発現ベクターへのクローニング］
pBluescript SKにクローニングされたＳｅＦＬＡ全長または部分長（ＳｅＦＬＡΔＮ、ＳｅＦＬＡΔＣ）ｃＤＮＡ をそれぞれKpn Iで切断し、Ｔ４ ＤＮＡ Polymeraseおよびklenowにより末端平滑化した後、Sac Iで切断した。得られた断片をＡＤＨ１プロモーターを有する酵母発現ベクター（pAUR123：Takara）のSac I/Hpa Iサイトにクローニングした。得られたプラスミドをSmaIで切断し、セルフライゲーションを行なうことでクローニング時に非コード領域で生じた余分な制限酵素サイトを除去した。
pBluescript SKにクローニングされたＳｅＦＬＡ全長または部分長（ＳｅＦＬＡΔＮ、ＳｅＦＬＡΔＣ）ｃＤＮＡ をそれぞれKpn Iで切断し、Ｔ４ ＤＮＡ Polymeraseおよびklenowにより末端平滑化した後、Sac Iで切断した。得られた断片をＡＤＨ１プロモーターを有する酵母発現ベクター（pAUR123：Takara）のSac I/Hpa Iサイトにクローニングした。得られたプラスミドをSmaIで切断し、セルフライゲーションを行なうことでクローニング時に非コード領域で生じた余分な制限酵素サイトを除去した。
［植物発現ベクターへのクローニング］
pBluescript SKにクローニングされたＳｅＦＬＡ全長ｃＤＮＡをKpn Iで切断し、Ｔ４ ＤＮＡ polymeraseおよびklenowにより末端平滑化した後、Xba Iで切断した。得られた断片を３５Ｓカリフラワーモザイクウイルスプロモーターを有する植物発現ベクター（pBI121） のプロモーター下流にクローニングした。
pBluescript SKにクローニングされたＳｅＦＬＡ全長ｃＤＮＡをKpn Iで切断し、Ｔ４ ＤＮＡ polymeraseおよびklenowにより末端平滑化した後、Xba Iで切断した。得られた断片を３５Ｓカリフラワーモザイクウイルスプロモーターを有する植物発現ベクター（pBI121） のプロモーター下流にクローニングした。
[形質転換Agrobacterium tumefaciensの作成]
ＳｅＦＬＡ（全長）ｃＤＮＡを導入したタバコ形質転換体を作出するために、エレクトロポレーション（ＧＴＥ−１０: 島津製作所）により上記のプラスミドをA. tumefaciens （ＥＨＡ株）に導入した。５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含むＹＥＰ固体培地で選抜し、得られた形質転換体を、ハイグロマイシンを含むＹＥＰ培地に植菌し、２８℃で振とう培養した。
ＳｅＦＬＡ（全長）ｃＤＮＡを導入したタバコ形質転換体を作出するために、エレクトロポレーション（ＧＴＥ−１０: 島津製作所）により上記のプラスミドをA. tumefaciens （ＥＨＡ株）に導入した。５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含むＹＥＰ固体培地で選抜し、得られた形質転換体を、ハイグロマイシンを含むＹＥＰ培地に植菌し、２８℃で振とう培養した。
[アグロバクテリウム法によるタバコへの遺伝子導入]
ＳｅＦＬＡ（全長）ｃＤＮＡを導入した形質転換A. tumefaciensを、アセトシリンゴン溶液（１０μｇ／ｍｌ）でＯＤ600 ＝０．２５になるように希釈した。無菌状態で生育させたタバコの葉のリーフディスク（直径７ｍｍ）を作成し、この菌体懸濁液に1分間浸けた。これをアセトシリンゴン１０μｇ／ｍｌを含むMurashige-Skoog (ＭＳ) 固体培地に置き、２６℃、暗条件下で２日間インキュベートした。その後、リーフディスクをＭＳ再分化培地（ベンジルアミノプリン:０．０５ｍｇ／ｍｌ、ナフチル酢酸:０．０５ｍｇ／ｍｌ、クラフォラン:２５０ｍｇ／ｍｌ、カナマイシン:１００ｍｇ／ｍｌを含む） に置き、２６℃、明/暗条件下で培養し、２週間ごとに植え継いだ。約１ヶ月後、リーフディスクから再分化したシュートを切り取り、MS発根培地 （クラフォラン:２５０ｍｇ／ｍｌ、カナマイシン: １００ｍｇ／ｍｌを含む）に植えた。約２ヶ月間生育させた各形質転換タバコを土におろし、約４ヶ月後、次世代 (Ｔ１) の種子を得た。
ＳｅＦＬＡ（全長）ｃＤＮＡを導入した形質転換A. tumefaciensを、アセトシリンゴン溶液（１０μｇ／ｍｌ）でＯＤ600 ＝０．２５になるように希釈した。無菌状態で生育させたタバコの葉のリーフディスク（直径７ｍｍ）を作成し、この菌体懸濁液に1分間浸けた。これをアセトシリンゴン１０μｇ／ｍｌを含むMurashige-Skoog (ＭＳ) 固体培地に置き、２６℃、暗条件下で２日間インキュベートした。その後、リーフディスクをＭＳ再分化培地（ベンジルアミノプリン:０．０５ｍｇ／ｍｌ、ナフチル酢酸:０．０５ｍｇ／ｍｌ、クラフォラン:２５０ｍｇ／ｍｌ、カナマイシン:１００ｍｇ／ｍｌを含む） に置き、２６℃、明/暗条件下で培養し、２週間ごとに植え継いだ。約１ヶ月後、リーフディスクから再分化したシュートを切り取り、MS発根培地 （クラフォラン:２５０ｍｇ／ｍｌ、カナマイシン: １００ｍｇ／ｍｌを含む）に植えた。約２ヶ月間生育させた各形質転換タバコを土におろし、約４ヶ月後、次世代 (Ｔ１) の種子を得た。
[大腸菌に対するＳｅＦＬＡの塩ストレス耐性強化機能]
pBluescript SKにクローニングされたＳｅＦＬＡ全長または部分長（ＳｅＦＬＡΔＮ、ＳｅＦＬＡΔＣ）ｃＤＮＡを大腸菌 (ＳＯＬＲ: Stratagene社) に導入して得られた形質転換体の生育を評価した。各形質転換体を初期濃度がＯＤ600 ＝０．０５になるようにそれぞれ２ＹＴ液体培地に植菌し、小型振とう培養装置ＴＶＳ０６２ＣＡ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）を用いて菌体濃度をモニタリングした。ストレス無し（ＮａＣｌ:８６ｍＭ、ソルビトール:０ｍＭ、３７℃）の状態ではいずれの形質転換体もほぼ同様な生育を示すのに対し（図４Ａ）、３７℃で６５０ｍＭ ＮａＣｌ を含む２ＹＴ液体培地（ソルビトール:０ｍＭ）では、対照となるベクター (pBluescript SK) を導入した形質転換体に比べ、ＳｅＦＬＡ全長および部分長（ＳｅＦＬＡΔＮ、ＳｅＦＬＡΔＣ）を導入した形質転換体に明らかな耐塩性の向上が認められた（図４Ｂ）。
pBluescript SKにクローニングされたＳｅＦＬＡ全長または部分長（ＳｅＦＬＡΔＮ、ＳｅＦＬＡΔＣ）ｃＤＮＡを大腸菌 (ＳＯＬＲ: Stratagene社) に導入して得られた形質転換体の生育を評価した。各形質転換体を初期濃度がＯＤ600 ＝０．０５になるようにそれぞれ２ＹＴ液体培地に植菌し、小型振とう培養装置ＴＶＳ０６２ＣＡ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）を用いて菌体濃度をモニタリングした。ストレス無し（ＮａＣｌ:８６ｍＭ、ソルビトール:０ｍＭ、３７℃）の状態ではいずれの形質転換体もほぼ同様な生育を示すのに対し（図４Ａ）、３７℃で６５０ｍＭ ＮａＣｌ を含む２ＹＴ液体培地（ソルビトール:０ｍＭ）では、対照となるベクター (pBluescript SK) を導入した形質転換体に比べ、ＳｅＦＬＡ全長および部分長（ＳｅＦＬＡΔＮ、ＳｅＦＬＡΔＣ）を導入した形質転換体に明らかな耐塩性の向上が認められた（図４Ｂ）。
[大腸菌に対するＳｅＦＬＡの水分ストレス耐性強化機能]
ＳｅＦＬＡ全長または部分長（ＳｅＦＬＡΔＮ、ＳｅＦＬＡΔＣ）ｃＤＮＡ、対照としてベクター(pBluescript SK) を導入した形質転換体の水分ストレス耐性を評価した。３７℃で１．２Ｍソルビトールを含む２ＹＴ培地（ＮａＣｌ: ８６ｍＭ）を用いて実施例８と同様の操作を行った。その結果、ＳｅＦＬＡ全長を導入した形質転換体は、対照となるベクターのみを導入した形質転換体と比べて顕著な増殖が認められた。このことから、ＳｅＦＬＡは大腸菌に対し、水分ストレス耐性強化機能を有していることが確認された。また、同条件下でＳｅＦＬＡ部分長（ＳｅＦＬＡΔＮ、ＳｅＦＬＡΔＣ）を導入した形質転換体では、ＳｅＦＬＡ全長を導入した形質転換体と比べ増殖速度が低下していることが明らかとなった（図４Ｃ）。
ＳｅＦＬＡ全長または部分長（ＳｅＦＬＡΔＮ、ＳｅＦＬＡΔＣ）ｃＤＮＡ、対照としてベクター(pBluescript SK) を導入した形質転換体の水分ストレス耐性を評価した。３７℃で１．２Ｍソルビトールを含む２ＹＴ培地（ＮａＣｌ: ８６ｍＭ）を用いて実施例８と同様の操作を行った。その結果、ＳｅＦＬＡ全長を導入した形質転換体は、対照となるベクターのみを導入した形質転換体と比べて顕著な増殖が認められた。このことから、ＳｅＦＬＡは大腸菌に対し、水分ストレス耐性強化機能を有していることが確認された。また、同条件下でＳｅＦＬＡ部分長（ＳｅＦＬＡΔＮ、ＳｅＦＬＡΔＣ）を導入した形質転換体では、ＳｅＦＬＡ全長を導入した形質転換体と比べ増殖速度が低下していることが明らかとなった（図４Ｃ）。
[大腸菌に対するＳｅＦＬＡの熱ストレス耐性強化機能]
ＳｅＦＬＡ全長または部分長（ＳｅＦＬＡΔＮ、ＳｅＦＬＡΔＣ）ｃＤＮＡ、対照としてベクター(pBluescript SK) を導入した形質転換体の熱ストレス耐性を評価した。実施例８と同様の操作を行い、通常の２ＹＴ液体培地（ＮａＣｌ: ８６ｍＭ、ソルビトール: ０ｍＭ）を用いて、４５℃条件下での増殖曲線をとった。その結果、ＳｅＦＬＡ全長を導入した形質転換体で顕著な増殖が認められた。また、ＳｅＦＬＡΔＮを導入した形質転換大腸菌では、全長を導入したものに比べ増殖速度は低下したものの、対照に比べて顕著な増殖が確認された。また、ＳｅＦＬＡΔＣは、対照と同レベルであった。（図４Ｄ）。これらの結果から、ＳｅＦＬＡは大腸菌に対し、塩、水分、熱ストレス耐性強化因子として機能することが確認された。また、このタンパク質が十分に機能するためには、分泌性シグナルペプチドと推定される領域とＧＰＩアンカーシグナル配列と推定される領域の両方が必要であった。
ＳｅＦＬＡ全長または部分長（ＳｅＦＬＡΔＮ、ＳｅＦＬＡΔＣ）ｃＤＮＡ、対照としてベクター(pBluescript SK) を導入した形質転換体の熱ストレス耐性を評価した。実施例８と同様の操作を行い、通常の２ＹＴ液体培地（ＮａＣｌ: ８６ｍＭ、ソルビトール: ０ｍＭ）を用いて、４５℃条件下での増殖曲線をとった。その結果、ＳｅＦＬＡ全長を導入した形質転換体で顕著な増殖が認められた。また、ＳｅＦＬＡΔＮを導入した形質転換大腸菌では、全長を導入したものに比べ増殖速度は低下したものの、対照に比べて顕著な増殖が確認された。また、ＳｅＦＬＡΔＣは、対照と同レベルであった。（図４Ｄ）。これらの結果から、ＳｅＦＬＡは大腸菌に対し、塩、水分、熱ストレス耐性強化因子として機能することが確認された。また、このタンパク質が十分に機能するためには、分泌性シグナルペプチドと推定される領域とＧＰＩアンカーシグナル配列と推定される領域の両方が必要であった。
[酵母に対するＳｅＦＬＡの塩ストレス耐性強化機能]
酵母発現ベクターであるpAUR123にクローニングされたＳｅＦＬＡ全長または部分長（ＳｅＦＬＡΔＮ、ＳｅＦＬＡΔＣ）をSaccharomyces cerevisiae（YM4271: Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に導入し、得られた形質転換体の耐塩性を評価した。各形質転換体を初期濃度がＯＤ600 ＝０．１になるようにそれぞれＹＰＤ液体培地に植え継ぎ、小型振とう培養装置ＴＶＳ０６２ＣＡ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）を用いて細胞濃度の変化をモニタリングした。ストレス無し（ＮａＣｌ: ０ｍＭ、ソルビトール: ０ｍＭ、３０℃）の状態ではいずれの形質転換酵母もほぼ同様な生育を示した(図５Ａ）。これに対し、１．５Ｍ ＮａＣｌ を含むＹＰＤ液体培地中ではベクターのみを導入した形質転換体に比べ、ＳｅＦＬＡ全長および各部分長（ＳｅＦＬＡΔＮ、ＳｅＦＬＡΔＣ）を導入したものに明らかな耐塩性の向上が認められた（図５Ｂ）。
酵母発現ベクターであるpAUR123にクローニングされたＳｅＦＬＡ全長または部分長（ＳｅＦＬＡΔＮ、ＳｅＦＬＡΔＣ）をSaccharomyces cerevisiae（YM4271: Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に導入し、得られた形質転換体の耐塩性を評価した。各形質転換体を初期濃度がＯＤ600 ＝０．１になるようにそれぞれＹＰＤ液体培地に植え継ぎ、小型振とう培養装置ＴＶＳ０６２ＣＡ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）を用いて細胞濃度の変化をモニタリングした。ストレス無し（ＮａＣｌ: ０ｍＭ、ソルビトール: ０ｍＭ、３０℃）の状態ではいずれの形質転換酵母もほぼ同様な生育を示した(図５Ａ）。これに対し、１．５Ｍ ＮａＣｌ を含むＹＰＤ液体培地中ではベクターのみを導入した形質転換体に比べ、ＳｅＦＬＡ全長および各部分長（ＳｅＦＬＡΔＮ、ＳｅＦＬＡΔＣ）を導入したものに明らかな耐塩性の向上が認められた（図５Ｂ）。
[酵母に対するＳｅＦＬＡの水分ストレス耐性強化機能]
ＳｅＦＬＡ全長または各部分長（ＳｅＦＬＡΔＮ、ＳｅＦＬＡΔＣ）、対照としてベクター(pAUR123) を導入した形質転換体の水分ストレス耐性を評価した。３０℃条件下で２．２ Ｍ ソルビトールを含むＹＰＤ培地（ＮａＣｌ: ０ｍＭ）を用いて実施例１１と同様の操作を行った。その結果、ＳｅＦＬＡ全長またＳｅＦＬＡΔＮを導入した形質転換体は、対照と比べて顕著な増殖が認められた（図５Ｃ）。また、同条件下でＳｅＦＬＡΔＣを導入した形質転換体では、対照と比べ顕著な差は認められなかった（図５Ｃ）。これらの結果からＳｅＦＬＡは酵母内において水分ストレス耐性強化因子として機能し、特にＧＰＩアンカーシグナル配列と推定される領域が不可欠であることが確認された。
ＳｅＦＬＡ全長または各部分長（ＳｅＦＬＡΔＮ、ＳｅＦＬＡΔＣ）、対照としてベクター(pAUR123) を導入した形質転換体の水分ストレス耐性を評価した。３０℃条件下で２．２ Ｍ ソルビトールを含むＹＰＤ培地（ＮａＣｌ: ０ｍＭ）を用いて実施例１１と同様の操作を行った。その結果、ＳｅＦＬＡ全長またＳｅＦＬＡΔＮを導入した形質転換体は、対照と比べて顕著な増殖が認められた（図５Ｃ）。また、同条件下でＳｅＦＬＡΔＣを導入した形質転換体では、対照と比べ顕著な差は認められなかった（図５Ｃ）。これらの結果からＳｅＦＬＡは酵母内において水分ストレス耐性強化因子として機能し、特にＧＰＩアンカーシグナル配列と推定される領域が不可欠であることが確認された。
[酵母に対するＳｅＦＬＡの熱ストレス耐性強化機能]
ＳｅＦＬＡ全長または部分長（ＳｅＦＬＡΔＮ、ＳｅＦＬＡΔＣ）、対照としてベクター（pAUR123) を導入した形質転換体の熱ストレス耐性を評価した。実施例１１と同様の操作を行い、ＹＰＤ液体培地（ＮａＣｌ: ０ｍＭ、ソルビトール: ０ｍＭ）を用いて、３８℃での生育を評価した。その結果、対照に比べ、ＳｅＦＬＡ全長を導入した形質転換体に顕著な増殖が認められた。また、ＳｅＦＬＡΔＮを導入した形質転換体では、全長を導入した形質転換体に比べ、増殖速度は低下したものの、対照に比べて顕著な増殖が確認された。ＳｅＦＬＡΔＣを導入した形質転換体では、対照と同レベルまで増殖速度が極端に低下した（図５Ｄ）。これらの結果からＳｅＦＬＡが酵母内において熱耐性強化因子としても機能し、特にＧＰＩアンカーシグナル配列と推定される領域が不可欠であることが確認された。
以上の結果から、ＳｅＦＬＡは酵母に対し、塩、水分、熱ストレス耐性強化因子として機能することが確認された。
ＳｅＦＬＡ全長または部分長（ＳｅＦＬＡΔＮ、ＳｅＦＬＡΔＣ）、対照としてベクター（pAUR123) を導入した形質転換体の熱ストレス耐性を評価した。実施例１１と同様の操作を行い、ＹＰＤ液体培地（ＮａＣｌ: ０ｍＭ、ソルビトール: ０ｍＭ）を用いて、３８℃での生育を評価した。その結果、対照に比べ、ＳｅＦＬＡ全長を導入した形質転換体に顕著な増殖が認められた。また、ＳｅＦＬＡΔＮを導入した形質転換体では、全長を導入した形質転換体に比べ、増殖速度は低下したものの、対照に比べて顕著な増殖が確認された。ＳｅＦＬＡΔＣを導入した形質転換体では、対照と同レベルまで増殖速度が極端に低下した（図５Ｄ）。これらの結果からＳｅＦＬＡが酵母内において熱耐性強化因子としても機能し、特にＧＰＩアンカーシグナル配列と推定される領域が不可欠であることが確認された。
以上の結果から、ＳｅＦＬＡは酵母に対し、塩、水分、熱ストレス耐性強化因子として機能することが確認された。
[タバコに対するＳｅＦＬＡの塩ストレス耐性強化機能]
実施例７に従って作成した形質転換タバコを計１４ライン作出し、各形質転換体におけるＳｅＦＬＡ ｍＲＮＡの発現をノーザンブロット法で確認した。プローブとしてＳｅＦＬＡ ｃＤＮＡ全長を用いた結果、ｌｉｎｅ ３、１４でＳｅＦＬＡ ｍＲＮＡが強く発現しているのが確認された（図６Ａ）。そこで、この２ラインを自家受粉させ、次世代の種子（Ｔ１）を獲得した。得られた種子を土に播種してから、ＮａＣｌ ２５０ｍＭを含む塩水を４日おきに与え、１０日後の発芽率を評価した。その結果、対照となる野生株に比べ、ＳｅＦＬＡ全長を導入した形質転換体では、ＮａＣｌ存在下での発芽率に顕著な向上が認められた（図６Ｂ）。このとき発芽した幼植物体は、対照に比べ明らかな生育の差が認められた（図６Ｃ）。湿重量においても顕著な差が認められた（図６Ｄ）。
以上の結果から、ＳｅＦＬＡは、バクテリアから、酵母に至る幅広い生物種の塩、水分、熱ストレス耐性を向上させる効果を有することが確認された。特に上記のストレスは各種細胞に対し、細胞内の水分含量の低下をもたらすものである事から、ＳｅＦＬＡタンパク質は細胞内の水分含量の低下を防ぐ効果を有するものと考えられた。実際、ＳｅＦＬＡを導入した形質転換タバコのｌｉｎｅ １４, ３はそれぞれ、４００ｍＭマンニトールを含む寒天培地中での発芽率(１０日間で評価)の向上も確認されている（図６Ｅ）。
実施例７に従って作成した形質転換タバコを計１４ライン作出し、各形質転換体におけるＳｅＦＬＡ ｍＲＮＡの発現をノーザンブロット法で確認した。プローブとしてＳｅＦＬＡ ｃＤＮＡ全長を用いた結果、ｌｉｎｅ ３、１４でＳｅＦＬＡ ｍＲＮＡが強く発現しているのが確認された（図６Ａ）。そこで、この２ラインを自家受粉させ、次世代の種子（Ｔ１）を獲得した。得られた種子を土に播種してから、ＮａＣｌ ２５０ｍＭを含む塩水を４日おきに与え、１０日後の発芽率を評価した。その結果、対照となる野生株に比べ、ＳｅＦＬＡ全長を導入した形質転換体では、ＮａＣｌ存在下での発芽率に顕著な向上が認められた（図６Ｂ）。このとき発芽した幼植物体は、対照に比べ明らかな生育の差が認められた（図６Ｃ）。湿重量においても顕著な差が認められた（図６Ｄ）。
以上の結果から、ＳｅＦＬＡは、バクテリアから、酵母に至る幅広い生物種の塩、水分、熱ストレス耐性を向上させる効果を有することが確認された。特に上記のストレスは各種細胞に対し、細胞内の水分含量の低下をもたらすものである事から、ＳｅＦＬＡタンパク質は細胞内の水分含量の低下を防ぐ効果を有するものと考えられた。実際、ＳｅＦＬＡを導入した形質転換タバコのｌｉｎｅ １４, ３はそれぞれ、４００ｍＭマンニトールを含む寒天培地中での発芽率(１０日間で評価)の向上も確認されている（図６Ｅ）。
Claims (18)
- 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
- 配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
- 配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
- 配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡ。
- 配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
- 配列番号１に示される塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
- 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
- 配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するタンパク質。
- 配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するタンパク質。
- 請求項７〜９のいずれか記載のタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクター。
- 請求項１〜６のいずれか記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
- 請求項１０又は１１記載の組換えベクターを宿主細胞に導入することにより得られる形質転換細胞。
- 宿主細胞が、植物細胞である請求項１２記載の形質転換細胞。
- 宿主細胞が、微生物細胞である請求項１２記載の形質転換細胞。
- 請求項１２〜１４のいずれか記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞又はその培養液の上清から組換えタンパク質を回収することを特徴とする少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するタンパク質の製造方法。
- 請求項７〜９のいずれか記載のタンパク質をコードするＤＮＡを植物細胞に導入し、該植物細胞の分裂・増殖と再分化を行わせることにより得られる少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するトランスジェニック植物。
- 請求項１〜６のいずれか記載のＤＮＡを植物細胞に導入し、該植物細胞の分裂・増殖と再分化を行わせることにより得られる少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するトランスジェニック植物。
- 請求項１２又は１３記載のベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞の分裂・増殖と再分化を行わせることにより得られる少なくとも熱又は水分ストレス耐性向上活性を有するトランスジェニック植物。
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