JP2003527115A - 新規のｈ因子関連タンパク質５及びその抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は新規のヒトタンパク質、因子−Ｈ関連タンパク質５（ＦＨＲ−５）、ＦＨＲ−５と実質的に同一なタンパク質、及びこれらのタンパク質に対する抗体に関する。新規のヒトＨ因子−関連タンパク質（ＦＨＲ−５）が開示されている。本発明の範囲にはＦＨＲ−５のアミノ酸配列、ＦＨＲ−５のアミノ酸配列をコードする核酸配列及び実質的にこれらと同一のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列が含まれる。本発明のヌクレオチド配列を含むベクター、本発明のヌクレオチド配列を含むトランスジェニック宿主細胞及びＦＨＲ−５タンパク質と反応する抗体も本発明の範囲内である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （関連出願のクロス−リファレンス） 本出願は、あらゆる目的のために参考としてその全体が本明細書に援用される
２０００年３月１３日出願の米国仮特許出願第６０／１８８，８７０号の利益を
主張する。

【０００２】 （背景） 本発明は新規のヒトタンパク質、因子−Ｈ関連タンパク質５（ＦＨＲ−５）、
ＦＨＲ−５と実質的に同一なタンパク質、及びこれらのタンパク質に対する抗体
に関するものである。

【０００３】 補体の活動が、抗体が脊椎動物を大部分の細菌感染から防御する第一の手段で
ある。補体は、抗体−抗原複合体または微生物によって活性化されて一連のタン
パク分解反応（その最終結果は膜攻撃複合体の集合である）を受ける血清タンパ
ク質系からなる。これらの複合体は微生物に孔を開け、それによって微生物を破
壊する。同時に、活性化過程に放出されたタンパク分解フラグメントは、血管を
拡張し、食細胞を感染部位に引き付けることによって防御反応を促進する。補体
は攻撃される微生物に対する食細胞の結合、消化、破壊能力も高める。

【０００４】 補体は約２０の相互作用するタンパク質からなる；そのうち反応性コンポーネ
ントはＣ１−Ｃ９、因子Ｂ、因子Ｄと呼ばれ、残りはＨ因子タンパク質等の種々
の調節タンパク質を含む。補体コンポーネントは全て可溶性タンパク質である。
それらは主として肝臓で作られ、血中及び細胞外液中を循環する。微生物の侵入
によって直接的にまたは間接的に免疫反応によってトリガーされない限り、それ
らは大部分が不活性である。補体活性化の究極的結果は、後期の補体コンポーネ
ント（Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８及びＣ９）が集合し、微生物細胞溶解を仲介する
大きいタンパク質複合体（膜攻撃複合体）を形成することである。

【０００５】 その主な機能は微生物細胞膜の攻撃であるから、補体の活性化は微生物細胞膜
に焦点を合わせる。その細胞膜において補体は上記微生物に結合した抗体または
微生物エンベロープ多糖類のいずれかによって、あるいは初期補体コンポーネン
トを活性化する上記両者によってトリガーされる。明らかに異なる二つの補体活
性化経路に属する二組の初期コンポーネントがある：Ｃ１、Ｃ２及びＣ４は抗体
結合によってトリガーされる典型的経路に属し、因子Ｂ及び因子Ｄは微生物多糖
によってトリガーされるもう一つの経路に属する。両経路の初期コンポーネント
類は究極的には最も重要な補体コンポーネントであるＣ３に作用する。初期コン
ポーネント類及びＣ３は、限定的タンパク質分解的切断によって逐次活性化され
る酵素前駆体である：その系列の各酵素前駆体が切断されると、それは活性化さ
れてセリンプロテアーゼを発生し、それはその系列の次の酵素前駆体を切断する
、等々。これら切断の多くは小さいペプチドフラグメントを遊離し、膜結合部位
をより大きいフラグメントにさらす。より大きいフラグメントはその新たに露出
した膜結合部位を介して標的細胞マクロファージにしっかりと結合し、その系列
の次の反応の生成を助ける。このようにして補体活性化は、その活性化が始まる
細胞表面にほぼ限定される。

【０００６】 切断によるＣ３の活性化は補体活性化系列の中心的反応であり、典型的経路と
もう一つ別の経路が一点に集まるのは“ここ”なのである。両経路において、Ｃ
３はＣ３変換酵素と呼ばれる酵素複合体によって切断される。異なるＣ３変換酵
素が各経路で産生され、カスケードのより早い段階で活性化される２つの補体コ
ンポーネントの自発的集合によって形成される。Ｃ３変換酵素の両タイプ共、Ｃ
３を２つのフラグメントに切断する。これらのうちの大きい方（Ｃ３ｂ）は標的
細胞膜に共有結合し、Ｃ５と結合する。ひとたび結合すると、上記Ｃ５タンパク
質はＣ３変換酵素（今やＣ５変換酵素として作用する）によって切断され、後期
コンポーネント（Ｃ５からＣ９まで）の自発的集合を開始し、膜攻撃複合体を形
成する。活性化された各酵素は、連鎖における次にくる多くの酵素前駆体分子を
切断するから、初期コンポーネントの活性化はタンパク質分解カスケードを増幅
し、上記系列の開始時に活性化された各分子は多くの膜攻撃複合体を産生する。

【０００７】 後期コンポーネントの集合が始まるのは、すでに標的細胞膜上のＣ３ｂにゆる
く結合しているＣ５が、典型的またはもう一つの別の経路のどちらかのＣ３変換
酵素によって分割されてＣ５ａ及びＣ５ｂを与えるときである。今述べたように
、Ｃ５ａは遊離し、炎症性反応を促進する。Ｃ５ｂはＣ３ｂに結合したままにな
り、Ｃ６に結合してＣ５６を形成し、それからＣ７に結合してＣ５６７を形成す
る一過性能力を有する。Ｃ５６７複合体はその後Ｃ７を介して膜にしっかりと結
合する。この複合体はＣ８の１分子を付加してＣ５６７８を形成し、それはその
後Ｃ９の８ないし１８分子に結合する。それは部分的に開き、重合して経膜チャ
ンネルを形成する。

【０００８】 上記補体カスケードの自己増幅性破壊特性にとって必要なのは、鍵となる活性
化コンポーネントが生成後速やかに不活性化され、上記攻撃が近くの宿主細胞に
絶対に広がらないようにすることである。不活性化は少なくとも二つの方法で実
現する。第一は、血中の特異的インヒビタータンパク質が、タンパク分解性切断
によって活性化された後、或る種のコンポーネントに結合するか、或る種のコン
ポーネントを切断することのいずれかによってそのカスケードを断ち切るという
方法である。インヒビタータンパク質は例えばＣ１複合体の活性化コンポーネン
トに結合し、それらのその後の働きを阻止し、一方その他のインヒビタータンパ
ク質はＣ３ｂを切断し、それによってそれを不活性化する。これらのインヒビタ
ーがなければ、血清Ｃ３は全て、相互に代わり得る別の経路によって形成される
正のフィードバックループによって枯渇してしまうかも知れない。

【０００９】 Ｈ因子（ＦＨ）（Ｒｉｐｏｃｈｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４９巻：５９３
−６０２ページ：１９８８）は、染色体１ｑ３２上の主要ＲＣＡ遺伝子集団から
約７Ｍｂの遺伝子によってコードされる液相ＲＣＡ（補体活性化調節物質）タン
パク質である（Ｈｏｕｅｃａｄｅら、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４５巻：３８
１−４１６ページ、１９８９）。それは２０の短いコンセンサス・リピート（Ｓ
ＣＲ）ドメインから構成され、Ｃ３及びＣ５変換酵素の衰退を加速することによ
り、そして表面結合Ｃ３ｂの因子Ｉ仲介性切断の補因子として作用することによ
って、もう一つの補体活性化経路の増幅を阻止するようにはたらく。ＦＨのＳＣ
Ｒ１−１０及び１６−２０はＣ３ｂのための結合部位を含むと考えられており、
衰退加速活性及び補因子活性はＳＣＲ１−５に局在化される（Ａｌｓｅｎｚら、
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２２４巻：３８９−３９８ページ、１９８４；Ａｌｓｅｎ
ｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３２巻：８４１−８５０ページ、１９８５；Ｇｏ
ｒｄｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５巻：３４８−３５６ページ、１９９５
；Ｋｕｈｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５巻：５６６３−５６７０ページ、１
９９５；ＫｕｈｎおよびＺｉｐｆｅｌ、Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６巻
：２３８３−２３８７ページ、１９９６；ＳｏａｍｅｓおよびＳｉｍ、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２３巻：５３Ｓ、１９９５；Ｓｈａｒｍａおよび
Ｐａｎｇｂｕｒｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３巻：
１０９９６−１１００１、１９９６）。Ｈ因子ファミリーには、交互スプライシ
ングによって生成するＨＦの比較的短い（ＳＣＲ１−７）バージョンであるＨ因
子様タンパク質１（ＦＨＬ−１）（Ｓｃｈｗａｅｂｌｅら、Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．、１７巻：１４８５−１４８９ページ、１９８７）、及びＳＣＲ４
または５を含む四種類のＨ因子−関連タンパク質 ＦＨＲ−１〜ＦＨＲ−４（Ｚ
ｉｐｆｅｌおよびＳｋｅｒｋａ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１５巻：１２１
−１２６ページ、１９９４；Ｓｋｅｒｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２
巻：５６２７−５６３４ページ、１９９７）も含まれる。これらの代わり得る形
のうち、全てがＣ３ｂ結合にかかわるＳＣＲを含むとはいえ、補体調節活性を有
するのはＦＨＬ−１だけである。

【００１０】 糸球体免疫デポジットの新規コンポーネント類を確認するために設計された研
究において、糸球体腎炎のヒト腎臓から得た糸球体基底膜試料でマウスを免疫し
た後、一連のモノクローナル抗体が産生された。生成した抗体の大部分は非構造
性コンポーネントに向けられていたが、数種は終末補体複合体のコンポーネント
類と反応した（Ｍｕｒｐｈｙおよびｄ’Ａｐｉｃｅ、Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２０
巻：１３０−１３６ページ、１９８８）。これらには、最初はヒト クラステリ
ン（ＳＣ５ｂ−９補体複合体のコンポーネント）と同定された、２種類の抗体が
含まれていた。糸球体免疫デポジットに対するもう一つの抗体、Ｋ２．２５４、
の免疫組織学的反応性のパターンは正常及び糸球体腎炎のヒト組織における終末
補体複合体のコンポーネント類に対する抗体のそれに似ているようにみえた。し
かしこの抗体は既知の補体コンポーネントまたは精製した終末補体Ｃ５ｂ−９複
合体とは反応せず、そしてこの抗体は正常なヒト血清とは反応しない。こうして
この抗体は、もともとは、活性化補体Ｃ５ｂ−９複合体上の、推定的には活性化
Ｃ９タンパク質上の新たに露出したエピトープに結合するか、または糸球体腎症
に特異的な因子上のエピトープに結合すると考えられた。

【００１１】 出願人は、抗体がこれまで知られていなかった補体結合タンパク質に結合する
ことを発見した。部分的ペプチド配列決定ならびにｃＤＮＡクローニング及び配
列決定によって導き出されたこのタンパク質の推定アミノ酸配列は、それがタン
パク質のＨ因子−関連ファミリーのメンバーであることを示している。この分野
における現在の命名法にしたがって、この新しいタンパク質をＨ因子−関連タン
パク質５（ＦＨＲ−５）と命名した。

【００１２】 （概要） 本発明は新規のヒトＨ因子−関連タンパク質５（ＦＨＲ−５）、実質的にこれ
と同一のタンパク質類、及びこれらのタンパク質に対する抗体に関するものであ
る。

【００１３】 一面において、本発明はアミノ酸配列がＦＨＲ−５、配列番号２に一致する実
質的に精製されたタンパク質に関する。その他の実施形態において、本発明はＦ
ＨＲ−５に実質的に同一のタンパク質類にも関する。従って、一実施形態におい
て、このようなタンパク質は、そのタンパク質の配列を配列番号２と整列させ、
マッチするアミノ酸の数を最大にするためにギャップを導入した場合に、配列中
の同一のアミノ酸の数によって測定して、少なくとも９０％の配列がＦＨＲ−５
と同じ配列（または約４９５の一致するアミノ酸）であるタンパク質である。別
の実施形態においては、このようなタンパク質はＦＨＲ−５と一致する最低９５
％の配列（または約５２３の一致するアミノ酸）を有する。なお別の実施形態に
おいて、このようなタンパク質はＦＨＲ−５と一致する最低９８％の配列（また
は約５３９の一致するアミノ酸）を有する。さらにまた別の実施形態では、この
ようなタンパク質はＦＨＲ−５に一致する最低９９％の配列（または約５４５の
一致するアミノ酸）を有する。さらなる一実施形態において、このようなタンパ
ク質はＦＨＲ−５に一致する最低９９．５％の配列（または約５４８の一致する
アミノ酸）を有する。

【００１４】 もう一つの面において、本発明は上記のタンパク質をコードする実質的に単離
された核酸ポリマー類に関する。これらの核酸の一実施形態は、ＦＨＲ−５の固
有のｃＤＮＡ配列、配列番号１、配列番号１にハイブリダイズするその補体及び
配列、または高ストリンジェンシー状態下におけるその補体である。これらの核
酸配列のその他の実施形態は、これもまた配列番号２をコードする同義の核酸配
列である。これらの配列は配列番号３の一般配列によってあらわされる。ＦＨＲ
−５に実質的に同一のタンパク質をコードする核酸ポリマー類もこれらの配列の
実施形態として考慮される。これらの配列は、上記で定義されるように、ＦＨＲ
−５に最低９０％一致するタンパク質をコードするもの、並びにＦＨＲ−５に最
低９５％一致するタンパク質、９８％一致するタンパク質、９９％一致するタン
パク質または９９．５％一致するタンパク質をコードするものである。当業者は
、遺伝暗号の再分類によって、及び配列番号１の核酸配列を誘導する種々の部位
に特異的な変異誘発技術を利用することによって、このような配列を容易に考案
し、作成し得る。

【００１５】 別の面において、本発明はＦＨＲ−５または実質的に同一のタンパク質に対す
る抗体にも関する：その際上記抗体はＫ２．２５４ではない。この面の好ましい
実施形態は、ＦＨＲ−５のエピトープに対するＫ２．２５４以外の（非−Ｋ２．
２５４）モノクローナル抗体である。これらは、ＦＨＲ−５が活性化補体と結合
する際に選択的にあらわれる。この面のその他の好ましい実施形態は、ＦＨＲ−
５に対する非−Ｋ２．２５４抗体であって、ＦＨＲ−５に結合すると、上記タン
パク質が活性化補体に結合するために必要なＦＨＲ−５の機能を阻害する抗体で
ある。この面のその他の実施形態は、ＦＨＲ−５または実質的にこれと同一のタ
ンパク質に対するヒト化モノクローナル抗体である。その他の面としては、ＦＨ
Ｒ−５または実質的に同一のタンパク質に対する組換え及びキメラ抗体ならびに
ＦＨＲ−５または実質的にこれと同一のタンパク質に対する免疫学的に活性な抗
体フラグメント（例えばＦａｂフラグメント等）がある。

【００１６】 もう一つの面において、本発明は本発明の抗体を利用する方法にも関する。Ｆ
ＨＲ−５が活性化補体と結合するときに選択的にあらわれる、ＦＨＲ−５のエピ
トープに対する非−Ｋ２．２５４モノクローナル抗体を免疫組織化学的診断試薬
として用いて、生検組織の免疫学的デポジットを検出することができる。さらに
、ＦＨＲ−５に結合したときに、上記タンパク質が活性化補体と結合するのに必
要なＦＨＲ−５の機能を阻害する、ＦＨＲ−５に対する非−Ｋ２．２５４抗体を
使用して、活性化補体とＦＨＲ−５との結合を阻止し得る。

【００１７】 また別の面において、本発明は（ａ）配列番号１のポリヌクレオチド及びその
補体と；（ｂ）０．１Ｘ ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、４２℃の洗浄条件下で（
ａ）のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、抗体
Ｋ２．２５４によって認識されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；と
からなる群から選択される単離されたポリヌクレオチドに関する。その他の実施
形態は、０．１Ｘ ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、４２℃の洗浄条件下で本発明の
ポリヌクレオチドのいずれかにハイブリダイズする少なくとも２０の核酸のオリ
ゴヌクレオチドを提供する。

【００１８】 本発明のこれらの及びその他の特徴、観点、及び利点は下記の説明、添付の特
許請求の範囲及び添付の図によってよりよく理解される。

【００１９】 （定義） “実質的に純粋”または“実質的に精製された”は、一般に、該物質にその他
の混入タンパク質、核酸及び元の生物源に由来するその他の生物学的物質がない
ことを意味する。純度は標準的方法によって測定され、普通は最低約４０％の純
度、より一般的には最低約５０％の純度、概して最低約６０％の純度、より一般
的には最低約７０％の純度、頻繁には最低約７５％の純度、より頻繁には最低約
８０％の純度、典型的には最低約８５％の純度、より典型的には最低約９０％の
純度、好ましくは最低約９５％の純度、より好ましくは最低約９８％の純度、さ
らにより好ましい実施形態においては最低９９％の純度である。分析は秤量で行
われるか、または例えばゲル染色、分光光度法、または末端標識化（ｔｅｒｍｉ
ｎｕｓ ｌａｂｅｌｉｎｇ）等によって評価されるモルパーセントであらわされ
る。

【００２０】 “核酸ポリマー”、“ポリヌクレオチド”及び“オリゴヌクレオチド”は交換
可能に用いられ、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドどちらでも
、ヌクレオチドのあらゆる長さのポリマー形態（モノマー２個以上）を指す。ヌ
クレオチドはホスホジエステル結合によって連結するのが普通だが、この用語は
アミノエチルグリシン単位からなる中性アミド主鎖結合を含む重合性ヌクレオチ
ドも含む。この用語は分子の一次構造だけを指す。従ってこの用語は二本鎖及び
一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。それは公知の種類の変形、例えば標識、メチル
化、“キャップ”、天然に生成する一つ以上のヌクレオチド類をアナログによっ
て置換すること、ヌクレオチド間変形、例えば電荷をもたない結合（例えばメチ
ルホスホネート類、ホスホトリエステル類、ホスホアミデート類、カルバメート
類等）による変形、例えばタンパク質等のペンダント部分を含む変形（例えばヌ
クレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジン等を含む）
、挿入物（例えばアクリジン、プソラレン等）による変形、キレート化剤（例え
ば金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属等）を含む変形、アルキレーター（ａ
ｌｋｙｌａｔｏｒ）を含む変形、改変結合（例えばアルファアノマー核酸等）に
よる変形、並びにポリヌクレオチドの未変形型も含む。ポリヌクレオチドは、セ
ンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む。ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びｍＲＮ
Ａは典型的核酸ポリマーである。

【００２１】 用語“ベクター”は関心とする核酸ポリマーを含む物理的または生化学的ビヒ
クルを含むものとする。このビヒクルによってこれら核酸ポリマーは宿主細胞に
移入され、この移入された核酸ポリマーで細胞は形質変換される。ベクターの例
には、ＤＮＡプラスミド、ウィルス、及び粒子状ガンペレット等がある。

【００２２】 用語“宿主細胞”はベクター形質転換の標的細胞を意味し、移された核酸ポリ
マーはその細胞内で複製されおよび／または発現する。

【００２３】 本明細書中で用いる“Ｋ２．２５４”は、特許手続き上の微生物の寄託の国際
承認に関するブダペスト条約の約定のもとでアメリカンタイプカルチャーコレク
ション（ＡＴＣＣ）１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．（マナッサ
ス、バージニア ２０１１０−２２０９ ＵＳＡ）に２０００年１２月１３日に
寄託された細胞株によって産生され、特許寄託名称ＰＴＡ−２８００を有するモ
ノクローナル抗体を言う。

【００２４】 （詳細な説明） 下記の詳細な説明は当業者による本発明の実施に役立つためのものである。だ
がこの詳細な説明は本発明を不当に制限するものではない。それは、当業者はこ
の発明的発見の精神または範囲から逸脱することなく本明細書に述べる実施形態
の変更及び変化をなし得るからである。

【００２５】 本出願に記載される全ての特許公報、特許、特許出願、データベース及びその
他の参考文献は、あたかも各個々の特許広報、特許、特許出願、データベースま
たはその他の参考文献が詳細にかつ個々に記載され、参考として援用されたかの
ように、そのまま参考として本明細書に援用される。

【００２６】 新規のヒトタンパク質Ｈ因子関連タンパク質５（ＦＨＲ−５）が本明細書に記
載のように単離され、特徴づけられ、組換えによって再生産された。ＦＨＲ−５
は配列番号２に示す一次アミノ酸配列を有し、配列番号１に示される固有のｃＤ
ＮＡ配列によってコードされる。ＦＨファミリーのその他のメンバーと同様に、
ＦＨＲ−５は肝臓によって合成され、完全にＳＣＲドメインからなる。それは成
熟補体Ｃ５ｂ−９複合体と結合することが判明し、補体カスケードに或る役割を
演ずると考えられている。特定の理論によって束縛されるものではないが、その
ＳＣＲの、その他のファミリーメンバーの特定のＳＣＲとの相同性（図６）は、
ＦＨＲ−５がＣ３ｂ及びヘパリンに結合することを示唆する。ＦＨＲ−５は、Ｆ
ＨＲ−１及びＦＨＲ−２（Ｐａｒｋ及びＷｒｉｇｈｔ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２７１巻：１８０５４−１８０６０ページ、１９９６）及びＦＨＲ−４（Ｓｋ
ｅｒｋａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２巻；５６２７−５６３４ページ、１
９９７）で示されたように、リポタンパク質とも結合するにちがいない。同様に
、その他の補体調節タンパク質（Ｃ４結合タンパク質、ＣＤ５９及びクラステリ
ン）もリポタンパク質結合を示した（Ｖａｌｅｖａ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、８
２巻：２８−３３ページ、１９９４；Ｍｅｒｉ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ ２
巻：１４９−１５５ページ、１９９４；Ｊｅｎｎｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２６６巻：１１０３０−１１０３６ページ、１９９１；Ｊｅｎｎｅ及びＴｓｃ
ｈｏｐｐ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７巻：１５４−１５９ペ
ージ、１９９２；Ｆｕｎａｋｏｓｈｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａ
ｃｔａ ９６３巻；９８−１０８ページ、１９８８）。こうしてリポタンパク質
の構成成分としてのＦＨＲタンパク質の役割が示唆され、リポタンパク質と補体
系との機能的相互作用を示すことができた。

【００２７】 ＦＨＲ−５は、それがインビボで終末Ｃ５ｂ−９複合体と結合して広く見いだ
されており、正常及び病的ヒト組織両方にこれらの複合体と一緒に局在している
ようにみえるという点で、ＦＨファミリー中では特異である。こうしてＦＨＲ−
５タンパク質は終末Ｃ５ｂ−９複合体のマーカーとして有用である。一連のヒト
腎生検において、Ｋ２．２５４は補体活性化の高感度のマーカーであるようにみ
える。このようなＣ５ｂ−９とのインビボ結合にもかかわらず、ＦＨＲ−５とそ
の他のＦＨタンパク質との分子構造の類似性は、補体系とＣ３／Ｃ５変換酵素と
の一次相互作用を示唆するものである。

【００２８】 表２に列挙せるプライマー及び当業者には周知のＤＮＡ増幅法を用いて、当業
者はＦＨＲ−５をコードするｃＤＮＡを、肝細胞ｃＤＮＡライブラリーから容易
に分離することができるかも知れない（例えばＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ（ロックビル、ＭＤ、ＵＳＡ）から提供されるヒト肝Ｒａｐｉｄ−Ｓ
ｃａｎ^TM Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐａｎｅｌ）。このような分離は
実施例２に示される。その後成熟ＦＨＲ−５タンパク質が真核生物タンパク質の
産生に適した任意の組換え発現系において産生される。実施例２で用いた昆虫細
胞発現系のような真核生物発現系を用いるのが好ましい。動物細胞系の利用はタ
ンパク質の不当なグリコシル化を阻止するために賢明な方法である。

【００２９】 分子生物学の技術的現状は今や十分に進歩し、比較的容易に正確に、ＤＮＡ配
列をごくわずか変化させることができるようになった。中程度に熟練せる実験技
術者は市販の部位特異的突然変異キット（例えばＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．（
マジソン、ウィスコンシン、ＵＳＡ）によって提供されるＧｅｎｅＥｄｉｔｏｒ ^TM 等）の一つの使用説明書にしたがってＤＮＡヌクレオチド配列にいかなる数の
変化も起こすことができる。標準的生化学的方法によってトリプレットヌクレオ
チドコドンをアミノ酸配列に翻訳するために利用する遺伝暗号を支配する一般的
規則も周知である。例えば、出願人は、配列番号２のＦＨＲ−５のアミノ酸配列
をコードする、配列番号３のコンセンサス配列によって示されるＤＮＡ配列の群
は、本発明の範囲内であると考える。コドン使用頻度のような遺伝暗号やＧＣ％
含有量のわずかな変化が若干の門（ｐｈｙｌａ）では起きるとはいえ、これらの
変化を支配する規則はよく証明されており、分子遺伝学分野の熟練者の合理的技
術の範囲内である。こうして出願人はアミノ酸配列配列番号２をコードするいか
なるその他の核酸配列も本発明の範囲内であると考える。

【００３０】 本明細書中に開示されるヌクレオチド配列の特殊の実施形態が配列番号１で与
えられているとはいえ、本発明の核酸配列のその他の生物学的機能的に等価の型
が一般的ＤＮＡ−ＤＮＡ及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション技術を用い
て容易に単離され得ることは当然である。このため本発明は、高ストリンジェン
シー条件下で配列番号１またはその補体にハイブリダイズし、本明細書中に開示
される配列番号２のタンパク質と同じかまたは類似の生物学的活性を示すタンパ
ク質類をコードするヌクレオチド配列も含む。１つの実施形態においては、この
ようなヌクレオチド配列は、高ストリンジェンシー条件下で配列番号１の核酸ま
たはその補体とハイブリダイズする。

【００３１】 当業者には周知のように、ストリンジェンシーは生成したハイブリッドのＴ_m
に関係する。核酸ハイブリッドのＴ_m（融点）とは、塩基の５０％が塩基対とな
る温度である。例えば、もしもハイブリッドのパートナーの一つが約２０塩基の
短いオリゴヌクレオチドであるならば、二重鎖の５０％は一般的にはＴ_mでは分
離している鎖である。この場合、Ｔ_mはオリゴヌクレオチドの濃度に依存し時間
には依存しない平衡を反映する。これに対して、もしも両方の鎖がより長い場合
は、Ｔ_mは、それらの鎖が多分交互に代わる二重鎖及び変性領域を含む構造内に
一緒に保持される状態に対応する。この場合、Ｔ_mは時間及びポリヌクレオチド
濃度には依存しない分子間平衡を反映する。

【００３２】 当業者には公知のように、Ｔ_mはポリヌクレオチドの組成（例えば二重鎖の長
さ、種類、塩基組成、及び正確な塩基対合の程度）及び溶媒の組成（例えば塩濃
度及びホルムアミドのような変性剤の存在等）に依存する。Ｔ_mの計算式の一つ
はＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、２版、コールド
スプリング ハーバー プレス、１９８９）に見いだされ、次のように示される
： Ｔ_m＝８１．５℃−１６．６（ｌｏｇ₁₀［Ｎａ⁺］）＝０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０
．６３（ホルムアミドの％）−６００／Ｌ 上記式中、Ｌは塩基対になっているハイブリッドの長さ、Ｎａ⁺濃度は０．０１
Ｍないし０．４Ｍの範囲で、Ｇ＋Ｃ含有量は３０％ないし７５％の範囲である。
ＲＮＡを含むハイブリッドの等式は同じ文献に見いだされる。これに代わる等式
がＤａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ、２版、Ａｐｐｌｅｔｏｎ及びＬａｎｇｅ、１９９４、６−８章に
見いだされる。

【００３３】 ハイブリダイゼーション法及び洗浄法は当業者には周知であり、本明細書に記
載されているような分子生物学の標準的文献に見いだすことができる。概してハ
イブリダイゼーションはＴ_mより低い温度２０−２５℃で、高イオン強度の溶液
（６Ｘ ＳＳＣまたは６Ｘ ＳＳＰＥ）中で行うのが普通である。高ストリンジ
ェンシー洗浄条件は予備実験で実験的に決定することがよくあるが、通常は塩と
、Ｔ_mより低い約１２−２０℃の温度との組み合わせが関係する。高ストリンジ
ェンシー洗浄条件の一例は６０℃における１Ｘ ＳＳＣである。高ストリンジェ
ンシー洗浄条件のもう一つの例は０．１Ｘ ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、４２℃
である（Ｍｅｉｎｋｏｔｈ及びＷａｈｌ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８巻
：２６７−２８４ページ、１９８４）。さらにより高いストリンジェンシー洗浄
条件の一例は０．１Ｘ ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０−６５℃である。具体
的条件は、５Ｘ ＳＳＰＥ、１−５Ｘ デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）溶
液、１００−２００μｇ／ｍｌ変性異種ＤＮＡ、０．５％ＳＤＳ、６８℃におい
て、ハイブリダイゼーションが行われる十分な時間、例えば数時間ないし一晩、
最初のハイブリダイゼーションを行い、その後２Ｘ ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ
中で室温で２回洗浄し、さらに０．１Ｘ ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中で４２℃
で１５分間２回洗浄し、その後ハイブリダイズ生成物を検出する。当業者にはよ
く認識されているように、因子類の種々の組み合わせが実質的に同等のストリン
ジェンシー条件に導くことがある。このような同等の条件は本発明の範囲内であ
る。

【００３４】 ＦＨＲ−５に加えて、その他の実質的に一致するタンパク質が当業者によって
容易に考案され、合成される。タンパク質生化学分野の理解は分子遺伝学のそれ
と同様に完全でないとはいえ、生化学の当業者は、合理的確実さをもって、タン
パク質の一次アミノ酸配列構造に若干の置換をおこなってもタンパク質構造また
は機能の明白な変化を起こさないことを予言することができる。このような保存
的置換は、配列中のアミノ酸を、同様な電荷、サイズ、及びその他の特徴を有す
る側鎖を含む別のアミノ酸で置換することによって行われる。例えば、アミノ酸
アラニン（これは小さい無極性メチル側鎖を有する）は通常、小さい無極性水素
側鎖を有するアミノ酸であるグリシンに置き換えることができ、その際何ら顕著
な影響はあらわれない。ポリペプチドの生物学的機能的活性を決めるのは、その
ポリペプチドの相互作用し得る能力及び性質であるから、或るアミノ酸配列の置
換をポリペプチド配列に加えることができ、しかも同様な特性を有するポリペプ
チドを得ることができる。

【００３５】 このような変化を行う場合、アミノ酸のヒドロパシー指数を考えることができ
る。ポリペプチドに相互作用性生物学的機能を与える際のヒドロパシーアミノ酸
指数の重要性は当業者には一般に理解されている（Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔ
ｌｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７巻：１０５−１３２ページ、１９８２）。
或る種のアミノ酸が同様なヒドロパシー指数またはスコアを有するその他のアミ
ノ酸に代わり得ること、そして同様な生物学的活性を有するポリペプチドを生成
し得ることは知られている。各アミノ酸にはその疎水性及び電荷特性に基づいて
ヒドロパシー指数が割り当てられている。これらの指数は：イソロイシン（＋４
．５）；バリン（＋４．２）：ロイシン（＋３．８）：フェニルアラニン（＋２
．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニ
ン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−
０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−
１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（
−３．５）；アスパルテート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン
（−３．９）；アルギニン（−４．５）である。

【００３６】 アミノ酸の相対的ヒドロパシー特性が、生成するポリペプチドの二次構造を決
め、それはそれでポリペプチドとその他の分子、例えば酵素、基質、受容体、抗
体、抗原等との相互作用を決める考えられている。アミノ酸は同様なヒドロパシ
ー指数を有するその他のアミノ酸によって置換され、それでも機能的に同様のポ
リペプチドを得ることができることは当業者には公知である。このような変化の
場合、ヒドロパシー指数が±２の範囲内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１
の範囲内にあるアミノ酸の置換が特に好ましく、±０．５の範囲内のそれらがさ
らに一層好ましい。

【００３７】 類似アミノ酸の置換は親水性に基づいても行うことができる。特に、それによ
って作成された生物学的機能的等価のポリペプチドまたはペプチドが免疫学的実
施形態に使用するためのものである場合にはこれが言える。参考として本明細書
に組み込まれる米国特許第４，５５４，１０１号は、隣接アミノ酸の親水性によ
って支配されるポリペプチドの最大局部的平均親水性は，その免疫原性及び抗原
性と、すなわちそのポリペプチドの生物学的特性と相関関係にあると述べている
。

【００３８】 米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されているように、下記の親水性値が
アミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．
０）；アスパルテート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリ
ン（＋０．３）；アルギニン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン
（０）；プロリン（−０．５±１）；スレオニン（−０．４）；アラニン（−０
．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１
．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８
）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（
−３．４）。或るアミノ酸が同様な親水性値を有する別のアミノ酸に置換され、
なお生物学的に等価の、特に免疫学的に等価のポリペプチドを得ることができる
ことは理解される。このような変化の場合、親水性値が±２の範囲内であるアミ
ノ酸の置換が好ましく、±１の範囲内であるものが特に好ましく、±０．５の範
囲内であるものがさらにより一層好ましい。

【００３９】 上に概略したように、保存的アミノ酸置換は概してアミノ酸側鎖置換基の相対
的類似性、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷、サイズ等の類似性に基づく。
前記の種々の特徴を考慮する具体的置換は当業者にはよく知られており、次のも
のが含まれる：アルギニンとリジン；グルタメートとアスパルテート；セリンと
スレオニン；グルタミンとアスパラギン；及びバリン、ロイシンとイソロイシン
（下表１を参照されたい）。このため本発明はＦＨＲ−５と実質的に同一である
ＦＨＲ−５の機能的または生物学的等価物を考慮する。これらの等価のタンパク
質類は活性化補体と結合することができ、上記タンパク質の配列を配列番号２と
整列させ、アミノ酸の最多数がマッチするようにギャップを導入した際の、配列
中の一致するアミノ酸の数によって測定して、ＦＨＲ−５に一致する配列が少な
くとも９０％（または約４９５のマッチするアミノ酸）はあるものである。より
好ましくはこのようなタンパク質が、ＦＨＲ−５と一致する配列を少なくとも９
５％有し（または約５２３のマッチするアミノ酸）、より好ましくはこのような
タンパク質がＦＨＲ−５と一致する配列を少なくとも９８％有し（または約５３
９のマッチするアミノ酸）、より好ましくはこのようなタンパク質がＦＨＲ−５
と一致する配列を少なくとも９９％有し（または約５４５のマッチするアミノ酸
）、最も好ましくはこのようなタンパク質がＦＨＲ−５と一致する配列を少なく
とも９９．５％（または約５４８のマッチするアミノ酸）を有する。これらの等
価のタンパク質は配列番号１に示される固有のｃＤＮＡ配列から、上述の種々の
部位特異的変異誘発法によって作成される。

【００４０】 当業者にはよく理解されているように、“同一性（一致）（ｉｄｅｎｔｉｔｙ
）”は配列の比較によって決まる２種類以上のポリペプチド配列間または２種類
以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。この分野では、“同一性（一致）
”はこのような配列のストリング（紐、ｓｔｒｉｎｇ）間の一致によって決まる
ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連程度も意味する。“同一
性（一致）”は次のような公知の方法によって容易に計算できる（だがこれらに
方法に制限するものではない）：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、オックスフォード大学プレス、
ニューヨーク（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ
ｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、アカ
デミックプレス、ニューヨーク、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉ
ｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、第Ｉ部、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及
びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、ヒューマナプレス、ニュージャーシー（１９９
４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、アカデミックプレス（１９８７）；
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．
及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、ストックトンプレス、ニューヨーク（１９９１
）；ならびにＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ Ｊ Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ，４８巻：１０７３ページ（１９８８）。同一性を決め
る方法は被検配列間の最大の一致を生み出すようにデザインすることである。さ
らに、同一性を測定する方法は人々が利用できるプログラムに体系化される。２
配列間の同一性を決めるために用いるコンピュータープログラムには非制限的に
次のものがある：“ＧＣＧ”（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２巻（１号）：３８７ページ（１９８４）；“５ＢＬＡ
ＳＴプログラムからなる一組”、このうち３プログラム（ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡ
ＳＴＸ、及びＴＢＬＡＳＴＸ）はヌクレオチド配列の問合わせ（ｑｕｅｒｙ）に
関して設計され、２プログラム（ＢＬＡＳＴＰ及びＴＢＬＡＳＴＮ）はタンパク
質配列の問合わせに関して設計されたものである（Ｃｏｕｌｓｏｎ、Ｔｒｅｎｄ
ｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２巻：７６−８０ページ（１９９４
）；Ｂｉｒｒｅｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ、１巻：５４３−５５９
ページ（１９９７））。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔ
ｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢ
Ｉ）及びその他のソース（ＢＬＡＳＴマニュアル、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、
ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ、ベセスダ、ＭＤ ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，
Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３−４１０ページ（１９９０）
）から一般の人々に提供される。よく知られているスミス ウォターマン（Ｓｍ
ｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムも同一性の測定のために用いることが
できる。

【００４１】

【表１】 本発明はＦＨＲ−５タンパク質のフラグメント、アナログ及び誘導体にも関係
する。本明細書中で用いる用語“フラグメント”、“誘導体”及び“アナログ”
はＣ３ｂに結合するポリペプチドであって、活性化補体と結合した際にはモノク
ローナル抗体Ｋ２．２５４によって識別されるポリペプチドを意味する。例えば
アナログには切断されて活性成熟タンパク質を生成するプロタンパクが含まれる
。

【００４２】 実施例２におけるＦＨＲ−５の単離の際のＫ２．２５４の使用によって示され
るように、ＦＨＲ−５は少なくとも一つの抗原性エピトープを含み、そのエピト
ープはＦＨＲ−５が活性化補体と結合した場合にあらわれ、ＦＨＲ−５が正常ヒ
ト血清中に存在する場合にはあらわれない。こうしてＦＨＲ−５は補体活性化の
マーカーとして役立つ。ＦＨＲ−５とリポタンパク質との結合が、正常なヒト血
清中でＫ２．２５４がＦＨＲ−５を検出できないことを説明するかも知れない。
もしもＦＨＲ−５がリポタンパク質複合体に組み込まれると、Ｋ２．２５４Ｍａ
ｂ結合部位は隠蔽されるかも知れない。このタンパク質が多分補体の活性化によ
って、その他のタンパク質から解離すると、上記エピトープは多分露出する。Ｆ
ＨＲ−５が正常ヒト血清においてＫ２．２５４Ｍａｂで検出できなかったため、
ポリ−ヒスチジンタグを組換えＦＨＲ−５に組み入れて分泌されたタンパク質の
検出を確実なものにした。興味深いことに、細胞培養上澄液をウェスターンブロ
ット法によって分析したとき、Ｋ２．２５４Ｍａｂも抗ヒスチジン抗体も約６７
ｋＤａの生成物を検出した。特定の理論によって束縛されるものではないが、こ
れらのデータは、ＦＨＲ−５が正常ヒト血清中では培養培地には存在しないその
他の分子に結合し得るという意見を裏づける。こうして、Ｋ２．２５４によって
識別されるエピトープは正常ヒト血清中では露出しないとはいえ、ＦＨＲ−５が
溶液中で実質的に単離された場合には露出する。このため、実質的に単離された
ＦＨＲ−５、または同じエピトープを有する実質的に同一のタンパク質を使用し
て、活性化補体の同定のために有用で、正常ヒト血清とは交差反応しない抗体を
生成することができる。

【００４３】 当業者に公知の標準法を用いて、ＦＨＲ−５または実質的に同一のタンパク質
に対する抗体類を生成し得る。上記抗体類はポリクローナル、モノクローナル、
組換え、キメラ、一本鎖および／または二特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）等で
ある。本発明は免疫学的に活性な抗体フラグメント、例えばＦａｂ及びＦａｂ’
フラグメント等も含む。当該分野で公知の種々の方法を用いて本発明のポリペプ
チド類のエピトープを識別するポリクローナル抗体を産生できる。抗体産生のた
めには種々の宿主動物、例えばウサギ、マウス、ラット、にわとり等（これらに
制限するものではない）をポリペプチド、またはそのフラグメントまたは誘導体
の注入によって免疫することができる。宿主種に応じた種々のアジュバントを用
いて免疫反応を増強してもよい。これらアジュバントには、非制限的に、フロイ
ンドアジュバント、水酸化アルミニウム（ａｌｕｍ）等のミネラルゲル類、リゾ
レシチン等の表面活性剤、プルロニックポリオール類、ポリアニオン類、ペプチ
ド類、オイルエマルション類、キーホール・リンペット・ヘモシアニン類、ジニ
トロフェノール、及びＢＣＧ（ワクチン）及びコリネバクテリウム パルヴム（
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）等の潜在的に有用なヒトアジ
ュバント類がある。

【００４４】 ＦＨＲ−５または実質的にこれと同一のタンパク質に向けられるモノクローナ
ル抗体の調製のためには、連続培養細胞株によって抗体分子を産生するいかなる
技術も使用できる。例えばＮａｔｕｒｅ２５６巻：４９５−４９７ページ（１９
７５）に記載されている、最初はＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎによって開
発されたハイブリドーマ法、トリオーマ法、Ｋｏｚｂｏｒら（Ｉｍｍｕｎｏｌ．
Ｔｏｄａｙ、４巻：７２ページ（１９８３））によって記載されたヒトＢ−細胞
ハイブリドーマ法、及びＣｏｌｅら（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７
−９６ページ（１９８５））によって報告された、モノクローナル抗体を産生す
るためのＥＢＶ−ハイブリドーマ法は、全て、本発明によるモノクローナル抗体
の調製に役立つ。その他の方法はＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｈｅｄｄｙ Ｚｏｌａ（１
９８７））に述べられている。

【００４５】 さらに、ＦＨＲ−５に対する“ヒト化”抗体及び実質的にこれと同一のタンパ
ク質が当業者に公知の方法を用いて産生できる。このプロセスにより、ＦＨＲ−
５のエピトープを識別する非−ヒト種の抗体は、キメラまたは分子遺伝学的技術
によってキメラ性の部分的ヒト抗体に転換される。ヒト化プロセスは米国特許第
５，８６１，１５５号に徹底的に議論されている。これは参考として本明細書に
組み込まれる。

【００４６】 或いは、組換え抗体はファージ・ディスプレー法によって産生できる。ファー
ジディスプレーを用いる抗体の産生及び選択のための方法は当業者にはよく知ら
れており、例えばＶａｕｇｈａｎらのＮａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６巻：
５３５−５３９ページ、１９９８；Ｗａｔｋｉｎｓ及びＯｕｗｅｈａｎｄのＶｏ
ｘ Ｓａｎｇｕｉｎｉｓ ７８巻：７２−７９ページ、２０００；及びそこに記
載の参考文献に見いだされる。

【００４７】 ファージディスプレーによる抗体産生は、免疫グロブリンの可変Ｈ鎖（ＶＨ）
及び可変Ｌ鎖（ＶＬ）配列の組み合わせライブラリーの産生を含む。これらの配
列はコート（ｃｏａｔ）タンパク質をコードするファージ遺伝子に挿入され、Ｖ
Ｈ及びＶＬ配列は繊維状バクテリオファージのコート上に発現（提示）する。関
心とするＶＨ及びＶＬ領域を発現するファージは一般にはパンニング法と呼ばれ
るアフィニティー選択法によって選別される。

【００４８】 ＶＨ及びＶＬ配列は、Ｂ−細胞を分泌する抗体からｍＲＮＡを単離し、免疫グ
ロブリン遺伝子の保存領域に対するプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲによって上
記ｍＲＮＡを増幅するという方法で作製される。ｍＲＮＡは動物、好ましくは関
心とする抗原で免疫された動物から、または関心とする抗原に対する抗体を産生
するハイブリドーマ細胞から直接得られるＢ−細胞から得ることができる。得ら
れたならば、そのＶＨ及びＶＬｃＤＮＡをＶＨ及びＶＬ配列の同一ベクターへの
逐次クローニングによって（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６巻：１２７５
−１２８１ページ、１９８９）、バクテリオファージＰＩのｌｏｘＣｒｅ部位特
異的組換え系を用いる組合わせ感染によって（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃ
．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２１巻：２２６５−２２６６ページ、１９９３）、ま
たはＰＣＲアセンブリーによって（Ｃｒａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２
巻；６２４−６２８ページ、１９９１；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏ
ｌ．２２２巻：５８１−５９７ページ、１９９１）組み換えられる。或いは、例
えばＧｒｉｆｆｉｔｈｓら（ＥＭＢＯ Ｊ．、１３巻：３２４５−３２６０ペー
ジ、１９９４）が記載したように、可変部配列の合成レパートリーを用いること
ができる。

【００４９】 ひとたびファージディスプレーライブラリーを構成したならば、反応性抗体を
表現するファージをパンニングによって選択する。一般的には精製抗原をプラス
チック表面またはアフィニティークロマトグラフィーカラムのような固体基質に
付着させる。上記抗原は上記表面に直接、またはストレプトアビジン／ビオチン
系等の中間体を介して結合させることができる。選択すべきファージを抗原と共
にインキュベートし、結合しないファージは洗い流す。選択の一ラウンドで特異
的ファージが２０ないし１０００倍豊富になる。一般的には数ラウンドの選択が
行われ、特異性及び親和性を高める。ひとたび所望特性の抗体を表現するファー
ジが確認されたなら、それらを適切な細菌宿主中で増やし、上記抗体をコードす
るＤＮＡを単離し、そのＤＮＡの配列決定を行う。その抗原配列をその後適切な
宿主細胞に挿入して発現させることができる。原核細胞、低級真核細胞及び真核
細胞からの抗体を大規模生産する方法は当業者には周知であり、例えばＦｒｅｎ
ｋｅｎら（Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９巻：５８９−５９９ページ、１９９
８）及びそこに記載の参考文献に見いだされる。

【００５０】 これらに代わって、上記のヒト化抗体を含むキメラ抗体を用いることができる
。キメラ抗体とは、免疫グロブリン分子の異なる領域が異なるソースに由来する
抗体である。一般的にはキメラ抗体はマウス可変部と、ヒト由来の定常部とを含
む。キメラ抗体の産生は当業者には日常的となり、抗体−抗原相互作用の深い構
造知識を何ら必要としない（Ｗａｔｋｉｎｓ及びＯｕｗｅｈａｎｄ、Ｖｏｘ Ｓ
ａｎｇｕｉｎｉｓ、７８巻：７２−７９ページ、２０００）。キメラ抗体のもう
一つの形は、“ＣＤＲグラフティング”として知られる方法によって産生できる
（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２−５２５ページ、１９８６）
。ＣＤＲは免疫グロブリンのひだとして知られる構造の逆平行β−プリーツシー
ツ間の頂点のループである。上記β−プリーツシーツは抗原との相互作用のため
にＣＤＲを正しく方向づけるためのフレームワークを形成する。ＣＤＲグラフテ
ィングにおいて、特異抗体のマウスＣＤＲを適したβ−プリーツシーツのフレー
ムワークに移植する。

【００５１】 さらに、抗体類をトランスジェニック動物、特にトランスジェニックマウスか
ら得ることができる（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ及びＴａｕｓｓｉｇ、Ｃｕｒｒ．Ｏ
ｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８巻：４５５−４５８ページ、１９９７）。
この方法で、内因性マウス免疫グロブリン遺伝子を不活性化し、ヒトからの再配
列していない免疫グロブリン配列で置換する。こうして上記の方法を用いてトラ
ンスジェニックマウスからモノクローナル抗体が産生される。

【００５２】 ひとたびＦＨＲ−５または実質的にこれと同一のタンパク質に対する抗体が作
られたならば、二、三の所望活性についてそれらをスクリーニングし得る。本発
明の抗体類の一つの好ましい活性は、活性化補体を選択的に識別する能力である
。ＦＨＲ−５または実質的にこれと同一のタンパク質に対する抗体類をこの活性
に関してスクリーニングするには、先ず最初に、実施例２．３のモルモット赤血
球に生成したような活性化補体とそれらとの反応性を試験する。上記スクリーニ
ングは実施例２．４に記載のように例えばＥＬＩＳＡまたはウェスターンブロッ
ト法によって実施できる。その後活性化補体と反応するモノコローナル抗体類に
ついて、その他の補体タンパク質（Ｃ３、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９）及び
正常ヒト血清との交差反応性を実施例１．６に記載したようにウェスターンブロ
ットまたはＥＬＩＳＡによってスクリーニングする。その他の補体コンポーネン
トまたは正常ヒト血清と交差反応しない抗体類を放射性核種、発蛍光団または蛍
光色素、酵素、ビタミン、ステロイドまたはその他の検出可能部分に結合し、種
々の生検組織、またはその他の生物学的分離物中の活性化補体を確認するために
用いることができる。このような確認のためにこれらの抗体を使用する、ＥＬＩ
ＳＡ及び蛍光顕微鏡法等を含む数種の免疫組織化学的方法は当業者には公知であ
る。このような方法に関するより詳細な説明はＡｌａｎ Ｊｏｈｎｓｔｏｎ及び
Ｒｏｂｉｎ Ｔｈｏｒｐｅ編“Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ Ｐｒａ
ｃｔｉｃｅ”、１９９６、及びＭａｒｇａｒｅｔ Ｍ．Ｍａｎｓｏｎ編“Ｉｍｍ
ｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”、１９９２に見いだされる。

【００５３】 本発明の抗体類のその他の好ましい活性は、ＦＨＲ−５が活性化補体と結合す
るために必要なＦＨＲ−５の生化学的機能を阻止する能力である。抗体類はかな
り大きいかさばった分子であるから、それらが、生物分子の正しい生物学的機能
のために必要な生物分子ドメインの近くのエピトープに結合する際、その生物分
子の正常機能を立体的に妨げる傾向があることは当該分野において周知である。
例えばタンパク質に結合したときにそのタンパク質が活性化補体と結合するため
に必要な生化学的機能を阻害する、ＦＨＲ−５または実質的にこれと同一のタン
パク質に対する抗体類を産生することができる。この特殊の活性を有する抗体Ｆ
ＨＲ−５または実質的にこれと同一なタンパク質は、活性化補体とＦＨＲ−５と
の結合の阻害をスクリーニングすることによって確認できる。スクリーニングプ
ロセスの第一段階はＥＬＩＳＡまたはその他のイムノアッセイ技術によって、よ
り好ましくは上記のように産生したポリクローナル抗体を用いることによって、
正常ヒト血清中のＦＨＲ−５濃度を測定することである。正常ヒト血清試薬ロッ
ト中のＦＨＲ−５濃度を測定した後、候補となる抗体の化学量論的に意味のある
量をそのロットの一つの血清サンプルに加える。抗体を含まない別の血清サンプ
ルを対照として用いる。実施例２．３に記載される方法により、両血清サンプル
を用いて補体溶解（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｌｙｓｅｄ）モルモット赤血球を生
成する。その後溶解赤血球をＫ２．２５４をプローブとして実施例２．４に示す
ようにウェスターンブロット法によって分析することができる。候補サンプルが
生成したモルモット赤血球のＫ２．２５４との反応性を対照と比較した際にみら
れる減少は、より少ないＦＨＲ−５が活性化補体と結合したこと、及びその抗体
が所望活性を有することを示唆する。

【００５４】 本発明は、本発明の実質的に精製された配列とその他の諸配列とを含んでなる
組換えポリヌクレオチドも含む。このような組換えポリヌクレオチドは一般にク
ローニングベクターまたは発現ベクターとして使用される。ただしそれ以外の用
途も可能である。組換えポリヌクレオチドは、異なる生物のポリヌクレオチド配
列が一緒になって単一単位を形成しているものである。クローニングベクターは
ＤＮＡセグメントを宿主細胞に移すために役立つ自己複製ＤＮＡ分子である。ク
ローニングベクターの最も一般的な三つのタイプは、細菌プラスミド、ファージ
、及びその他のウィルス類である。発現ベクターは特定部位に挿入されたコード
配列が転写され、タンパク質に翻訳されるように設計されたクローニングベクタ
ーである。

【００５５】 クローニングベクター及び発現ベクターは両方とも、一つ以上の適切な宿主細
胞内でそれらベクターを複製させるヌクレオチド配列を含む。クローニングベク
ターにおいて、この配列は概して、宿主細胞の染色体には無関係にそのベクター
を複製させる配列であり、複製開始点（ｏｒｉ領域）かまたは自己複製配列も含
む。種々の細菌及びウィルス複製開始点は当業者には周知であり、非制限的に、
ｐＢＲ３２２プラスミドオリジン、２μプラスミドオリジン、及びＳＶ４０、ポ
リオーマ、アデノウィルス、ＶＳＶ及びＢＰＶウィルスオリジンがある。

【００５６】 本発明のポリヌクレオチド配列を用いて、これらの配列を含む組換え発現ベク
ターの使用により、タンパク質を生産することができる。適切な発現ベクターに
は染色体、非染色体及び合成ＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０誘導体等；細菌プラス
ミド；ファージＤＮＡ；バキュロウィルス；酵母プラスミド；プラスミド及びフ
ァージＤＮＡの組合わせから誘導されるベクター類；及びワクシニア、アデノウ
ィルス、鶏痘ウィルス、シュードラビー（ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ）のような
ウィルスＤＮＡがある。さらに、宿主中で複製でき、生育可能であれば、いかな
る他のベクターも使用できる。

【００５７】 関心とするヌクレオチド配列は種々の方法によってベクター内に挿入できる。
最も一般的な方法において、上記配列を適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（１
または複数部位）に挿入する。その際当業者には一般的に知られており、例えば
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２版、コールドスプリング・ハーバー・プレス（１９
８９）及びＡｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２版、ジョンウィリー＆ソンズ（１９９２）に
詳述されている方法が用いられる。

【００５８】 発現ベクターにおいて、関心とする配列を宿主細胞によって識別される適切な
発現コントロール配列またはプロモーターに操作可能に結合させ、ｍＲＮＡ合成
に向ける。プロモーターは、そのコントロール下で核酸配列の転写及び翻訳を調
節する構造遺伝子の開始コドンから上流約１００ないし１０００塩基対（ｂｐ）
に位置する翻訳されない配列である。プロモーターは概ね誘導性かまたは構成性
として分類される。誘導性プロモーターはそのコントロール下で何らかの環境変
化、例えば栄養のあるなしまたは温度変化等に反応してＤＮＡからの転写レベル
の上昇を開始するプロモーターである。これに対し、構成プロモーターは転写レ
ベルを比較的一定に維持する。さらに、有用なプロモーター類は適切な細胞特異
性及び時間特異性も与えることができる。このようなプロモータには発育的に調
節されるプロモーター類、または細胞小器官特異的、組織特異的、または細胞特
異的なプロモーター類が含まれる。

【００５９】 核酸配列は、その他の核酸配列と機能的関係に置かれたときは操作可能に結合
する。例えばプレシーケンス（ｐｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）や分泌リーダー（ｌｅ
ａｄｅｒ）のためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレプロテ
インとして発現される場合、ポリペプチドのためのＤＮＡに操作可能に結合する
；プロモーターは、コード配列の転写に影響を与える場合は、そのコード配列に
操作可能に結合する；またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするよ
うな位置に置かれると、コード配列に操作可能に結合する。概して、操作可能に
結合する配列は隣接しており、分泌リーダーの場合は隣接して、リーディング相
（ｒｅａｄｉｎｇ ｐｈａｓｅ）にある。制限酵素部位の結紮によって連結が行
われる。もしも適切な制限部位が与えられないならば、当業者に公知のように、
合成オリゴヌクレオチド アダプターまたはリンカーを用いることができる。Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２版、コールドスプリング・ハーバー・プレス（１９８
９）及びＡｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２版、ジョンウィリー＆ソンズ（１９９２）。

【００６０】 発現ベクターに用いられる一般的プロモーター類には、非制限的に、ＬＴＲま
たはＳＶ４０プロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃまたはｔｒｐプロモ
ーター、及びファージ ラムダＰＬプロモーターがある。原核または真核細胞の
遺伝子の発現をコントロールすることが知られているその他のプロモーターを用
いることができ、これらは当業者には公知である。発現ベクターは翻訳開始のた
めのリボソーム結合部位、及び転写ターミネーターも含むことができる。ベクタ
ーは遺伝子発現の増幅のために役立つ配列も含むことができる。

【００６１】 発現ベクター及びクローニングベクターは選択遺伝子または選択マーカーを含
むことができ、これらを含むのが普通である。一般的にはこの遺伝子は、上記ベ
クターで形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコード
する。適切なマーカーの例としては、ジヒドロフォレート還元酵素（ＤＨＦＲ）
、または真核細胞のためにはネオマイシン耐性、大腸菌のためにはテトラサイク
リンまたはアンピシリン耐性がある。

【００６２】 それに加えて発現ベクターは、マーカーとして使用する付加的タンパク質をコ
ードする、タンパク質のためのヌクレオチド配列に、操作可能に結合するマーカ
ー配列も含むことができる。その結果は二つの結合した異なるタンパク質を含む
ハイブリッドまたは融合タンパク質である。マーカータンパク質は例えば発現ベ
クターによって生産される組換えタンパク質のための免疫学的または酵素マーカ
ーを提供できる。アフィニティークロマトグラフィーによって生成するタンパク
質の精製のために有用なアミノ酸配列をコードする配列をポリヌクレオチド末端
に付加することによってポリヌクレオチド末端を変化させることができる。この
ようなアフィニティー精製部分をタンパク質に付加するための種々の方法が考案
された。代表的例は米国特許第４，７０３，００４号、同第４，７８２，１３７
号、同第４，８４５，３４１号、同第５，９３５，８２４号及び同第５，５９４
，１１５号に見いだすことができる。精製部分をコードするヌクレオチド配列の
付加のための当業者に公知のいかなる方法も用いることができる。これらの方法
は例えばＩｎｎｉｓら、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、アカデミック・プレス（
１９９０）及びＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、２
版、コールドスプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（１９８９）に含ま
れる。

【００６３】 より詳細に述べれば、本発明は本発明の分離されたポリヌクレオチド配列を含
んでなる組換え構成物を含む。上記構成物としては、本発明の配列が順方向（ｆ
ｏｒｗａｒｄ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）または逆方向（ｒｅｖｅｒｓｅ ｏｒ
ｉｅｎｔａｔｉｏｎ）に挿入されたプラスミドまたはウィルスベクター等のベク
ターがある。上記組換え構成物は、例えば上記配列に操作可能に結合したプロモ
ーター等の調節配列をさらに含む。適切なベクター及びプロモーターの多数が当
業者には公知であり、商業的に販売されている。

【００６４】 本発明のポリヌクレオチド配列は、５’から３’の方向に操作可能に結合した
少なくともプロモーター、本発明のポリヌクレオチド、及び宿主細胞内で機能す
る転写終止シグナル配列を含む発現カセットの一部でもある。プロモーターは本
明細書中に述べるタイプのいずれでもよい；例えば組織特異的プロモーター、発
達的調節プロモーター、細胞小器官特異的プロモーター等である。発現カセット
は操作可能に結合するターゲティング配列、産生したタンパク質の輸送を指向で
きる輸送ペプチドまたは分泌ペプチドコード領域をさらに含むことができる。発
現カセットはさらに、選択性マーカーをコードするヌクレオチド配列、及び精製
部分も含むことができる。

【００６５】 本発明のその他の実施形態は本発明のポリヌクレオチド配列を含んでなる構成
物を含む形質転換宿主細胞に関係する。上記宿主細胞は哺乳動物細胞等のより高
次の真核細胞、または昆虫細胞または酵母細胞のようなより低次の真核細胞でも
よく、または宿主は細菌細菌のような原核細胞でもよい。構成物の宿主細胞への
導入は、燐酸カルシウム トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介
性トランスフェクション、ポリブレン仲介性トランスフェクション、プロトブラ
スト融合、リポソーム仲介性トランスフェクション、核への直接微量注入法、微
粒子銃（遺伝子銃）デバイス、スクレイプローディング、及びエレクトロポレー
ション等、種々の方法によって達成される。

【００６６】 （実施例） 下記の実施例は本発明の出願の説明となるものである。下記の実施例は本発明
の範囲を完全に明確にするものではなく、制限するものでもない。

【００６７】 （実施例１） （モノクローナル抗体Ｋ２．２５４の産生） （１．１ ヒト糸球体の分離及び調製） Ｋ２．２５４モノクローナル抗体の産生は既に記載されている（Ｍｕｒｐｈｙ
及びｄ’Ａｐｉｃｅ“Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ”２０巻：１３０−１３６ページ、１
９８８）。末期腎不全以外の原因で死亡した糸球体腎炎患者２名から死後の腎臓
を得た。腎皮質の部分をその後の免疫組織学的研究のためにパラホルムアルデヒ
ド−リジン過ヨウ素酸塩（ＰＬＰ）もしくは水銀ホルマリンに固定し、または新
鮮なまま凍結し、皮質の残りをその後のマウス免疫のために凍結した。新鮮組織
の凍結切片４μｍをヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ及びＣ３に対する蛍光標識抗体
で染色し、免疫蛍光顕微鏡で検査した。さらに水銀ホルマリン固定組織の切片を
光顕微鏡検査のために処理した。

【００６８】 各々の死後腎臓からの糸球体基底膜（ＧＢＭ）をさいの目に切り、２５０μｍ
篩を加圧濾過して通し、冷０．１Ｍ燐酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で１８０μ
ｍ篩を通しながら洗い、１０６μｍ篩上に糸球体を集めた。糸球体懸濁液を位相
差顕微鏡によって検査し、細管フラグメントの混入が２０％より大きい場合には
再び篩を通した。糸球体をＰＢＳで４℃で２回洗い、ＰＢＳに１２，５００／ｍ
ｌ濃度で再懸濁した。

【００６９】 糸球体懸濁液の半分をそれからブランソン超音波装置でマイクロチップ及び出
力６を用いて超音波処理した。糸球体の９０％以上の破壊には３回、２０秒間の
バースト（各バースト間に氷水で１分間冷却）で十分であることが判明した。こ
の方法がＧＢＭの諸成分を損傷し、予想通りＧＢＭに付着した免疫デポジットの
諸成分を剥離したり破壊し得ることが判明したため、最小の超音波処理が必要で
あると考えられた。超音波処理後、その懸濁液を１，５００ｇで遠心分離し、Ｐ
ＢＳで２回洗った。

【００７０】 （１．２ マウスの免疫） 糸球体懸濁液をほぼ同容量のフロインド完全アジュバントと共に乳化し、齢５
ないし６週の Ｂａｌｂ Ｃ マウスに上記乳濁液を０．８ｍｌ（約５，０００
糸球体）づつ皮内注射した。ＧＢＭ懸濁液も同様に等量のフロインド完全アジュ
バントと共に（懸濁液０．８ｍｌが５，０００糸球体の等価量を含むようにした
）乳化し、その他のマウスに皮内注射した。２１日後、不完全アジュバントを使
用した同じ乳濁液を用いて注射を繰り返した。各マウスはどちらの場合も同じ腎
臓から採取した腎組織の注射を受けた。さらに１４日後、全てのマウスはＰＢＳ
中適切なＧＢＭ製剤の腹腔内注射（約３，０００糸球体の等価量を含む）を受け
た。

【００７１】 （１．３ 免疫マウスの抗ＨＳＡ抗体の測定） 腹腔内注射（融合３日前）の前に全てのマウスにおいて目から血を取った。マ
ウス血清の逓減希釈物を１％アガロース中のｃａｒｉｏｎｉｃ及び固有ヒト血清
アルブミン（ＨＳＡ）に対する放射免疫拡散によって試験した。実施例１．６に
記載のように酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によってマウス血清の抗−
ＨＳＡ抗体の定量的推定も行った。

【００７２】 （１．４ 融合） 融合技術はＯｉ及びＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇの方法（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｍｉｓｈｅｌｌ及
びＳｈｉｉｇｉ編、Ｆｒｅｅｍａｎ、３５１−３７２ページ、１９８０）から採
用した。ＧＢＭの腹腔内注射の３日後にポリエチレングリコールの５０％（ｗ／
ｖ）溶液の存在のもとでマウス脾臓と１０⁷ＳＰ２／０骨髄腫細胞とを融合させ
た。融合混合物をＨＡＴ培地（グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、
ピルビン酸Ｎａ、ＨＥＰＥＳ緩衝液を含むＲＰＭＩ、及びヒポキサンチン、アミ
ノプテリン及びチミジンを付加した１５％ウシ胎児血清）に再懸濁し、あらかじ
めマウス胸腺フィーダー細胞を植え付けた３枚の９６ウェル−ミクロタイタート
レー上にプレーティングした。各ウェルからの上澄液をサンプルとして取り、マ
ウス免疫グロブリンの存在をＥＬＩＳＡ法によって試験した。

【００７３】 （１．５ 上澄液のスクリーニング） １０日目に全てのウェルについてマウス免疫グロブリンの産生をＥＬＩＳＡに
よって試験した。マウス免疫グロブリンを産生しているウェルは２日後に再サン
プリングし、ＨＳＡに対する活性をＥＬＩＳＡによって試験した。抗ＨＳＡ活性
を有するウェルからのハイブリドーマをより大きいウェルに取り、マウス胸腺フ
ィーダー細胞を用い、９６ウェル−ミクロタイタートレーにおける希釈を制限す
ることによってクローン化した。４８時間後に陽性ウェルを再サンプリングし、
免疫組織学的試験を次のように行った： 免疫のために用いた腎臓及び正常腎から採取したＰＬＰ固定皮質の３μｍ凍結
切片をスライド上に互いに隣接するように置いた。それらの切片をハイブリドー
マ上澄液と共にインキュベートし、それから４層イムノペルオキシダーゼ法によ
って染色した。正常腎と免疫腎の両方で同様に反応する抗体を産生するハイブリ
ドーマは棄てた。免疫腎の糸球体免疫デポジットに対して明らかに優先的に反応
する抗体を産生するハイブリドーマをクローン化した。

【００７４】 （１．６ “免疫デポジット反応性”モノクローナル抗体の組織学的反応性及
び特徴） 免疫腎の切片をさらに最終的クローン化モノクローナル抗体の各々を用いてイ
ムノペルオキシダーゼによって試験し、糸球体及び糸球体外反応性のパターンを
調べ、記載した。

【００７５】 ミクロタイタープレートをＰＢＳ中の抗原と共に４℃でプレインキュベートし
、０．５％ツイーン２０（ビオ・ラド・ラボラトリーズ、ヘラクレス、ＣＡ、Ｕ
ＳＡ）を含むＰＢＳで洗い、続いてＭＡｂ上澄液、マウスＩｇＧ及びＩｇＭに対
するアルカリホスファターゼ結合抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒ
ｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）及
び基質、ｐ−ニトロフェニル燐酸（シグマケミカル、セントルイス、ＭＯ、ＵＳ
Ａ）と共にインキュベートした。ティトレテク（Ｔｉｔｒｅｔｅｋ）マルチ−ス
キャン プレート リーダーを用いて４０５ｎｍでプレートを読んだ。使用した
抗原は精製ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭ、精製ヒト補体コンポーネント（Ｃ３
、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９）及び溶解赤血球から抽出した補体（ＭＡＣ）
の精製膜攻撃複合体であった。

【００７６】 正常ヒト血清が抗原であったＥＬＩＳＡ研究では、二次抗体はマウス免疫グロ
ブリンに対するホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗体（ＤＡＫＯ、デン
マーク）で、基質はｏ−フェニレンジアミンであった。プレートを４８５ｎｍで
読んだ。

【００７７】 精製ＭＡＣ及び精製補体コンポーネント類をドデシル硫酸ナトリウム−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけた。ビオラド（ＢｉｏＲ
ａｄ）トランスブロットセルを用いてタンパク質をニトロセルロースに移し、ニ
トロセルロース片を、モノクローナル抗体上澄液、その後¹²⁵Ｉ−標識（Ｆａｂ
）₂ヤギ抗マウス免疫グロブリン（ペル−フリーズ（Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚｅ）、
ロジャーズ、ＡＲ、ＵＳＡ）をプローブとして分析した。その他のセルロース片
はヒト補体コンポーネントＣ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８及びＣ９に対する抗血清をプ
ローブとし、その後ヤギ（Ｋｉｒｋｅｇａａｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ）またはウサギ（ＤＡＫＯ、デンマーク）免疫グロブリンに対
する¹²⁵Ｉ−標識抗血清をプローブとして分析した。ニトロセルロース片をその
後オートラジオグラフィーにかけた。

【００７８】 このやり方で産生したモノクローナル抗体から、糸球体免疫デポジットと反応
するが、精製ヒト補体コンポーネント（Ｃ３、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９）
、溶解赤血球または正常ヒト血清から抽出した補体の精製膜攻撃複合体（ＭＡＣ
）とは反応しない一つの候補が見つかった。この抗体、Ｋ２．２５４、をその後
の実験に用い、糸球体免疫デポジットに結合しているコンポーネントを明らかに
した。

【００７９】 （実施例２） （ＦＨＲ−５タンパク質の分離及びそのアミノ酸配列の解明） （２．１ 材料） Ｋ５６２細胞の表面に対するウサギポリクローナル抗原はＰａｕｌ Ｍｏｒｇ
ａｎ教授（Ｃａｒｄｉｆｆ、英国）から提供され、重合ヒトＣ９上のネオ抗原に
対するモノクローナル抗体（Ｗｕ−７−２）はＲｅｉｎｈａｒｄｔ Ｗｕｒｚｎ
ｅｒ博士から提供された（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、７４巻：１３２−１３８ペー
ジ、１９９１）。ヒトＣ９に対するモノクローナル抗体（Ｋ２．３２２）及びア
イソタイプ対合（ｉｓｏｔｙｐｅ ｍａｔｃｈｅｄ）対照モノクローナル抗体（
Ｋ１．４３１）は前記のようにして産生した。ＦＩＴＣ結合ヒツジ抗ヒトアルブ
ミン抗体はシレナス（Ｓｉｌｅｎｕｓ）、オーストラリア、から入手した。使用
した二次抗体はＦＩＴＣ結合ウサギ抗マウス免疫グロブリン（ＤＡＫＯ、カルピ
ンテリア、ＣＡ、ＵＳＡ）、¹²⁵Ｉで標識した（Ｗｕｒｚｎｅｒら、Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ、７４巻：１３２−１３８ページ、１９９１）ウサギ抗マウス及びロ
バ抗ヤギ免疫グロブリン（Ｋｉｒｋｅｇａａｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ−結合ウサギ抗マウ
ス免疫グロブリン（ＤＡＫＯ）、及びヒツジ抗−蛍光−ＰＯＤ Ｆａｂフラグメ
ント（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｏｎｏｓｔｉｃｓ、マンハイム、ドイツ）であった
。

【００８０】 テトラ−Ｈｉｓモノクローナル抗体（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）を用
い、Ｈｉｓ−タグ化組換えタンパク質発現の検出を行った。

【００８１】 （２．２ Ｍａｂ Ｋ２．２５４とヒト補体攻撃にさらされたＫ５６２細胞と
の反応性の測定） ヒトリンパ芽球細胞株Ｋ５６２をアメリカンタイプカルチャーコレクション（
マナッサス、ＶＡ、ＵＳＡ）から得た。約１００万のＫ５６２細胞を０．１ｍｇ
／ｍｌ抗−Ｋ５６２抗体と共に３７℃で２時間インキュベートし、ＰＢＳで３回
洗い、ＰＢＳで１：２希釈した正常ヒト血清または対照−熱不活性化正常ヒト血
清と共に３７℃で４時間インキュベートした。血清と共にインキュベートした後
、細胞をＰＢＳで３回洗い、その試料を分割し、アミノアルキルシラン（ＡＡＳ
）（シグマ社）で処理した顕微鏡スライド上に延ばし、アセトン中で１０分間固
定し、空気乾燥した。それらのスライドをＫ２．２５４、抗−Ｃ９Ｍａｂ Ｋ２
．３２２、またはアイソタイプ−対合対照モノクローナル抗体Ｋ１．４３１（抗
体は全て１０μｇ／ｍｌで）と共に室温（ＲＴ）で１時間インキュベートし、Ｐ
ＢＳで３回洗った。スライドを最後にウサギＦＩＴＣ−抗マウス−マウス免疫グ
ロブリン（１：２０）中でＲＴで３０分間インキュベートし、さらに３回洗い、
エピフルオレッセンス顕微鏡で検査した。

【００８２】 Ｍａｂ Ｋ２．２５４は未処理Ｋ５６２細胞、抗−Ｋ５６２抗体にさらしたＫ
５６２細胞及び熱不活性化ヒト血清、または新鮮ヒト血清にさらした未感作Ｋ５
６２細胞の表面とは反応しなかった。しかし抗−Ｋ５６２抗体及び新鮮なヒト血
清の両方にさらした後、上記細胞は補体ダメージの形態的証拠をあらわし、Ｃ９
（Ｍａｂ Ｋ２．３２２）及びＫ２．２５４抗原に対する強い細胞表面染色を示
した（図１）。新鮮ヒト血清をモルモットまたはウサギ血清に代えると、Ｋ５６
２細胞は形態的ダメージを示したが、Ｋ２．２５４との細胞表面反応性はなかっ
た。これらのデータは、Ｋ２．２５４のためのエピトープが、補体の活性化によ
ってヒト血清由来抗原上に発現することを示唆する。

【００８３】 （２．３ 補体溶解ヒト及びモルモット赤血球ゴーストの生成） モルモット赤血球（ＧＰＥ）を、新鮮な正常ヒト血清を用いる反応性溶解によ
って直接溶解した。洗浄したＧＰＥを０．９％塩化ナトリウム溶液に１：１０（
ｖ：ｖ）に懸濁し、この試料５ｍｌを正常ヒト血清２０ｍｌと共に３７℃で一晩
インキュベートした。ＧＰＥゴーストが遠心分離によって回収され、これを上澄
液が澄明になるまで生理的食塩液中で３−５回洗った。

【００８４】 ヒト赤血球（ＨＥ）（ＡＢＯ血液型Ａ）を２０％高いタイターのヒト抗−血液
型Ａ血清と共にインキュベートすることによって（２１℃、３０分間）抗体を感
作させた。ＨＥをその後一回洗い、ＧＰＥについて述べたように、正常ヒト血清
と共にインキュベートした。陰性対照赤血球ゴーストを生成するために、洗浄し
たＧＰＥ及びＨＥの１：１０懸濁液５ｍｌを１０ｍｌ蒸留水の添加によって浸透
圧的に溶解し、赤血球ゴーストを回収し、上記のように洗った。

【００８５】 （２．４ ウェスターン ブロッティング） 活性血清から精製した正常ヒト血清、ＳＣ５ｂ−９複合体（Ｗｕｒｚｎｅｒら
、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、７４巻：１３２−１３８ページ、１９９１）、赤血球
ゴースト及びアフィニティー精製Ｋ２．２５４抗原を生成し、７．５％または４
−１６％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動にかけ（Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａ
ｔｕｒｅ、２２７巻：６８０−６８５ページ、１９７０）、Ｂｉｏ−Ｒａｄトラ
ンスブロットセルを用いて（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１
１２巻：１９５−２０３ページ、１９８１）ニトロセルロースに移し（Ｔｒａｎ
ｓ−Ｂｌｏｔ（登録商標）伝達培地、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ヘラクレス、ＣＡ、ＵＳ
Ａ）、ＰＢＳ（燐酸緩衝化生理食塩水）中５％ドライミルクでＲＴで１時間ブロ
ックし、それから適切なモノクローナル及びポリクローナル抗体をプローブとし
て用いた。膜をＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０で５分間５回洗い、その後¹²⁵
Ｉ標識二次抗体またはウサギ抗マウスＨＲＰ（１：１００）と共にＲＴで１時間
インキュベートした。洗浄後、既述のように放射性バンドをオートグラフィーに
よって検出し、ＨＲＰ標識バンドをＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓ
ｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ピア
ース、ロックフォード、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いて検出した。

【００８６】 Ｋ２．２５４によって識別される抗原をさらに分析するために、ヒト血清で溶
解したモルモットまたはヒト赤血球からの膜をウェスターン・イムノブロッティ
ングによって試験した（図２）。Ｋ２．２５４は補体溶解ＨＥ及びＧＰＥ膜（レ
ーン１、２、３）に約６５ｋＤのバンドを確認したが、対照−水溶解膜（レーン
４）には確認しなかった。

【００８７】 正常ヒト血清はＣ９を含んでいた（図３Ａ）が、Ｍａｂ Ｋ２．２５４とは反
応しなかった（図３Ｂ）。上記血清をチモサンで前処理して補体を活性化した後
、二量体Ｃ９が検出され、補体の活性化を示したが、この際もＫ２．２５４との
反応性は認められなかった。同様に精製ＳＣ５ｂ−９のウェスターンブロッティ
ングはＫ２．２５４によって識別される抗原を確認できなかった。

【００８８】 （２．５ Ｋ２．２５４抗原のアフィニティー精製） 補体溶解ＧＰＥゴーストを０．１Ｍ ＰＢＳ中１％ジギトニン（シグマ）５ｍ
ｌで４℃で一晩抽出した。アフィニティークロマトグラフィーはメーカーのイン
ストラクションにより、臭化シアン−活性化セファロース４Ｂの１０ｍｌカラム
（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ、アップザラ、スウェーデン）を用い、そ
れにＫ２．２５４Ｍａｂ ５０ｍｇを加えることによって行った。５ｍｌのジギ
トニン抽出液を上記カラムを通過させ、集めた。その後上記カラムを０．０１％
トリトンＸ−１００を含むＰＢＳ２００容量（ＰＢＳ／トリトン）で洗い、０．
０５Ｍジエチルアミン、ｐＨ１１．５、１０ｍｌで溶出した。サンプルを１Ｍト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）１ｍｌ中に溶出した。各５ｍｌ抽出液をカラムを２
回通し、３サンプルからの溶出液（６通過）を集め、ＰＢＳ／トリトンに対して
広く透析し、それから０．５ｍｌに濃縮した（ＹＭ３０膜及びＣｅｎｔｒｉｃｏ
ｎ３０；アミコン、ビバリー、ＭＡ、ＵＳＡ）。濃縮した溶出液をその後上記の
ようにＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスターン・ブロッティングにかけた。

【００８９】 Ｋ２．２５４とヒト補体−溶解ＧＰＥとの強い反応性により、ジギトニンで抽
出したＧＰＥゴーストを用いて関連タンパク質を抽出し、アフィニティー精製し
た。その際Ｋ２．２５４アフィニティーカラムを用いた。アフィニティー精製し
た材料はウェスターン・ブロット法でＫ２．２５４と反応したが、Ｃ９及びヒト
血清アルブミン（ＨＳＡ）で汚染されており（図４）、さらなる精製が必要であ
った。

【００９０】 （２．６ 逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）） ＨＳＡ及びＣ９からの分離は逆相ＨＰＬＣによって行われた。Ｋ２．２５４と
反応するがヒトＣ９またはＨＳＡとは反応しない物質を含むフラクションを集め
、凍結乾燥し、その後ペプチド配列決定のために用いた。濃縮したアフィニティ
ーカラム溶出液のサンプルを１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で沈殿させ、８０
％エーテル／２０％エタノール溶液で洗い、６Ｍ塩酸グアニジン、０．１Ｍトリ
ス、ｐＨ８．０（ＨＣｌ）＋０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）１００μｌ
に再溶解し、２．１ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ Ｂｒｏｗｎｌｅｅ ＲＰ３００ ７
オングストロームのＣ８カラムを用いるファルマシアＳＭＡＲＴ ＨＰＬＣ装置
で逆相ＨＰＬＣにかけた。（溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ：６０％アセトニ
トリル ０．１％ＴＦＡ、流速１００マイクロリットル／分）。６０分間に０−
１００％Ｂの勾配を用い、ピークを２８０ｎｍにおいてモニターし、手動で集め
た。フラクションをウェスターン・ブロットによって分析し、個々のコンポーネ
ントの溶出を検出し、Ｋ２．２５４結合活性を含むフラクションを集めて凍結乾
燥した。

【００９１】 （２．７ ペプチド配列分析） ＨＰＬＣから得られた凍結乾燥フラクションをＳＤＳサンプル緩衝液で再構成
し、１０％ＳＤＳ ＰＡＧＥ上を移動させた。バンドを切り取り、還元し、ピリ
ジルエチル化し、Ａｃｈｒｏｍｂａｃｔｅｒ Ｌｙｓ−Ｃ エンドプロテイナー
ゼ（ワコー）によるゲル内（ｉｎ−ｇｅｌ）消化を行った（Ｍｉｔｃｈｅｌｈｉ
ｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２巻：２４４７５−２４４７９ページ
、１９９７）。抽出されたペプチド混合物を１ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ、ＳＧＥ３
００ミクロン、５オングストローム、Ｃ１８ ＧＬＴカラムを用いるファルマシ
アＳＭＡＲＴ装置でＨＰＬＣにかけた。（溶媒Ａ：０．１％ＴＥＡ、溶媒Ｂ：６
０％ アセトニトリル ０．０７５％ＴＦＡ、流速４０ミクロリットル／分）。
１５０分間０−１００％Ｂ勾配で行い、２１４、２５４及び２８０ｎｍのピーク
をモニターし、個々のペプチドを手動で集めた。ペプチドの相同性及び質量をＰ
ｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ ＭＡＬＤ
Ｉ質量計で確認し、アミノ酸配列をヒューレットパッカードＧ１０００Ａタンパ
ク質シーケンサーで決定した。ホモロジー検索は、重複しないタンパク質データ
ベース（Ｇｅｎｂａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋ＰＤＢ＋Ｓｐｕｎｄａｔｅ＋ＰＩＲ）と
ＥＳＴデータベースの６翻訳を用いて行った。

【００９２】 ゲル内タンパク質分解及びペプチドのＨＰＬＣ分離後、１３の精製ペプチド配
列が得られた。これらペプチドの全てはタンパク質のＨ因子（ＦＨ）ファミリー
のメンバーに関して若干の相同性を示した。表３はこれらのペプチド配列を示し
、それらが最も強い相同性を示したペプチドを列挙している。

【００９３】 （２．８ ＲＮＡの作製） 肝切除中の一患者から得た一片の正常、非侵潤ヒト肝から全ＲＮＡを抽出した
。その組織をホモジナイズし、ＲＮＡをメーカーのインストラクションによって
ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド
、ＮＹ、ＵＳＡ）で単離した。全ＲＮＡ １０μｇをＤＮａｓｅで処理し、混入
ゲノムＤＮＡを除去し、ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡをオリゴテックス（Ｏｌｉｇｏｔｅ
ｘ）ｍＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）を用いて単離した。

【００９４】 （２．９ ｃＤＮＡ合成及びクローニング） 二本鎖ｃＤＮＡをヒト肝ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ２μｇから、オリゴ（ｄＴ）また
はランダムプライマーのどちらかと、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＮａｓ
ｅＨ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてメーカーのイ
ンストラクションにしたがって合成した。

【００９５】 遺伝子特異的プライマー類（ＧＳＰ−１及びＧＳＰ−２、表２参照）を用いて
、ヒト肝ｃＤＮＡからの最初の生成物を増幅した。ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ熱サイ
クラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ウォータタウン、ＭＡ、ＵＳＡ）中でアニー
リング温度７０℃から６５℃でタッチダウンＰＣＲを４０サイクル行った。３’
及び５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の急速増幅法）（参照：Ｉｎｎｉｓら、ＰＣＲ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、アカデミックプレス、２８−３８ページ、１９９０）を
、ＧＳＰ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＤＮＡポリメラーゼ及びＭａｒａｔｈｏｎ ｃ
ＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、パロアルト
、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて行った。ヒト肝ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡから、ＴＣＡＰ−
Ｆプライマー（表２）及びＭａｒａｔｈｏｎキットと共に供給されたＡＰ１プラ
イマーを用いて、全長ｃＤＮＡを上記のように増幅した。

【００９６】 ＰＣＲ生成物をゲル精製し（Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キット）、ｐＧＥＭ−Ｔ
Ｅａｓｙにクローン化した（Ｐｒｏｍｅｇａ、マジソン、ＷＩ、ＵＳＡ）。オリ
ゴヌクレオチド プライマーはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓで合成され
た。

【００９７】

【表２】 （２．１０ ＤＮＡの作製及び配列決定） プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用
いて細菌培養物から作製した。クローンフラグメントの正確な同定が配列決定、
ＰＣＲ、及び制限酵素分析によって確認された。ＤＮＡ配列決定反応は、オース
トラリア ゲノム研究所（メルボルン、オーストラリア）によってＢＩＧＤＹＥ
Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒ
ｅａｃｔｉｏｎ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシ
ティー、ＣＡ、ＵＳＡ）及び電気泳動を用いて行われた。ｃＤＮＡクローンの両
方の鎖とも、標準ベクタープライマー及び表２に記載されている内プライマー数
種を用いて配列決定された。

【００９８】 ｃＤＮＡ単離のためのプライマーを設計するために、ペプチドとヒトＦＨとの
アラインメントを利用した。ＦＨ遺伝子ファミリーのメンバーが肝臓に発現する
ので、ヒト肝をＲＮＡのソースとして選んだ。２種類の変性プライマー、２５４
−Ｆ１（５’−ＧＧＮＧＡＲＴＧＹＣＡＹＧＴＮＣＣＮＡＴ、配列番号２６）及
び２５４−Ｒ１（５’−ＣＡＲＴＣＮＡＣＹＴＣＮＧＧＲＴＴＣＣＡ、配列番号
２７）を用いて７０９ｂｐ生成物を増幅した。このＰＣＲ生成物の配列決定は、
ヒトＦＨのアミノ酸５４９から７８５までに５５．５％一致する部分的タンパク
質配列をコードする一つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を明らかに
した。導きだ出されたアミノ酸配列はペプチドＨ１１１３、Ｈ１１１４、Ｈ１１
１６及びＨ１１１７との完全な一致を含んでいた（表３）。この新しいタンパク
質はＦＨに似てはいるが同一ではなかったから、それはＨ因子−関連タンパク質
５（ＦＨＲ−５）と命名された。

【００９９】 ３’及び５’ＲＡＣＥをその後行い、それぞれ１０７２ｂｐ及び２２４８ｂｐ
生成物を得た。これらのクローンの配列決定は肝ＲＮＡからの単一全長ＦＨＲ−
５ｃＤＮＡの増幅を可能にした。図５は２８２３ｂｐ ｃＤＮＡを生成するため
のこれらクローンの位置及び重なりを示す。ＰＣＲで発生する誤差の可能性を最
小にするために、少なくとも２回の同一ＰＣＲから生成したクローンから、全配
列を得た。

【０１００】 （２．１１ ノザーン・ブロット分析） 全ＲＮＡ１０μｇまたはポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ１μｇをホルムアルデヒド含有１
％アガロースゲル上で電気泳動にかけ、標準法によって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、２版、コールドスプリング ハーバー
ラボラトリー プレス、１９８９）ナイロン膜ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ
（ＮＥＮ^TM−Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ボストン、ＭＡ、
ＵＳＡ）に移した。ＵＶ Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（登録商標）１８００（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラジョラ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてＲＮＡを膜にクロスリ
ンクさせ、ブロットをＲａｐｉｓ−ｈｙｂ緩衝液（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ、アップザラ、スウェーデン）中で６５℃、１時間プレハイブリダイズし
た。Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ ＤＮＡ標識装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ
）を用いて³²Ｐ−αで標識した特異的プローブとのハイブリダイゼーションを６
５℃で２時間行った。膜を２Ｘ ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ、６５℃、１Ｘ ＳＳ
Ｃ＋０．１％ＳＤＳ、６５℃、そして０．１Ｘ ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ、室温
、で１５分間洗い、フィルターを−７０℃に一晩さらした。

【０１０１】 ヒト肝ＲＮＡのノザーン・ブロットを７０９ｂｐ ＦＨＲ−５ ＰＣＲフラグ
メントをプローブとして分析し、ヒトＦＨ７１１ｂｐ ＰＣＲフラグメントを同
じ領域から増幅した。ＦＨＲ−５フラグメントは推定サイズ３．０キロベースを
有する単一のｍＲＮＡ種にハイブリダイズした（図７）。他のｍＲＮＡ種との交
差反応性はなかった。同じブロットをＦＨプローブを用いて分析した際、２種類
のｍＲＮＡが４．４及び５．０キロベースに見いだされた。このような２種につ
いては既に述べた。上記ＦＨプローブはＦＨＲ−５ｍＲＮＡとはクロス−ハイブ
リダイズせず、特異的ＦＨＲ−５ｍＲＮＡの同定がさらに確認された。

【０１０２】 （２．１２ バキュロウィルス発現のためのプラスミドの構成） 完全ｃＤＮＡ配列は配列番号１に示され、導き出だされたアミノ酸配列は配列
番号２に示される。塩基９４から１８００までのＯＲＦがあり、開始コドンの領
域は翻訳開始のためのコザク（Ｋｏｚａｋ）コンセンサス配列と良く一致してい
る。上記ＯＲＦは１８−アミノ酸シグナル配列と成熟タンパク質の５５１アミノ
酸をコードしていた。上記ＯＲＦに続いて、２７０５−２７１０の位置のコンセ
ンサス ポリアデニル化シグナル及びポリＡ⁺テイル（ｔａｉｌ）を含む１００
０ｂｐの３’非翻訳配列があった。

【０１０３】 成熟ＦＨＲ−５は推定分子量（非グリコシル化）が〜６２，６５０Ｄａであり
、１０８及び３８２の位置に、可能性のある二つのＮ−結合グリコシル化部位を
有する。配列番号２を参照されたい。

【０１０４】 ＦＨＲ−５の分泌型は９つの短いコンセンサスリピート（ＳＣＲ）のドメイン
を含む。各ＳＣＲは４個の特徴的システイン（Ｃ）残基（図９のボックス）及び
その他の保存アミノ酸（図９に整列）を含む。単離された全てのペプチドフラグ
メントは成熟タンパク質とすることができた。

【０１０５】 ＦＨＲ−５のＳＣＲはＦＨファミリーのメンバーに対して種々の相同性をあら
わす（図１０）。ＦＨＲ−５のＳＣＲ１及び２はＦＨＲ−１及びＦＨＲ−２のＳ
ＣＲ１及び２に相同であり、ＳＣＲ３−７はＦＨのＳＣＲ１０−１４にわたって
相同性を示し、ＳＣＲ８及び９はＦＨ及び全てのＦＨＲタンパク質の最後の２Ｓ
ＣＲに対して相同性を示す。ＳＣＲアラインメントの略図が図６に示される。

【０１０６】 １，６７２ｂｐフラグメントを全長（３．０ｋｂ）ｃＤＮＡから、Ｐｆｕ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、マンハイム、ドイツ
）を用いるＰＣＲ（タッチダウン５６℃−５０℃）によって増幅した。前方プラ
イマー（Ｍｌｕ１−Ｆ、表２参照）は、シグナルペプチドをコードする領域の直
ぐ下流をアニールするように設計され、５’末端にＭｌｕ１制限部位を含んでい
た。逆プライマー（Ｓａｌｌ−Ｒ、表２参照）はオープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ）の直ぐ下流をアニーリングし、５’末端にＳａｌｌ制限部位を挿入し
た。ＰＣＲ生成物をＭｌｕ１／Ｓａｌｌで消化し（Ｐｒｏｍｅｇａ、マジソン、
ＷＩ、ＵＳＡ）、ｐＦＡＳＴＢＡＣ１−Ｈｉｓ¹⁰⁺ベクターにクローン化した；
上記ベクターはＭｌｕ１で一部分消化され、ゲル精製され、それからＸｈｏ１で
処理されていた。ｐＦＡＳＴＢＡＣ１の変形物であるｐＦＡＳＴＢＡＣ１−Ｈｉ
ｓ¹⁰⁺（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）はＳＶＩＭＲのＤｒ Ｂｒｅｔ
ｔ Ｃｒｏｍｅｒから好意的に提供された。これは効率的分泌を確実にするｇｐ
６７シグナルペプチドと、検出及び精製のための１０−ヒスチジンＮ−末端エピ
トープタグとをコードする。上記挿入物（ｉｎｓｅｒｔ）及びその結合の完全配
列が配列決定によって確認された。

【０１０７】 （２．１３ 昆虫細胞におけるＦＨＲ−５の組換え発現及び精製） Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウィルス発現システムプロトコル（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の一変法を利用して精製組換えバキュロウィルスを
得た。組換えｐＦａｓｔＢａｃ１−Ｈｉｓ¹⁰⁺ベクターをＤＨ１０Ｂａｃ−コン
ピテント細胞に移入し、ゲンタマイシン、テトラサイクリン及びカナマイシンを
含むＳ．Ｏ．Ｃ．培地４ｍｌ中で一晩培養した。プラークアッセイ分析の必要な
しに純粋な組換えウィルス種を得るために、組換えＢａｃｍｉｄ ＤＮＡを上記
のように分離し、エレクトロポレーション（２．５ｋｖｏｌｔ、２５μＦＤ、２
００ｏｈｍ）によってＤＨ１０コンピテント細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ）に導入した。トランスフェクトした細胞を５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドイルβ−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−Ｇａｌ）、イソプロピルβ−Ｄ−チ
オガラクトシド（ＩＰＴＧ）、カナマイシン及びゲンタマイシンを含むルリア（
Ｌｕｒｉａ）寒天プレート上で２４時間培養した。純粋な組換えＢａｃｍｉｄ
ＤＮＡを含むコロニーをブルー／ホワイトスクリーニングによって選択し、全Ｄ
ＮＡを生成し、これを用いてＳｆ９細胞にトランスフェクトした。

【０１０８】 Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞（Ｓｆ９）を、１０％ウシ
胎児血清（ＦＣＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したグレース
（Ｇｒａｃｅ）の昆虫培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバード、ＣＡ、Ｕ
ＳＡ）に２７℃で維持した。細胞はスピナーフラスコ中で懸濁培養として増殖さ
せるか、または組織培養フラスコ中で単層培養として増殖させた。組換え発現プ
ラスミドでトランスフェクションする前に、ＨｙＱ（登録商標）ＳＦＸ−昆虫血
清フリー細胞培養培地（Ｐｒｏｇｅｎ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｑｌｄ、オーストラリ
ア）を用いて細胞を無血清条件に適応させた。

【０１０９】 Ｓｆ９細胞を１０⁶／３５−ｍｍウェルで１回、播種し、メーカーの操作法に
したがってＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウィルス発現系を用いてトランスフェ
クトした。３−４日後に培養上澄液を集め、組換えタンパク質の合成をウェスタ
ーン・ブロット法によって分析した。昆虫細胞培養培地１５μｌを４Ｘ非還元ま
たは４Ｘ還元サンプル緩衝液５μｌに加え、２０μｌサンプルを７．５％ＳＤＳ
−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動し、既述のようにニトロセルロースにトランスフェ
クトした。ブロットをＫ２．２５４または抗−テトラＨｉｓ Ｍａｂ（１：１０
００）（Ｑｉａｇｅｎ）をプローブとして、そして陰性対照として抗ヒトＨ因子
Ｍａｂ（１：１０００）（Ｓｅｒｏｔｅｃ、英国）をプローブとして分析した
。二次抗体はウサギ抗マウス−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ）であった。

【０１１０】 組換えウィルスをトランスフェクションの３日後に培養培地から分離し、ウィ
ルス ストックを確立した。組換えタンパク質の精製のために、４０ｍｌ Ｈｙ
Ｑ培地中の１×１０⁶Ｓｆ９／Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞に精製組換えウィルスを
感染させた。感染４日後、組換えタンパク質をＮｉ²⁺−ＮＴＡアガロース（Ｑｉ
ａｇｅｎ）クロマトグラフィーを用いて既述のように精製した（Ｋｕｈｎ及びＺ
ｉｐｆｅｌ、Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，、２６巻：２３８３−２３８７、
１９９５）そしてウェスターンブロットによって分析した（図８）。

【０１１１】 Ｃ−末端にポリヒスチジンエピトープタグを組み込んだＦＨＲ−５の組換えバ
ージョンをバキュロウィルス発現系を用いて昆虫細胞に発現させた。テトラ−Ｈ
ｉｓ抗体を用いるウェスターンブロット（図８、レーン３）は感染昆虫細胞の細
胞培養培地に６５ｋＤ分子を検出した。還元で、〜９０ｋＤのバンドが見られ（
図８、レーン４）、生成したタンパク質がＳＣＲ含有分子に特徴的な内部ジスル
フィド結合を含むことが確認された。Ｋ２．２５４抗体もウェスターンブロット
法に用い、非還元サンプルに同一バンドを確認した（図８、レーン１）。多分二
量体形成を示唆する、より高次のタンパク質バンドも〜１４０ｋＤａのＭｒに検
出された；ただしこれは抗−Ｈｉｓ抗体では検出されなかった。Ｋ２．２５４で
試験した還元サンプルではバンドは全然見られなかった。これはジスルフィド結
合の還元後には上記エピトープが消失することを示唆している。

【０１１２】

【表３】 関連ペプチドと最も強い相同性を有するタンパク質領域のアミノ酸対応配列を
コラム３に示す。大部分のペプチドがヒトＦＨと高い相同性を示したが、Ｈ１１
１８及びＨ１１１９はＦＨＲ−及びＦＨＲ−２に最も近い関連性を示した。ペプ
チドＨ１１２０及びＨ１１２１はタンパク質のＦＨファミリーに顕著な相同性を
示さなかったが、後にＦＨＲ−５タンパク質に指定された。

【０１１３】 （実施例３） （組換えＦＨＲ−５とのインビトロ結合研究） 組換えＦＨＲ−５またはＨ因子（シグマ）を０．１Ｍカルボネート緩衝液、ｐ
Ｈ９．３で１：２に逓減希釈した。ミクロタイタープレートの二重ウェルを、５
０ｐｍｏｌ／ウェルから０．４ｐｍｏｌ／ウェルまでのＦＨＲ−５またはＨ因子
希釈液と共にインキュベートした。プレートをブロックし、ウェルを１０μｇ／
ウェルのヒトＣ３ｂ、Ｃ５ｂ−６またはＨＳＡと共にインキュベートした。Ｃ３
ｂはポリクローナル ウサギ抗−Ｃ３抗体（１：１０００希釈）とのインキュベ
ーション、その後ペルオキシダーゼ結合ブタ抗ウサギ抗体（１：２０００希釈）
とのインキュベーションによって検出した。Ｃ５ｂ−６及びＨＳＡはそれぞれＫ
１．１１５（抗Ｃ６）及び抗ＨＳＡモノクローナル抗体を用い（１：５００希釈
）、その後ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウス抗体（１：２０００希釈）を用
いて検出した。ＥＬＩＳＡはＯ−フェニレンジアミン二塩酸で発現させた。その
反応を４Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄で停止し、溶液の光学密度をＢｅｈｒｉｎｇ ＥＬ３１ミ
クロプレートリーダーを用い波長４９２ｎｍで測定した。

【０１１４】 結果を図１１に示す。Ｈ因子（パネルＢ、図１１）のように、Ｃ３ｂは用量依
存的及び飽和可能にＦＨＲ−５に結合した（パネルＡ、図１１）。ヒトＣ５ｂ−
６複合体もＨＳＡもＦＨＲ−５またはＨ因子への結合を示さなかった。

【０１１５】 （結論） 本発明の詳細な説明及び上に示した実施例によって、本発明のいくつかの面が
達成されることを認めることができる。

【０１１６】 その他の当業者に本発明、その原理、及びその実際的利用を知らせるために、
本発明を具体的説明及び実施例によって詳細に記載したことが理解されるべきで
ある。本発明の特定の処方及びプロセスは、示される特異的実施形態の記載によ
って制限されるものでなく、むしろ上記の記述及び実施例は添付の特許請求の範
囲及びその同等物に関連して考慮しなければならない。上記の実施例及び記述の
若干は本発明が機能する方法に関する結論を幾つか含むとはいえ、発明者はこれ
らの結論及び機能によって束縛されることは意図せず、それらを可能性のある説
明として提供するに過ぎない。

【０１１７】 示された本発明の特殊な実施形態は本発明を余すところなく網羅しているもの
でも、制限するものでもなく、当業者には前記の実施例及び詳細な説明によって
多くの変更、修正及び変化が可能であることも理解すべきである。よって本発明
は添付の特許請求の範囲の精神及び範囲内に入る全てのこのような変更、修正及
び変化を含むものとする。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、Ｋ５６２Ｍａｂで染色した抗体感受性、正常ヒト血清処理Ｋ５６２細
胞の免疫蛍光を示す図である。細胞を抗−Ｋ５６２ポリクローナル及び正常ヒト
血清と共に徐々にインキュベートし、Ｋ２．２５４及びＦＩＴＣ−標識二次抗体
を用いてＫ２．２５４抗原結合を検出する。倍率、Ｘ４００。

【図２】 図２は、補体−溶解ＨＥ及びＧＰＥからの膜のウェスターン・ブロットを示す
。このブロットをＫ２．２５４Ｍａｂ及び¹²⁵Ｉ標識二次抗体をプローブとして
分析した。〜６７ｋＤのバンド（矢印）がヒト補体溶解ヒト赤血球（レーン１お
よび２）及びモルモット赤血球（レーン３）に検出されたが、浸透圧によって溶
解したヒト赤血球（レーン４）では検出されなかった。

【図３】 図３は、正常（Ｎ）及びチモサン活性化（Ｚ）ヒト血清のウェスターン・ブロ
ットを示す図である。ブロットを抗−ｎａｔｉｖｅ Ｃ９Ｍａｂ Ｋ２．３２２
、Ｋ２．２５４Ｍａｂをプローブとして、または陰性対照として二次¹²⁵Ｉ抗体
のみをプローブとして分析した。Ｍｒマーカータンパク質類のシフトが左に示さ
れる。Ｋ２．３２２（図３Ａ）はＺ及びＮヒト血清両方のモノマーＣ９（矢印）
を検出し、Ｚヒト血清のダイマーＣ９（矢印の頭）を検出し、補体活性化が起き
たことを示した。Ｋ２．２５４（図３Ｂ）は両血清試料で特異的反応性を示さな
い。

【図４】 図４は、補体溶解ＧＰＥから抽出したアフィニティー精製タンパク質のウェス
ターン・ブロットを示す図である。アフィニティー精製試料は、Ｋ２．２５４抗
原（レーン１）の他に混入Ｃ９（レーン２）及びＨＳＡ（レーン３）を含んでい
た。Ｍｒマーカーを左に示す。

【図５】 図５は、ＦＨＲ−５ ｃＤＮＡの概略図である。ＯＲＦはボックス化され、シ
グナルペプチドが斜線を引いていない領域をコードする。ＲＴ−ＰＣＲによって
生成したｃＤＮＡクローンが示される。

【図６】 図６は、ヒトＦＨファミリー内の相同性を示す図である。（Ｚｉｐｆｅｌおよ
びＳｋｅｒｋａ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１５巻：１２１−１２６ページ
、１９９４から採用）。個々のタンパク質のＳＣＲに連続番号をつけた。関連Ｓ
ＣＲは縦の整列によって示され、ギャップは破線であらわされる。明確なＳＣＲ
及びＳＣＲ内の明確な配列は黒色で示され、それらの縦の整列も相同性を示す。
提案の機能性ドメインは水平の棒であらわされる：（Ａ）、衰退加速と補因子活
性；（Ｂ）、Ｃ３ｂ結合；（Ｃ）、ヘパリン結合。ＲＧＤ配列はＦＨ及びＦＨＬ
−１のＳＣＲ４に局在化された。

【図６Ａ】 図６は、ヒトＦＨファミリー内の相同性を示す図である。（Ｚｉｐｆｅｌおよ
びＳｋｅｒｋａ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１５巻：１２１−１２６ページ
、１９９４から採用）。個々のタンパク質のＳＣＲに連続番号をつけた。関連Ｓ
ＣＲは縦の整列によって示され、ギャップは破線であらわされる。明確なＳＣＲ
及びＳＣＲ内の明確な配列は黒色で示され、それらの縦の整列も相同性を示す。
提案の機能性ドメインは水平の棒であらわされる：（Ａ）、衰退加速と補因子活
性；（Ｂ）、Ｃ３ｂ結合；（Ｃ）、ヘパリン結合。ＲＧＤ配列はＦＨ及びＦＨＬ
−１のＳＣＲ４に局在化された。

【図７】 図７は、ヒト肝ＲＮＡに関するノザーン・ブロット分析を示す図である。総細
胞ＲＮＡ及びｍＲＮＡをヒト肝組織から単離した。全ＲＮＡ１０μｇ及びｍＲＮ
Ａ２μｇを変性アガロースゲル上で分離し、ニトロセルロース膜に移した。ＦＨ
Ｒ−５に特異的な³²Ｐ−標識ｃＤＮＡプローブを用い、推定サイズ３．０キロベ
ースのｍＲＮＡ種にハイブリダイズした。同じ膜をはがし、ＦＨに特異的なｃＤ
ＮＡプローブで分析した。このプローブは特徴的な４．４キロベースｍＲＮＡと
より大きい５．０キロベース種を検出したが、３．０ｋｂ種とはクロス−ハイブ
リダイズしなかった。

【図８】 図８は、組換えＦＨＲ−５（ｒＦＨＲ−５）を発現するＳｆ９昆虫細胞からの
培養培地のウェスターン・ブロット分析を示す図である。タンパク質を７．５％
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で非還元条件及び還元条件下で分離し、ニトロセルロー
ス膜に移し、ウェスターン・ブロットを行った。ｒＦＨＲ−５タンパク質の発現
を検出するために、ブロットをＫ２．２５４（レーン１、非還元条件及びレーン
２、還元条件）または抗−Ｔｅｔｒａ−ｈｉｓ 抗体（レーン３、非還元条件及
びレーン４、還元条件）をプローブとして分析した。抗Ｃ９モノクローナル、Ｋ
２．２５４、を陰性対照として用いた。これはレーン５（非還元条件）及びレー
ン６（還元条件）に示される。Ｍｒマーカーが左に示される。

【図９】 図９は、ＦＨＲ−５のＳＣＲ構造を示す図である。これらの配列はＳＣＲ構造
によりそれらの保存アミノ酸に基づいて並べられた。特徴的なシステイン残基は
ボックス内に囲み、保存配列は整列している。

【図１０】 図１０は、ＦＨＲ−５のＳＣＲとその他のファミリーメンバーとを整列させた
図である。同一アミノ酸は点（ｄｏｔ）によって示される。個々のラインはＦＨ
Ｒ−５のＳＣＲ及び４０％より大きい相同性を示すＦＨファミリーのＳＣＲをあ
らわす。

【図１１Ａ】 図１１は、組換えＦＨＲ−５のインビトロ結合を示す図である。Ｃ３ｂ、Ｃ５
ｂ−６及びＨＳＡの、組換えＦＨＲ−５（パネルＡ）またはＨ因子（パネルＢ）
への結合をＥＬＩＳＡによって明らかにした。

【図１１Ｂ】 図１１は、組換えＦＨＲ−５のインビトロ結合を示す図である。Ｃ３ｂ、Ｃ５
ｂ−６及びＨＳＡの、組換えＦＨＲ−５（パネルＡ）またはＨ因子（パネルＢ）
への結合をＥＬＩＳＡによって明らかにした。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 7/00 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｙ 7/00 33/577 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA44 BA61 BA80 CA04 CA07 CA09 CA12 CA20 DA01 DA02 DA05 DA06 DA12 DA20 EA02 FA02 FA07 GA11 GA14 GA18 HA03 HA13 HA14 HA15 4B064 AG27 CA01 CA10 CA19 CA20 CC01 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA58X AA72X AA90X AA93Y AA98X AB01 AC14 BA02 BB01 BC03 CA24 CA44 CA46 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA76 DA86 EA20 EA50 FA71 FA72 FA74 GA26

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 実質的に精製されたＨ因子関連タンパク質５であって、 （ａ）配列番号２； （ｂ）配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
   ； からなる群から選択される一次アミノ酸配列を含む、実質的に精製されたＨ因子
   関連タンパク質５。
2. 【請求項２】 配列番号２のフラグメントを含んでなる実質的に精製された
   Ｈ因子関連タンパク質５フラグメントであって、該フラグメントは補体コンポー
   ネントＣ３ｂに結合し、活性化補体と結合した場合にはモノクローナル抗体Ｋ２
   ．２５４によって識別される、実質的に精製されたＨ因子関連タンパク質５フラ
   グメント。
3. 【請求項３】 下記の群から選択される核酸配列を含む実質的に単離された
   ポリヌクレオチド： （ａ）配列番号２をコードする核酸配列； （ｂ）配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
   をコードする核酸配列； （ｃ）配列番号２のフラグメントをコードする核酸配列であって、該フラグメン
   トは補体コンポーネントＣ３ｂに結合し、活性化補体と結合した場合にはモノク
   ローナル抗体Ｋ２．２５４によって識別される、核酸配列； （ｄ）配列番号１またはその補体； （ｅ）配列番号３またはその補体； （ｆ）洗浄条件０．１Ｘ ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳ、４２℃、のもとで（ａ
   ）の核酸配列にハイブリダイズし、そして補体コンポーネントＣ３ｂに結合し、
   活性化補体と結合した場合にはモノクローナル抗体Ｋ２．２５４によって識別さ
   れるタンパク質をコードする、核酸配列； （ｇ）洗浄条件０．１Ｘ ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、４２℃のもとで（ａ）の
   核酸配列にハイブリダイズする少なくとも２０ヌクレオチドの核酸配列； （ｈ）洗浄条件０．１Ｘ ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、４２℃のもとで（ｂ）の
   核酸配列にハイブリダイズし、そして補体コンポーネントＣ３ｂに結合し、活性
   化補体に結合した場合にはモノクローナル抗体Ｋ２．２５４によって識別される
   タンパク質をコードする、核酸配列；及び （ｉ）洗浄条件０．１Ｘ ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、４２℃のもとで（ｂ）の
   核酸配列にハイブリダイズする少なくとも２０ヌクレオチドの核酸配列。
4. 【請求項４】 請求項３のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
5. 【請求項５】 前記ベクターがクローニングベクターである請求項４に記載
   の組換えベクター。
6. 【請求項６】 前記ベクターが発現ベクターである請求項４に記載の組換え
   ベクター。
7. 【請求項７】 プロモーター、請求項３に記載のポリヌクレオチド、及び転
   写終止配列を含んでなる発現カセット。
8. 【請求項８】 請求項４のベクターを含む宿主細胞。
9. 【請求項９】 前記宿主細胞が細菌細胞、バクテリオファージ、酵母細胞、
   昆虫細胞、植物細胞、及び動物細胞からなる群から選択される請求項８に記載の
   宿主細胞。
10. 【請求項１０】 請求項７の発現カセットを含む宿主細胞。
11. 【請求項１１】 前記宿主細胞が細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞
    、及び動物細胞からなる群から選択される請求項１０に記載の宿主細胞。
12. 【請求項１２】 請求項１のＨ因子関連タンパク質５に特異的に結合する抗
    体であって、モノクローナル抗体Ｋ２．２５４ではない、抗体。
13. 【請求項１３】 前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項１２に記載
    の抗体。
14. 【請求項１４】 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１２に記載
    の抗体。
15. 【請求項１５】 前記抗体が組換え抗体である、請求項１２に記載の抗体。
16. 【請求項１６】 前記抗体がキメラ抗体である、請求項１５に記載の抗体。
17. 【請求項１７】 前記抗体がヒト化抗体である、請求項１６に記載の抗体。
18. 【請求項１８】 前記抗体が免疫学的に活性な抗体フラグメントである、請
    求項１２に記載の抗体。
19. 【請求項１９】 Ｈ因子関連タンパク質５が活性化補体と結合した場合、前
    記抗体がＨ因子関連タンパク質５に結合する、請求項１２に記載の抗体。
20. 【請求項２０】 請求項２に記載のＨ因子関連タンパク質５フラグメントに
    特異的に結合する抗体であって、モノクローナル抗体Ｋ２．２５４ではない抗体
    。
21. 【請求項２１】 前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項２０に記載
    の抗体。
22. 【請求項２２】 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２０に記載
    の抗体。
23. 【請求項２３】 前記抗体が組換え抗体である、請求項２０に記載の抗体。
24. 【請求項２４】 前記抗体がキメラ抗体である、請求項２３に記載の抗体。
25. 【請求項２５】 前記抗体がヒト化抗体である、請求項２４に記載の抗体。
26. 【請求項２６】 前記抗体が免疫学的に活性な抗体フラグメントである、請
    求項２０に記載の抗体。
27. 【請求項２７】 前記Ｈ因子−関連タンパク質５フラグメントが活性化補体
    に結合した場合、前記抗体が該Ｈ因子−関連タンパク質５フラグメントに結合す
    る、請求項１２に記載の抗体。
28. 【請求項２８】 前記Ｈ因子−関連タンパク質５フラグメントが活性化補体
    と結合した場合、前記抗体が該Ｈ因子−関連タンパク質５フラグメントに結合す
    る、請求項２０に記載の抗体。
29. 【請求項２９】 細胞または組織を請求項１２に記載の抗体と接触させる工
    程、および該抗体の該細胞または組織に対する結合を検出する工程を含む、Ｃ５
    ｂ−９補体複合体の検出法。
30. 【請求項３０】 細胞または組織を請求項２０に記載の抗体と接触させる工
    程、および該抗体の該細胞または組織に対する結合を検出する工程を含む、Ｃ５
    ｂ−９補体複合体の検出法。