JP2001275681A - アポトーシス関連蛋白質、その抗体及びそのｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規なアポトーシス関連蛋白質を提供するこ
と。 【解決手段】 本発明のアポトーシス関連蛋白質ＡＳＣ
は、１９５のアミノ酸配列を有するものであり、ピリン
様ドメインとＣＡＲＤとを有している。ＡＳＣは、本
来、サイトゾルに存在し、トリトンＸ−１００を含む緩
衝液に可溶な蛋白質であるが、レチノイン酸や抗癌剤の
誘発によるアポトーシスに伴い、トリトンＸ−１００を
含む緩衝液に不溶化し、凝集を起こす。また、ＡＳＣ
は、自らアポトーシスを誘発する作用はないが、他の因
子によって誘発されるアポトーシスを促進する作用を有
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、細胞のアポトーシ
スを促進する作用を有するアポトーシス関連蛋白質、そ
の抗体及びそのＤＮＡに関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】カー
（Kerr）らによって初めて、アポトーシスによる細胞死
は、生物の成長と発達を制御する遺伝的にプログラムさ
れた重要な過程であると提唱された。アポトーシスによ
る細胞死は、正常組織や新生組織の成長を制御すること
により、過剰な細胞を除去する過程に携わる。前骨髄性
白血病細胞の一種であるＨＬ−６０細胞におけるアポト
ーシスの誘導は、様々な生物物質または化学物質たとえ
ばレチノイン酸等によって引き起こされる可能性が示唆
されている。

【０００３】最近、ＣＡＲＤは、ＲＡＩＤＤとＩＣＨ−
１のＮ末のドメインと高い相同性をもつドメインとして
提唱された。ＩＣＨ−１、Ｃｅｄ−３、ＩＣＥおよびＭ
ｃｈ６の全ての蛋白質はＣＡＲＤをその一部として有す
る。これらのＣＡＲＤ部位をもつ蛋白質は、アポトーシ
スのシグナル伝達において関与することが報告されてい
る。

【０００４】ＣＡＲＤは、Ａｐａｆ−１などの蛋白質が
カスパーゼ９と結合するのを促進することにより、アポ
トーシスの過程において制御的役割を果たすことが示唆
されている。ＲＡＩＤＤは、ＴＮＦＲ１−ＴＲＡＤＤ−
ＲＩＰ複合体の一部であり、ＲＡＩＤＤは、ＣＡＲＤを
介してＩＣＨ−１を取り込む。二種細胞相同性ｃ−ＩＡ
Ｐ１とｃ−ＩＡＰ２のウイルス性アポトーシス抑制ＩＡ
Ｐは、ＣＡＲＤを介してＴＮＦＲ２−ＴＲＡＦ複合体の
一部を形成している。Ｃｅｄ−４は、ＣＡＲＤを介して
Ｃｅｄ−３を取り込む。これらの蛋白質のＣＡＲＤは、
たがいに静電気力により結合する。ＣＡＲＤの結合特異
性は、ドメイン表面上の荷電荷の局在化（分布）により
決定される。

【０００５】なお、略号については、次の通り。ＣＡＲ
Ｄ：caspase recruitment domain，ＩＣＥ：interleuki
n-1β converting enzyme，ＩＣＨ：ICE and Ced-3 hom
olog，ＲＩＰ：receptor interacting protein，ＲＡＩ
ＤＤ：RIP-associated ICH-1/Ced-3-homologous protei
n with a death domain，Ｍｃｈ：mammalian Ced-3 hom
olog，Ａｐａｆ：apoptotic protease activating fact
or，ＴＮＦＲ：tumornecrosis factor receptor，ＴＲ
ＡＤＤ：TNFR1-associated death domain protein，Ｉ
ＡＰ：inhibitor of apoptosis protein．ところで、こ
れまで知られているＣＡＲＤ部位を持つ蛋白質のうち、
強制発現させてもアポトーシスを抑制したり誘導したり
せず、その代わりにアポトーシスの刺激を増幅すること
によりアポトーシスを制御するものは知られていない。
このような蛋白質は、アポトーシスが関与する様々な疾
患の診断、予防又は治療に有用である可能性が期待され
る。

【０００６】本発明は、このような期待を担ったアポト
ーシス関連蛋白質を提供することを目的とする。また、
この蛋白質に特異的に結合する抗体や、この蛋白質をコ
ードするＤＮＡを提供することも目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段、発明の実施の形態及び発
明の効果】本発明のアポトーシス関連蛋白質は、配列表
の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するものであり、
ピリン(pyrin)様ドメイン（ピリンのＮ末端と相同性を
有するドメイン）とＣＡＲＤとを有している。ここで、
ピリン様ドメインは配列番号１のアミノ酸番号６〜９１
であり、ＣＡＲＤは配列番号１のアミノ酸番号１０８〜
１９４である。本発明者らは、このアポトーシス関連蛋
白質をＡＳＣ(apoptosis-associated speck-like prote
in containing a CARD)と命名した。

【０００８】このＡＳＣは、本来、サイトゾルに存在
し、トリトンＸ−１００（フェニルポリエチレングリコ
ール型のノンイオン界面活性剤）を含む緩衝液に可溶な
蛋白質であるが、レチノイン酸や抗癌剤等のアポトーシ
ス誘発剤によって誘発されるアポトーシスに伴い、トリ
トンＸ−１００を含む緩衝液に不溶化し、凝集を起こ
す。ＡＳＣがアポトーシスに伴ってトリトンＸ−１００
を含む緩衝液に対して溶性から不溶性に変化する原因
は、コンフォメーションの変化によるものと考えられ
る。また、ＡＳＣは、自らアポトーシスを誘発する作用
はないが、他の因子によって誘発されるアポトーシスを
促進する作用を有する。

【０００９】ＡＳＣのアミノ酸配列（配列番号１）は、
ヒト前骨髄性白血病細胞の一種であるＨＬ−６０細胞を
ｔｒａｎｓ−レチノイン酸で処理してアポトーシスを誘
発させた際に０．５％トリトンＸ−１００緩衝液に溶解
しなかった約２２ｋＤａの蛋白質につき、ｃＤＮＡのク
ローニングを行い、そのｃＤＮＡの塩基配列を解読し、
その塩基配列を翻訳することにより、得られたものであ
る。解読した塩基配列は、配列番号２に示すとおりであ
り、この配列番号２の塩基番号８７〜８９の配列即ちＡ
ＴＧが開始コドンであり、塩基番号６７２〜６７４の配
列即ちＴＧＡがストップコドンである。つまり、塩基番
号８７〜６７１がコーディング領域であり、この区間の
塩基配列がＡＳＣのアミノ酸配列をコードしている。

【００１０】本発明のアポトーシス関連蛋白質は、ＡＳ
Ｃのアミノ酸配列と実質同一のアミノ酸配列を持つ蛋白
質、具体的には、１又は数個のアミノ酸が欠失(deletio
n)、置換(substitution)、挿入(insertion)又は付加(ad
dition)されたアミノ酸配列を有し、且つ、他の因子
（例えばレチノイン酸や抗癌剤など）によって誘発され
るアポトーシスを促進する作用を有する蛋白質も含む。
つまり、ＡＳＣのアミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸
が欠失、置換、挿入、又は付加されたものであって、Ａ
ＳＣの基本的な性質を損なわないものも本発明のアポト
ーシス関連蛋白質に含まれる。

【００１１】このような改変された蛋白質は、例えば部
位特異的変異法によって特定の部位のアミノ酸が欠失、
置換、挿入、又は付加されるようにＤＮＡの塩基配列を
改変することによって得られる。また、ＤＮＡ（配列番
号２の塩基番号８７〜６７１の塩基配列もしくは配列番
号２の全塩基配列）又はこれを有する細胞に変異処理を
行い、その変異処理後のＤＮＡ又は細胞から、変異処理
前のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズするＤＮＡを選択することにより、改変されたＤＮＡ
を得ることができる。なお、ストリンジェントな条件と
は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異
的なハイブリッドが形成されない条件をいい、一例を示
せば、相同性が高い核酸同士、例えば９８％以上の相同
性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相
同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件が挙げ
られる。

【００１２】本発明のアポトーシス関連蛋白質に特異的
に結合するモノクローナル抗体は、例えばＡＳＣを用い
て哺乳動物（ヒトを除く）を免疫感作し、この免疫感作
した哺乳動物から得られる抗体産生細胞をミエローマ細
胞と融合して融合細胞を作製し、この融合細胞の中から
ＡＳＣと特異的に結合する抗体を産生しているクローン
を選択して培養し、その選択されたクローンの培養上清
を精製することにより、得ることができる。

【００１３】本発明のアポトーシス関連蛋白質（ＡＳＣ
及びこれと実質同一の蛋白質）やそのモノクローナル抗
体は、アポトーシスが関与する疾患である癌、免疫抑制
性疾患、自己免疫疾患、ウイルス感染症、神経変性疾
患、内分泌疾患、炎症性疾患、臓器移植障害、放射線障
害等の診断、予防又は治療薬としての利用が期待され
る。

【００１４】

【実施例】［１］ＨＬ−６０細胞のトリトンＸ−１００
不溶成分の調製 ヒト前骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０細胞を２〜３×１０
⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌでＲＰＭＩ１６４０培地に調整し、
レチノイン酸で処理する場合には１μＭでｔｒａｎｓ−
レチノイン酸を加え、レチノイン酸で処理しない場合に
はそのまま、５％ＣＯ₂、３７℃、７２時間培養した。
なお、以下ではｔｒａｎｓ−レチノイン酸を「ＲＡ」と
略す。

【００１５】この培養細胞をＰＢＳ（−）で１回洗い、
０．５％トリトンＸ−１００の細胞骨格緩衝液（１０ｍ
Ｍ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．８，１００ｍＭ ＮａＣｌ，３
００ｍＭ スクロース，３ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＥＧ
ＴＡ、１ｍＭ バナジルリボシドコンプレックス、１．
２ｍＭ ＰＭＳＦ）溶液で、溶性成分を氷上３分で抽出
した。残った不溶性成分を６００ｇ、５分で回収した。
そして、この操作をもう一度繰り返した。

【００１６】回収した不溶成分をＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ
ＤＮａｓｅＩ（１５０μｇ／ｍｌ）入りのトリトンＸ−
１００の細胞骨格緩衝液中で室温３０分処理し、クロマ
チンを消化した。次に、０．２５Ｍ 硫酸アンモニウム
溶液（１．０ｍＭ ＰＭＳＦを含む）で沈殿分画し、１
００００ｇ、１５分遠心し、沈殿を８Ｍ 尿素溶液（２
０ｍＭ ＭＥＳ，ｐＨ６．６，０．１ｍＭ ＭｇＣｌ₂，
１ｍＭ ＥＧＴＡ，１％２−メルカプトエタノール，
１．２ｍＭ ＰＭＳＦを含む）で再溶解した。

【００１７】溶解液を５００倍の透析液（２５ｍＭ イ
ミダゾール，ｐＨ７．１，１５０ｍＭ ＫＣｌ，５ｍＭ
ＭｇＣｌ₂，０．１２５ｍＭ ＥＧＴＡ，０．２ｍＭ Ｐ
ＭＳＦ）に対して２回透析した。１００００ｇ、３０分
遠心し、上清を「ＲＡ未処理のトリトン不溶成分」（＝
ＲＡで未処理のＨＬ−６０細胞のトリトンＸ−１００緩
衝液に不溶な成分）、又は、「ＲＡ処理後のトリトン不
溶成分」（＝ＲＡで処理したＨＬ−６０細胞のトリトン
Ｘ−１００緩衝液に不溶な成分）を得た。

【００１８】［２］トリトン不溶成分に対するモノクロ
ーナル抗体の作製 上記［１］で調製した「ＲＡ処理後のトリトン不溶成
分」３００μｇをＰＢＳ１ｍｌに溶解し、同容量の完全
フロインドアジュバントと懸濁液を作成した。これを生
後１２週目のＢａｌｂ／ｃマウスに０．４ｍｌを腹腔内
投与した。その４週後、「ＲＡ処理後のトリトン不溶成
分」３００μｇをＰＢＳ１ｍｌに溶解し、同容量の不完
全フロインドアジュバントと共に懸濁し、０．４ｍｌを
腹腔内投与した。その１週後、同量を腹腔内投与した。
そして、その３日後、同マウスの脾臓を摘出し、脾細胞
とマウスミエローマ細胞（Ｐ３−Ｘ６３−ＡＧ８．６５
３）を５：１の割合で混合し、ポリエチレングリコール
１５００（ＰＥＧ１５００）を融合促進剤として融合さ
せた。

【００１９】融合後の細胞は脾細胞あたり、５×１０⁵
ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１０％ウシ胎児血清を含
むＨＡＴ培地に懸濁し、１２ウェルのプレートに０．５
ｍｌずつ分注した。融合細胞はＣＯ₂インキュベータ
（５％ＣＯ₂，３７℃）中で培養し、ＨＡＴ培地で培地
交換を行い、増殖させた。

【００２０】細胞の増殖が確認されたウェルの培養上清
を「ＲＡ未処理のトリトン不溶成分」と「ＲＡ処理後の
トリトン不溶成分」を抗原として結合させた９６ウェル
のマイクロタイタープレートを用いてＥＬＩＳＡを行
い、抗体価を確認した。十分な抗体価を確認したウェル
の細胞を５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度で１０％ウシ胎
児血清を含むＨＡＴ培地に懸濁し、９６ウェルのマイク
ロタイタープレートに１００μｌずつ分注した。

【００２１】同様に細胞の増殖が確認されたウェルの培
養上清を「ＲＡ未処理のトリトン不溶成分」と「ＲＡ処
理後のトリトン不溶成分」を抗原として結合させた９６
ウェルのマイクロタイタープレートを用いてＥＬＩＳＡ
を行い、抗体価を確認し、ＲＡ処理前後でトリトンＸ−
１００不溶成分の量の変化する成分を認識する抗体のス
クリーニングを行った。同時に、培養上清を蛍光抗体法
とウェスタンブロッティングより選別した（１次スクリ
ーニング）。即ち、「ＲＡ未処理のトリトン不溶成分」
と「ＲＡ処理後のトリトン不溶成分」をウェスタンブロ
ッティングでナイロン膜に転写したものを１．５ｍｍ幅
で短冊状にし、培養上清２０μｌを１次抗体として使用
した。これにより、交叉反応がなくウェスタンブロッテ
ィングで使用可能な抗体を選別できた。また、抗体と結
合した蛋白質の分子量が判明した。

【００２２】以上により選別されたウェル細胞を１２ウ
ェルのプレートで更に増殖させ、再度５ｃｅｌｌｓ／ｍ
ｌの細胞密度で１０％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地に
懸濁し、９６ウェルのマイクロタイタープレートに１０
０μｌずつ分注し、上記のスクリーニングを行った（２
次スクリーニング）。

【００２３】選別された細胞を更にＨＡＴ培地で細胞を
増殖させ、１０％ウシ胎児血清ＲＰＭＩ１６４０培地で
順化した。これらのモノクローナル細胞群は、１０％Ｄ
ＭＳＯ，３０％ウシ胎児血清ＲＰＭＩ１６４０培地に懸
濁し、液体窒素中に保存した。

【００２４】なお、１次スクリーニングにおいて、ＡＳ
Ｃの場合、約２２ｋＤａで交差反応がなく、「ＲＡ未処
理のトリトン不溶成分」と反応せず、「ＲＡ処理後のト
リトン不溶成分」と反応したモノクローナル抗体（抗Ａ
ＳＣモノクローナル抗体）を得たため、当初は、ＲＡ処
理によってこの蛋白質ＡＳＣの発現が誘導されると考え
ていたが、そうではなく、実際はＲＡ処理の有無でトリ
トンＸ−１００緩衝液に溶性だったのが不溶性に変化し
たことがわかった（後述の［９］を参照）。

【００２５】［３］国際寄託した抗ＡＳＣクローン（an
ti-ASC clone23-）の調製 上記［２］において液体窒素中に保存した細胞を３７℃
湯浴中で急速解凍し、６００ｇ、５分遠心後、ＤＭＳＯ
を含む培地を１０％ウシ胎児血清ＲＰＭＩ１６４０培地
に置換した。ＣＯ₂インキュベータ（５％ＣＯ₂、３７
℃）中で培養し、増殖させた後、培養上清がＡＳＣを認
識することをウェスタンブロッティングによって確認し
た。この細胞を２×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌで１０％ウ
シ胎児血清ＲＰＭＩ１６４０培地に継代し、２４時間
後、６００ｇ、５分遠心し、上清を同量のセルバンカー
に置換懸濁し、２ｍｌずつクライオチューブに分注し３
０分間氷冷後、−８０℃のディープフリーザで凍結さ
せ、２４時間後、液体窒素中に保存した。この抗ＡＳＣ
クローン（anti-ASC clone23-）を国際寄託し、受託
番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７０２６を得た。

【００２６】［４］ｍＲＮＡの調製 和光社の「アイソジェン(Isogen)」及び、ファルマシア
社の「プレパックド・スピン・オリゴ−ｄＴ−セルロー
ス・カラム(pre-packed spin oligo-dT-cellulose colu
mns)」の使用説明書に従い、ＨＬ−６０の細胞抽出液よ
りポリＡの付いたｍＲＮＡを次の手順１）〜３）で抽出
した。

【００２７】１）トータルＲＮＡの調製 ５×１０⁶個のＨＬ−６０細胞を遠心して上清を除いた
後、１ｍｌの「アイソジェン」を加え、軽く攪拌し、室
温５分放置した。０．２ｍｌのクロロホルムを加え、１
５秒間激しく攪拌し、３分間室温に放置後、４℃、１２
０００ｇ１５分間遠心し、水層を別のエッペンドルフチ
ューブに分離した。分離した水層に、０．５ｍｌのイソ
プロパノールを加え、室温１０分放置した。その後、４
℃、１２０００ｇ、１０分間遠心し、ＲＮＡを沈殿させ
た。その沈殿を７５％エタノールで洗い、４℃、７５０
０ｇ、５分間遠心し、沈殿をＤＥＰＣ処理水に１００μ
ｌに溶解し、トータルＲＮＡを得た。

【００２８】２）オリゴ−ｄＴ−セルロース・カラムの
準備 ミニ・オリゴ−ｄＴ−セルロース・カラムを室温に戻
し、完全にレジンを均質化するため、数回転倒させた。
ミニ・オリゴ−ｄＴ−セルロース・カラムの上部と下部
の蓋を取り除き、ミニ・オリゴ−ｄＴ−セルロース・カ
ラムをＲＮａｓｅフリーの１．５ｍｌアシスト・チュー
ブにセットした。そして、２００ｇ、１０秒遠心し、ミ
ニ・オリゴ−ｄＴ−セルロース・カラム内の緩衝液を溶
出・除去した。溶出した緩衝液を捨て、再度ミニ・オリ
ゴ−ｄＴ−セルロース・カラムを１．５ｍｌアシストチ
ューブにセットした。そして、０．５Ｍ ＮａＣｌ緩衝
液１ｍｌを加え、蓋をして再度レジンをよく攪拌した。
その後蓋を外し、２００ｇ、１０秒遠心し、溶出した緩
衝液を捨て新しい１．５ｍｌアシスト・チューブにセッ
トした。

【００２９】３）ポリＡの付いたＲＮＡの分離 上記１）で調製したトータルＲＮＡを１．０ｍｇ／ｍｌ
で１．０ｍｌ調製し、６５℃、５分インキュベートし
た。その後、０．２５ｍｌのローディング・バッファを
加え、氷冷した。上記２）で準備したミニ・オリゴｄＴ
セルロース・カラムにアプライし、蓋をし、よく混合
し、２，３分おきに攪拌しながら１５分間室温に置い
た。その後蓋を外し、２００ｇ、１０秒遠心し、溶出液
を捨て再度１．５ｍｌアシスト・チューブにセットし
た。続いて、１ｍｌの０．５Ｍ ＮａＣｌ緩衝液を加
え、２００ｇ、１０秒遠心し、溶出した緩衝液を捨て
た。続いて、１ｍｌの０．１Ｍ ＮａＣｌ緩衝液を加
え、２００ｇ、１０秒遠心し、溶出した緩衝液を捨て
た。これを２回繰り返した。ミニ・オリゴ−ｄＴ−セル
ロース・カラムを新しい１．５ｍｌアシスト・チューブ
にセットし、あらかじめ６５℃にインキュベートしてお
いた溶出用緩衝液（溶出用に別途用意した緩衝液）を
０．５ｍｌ加え、２００ｇ１０秒遠心し、溶出したｍＲ
ＮＡを−８０℃ディープフリーザ内に保存した。

【００３０】［５］ｃＤＮＡライブラリの作製 ファルマシア社の「タイム・セイバー・ｃＤＮＡ・シン
セシス・キット(TimeSaver^TM cDNA synthesis kit)」及
びアマーシャム社の「ｃＤＮＡラピッド・クローニング
・モジュール(cDNA rapid cloning module)」と「ラム
ダ−ＤＮＡ・インビトロ・パッケージング・モジュール
(λ-DNA in vitro packaging module)」を用い、このキ
ットの使用説明書に従って、上記［４］で得たｍＲＮＡ
からｃＤＮＡライブラリを作製した。

【００３１】［６］イムノスクリーニング 上記［５］で作製したｃＤＮＡライブラリをＳＭ緩衝液
（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）と１００ｍ
ＭのＮａＣｌと、１０ｍＭのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏと、
０．０１％ゼラチンを含む）で１×１０⁶ｐｆｕ／ｍｌ
に希釈した。この液を１０本の遠心管に１００μｌ分注
し、大腸菌（Ｙ１０９０）の終夜培養液（５０ｍｌの
０．４％マルトース入りＬＢ培地でＯＤ₆₀₀＝０．５に
なるまで培養し、遠心後、培地を１５ｍｌの１０ｍＭの
ＭｇＳＯ₄に置換したもの）を１００μｌずつ加え、３
７℃、１５分湯浴中でインキュベートした。

【００３２】これに、あらかじめ４５℃にインキュベー
トしておいた１０ｍｌのＭ−トップ・エイジャー（Ｍ−
ｔｏｐ ａｇｅｒ）（ＬＢ培地に０．４％マルトース、
０．８％寒天としたもの）を加えよく攪拌し、１．５％
寒天入りで１５０ｍｍシャーレに固めて４２℃にインキ
ュベートしておいたＬＢ培地上に重層し、４時間インキ
ュベート後、１０ｍＭのＩＰＴＧに浸して乾燥させてお
いたニトロセルロース膜をのせ、３７℃で６時間インキ
ュベートした。なおＬＢ培地とは、培地１Ｌあたりトリ
プトン１０ｇ、イースト抽出物５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇを
含み、１Ｍ ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整した培地であ
る。

【００３３】インキュベート後、ニトロセルロース膜を
５％スキム・ミルクを入れたＰＢＳ（−）に入れて１時
間浸透しブロッキングした後、前出の抗ＡＳＣクローン
（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７０２６）の培養上清２０
ｍｌと共にハイブリバックに入れ、室温１時間インキュ
ベートした。その後、ＰＢＳ（−）で５分３回洗い、５
％ウシ胎児血清ＰＢＳ（−）に対して５００倍希釈した
ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇ（ダコ社製：Ｐ４４
７）１５ｍｌと共にハイブリバックに入れ、室温１時間
インキュベートした。その後、ＰＢＳ（−）で５分、３
回洗浄した。

【００３４】このニトロセルロース膜を発色基質液（ジ
アミノベンチジン２０ｍｇ／１００ｍｌ−０．０５Ｍト
リス−ＨＣｌ ｐＨ７．６）に浸した後、３０％過酸化
水素５μｌを加えて発色させ、発色の位置から対応する
クローンを選択した。 ［７］塩基配列の確認 １）イムノスクリーニングで得られた陽性２クローンを
パスツールピペットの先端で寒天から切り出し、２００
μｌのＴＥ（０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））中に入れ、抽
出し、その２μｌをλｇｔ１１のプライマー（５’−Ｇ
ＧＴＧＧＣＧＡＣＧＡＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＧ−
３’（配列番号３）と５’−ＴＴＧＡＣＡＣＣＡＧＡＣ
ＣＡＡＣＴＧＧＴＡＡＴＧ−３’（配列番号４））でＰ
ＣＲを行い、テキサス・レッド標識の同プライマーを用
いて、日立社製のＳＱ−５５００ＤＮＡシークエンサで
塩基配列を確認した。

【００３５】２つのクローンは互いに重複しており（４
２５ｂｐ、７２５ｂｐ）、４２５ｂｐのクローンは配列
番号２の塩基番号６６番目の塩基から４２５ｂｐのクロ
ーンであり、７２５ｂｐのクローンは３’末端であるポ
リＡの配列を含んでいた。なお、ｂｐはベース・ペア(b
ase pair)の略である。

【００３６】ここで得られた塩基配列をデータベースか
らＢＬＡＳＴ(Basic Local Alignment Search Tool)に
より相同検索したところ、未知の配列であり、その他有
意な相同配列を持つ遺伝子も見つからなかった。また、
この配列をジェネティクス(Genetyx)ソフトウェアで最
も長い読枠を持つアミノ酸配列に変換し、ＮＩＨのデー
タベースのＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ(Position Specific Ite
rated-BLAST)により、相同検索すると、アミノ末端側は
家族性地中海熱の原因遺伝子として同定されたピリン(P
yrin)のアミノ末端と相同性が高く、カルボキシ末端側
にＣＡＲＤドメインを持つことが明らかになった。長い
方のクローンは開始メチオニンに該当するコザック(Koz
ak)配列によく合う開始コドンＡＴＧが存在したが、そ
の上流に開始コドンがある可能性も否定できず、ここで
明らかになった配列をもとに、５’−レース(ＲＡＣ
Ｅ：Rapid amplification of cDNA ends)を行った。

【００３７】２）５’−レース ギブコ社製の５’−レース・システム・バージョン２．
０（５’ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ Ｖｅｒ．２．０）を
用い、このキットの使用説明書に従って、次の手順で残
りの配列を確認した。

【００３８】上記［４］で調製したｍＲＮＡを用い、プ
ライマー（１）５’−ＧＧＴＧＡＧＧＴＣＣＡＡＧＧＣ
ＧＴＣＣＡＴＧ−３’（配列番号５）を用いて、スーパ
ースクリプトII(Super ScriptII)逆転写酵素で４２℃、
５０分逆転写反応を行った。さらに７０℃、１５分伸長
させた。その後１μｌのＲＮａｓｅを加え、ＲＮＡを分
解した。

【００３９】その後、グラスマックス・ＤＮＡ・アイソ
レーション・スピン・カートリッジ(GlassMax DNA Isol
ation Spin Cartridge)でｃＤＮＡを精製し、ｄＣＴＰ
とターミナル・デオキシ・ヌクレオタイダルトランスフ
ェラーゼ（ＴｄＴ）を加え、３７℃、１０分インキュベ
ートし、ｃＤＮＡの３’−末端をポリＣ化した。

【００４０】次に、添付のアブリッジド・アンカー・プ
ライマー(Abridged Anchor Primer)と内側のプライマー
（２）５’−ＧＣＧＣＡＧＧＧＣＴＡＣＧＧＴＣＧＣＡ
ＴＣ−３’（配列番号６）を用いてＰＣＲを行い、二重
鎖ＤＮＡを合成し、さらに、添付のユニバーサル・アン
カー・プライマー（ＵＡＰ）とさらに内側のプライマー
（３）５’−ＣＣＴＧＧＡＴＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＡＣ
ＣＴＧ−３’（配列番号７）を用いてＰＣＲを行い増幅
させた。

【００４１】ＰＣＲ産物を、プロメガ社製のＴ−イージ
ー(T-Easy)ベクターにサブクローニングし、テキサスレ
ッド標識Ｍ１３前後プライマーを用いて、５’−末端側
の残り５９ｂｐの配列を決定した。なお、７２５ｂｐの
クローンは５’末端の１塩基に欠失があったため、実際
は７２６ｂｐであった。

【００４２】この結果、配列表の配列番号２に示す塩基
配列を得た。この塩基配列は、塩基番号８７〜８９のＡ
ＴＧが開始コドンであり、塩基番号６７２〜６７４のＴ
ＧＡがストップコドンであることから、これから類推さ
れるアミノ酸配列、即ち、ＨＬ−６０細胞のアポトーシ
スに伴って０．５％トリトンＸ−１００に不溶化する約
２２ｋＤａの蛋白質（ＡＳＣ）のアミノ酸は、配列番号
１に示すとおりとなった。

【００４３】ＡＳＣは、１９５のアミノ酸のペプチドで
あり、図１（ａ）に示すようにピリン様ドメインとＣＡ
ＲＤとを有している。ここで、ピリン様ドメインは配列
番号１のアミノ酸番号６〜９１であり、ＣＡＲＤは配列
番号１のアミノ酸番号１０８〜１９４である。また、
６．４という等電位点を持ち、分子量が２１．７ｋＤａ
である。図１（ｂ）には、塩基配列とアミノ酸配列との
対応がわかりやすいように、両配列を併記したものを示
した。

【００４４】なお、ＡＳＣのＣＡＲＤは他のＣＡＲＤを
持つ蛋白質との比較からアミノ酸番号１０７〜１９４の
８８アミノ酸残基からなると推定されたが、ＮＩＨのデ
ータベースのＰＳＩ−ＢＬＡＳＴによる検索で、アミノ
酸番号１０８〜１９４の８７アミノ酸残基が、哺乳類の
ｃＩＡＰ１とｃＩＡＰ２のＣＡＲＤと有意な相同性（期
待値＜０．０１）を持つことが確認された（図２参
照）。また、ＡＳＣのＣ末端の８７アミノ酸残基が、ヒ
トのカスパーゼ−２(caspase-2)とある程度の相同性を
持つことが確認された（図２参照）。一方、ＡＳＣのＮ
末端は家族性地中海熱の原因遺伝子として同定されたピ
リンのＮ末端と高い相同性を示した（図３参照）。

【００４５】［８］発現プラスミドの生成 ＡＳＣのすべてのオープンリーディングフレームをｐｃ
ＤＮＡ３（インビトロジェン社製）に組み込み、ｐｃＤ
ＮＡ３−ＡＳＣとした。このＤＮＡを、遺伝子導入法の
一つであるリポフェクションキットTransome^TM（和光純
薬社製）のプロトコルに従い、ＣＯＳ７細胞に遺伝子導
入した。また、ｐｃＤＮＡ３（空ベクター）を同様にし
てＣＯＳ７細胞に遺伝子導入した。

【００４６】これらのＣＯＳ７細胞と抗ＡＳＣモノクロ
ーナル抗体とを用いて免疫蛍光法及びウエスタンブロッ
ト法を行った。その結果、免疫蛍光法において、ｐｃＤ
ＮＡ３−ＡＳＣを遺伝子導入したＣＯＳ７細胞では環状
の蛍光シグナルが検出されたが、ｐｃＤＮＡ３を遺伝子
導入したＣＯＳ７細胞では検出されなかった。また、ウ
エスタンブロット法において、ｐｃＤＮＡ３−ＡＳＣを
遺伝子導入したＣＯＳ７細胞では約２２ｋＤａのバンド
が確認された。このバンドの大きさは、ＨＬ−６０細胞
中のＡＳＣをウエスタンブロット法で測定したものと同
一であった。

【００４７】以上の結果から、決定した塩基配列による
転写産物が確実に抗ＡＳＣモノクローナル抗体によって
認識されるという証明がなされた。また、決定した読枠
で分子量が一致するという証明もなされた。 ［９］ＡＳＣの挙動−その１ ＨＬ−６０細胞を、１μＭのＲＡの存在下、又は、ＲＡ
を加えない状態で、４日間培養した。培養後の細胞を、
０．５％トリトンＸ−１００の細胞骨格緩衝液に懸濁
し、１５００ｇで１０分間遠心分離し、可溶成分と不溶
成分に分離した。すべての細胞溶解質の可溶成分ならび
に不溶成分を、抗ＡＳＣモノクローナル抗体を用いたウ
エスタンブロット法に適用した。その結果を、図４に示
す。

【００４８】この図４から明らかなように、ＡＳＣは、
ＲＡを加えない状態では０．５％トリトンＸ−１００の
細胞骨格緩衝液に可溶であったのに対して、ＲＡの存在
下では同緩衝液に不溶化した。このことから、ＡＳＣ
は、ＲＡによって誘発されたアポトーシスに伴い、同緩
衝液に不溶化することがわかった。この原因は、コンフ
ォメーションの変化によるものと考えられる。

【００４９】［１０］ＡＳＣの挙動−その２ ＲＡ処理を施した細胞の免疫蛍光顕微鏡による観察によ
り、ＡＳＣの存在箇所が明らかになった。ＡＳＣの蛍光
シグナルは、斑点のように観察された。即ち、ＨＬ−６
０細胞は、１μＭのＲＡ存在下で４日間培養し、−２０
℃で３０分間、７０％のエタノールで固定され、抗ＡＳ
Ｃモノクローナル抗体で免疫染色された。ＤＮＡは、ｂ
ｌｕｅ（ヘキスト３３２５８）で染色され、アポトーシ
スを引き起こした細胞はＡＳＣの斑点として観察され
た。

【００５０】［１１］ＡＳＣの挙動−その３ また、プリエンベッディング(Pre-embedding)電子顕微
鏡において、ＡＳＣがアポトースシスを引き起こしたＨ
Ｌ−６０細胞の辺縁に存在し、中心に穴の空いたような
凝集塊を形成することが確認された。

【００５１】［１２］ＡＳＣの挙動−その４ 細胞分画によって、ＡＳＣの局在部位が同定された。２
０μｇのペレットの分液および上清を、抗ＡＳＣモノク
ローナル抗体を用いたウェスタンブロット法にて分析し
た。細胞の破砕物は１，０００、１０，０００および１
００，０００×ｇで遠心した。全ての細胞の蛋白質は各
遠心後の沈殿分画及び最終的に残った上清分画にそれぞ
れ約３５、１３、１７および３５％の割合で存在した。
ＡＳＣは１００，０００ｇの上清に主に分布し、通常細
胞質に分布することが明らかになった。ここで１，００
０ｇ沈殿には主に核分画、１０，０００ｇ沈殿には主に
ミトコンドリア分画、１００，０００ｇ沈殿には主にミ
クロソーム分画が分離された。

【００５２】［１３］ＡＳＣの組織細胞分布 ノーザンブロット法とウエスタンブロット法を用いて、
数種類の腫瘍系列でヒト組織におけるＡＳＣの発現の有
無を検討した。その結果、白血病細胞系列である二種類
のＨＬ−６０及びＵ９３７、並びに、黒色腫細胞系列で
あるＷＭ３５にＡＳＣが発現していることが明らかにな
った。更に、ＡＳＣのｍＲＮＡ発現の痕跡が、慢性骨髄
性白血病細胞系列であるＫ５６２でも確認された。これ
らの観察結果により、ＡＳＣ発現の程度は、細胞系列ま
たは成熟度、若しくは細胞の形質転換に依存することが
予想される。

【００５３】［１４］エトポシド誘導性アポトーシスの
ＡＳＣによる促進 ＨＬ−６０細胞に、アンチセンスオリゴヌクレオチド−
（７６−９５）５’−ＧＣＧＣＣＣＣＡＴＧＧＣＴＣＣ
ＡＧＧＡＴ−３’（配列番号８）を遺伝子導入した。ま
た、コントロールとして、センスオリゴヌクレオチド−
（７６−９５）５’−ＡＴＣＣＴＧＧＡＧＣＣＡＴＧＧ
ＧＧＣＧＣ−３’（配列番号９）、又は、センスオリゴ
ヌクレオチド−（７１−９０）５’−ＣＧＧＧＧＡＴＣ
ＣＴＧＧＡＧＣＣＡＴＧＧ−３’（配列番号１０）を遺
伝子導入した。ＨＬ−６０細胞（２Ｘ１０⁶ｃｅｌｌｓ
／ｍｌ）に、リポフェクト・アミンプラス試薬(Lipofec
tAMINEPLUS reagent)（ライフテクノロジー社）を用い
て、それぞれのオリゴヌクレオチド（５μＭ）を遺伝子
導入した。

【００５４】これらのＨＬ−６０細胞につき、エトポシ
ド１０μｇ／ｍｌを加えて、エトポシドによるアポトー
シスの誘導性を調査したところ、図５に示すように、ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドによる遺伝子導入を施し
たＨＬ−６０細胞のエトポシド誘導性アポトーシスで
は、アポトーシスの発生率が、コントロール細胞に比較
して、顕著に低下した。この結果から、ＡＳＣは、エト
ポシド等によるアポトーシス誘発の刺激に対して、ＨＬ
−６０細胞の感受性を増加させることにより、アポトー
シスを促進する働きがある可能性が示唆された。

【００５５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Junya Masumoto, Junji Sagara, Shun'ichiro Taniguchi and Medical&B iological Laboratories Co. Ltd. <120> Protein related on Apoptosis, antibody against the protein, and D NA which codes the protein <160> 10 <210> 1 <211> 195 <212> PRT <213> human <400> 1 Met Gly Arg Ala Arg Asp Ala Ile Leu Asp Ala Leu Glu Asn Leu 1 5 10 15 Thr Ala Glu Glu Leu Lys Lys Phe Lys Leu Lys Leu Leu Ser Val 20 25 30 Pro Leu Arg Glu Gly Tyr Gly Arg Ile Pro Arg Gly Ala Leu Leu 35 40 45 Pro Met Asp Ala Leu Asp Leu Thr Asp Lys Leu Val Ser Phe Tyr 50 55 60 Leu Glu Thr Tyr Gly Ala Glu Leu Thr Ala Asn Val Leu Arg Asp 65 70 75 Met Gly Leu Gln Glu Met Ala Gly Gln Leu Gln Ala Ala Thr His 80 85 90 Gln Gly Ser Gly Ala Ala Pro Ala Gly Ile Arg Ala Pro Pro Gln 95 100 105 Ser Ala Ala Lys Pro Gly Leu His Phe Ile Asp Gln His Arg Ala 110 115 120 Ala Leu Ile Ala Arg Val Thr Asn Val Glu Trp Leu Leu Asp Ala 125 130 135 Leu Tyr Gly Lys Val Leu Thr Asp Glu Gln Tyr Gln Ala Val Arg 140 145 150 Ala Glu Pro Thr Asn Pro Ser Lys Met Arg Lys Leu Phe Ser Phe 155 160 165 Thr Pro Ala Trp Asn Trp Thr Cys Lys Asp Leu Leu Leu Gln Ala 170 175 180 Leu Arg Glu Ser Gln Ser Tyr Leu Val Glu Asp Leu Glu Arg Ser 185 190 195 <210> 2 <211> 785 <212> DNA <213> human <400> 2 gtccaggttc cgccccggag ccgacttcct cctggtcggc ggctgcagcg gggtgagcgg 60 cggcagcggc cggggatcct ggagccatgg ggcgcgcgcg cgacgccatc ctggatgcgc 120 tggagaacct gaccgccgag gagctcaaga agttcaagct gaagctgctg tcggtgccgc 180 tgcgcgaggg ctacgggcgc atcccgcggg gcgcgctgct gcccatggac gccttggacc 240 tcaccgacaa gctggtcagc ttctacctgg agacctacgg cgccgagctc accgctaacg 300 tgctgcgcga catgggcctg caggagatgg ccgggcagct gcaggcggcc acgcaccagg 360 gctctggagc cgcgccagct gggatccggg cccctcctca gtcggcagcc aagccaggcc 420 tgcactttat agaccagcac cgggctgcgc ttatcgcgag ggtcacaaac gttgagtggc 480 tgctggatgc tctgtacggg aaggtcctga cggatgagca gtaccaggca gtgcgggccg 540 agcccaccaa cccaagcaag atgcggaagc tcttcagttt cacaccagcc tggaactgga 600 cctgcaagga cttgctcctc caggccctaa gggagtccca gtcctacctg gtggaggacc 660 tggagcggag ctgaggctcc ttcccagcaa cactccggtc agcccctggc aatcccacca 720 aatcatcctg aatctgatct ttttatacac aatatacgaa aagccagctt gaaaaaaaaa 780 aaaaa 785 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 ggtggcgacg actcctggag cccg 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 ttgacaccag accaactggt aatg 24 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 ggtgaggtcc aaggcgtcca tg 22 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 gcgcagggct acggtcgcat c 21 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 cctggatgcg ctggagaacc tg 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 gcgccccatg gctccaggat 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 atcctggagc catggggcgc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 cggggatcct ggagccatgg 20

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＡＳＣの説明図であり、（ａ）はＡＳＣの模
式図、（ｂ）はＡＳＣの塩基配列とアミノ酸配列であ
る。

【図２】 ＡＳＣのＣＡＲＤ部位と他のアポトーシス関
連蛋白質のＣＡＲＤ部位との対比を表す説明図である。

【図３】 ＡＳＣのピリン様ドメインとピリンとの対比
を表す説明図である。

【図４】 ＡＳＣの０．５％トリトンＸ−１００緩衝液
に対する可溶性、不溶性を表す説明図である。

【図５】 エトポシド誘導性アポトーシスに対するＡＳ
Ｃの影響を表すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 390004097 株式会社医学生物学研究所 愛知県名古屋市中区丸の内３丁目５番10号 住友商事丸の内ビル５Ｆ (72)発明者 増本 純也 長野県松本市横田４−13−５ (72)発明者 相良 淳二 長野県松本市蟻ヶ崎２−５−４−401 (72)発明者 谷口 俊一郎 長野県松本市里山辺1198−１ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA45 BA80 CA04 DA02 EA04 GA03 GA13 HA04 HA14 HA15 4B064 AG01 AG27 CA10 CA20 CC24 DA01 DA13 4H045 AA11 CA42 DA76 DA86 EA22 EA28 EA29 EA50 EA51 EA53 FA72 FA74

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列
   を有するアポトーシス関連蛋白質。
2. 【請求項２】 請求項１記載のアポトーシス関連蛋白質
   のアミノ酸配列につき、１又は数個のアミノ酸が欠失、
   置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、
   細胞のアポトーシスを促進する作用を有するアポトーシ
   ス関連蛋白質。
3. 【請求項３】 請求項１又は２記載のアポトーシス関連
   蛋白質に特異的に結合するモノクローナル抗体。
4. 【請求項４】 請求項１又は２記載のアポトーシス関連
   蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
5. 【請求項５】 配列表の配列番号２の塩基配列のうち塩
   基番号８７〜６７１で表される塩基配列を有するＤＮ
   Ａ。
6. 【請求項６】 配列表の配列番号２の全塩基配列を有す
   るＤＮＡ。
7. 【請求項７】 請求項５又は６記載のＤＮＡとストリン
   ジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、細胞のア
   ポトーシスを促進する作用を有するアポトーシス関連蛋
   白質をコードするＤＮＡ。